特開 2024-12184 昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法、昆虫の匂い応答に対する阻害剤、昆虫阻害システム、及び昆虫阻害方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024012184

(43)【公開日】2024-01-25

(54)【発明の名称】昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法、昆虫の匂い応答に対する阻害剤、昆虫阻害システム、及び昆虫阻害方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20240118BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20240118BHJP

   A01P 19/00 20060101ALN20240118BHJP

   A01N 31/08 20060101ALN20240118BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02 ZNA

G01N33/50 Z

A01P19/00

A01N31/08

【審査請求】未請求

【請求項の数】35

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023115895

(22)【出願日】2023-07-14

(31)【優先権主張番号】P 2022114316

(32)【優先日】2022-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(71)【出願人】

【識別番号】000002853

【氏名又は名称】ダイキン工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】光野 秀文

(72)【発明者】

【氏名】祐川 侑司

(72)【発明者】

【氏名】二木 佐和子

(72)【発明者】

【氏名】中條 卓也

(72)【発明者】

【氏名】神崎 亮平

(72)【発明者】

【氏名】黒田 枝里

(72)【発明者】

【氏名】北園 茜

(72)【発明者】

【氏名】田中 利夫

(72)【発明者】

【氏名】黒井 聖史

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4H011

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045CB17

2G045FB04

4B063QA05

4B063QQ08

4B063QR41

4B063QS36

4B063QX02

4H011AC07

4H011BB03

4H011BC03

4H011DA12

(57)【要約】

【課題】昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】昆虫の嗅覚受容体及び嗅覚受容体の共受容体の少なくとも一方を発現している匂い検出構造体を用意することと、嗅覚受容体に対応する匂い物質と、複数の阻害剤候補物質のそれぞれを、匂い検出構造体に与えることと、匂い検出構造体内へのイオンの流入に基づいて、複数の阻害剤候補物質をスクリーニングすることと、を含む。昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

昆虫の嗅覚受容体及び前記嗅覚受容体の共受容体の少なくとも一方を発現している匂い検出構造体を用意することと、
前記嗅覚受容体に対応する匂い物質と、複数の阻害剤候補物質のそれぞれを、前記匂い検出構造体に与えることと、
前記匂い検出構造体内へのイオンの流入に基づいて、前記複数の阻害剤候補物質をスクリーニングすることと、
を含む、昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項2】

前記嗅覚受容体が１－オクテン－３－オールの受容体であり、前記匂い物質が１－オクテン－３－オールである、請求項１に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項3】

前記昆虫がゴキブリである、請求項１に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項4】

昆虫の触角を用意することと、
前記昆虫の触角を刺激する刺激物質と、前記スクリーニングで選別された阻害剤候補物質を、前記昆虫の触角に与えることと、
前記昆虫の触角の反応を検出することと、
をさらに含む、請求項１に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項5】

前記刺激物質がボンビコールである、請求項４に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項6】

前記昆虫の触角がガの触角である、請求項４に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項7】

前記ガがカイコガである、請求項６に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項8】

前記嗅覚受容体が１－オクテン－３－オールの受容体であり、
前記匂い物質が１－オクテン－３－オールであり、
前記刺激物質がボンビコールであり、
前記昆虫の触角がガの触角である、
ガのフェロモンへの応答に対する阻害剤をスクリーニングするための、請求項４に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項9】

前記昆虫の触角の反応を検出することにおいて、前記触角の電位を検出する、請求項４に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項10】

昆虫を用意することと、
前記昆虫を刺激する刺激物質と、前記スクリーニングで選別された阻害剤候補物質を、前記昆虫に与えることと、
前記昆虫の反応を検出することと、
をさらに含む、請求項１に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項11】

前記刺激物質がボンビコールである、請求項１０に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項12】

前記昆虫がガである、請求項１０に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項13】

前記ガがカイコガである、請求項１２に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項14】

前記昆虫がゴキブリである、請求項１０に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項15】

前記嗅覚受容体が１－オクテン－３－オールの受容体であり、
前記匂い物質が１－オクテン－３－オールであり、
前記刺激物質がボンビコールであり、
前記昆虫がガである、
ガのフェロモンへの応答に対する阻害剤をスクリーニングするための、請求項１０に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項16】

前記昆虫の反応を検出することにおいて、前記昆虫の行動を観察する、請求項１０に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項17】

請求項１に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法で得られた昆虫の匂い応答に対する阻害剤であって、
前記匂い検出構造体内へのイオンの流入を３７％未満にする、昆虫の匂い応答に対する阻害剤。

【請求項18】

前記匂い検出構造体内へのイオンの流入を２０％以下にする、請求項１７に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤。

【請求項19】

メチルフェノール誘導体である、請求項１７に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤。

【請求項20】

４－イソプロピル－３－メチルフェノールを含む、請求項１７に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤。

【請求項21】

４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－メチルフェノールを含む、請求項１７に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤。

【請求項22】

溶媒が、エタノール、ヘキサン、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、及び水からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１７に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤。

【請求項23】

ガの匂い応答に対する阻害剤である、請求項１７に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤。

【請求項24】

前記ガがカイコガである、請求項２３に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤。

【請求項25】

ゴキブリの匂い応答に対する阻害剤である、請求項１７に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤。

【請求項26】

請求項１に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法で得られた昆虫の匂い応答に対する阻害剤を散布する散布部を備える、昆虫阻害システム。

【請求項27】

前記散布部が、前記昆虫の匂い応答に対する阻害剤を微粒子化する、請求項２６に記載の昆虫阻害システム。

【請求項28】

前記散布部が、前記昆虫の匂い応答に対する阻害剤を微粒子化する、二流体ノズル、超音波振動子、圧電素子、及び静電噴霧ノズルからなる群から選択される少なくとも一つを備える、請求項２６に記載の昆虫阻害システム。

【請求項29】

前記昆虫の匂い応答に対する阻害剤の溶媒が、エタノール、ヘキサン、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、及び水からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項２６に記載の昆虫阻害システム。

【請求項30】

前記昆虫の匂い応答に対する阻害剤が、４－イソプロピル－３－メチルフェノール又は４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－メチルフェノールを含む、請求項２６に記載の昆虫阻害システム。

【請求項31】

請求項１に記載の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法で得られた昆虫の阻害溶液を散布することを含む、昆虫阻害方法。

【請求項32】

前記散布することにおいて、前記昆虫の匂い応答に対する阻害剤を微粒子化する、請求項３１に記載の昆虫阻害方法。

【請求項33】

前記散布することにおいて、二流体ノズル、超音波振動子、圧電素子、及び静電噴霧ノズルからなる群から選択される少なくとも一つで、前記昆虫の匂い応答に対する阻害剤を微粒子化する、請求項３１に記載の昆虫阻害方法。

【請求項34】

前記昆虫の匂い応答に対する阻害剤の溶媒が、エタノール、ヘキサン、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、及び水からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項３１に記載の昆虫阻害方法。

【請求項35】

前記昆虫の匂い応答に対する阻害剤が、４－イソプロピル－３－メチルフェノール又は４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－メチルフェノールを含む、請求項３１に記載の昆虫阻害方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は環境技術に関し、昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法、昆虫の匂い応答に対する阻害剤、昆虫阻害システム、及び昆虫阻害方法に関する。

【背景技術】

【0002】

昆虫の習性には多くに嗅覚が関与している（例えば、特許文献１及び非特許文献１参照。）。昆虫の摂食行動、交尾を目的とする雌雄間の誘引、及び産卵場所の選択には、嗅覚が重要な役割を果たしていると考えられている。一方、有害な昆虫を忌避するために、昆虫の嗅覚を阻害したり、昆虫が忌避する匂いを利用したりすることが提案されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】国際公開第２０２１／０４５２３３号

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Satoshi Hamada et al., "Giant vesicles functionally expressing membrane receptors for an insect pheromone," Chem. Commun., 2014,50, 2958

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

昆虫の匂い応答に対する効果の高い阻害剤、及び当該阻害剤をスクリーニングする方法が望まれている。そこで、本発明は、昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法、昆虫の匂い応答に対する阻害剤、昆虫阻害システム、及び昆虫阻害方法を提供することを目的の一つとする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の態様に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法は、昆虫の嗅覚受容体及び嗅覚受容体の共受容体の少なくとも一方を発現している匂い検出構造体を用意することと、嗅覚受容体に対応する匂い物質と、複数の阻害剤候補物質のそれぞれを、匂い検出構造体に与えることと、匂い検出構造体内へのイオンの流入に基づいて、複数の阻害剤候補物質をスクリーニングすることと、を含む。昆虫の嗅覚受容体は、イオンチャネル型受容体であってもよい。匂い検出構造体は細胞であってもよい。匂い検出構造体は人工の構造体であってもよい。匂い検出構造体は、嗅覚受容体の共受容体を発現していてもよい。

【0007】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法において、嗅覚受容体が１－オクテン－３－オールの受容体であり、匂い物質が１－オクテン－３－オールであってもよい。

【0008】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法において、昆虫がゴキブリであってもよい。

【0009】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法が、昆虫の触角を用意することと、昆虫の触角を刺激する刺激物質と、スクリーニングで選別された阻害剤候補物質を、昆虫の触角に与えることと、昆虫の触角の反応を検出することと、をさらに含んでいてもよい。刺激物質がボンビコールであってもよい。昆虫の触角がガの触角であってもよい。ガがカイコガであってもよい。

【0010】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法において、嗅覚受容体が１－オクテン－３－オールの受容体であり、匂い物質が１－オクテン－３－オールであり、刺激物質がボンビコールであり、昆虫の触角がガの触角であってもよい。上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法が、ガのフェロモンへの応答に対する阻害剤をスクリーニングするための方法であってもよい。

【0011】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法において、昆虫の触角の反応を検出することにおいて、触角の電位を検出してもよい。

【0012】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法が、昆虫を用意することと、昆虫を刺激する刺激物質と、スクリーニングで選別された阻害剤候補物質を、昆虫に与えることと、昆虫の反応を検出することと、をさらに含んでいてもよい。刺激物質がボンビコールであってもよい。昆虫がガであってもよい。ガがカイコガであってもよい。昆虫がゴキブリであってもよい。ゴキブリがワモンゴキブリであってもよい。

【0013】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法において、嗅覚受容体が１－オクテン－３－オールの受容体であり、匂い物質が１－オクテン－３－オールであり、刺激物質がボンビコールであり、昆虫がガであってもよい。上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法が、ガのフェロモンへの応答に対する阻害剤をスクリーニングするための方法であってもよい。

【0014】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法において、昆虫の反応を検出することにおいて、昆虫の行動を観察してもよい。昆虫の行動が羽ばたき行動であってもよい。昆虫の行動が探索行動であってもよい。

【0015】

本発明の態様に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、匂い検出構造体内へのイオンの流入を３７％未満にする、昆虫の匂い応答に対する阻害剤である。

【0016】

本発明の態様に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法で得られた昆虫の匂い応答に対する阻害剤であって、匂い検出構造体内へのイオンの流入を３７％未満にする、昆虫の匂い応答に対する阻害剤である。

【0017】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤が、匂い検出構造体内へのイオンの流入を２０％以下にしてもよい。

【0018】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤が、メチルフェノール誘導体であってもよい。

【0019】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤が、４－イソプロピル－３－メチルフェノールを含んでいてもよい。

【0020】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤が、４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－メチルフェノールを含んでいてもよい。

【0021】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤において、溶媒が、エタノール、ヘキサン、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、及び水からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。

【0022】

上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤が、ガの匂い応答に対する阻害剤であってもよい。ガがカイコガであってもよい。上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤が、ゴキブリの匂い応答に対する阻害剤であってもよい。ゴキブリがワモンゴキブリであってもよい。

【0023】

本発明の態様に係る昆虫阻害システムは、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を散布する散布部を備える。昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤であってもよい。

【0024】

本発明の態様に係る昆虫阻害システムは、上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法で得られた昆虫の匂い応答に対する阻害剤を散布する散布部を備える。

【0025】

上記の昆虫阻害システムにおいて、散布部が、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を微粒子化してもよい。

【0026】

上記の昆虫阻害システムにおいて、散布部が、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を微粒子化する、二流体ノズル、超音波振動子、圧電素子、及び静電噴霧ノズルからなる群から選択される少なくとも一つを備えていてもよい。

【0027】

上記の昆虫阻害システムにおいて、昆虫の匂い応答に対する阻害剤の溶媒が、エタノール、ヘキサン、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、及び水からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。

【0028】

上記の昆虫阻害システムにおいて、昆虫の匂い応答に対する阻害剤が、４－イソプロピル－３－メチルフェノール又は４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－メチルフェノールを含んでいてもよい。

【0029】

本発明の態様に係る昆虫阻害方法は、昆虫の阻害溶液を散布することを含む。昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤であってもよい。

【0030】

本発明の態様に係る昆虫阻害方法は、上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法で得られた昆虫の阻害溶液を散布することを含む。

【0031】

上記の昆虫阻害方法において、散布することにおいて、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を微粒子化してもよい。

【0032】

上記の昆虫阻害方法において、散布することにおいて、二流体ノズル、超音波振動子、圧電素子、及び静電噴霧ノズルからなる群から選択される少なくとも一つで、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を微粒子化してもよい。

【0033】

上記の昆虫阻害方法において、昆虫の匂い応答に対する阻害剤の溶媒が、エタノール、ヘキサン、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、及び水からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。

【0034】

上記の昆虫阻害方法において、昆虫の匂い応答に対する阻害剤が、４－イソプロピル－３－メチルフェノール又は４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－メチルフェノールを含んでいてもよい。

【発明の効果】

【0035】

本発明によれば、昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法、昆虫の匂い応答に対する阻害剤、昆虫阻害システム、及び昆虫阻害方法を提供可能である。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】実施形態に係る嗅覚受容体を匂い検出細胞に発現させる方法を示す模式図である。

【図2】実施形態に係る匂い検出細胞を均一化する方法を示す模式図である。

【図3】実施形態に係る複数の嗅覚受容体を匂い検出細胞に発現させる方法を示す模式図である。

【図4】実施形態に係る複数の嗅覚受容体を匂い検出細胞に発現させる方法を示す模式図である。

【図5】実施形態に係る昆虫阻害システムの模式図である。

【図6】実施形態に係る昆虫阻害システムの模式図である。

【図7】実施形態に係る昆虫阻害システムの模式図である。

【図8】実施形態に係る昆虫阻害システムの模式図である。

【図9】実施例に係る匂い検出細胞が発する蛍光の強度の時間変化を示すグラフである。

【図10】実施例に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤及び阻害剤候補物質の濃度と、匂い検出細胞が発する蛍光の正規化された強度と、の関係を示すグラフである。

【図11】実施例に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤候補物質の濃度と、匂い検出細胞が発する蛍光の正規化された強度と、の関係を示すグラフである。

【図12】実施例に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤及び阻害剤候補物質の濃度と、匂い検出細胞が発する蛍光の正規化された強度と、の関係を示すグラフである。

【図13】実施例に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤及び阻害剤候補物質と、匂い検出細胞が発する蛍光の正規化された強度と、の関係を示すグラフである。

【図14】実施例に係るＥＡＧの計測方法を示す写真である。

【図15】実施例に係る触角の電位の時間変化を示すグラフである。

【図16】実施例に係る触角の電位の時間変化を示すグラフである。

【図17】実施例に係る複数濃度のボンビコールに対する昆虫の応答を示す表である。

【図18】実施例に係る阻害剤を昆虫に与えた後の複数濃度のボンビコールに対する昆虫の応答を示す表である。

【図19】実施例に係る複数濃度のボンビコールに対する昆虫の応答を示す表である。

【図20】実施例に係る阻害剤候補物質を昆虫に与えた後の複数濃度のボンビコールに対する昆虫の応答を示す表である。

【図21】実施例に係る複数濃度のボンビコールに対する昆虫の応答を示す表である。

【図22】実施例に係る阻害剤候補物質を昆虫に与えた後の複数濃度のボンビコールに対する昆虫の応答を示す表である。

【図23】実施例に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤及び阻害剤候補物質の濃度と、匂い検出細胞が発する蛍光の正規化された強度と、の関係を示すグラフである。

【図24】実施例に係るゴキブリの配偶行動を観察するためのコンテナの写真である。

【図25】実施例に係るフェロモンを含ませたろ紙片又はアルミ片へのゴキブリのアクセス数を示すグラフである。

【図26】実施例に係るフェロモンを含ませたろ紙片又はアルミ片へのゴキブリのアクセス数を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0037】

実施形態に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法は、昆虫の嗅覚受容体及び嗅覚受容体の共受容体の少なくとも一方を発現している匂い検出構造体を用意することと、嗅覚受容体に対応する匂い物質と、複数の阻害剤候補物質のそれぞれを、匂い検出構造体に与えることと、匂い検出構造体内へのイオンの流入に基づいて、複数の阻害剤候補物質をスクリーニングすることと、を含む。

【0038】

匂い検出構造体は、細胞であってもよいし、人工の構造体であってもよい。

【0039】

匂い検出構造体が細胞である場合、匂い検出細胞は、細胞膜に嗅覚受容体を発現している。匂い検出細胞において、嗅覚受容体は天然に発現されていてもよいし、導入遺伝子によって発現されていてもよい。嗅覚受容体は、昆虫の嗅覚受容体であってもよい。

【0040】

匂い検出細胞は、昆虫細胞であってもよい。昆虫細胞は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）等のガ由来の細胞であってもよい。ヨトウガ由来の細胞の例としては、Ｓｆ２１及びＳｆ９が挙げられる。Ｓｆ２１細胞は、卵巣細胞由来である。Ｓｆ２１細胞は、無限分裂し、導入した遺伝子を永続的に発現する安定発現系統を樹立することが可能である。また、Ｓｆ２１細胞は、１８℃から４０℃の広い温度範囲で生存可能であり、培養液のｐＨを調整するための二酸化炭素も不要である。Ｓｆ２１細胞は、本来、嗅覚受容体を有しないが、嗅覚受容体の遺伝子を導入することにより、嗅覚受容体を発現させることが可能である。Ｓｆ９細胞は、Ｓｆ２１のクローンである。イラクサギンウワバ由来の細胞の例としては、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ及びＴｎｉが挙げられる。Ｔｎｉ由来細胞は、卵巣細胞由来である。

【0041】

あるいは、昆虫細胞は、ショウジョウバエ由来の細胞であってもよい。ショウジョウバエ由来の細胞の例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞が挙げられる。またあるいは、昆虫細胞は、ゴキブリ由来の細胞であってもよい。

【0042】

嗅覚受容体は、イオンチャネル型受容体である。嗅覚受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体であってもよいし、イオンチャネル型受容体であってもよい。イオンチャネル型受容体は、匂い分子であるリガンドと相互作用する部位と、イオンが流入する部位と、を有する。匂い検出細胞のイオンチャネル型受容体がリガンドと結合すると、匂い検出細胞内にナトリウムイオンやカルシウムイオン等の陽イオンが流入する。匂い検出細胞において、イオンの流入は、リガンドの結合から数１０ミリ秒程度で生じ得る。流入するイオンの量は多く、１個のリガンドの結合に対し、細胞内に流入するイオンの量は１０⁷個ともいわれている。

【0043】

一般に、特定の種類の嗅覚受容体は、特定の匂い分子に対する特異性を有する。匂い検出細胞において、１種類の匂い分子に対応する１種類の嗅覚受容体のみを発現させてもよいし、複数種類の匂い分子に対応する複数種類の嗅覚受容体を発現させてもよい。また、発現させる嗅覚受容体の量を調整してもよい。昆虫の嗅覚受容体は、ハエ、カ、ガ、ハチ、シラミ、及びゴキブリ等の多くの昆虫種で類似した匂い物質の受容のしくみを備えている。したがって、ある特定の昆虫の嗅覚受容体に対する阻害剤は、昆虫全般の嗅覚受容体に対する阻害剤として機能し得る。

【0044】

匂い検出構造体は、嗅覚受容体とともに、嗅覚受容体の共受容体を発現していてもよい。共受容体は、嗅覚受容体とヘテロ複合体を形成して、匂い物質の受容体として機能する。昆虫の共受容体も、ハエ、カ、ガ、ハチ、シラミ、及びゴキブリ等の多くの昆虫種で類似した匂い物質の受容のしくみを備えている。したがって、ある特定の昆虫の嗅覚受容体の共受容体に対する阻害剤は、昆虫全般の嗅覚受容体の共受容体に対する阻害剤として機能し得る。

【0045】

嗅覚受容体の例としては、ショウジョウバエの受容体であって、カビ臭であるゲオスミンの受容体であるＤｍＯｒ５６ａ、ショウジョウバエの受容体であって、芳香あるいは果実臭を有する酢酸ゲラニルの受容体であるＤｍＯｒ８２ａ、ショウジョウバエの受容体であって、ヒトの汗の臭いを有する２－メチルフェノール（ｏ－クレゾール）の受容体であるＤｍＯｒ４９ｂ、ショウジョウバエの受容体であって、カビ臭である１－オクテン－３－オール（１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌ）の受容体であるＤｍＯｒ１３ａ、カイコガの性フェロモンであるボンビコール（Ｂｏｍｂｙｋｏｌ）の受容体であるＢｍＯＲ１、カイコガの性フェロモンの副成分であるボンビカール（Ｂｏｍｂｙｋａｌ）の受容体であるＢｍＯＲ３、キイロショウジョウバエの一般臭受容体であるＤｍＯｒ８５ｂ、及びコナガの性フェロモン受容体であるＰｘＯＲ１が挙げられるが、これらに限定されない。なお、「ゲオスミン」は「ジェオスミン」とも呼ばれる。

【0046】

遺伝子工学的に嗅覚受容体を匂い検出細胞に発現させる場合、例えば、図１に示すように、嗅覚受容体をコードする遺伝子をベクターに組み込み、構築されたベクターを宿主細胞にトランスフェクトさせてもよい。嗅覚受容体をコードする遺伝子は、例えば、昆虫の嗅覚器官からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成して単離することができる。単離されたｃＤＮＡから、ＰＣＲプライマーを用いて、嗅覚受容体をコードする遺伝子の一部をＰＣＲ法にて増幅することが可能である。

【0047】

嗅覚受容体をコードする遺伝子の一部は、合成した二本鎖ｃＤＮＡを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを作製することによっても取得することができる。ｃＤＮＡは、制限酵素とリガーゼを用いる通常の方法、例えば、得られたｃＤＮＡを制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位に挿入してベクターに連結する方法によって、ベクターに組込むことができる。

【0048】

嗅覚受容体に対応する匂い物質とは、嗅覚受容体と特異的に反応する匂い物質である。ＤｍＯｒ５６ａに対応する匂い物質は、ゲオスミンである。ＤｍＯｒ８２ａに対応する匂い物質は、酢酸ゲラニルである。ＤｍＯｒ４９ｂに対応する匂い物質は、２－メチルフェノール（ｏ－クレゾール）である。ＤｍＯｒ１３ａに対応する匂い物質は、１－オクテン－３－オール（１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌ）である。ＢｍＯＲ１に対応する匂い物質は、ボンビコール（Ｂｏｍｂｙｋｏｌ）である。ＢｍＯＲ３に対応する匂い物質は、ボンビカール（Ｂｏｍｂｙｋａｌ）である。ＰｘＯＲ１に対応する匂い物質は、コナガの性フェロモンである。

【0049】

匂い検出細胞内において、イオンに応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質が発現していてもよい。上述したように、匂い検出細胞において、イオンチャネル型嗅覚受容体に匂い分子が結合すると、匂い検出細胞内にイオンが流れる。したがって、イオンに応じて蛍光強度が変化する蛍光タンパク質を発現させる遺伝子を匂い検出細胞に導入することにより、蛍光強度の変化、あるいは蛍光強度変化率から、匂い検出細胞が匂い分子を検出しているか否かを確認することが可能である。蛍光タンパク質の例としては、カルシウムイオンと反応して蛍光を発するＧＣａＭＰ３、ＧＣａＭＰ６ｓ、及びエクオリンが挙げられる。

【0050】

嗅覚受容体と匂い分子が反応すると、匂い検出細胞内に流入するイオンの濃度が高くなり、多くの蛍光タンパク質が蛍光を発する。そのため、匂い検出細胞が発する蛍光強度が強くなる。嗅覚受容体と匂い分子の反応が阻害物質により阻害されると、匂い検出細胞内に流入するイオンの濃度が低くなるか、ゼロになり、少ない蛍光タンパク質が蛍光を発するか、蛍光が発せられなくなる。そのため、匂い検出細胞が発する蛍光強度が弱くなるか、無くなる。したがって、匂い検出細胞内へのイオンの流入に対応する蛍光強度に基づき、嗅覚受容体と匂い分子の反応が阻害物質で阻害されているか否かを評価することが可能である。

【0051】

匂い検出細胞内へのイオンの流入を、電気的に測定してもよい。例えば、匂い検出細胞の近傍に、ソース電極、ドレイン電極、及びゲート電極を備えるトランジスターを配置する。嗅覚受容体と匂い分子が反応し、匂い検出細胞内へイオンが流入すると、トランジスターのゲート電極のゲート電位が変位し、ソース電極及びドレイン電極の間を流れるドレイン電流に変調が生じる。嗅覚受容体と匂い分子の反応が阻害物質により阻害されると、匂い検出細胞内に流入するイオンの濃度が低くなるか、ゼロになり、ドレイン電流の変調が低くなるか、無くなる。したがって、匂い検出細胞内へのイオンの流入に対応するトランジスターのドレイン電流の変調を検出することによって、嗅覚受容体と匂い分子の反応が阻害物質で阻害されているか否かを評価することが可能である。

【0052】

匂い検出細胞は、（ａ）嗅覚受容体を有する細胞群から一部の細胞を選択し、（ｂ）選択された細胞を増殖し、（ｃ）増殖した細胞の匂い物質への応答性を確認することの（ａ）工程から（ｃ）工程を複数実施し、匂い物質への応答性が基準値以上の増殖した細胞から選択されてもよい。（ａ）工程で選択される細胞は、単一の細胞（シングルセル）であってもよい。

【0053】

あるいは、匂い検出細胞は、（ａ）嗅覚受容体を有する細胞群から一部の細胞を選択し、（ｂ）選択された細胞を増殖し、（ｃ）増殖した細胞の匂い物質への応答性を確認することの（ａ）工程から（ｃ）工程を複数実施し、匂い物質への応答性が最も高い増殖した細胞から選択されてもよい。（ａ）工程で選択される細胞は、単一の細胞（シングルセル）であってもよい。

【0054】

具体的には、図２に示すように、嗅覚受容体を有し、蛍光タンパク質を発現している細胞系統群の希釈を繰り返すことにより、単一又は少数の細胞を選択し、選択した細胞を培養して増殖させることにより、細胞系統を樹立してもよい。当該工程を複数実施することにより、複数の細胞系統が樹立される。樹立された複数の細胞系統のうち、匂い物質への応答性が所定の基準値以上の細胞系統を、匂い検出細胞として使用してもよい。あるいは、樹立された複数の細胞系統のうち、匂い物質への応答性が最も高い細胞系統を、匂い検出細胞として使用してもよい。

【0055】

図３及び図４に示すように、樹立した嗅覚受容体を発現している細胞に、さらに別の嗅覚受容体を発現させてもよい。すなわち、上記の方法等で樹立した第１の嗅覚受容体を発現している細胞に、さらに第２の嗅覚受容体を発現させてもよい。例えば、第２の嗅覚受容体をコードする遺伝子をベクターに組み込み、構築されたベクターを第１の嗅覚受容体を発現している細胞にトランスフェクトさせることにより、第１の嗅覚受容体及び第２の嗅覚受容体を発現している細胞を樹立することが可能である。第１の嗅覚受容体を発現している細胞に、さらに複数の異なる嗅覚受容体を発現させてもよい。図３は、第１の嗅覚受容体としてＯｒ５６ａを発現している細胞に、第２の嗅覚受容体であるＯｒ－Ｘの遺伝子を含むベクターと、抗生物質耐性遺伝子を含むベクターと、を導入する例を示している。図４は、第１の嗅覚受容体としてＯｒ５６ａを発現している細胞に、第２の嗅覚受容体であるＯｒ－Ｘの遺伝子と抗生物質耐性遺伝子の両方を含むベクターを導入する例を示している。

【0056】

匂い検出構造体が、人工の構造体である場合、人工の構造体は、細胞を模様していてもよい。人工の構造体は、例えば、膜を備えるベシクルを備え、膜に配置された嗅覚受容体を備える。人工の構造体は、膜内にイオンの濃度に応じて蛍光を発する蛍光タンパク質を備えていてもよい。人工の構造体は、例えば、非特許文献１を参照して製造することが可能である。

【0057】

匂い物質と複数の阻害剤候補物質のそれぞれを、匂い検出構造体に同時に与えてもよい。あるいは、匂い物質を匂い検出構造体に与えた後に、複数の阻害剤候補物質のそれぞれを匂い検出構造体に与えてもよい。またあるいは、複数の阻害剤候補物質のそれぞれを匂い検出構造体に与えた後に、匂い物質を匂い検出構造体に与えてもよい。匂い物質により生じ得る匂い検出構造体内へのイオンの流入を阻害した阻害剤候補物質が、昆虫の匂い応答に対する阻害剤として選別される。

【0058】

匂い検出構造体を用いてスクリーニングされた複数の阻害剤候補物質を、さらにスクリーニングしてもよい。例えば、実施形態に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤のスクリーニング方法は、昆虫又は昆虫の一部を用意することと、昆虫又は昆虫の一部を刺激する刺激物質と、上記のスクリーニングで選別された阻害剤候補物質を、昆虫又は昆虫の一部に与えることと、昆虫又は昆虫の一部の反応を検出することと、をさらに含む。

【0059】

昆虫の例としては、ガ、ゴキブリ、カ、ハエ、ハチ、及びシラミなどが挙げられる。ガの例としては、カイコガ、コナガ、アワヨトウ、及びメイガが挙げられる。ゴキブリの例としては、トウヨウゴキブリ、チャバネゴキブリ、ワモンゴキブリ、コワモンゴキブリ、トビイロゴキブリ、クロゴキブリ、ヤマトゴキブリ、ウルシゴキブリ、及びスズキゴキブリが挙げられる。昆虫の一部の例としては、触角、吻、脚、及び翅が挙げられる。

【0060】

昆虫又は昆虫の一部に対する刺激物質の例としては、ボンビコール、ペリプラノンＡ、ペリプラノンＢ、及び１－オクテン－３－オールが挙げられる。

【0061】

刺激物質と複数の阻害剤候補物質のそれぞれを、昆虫又は昆虫の一部に同時に与えてもよい。あるいは、刺激物質を昆虫又は昆虫の一部体に与えた後に、複数の阻害剤候補物質のそれぞれを昆虫又は昆虫の一部に与えてもよい。またあるいは、複数の阻害剤候補物質のそれぞれを昆虫又は昆虫の一部に与えた後に、刺激物質を昆虫又は昆虫の一部に与えてもよい。

【0062】

昆虫の反応を検出することにおいて、昆虫の行動を観察してもよい。刺激物質により生じ得る昆虫の行動を阻害した阻害剤候補物質が、昆虫の匂い応答に対する阻害剤として選別される。昆虫の行動の例としては、羽ばたき行動、探索行動、及び配偶行動が挙げられる。また、昆虫の触角の反応を検出することにおいて、触角の電位を検出してもよい。刺激物質により生じ得る触角の電位の変化を阻害した阻害剤候補物質が、昆虫の匂い応答に対する阻害剤として選別される。

【0063】

実施形態に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、匂い検出構造体内へのイオンの流入を３７％未満、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、あるいは２０％未満にし得る。例えば、匂い検出構造体内の蛍光強度を観察することにより、匂い検出構造体内へのイオンの流入を評価する場合、実施形態に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、阻害剤がないときの匂い分子により生じる蛍光の強度に対し、蛍光の強度を３７％未満、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、あるいは２０％未満にし得る。匂い検出構造体近傍のトランジスターのドレイン電流を観察することにより、匂い検出構造体内へのイオンの流入を評価する場合、実施形態に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、阻害剤がないときの匂い分子により生じるドレイン電流の変調に対し、ドレイン電流の変調を３７％未満、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、あるいは２０％未満にし得る。なお、イオン流入、あるいはドレイン電流の低下の割合は、実施形態に係る蛍光強度の低下の割合と関連する値としてもよい。

【0064】

昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、例えば、メチルフェノール誘導体である。昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、下記化学式１に示す４－イソプロピル－３－メチルフェノールを含んでいてもよい。昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、下記化学式２に示す４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－メチルフェノールを含んでいてもよい。昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、下記化学式３に示す２－イソプロピル―６－メチルフェノールを含んでいてもよい。昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、下記化学式４に示す２，４－ジイソプロピルフェノールを含んでいてもよい。昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、下記化学式５に示す２－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノールを含んでいてもよい。

【0065】

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【0066】

昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、ケイ皮酸誘導体を含んでいてもよい。ケイ皮酸誘導体の例としては、トランスケイ皮酸メチル、及びトランスケイ皮酸ｔｅｒｔブチルが挙げられる。

【0067】

昆虫の匂い応答に対する阻害剤の溶媒の例としては、エタノール、ヘキサン、イソプロピルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ、及び水が挙げられる。実施形態に係る昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、例えば、ガの匂い応答に対する阻害剤として使用可能である。ガは、カイコガであってもよい。

【0068】

実施形態に係る昆虫阻害システムは、図５に示すように、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を散布する散布部２０を備える。昆虫の匂い応答に対する阻害剤は、上記の昆虫の匂い応答に対する阻害剤であってもよい。散布部２０は、例えば、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を貯留する貯留部２１、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を微粒化する微粒子化部２２、及び微粒化された昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を吹き出す吹出部２３を備える。溶液の溶媒は、上記の溶媒であってもよい。

【0069】

貯留部２１は、例えばタンクであり、本体２１ａと蓋２１ｂを備える。微粒子化部２２は、例えば、貯留部２１内に配置された、液体と気体の二流体を混合し微粒化する二流体ノズル２５を備える。吹出部２３は、蓋２１ｂに設けられていてもよい。

【0070】

二流体ノズル２５には、気体が流入する気体流入口２５ａと、貯留部２１内の昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液が流入する溶液流入口２５ｂが設けられている。気体は、例えば、高圧の圧縮空気である。また、二流体ノズル２５には、噴霧口２６が設けられている。噴霧口２６に形成される液膜状の昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液が、気流の剪断力で微粒子化され、噴霧口２６から噴出される。噴霧口２６から噴出された微粒化された昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液は、吹出部２３から貯留部２１の外に放出される。

【0071】

二流体ノズル２５の気体流入口２５ａには、管継手などの接続部２７を介して、二流体ノズル２５に気体を供給するための制御部３０が接続されている。制御部３０は、例えば、空気を供給するためのポンプ３２と、ポンプ３２と接続部２７を接続する気体供給管３４と、を備える。気体供給管３４に、電磁弁等の弁３３が設けられている。ポンプ３２及び弁３３は、コントローラー３１に電気的に接続されている。コントローラー３１は、ポンプ３２及び弁３３を制御して、二流体ノズル２５に供給される気体の流量、及び圧力等を制御する。

【0072】

あるいは、実施形態に係る昆虫阻害システムは、図６に示す構成を備えていてもよい。図６に示す昆虫阻害システムの散布部１２０は、例えば、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を貯留する貯留部４１、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を微粒化する微粒子化部４２、及び微粒化された昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を吹き出す吹出部４３を備える。

【0073】

貯留部２１は、例えばタンクであり、本体２１ａと蓋２１ｂを備える。貯留部２１と微粒子化部４２は、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を送液するための配管で接続されている。微粒子化部４２は、例えば、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を収容するノズルヘッド４７、及びノズルヘッド４７に配置されたピエゾ素子等の圧電素子４５を備える。吹出部４３は、ノズルヘッド４７に設けられている。

【0074】

圧電素子４５は、パルス電圧を印加されると、変形と復元を繰り返す。そのため、ノズルヘッド４７の容積が収縮と復元を繰り返す。これにより、ノズルヘッド４７内の昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液は、吹出部４３から間欠的に押し出され、微粒子化する。

【0075】

圧電素子４５には、配線４８を介して制御部１３０が接続されている。制御部１３０は、圧電素子４５に電圧を印加して、圧電素子４５の変形量等を制御する。

【0076】

あるいは、実施形態に係る昆虫阻害システムは、図７に示す構成を備えていてもよい。図７に示す昆虫阻害システムの散布部６０は、例えば、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を貯留する貯留部６１、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を微粒化する微粒子化部６２、及び微粒化された昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を吹き出す吹出部６３を備える。

【0077】

貯留部６１は、例えば、可撓性の袋状の容器である。貯留部６１の少なくとも一部は、超音波透過膜６５である。吹出部４３は、貯留部６１に設けられている。貯留部６１は、作用水６７が充填された振動発生容器６６に保持されている。微粒子化部６２は、超音波振動子を備える。

【0078】

超音波振動子は、高周波の交流電圧を印加されると、超音波振動する。超音波振動により発生した振動エネルギーは、作用水６７及び超音波透過膜６５を介して、貯留部６１内の昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液に到達する。これにより、貯留部６１内の昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液が振動し、溶液表面が霧化して、微粒子化された昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液が、吹出部６３から吹き出される。

【0079】

微粒子化部６２の超音波振動子には、配線７０を介して制御部２３０が接続されている。制御部２３０は、超音波振動子に交流電圧を印加して、超音波振動子の振動量等を制御する。

【0080】

あるいは、実施形態に係る昆虫阻害システムは、図８に示す構成を備えていてもよい。図８に示す昆虫阻害システムの散布部８０は、例えば、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を貯留する貯留部８１、昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を微粒化する静電噴霧式の微粒子化部８２、及び微粒化された昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を吹き出す吹出部８３を備える。

【0081】

貯留部８１は、例えばタンクであり、本体８１ａと蓋８１ｂを備える。吹出部８３は、貯留部８１に設けられている。貯留部８１内に、微粒子化部８２が配置される。微粒子化部８２は、静電噴霧ノズル８４及びポンプ等の搬送部８５を備える。搬送部８５は、静電噴霧ノズル８４に昆虫の匂い応答に対する阻害剤を含む溶液を搬送する。静電噴霧ノズル８４の周囲には筒状部材８６が配置されている。筒状部材８６の上端面には対向電極等の電圧印加部８７が配置されている。

【0082】

電圧印加部８７により静電噴霧ノズル８４と静電噴霧ノズル８４の外部に高電圧を印加すると、気液界面において、溶液の表面張力と、溶液に作用する静電気力と、の釣り合いにより、微細な液糸が引き出され、その先端が微粒子に分裂して静電噴霧ノズル８４から噴霧される。

【0083】

電圧印加部８７には、配線７１を介して高電圧制御部３３０が接続されている。高電圧制御部３３０は、電圧印加部８７に高電圧を印加して、溶液に作用する静電気力等を制御する。

【0084】

（実施例１：均質な匂い検出細胞系統の樹立）
ＤｍＯｒ１３ａとＤｍＯｒｃｏは、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の触角に由来する嗅覚受容体であり、対象臭である１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌに応答する。ＧＣａＭＰ６ｓは、改良型のカルシウム感受性蛍光タンパク質である。ＤｍＯｒ１３ａとＤｍＯｒｃｏを挿入したｐＩＢベクター、及びＧＣａＭＰ６ｓを挿入したｐＩＺベクターをリポフェクションによりＳｆ２１細胞へ遺伝子導入した。

【0085】

Ｇｒａｃｅ'ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ（１１６０５－０９４、Ｇｉｂｃｏ）に、終濃度１０％のＵＳ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｓｃｒｅｅｎｅｄ ＦＢＳ（ＳＨ３００７０．０３、ＧＥヘルスケア）と、３種類の抗生物質（終濃度１０μｇ／ｍＬのＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１５７１０－０６４、Ｇｉｂｃｏ）、終濃度１０μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ ＨＣｌ（Ａ１１１３９－０３、Ｇｉｂｃｏ）、終濃度１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（Ｒ２５００１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加して、継代培地を用意した。当該継代培地を用いて、ＤｍＯｒ１３ａ受容体及び共受容体ＤｍＯｒｃｏ、並びにＧＣａＭＰ６ｓを発現しているＳｆ２１細胞をフラスコ（３５３０８２、ＦＡＬＣＯＮ）内で継代培養した。継代時の細胞懸濁液の液量は６ｍＬとした。細胞がコンフルエントになったら、フラスコから６ｍＬの上清を回収し、１５ｍＬチューブ（９１０１５、ＴＰＰ）に入れた。微量高速遠心機を用いて、１５ｍＬチューブを４００×ｇ、４℃で３分間遠心した。

【0086】

遠心後、上清を１０ｍＬシリンジ（０１００７、ＴＯＰ）と０．４５μｍフィルター（４３１２２０、ＣＯＲＮＩＮＧ）を用いて滅菌した。滅菌した上清を、抗生物質（終濃度１０μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ ＨＣｌ、終濃度１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ）を含む、等量の新しい継代培地と混合することで、１０ｍＬのコンディション培地を調製した。

【0087】

上清を回収したフラスコ底面に接着した細胞を剥がして新しい培地１ｍＬに懸濁し、細胞懸濁液を１．５ｍＬチューブ（ＭＣＴ－１５０－Ｃ、ＡＸＹＧＥＮ）に回収した。細胞を４０個含む細胞懸濁液を抽出し、上記のコンディション培地に加え、よくピペッティングをした。細胞を加えられたコンディション培地の全量をリザーバー（ＢＭ－０８５０－１、ＢＭＢｉｏ）に移した。さらに、８マルチチャンネルピペット（ＨＴ５１２３、ＨＴＬ）を用いて、９６ウェルプレート（３８６０－０９６、ＩＷＡＫＩ）に細胞を加えられたコンディション培地を１００μＬずつ滴下し、その後、細胞を２７℃で培養した。細胞がウェルに接着した後、倒立顕微鏡でウェルを観察し、単一細胞（シングルセル）のみがコンディション培地中に存在するウェルを確認した。

【0088】

播種時に単一細胞が確認できたウェルの細胞を約８０％から約９０％コンフルエントになるまで培養を続けた。その後、２４ウェルプレート（３８２０－０２４、ＩＷＡＫＩ）、３５ｍｍディッシュ（３５３８０１、ＣＯＲＮＩＮＧ）、Ｔ－２５フラスコの順で、細胞をスケールアップした。２４ウェルプレート、３５ｍｍディッシュ、Ｔ－２５フラスコでの培養は、それぞれ液量が５００μＬ、２．５ｍＬ、５ｍＬとなるように培地の量を調整し、２７℃で培養した。Ｔ－２５フラスコまでスケールアップができた細胞の匂い物質に対する応答性を、カルシウムイメージングにより調査し、良好な応答性を示した細胞系統を、均質な匂い検出細胞系統として得た。

【0089】

（実施例２：阻害剤に対する匂い検出細胞の応答）
直径１２ｍｍのカバーガラス（ＣＳ－１２Ｒ：Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＬＬＣ，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）に、実施例１で得た匂い検出細胞を播種した後、カバーガラスを円形カバーガラス用開放型バスチャンバー（ＲＣ－４８ＬＰ：Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＬＬＣ，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）に挿入した。

【0090】

匂い検出細胞に溶液を潅流するために、ペリスタルティックチューブポンプ（ＭＰ－２０１０：Ｔｏｋｙｏ Ｒｉｋａｋｉｋａｉ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にそれぞれ接続した内径１ｍｍ、外径３ｍｍの２本のシリコンチューブを、チューブクランプ（ＣＡＴ－１：ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって、開放型バスチャンバーのインレットとアウトレットにそれぞれ接続した。

【0091】

２０倍の水浸対物レンズ（ＵＭＰｌａｎＦＩ ２０ｘ／０．５０Ｗ：Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を備えた正立蛍光顕微鏡（ＢＸ５１ＷＩ：Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用意した。正立蛍光顕微鏡には、ＧＦＰ用の蛍光フィルターセット（Ｕ－ＭＧＦＰＨＱ：Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を配置した。また、正立蛍光顕微鏡に、光源として、１００Ｗハロゲンランプ（ＴＨ４－１００，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）を配置した。蛍光観察時の露光時間を５００ミリ秒に設定した。

【0092】

細胞の蛍光強度変化の計測のために、ＥＭ－ＣＣＤカメラ（ＤＵ－８９７Ｅ：Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＰＬＣ，Ｂｅｌｆａｓｔ，ＵＫ）を用意した。ＥＭ－ＣＣＤカメラは、ＡｎｄｏｒｉＱ（Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＰＬＣ，Ｂｅｌｆａｓｔ，ＵＫ）で操作した。ＥＭ－ＣＣＤカメラは、毎秒５１２×５１２ピクセルの画像を取得するよう設定された。

【0093】

アッセイバッファーによる潅流を開始した。流量は約１．４ｍＬ／分に設定し、チャンバーの内液量は約２３０μＬに設定した。図９に示すように、匂い物質である１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌをバッファーとともに１５秒間流したところ、匂い検出細胞において蛍光強度の上昇が観察された。

【0094】

阻害剤候補物質である３００μｍｏｌ／Ｌのゲラニオールを６０秒流し、次に匂い物質である１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを３００μｍｏｌ／Ｌのゲラニオールとともに１５秒間流し、さらに６０秒３００μｍｏｌ／Ｌのゲラニオールを流したところ、匂い検出細胞における蛍光強度の上昇は、匂い物質の阻害剤がない場合と比較して抑制された。

【0095】

阻害剤候補物質である３００μｍｏｌ／Ｌのl－メントールを６０秒流し、次に匂い物質である１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを３００μｍｏｌ／Ｌのl－メントールとともに１５秒間流し、さらに６０秒３００μｍｏｌ／Ｌのｌ－メントールを流したところ、匂い検出細胞における蛍光強度の上昇は、匂い物質の阻害剤がない場合と比較して抑制された。

【0096】

阻害剤候補物質である３００μｍｏｌ／Ｌのチモールを６０秒流し、次に匂い物質である１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを３００μｍｏｌ／Ｌのチモールとともに１５秒間流し、さらに６０秒３００μｍｏｌ／Ｌのチモールを流したところ、匂い検出細胞における蛍光強度の上昇は、匂い物質の阻害剤がない場合と比較して抑制された。

【0097】

既知の匂い物質の阻害剤である３００μｍｏｌ／Ｌのぎ酸リナリル（ＬＦ）を６０秒流し、次に匂い物質である１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを３００μｍｏｌ／ＬのＬＦとともに１５秒間流し、さらに６０秒３００μｍｏｌ／ＬのＬＦを流したところ、匂い検出細胞における蛍光強度の上昇は、匂い物質の阻害剤がない場合と比較して抑制された。

【0098】

既知の匂い物質の阻害剤である３００μｍｏｌ／Ｌの２－ｔｅｒｔ－ブチル－６－メチルフェノール（ＢＭＰ）を６０秒流し、次に匂い物質である１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを３００μｍｏｌ／ＬのＢＭＰとともに１５秒間流し、さらに６０秒３００μｍｏｌ／ＬのＢＭＰを流したところ、匂い検出細胞における蛍光強度の上昇は、匂い物質の阻害剤がない場合と比較して抑制された。

【0099】

最後に、匂い物質である１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌをバッファーとともに１５秒間流したところ、匂い検出細胞における蛍光強度の上昇が回復した。

【0100】

実施例２の結果は、匂い検出細胞が、匂い物質の阻害剤のスクリーニングに有用であることを示している。

【0101】

（実施例３：香料成分の濃度に応じた匂い検出細胞の応答）
阻害剤候補物質である、チモール、シトラール、１－ノナノール、酢酸オイゲノール、ｄ－リモネン、オイゲノール、ゲラニオール、酢酸ゲラニル、及び既知の匂い物質の阻害剤であるＢＭＰ、及びＬＦを用意した。

【0102】

図９の測定方法と同様に、阻害剤を含めずに、匂い物質である１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを実施例１で得た匂い検出細胞に与え、匂い検出細胞における蛍光の強度を測定した。次に、１０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は阻害剤、３０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は阻害剤、１００μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は阻害剤、１７０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は阻害剤、３００μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は阻害剤、５６０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は阻害剤、１ｍｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は阻害剤、３ｍｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は阻害剤を順次１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌとともに匂い検出細胞に与え、匂い検出細胞における蛍光の強度を測定した。最後に、阻害剤を含めずに、１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを匂い検出細胞に与え、匂い検出細胞における蛍光の強度を測定した。

【0103】

阻害剤を含めずに１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを匂い検出細胞に与えたときの匂い検出細胞における蛍光強度変化率の平均値を１００％として、各阻害剤についての、阻害剤の濃度と、匂い検出細胞における蛍光の正規化された強度と、の得られた関係を図１０のグラフに示す。図１０に示されたように、匂い検出細胞における匂い物質に対する応答は、阻害剤の濃度に応じて抑制された。

【0104】

実施例３の結果は、匂い検出細胞が、匂い物質の阻害剤のスクリーニングに有用であることを示している。

【0105】

（実施例４：阻害剤候補物質の濃度に応じた匂い検出細胞の応答）
阻害剤候補物質である、トランスケイ皮酸メチル、及びトランスケイ皮酸ｔｅｒｔブチルを用意した。

【0106】

阻害剤候補物質を含めずに、匂い物質である１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを実施例１で得た匂い検出細胞に与え、匂い検出細胞における蛍光の強度を測定した。次に、１０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質、３０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質、１００μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質、１７０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質、３００μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質、５６０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質、及び１ｍｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質を順次１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌとともに匂い検出細胞に与え、匂い検出細胞における蛍光の強度を測定した。最後に、阻害剤を含めずに、１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを匂い検出細胞に与え、匂い検出細胞における蛍光の強度を測定した。

【0107】

阻害剤候補物質を含めずに１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを匂い検出細胞に与えたときの匂い検出細胞における蛍光強度変化率の平均値を１００％として、各阻害剤候補物質についての、阻害剤候補物質の濃度と、匂い検出細胞における蛍光の正規化された強度と、の得られた関係を図１１のグラフに示す。図１１に示されたように、匂い検出細胞における匂い物質に対する応答は、阻害剤候補物質の濃度に応じて抑制された。

【0108】

（実施例５：阻害剤及び阻害剤候補物質の濃度に応じた匂い検出細胞の応答）
阻害剤候補物質である、２，４－ジイソプロピルフェノール、４－イソプロピル－３－メチルフェノール、２－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール、４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノール、及び２－イソプロピル―６－メチルフェノールを用意した。

【0109】

阻害剤候補物質を含めずに、匂い物質である１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを実施例１で得た匂い検出細胞に与え、匂い検出細胞における蛍光の強度を測定した。次に、１０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質、３０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質、１００μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質、１７０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質、及び３００μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質を順次１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌとともに匂い検出細胞に与え、匂い検出細胞における蛍光の強度を測定した。最後に、阻害剤を含めずに、１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを匂い検出細胞に与え、匂い検出細胞における蛍光の強度を測定した。

【0110】

阻害剤候補物質を含めずに１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを匂い検出細胞に与えたときの匂い検出細胞における蛍光強度変化率の平均値を１００％として、各阻害剤候補物質についての、阻害剤候補物質の濃度と、匂い検出細胞における蛍光の正規化された強度と、の得られた関係を図１２のグラフに示す。図１２に示されたように、匂い検出細胞における匂い物質に対する応答は、阻害剤候補物質の濃度に応じて抑制された。

【0111】

（実施例６：濃度に応じた匂い検出細胞の阻害効果による阻害剤及び阻害剤候補物質のスクリーニング）
実施例３から５の結果に基づき、ディート、ｄ－リモネン、シトラール、ぎ酸リナリル、オイゲノール、ゲラニオール、１－ノナノール、酢酸ゲラニル、チモール、酢酸オイゲノール、トランスケイ皮酸メチル、トランスケイ皮酸ｔｅｒｔブチル、２，４－ジイソプロピルフェノール、４－イソプロピル－３－メチルフェノール、２－イソプロピル―６－メチルフェノール、２－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール、及び４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノールの濃度が３００μＭであるときの蛍光強度変化率の値のグラフを図１３に示す。

【0112】

トランスケイ皮酸メチル、トランスケイ皮酸ｔｅｒｔブチル、２，４－ジイソプロピルフェノール、４－イソプロピル－３－メチルフェノール、２－イソプロピル―６－メチルフェノール、２－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール、及び４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノールは、１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを匂い検出細胞に与えたときの匂い検出細胞における蛍光強度変化率を３７％未満にした。後述する実施例７に示すように、阻害剤であるＢＭＰ、並びに阻害剤候補物質である４－イソプロピル－３－メチルフェノール及び４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノールは、エレクトロアンテノグラムで、阻害効果が認められた。実施例６の場合、それらの物質の蛍光強度変化率は２５％（２４．７％）未満であった。一方、後述する実施例７に示すように、蛍光強度変化率が３７％以上である酢酸オイゲノール、１－ノナノール、及びチモールでは、エレクトロアンテノグラムで、阻害効果が認められなかった。実施例６の場合、それらの物質の蛍光強度変化率は３７％以上であった。よって、蛍光強度変化率の値が２５％未満の物質は阻害効果が認められ、蛍光強度変化率の値が３７％未満であれば、阻害効果を得られることが示された。また、２－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール、及び４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノールは、１０μｍｏｌ／Ｌの１－ｏｃｔｅｎ－３－ｏｌを匂い検出細胞に与えたときの匂い検出細胞における蛍光強度変化率を２０％以下にした。

【0113】

（実施例７：阻害剤への触角の応答）
図１４に示すように、２本の金属電極の表面にそれぞれゲル滴（Ｓｐｅｃｔｒａ ３６０ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ Ｇｅｌ、Ｐａｒｋｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を載せ、先端と基部を切除したカイコガの触角をゲル滴に接触させて、２本の金属電極の間に触角をアーチ状に設置した。昆虫の触角は、匂い物質に応答して、先端と基部の間の電位が変化することが知られており、当該電位を記録することは、エレクトロアンテノグラム（ＥＡＧ）と呼ばれている。

【0114】

カイコガの性フェロモンであるボンビコール（ＢＯＬ）、既知の匂い物質の阻害剤であるＢＭＰ、阻害剤候補物質である４－イソプロピル－３－メチルフェノール、及び阻害剤候補物質である４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノールを用意した。１０００ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙、１０００ｎｇのＢＯＬと１０００μｇのＢＭＰを滴下したろ紙、１０００ｎｇのＢＯＬと１０００ｎｇの４－イソプロピル－３－メチルフェノールを滴下したろ紙、及び１０００ｎｇのＢＯＬと１０００ｎｇの４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノールを滴下したろ紙を用意した。第１のガラス管カートリッジにＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第２のガラス管カートリッジにＢＯＬとＢＭＰを滴下したろ紙を入れ、第３のガラス管カートリッジにＢＯＬと４－イソプロピル－３－メチルフェノールを滴下したろ紙を入れ、第４のガラス管カートリッジにＢＯＬと４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノールを滴下したろ紙を入れた。

【0115】

第１のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位が図１５（ａ）上段に示すように低下した。次に、第２のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬとＢＭＰを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位の低下は、図１５（ｂ）上段に示すように、ＢＭＰを含まない場合と比較して、半分以下に抑制された。再び、第１のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位は、図１５（ｃ）上段に示すように、低下した。

【0116】

第１のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位が図１５（ａ）中段に示すように低下した。次に、第３のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬと４－イソプロピル－３－メチルフェノールを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位の低下は、図１５（ｂ）中段に示すように、４－イソプロピル－３－メチルフェノールを含まない場合と比較して、半分程度に抑制された。再び、第１のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位は、図１５（ｃ）中段に示すように、低下した。

【0117】

第１のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位が図１５（ａ）下段に示すように低下した。次に、第４のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬと４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノールを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位の低下は、図１５（ｂ）下段に示すように、４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノールを含まない場合と比較して、半分程度に抑制された。再び、第１のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位は、図１５（ｃ）下段に示すように、低下した。

【0118】

カイコガの性フェロモンであるボンビコール（ＢＯＬ）、阻害剤候補物質である酢酸オイゲノール、阻害剤候補物質である１－ノナノール、及び阻害剤候補物質であるチモールを用意した。１０００ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙、１０００ｎｇのＢＯＬと１０００μｇの酢酸オイゲノールを滴下したろ紙、１０００ｎｇのＢＯＬと１０００μｇの１－ノナノールを滴下したろ紙、及び１０００ｎｇのＢＯＬと１０００ｎｇのチモールを滴下したろ紙を用意した。第５のガラス管カートリッジにＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第６のガラス管カートリッジにＢＯＬと酢酸オイゲノールを滴下したろ紙を入れ、第７のガラス管カートリッジにＢＯＬと１－ノナノールを滴下したろ紙を入れ、第８のガラス管カートリッジにＢＯＬとチモールを滴下したろ紙を入れた。

【0119】

第５のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位が図１６（ａ）上段に示すように低下した。次に、第６のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬと酢酸オイゲノールを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位の低下は、図１６（ｂ）上段に示すように、酢酸オイゲノールを含まない場合と比較して、増強された。再び、第５のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位は、図１６（ｃ）上段に示すように、低下した。

【0120】

第５のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位が図１６（ａ）中段に示すように低下した。次に、第７のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬと１－ノナノールを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位の低下は、図１６（ｂ）中段に示すように、１－ノナノールを含まない場合と比較して、増強された。再び、第５のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位は、図１６（ｃ）中段に示すように、低下した。

【0121】

第５のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位が図１６（ａ）下段に示すように低下した。次に、第８のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬとチモールを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位の低下は、図１６（ｂ）下段に示すように、チモールを含まない場合と比較して、増強された。再び、第５のガラス管カートリッジから触角に１Ｌ／分でＢＯＬを含む気体を噴射したところ、触角の先端と基部の間の電位は、図１６（ｃ）下段に示すように、低下した。

【0122】

実施例７の結果は、ＥＡＧが、匂い物質の阻害剤のスクリーニングに有用であることを示している。

【0123】

（実施例８：阻害剤への昆虫の応答）
複数の透明な蓋付きプラスチック容器（マルカップ２００ＭＢ、ミネロン化成工業株式会社）を用意した。プラスチック容器の蓋には、パスツールピペットの先端を差し込める小さな穴をあけた。複数のプラスチック容器のそれぞれに、オスのカイコガを一匹入れて蓋を閉めた。

【0124】

カイコガの性フェロモンであるボンビコール（ＢＯＬ）、既知の匂い物質の阻害剤であるＢＭＰを用意した。０．０１ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙、０．１ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙、１ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙、１０ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙、１００ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙、１０００ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙、及びヘキサンで希釈した１０００μｇのＢＭＰを滴下したろ紙を用意した。

【0125】

第１のパスツールピペットに０．０１ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第２のパスツールピペットに０．１ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第３のパスツールピペットに１ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第４のパスツールピペットに１０ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第５のパスツールピペットに１００ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第６のパスツールピペットに１０００ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第７のパスツールピペットにＢＭＰを滴下したろ紙を入れた。それぞれのパスツールピペットをプラスチック容器に挿入し、カイコガをＡｉｒ－ｐｕｆｆ（パフ）刺激した。

【0126】

図１７に示すように、順次各濃度のＢＯＬでカイコガを３回パフ刺激したところ、１ｎｇのＢＯＬで５匹中３匹のカイコガが羽ばたき行動を示し、２匹のカイコガが探索行動を示した。１０ｎｇのＢＯＬでは、全てのカイコガが探索行動を示した。

【0127】

図１８に示すように、ＢＭＰで３回パフ刺激をした後、順次各濃度のＢＯＬでカイコガを３回パフ刺激したところ、１ｎｇのＢＯＬでは、５匹中３匹のカイコガが反応を示さず、２匹のカイコガが羽ばたき行動を示した。１０ｎｇのＢＯＬでは、５匹中１匹のカイコガが反応を示さず、５匹中２匹のカイコガが羽ばたき行動を示し、５匹中２匹のカイコガが探索行動を示した。１００ｎｇのＢＯＬでは、３匹中１匹のカイコガが羽ばたき行動を示し、２匹のカイコガが探索行動を示した。１０００ｎｇのＢＯＬでは、残りの１匹のカイコガが探索行動を示した。図１７と図１８の比較から、ＢＭＰは昆虫の匂い物質への応答を阻害し、羽ばたき行動及び探索行動を生じさせるＢＯＬの濃度の閾値を上昇させることが示された。

【0128】

実施例８の結果は、昆虫の応答を観察することが、匂い物質の阻害剤のスクリーニングに有用であることを示している。

【0129】

（実施例９：昆虫による阻害剤のスクリーニング）
実施例８と同じ複数のプラスチック容器を用意し、複数のプラスチック容器のそれぞれに、オスのカイコガを一匹入れて蓋を閉めた。

【0130】

ヘキサンで希釈したボンビコール（ＢＯＬ）を用意した。阻害剤候補物質として、ヘキサンで希釈した４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノール、及びエタノールで希釈した４－イソプロピル－３－メチルフェノールを用意した。

【0131】

第１のパスツールピペットに０．０１ｎｇのヘキサンで希釈したＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第２のパスツールピペットにヘキサンで希釈した０．１ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第３のパスツールピペットにヘキサンで希釈した１ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第４のパスツールピペットにヘキサンで希釈した１０ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第５のパスツールピペットにヘキサンで希釈した１００ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙を入れ、第６のパスツールピペットにヘキサンで希釈した１０００ｎｇのＢＯＬを滴下したろ紙を入れた。

【0132】

図１９に示すように、順次ヘキサンで希釈した各濃度のＢＯＬでカイコガを３回パフ刺激したところ、０．０１ｎｇのヘキサンで希釈されたＢＯＬで３匹中２匹のカイコガが反応を示さず、１匹のカイコガが羽ばたき行動を示した。０．１ｎｇのヘキサンで希釈されたＢＯＬで全てのカイコガが探索行動を示した。

【0133】

ヘキサンで希釈した１０００ｎｇの４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノールを滴下したろ紙を、カイコガと共にプラスチック容器に１０分間入れた。その後、図２０に示すように、順次ヘキサンで希釈した各濃度のＢＯＬでカイコガを３回パフ刺激したところ、ヘキサンで希釈された０．０１ｎｇのＢＯＬで全てのカイコガが反応を示さなかった。ヘキサンで希釈された０．１ｎｇのＢＯＬで３匹中２匹のカイコガが反応を示さず、１匹のカイコガが羽ばたき行動を示した。ヘキサンで希釈された１ｎｇのＢＯＬで３匹中２匹のカイコガが反応を示さず、１匹のカイコガが探索行動を示した。ヘキサンで希釈された１０ｎｇのＢＯＬで２匹中１匹のカイコガが羽ばたき行動を示し、１匹のカイコガが探索行動を示した。ヘキサンで希釈された１００ｎｇのＢＯＬで残った１匹のカイコガが探索行動を示した。図１９と図２０の比較から、４－ｔｅｒｔ－ブチル－２－メチルフェノールは昆虫の匂い物質への応答を阻害し、羽ばたき行動及び探索行動を生じさせるＢＯＬの濃度の閾値を上昇させることが示された。

【0134】

エタノールを滴下したろ紙を、カイコガと共にプラスチック容器に１０分間入れた。その後、図２１に示すように、順次ヘキサンで希釈した各濃度のＢＯＬでカイコガを３回パフ刺激したところ、０．０１ｎｇのヘキサンで希釈されたＢＯＬで全てのカイコガが反応を示さなかった。０．１ｎｇのヘキサンで希釈されたＢＯＬで３匹中２匹のカイコガが反応を示さず、１匹のカイコガが羽ばたき行動を示した。１ｎｇのヘキサンで希釈されたＢＯＬで全てのカイコガが探索行動を示した。

【0135】

エタノールで希釈した１０００ｎｇの４－イソプロピル－３－メチルフェノールを滴下したろ紙を、カイコガと共にプラスチック容器に１０分間入れた。その後、図２２に示すように、順次ヘキサンで希釈した各濃度のＢＯＬでカイコガを３回パフ刺激したところ、ヘキサンで希釈された０．０１ｎｇ及び０．１ｎｇのＢＯＬで全てのカイコガが反応を示さなかった。ヘキサンで希釈された１ｎｇのＢＯＬで３匹中２匹のカイコガが反応を示さず、１匹のカイコガが羽ばたき行動を示した。ヘキサンで希釈された１０ｎｇのＢＯＬで３匹中２匹のカイコガが羽ばたき行動を示し、１匹のカイコガが探索行動を示した。ヘキサンで希釈された１００ｎｇのＢＯＬで全てのカイコガが探索行動を示した。図２１と図２２の比較から、４－イソプロピル－３－メチルフェノールは昆虫の匂い物質への応答を阻害し、羽ばたき行動及び探索行動を生じさせるＢＯＬの濃度の閾値を上昇させることが示された。

【0136】

（実施例１０：Ｏｒ５６を発現する匂い検出細胞の作製）
キイロショウジョウバエの触覚ｃＤＮＡ由来の、共受容体であるＤｍＯｒｃｏの遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、下記の遺伝子特異的配列を含むプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ＤｍＯｒｃｏ遺伝子を得た。得られたＤｍＯｒｃｏの遺伝子を、ｐＩＺベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイトにＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ）を用いて挿入し、ｐＩＺ－ＤｍＯｒｃｏベクターを構築した。

【0137】

ＤｍＯｒｃｏ：
フォワード：5'-TTCGAATTTAAAGCTGCCGCCATGATGACAACCTCGATGCAGCC-3'
リバース：5'-TTACCTTCGAACCGCTTACTTGAGCTGCACCAGCAC-3'

【0138】

また、構築したｐＩＺ－ＤｍＯｒｃｏベクターを下記のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＩＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＰｃｉ１部位にＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ）を用いて挿入し、ｐＩＢ－ＤｍＯｒｃｏベクターを構築した。

【0139】

ｐＩＢ－Ｐｃｉ１：
フォワード：5'-GCAGGAAAGAACATGCATGATGATAAACAATGTATGGTGCTAATG-3'
リバース：5'-CCTTTTGCTCACATGGTTATCCCCTGATTCTGTGG-3

【0140】

ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、各１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度のフォワードプライマー及びリバースプライマー、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ、Ｒ０１０Ａ）、当該ポリメラーゼに添付の反応バッファー、並びにｄＮＴＰを使用し、ポリメラーゼに添付のプロトコールに従って行った。ＰＣＲの温度条件は、９４℃で１分間のステップ、次に、９８℃で１０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で１．５分間の温度サイクルを３０サイクル繰り返すステップ、その後、７２℃で５分間のステップとした。

【0141】

次に、嗅覚受容体であるＤｍＯｒ５６ａの塩基配列を昆虫細胞Ｓｆ９にコドン変換し、下記の配列をアダプター配列として付加して遺伝子を合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。

【0142】

アダプター配列：
フォワード：5'-CAGTGTGGTGGAATTGCCGCC-3'
リバース：5'-GCCCTCTAGACTCGATTA-3'

【0143】

得られたＤｍＯｒ５６ａ＿Ｓｆ９の合成遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、上記のアダプター配列のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ＤｍＯｒ５６ａ＿Ｓｆ９遺伝子を得た。得られたＤｍＯｒ５６ａ＿Ｓｆ９の遺伝子を、構築したｐＩＢ－ＤｍＯｒｃｏベクターのマルチクローニングサイトにＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ）を用いて挿入し、ｐＩＢ－ＤｍＯｒ５６ａ＿Ｓｆ９－ＤｍＯｒｃｏベクターを構築した。

【0144】

ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、各１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度のフォワードプライマー及びリバースプライマー、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ、Ｒ０１０Ａ）、当該ポリメラーゼに添付の反応バッファー、並びにｄＮＴＰを使用し、ポリメラーゼに添付のプロトコールに従って行った。ＰＣＲの温度条件は、９８℃で２分間のステップ、次に、９８℃で１０秒間、５５℃で１０秒間、７２℃で１．５分間の温度サイクルを２５サイクル繰り返すステップ、その後、７２℃で１０分間のステップとした。

【0145】

同様に、カルシウム感受性タンパク質（ＧＣａＭＰ６ｓ）発現ベクターを構築した。ＧＣａＭＰ６ｓ遺伝子は、Ａｄｄｇｅｎｅを介して、Ｄｏｕｇｌａｓ Ｋｉｍ博士（Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｍｐｕｓ， Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より入手した。ＧＣａＭＰ６ｓの遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、下記の遺伝子特異的配列を含むプライマーで増幅し、ＧＣａＭＰ６ｓ遺伝子を得た。得られたＧＣａＭＰ６ｓの遺伝子を、ｐＩＺベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイトにＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ）を用いて挿入し、ｐＩＺ－ ＧＣａＭＰ６ｓ ベクターを構築した。

【0146】

ＧＣａＭＰ６ｓ：
フォワード：5'-TTCGAATTTAAAGCTGCCGCCATGGGTTCTCATCATCATCATC-3'
リバース：5'-TTACCTTCGAACCGCTCACTTCGCTGTCATCATTTGTAC-3'

【0147】

構築した嗅覚受容体発現ベクター及びカルシウム感受性タンパク質発現ベクターを、トランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＩＴ－Ｉｎｓｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ：Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて、添付のマニュアルに従ってＳｆ２１細胞に導入した。これにより、ＤｍＯｒ５６ａ＿Ｓｆ９受容体、ＤｍＯｒｃｏ、及びＧＣａＭＰ６ｓを共発現しているＳｆ２１細胞（以下、「Ｏｒ５６を発現する匂い検出細胞」という。）を得た。

【0148】

（実施例１１：Ｏｒ５６を発現する均質な匂い検出細胞系統の樹立）
前準備として、系統化を行う前の継代時に、６ｍＬのＯｒ５６を発現する匂い検出細胞を含む培地を１フラスコ（ＦＡＬＣＯＮ）用意した。コンフルエントになった細胞のフラスコから培養上清６ｍＬを１５ｍＬチューブ（ＴＰＰ）に回収し、４００×ｇ、３分、４℃で遠心分離した。遠心分離後の上清を２５ｍＬチューブ（ＩＷＡＫＩ）に回収し、１０ｍＬシリンジ（ＴＯＰ）と０．４５μｍフィルター（ＣＯＲＮＩＮＧ）を用いて滅菌した。滅菌した培地５ｍＬ、新しい培地５ｍＬ、及び新しい培地分の２種の抗生物質（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＺｅｏｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を混合し、コンディション培地を調製した。

【0149】

次に、フラスコ底面の細胞を剥がし、新しい培地１ｍＬに細胞を懸濁し、その懸濁液を１．５ｍＬチューブ（ＡＸＹＧＥＮ）に回収した。１．５ｍＬチューブに回収した細胞の細胞数の測定を行い、４０個の細胞をコンディション培地に加えて細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液の全量をリザーバー（ＢＭＢｉｏ）に移し、８マルチチャンネルピペット（ＨＴＬ）を用いて９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）に１００μＬずつ播種し、２７℃のインキュベータで培養した。細胞がウェルに接着した後、倒立顕微鏡でシングルセルが入ったウェルを確認した。

【0150】

９６ウェルプレートでシングルセルを確認したウェルの細胞を約８０％から９０％コンフルエントになるまで培養を続けた。その後、２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）、３５ｍｍディッシュ（ＣＯＲＮＩＮＧ）、及びＴ２５フラスコの順にスケールアップした。Ｔ２５フラスコまでスケールアップが出来た細胞は、カルシウムイメージング法により蛍光の応答を確認し、応答がない細胞は破棄し、応答がある細胞は凍結ストックを作製し、継代を繰り返しながら系統を維持した。

【0151】

（実施例１２：阻害剤及び阻害剤候補物質の濃度に応じたＯｒ５６を発現する匂い検出細胞の応答）
阻害剤候補物質である、２，４－ジイソプロピルフェノール、２，５－ジイソプロピルフェノール、４－イソプロピル－３－メチルフェノール、２－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール、４－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２－メチルフェノール、及び２－イソプロピル－６－メチルフェノールを用意した。また、既知の匂い物質の阻害剤である２－ｔｅｒｔ－ブチル－６－メチルフェノール（ＢＭＰ）を用意した。

【0152】

阻害剤候補物質又は既知の阻害剤を含めずに、匂い物質である１μｍｏｌ／Ｌのゲオスミンを実施例１１で得たＯｒ５６を発現する匂い検出細胞に与え、匂い検出細胞における蛍光の強度を測定した。次に、１０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は既知の阻害剤、３０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は既知の阻害剤、１００μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は既知の阻害剤、１７０μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は既知の阻害剤、及び３００μｍｏｌ／Ｌの阻害剤候補物質又は既知の阻害剤を順次１μｍｏｌ／Ｌのゲオスミンとともに匂い検出細胞に与え、匂い検出細胞における蛍光の強度を測定した。最後に、阻害剤又は既知の阻害剤を含めずに、１μｍｏｌ／Ｌのゲオスミンを匂い検出細胞に与え、匂い検出細胞における蛍光の強度を測定した。

【0153】

阻害剤候補物質又は既知の阻害剤を含めずに１μｍｏｌ／Ｌのゲオスミンを匂い検出細胞に与えたときの匂い検出細胞における蛍光強度変化率の平均値を１００％として、各阻害剤候補物質及び既知の阻害剤の濃度と、匂い検出細胞における蛍光の正規化された強度と、の得られた関係を図２３のグラフに示す。図２３に示されたように、Ｏｒ５６を発現する匂い検出細胞における匂い物質に対する応答は、阻害剤候補物質及び既知の阻害剤の濃度に応じて抑制された。

【0154】

（実施例１２：阻害剤への昆虫の応答）
阻害剤候補物質としてＤＭＳＯを溶媒とする４－イソプロピル－３－メチルフェノール（ＩＰＭＰ）、及びコントロールとしてＤＭＳＯを試験薬剤として用意した。ゴキブリフェロモンであるペリプラノンＡ及びペリプラノンＢの粗抽出物（アセトン溶媒）を１μＬ用意し、１５ｍｍ四方のろ紙片又はアルミ片に付着させ、溶媒のアセトンを十分揮発させた。

【0155】

１０頭前後のゴキブリを飼育しているコンテナのフタを、暗室内の赤色照明下で外し、餌皿と給水カップを回収した。試験薬剤を含ませたろ紙を載せたシャーレ２つをコンテナ四隅のうち対角となる場所に設置した。また、保湿のため、水を含ませたキムワイプをコンテナへ入れ、コンテナにフタをした。その後、３０分間静置した。

【0156】

コンテナの動画撮影を開始し、ゴキブリフェロモン粗抽出物を付着させたろ紙片又はアルミ片を、試験薬剤を含ませたろ紙を載せたシャーレの１つの上へ設置した。その後、図２４に示すように、撮影をしやすくするため、フタの代わりに透明アクリル板をコンテナに載せ、１０分間、動画を撮影した。

【0157】

撮影をした動画を解析し、透明アクリル板をコンテナに載せた直後から５分間に、ゴキブリフェロモン粗抽出物を付着させたろ紙片又はアルミ片にゴキブリが接触した延べ回数を計測した。その結果、図２５に示すように、ＤＭＳＯを溶媒とした３００ｍｍｏｌ／Ｌの４－イソプロピル－３－メチルフェノールは、フェロモンを含ませたろ紙片又はアルミ片へゴキブリが近づき、接触することを妨げた。また、図２６に示すように、４－イソプロピル－３－メチルフェノールの濃度が高くなるほど、フェロモンを含ませたろ紙片又はアルミ片にゴキブリが近づくことが抑制された。

【符号の説明】

【0158】

２０・・・散布部、２１・・・貯留部、２１ａ・・・本体、２１ｂ・・・蓋、２２・・・微粒化部、２３・・・吹出部、２５・・・二流体ノズル、２５ａ・・・気体流入口、２５ｂ・・・溶液流入口、２６・・・噴霧口、２７・・・接続部、３０・・・制御部、３１・・・コントローラー、３２・・・ポンプ、３３・・・弁、３４・・・気体供給管、４１・・・貯留部、４２・・・微粒子化部、４３・・・吹出部、４５・・・圧電素子、４７・・・ノズルヘッド、４８・・・配線、６０・・・散布部、６１・・・貯留部、６２・・・微粒化部、６２・・・微粒子化部、６３・・・吹出部、６５・・・超音波透過膜、６６・・・振動発生容器、６７・・・作用水、７０・・・配線、７１・・・配線、８０・・・散布部、８１・・・貯留部、８１ａ・・・本体、８１ｂ・・・蓋、８２・・・微粒子化部、８３・・・吹出部、８４・・・静電噴霧ノズル、８５・・・搬送部、８６・・・筒状部材、８７・・・電圧印加部、１２０・・・散布部、１３０・・・制御部、２３０・・・制御部、３３０・・・高電圧制御部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【配列表】

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