ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人 東京大学
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024119178
(43)【公開日】2024-09-03
(54)【発明の名称】魚類の生殖腺発育促進剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/22 20060101AFI20240827BHJP
C12N 5/075 20100101ALI20240827BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20240827BHJP
A23K 20/147 20160101ALI20240827BHJP
A23K 50/80 20160101ALI20240827BHJP
A01K 61/10 20170101ALI20240827BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20240827BHJP
【ＦＩ】
A61K38/22
C12N5/075
A61P15/00 171
A23K20/147
A23K50/80
A01K61/10
C07K7/06 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023025897
(22)【出願日】2023-02-22
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】110003421
【氏名又は名称】弁理士法人フィールズ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】神田 真司
(72)【発明者】
【氏名】大久保 範聡
【テーマコード（参考）】
2B005
2B104
2B150
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
2B005GA02
2B005GA04
2B005MB09
2B104AA03
2B104AA07
2B104BA02
2B104BA09
2B150AA08
2B150AB20
2B150DC23
4B065AA90X
4B065BB19
4B065BB34
4B065CA60
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA44
4C084CA18
4C084CA45
4C084DB41
4C084DB43
4C084NA14
4C084ZC61
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA15
4H045CA52
4H045DA30
(57)【要約】
【課題】新規な魚類の生殖腺発育促進剤の提供。
【解決手段】本発明によれば、コレシストキニン受容体作動剤（ＣＣＫ受容体作動剤）を有効成分として含んでなる、魚類の生殖腺発育促進剤が提供される。本発明によればまた、ＣＣＫ受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の卵胞刺激ホルモン放出促進剤が提供される。本発明によればまた、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、魚類卵母細胞の卵黄形成促進方法が提供される。本発明によればまた、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、生殖腺の発育が促進された魚類の生産方法が提供される。本発明によればまた、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、早期催熟された魚類の生産方法が提供される。
【選択図】図３
【解決手段】本発明によれば、コレシストキニン受容体作動剤（ＣＣＫ受容体作動剤）を有効成分として含んでなる、魚類の生殖腺発育促進剤が提供される。本発明によればまた、ＣＣＫ受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の卵胞刺激ホルモン放出促進剤が提供される。本発明によればまた、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、魚類卵母細胞の卵黄形成促進方法が提供される。本発明によればまた、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、生殖腺の発育が促進された魚類の生産方法が提供される。本発明によればまた、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、早期催熟された魚類の生産方法が提供される。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コレシストキニン（ＣＣＫ）受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の生殖腺発育促進剤。
【請求項2】
生殖腺が卵巣である、請求項１に記載の促進剤。
【請求項3】
卵胞細胞および／または卵母細胞の発育を促進するための、請求項１または２に記載の促進剤。
【請求項4】
ＣＣＫ受容体作動剤がＣＣＫまたはガストリンである、請求項１に記載の促進剤。
【請求項5】
ＣＣＫまたはガストリンが、ヒトまたは魚類のＣＣＫまたはガストリンである、請求項４に記載の促進剤。
【請求項6】
ＣＣＫおよびガストリンが、式（Ａ）ＤＸ１Ｘ２ＧＷＸ３ＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｘ１はＹまたはＡであり、前記Ｙは硫酸化されていてもよく、Ｘ２およびＸ３は任意のアミノ酸である）（配列番号１３）のアミノ酸配列または式（Ｂ）ＷＸ４ＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｘ４は任意のアミノ酸である）（配列番号１２）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチドである、請求項４に記載の促進剤。
【請求項7】
前記式（Ａ）のアミノ酸配列が、
式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６）、
式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）、
式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５）、
式（４）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１８）、
式（５）ＤＹＶＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１９）、
式（６）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号２０）および
式（７）ＤＡＮＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２１）
からなる群から選択される、請求項６に記載の促進剤。
式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６）、
式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）、
式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５）、
式（４）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１８）、
式（５）ＤＹＶＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１９）、
式（６）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号２０）および
式（７）ＤＡＮＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２１）
からなる群から選択される、請求項６に記載の促進剤。
【請求項8】
魚類が、下位条鰭類または真骨魚類である、請求項１または５に記載の促進剤。
【請求項9】
ＣＣＫ受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進剤。
【請求項10】
ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、魚類卵母細胞の卵黄形成促進方法。
【請求項11】
ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、生殖腺の発育が促進された魚類の生産方法。
【請求項12】
魚類がウナギまたはチョウザメである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
請求項１１または１２に記載の方法を実施して生殖腺の発育が促進された魚類を生産し、次いで、生殖腺の発育が促進された魚類から卵を採取する、魚類の卵の採取方法。
【請求項14】
請求項１３に記載の方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させることを含む、魚類の受精卵の生産方法。
【請求項15】
請求項１３に記載の方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させ、さらに得られた受精卵を孵化させることを含む、魚類の仔魚の生産方法。
【請求項16】
生殖腺の発育が促進された魚類が、早期催熟された魚類である、請求項１１または１２に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、魚類の生殖腺発育促進剤に関する。本発明はまた、魚類の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進剤に関する。
【背景技術】
【0002】
脊椎動物において、卵を成長させて排卵させる制御システムとして、脳下垂体で産生される卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）といった生殖腺刺激ホルモン（ＧＴＨ）が中心的役割を果たしている。魚類では、脳下垂体から分泌されたＦＳＨが血流に入り卵母細胞を取り囲む卵胞細胞に作用し、エストロジェンおよびビテロジェニンを介することにより、卵母細胞では卵黄形成が進み、卵母細胞が発育する。人工飼育環境下のウナギ等においては、生殖腺の成熟がほとんど進行しないため人為的な成熟誘導（人為催熟）が行われる。近年の人為催熟の研究により、ウナギやその他の魚類の発達中の卵巣において卵母細胞と、卵母細胞を取り囲む卵胞細胞の発育はＦＳＨのみによって促進され、ＬＨは卵母細胞の最終成熟・排卵の誘発のみに関わることが明らかとなってきた（非特許文献１および２）。人為催熟としては、これまでウナギの卵を得るためにＦＳＨの投与が行われてきたものの、ＦＳＨは複雑な糖タンパク質ホルモンであり、合成に莫大なコストがかかる。このため、ＦＳＨの比較的安価な代用として、サケ脳下垂体抽出物を使用する技術が用いられているが、排卵を促すホルモン等の夾雑物の影響による卵質の低下が課題となっている。
【0003】
魚類において、ＬＨの制御には視床下部ホルモンであるゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ／ＬＨＲＨ）が有効であることが古くから知られていた。一方で、卵胞細胞および卵母細胞の発達を促すＦＳＨの制御に関しては明らかとなっていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Takahashi et al., Endocrinology, 157, 2016: 3994-4002.
【非特許文献2】日本水産学会誌、８６（５）、３６４－３６６（２０２０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、魚類の生殖腺発育促進剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは今般、イン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法および免疫組織化学により、メダカ成体脳下垂体においてＦＳＨ細胞がＣＣＫ受容体Ｂ１（ＣＣＫＲＢ１）を発現し、視床下部のＣＣＫニューロンからの支配を受けることを見出した。本発明者らはまた、ＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイにより、メダカＣＣＫ－８およびメダカガストリン－８がＣＣＫＲＢ１を介してｃＡＭＰ、Ｃａ２＋およびＭＡＰＫを賦活することを見出した。本発明者らはまた、ＣＣＫＲＢ１ノックアウトメダカの解析により、ＣＣＫＲＢ１ノックアウトメダカでは卵巣および精巣の発達が著しく阻害され、ＦＳＨ発現量も著しく低下することを見出した。本発明者らはまた、カルシウムイメージング解析により、メダカＣＣＫ－８およびメダカＣＣＫ－４がＦＳＨ細胞の細胞内カルシウム濃度を急激に上昇させること、すなわちＦＳＨ放出を促進することを見出した。本発明者らはまた、ＰＣＲ法および二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法により、メダカで見出した知見が魚類一般において保存された機構であって、魚類一般に適用できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【0007】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］コレシストキニン（ＣＣＫ）受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の生殖腺発育促進剤。
［２］生殖腺が卵巣である、上記［１］に記載の促進剤。
［３］卵胞細胞および／または卵母細胞の発育を促進するための、上記［１］または［２］に記載の促進剤。
［４］ＣＣＫ受容体作動剤がＣＣＫまたはガストリンである、上記［１］～［３］のいずれかに記載の促進剤。
［５］ＣＣＫまたはガストリンが、ヒトまたは魚類のＣＣＫまたはガストリンである、上記［４］に記載の促進剤。
［６］ＣＣＫおよびガストリンが、式（Ａ）ＤＸ１Ｘ２ＧＷＸ３ＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｘ１はＹまたはＡであり、前記Ｙは硫酸化されていてもよく、好ましくは硫酸化チロシンであり、Ｘ２およびＸ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は好ましくはＭ、Ｖ、Ｎ、Ａ、Ｑ、Ｒ、ＴまたはＮであり、Ｘ３は好ましくはＶ、ＬまたはＭである）（配列番号１３）のアミノ酸配列または式（Ｂ）ＷＸ４ＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｘ４は任意のアミノ酸であり、Ｘ４は好ましくはＭ、ＬまたはＶである）（配列番号１２）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチドである、上記［４］または［５］に記載の促進剤。
［７］前記式（Ａ）のアミノ酸配列が、
式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６）、
式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）、
式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５）、
式（４）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１８）、
式（５）ＤＹＶＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１９）、
式（６）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号２０）および
式（７）ＤＡＮＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２１）
からなる群から選択される、上記［６］に記載の促進剤。
［８］魚類が、下位条鰭類または真骨魚類である、上記［１］～［７］のいずれかに記載の促進剤。
［９］ＣＣＫ受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進剤。
［１０］ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、魚類卵母細胞の卵黄形成促進方法。
［１１］ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、生殖腺の発育が促進された魚類の生産方法。
［１２］魚類がウナギまたはチョウザメである、上記［１１］に記載の方法。
［１３］上記［１１］または［１２］に記載の方法を実施して生殖腺の発育が促進された魚類を生産し、次いで、生殖腺の発育が促進された魚類から卵を採取する、魚類の卵の採取方法。
［１４］上記［１３］に記載の方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させることを含む、魚類の受精卵の生産方法。
［１５］上記［１３］に記載の方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させ、さらに得られた受精卵を孵化させることを含む、魚類の仔魚の生産方法。
［１６］生殖腺の発育が促進された魚類が、早期催熟された魚類である、上記［１１］～［１５］のいずれかに記載の生産方法。
［１］コレシストキニン（ＣＣＫ）受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の生殖腺発育促進剤。
［２］生殖腺が卵巣である、上記［１］に記載の促進剤。
［３］卵胞細胞および／または卵母細胞の発育を促進するための、上記［１］または［２］に記載の促進剤。
［４］ＣＣＫ受容体作動剤がＣＣＫまたはガストリンである、上記［１］～［３］のいずれかに記載の促進剤。
［５］ＣＣＫまたはガストリンが、ヒトまたは魚類のＣＣＫまたはガストリンである、上記［４］に記載の促進剤。
［６］ＣＣＫおよびガストリンが、式（Ａ）ＤＸ１Ｘ２ＧＷＸ３ＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｘ１はＹまたはＡであり、前記Ｙは硫酸化されていてもよく、好ましくは硫酸化チロシンであり、Ｘ２およびＸ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は好ましくはＭ、Ｖ、Ｎ、Ａ、Ｑ、Ｒ、ＴまたはＮであり、Ｘ３は好ましくはＶ、ＬまたはＭである）（配列番号１３）のアミノ酸配列または式（Ｂ）ＷＸ４ＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｘ４は任意のアミノ酸であり、Ｘ４は好ましくはＭ、ＬまたはＶである）（配列番号１２）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチドである、上記［４］または［５］に記載の促進剤。
［７］前記式（Ａ）のアミノ酸配列が、
式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６）、
式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）、
式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５）、
式（４）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１８）、
式（５）ＤＹＶＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１９）、
式（６）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号２０）および
式（７）ＤＡＮＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２１）
からなる群から選択される、上記［６］に記載の促進剤。
［８］魚類が、下位条鰭類または真骨魚類である、上記［１］～［７］のいずれかに記載の促進剤。
［９］ＣＣＫ受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進剤。
［１０］ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、魚類卵母細胞の卵黄形成促進方法。
［１１］ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、生殖腺の発育が促進された魚類の生産方法。
［１２］魚類がウナギまたはチョウザメである、上記［１１］に記載の方法。
［１３］上記［１１］または［１２］に記載の方法を実施して生殖腺の発育が促進された魚類を生産し、次いで、生殖腺の発育が促進された魚類から卵を採取する、魚類の卵の採取方法。
［１４］上記［１３］に記載の方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させることを含む、魚類の受精卵の生産方法。
［１５］上記［１３］に記載の方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させ、さらに得られた受精卵を孵化させることを含む、魚類の仔魚の生産方法。
［１６］生殖腺の発育が促進された魚類が、早期催熟された魚類である、上記［１１］～［１５］のいずれかに記載の生産方法。
【0008】
本発明によれば、魚類において生殖腺、特に卵胞細胞および卵母細胞の発育を、４ないし８アミノ酸からなる非常に安価なＣＣＫおよびガストリン等のＣＣＫ受容体作動剤の投与により促進できる点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】図１は、メダカ成体脳下垂体におけるＦＳＨｂプローブおよびＣＣＫＲＢ１プローブを用いた二重イン・サイチュハイブリダイゼーションの結果を示す図である。左はＦＳＨｂの像（マゼンタ）、中央はＣＣＫＲＢ１の像（緑色）、右はＦＳＨｂとＣＣＫＲＢ１とを重ね合わせた像である。脳下垂体においてＦＳＨｂとＣＣＫＲＢ１との発現の重なりが観察された。
【図4】図４は、ＣＣＫＲＢ１ノックアウト個体における生殖腺の表現型および脳下垂体におけるＦＳＨ遺伝子の発現量を示す図である。Ａは野生型およびＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体の卵巣および精巣の表現型、ＢはＣＣＫＲＢ１ヘテロノックアウト個体およびＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体におけるＦＳＨｂ ｍＲＮＡの定量結果（ＦＳＨｂ／ａｃｔｂ）を示す。
【図5】図５は、ＣＣＫペプチドに対するＦＳＨ細胞の反応性および用量応答性に関するカルシウムイメージング解析の結果を示す図である。Ａは式（２）のペプチドへの反応性、Ｂは式（８）のペプチドへの反応性、Ｃは式（２）のペプチドへの用量応答性を示す。なお、ＡおよびＢのグラフの縦軸は細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）レベルの相対値を示し、横軸はペプチド投与後の経過時間（秒）を示す。Ｃのグラフの縦軸は細胞内カルシウムレベルの相対値を示す。
【発明の具体的説明】
【0010】
本発明において「コレシストキニン受容体作動剤」（本明細書において、「ＣＣＫ受容体作動剤」ともいう）は、ＣＣＫ受容体介在性シグナル伝達を活性化する薬剤をいう。
【0011】
ＣＣＫ受容体介在性シグナル伝達の活性化は、後記実施例に記載されるように、ＣＣＫＲＢ１遺伝子を発現させた培養細胞を用いて、細胞内カルシウム濃度、細胞内ｃＡＭＰ濃度または細胞内ＭＡＰＫ濃度をモニターする方法により確認することができる。
【0012】
ＣＣＫ受容体作動剤としては、ＣＣＫ受容体に対してアゴニストとして作用するペプチド、タンパク質および化合物とすることができ、例えば、コレシストキニン（ｃｈｏｌｅｓｙｓｔｏｋｉｎｉｎ、本明細書において「ＣＣＫ」ということがある）、ガストリン（ｇａｓｔｒｉｎ）が挙げられる。本発明においては、コレシストキニン（ＣＣＫ）およびガストリン並びにそれらの断片からなる群から選択される１種以上のペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。なお、本発明において上記ペプチドを構成するアミノ酸は天然のＣＣＫおよびガストリンにおけるアミノ酸の修飾（例えば、Ｃ末端から７番目のチロシン残基の硫酸化、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシ基のアミド化）がなされているものとすることができる。
【0013】
「コレシストキニン」（本明細書において、「ＣＣＫ」ともいう）は、消化管ホルモンおよび神経伝達物質として機能するペプチドである。ヒトでは、３３個のアミノ酸残基からなるコレシストキニンポリペプチド（ＣＣＫ－３３）は消化管ホルモンであり、Ｃ末端オクタペプチド（ＣＣＫ－８）がＣＣＫ－３３の生物活性に重要な役割を果たす。ヒトではまた、ＣＣＫは脳および末梢神経系にも存在し、ＣＣＫ－８の形でシナプス小胞内に存在し、睡眠や食欲に関与することが知られている。また、本明細書においてＣＣＫのＣ末端テトラペプチドをＣＣＫ－４という。
【0014】
「ガストリン」とは、ヒトでは消化管ホルモンであり、１７個のアミノ酸残基からなる直鎖のペプチドである。
【0015】
天然に存在するＣＣＫおよびガストリンは、いずれもＣＣＫのアゴニスト活性を高める、硫酸化されたチロシン（Ｔｙｒ）残基を有することがあり、この場合、ＣＣＫではＣ末端から７番目のチロシン残基が、非哺乳類動物のガストリンではＣ末端から７番目のチロシン残基が硫酸化されている。天然に存在するＣＣＫとガストリンはまた、いずれも、Ｃ末端アミノ酸残基はアミド化されているという特徴を有する。天然に存在するＣＣＫとガストリンはさらに、ＣＣＫおよびガストリンと受容体との結合に寄与するＣ末端側の４アミノ酸残基において共通し、共通配列は式（Ｂ）ＷＸ４ＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｘ４は任意のアミノ酸であり、Ｘ４は好ましくはＭ、ＬまたはＶである）（配列番号１２）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（Ｂ）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（Ｂ）のアミノ酸配列を有するテトラペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。
【0016】
ＣＣＫとガストリンは、脊椎動物において共通祖先を有するペプチドであることが示唆され、軟骨魚類から哺乳類まで広い動物種で同定されている。魚類では多くの種において、ＣＣＫおよびガストリンの活性部位は共通し、該活性部位はＣ末端側の８アミノ酸残基からなる式（Ａ）ＤＸ１Ｘ２ＧＷＸ３ＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｘ１はＹまたはＡであり、前記Ｙは硫酸化されていてもよく、好ましくは硫酸化チロシンであり、Ｘ２およびＸ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は好ましくはＭ、Ｖ、Ｎ、Ａ、Ｑ、Ｒ、ＴまたはＮであり、Ｘ３は好ましくはＶ、ＬまたはＭである）（配列番号１３）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（Ａ）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（Ａ）のアミノ酸配列を有するオクタペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。
【0017】
ヒトでは、ＣＣＫは消化管ホルモンおよび神経伝達物質であり、Ｃ末端の８個のアミノ酸残基からなる活性部位をもつ。この活性部位の８アミノ酸残基は式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（１）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（１）のアミノ酸配列を有するオクタペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。
【0018】
メダカでは、ＣＣＫはペプチドホルモン・神経伝達物質であり、Ｃ末端の８個のアミノ酸残基からなる活性部位をもつ。メダカではＣＣＫ遺伝子はＣＣＫＡおよびＣＣＫＢ遺伝子の２種類が存在し、いずれの遺伝子がコードするペプチドも、活性部位の８アミノ酸残基は式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）のアミノ酸配列で表すことができ、Ｃ末端側の４アミノ酸残基は式（８）ＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２２）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（２）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（２）のアミノ酸配列を有するオクタペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。本発明においては式（８）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基、９アミノ酸残基、８アミノ酸残基、７アミノ酸残基、６アミノ酸残基または５アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（８）のアミノ酸配列を有するテトラペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。
【0019】
メダカではまた、ガストリンはペプチドホルモンであり、Ｃ末端の８個のアミノ酸残基からなる活性部位をもつ。この活性部位の８アミノ酸残基は式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（３）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（３）のアミノ酸配列を有するオクタペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。
【0020】
ウナギでは、ＣＣＫ遺伝子は２種類存在し、活性部位の８アミノ酸残基は、式（４）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１８）および式（５）ＤＹＶＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１９）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（４）または式（５）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（４）または式（５）のアミノ酸配列を有するオクタペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。
【0021】
チョウザメ類、例えば、コチョウザメにおいてもＣＣＫ遺伝子が存在し、活性部位の８アミノ酸残基は式（６）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号２０）および式（７）ＤＡＮＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２１）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（６）または式（７）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（６）または式（７）のアミノ酸配列を有するオクタペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。
【0022】
本明細書において、アミノ酸は以下の周知の３文字表記または１文字表記により特定することができる。
アラニン：Ａｌａ Ａ
アルギニン：Ａｒｇ Ｒ
アスパラギン：Ａｓｎ Ｎ
アスパラギン酸：Ａｓｐ Ｄ
システイン：Ｃｙｓ Ｃ
グルタミン：Ｇｌｎ Ｑ
グルタミン酸：Ｇｌｕ Ｅ
グリシン：Ｇｌｙ Ｇ
ヒスチジン：Ｈｉｓ Ｈ
イソロイシン：Ｉｌｅ Ｉ
ロイシン：Ｌｅｕ Ｌ
リシン：Ｌｙｓ Ｋ
メチオニン：Ｍｅｔ Ｍ
フェニルアラニン：Ｐｈｅ Ｆ
プロリン：Ｐｒｏ Ｐ
セリン：Ｓｅｒ Ｓ
トレオニン：Ｔｈｒ Ｔ
トリプトファン：Ｔｒｐ Ｗ
チロシン：Ｔｙｒ Ｙ
バリン：Ｖａｌ Ｖ
アラニン：Ａｌａ Ａ
アルギニン：Ａｒｇ Ｒ
アスパラギン：Ａｓｎ Ｎ
アスパラギン酸：Ａｓｐ Ｄ
システイン：Ｃｙｓ Ｃ
グルタミン：Ｇｌｎ Ｑ
グルタミン酸：Ｇｌｕ Ｅ
グリシン：Ｇｌｙ Ｇ
ヒスチジン：Ｈｉｓ Ｈ
イソロイシン：Ｉｌｅ Ｉ
ロイシン：Ｌｅｕ Ｌ
リシン：Ｌｙｓ Ｋ
メチオニン：Ｍｅｔ Ｍ
フェニルアラニン：Ｐｈｅ Ｆ
プロリン：Ｐｒｏ Ｐ
セリン：Ｓｅｒ Ｓ
トレオニン：Ｔｈｒ Ｔ
トリプトファン：Ｔｒｐ Ｗ
チロシン：Ｔｙｒ Ｙ
バリン：Ｖａｌ Ｖ
【0023】
本発明において「任意のアミノ酸」は上記の２０種のアミノ酸から選択することができる。また、アミノ酸配列により特定されたペプチドは向かって左側がＮ末端であり、右側がＣ末端である。また、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基がアミド化されている場合には、本明細書ではペプチドのＣ末端を「－ＮＨ２」と表記する。
【0024】
本発明においてＣＣＫおよびガストリンは、魚類等の生物素材から単離または精製（粗精製を含む）したものを使用しても、化学的に合成したものを使用してもよい。コスト的観点から化学的に合成したものが好ましい。また本発明においてペプチドを構成するアミノ酸はＬ－アミノ酸とすることができるが、Ｄ－アミノ酸等の非天然アミノ酸も使用することができる。
【0025】
本発明において、ＣＣＫ受容体作動剤は、ＣＣＫおよびガストリンとすることができ、ＣＣＫおよびガストリンとしては、脊椎動物のＣＣＫおよびガストリンが挙げられ、脊椎動物としてはヒト等の哺乳類、下位条鰭類および真骨魚類などの魚類が挙げられ、ヒトまたは魚類のＣＣＫまたはガストリンとすることができる。本発明においてＣＣＫおよびガストリンは、下位条鰭類および真骨魚類のＣＣＫおよびガストリンとすることができる。下位条鰭類としては、例えば、チョウザメ目魚類が挙げられる。真骨魚類としては、例えば、ウナギ目魚類、スズキ目魚類、、カレイ目魚類、ダツ目魚類、サケ目魚類、フグ目魚類、タラ目魚類、コイ目魚類が挙げられ、本発明においてＣＣＫおよびガストリンは、真骨魚類のＣＣＫおよびガストリンとすることができ、ウナギ目魚類、スズキ目魚類、チョウザメ目魚類、カレイ目魚類、ダツ目魚類、サケ目魚類、フグ目魚類、タラ目魚類およびコイ目魚類からなる群から選択される真骨魚類のＣＣＫおよびガストリンとすることができる。
【0026】
本発明においてＣＣＫおよびガストリンは、例えば、表１に示されるデータベースおよびアクセッション番号により特定されるアミノ酸配列を基準とすることができる。すなわち本発明においては、表１により特定される全長アミノ酸を有するペプチドに加え、該ペプチドのＣ末端から８残基のアミノ酸配列または該ペプチドのＣ末端から４残基のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは該ペプチドのＣ末端から８残基のアミノ酸配列からなるオクタペプチドまたは該ペプチドのＣ末端から４残基のアミノ酸配列からなるテトラペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。この場合、上記ペプチドのいずれにおいてもＣ末端アミノ酸残基はアミド化されており、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されたチロシン残基である。なお、表１に記載されていない生物種由来のＣＣＫおよびガストリン並びにそれらのＣ末端断片を含むペプチドを本発明においてＣＣＫ受容体作動剤として使用できることはいうまでもない。
【0027】
【表1】
【0028】
本発明においてＣＣＫ受容体作動剤の標的となるＣＣＫ受容体（ＣＣＫＲ）としては、例えば、脊椎動物のＣＣＫ受容体が挙げられ、脊椎動物としては下位条鰭類および真骨魚類などの魚類が挙げられるが、好ましくは生殖腺の発育促進の対象である魚類のＣＣＫ受容体とすることができる。例えば、生殖腺の発育促進の対象が下位条鰭類および真骨魚類である場合には、ＣＣＫ受容体を下位条鰭類および真骨魚類のＣＣＫ受容体Ａ（ＣＣＫＲＡ、ＣＣＫ１Ｒとも呼ばれる）およびＣＣＫ受容体Ｂ（ＣＣＫＲＢ、ＣＣＫ２Ｒとも呼ばれる）を含むＣＣＫ受容体とすることができ、好ましくは脳下垂体において発現するＣＣＫＲＡおよびＣＣＫＲＢからなる群から選択される１種以上とすることができる。ＣＣＫＲＢを複数有する種においては、ＣＣＫＲＢはいずれのＣＣＫＲＢ（動物種によっては、ＣＣＫＲＢ１およびＣＣＫＲＢ２等と呼ばれる場合がある）であってもよい。
【0029】
なお、ＣＣＫ－ＣＣＫＲファミリーの機能は脊椎動物を通じて保存されていることから（Sekiguchi, Handbook of Hormones, 2016 :177-178, e20B-1-e20B-3）、ＣＣＫ受容体作動剤のＦＳＨ細胞に対するＦＳＨホルモン放出の制御は、魚類全般で適応可能である。また、本発明の実施にあたっては適用対象の魚類の種と同じ種のＣＣＫまたはそのＣ末端ペプチドあるいはガストリンまたはそのＣ末端ペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができるが、本発明においては、適用対象の魚類の種とは異なる種のＣＣＫまたはそのＣ末端ペプチドあるいはガストリンまたはそのＣ末端ペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することもできる。
【0030】
本明細書において「生殖腺の発育促進」とは、生殖腺の発育を促進させることをいい、魚類においては卵胞の発育促進および卵母細胞の卵黄形成促進を含む意味である。生殖腺としては、卵巣および精巣が挙げられ、卵巣としては卵母細胞および卵胞（卵胞細胞）を含み、精巣としては精子、体細胞および生殖細胞を含む。
【0031】
後記実施例に示されるように、ＣＣＫ受容体作動剤はＦＳＨ放出促進作用を有する。魚類の卵巣では卵母細胞を取り囲む卵胞細胞の発育によって、卵母細胞の卵黄形成が促進されて卵母細胞が発育することが知られ、該卵胞の発育は、脳下垂体のＦＳＨ細胞から放出されたＦＳＨによって促進される（化学と生物、Ｖｏｌ．３９、Ｎｏ．１、２００１）。すなわち、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することにより、卵胞細胞の発育、卵母細胞の卵黄形成および生殖腺発育を促進することができる。
【0032】
本発明において魚類とは、特に限定されるものではなく、例えば硬骨魚類が挙げられ、好ましくは下位条鰭類および真骨魚類とすることができる。下位条鰭類としては、例えば、チョウザメ目魚類が挙げられ、チョウザメ目魚類としては、例えば、チョウザメが挙げられる。真骨魚類としては、例えば、ウナギ目魚類、スズキ目魚類、カレイ目魚類、ダツ目魚類、サケ目魚類、フグ目魚類、タラ目魚類、コイ目魚類が挙げられ、これらの魚類としては、ウナギ、マグロ、ブリ、シマアジ、アジ、ハタ、タイ、スズキ、ヒラメ、メダカ、サケ、フグ、タラ、ゼブラフィッシュが挙げられる。また、本発明において魚類は養殖魚とすることができる。
【0033】
本発明の剤は魚類の生殖腺の発育を促進するホルモン剤としての側面を持つことから、水産用医薬品、飼料添加物等の形態で提供することができ、下記の記載に従って実施することができる。
【0034】
本発明においてＣＣＫ受容体作動剤は、魚類に経口投与することができる。ＣＣＫ受容体作動剤を含む剤を経口投与する場合は、ＣＣＫ受容体作動剤は飼料添加物として飼料の原料の形態であってもよい。
【0035】
本発明においてＣＣＫ受容体作動剤は、魚類に投与することができる。投与形態としては、例えば、注射による腹腔内、皮下または筋肉への注入投与、浸透圧ポンプによる持続投与および経口投与が挙げられる。ＣＣＫ受容体作動剤を含む剤を注入投与する場合は、ＣＣＫ受容体作動剤を生理食塩水に溶解させた液状組成物を調製し、該組成物を注射器により投与することができる。ＣＣＫ受容体作動剤を含む剤を浸透圧ポンプあるいはアジュバントにより持続投与する場合は、公知の方法により投与することができ、例えば、ＣＣＫ受容体作動剤をリン酸緩衝液に溶解させた組成物を市販の浸透圧ポンプにセットし、該浸透圧ポンプを腹腔内に埋め込むこと、あるいは、ＣＣＫ受容体作動剤をアジュバントに混合した組成物として投与することで、より持続的な投与をすることができる。
【0036】
本発明の剤の１日当たりの投与量は、対象魚類の魚種、年齢、体重、用途等によって異なるため、特に限定されない。生殖腺発育促進を目的とする投与の場合、成体１回当たりのＣＣＫ受容体作動剤の投与量（固形分換算）は、特に制限されないが、その下限は、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ・日または０．０１ｍｇ／ｋｇ・日とすることができる。また、その上限は、例えば、１００ｍｇ／ｋｇ・日、５０ｍｇ／ｋｇ・日、１０ｍｇ／ｋｇ・日または５ｍｇ／ｋｇ・日とすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができる。また、投与の回数および頻度は、求められる生殖腺発育促進の程度に応じて適宜定めることができる。投与量ならびに投与間隔は、例えば、１日当たり１回、１週当たり１回とすることができる。本発明の剤はその効果をよりよく発揮させるために、投与期間は好ましくは２週間以上、より好ましくは３週間または４週間以上である。
【0037】
本発明の剤は、他の投与できる組成物や剤と併用することに制限はない。例えば、生殖腺発育促進が期待できる素材や組成物と併用することで、生殖腺発育促進効果をさらに高めることができる。例えばまた、ＧｎＲＨ／ＬＨＲＨ、ＬＨおよびｈＣＧ等の卵の最終成熟・排卵を誘発する成分と組み合わせて用いることで、成熟した卵を適切に得ることができる。
【0038】
本明細書において「卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進」とは、脳下垂体のＦＳＨ細胞におけるＦＳＨの放出を促進させることをいう。本発明の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進剤は、本発明の生殖腺発育促進剤の記載に従って実施することができる。
【0039】
前述の通り、ＣＣＫ受容体作動剤はＦＳＨ放出促進作用を有するため、魚類卵母細胞の卵黄形成を促進する。従って、ＣＣＫ受容体作動剤は魚類卵母細胞の卵黄形成促進剤の有効成分として使用することができる。
【0040】
すなわち、本発明によれば、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、魚類卵母細胞の卵黄形成促進方法が提供される。本発明において「魚類卵母細胞の卵黄形成促進」とは、魚類の卵母細胞における卵黄形成を促進させることをいう。本発明の方法を実施する場合には魚類に有効量のＣＣＫ受容体作動剤を投与することにより実施することができる。魚類としては前記したものが挙げられ、好ましくは、ウナギまたはチョウザメとすることができる。本発明の卵黄形成促進方法は、本発明の生殖腺発育促進剤の記載に従って実施することができる。
【0041】
前述の通り、ＣＣＫ受容体作動剤はＦＳＨ放出促進作用を有するため、魚類の生殖腺の発育を促進する。従って、ＣＣＫ受容体作動剤は生殖腺の発育が促進された魚類の生産に用いる薬剤の有効成分として使用することができる。
【0042】
すなわち、本発明によれば、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、生殖腺の発育が促進された魚類の生産方法が提供される。本発明の生産方法を実施する場合には魚類に有効量のＣＣＫ受容体作動剤を投与することにより実施することができる。魚類としては前記したものが挙げられ、好ましくは、ウナギまたはチョウザメとすることができる。本発明の魚類の生産方法は、本発明の生殖腺発育促進剤の記載に従って実施することができる。
【0043】
本発明によれば、本発明の生産方法を実施して生殖腺の発育が促進された魚類を生産し、次いで、生殖腺の発育が促進された魚類から卵を採取することができる。卵母細胞の最終成熟・排卵および卵の採取は公知の方法により行うことができる。
【0044】
すなわち、本発明によれば、本発明の生産方法を実施して生殖腺の発育が促進された魚類を生産し、次いで、生殖腺の発育が促進された魚類から卵を採取する、魚類の卵の採取方法が提供される。卵の採取方法は、卵母細胞の最終成熟および排卵させる工程を含むものとすることができる。魚類としては前記したものが挙げられ、好ましくは、ウナギまたはチョウザメとすることができる。本発明の魚類の卵の採取方法は、本発明の生殖腺発育促進剤および本発明の生産方法の記載に従って実施することができる。
【0045】
本発明によれば、本発明の卵の採取方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵は人工受精させることができ、人工受精により受精卵を生産することができる。卵の人工受精は公知の方法により行うことができる。
【0046】
すなわち、本発明によれば、本発明の卵の採取方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させることを含む、魚類の受精卵の生産方法が提供される。魚類としては前記した魚類が挙げられ、好ましくは、ウナギまたはチョウザメとすることができる。本発明の魚類の受精卵の生産方法は、本発明の生殖腺発育促進剤、本発明の生産方法および本発明の魚類の卵の採取方法の記載に従って実施することができる。
【0047】
本発明の卵の採取方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させることができ、さらに得られた受精卵を孵化させることにより、仔魚を生産することができる。仔魚の生産は公知の方法により行うことができる。
【0048】
すなわち、本発明によれば、本発明の卵の採取方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させ、さらに得られた受精卵を孵化させることを含む、魚類の仔魚の生産方法が提供される。魚類としては前記した魚類が挙げられ、好ましくは、ウナギまたはチョウザメとすることができる。本発明の卵の採取方法は、本発明の生殖腺発育促進剤、本発明の生産方法および本発明の魚類の卵の採取方法の記載に従って実施することができる。
【0049】
前述の通り、ＣＣＫ受容体作動剤はＦＳＨ放出促進作用を有するため、魚類の生殖腺の発育を促進する。従って、ＣＣＫ受容体作動剤は早期催熟された魚類の生産に用いる薬剤の有効成分として使用することができる。
【0050】
すなわち、本発明の魚類の生産方法の好ましい態様によれば、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、早期催熟された魚類の生産方法が提供される。本明細書において「早期催熟」とは、生殖腺の発育を促進させて性成熟を早めることをいう。本発明の生産方法を実施する場合には魚類に有効量のＣＣＫ受容体作動剤を投与することにより実施することができる。魚類としては前記したものが挙げられ、好ましくは、ウナギまたはチョウザメとすることができる。本発明の早期催熟された魚類の生産方法は、本発明の生殖腺発育促進剤および本発明の生産方法の記載に従って実施することができる。
【実施例0051】
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【0052】
例１：ＦＳＨ細胞におけるＣＣＫ受容体（ＣＣＫＲＢ１）発現および視床下部からのＣＣＫ入力の検証
例１では、ＦＳＨ細胞がＣＣＫ受容体を発現すること、また、ＦＳＨ細胞がＣＣＫニューロンの入力を受けることを検証した。
例１では、ＦＳＨ細胞がＣＣＫ受容体を発現すること、また、ＦＳＨ細胞がＣＣＫニューロンの入力を受けることを検証した。
【0053】
（１）方法
ア 二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法
メダカ成体をエチル３－アミノベンゾエートメタンスルホン酸塩（ＭＳ－２２２；０．０２％、Ｓｉｇｍａ）によって麻酔処理（以下、同様）した後、脳を摘出して４％ＰＦＡ／ＰＢＳにより４℃で固定し、次いで３０％スクロース／ＰＢＳに置換した。次いで、固定した脳を５％低融点アガロース（Ｔｙｐｅ ＩＸ、Sigma）・２０％スクロース／ＰＢＳにより包埋し、－８０℃に冷却したｎ－ヘキサンで凍結した後、クリオスタット（ＣＭ３０５０ Ｓ、Leica、Wetzlar, Germany）を用いて２５μｍ厚の脳凍結切片を作製した（Umatani et al., In: d'Angelo L, Girolamo Pd, eds. Laboratory Fish in Biomedical Research. Amsterdam: Elsevier; 2021:215-243.）。イン・サイチュハイブリダイゼーション法は、ＤＩＧラベルＣＣＫＲＢ１プローブおよびフルオレセインラベルＦＳＨｂプローブを用い、従来の方法に従って行った（Kanda et al., PLoS One. 2013; 8(4): e62776.）。なお、ＦＳＨｂ遺伝子はＦＳＨホルモンをコードし、ＣＣＫＲＢ１遺伝子はＣＣＫＲＢ１をコードする。それぞれのプローブ、ラベルされたプローブに対する抗体による標識の後、ＴＳＡ増感（ＴＳＡ ｐｌｕｓ ｂｉｏｔｉｎまたはｃｙ３、Perkin Elmer/Akoya）を行い、ＴＳＡ－ビオチンでラベルされたＣＣＫＲＢ１ ＤＩＧプローブは、ストレプトアビジンＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲートにより可視化した。両者のペルオキシダーゼ活性の検出の間に３％過酸化水素水による３０分間の処理を行い、シグナルの誤検出を防いだ。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とｃｙ３の蛍光（それぞれＣＣＫＲＢ１ ｍＲＮＡ、ＦＳＨｂ ｍＲＮＡを標識）を、共焦点顕微鏡（ＦＶ－１０００、オリンパス）により観察した。
ア 二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法
メダカ成体をエチル３－アミノベンゾエートメタンスルホン酸塩（ＭＳ－２２２；０．０２％、Ｓｉｇｍａ）によって麻酔処理（以下、同様）した後、脳を摘出して４％ＰＦＡ／ＰＢＳにより４℃で固定し、次いで３０％スクロース／ＰＢＳに置換した。次いで、固定した脳を５％低融点アガロース（Ｔｙｐｅ ＩＸ、Sigma）・２０％スクロース／ＰＢＳにより包埋し、－８０℃に冷却したｎ－ヘキサンで凍結した後、クリオスタット（ＣＭ３０５０ Ｓ、Leica、Wetzlar, Germany）を用いて２５μｍ厚の脳凍結切片を作製した（Umatani et al., In: d'Angelo L, Girolamo Pd, eds. Laboratory Fish in Biomedical Research. Amsterdam: Elsevier; 2021:215-243.）。イン・サイチュハイブリダイゼーション法は、ＤＩＧラベルＣＣＫＲＢ１プローブおよびフルオレセインラベルＦＳＨｂプローブを用い、従来の方法に従って行った（Kanda et al., PLoS One. 2013; 8(4): e62776.）。なお、ＦＳＨｂ遺伝子はＦＳＨホルモンをコードし、ＣＣＫＲＢ１遺伝子はＣＣＫＲＢ１をコードする。それぞれのプローブ、ラベルされたプローブに対する抗体による標識の後、ＴＳＡ増感（ＴＳＡ ｐｌｕｓ ｂｉｏｔｉｎまたはｃｙ３、Perkin Elmer/Akoya）を行い、ＴＳＡ－ビオチンでラベルされたＣＣＫＲＢ１ ＤＩＧプローブは、ストレプトアビジンＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲートにより可視化した。両者のペルオキシダーゼ活性の検出の間に３％過酸化水素水による３０分間の処理を行い、シグナルの誤検出を防いだ。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とｃｙ３の蛍光（それぞれＣＣＫＲＢ１ ｍＲＮＡ、ＦＳＨｂ ｍＲＮＡを標識）を、共焦点顕微鏡（ＦＶ－１０００、オリンパス）により観察した。
【0054】
イ 免疫組織化学
上記の二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法に記載の方法によりメダカ成体脳の凍結切片を作成し、抗ヒトＣＣＫ抗体（Ｃ２５８１、sigma-aldrich）により標識した。具体的には、８０度に加熱した抗原賦活液（ＨｉｓｔｏＶＴ Ｏｎｅ）内で抗原賦活化処理を１５分間行った後、１０％正常ヤギ血清を含むＰＢＳで１／５，０００倍に希釈したＣＣＫ抗体を添加した。次いで、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Vector laboratory）により標識した後、ＡＢＣキット（Vector laboratory）で増感し、ストレプトアビジンａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲートで蛍光標識した。サンプルを封入した後、共焦点顕微鏡（ＦＶ－１０００、オリンパス）により観察した。
上記の二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法に記載の方法によりメダカ成体脳の凍結切片を作成し、抗ヒトＣＣＫ抗体（Ｃ２５８１、sigma-aldrich）により標識した。具体的には、８０度に加熱した抗原賦活液（ＨｉｓｔｏＶＴ Ｏｎｅ）内で抗原賦活化処理を１５分間行った後、１０％正常ヤギ血清を含むＰＢＳで１／５，０００倍に希釈したＣＣＫ抗体を添加した。次いで、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Vector laboratory）により標識した後、ＡＢＣキット（Vector laboratory）で増感し、ストレプトアビジンａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲートで蛍光標識した。サンプルを封入した後、共焦点顕微鏡（ＦＶ－１０００、オリンパス）により観察した。
【0055】
（２）結果
結果は、図１および図２に示す通りであった。図１では、二重イン・サイチュハイブリダイゼーションにより、メダカ成体において、ＦＳＨを発現する脳下垂体の細胞（本明細書において「ＦＳＨ細胞」ということがある）が、ＣＣＫ受容体であるＣＣＫＲＢ１遺伝子を発現していることが確認された（図１）。この結果から、ＦＳＨ細胞はＣＣＫＲＢ１を介して何らかの作用を受けることが示唆された。図２では、ＣＣＫ抗体を用いた免疫組織化学により、視床下部ＮＶＴ領域においてＣＣＫを発現するニューロン（本明細書において「ＣＣＫニューロン」ということがある）が局在すること、また、脳下垂体においてＣＣＫ免疫陽性である神経線維が密に存在することが確認された（図２）。なお、視床下部ＮＶＴ領域におけるＣＣＫニューロンの位置は、イン・サイチュハイブリダイゼーションにより確認されるＣＣＫＡおよびＣＣＫＢ ｍＲＮＡの局在と一致することが確認された（データ示さず）。以上の結果から、ＦＳＨ細胞は、視床下部のＣＣＫニューロンからの支配を受けるとともに、ＣＣＫをＦＳＨ細胞が発現するＣＣＫＲＢ１で受容していることが示された。なお、メダカには、ＣＣＫＡ遺伝子およびＣＣＫＢ遺伝子の２つのＣＣＫ遺伝子がありいずれも視床下部で発現しているが、ＣＣＫＡおよびＣＣＫＢペプチドにおいて活性を示す８アミノ酸残基である式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）のアミノ酸配列を有するメダカＣＣＫ－８は共通する。
結果は、図１および図２に示す通りであった。図１では、二重イン・サイチュハイブリダイゼーションにより、メダカ成体において、ＦＳＨを発現する脳下垂体の細胞（本明細書において「ＦＳＨ細胞」ということがある）が、ＣＣＫ受容体であるＣＣＫＲＢ１遺伝子を発現していることが確認された（図１）。この結果から、ＦＳＨ細胞はＣＣＫＲＢ１を介して何らかの作用を受けることが示唆された。図２では、ＣＣＫ抗体を用いた免疫組織化学により、視床下部ＮＶＴ領域においてＣＣＫを発現するニューロン（本明細書において「ＣＣＫニューロン」ということがある）が局在すること、また、脳下垂体においてＣＣＫ免疫陽性である神経線維が密に存在することが確認された（図２）。なお、視床下部ＮＶＴ領域におけるＣＣＫニューロンの位置は、イン・サイチュハイブリダイゼーションにより確認されるＣＣＫＡおよびＣＣＫＢ ｍＲＮＡの局在と一致することが確認された（データ示さず）。以上の結果から、ＦＳＨ細胞は、視床下部のＣＣＫニューロンからの支配を受けるとともに、ＣＣＫをＦＳＨ細胞が発現するＣＣＫＲＢ１で受容していることが示された。なお、メダカには、ＣＣＫＡ遺伝子およびＣＣＫＢ遺伝子の２つのＣＣＫ遺伝子がありいずれも視床下部で発現しているが、ＣＣＫＡおよびＣＣＫＢペプチドにおいて活性を示す８アミノ酸残基である式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）のアミノ酸配列を有するメダカＣＣＫ－８は共通する。
【0056】
例２：ＣＣＫに対するＣＣＫＲＢ１活性の検証
例２では、ＣＣＫに対するＣＣＫＲＢ１の活性をＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイにより検証した。
例２では、ＣＣＫに対するＣＣＫＲＢ１の活性をＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイにより検証した。
【0057】
（１）方法
ＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイ
表２に示すメダカＣＣＫＢＲ１遺伝子のコード配列（配列番号１）を、Ｋｏｚａｋ配列を含む下記プライマーを用いてメダカ脳ｃＤＮＡにおいてＰＣＲ法により増幅した。
ＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイ
表２に示すメダカＣＣＫＢＲ１遺伝子のコード配列（配列番号１）を、Ｋｏｚａｋ配列を含む下記プライマーを用いてメダカ脳ｃＤＮＡにおいてＰＣＲ法により増幅した。
【0058】
【表2】
【0059】
＜メダカＣＣＫＢＲ１用プライマー＞
フォワード（配列番号２）：CTTGCCGCCATGGATACTTTGAGAAACGAGAC
リバース（配列番号３）：CTCTCAGCAGTTTCCCATGGTG
フォワード（配列番号２）：CTTGCCGCCATGGATACTTTGAGAAACGAGAC
リバース（配列番号３）：CTCTCAGCAGTTTCCCATGGTG
【0060】
増幅したＣＣＫＢＲ１遺伝子コード配列をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯにクローニングすることにより、ＣＣＫＲＢ１発現ベクターを構築した。次いで、Ｈｅｌａ細胞に、ＣＣＫＲＢ１発現ベクターと、ｃＡＭＰ測定用コンストラクト（ｐＧＬ４．２９）、Ｃａ２＋測定用コンストラクト（ｐＧＬ４．３０）またはＭＡＰＫ測定用コンストラクト（ｐＧＬ４．３３）と、コントロールベクター（ｐＧＬ４．７４）との３つのコンストラクトをトランスフェクションし４２時間インキュベーションを行った。次いで、Ｈｅｌａ細胞を、０、１０－１１、１０－１０、１０－９、１０－８、１０－７、１０－６または１０－５Ｍの濃度の式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４、スクラム社受託合成品）のアミノ酸配列を有するメダカＣＣＫ－８または式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５、スクラム社受託合成品）のアミノ酸配列を有するメダカガストリン－８とそれぞれ６時間反応させた後、細胞を回収し、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。測定用ホタルベクター（ｐＧＬ４．２９、ｐＧＬ４．３０またはｐＧＬ４．３３）のシグナルを、コントロールベクター（ｐＧＬ４．７４）のシグナルで補正した。なお、本試験ではＣＣＫ受容体ファミリーのリガンドとなるＣＣＫ－８およびガストリン－８は、多くの魚類で保存されている活性部位である８アミノ酸残基（式（Ａ））に含まれるペプチドを用いた。
【0061】
（２）結果
結果は、図３に示す通りであった。図３では、ＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイにより、メダカＣＣＫ－８およびメダカガストリン－８のいずれのペプチドも、ＣＣＫＲＢ１を介してｃＡＭＰ、Ｃａ２＋およびＭＡＰＫに対応するレポーターを生理的な濃度で賦活することが確認された。この結果は、哺乳類や鳥類などのＣＣＫＲＢで報告されている結果と整合することから、脊椎動物全般においてＣＣＫはＣＣＫＲＢに作用することが示された（Wan et al., Poult Sci. 2023 Jan;102(1):102273.、Zeng Q, Ou L, Wang W, Guo DY. Front Endocrinol (Lausanne). 2020 Mar 6;11:112.）。
結果は、図３に示す通りであった。図３では、ＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイにより、メダカＣＣＫ－８およびメダカガストリン－８のいずれのペプチドも、ＣＣＫＲＢ１を介してｃＡＭＰ、Ｃａ２＋およびＭＡＰＫに対応するレポーターを生理的な濃度で賦活することが確認された。この結果は、哺乳類や鳥類などのＣＣＫＲＢで報告されている結果と整合することから、脊椎動物全般においてＣＣＫはＣＣＫＲＢに作用することが示された（Wan et al., Poult Sci. 2023 Jan;102(1):102273.、Zeng Q, Ou L, Wang W, Guo DY. Front Endocrinol (Lausanne). 2020 Mar 6;11:112.）。
【0062】
例３：ＣＣＫＲＢ１ノックアウトが生殖腺発育およびＦＳＨ ｍＲＮＡ発現に与える影響の検証
例３では、ＣＣＫＲＢ１ノックアウトが生殖腺発育およびＦＳＨ ｍＲＮＡ発現に与える影響を検証した。
例３では、ＣＣＫＲＢ１ノックアウトが生殖腺発育およびＦＳＨ ｍＲＮＡ発現に与える影響を検証した。
【0063】
（１）方法
ア ＣＣＫＲＢ１のノックアウト個体の作製および表現型の検証
ＣＣＫＲＢ１の第一エキソンに対するＣＲＩＳＰＲ（配列番号７：AAGCGTGGACGGGTTCACGCAGG）を設計し、Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ（Cas9 Nuclease protein NLS（１５μｇ／μｌ）、ニッポンジーン）およびｔｒａｃｒ ＲＮＡ（ＦＡＳＭＡＣ）とともに、１－２細胞期のメダカ胚にマイクロインジェクションした。該メダカ胚から発生した成体の交配後に得られた個体から、GAACCCGTの８塩基欠失を示すアリルを得て、野生型遺伝子座との交配を行い、系統化した。同腹由来の野生型、ヘテロノックアウト個体およびホモノックアウト個体について、卵巣および精巣の形態観察並びに脳下垂体におけるＦＳＨｂ ｍＲＮＡの発現解析を逆転写リアルタイムＰＣＲ法により行った。
ア ＣＣＫＲＢ１のノックアウト個体の作製および表現型の検証
ＣＣＫＲＢ１の第一エキソンに対するＣＲＩＳＰＲ（配列番号７：AAGCGTGGACGGGTTCACGCAGG）を設計し、Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ（Cas9 Nuclease protein NLS（１５μｇ／μｌ）、ニッポンジーン）およびｔｒａｃｒ ＲＮＡ（ＦＡＳＭＡＣ）とともに、１－２細胞期のメダカ胚にマイクロインジェクションした。該メダカ胚から発生した成体の交配後に得られた個体から、GAACCCGTの８塩基欠失を示すアリルを得て、野生型遺伝子座との交配を行い、系統化した。同腹由来の野生型、ヘテロノックアウト個体およびホモノックアウト個体について、卵巣および精巣の形態観察並びに脳下垂体におけるＦＳＨｂ ｍＲＮＡの発現解析を逆転写リアルタイムＰＣＲ法により行った。
【0064】
イ ＦＳＨｂ ｍＲＮＡの逆転写リアルタイムＰＣＲによる発現解析
メダカ成体を麻酔処理し、脳下垂体を摘出した後、ＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）を用いて脳下垂体からトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ）を用いて逆転写し、ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）および下記プライマーを用いてＦＳＨｂ ｍＲＮＡおよび内部標準としてのａｃｔｂ ｍＲＮＡの定量的ＰＣＲを行った。
メダカ成体を麻酔処理し、脳下垂体を摘出した後、ＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）を用いて脳下垂体からトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ）を用いて逆転写し、ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）および下記プライマーを用いてＦＳＨｂ ｍＲＮＡおよび内部標準としてのａｃｔｂ ｍＲＮＡの定量的ＰＣＲを行った。
【0065】
＜ＦＳＨｂ用プライマー＞
フォワード（配列番号８）：TGGAGATCTACAGGCGTCGGTAC
リバース（配列番号９）：AGCTCTCCACAGGGATGCTG
＜ａｃｔｂ用プライマー＞
フォワード（配列番号１０）：GTGATGTTGATATCCGTAAGGATCTGTA
リバース（配列番号１１）：TCTGGTGGGGCAATGATCTTGA
フォワード（配列番号８）：TGGAGATCTACAGGCGTCGGTAC
リバース（配列番号９）：AGCTCTCCACAGGGATGCTG
＜ａｃｔｂ用プライマー＞
フォワード（配列番号１０）：GTGATGTTGATATCCGTAAGGATCTGTA
リバース（配列番号１１）：TCTGGTGGGGCAATGATCTTGA
【0066】
（２）結果
結果は、図４に示す通りであった。図４Ａでは、野生型およびＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体における生殖腺の表現型解析により、ＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体では野生型と比較して、卵巣および精巣の大きさが著しく小さくなることが確認された。卵巣重（体重比）を測定したところ、ＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体では野生型と比較して、７分の１へ減少した。この結果から、ＣＣＫＲＢ１ノックアウトにより卵巣において卵胞および卵母細胞の発達が阻害されることが示された。この結果はまた、ＦＳＨ（ＦＳＨｂ遺伝子）のノックアウトメダカ個体において生殖腺の大きさが著しく小さくなるという研究結果と類似していることから、ＣＣＫＲＢ１のノックアウトによりＦＳＨの分泌が阻害されることが示された（Takahashi et al., Endocrinology, Volume 157, Issue 10, 1 October 2016, Pages 3994-4002)。上記を確認するため、図４Ｂでは、ＣＣＫＲＢ１ノックアウト個体の脳下垂体におけるＦＳＨｂ ｍＲＮＡ発現の逆転写リアルタイムＰＣＲ法により、ＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体ではヘテロノックアウト個体と比較して、ＦＳＨ遺伝子発現が４００分の１へ著しく低下することが確認された。これらの結果はまた、ＣＣＫＡおよびＣＣＫＢのダブルノックアウトメダカ個体において卵巣およびＦＳＨ発現が著しく阻害されるという結果と非常に類似する（データ示さず）。これらの結果から、メダカ生体内においてＣＣＫＲＢ１が卵巣において卵胞発育および卵母細胞の発達（すなわち、卵黄形成）を促すＦＳＨの正常な発現に必須であることが示された。
結果は、図４に示す通りであった。図４Ａでは、野生型およびＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体における生殖腺の表現型解析により、ＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体では野生型と比較して、卵巣および精巣の大きさが著しく小さくなることが確認された。卵巣重（体重比）を測定したところ、ＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体では野生型と比較して、７分の１へ減少した。この結果から、ＣＣＫＲＢ１ノックアウトにより卵巣において卵胞および卵母細胞の発達が阻害されることが示された。この結果はまた、ＦＳＨ（ＦＳＨｂ遺伝子）のノックアウトメダカ個体において生殖腺の大きさが著しく小さくなるという研究結果と類似していることから、ＣＣＫＲＢ１のノックアウトによりＦＳＨの分泌が阻害されることが示された（Takahashi et al., Endocrinology, Volume 157, Issue 10, 1 October 2016, Pages 3994-4002)。上記を確認するため、図４Ｂでは、ＣＣＫＲＢ１ノックアウト個体の脳下垂体におけるＦＳＨｂ ｍＲＮＡ発現の逆転写リアルタイムＰＣＲ法により、ＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体ではヘテロノックアウト個体と比較して、ＦＳＨ遺伝子発現が４００分の１へ著しく低下することが確認された。これらの結果はまた、ＣＣＫＡおよびＣＣＫＢのダブルノックアウトメダカ個体において卵巣およびＦＳＨ発現が著しく阻害されるという結果と非常に類似する（データ示さず）。これらの結果から、メダカ生体内においてＣＣＫＲＢ１が卵巣において卵胞発育および卵母細胞の発達（すなわち、卵黄形成）を促すＦＳＨの正常な発現に必須であることが示された。
【0067】
例４：ＣＣＫ受容体作動剤がＦＳＨ細胞におけるＦＳＨ放出に与える影響の検証
例４では、一般的にホルモンの放出は細胞内カルシウムの上昇によって引き起こされるため、ＣＣＫ受容体作動剤がＦＳＨの放出を促す可能性を検証するために、カルシウムイメージング実験により、ＣＣＫ受容体作動剤が細胞内カルシウムに与える影響を検証した。
例４では、一般的にホルモンの放出は細胞内カルシウムの上昇によって引き起こされるため、ＣＣＫ受容体作動剤がＦＳＨの放出を促す可能性を検証するために、カルシウムイメージング実験により、ＣＣＫ受容体作動剤が細胞内カルシウムに与える影響を検証した。
【0068】
（１）方法
ＦＳＨ細胞のカルシウムイメージング解析
カルシウムインジケーターであるｉｎｖｅｒｓｅ ｐｅｒｉｃａｍをＦＳＨ細胞特異的に発現するトランスジェニックメダカ（Karigo et al., Endocrinology, Volume 155, 2014, 536-547、本明細書において「ＦＳＨ－ＩＰトランスジェニックメダカ」ということがある）を用いて、ＣＣＫ受容体作動剤に対する反応性および用量応答性をカルシウムイメージングにより試験した。ＦＳＨ－ＩＰトランスジェニックメダカを麻酔処理した後、脳下垂体を摘出し、灌流チューブへのペプチド吸着防止のために０．１％ＢＳＡを含む人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ、１３４ｍＭ ＮａＣｌ；２．９ｍＭ ＫＣｌ；２．１ｍＭ ＣａＣｌ２；１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１５ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４）を満たしたチャンバーに移し、脳下垂体の腹側を上面にして露出した。次いで、チャンバー内に式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６、ペプチド研究所）のアミノ酸配列を有するヒトＣＣＫ－８、式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４、スクラム社受託合成品）のアミノ酸配列を有するメダカＣＣＫ－８、式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５、スクラム社受託合成品）のアミノ酸配列を有するメダカガストリン－８または式（８）ＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２２、ペプチド研究所）のアミノ酸配列を有するメダカＣＣＫ－４を含む上記ＡＣＳＦ溶液を灌流し、灌流投与時の蛍光強度の変化を、各ペプチドがＦＳＨ細胞の細胞内カルシウム濃度へ与える影響として解析した。各ペプチドの潅流投与の濃度は、反応性試験では１０００ｎＭとし、用量応答性試験では０ｎＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１０００Ｍの濃度とした。なお、式（１）のペプチドは終濃度０．１％のＤＭＳＯに溶解しているため、灌流時に使用したＡＣＳＦ溶液には同濃度のＤＭＳＯを含ませた。カルシウムイメージングは、正立蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００ＦＮ、Nikon）および励起光（Ｘ－Ｃｉｔｅ １１０ＬＥＤ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Excelitas Technologies）を用いて行い、蛍光画像はＺｙｌａ４．２Ｐ（Andor Technology）およびイメージングソフトウェア（Micro Manager）を用いて、ｅｘｐｏｓｕｒｅ：５０ｍｓ；ｉｎｔｅｒｖａｌ １００ｍｓにて撮影し、取得したイメージ画像をＩｍａｇｅ Ｊにより解析した。
ＦＳＨ細胞のカルシウムイメージング解析
カルシウムインジケーターであるｉｎｖｅｒｓｅ ｐｅｒｉｃａｍをＦＳＨ細胞特異的に発現するトランスジェニックメダカ（Karigo et al., Endocrinology, Volume 155, 2014, 536-547、本明細書において「ＦＳＨ－ＩＰトランスジェニックメダカ」ということがある）を用いて、ＣＣＫ受容体作動剤に対する反応性および用量応答性をカルシウムイメージングにより試験した。ＦＳＨ－ＩＰトランスジェニックメダカを麻酔処理した後、脳下垂体を摘出し、灌流チューブへのペプチド吸着防止のために０．１％ＢＳＡを含む人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ、１３４ｍＭ ＮａＣｌ；２．９ｍＭ ＫＣｌ；２．１ｍＭ ＣａＣｌ２；１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１５ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４）を満たしたチャンバーに移し、脳下垂体の腹側を上面にして露出した。次いで、チャンバー内に式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６、ペプチド研究所）のアミノ酸配列を有するヒトＣＣＫ－８、式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４、スクラム社受託合成品）のアミノ酸配列を有するメダカＣＣＫ－８、式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５、スクラム社受託合成品）のアミノ酸配列を有するメダカガストリン－８または式（８）ＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２２、ペプチド研究所）のアミノ酸配列を有するメダカＣＣＫ－４を含む上記ＡＣＳＦ溶液を灌流し、灌流投与時の蛍光強度の変化を、各ペプチドがＦＳＨ細胞の細胞内カルシウム濃度へ与える影響として解析した。各ペプチドの潅流投与の濃度は、反応性試験では１０００ｎＭとし、用量応答性試験では０ｎＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１０００Ｍの濃度とした。なお、式（１）のペプチドは終濃度０．１％のＤＭＳＯに溶解しているため、灌流時に使用したＡＣＳＦ溶液には同濃度のＤＭＳＯを含ませた。カルシウムイメージングは、正立蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００ＦＮ、Nikon）および励起光（Ｘ－Ｃｉｔｅ １１０ＬＥＤ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Excelitas Technologies）を用いて行い、蛍光画像はＺｙｌａ４．２Ｐ（Andor Technology）およびイメージングソフトウェア（Micro Manager）を用いて、ｅｘｐｏｓｕｒｅ：５０ｍｓ；ｉｎｔｅｒｖａｌ １００ｍｓにて撮影し、取得したイメージ画像をＩｍａｇｅ Ｊにより解析した。
【0069】
（２）結果
結果は、図５に示す通りであった。図５Ａおよび図５Ｂでは、メダカＣＣＫ－８およびメダカＣＣＫ－４の投与に対する反応性をカルシウムイメージング解析したところ、１０００ｎＭのメダカＣＣＫ－８およびメダカＣＣＫ－４がＦＳＨ細胞の細胞内カルシウムを著しく上昇させることが確認された。図５Ｃでは、メダカＣＣＫ－８の投与に対する用量応答性をカルシウムイメージング解析したところ、メダカＣＣＫ－８の濃度に依存してＦＳＨ細胞の細胞内カルシウムが上昇することが確認された。なお、ヒトＣＣＫ－８およびメダカガストリン－８に対しても同様の反応性が観察された（データ示さず）。これらの結果から、ＣＣＫ－８およびガストリン－８がＦＳＨ細胞のＦＳＨホルモン放出を促進する作用を有すること、また、ＣＣＫ－４であっても上記作用を有することが示された。
結果は、図５に示す通りであった。図５Ａおよび図５Ｂでは、メダカＣＣＫ－８およびメダカＣＣＫ－４の投与に対する反応性をカルシウムイメージング解析したところ、１０００ｎＭのメダカＣＣＫ－８およびメダカＣＣＫ－４がＦＳＨ細胞の細胞内カルシウムを著しく上昇させることが確認された。図５Ｃでは、メダカＣＣＫ－８の投与に対する用量応答性をカルシウムイメージング解析したところ、メダカＣＣＫ－８の濃度に依存してＦＳＨ細胞の細胞内カルシウムが上昇することが確認された。なお、ヒトＣＣＫ－８およびメダカガストリン－８に対しても同様の反応性が観察された（データ示さず）。これらの結果から、ＣＣＫ－８およびガストリン－８がＦＳＨ細胞のＦＳＨホルモン放出を促進する作用を有すること、また、ＣＣＫ－４であっても上記作用を有することが示された。
【0070】
例５：メダカ以外の魚類の脳下垂体におけるＣＣＫＲＢ発現の検証
例５では、逆転写ＰＣＲ法によってメダカ以外の魚類（ウナギおよびチョウザメ）の脳下垂体においてＣＣＫＲＢの発現を検証した。
例５では、逆転写ＰＣＲ法によってメダカ以外の魚類（ウナギおよびチョウザメ）の脳下垂体においてＣＣＫＲＢの発現を検証した。
【0071】
（１）方法
ア ＣＣＫＢＲ１ ｍＲＮＡのＰＣＲ法による発現解析
未成熟個体のニホンウナギ（約２００～２６０ｇ）および未成熟個体のチョウザメ（１４０～２００ｇ）から例３（１）イに記載の方法と同様にして脳下垂体トータルＲＮＡの抽出および逆転写を行い、下記プライマーを用いてＣＣＫＲＢの増幅の可否をＰＣＲ法により検証した。
ア ＣＣＫＢＲ１ ｍＲＮＡのＰＣＲ法による発現解析
未成熟個体のニホンウナギ（約２００～２６０ｇ）および未成熟個体のチョウザメ（１４０～２００ｇ）から例３（１）イに記載の方法と同様にして脳下垂体トータルＲＮＡの抽出および逆転写を行い、下記プライマーを用いてＣＣＫＲＢの増幅の可否をＰＣＲ法により検証した。
【0072】
＜ウナギＣＣＫＢＲ１用プライマー＞
フォワード（配列番号１４）：GCGATGGACGTACAGAAACTGAATG
リバース（配列番号１５）：CTTCCAGGTGTTGACGGAGTAG
フォワード（配列番号１４）：GCGATGGACGTACAGAAACTGAATG
リバース（配列番号１５）：CTTCCAGGTGTTGACGGAGTAG
【0073】
＜チョウザメＣＣＫＢＲ１用プライマー＞
フォワード（配列番号１６）：GTGGAAACGGCTCTGTGACAAG
リバース（配列番号１７）：GCTGACAGTGGTGTAGCTGAATTTAGAC
フォワード（配列番号１６）：GTGGAAACGGCTCTGTGACAAG
リバース（配列番号１７）：GCTGACAGTGGTGTAGCTGAATTTAGAC
【0074】
ＰＣＲ反応の増幅条件は、最初に９５℃、２分の変性を行った後、９５℃、１０秒（変性）、６８℃、１０秒（１サイクルごとに０．５℃低下）（アニーリング）、７２℃、３０秒（伸長）を２０サイクル、次いで、９５℃、１０秒（変性）、６０℃、１０秒（アニーリング）、７２℃、３０秒（伸長）を１６サイクルとした。
【0075】
イ ｃＤＮＡ配列の決定
ウナギおよびチョウザメの脳下垂体ｃＤＮＡから増幅してＣＣＫＢＲ１をクローニングし、各ＤＮＡの塩基配列を決定した。
ウナギおよびチョウザメの脳下垂体ｃＤＮＡから増幅してＣＣＫＢＲ１をクローニングし、各ＤＮＡの塩基配列を決定した。
【0076】
（２）結果
結果は、図６に示す通りであった。図６では、ウナギおよびチョウザメにおいて、各ＣＣＫＲＢとして予想される長さ（１０７１ｂｐおよび１２０２ｂｐ）のＰＣＲ産物がそれぞれ増幅された。また、ウナギおよびチョウザメの各脳下垂体ｃＤＮＡから得られたＤＮＡ配列は、別種のＣＣＫＲＢとの配列類似性から、正しくＣＣＫＲＢ遺伝子であることが確認された。これらの結果から、ウナギおよびチョウザメ未成熟個体の脳下垂体においてＣＣＫＲＢ遺伝子が発現していることが示された。ここで、チョウザメは真骨魚類が出現する前の下位条鰭類（古代魚）であり、ウナギは真骨魚類の基部でメダカと分岐した下位真骨魚類である。したがって、以上の結果から、メダカにおいて証明された、ＣＣＫが脳下垂体におけるＦＳＨ放出を制御するというメカニズムがチョウザメを含む下位条鰭類および真骨魚類を含む魚類において広く保存されているメカニズムであることが示された。よって、本実施例（例１～５）により、メダカに加え、ウナギおよびチョウザメを含む魚類において広く、ＣＣＫ受容体作動剤が生殖腺発育促進作用を奏することが示された。
結果は、図６に示す通りであった。図６では、ウナギおよびチョウザメにおいて、各ＣＣＫＲＢとして予想される長さ（１０７１ｂｐおよび１２０２ｂｐ）のＰＣＲ産物がそれぞれ増幅された。また、ウナギおよびチョウザメの各脳下垂体ｃＤＮＡから得られたＤＮＡ配列は、別種のＣＣＫＲＢとの配列類似性から、正しくＣＣＫＲＢ遺伝子であることが確認された。これらの結果から、ウナギおよびチョウザメ未成熟個体の脳下垂体においてＣＣＫＲＢ遺伝子が発現していることが示された。ここで、チョウザメは真骨魚類が出現する前の下位条鰭類（古代魚）であり、ウナギは真骨魚類の基部でメダカと分岐した下位真骨魚類である。したがって、以上の結果から、メダカにおいて証明された、ＣＣＫが脳下垂体におけるＦＳＨ放出を制御するというメカニズムがチョウザメを含む下位条鰭類および真骨魚類を含む魚類において広く保存されているメカニズムであることが示された。よって、本実施例（例１～５）により、メダカに加え、ウナギおよびチョウザメを含む魚類において広く、ＣＣＫ受容体作動剤が生殖腺発育促進作用を奏することが示された。
【0077】
例６：ウナギ脳下垂体のＦＳＨ細胞におけるＣＣＫＲＢ発現の検証
例６では、例５におけるＰＣＲレベルのＣＣＫＲＢ検出結果が正しいことを確認するため、例としてウナギ脳下垂体のＦＳＨ細胞がＣＣＫＲＢを発現することを検証した。
例６では、例５におけるＰＣＲレベルのＣＣＫＲＢ検出結果が正しいことを確認するため、例としてウナギ脳下垂体のＦＳＨ細胞がＣＣＫＲＢを発現することを検証した。
【0078】
（１）二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法
ニホンウナギの脳下垂体を用いて、例１アに記載の方法と同様にして二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法を行った。ＤＩＧラベルＣＣＫＲＢプローブおよびフルオレセインラベルＦＳＨｂプローブは、ニホンウナギの脳下垂体ｃＤＮＡを材料にして、以下のプライマーを用いて増幅した配列から作製した。
ニホンウナギの脳下垂体を用いて、例１アに記載の方法と同様にして二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法を行った。ＤＩＧラベルＣＣＫＲＢプローブおよびフルオレセインラベルＦＳＨｂプローブは、ニホンウナギの脳下垂体ｃＤＮＡを材料にして、以下のプライマーを用いて増幅した配列から作製した。
【0079】
＜ウナギＣＣＫＢＲ１用プライマー＞
フォワード（配列番号１４）：GCGATGGACGTACAGAAACTGAATG
リバース（配列番号１５）：CTTCCAGGTGTTGACGGAGTAG
フォワード（配列番号１４）：GCGATGGACGTACAGAAACTGAATG
リバース（配列番号１５）：CTTCCAGGTGTTGACGGAGTAG
【0080】
＜ウナギＦＳＨｂ用プライマー＞
フォワード（配列番号２３）：CAGATTCACAGTTGCCATGCATCT
リバース（配列番号２４）：CATCTATCCCTTGCCGCAGTT
フォワード（配列番号２３）：CAGATTCACAGTTGCCATGCATCT
リバース（配列番号２４）：CATCTATCCCTTGCCGCAGTT
【0081】
（２）結果
結果は、図７に示す通りであった。図７では、二重イン・サイチュハイブリダイゼーションにより、ニホンウナギ成体において、脳下垂体のＦＳＨ細胞が、ＣＣＫＲＢ遺伝子を発現していることが確認された。この結果から、ウナギにおいても、メダカと同様にＦＳＨ細胞がＣＣＫによって制御されていることが示された。この結果からまた、ウナギとメダカは真骨魚類の初期に分岐したため、ＦＳＨ細胞におけるＣＣＫＲＢを介する、ＣＣＫによるＦＳＨ放出制御は真骨魚類全般で共通していることが示された。さらに、ウナギと同様にＰＣＲレベルでＣＣＫＲＢの発現が脳下垂体で検出されたチョウザメにおいても、ＦＳＨ細胞におけるＣＣＫＲＢを介する、ＣＣＫによるＦＳＨ放出制御の機構が存在することが示唆された。
結果は、図７に示す通りであった。図７では、二重イン・サイチュハイブリダイゼーションにより、ニホンウナギ成体において、脳下垂体のＦＳＨ細胞が、ＣＣＫＲＢ遺伝子を発現していることが確認された。この結果から、ウナギにおいても、メダカと同様にＦＳＨ細胞がＣＣＫによって制御されていることが示された。この結果からまた、ウナギとメダカは真骨魚類の初期に分岐したため、ＦＳＨ細胞におけるＣＣＫＲＢを介する、ＣＣＫによるＦＳＨ放出制御は真骨魚類全般で共通していることが示された。さらに、ウナギと同様にＰＣＲレベルでＣＣＫＲＢの発現が脳下垂体で検出されたチョウザメにおいても、ＦＳＨ細胞におけるＣＣＫＲＢを介する、ＣＣＫによるＦＳＨ放出制御の機構が存在することが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】