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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024122632
(43)【公開日】2024-09-09
(54)【発明の名称】器官芽の保存方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240902BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023030290
(22)【出願日】2023-02-28
(71)【出願人】
【識別番号】505155528
【氏名又は名称】公立大学法人横浜市立大学
(71)【出願人】
【識別番号】000003986
【氏名又は名称】日産化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】谷口 英樹
(72)【発明者】
【氏名】田所 友美
(72)【発明者】
【氏名】畑中 大輔
(72)【発明者】
【氏名】阿武 志保
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BD12
4B065BD33
4B065BD50
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】従来の課題を解決できる新規の器官芽の保存技術の確立。
【解決手段】脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び、アルギン酸又はその塩を含む、器官芽を保存するための液体組成物。
【選択図】なし
【解決手段】脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び、アルギン酸又はその塩を含む、器官芽を保存するための液体組成物。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び、アルギン酸又はその塩を含む、器官芽を保存するための液体組成物。
【請求項2】
塑性流体であることを特徴とする、請求項１記載の液体組成物。
【請求項3】
脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度が、０．００２～０．０１（ｗ／ｖ）％であり、
アルギン酸又はその塩の濃度が、０．００４～０．１（ｗ／ｖ）％である、
請求項１又は２記載の液体組成物。
アルギン酸又はその塩の濃度が、０．００４～０．１（ｗ／ｖ）％である、
請求項１又は２記載の液体組成物。
【請求項4】
さらに器官芽を含む、請求項１～３のいずれか一項記載の液体組成物。
【請求項5】
液体組成物において、器官芽が１～７６８０器官芽／ｍＬの密度で存在することを特徴とする、請求項４記載の液体組成物。
【請求項6】
液体組成物において、溶液中に占める器官芽の体積が０．００００２～０．１７％の比率で存在することを特徴とする、請求項４記載の液体組成物。
【請求項7】
液体組成物が、１５～３４℃に維持されることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項記載の液体組成物。
【請求項8】
器官芽が、肝芽である、請求項１～７のいずれか一項記載の液体組成物。
【請求項9】
脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び、アルギン酸又はその塩を含む液体組成物中で器官芽を浮遊及び分散させる工程を含む、器官芽を保存するための方法。
【請求項10】
液体組成物が、塑性流体であることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項11】
液体組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度が、０．００２～０．０１（ｗ／ｖ）％であり、
アルギン酸又はその塩の濃度が、０．００４～０．１（ｗ／ｖ）％である、
請求項９又は１０記載の方法。
アルギン酸又はその塩の濃度が、０．００４～０．１（ｗ／ｖ）％である、
請求項９又は１０記載の方法。
【請求項12】
液体組成物において、器官芽が１～７６８０器官芽／ｍＬの密度で存在することを特徴とする、請求項９～１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項13】
液体組成物において、溶液中に占める器官芽の体積が０．００００２～０．１７％の比率で存在することを特徴とする、請求項９～１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項14】
器官芽の保存が、１５～３４℃で行われることを特徴とする、請求項９～１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項15】
器官芽が、肝芽である、請求項９～１４のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、器官芽を保存するための方法に関し、より詳細には、脱アシル化ジェランガム及びアルギン酸を用いた、器官芽を保存するための方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、末期臓器不全に対して臓器移植が唯一の根本的治療法である。しかし、ドナー臓器の供給は絶対的に不足しており、米国だけでも毎年２千人以上の肝不全患者が移植を待つ間に死亡あるいは病状悪化により移植が受けられない状態が続いている。従って、臓器移植に代わる治療法として、新たなヒト臓器創出技術の開発が求められている。
【0003】
かかる状況下、本発明者らのグループは、これまでに様々な器官芽を調製する方法を構築している。例えば、本発明者らのグループは、肝内胚葉細胞、血管内皮細胞、間葉系細胞の３種類の細胞から、血管網を有した肝臓の原基（肝芽）を調製する方法を構築しており、さらには、これらの３種類の細胞すべてをｉＰＳ細胞から調製することで、高品質かつ均質な肝芽を大量に調製する方法を構築している（特許文献１～３、非特許文献１、２）。
【0004】
本発明者らのグループの成果により肝芽をはじめとする器官芽を調製する手段は構築されたが、依然として器官芽の生体移植プロセスには課題が存在する。生体移植用の器官芽は細胞培養加工施設を用いて再生医療等製品の製造管理及び品質管理の基準であるGCTPに準拠して製造されるが、調製された器官芽を品質を保ったうえで医療機関などの移植実施施設へ輸送するためには、器官芽の保存技術が必要不可欠である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】ＷＯ２０１３／０４７６３９
【特許文献2】ＷＯ２０１５／０１２１５８
【特許文献3】ＷＯ２０１９／１０７５３５
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Takebe T et al., Nature 499, pp481-484, 2013
【非特許文献2】Takebe T et al., Cell Stem Cell 16, pp556-565, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
器官芽は栄養や酸素供給の面から、分散した状態で保存および輸送されることが求められる。現在は、研究施設などで調製された移植用の器官芽は凝集を防ぎ分散状態を保つために４℃などの低温条件下で医療機関へ輸送されることが一般的である。しかし、低温条件下における器官芽の保存及び輸送は６時間程度が限界である。また、分散状態を保つためにゲル包埋による保存も可能であるが、使用温度範囲が限定されること、および移植前に器官芽をゲルから取り出す作業を要することなど、課題も多い。従って、これらの課題を解決できる新規の器官芽の保存および輸送技術の確立が強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、脱アシル化ジェランガムとアルギン酸を含む水溶液が、
（１）撹拌等の操作なしに、肝芽を浮遊及び分散した状態で維持できること、
（２）常温に近い温度帯で肝芽を保存できること、
（３）生物学的機能を良好に保持した肝芽を長時間保存できること、
等を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）撹拌等の操作なしに、肝芽を浮遊及び分散した状態で維持できること、
（２）常温に近い温度帯で肝芽を保存できること、
（３）生物学的機能を良好に保持した肝芽を長時間保存できること、
等を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【0009】
［１］
脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び、アルギン酸又はその塩を含む、器官芽を保存するための液体組成物。
［２］
塑性流体であることを特徴とする、［１］記載の液体組成物。
［３］
脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度が、０．００２～０．０１（ｗ／ｖ）％であり、
アルギン酸又はその塩の濃度が、０．００４～０．１（ｗ／ｖ）％である、
［１］又は［２］記載の液体組成物。
［４］
さらに器官芽を含む、［１］～［３］のいずれか記載の液体組成物。
［５］
液体組成物において、器官芽が１～７６８０器官芽／ｍＬの密度で存在することを特徴とする、［４］記載の液体組成物。
［６］
液体組成物において、溶液中に占める器官芽の体積が０．００００２～０．１７％の比率で存在することを特徴とする、［４］記載の液体組成物。
［７］
液体組成物が、１５～３４℃に維持されることを特徴とする、［１］～［６］のいずれか記載の液体組成物。
［８］
器官芽が、肝芽である、［１］～［７］のいずれか記載の液体組成物。
［９］
脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び、アルギン酸又はその塩を含む液体組成物中で器官芽を浮遊及び分散させる工程を含む、器官芽を保存するための方法。
［１０］
液体組成物が、塑性流体であることを特徴とする、［９］記載の方法。
［１１］
液体組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度が、０．００２～０．０１（ｗ／ｖ）％であり、
アルギン酸又はその塩の濃度が、０．００４～０．１（ｗ／ｖ）％である、
［９］又は［１０］記載の方法。
［１２］
液体組成物において、器官芽が１～７６８０器官芽／ｍＬの密度で存在することを特徴とする、［９］～［１１］のいずれか記載の方法。
［１３］
液体組成物において、溶液中に占める器官芽の体積が０．００００２～０．１７％の比率で存在することを特徴とする、［９］～［１１］のいずれか記載の方法。
［１４］
器官芽の保存が、１５～３４℃で行われることを特徴とする、［９］～［１３］のいずれか記載の方法。
［１５］
器官芽が、肝芽である、［９］～［１４］のいずれか記載の方法。
脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び、アルギン酸又はその塩を含む、器官芽を保存するための液体組成物。
［２］
塑性流体であることを特徴とする、［１］記載の液体組成物。
［３］
脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度が、０．００２～０．０１（ｗ／ｖ）％であり、
アルギン酸又はその塩の濃度が、０．００４～０．１（ｗ／ｖ）％である、
［１］又は［２］記載の液体組成物。
［４］
さらに器官芽を含む、［１］～［３］のいずれか記載の液体組成物。
［５］
液体組成物において、器官芽が１～７６８０器官芽／ｍＬの密度で存在することを特徴とする、［４］記載の液体組成物。
［６］
液体組成物において、溶液中に占める器官芽の体積が０．００００２～０．１７％の比率で存在することを特徴とする、［４］記載の液体組成物。
［７］
液体組成物が、１５～３４℃に維持されることを特徴とする、［１］～［６］のいずれか記載の液体組成物。
［８］
器官芽が、肝芽である、［１］～［７］のいずれか記載の液体組成物。
［９］
脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び、アルギン酸又はその塩を含む液体組成物中で器官芽を浮遊及び分散させる工程を含む、器官芽を保存するための方法。
［１０］
液体組成物が、塑性流体であることを特徴とする、［９］記載の方法。
［１１］
液体組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度が、０．００２～０．０１（ｗ／ｖ）％であり、
アルギン酸又はその塩の濃度が、０．００４～０．１（ｗ／ｖ）％である、
［９］又は［１０］記載の方法。
［１２］
液体組成物において、器官芽が１～７６８０器官芽／ｍＬの密度で存在することを特徴とする、［９］～［１１］のいずれか記載の方法。
［１３］
液体組成物において、溶液中に占める器官芽の体積が０．００００２～０．１７％の比率で存在することを特徴とする、［９］～［１１］のいずれか記載の方法。
［１４］
器官芽の保存が、１５～３４℃で行われることを特徴とする、［９］～［１３］のいずれか記載の方法。
［１５］
器官芽が、肝芽である、［９］～［１４］のいずれか記載の方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、生物学的機能を良好に保持した器官芽を長時間保存できる。加えて、本発明によれば、器官芽の保管や輸送時の温度管理が容易となる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0013】
１．器官芽を保存するための液体組成物
本発明は、脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び、アルギン酸又はその塩を含む、器官芽を保存するための液体組成物（以下、「本発明の液体組成物」と称することがある）を提供する。
本発明は、脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び、アルギン酸又はその塩を含む、器官芽を保存するための液体組成物（以下、「本発明の液体組成物」と称することがある）を提供する。
【0014】
本発明において、「器官芽」とは、成熟することで器官に分化することができる構造体であって、臓器細胞、血管内皮細胞、及び未分化間葉系細胞若しくはそれから分化した細胞の三種類の細胞を含む構造体をいう。ある構造体が器官芽であるかどうかは、例えば、その構造体を生体へ移植し、目的の器官に分化できるかどうかを調べること（目的の器官へ分化していれば器官芽であると判断できる。）、及び／又はその構造体が上述した三種類の細胞をすべて含んでいるかどうかを調べること（三種類の細胞をすべて含んでいれば器官芽であると判断できる。）により確認できる。器官芽は、例えば、腎臓、心臓、肺臓、脾臓、食道、胃、甲状腺、副甲状腺、胸腺、生殖腺、脳、脊髄などの器官に分化する器官芽などであってもよいが、肝臓に分化する器官芽（肝芽）、膵臓に分化する器官芽（膵芽）、腸管に分化する器官芽など内胚葉性器官に分化する器官芽が好ましい。ある構造体が内胚葉性器官に分化する器官芽であるかどうかは、マーカーとなるタンパク質の発現を調べることにより確認できる（後述するマーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば器官芽であると判断できる。）。例えば、肝芽では、ＨＨＥＸ、ＳＯＸ２、ＨＮＦ４Ａ、ＡＦＰ、 ＡＬＢなどがマーカーになり、膵芽では、ＰＤＸ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ９などがマーカーになり、腸管に分化する器官芽では、ＣＤＸ２、ＳＯＸ９などがマーカーになる。当業者間で使用されている用語のうち、ｌｉｖｅｒ ｂｕｄ、ｌｉｖｅｒ ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌａ、ｌｉｖｅｒ ｏｒｇａｎｏｉｄ、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ（ｄｏｒｓａｌ ｏｒ ｖｅｎｔｒａｌ） ｂｕｄｓ、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌａ、ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｏｒｇａｎｏｉｄ、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂｕｄ、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌａ、ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄ（Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９；２９４（５５４２）：５５９－６３．（２００１））などは本発明における器官芽に含まれる。
【0015】
器官芽を製造するための方法は、自体公知の方法を用いることができ、例えば、特許第６９９０４６２号に開示される方法を用いることができるが、これに限定されない。
【0016】
本発明の好ましい一態様において、器官芽は肝芽であり得る。「肝芽」とは、成熟することにより肝臓に分化することができる複数種の細胞を含む構造体を意味する。「肝芽」は、「ミニ肝臓」、「liver bud」、「liver diverticula」、又は「liver organoid」等とも称されるが、本明細書における「肝芽」はこれらのいずれをも含む概念である。構造体が肝芽であるかどうかは、マーカーとなるタンパク質（例、HHEX、SOX2、HNF4A、AFP、およびALB等）の発現を調べることにより当業者であれば容易に確認することができる。本発明の液体組成物により保存される肝芽は、肝芽融合前の小型肝芽であってもよく、血管形成やアルブミン分泌を行う肝芽融合後の成熟した肝芽であってもよい。好ましい一態様において、肝芽は、肝芽融合前の小型肝芽であり得る。
【0017】
肝芽は、生体内から採取したものであってもよく、又は自体公知の方法を用いてインビトロで調製したものであってもよい。インビトロでの肝芽の調製方法は、肝前駆細胞、血管内皮細胞、および間葉系細胞を混合して培養する工程を含む。インビトロでの肝芽の調製方法において、肝前駆細胞、血管内皮細胞、および間葉系細胞は生体由来のものであってもよく、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から分化させたものであってもよい。好ましくは、肝前駆細胞、血管内皮細胞、および間葉系細胞の少なくとも１つがｉＰＳ細胞由来であり、より好ましくは、これらすべての細胞がｉＰＳ細胞由来である。尚、インビトロでの肝芽の調製方法における各種条件は、例えば、ＷＯ２０１７／１１０７２４、ＷＯ２０１９／０８７９８８、ＷＯ２０１９／１８９３２４、ＷＯ２０１９／１０７５３５等の教示内容を参考として適宜設定することができる。
【0018】
本発明の液体組成物は、脱アシル化ジェランガム（これ以降、「ＤＡＧ」と表記する場合がある）又はその塩と、アルギン酸又はその塩を含む。
【0019】
脱アシル化ジェランガムは、１－３結合したグルコース、１－４結合したグルクロン酸、１－４結合したグルコース及び１－４結合したラムノースの４分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（Ｉ）（ここで、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、ｎは２以上の整数である）で表わされる多糖類である。ただし、Ｒ１がグリセリル基を、Ｒ２がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下である。
【0020】
【化1】
【0021】
脱アシル化ジェランガムは、発酵培地でジェランガム生産微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物をアルカリ処理に付し、１－３結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすることにより、製造することが出来る。精製方法としては、例えば、液－液抽出、分別沈澱、結晶化、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ－２０等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、あるいは逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、不純物を除き精製することができる。ジェランガムの生産微生物の例としては、これに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア（Sphingomonas elodea）及び当該微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
【0022】
脱アシル化ジェランガムはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
【0023】
一般式（Ｉ）で表される化合物のＲ１及び／又はＲ２に当たる水酸基を、Ｃ１－３アルコキシ基、Ｃ１－３アルキルスルホニル基、グルコースあるいはフルクトースなどの単糖残基、スクロース、ラクトースなどのオリゴ糖残基、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸残基などに置換した脱アシル化ジェランガムの誘導体も本発明に使用できる。また、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等のクロスリンカーを用いて脱アシル化ジェランガムを架橋することもできる。
【0024】
塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩；カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩；アルミニウム、亜鉛、銅、鉄等の塩；アンモニウム塩；テトラエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、メチルトリブチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ベンジルメチルヘキシルデシルアンモニウム、コリン等の四級アンモニウム塩；ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、エタノールアミン、ジオラミン、トロメタミン、メグルミン、プロカイン、クロロプロカイン等の有機アミンとの塩；グリシン、アラニン、バリン等のアミノ酸との塩；等が挙げられる。
【0025】
脱アシル化ジェランガム又はその塩の重量平均分子量は、好ましくは１０，０００乃至５０，０００，０００であり、より好ましくは１００，０００乃至２０，０００，０００、更に好ましくは１，０００，０００乃至１０，０００，０００である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるプルラン換算で測定できる。
【0026】
脱アシル化ジェランガム又はその塩として、市販の製品、例えば、三晶株式会社製「KELCOGEL（シーピー・ケルコ社の登録商標）CG-LA」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。
【0027】
アルギン酸は、α１－４結合したＬ－グルクロン酸とβ１－４結合したＤ－マンヌロン酸の両方のウロン酸が直鎖重合した構造を有する多糖類である。
【0028】
アルギン酸又はその塩は、コンブやワカメに代表される褐藻類から、アルギン酸が有するカルボキシル基に対するイオン交換反応を行うことにより、抽出、精製することが出来る。藻体中のアルギン酸はカルシウムイオンなどの多価カチオンと不溶性の塩を作っているので、これをＮａとイオン交換させ水溶性のアルギン酸ナトリウムとすることで、藻体外へ抽出する。更に、アルギン酸ナトリウムの水溶液に対して酸を加えることにより、不溶性のアルギン酸を凝固析出させ、凝固析出したアルギン酸を単離することにより、精製されたアルギン酸を得ることができる。
【0029】
塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩；カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩；アルミニウム、亜鉛、銅、鉄等の塩；アンモニウム塩；テトラエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、メチルトリブチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ベンジルメチルヘキシルデシルアンモニウム、コリン等の四級アンモニウム塩；ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、エタノールアミン、ジオラミン、トロメタミン、メグルミン、プロカイン、クロロプロカイン等の有機アミンとの塩；グリシン、アラニン、バリン等のアミノ酸との塩；等が挙げられる。本発明においては、水への溶解性の観点から、アルギン酸ナトリウムが好適に使用される。
【0030】
アルギン酸又はその塩の重量平均分子量は、好ましくは３００乃至５０，０００，０００であり、より好ましくは５００乃至１０，０００，０００、更に好ましくは１，０００乃至５，０００，０００である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるプルラン換算で測定できる。
【0031】
アルギン酸又はその塩として、市販の製品、例えば、以下の製品を使用することもできる。
株式会社キミカ：
キミカアルギンシリーズ IL-2、IL-6、I-1、I-3、I-5、I-8、ULV-L3、ULV-L5、ULV-1、ULV-3、ULV-5、ULV-20、ULV-L3G、IL-6G、I-1G、I-3G、IL-6M、BL-2、BL-6、B-1、B-3、B-5、B-8、SKAT-ONE、SKAT-ULV
アルギテックスシリーズ LL、L、M、H
キッコーマンバイオケミファ株式会社：
ダックアルギンNSPH2R、NSPHR、NSPMR、NSPLR、NSPLLR
三晶株式会社：
スコーギン、サンアルギン
北海道三井化学株式会社：
アルギン酸オリゴ糖 ALGIN
持田製薬株式会社：
低エンドトキシン アルギン酸ナトリウム Sea Matrix（登録商標）
株式会社キミカ：
キミカアルギンシリーズ IL-2、IL-6、I-1、I-3、I-5、I-8、ULV-L3、ULV-L5、ULV-1、ULV-3、ULV-5、ULV-20、ULV-L3G、IL-6G、I-1G、I-3G、IL-6M、BL-2、BL-6、B-1、B-3、B-5、B-8、SKAT-ONE、SKAT-ULV
アルギテックスシリーズ LL、L、M、H
キッコーマンバイオケミファ株式会社：
ダックアルギンNSPH2R、NSPHR、NSPMR、NSPLR、NSPLLR
三晶株式会社：
スコーギン、サンアルギン
北海道三井化学株式会社：
アルギン酸オリゴ糖 ALGIN
持田製薬株式会社：
低エンドトキシン アルギン酸ナトリウム Sea Matrix（登録商標）
【0032】
脱アシル化ジェランガム、及びアルギン酸は、環内或いは環外異性化により生成する互変異性体、幾何異性体、互変異性体若しくは幾何異性体の混合物、又はそれらの混合物の形で存在してもよい。脱アシル化ジェランガム及びアルギン酸は、異性化により生じるか否かに拘わらず、不斉中心を有する場合は、分割された光学異性体或いはそれらを任意の比率で含む混合物の形で存在してよい。
【0033】
脱アシル化ジェランガム又はその塩、及びアルギン酸又はその塩は、液体組成物中の金属カチオン（例えば、カルシウムイオン等の二価金属カチオン）を介して集合し、三次元のネットワーク（不定型な構造体）を形成する。多糖類が金属カチオンを介してマイクロゲルを形成することは公知であり（例えば、特開２００４－１２９５９６号公報）、前記不定型な構造体には、一態様として当該マイクロゲルも包含される。脱アシル化ジェランガム又はその塩、及びアルギン酸又はその塩が金属カチオンを介して集合したものとしては、その一態様としてフイルム状の構造体が挙げられる。本発明の液体組成物は、この脱アシル化ジェランガム又はその塩、及びアルギン酸又はその塩が、金属カチオン（例えば、カルシウムイオン等の二価金属カチオン）を介して集合することにより形成された、三次元のネットワーク（不定型な構造体）を含む。本発明の液体組成物中に、器官芽（例、肝芽）を懸濁し保存すると、液体組成物中に懸濁された器官芽は、この三次元ネットワークにトラップされ、沈降しないため、振とう、回転操作等を要することなく、器官芽を浮遊状態で分散させたまま、保存する（浮遊静置保存する）ことが可能となる。本発明の液体組成物は、好ましくは、前記三次元のネットワーク（不定型な構造体）を均一に分散された態様で含む。
【0034】
好ましい態様において、上記三次元のネットワーク（不定型な構造体）の形成は、本発明の液体組成物の粘度を実質的に高めない。「液体組成物の粘度を実質的に高めない」とは、液体組成物の粘度が８ｍＰａ・ｓを上回らないことを意味する。この際の当該液体組成物の粘度は、２５℃において、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。従って、本発明の好ましい一態様において、本発明の液体組成物は塑性流体である。尚、本明細書において「塑性流体」とは、流動させるために降伏応力が必要な流体、すなわち、降伏値を持つ流体をいう。塑性流体は、ビンガム流体であってもよく、非ビンガム流体であってもよい。
【0035】
液体組成物の粘度は、自体公知の方法で測定することができる。具体的には２５℃条件下でＥ型粘度計（東機産業株式会社製、ＴＶ－２２型粘度計、機種：ＴＶＥ－２２Ｌ、コーンロータ：標準ロータ １°３４’×Ｒ２４、回転数１００ｒｐｍ）を用いて測定することができる。
【0036】
また、本発明の液体組成物は「脱アシル化ジェランガム又はその塩、及びアルギン酸又はその塩」以外の多糖類又はその塩を含んでいてもよい。当該多糖類は、好ましくはアニオン性の官能基を有する酸性多糖類である。酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ネイティブジェランガム、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸、又はそれらの塩が例示される。
【0037】
本発明の液体組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度（フリー体の脱アシル化ジェランガム換算）は、例えば、０．００２～０．０１（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．００２～０．００９（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．００３～０．００９（ｗ／ｖ）％、更に好ましくは０．００３３～０．００６６（ｗ／ｖ）％である。
【0038】
本発明の液体組成物中のアルギン酸又はその塩の濃度（フリー体換算）は、例えば、０．００４～０．１（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．００４～０．０２（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．００４～０．０１５（ｗ／ｖ）％であり、更に好ましくは０．００５～０．０１５（ｗ／ｖ）％、より更に好ましくは０．００６６～０．０１３３（ｗ／ｖ）％である。
【0039】
脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、器官芽を浮遊および分散させる作用を確保する観点から、０．００２（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．００３（ｗ／ｖ）％以上とすることが好ましい。一方、この濃度が高すぎると、浮遊作用が強くなることにより器官芽の回収率が低下したり、液体組成物自体の取扱い性が低下するおそれがあるので、０．０１（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは０．００９（ｗ／ｖ）％以下とすることが好ましい。アルギン酸又はその塩の濃度は、せん断力によって、器官芽の浮遊および分散状態を維持する効果を速やかに消失する特性（器官芽の浮遊および分散状態を維持する効果のせん断力に対する脆弱性）を確保する観点から、０．００４（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは、０．００５（ｗ／ｖ）％以上とすることが好ましい。一方、この濃度が高すぎると本発明の液体組成物が塑性流体ではなくなり、ゲル化する恐れがあるので、０．１（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは０．０２（ｗ／ｖ）％以下、より好ましくは０．０１５（ｗ／ｖ）％以下とすることが好ましい。
【0040】
本発明の液体組成物中に含まれる、脱アシル化ジェランガム又はその塩と、アルギン酸又はその塩の質量比（フリー体換算）は、せん断力によって、器官芽の浮遊状態を維持する効果を速やかに消失する特性を達成する観点から、脱アシル化ジェランガム又はその塩１質量部に対して、アルギン酸又はその塩を１質量部以上、好ましくは２質量部以上とする。一態様において、脱アシル化ジェランガム又はその塩１質量部に対して、アルギン酸又はその塩を例えば１～４質量部、好ましくは１～３質量部、より好ましくは１～２質量部とする。
【0041】
尚、液体組成物中の化合物濃度は、以下の式で算出できる。
【0042】
濃度［(w/v)%］＝化合物の質量（g）／液体組成物の容量（ml）×100
【0043】
本発明の液体組成物は、上記の含有量で脱アシル化ジェランガム又はその塩、及びアルギン酸又はその塩を含むことにより、非凍結状態で保存された器官芽の良好な生存性を維持する効果を奏する。本発明の液体組成物は、上記の含有量で脱アシル化ジェランガム又はその塩、及びアルギン酸又はその塩を含むことにより、器官芽の浮遊および分散状態を維持する効果を奏する。
【0044】
本発明の液体組成物は上記の含有量で脱アシル化ジェランガム又はその塩、及びアルギン酸又はその塩を含むことにより、器官芽の浮遊および分散状態を維持する効果が、ピペッティングやフィルター濾過等のせん断力により速やかに消失するという特性（器官芽の浮遊状態を維持する効果のせん断力に対する脆弱性）をも備える。
【0045】
本発明の液体組成物は、脱アシル化ジェランガム又はその塩、及びアルギン酸又はその塩が、金属カチオン（例えば、カルシウムイオン等の二価金属カチオン）を介して集合して形成した、三次元のネットワーク（不定型な構造体）を含み、これが器官芽の浮遊及び分散状態を維持する効果を生じるが、アルギン酸又はその塩が含まれることにより、三次元ネットワークが、キレート剤又はせん断力に対して脆弱となり、ピペッティングやフィルター濾過等のせん断力により、この三次元ネットワークが容易に破壊され、器官芽の浮遊及び分散状態を維持する効果が速やかに消失する。脱アシル化ジェランガムは、比較的直線的な構造の構成単位を有し、液体組成物中で複数の脱アシル化ジェランガム鎖がバンドル化することにより、タイトで安定な三次元ネットワークを形成するため、キレート剤やピペッティングやフィルター濾過等ではこの三次元ネットワークが破壊され難いのに対して、α１－４結合したＬ－グルクロン酸とβ１－４結合したＤ－マンヌロン酸の両方のウロン酸を含むことにより比較的嵩高い構造を有するアルギン酸又はその塩を液体組成物中に添加すると、脱アシル化ジェランガムのバンドル化が抑制されることにより、三次元ネットワークがピペッティングやフィルター濾過等のせん断力に対して脆弱になると考えられるが、この理論に特に束縛されるものではない。
【0046】
上述のように、本発明の液体組成物においては、脱アシル化ジェランガム又はその塩、及びアルギン酸又はその塩が、液体組成物中の金属カチオン（例えば、カルシウムイオン等の二価金属カチオン）を介して集合し、三次元のネットワーク（不定型な構造体）を形成するため、本発明の液体組成物は、金属カチオン、例えば二価の金属カチオン（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオン等）、好ましくはカルシウムイオンを含有する。当該金属カチオンは、例えばカルシウムイオンとマグネシウムイオン、カルシウムイオンと亜鉛イオン、カルシウムイオンと鉄イオン、カルシウムイオンと銅イオンのように、２種類以上を組み合わせて使用することができる。当業者は適宜その組み合わせを決定することができる。本発明の液体組成物中の金属カチオン濃度は０．１～３００ｍＭで、好ましくは、０．５～１００ｍＭであるが、これらに限定されない。
【0047】
ピペッティングやフィルター濾過等のせん断力による、三次元ネットワークの破壊（器官芽の浮遊及び分散状態を維持する特性の消失）は、可逆的な反応である。せん断力により破壊された三次元のネットワーク（不定型な構造体）の断片が、金属カチオン（例えば、カルシウムイオン等の二価金属カチオン）を介して再度集合することにより、三次元のネットワーク（不定型な構造体）が再生されるからである。
【0048】
本発明の液体組成物は、器官芽の培養に用いられる培地（好ましくは液体培地）を含むことが好ましい。かかる培地は、器官芽が形成されるものであればどのようなものでもよいが、血管内皮細胞培養用の培地、臓器細胞培養用の培地、前記２つの培地を混合したものなどを使用することが好ましい。血管内皮細胞培養用の培地はどのようなものを使用してもよいが、ｈＥＧＦ（組換えヒト上皮細胞成長因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子）、ヒドロコルチゾン、ｂＦＧＦ、アスコルビン酸、ＩＧＦ１、ＦＢＳ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシンＢなど）、Ｈｅｐａｒｉｎ、Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ、ＢＢＥの少なくとも１種を含むものを使用するのが好ましい。血管内皮細胞培養用の培地としては、ＥＧＭ－２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製）、ＥＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製）、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ ＥｎＧＳ Ｃｏｍｐ Ｋｉｔ（ＬＣＴ社製）、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ＳＦＭ Ｂａｓａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ヒト微小血管内皮細胞増殖培地（ＴＯＹＯＢＯ社製）などを用いることができる。臓器細胞培養用の培地はどのようなものを使用してもよいが、臓器細胞が肝細胞である場合、ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ、ＢＳＡ－ＦＡＦ、ｉｎｓｕｌｉｎ、ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、ＧＡ－１０００の少なくとも１種を含むものを使用するのが好ましい。肝細胞培養用の培地としては、ＨＣＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製）よりｈＥＧＦ（組換えヒト上皮細胞成長因子）を除いたもの、ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に１％ Ｂ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ （ＧＩＢＣＯ社製）と１０ｎｇ／ｍＬ ｈＨＧＦ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）などを用いることができる。
【0049】
本発明の液体組成物は、器官芽の培養に用いられる培地（好ましくは液体培地）と、脱アシル化ジェランガム又はその塩、及びアルギン酸又はその塩とを混合することにより調製することができる。
【0050】
また、別の実施態様において、本発明の所望の効果を奏する限り、本発明の液体組成物は、器官芽の培養に用いられる培地の代わりに、生理食塩水やリン酸バッファーなどの緩衝液をベースとした水溶液であってもよい。
【0051】
器官芽が肝芽である実施態様において、本発明の液体組成物に用いられる培地としては、肝芽が維持できる限り特に限定されない。例えば、血管内皮細胞培養用の培地、肝細胞（肝前駆細胞）培養用の培地、前記２つの培地を混合した培地などを使用することができる。血管内皮細胞培養用の培地はどのようなものを使用してもよいが、ｈＥＧＦ（組換えヒト上皮細胞成長因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子）、ヒドロコルチゾン、ｂＦＧＦ、アスコルビン酸、ＩＧＦ１、ＦＢＳ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシンＢなど）、Ｈｅｐａｒｉｎ、Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ、ＢＢＥの少なくとも１種を含む培地を使用することが好ましい。血管内皮細胞培養用の培地としては、ＥＧＭ－２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製）、ＥＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製）、ＶａｓｃｕＬｉｆｅ ＥｎＧＳ Ｃｏｍｐ Ｋｉｔ（ＬＣＴ社製）、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ＳＦＭ Ｂａｓａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ヒト微小血管内皮細胞増殖培地（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＫＢＭ ＶＥＣ－１（コージンバイオ社製）などを用いることができる。肝細胞培養用の培地としては、ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ、ＢＳＡ－ＦＡＦ、ｉｎｓｕｌｉｎ、ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ， Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、ＨＧＦの少なくとも１種を含む培地を使用するのが好ましい。肝細胞培養用の培地としては、ＨＣＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製）よりｈＥＧＦ（組換えヒト上皮細胞成長因子）を除いたもの、ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に１％ Ｂ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（ＧＩＢＣＯ社製）と１０ｎｇ／ｍＬ ｈＨＧＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を加えた培地などを用いることができる。ヒト肝芽の形成に関しては、ＥＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製）とＨＣＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製）よりｈＥＧＦ（組換えヒト上皮細胞成長因子）を除いたものを１：１で混ぜたものに、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、ＨＧＦを添加すると、肝芽の成熟に効果がある。
【0052】
尚、本発明の液体組成物は、器官芽の維持に悪影響がない限りにおいて、さらにその他の成分を含んでいてもよい。
【0053】
例えば、本発明の液体組成物は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。
【0054】
また、一態様において、本発明の液体組成物は器官芽（例、肝芽）を含んでもよい。
【0055】
本発明の液体組成物が器官芽を含む場合、脱アシル化ジェランガム又はその塩とアルギン酸又はその塩とが形成する三次元ネットワークにより器官芽は本発明の液体組成物中において浮遊及び分散した状態で存在する。
【0056】
また、本発明の液体組成物が器官芽（例、肝芽）を含む場合、直径１５０μｍの器官芽は、液体組成物中に、通常１～９６０器官芽／ｍＬ（溶液中に占める器官芽体積０．０００１８～０．１７％）（好ましくは、３０～４８０器官芽／ｍＬ（溶液中に占める器官芽体積０．００５３～０．０８５％）、より好ましくは、６０～２４０器官芽／ｍＬ（溶液中に占める器官芽体積０．０１０６～０．０４２％））の密度で存在させることが好ましい。直径７５μｍの器官芽（例、肝芽）の場合、液体組成物中に、通常１～７６８０器官芽／ｍＬ（溶液中に占める器官芽体積０．００００２～０．１７％）（好ましくは、２４０～３８４０器官芽／ｍＬ（溶液中に占める器官芽体積０．００５３～０．０８５％）、より好ましくは、４８０～１９２０器官芽／ｍＬ（溶液中に占める器官芽体積０．０１０６～０．０４２％））の密度で存在させることが好ましい。尚、本明細書において「肝芽／ｍＬ」は「ＬＢ／ｍＬ」と記載することがある。
【0057】
また、本発明の液体組成物が器官芽（例、肝芽）を含む場合、かかる肝芽を含む液体組成物は、通常１５℃以上、好ましくは１７℃以上、１９℃以上、２１℃以上、２３℃以上、又は２５℃以上、より好ましくは２６℃以上の温度で維持することができる。また、温度の上限は、通常３４℃以下、好ましくは３３℃以下、３２℃以下、３１℃以下、３０℃以下、又は２９℃以下、より好ましくは２８℃以下であり得る。一態様において、器官芽（例、肝芽）の保存時の温度は、通常１５～３４℃、好ましくは、１７～３３℃、１９～３２℃、２１～３１℃、２３～３０℃、又は２５～２９℃、より好ましくは２６～２８℃（例、２７℃）であり得る。
【0058】
２．器官芽を保存するための方法
本発明はまた、脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び、アルギン酸又はその塩を含む液体組成物中で器官芽を浮遊及び分散させる工程を含む、器官芽を保存するための方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。
本発明はまた、脱アシル化ジェランガム又はその塩、及び、アルギン酸又はその塩を含む液体組成物中で器官芽を浮遊及び分散させる工程を含む、器官芽を保存するための方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。
【0059】
本発明の方法における、器官芽、脱アシル化ジェランガム又はその塩、アルギン酸及びその塩、液体組成物中のそれらの濃度、液体組成物を構成する培地等は「本発明の液体組成物」において説明したものと同様である。尚、本発明の方法は、本発明の液体組成物中で器官芽を浮遊及び分散させる工程を含む、器官芽を保存するための方法と言い換えることができる。
【0060】
本発明の方法において、器官芽を本発明の液体組成物中に浮遊及び分散させる工程は、器官芽を本発明の液体組成物に播種することにより容易に達成することができる。器官芽の播種後、必要に応じて、本発明の液体組成物を撹拌してもよいし、しなくてもよい。
【0061】
本発明の方法の一態様において、液体組成物は塑性流体であり得る。塑性流体は本発明の液体組成物で説明したものと同様である。
【0062】
本発明の方法の一態様において、直径１５０μｍの器官芽（例、肝芽）は、液体組成物中に、通常１～９６０器官芽／ｍＬ（溶液中に占める器官芽体積０．０００１８～０．１７％）（好ましくは、３０～４８０器官芽／ｍＬ（溶液中に占める器官芽体積０．００５３～０．０８５％）、より好ましくは、６０～２４０器官芽／ｍＬ（溶液中に占める器官芽体積０．０１０６～０．０４２％））の密度で存在させることが好ましい。直径７５μｍの器官芽（例、肝芽）の場合、液体組成物中に、通常１～７６８０器官芽／ｍＬ（溶液中に占める器官芽体積０．００００２～０．１７％）（好ましくは、２４０～３８４０器官芽／ｍＬ（溶液中に占める器官芽体積０．００５３～０．０８５％）、より好ましくは、４８０～１９２０器官芽／ｍＬ（溶液中に占める器官芽体積０．０１０６～０．０４２％））の密度で存在させることが好ましい。
【0063】
本発明の方法の一態様において、器官芽の保存時の温度は、通常１５℃以上、好ましくは、１７℃以上、１９℃以上、２１℃以上、２３℃以上、又は２５℃以上、より好ましくは２６℃以上であり得る。また、温度の上限は、通常３４℃以下、好ましくは、３３℃以下、３２℃以下、３１℃以下、３０℃以下、又は２９℃以下、より好ましくは２８℃以下であり得る。一態様において、器官芽の保存時の温度は、通常１５～３４℃、好ましくは、１７～３３℃、１９～３２℃、２１～３１℃、２３～３０℃、又は２５～２９℃、より好ましくは２６～２８℃（例、２７℃）であり得る。
【0064】
以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例0065】
〔調製例１〕
ＡＬＧ／ＤＡＧ配合保存培地の調製方法
０．６７質量部のアルギン酸ナトリウム（ＡＬＧ）（キミカアルギンＩＬ－２、株式会社キミカ製）および０．３３質量部の脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を、９９質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、攪拌により溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、計１質量％濃度の多糖混合水溶液を作製した。また、ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＶＥＣ１培地（コージンバイオ）を１：１で混合した培地に２．５％ＦＢＳ、２．５ｕｇ／ｍｌインスリン、０．２５μｇ／ｍｌハイドロコルチゾン、５ｕｇ／ｍＬホロトランスフェリン、１０ｎｇ／ｍＬ Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、２５ｎＭデキサメタゾンを加えることで、肝芽培養培地を調製した。
ＡＬＧ／ＤＡＧ配合保存培地の調製方法
０．６７質量部のアルギン酸ナトリウム（ＡＬＧ）（キミカアルギンＩＬ－２、株式会社キミカ製）および０．３３質量部の脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を、９９質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、攪拌により溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、計１質量％濃度の多糖混合水溶液を作製した。また、ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＶＥＣ１培地（コージンバイオ）を１：１で混合した培地に２．５％ＦＢＳ、２．５ｕｇ／ｍｌインスリン、０．２５μｇ／ｍｌハイドロコルチゾン、５ｕｇ／ｍＬホロトランスフェリン、１０ｎｇ／ｍＬ Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、２５ｎＭデキサメタゾンを加えることで、肝芽培養培地を調製した。
【0066】
つぎに、培地作製キット（日産化学 ＦＣｅＭ（登録商標）－ｓｅｒｉｅｓ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用し、保存培地の作製を行った。上述肝芽培養培地を、上述キット付属の５０ｍＬコニカルチューブに４９ｍＬ分注し、キットの構成品であるアダプターキャップを装着した。上述計１質量％濃度の多糖混合水溶液を１ｍＬ充填したディスポーザブルシリンジの先端部をアダプターキャップの円筒部に嵌め込んで接続し、シリンジのプランジャーを人力で押圧し、勢い良くシリンジ内の多糖混合液を容器内へと射出して培地と瞬時に混合させることで、多糖終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）の液体培地組成物（以下、ＡＬＧ／ＤＡＧ配合保存培地と表記）を作製した。
【0067】
〔調製例２〕
ＡＬＧ／ＤＡＧ／ＭＣ配合保存培地の調製方法
０．６７質量部の脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を、９９．３３質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことで、０．６７質量部のＤＡＧ水溶液を作製した。２．６６質量部のアルギン酸ナトリウム（ＡＬＧ）（キミカアルギンＩＬ－２、株式会社キミカ製）を、９７．３４質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、攪拌により溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、２．６６質量部のＡＬＧ水溶液を作製した。２質量部のメチルセルロース（ＭＣ）（ＭＥＴＯＬＯＳＥ（ＳＭ－１５００）、信越化学工業社製）を、９８質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことで、２質量部のＭＣ水溶液を作製した。
ＡＬＧ／ＤＡＧ／ＭＣ配合保存培地の調製方法
０．６７質量部の脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を、９９．３３質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことで、０．６７質量部のＤＡＧ水溶液を作製した。２．６６質量部のアルギン酸ナトリウム（ＡＬＧ）（キミカアルギンＩＬ－２、株式会社キミカ製）を、９７．３４質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、攪拌により溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、２．６６質量部のＡＬＧ水溶液を作製した。２質量部のメチルセルロース（ＭＣ）（ＭＥＴＯＬＯＳＥ（ＳＭ－１５００）、信越化学工業社製）を、９８質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことで、２質量部のＭＣ水溶液を作製した。
【0068】
つぎに、安全キャビネット内で、ガラス製培地ビンに０．６７質量部のＤＡＧ水溶液を２０ｍＬ、２．６６質量部のＡＬＧ水溶液を１０ｍＬ、２質量部のＭＣ水溶液を１０ｍＬ加え、ピペッティングにより無菌的に混合し、計１．５質量％濃度の多糖混合水溶液を作製した。
【0069】
つぎに、培地作製キット（日産化学 ＦＣｅＭ（登録商標）－ｓｅｒｉｅｓ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用し、保存培地の作製を行った。上述の肝芽培養培地を、上述のキット付属の５０ｍＬコニカルチューブに４９ｍＬ分注し、キットの構成品であるアダプターキャップを装着した。上述の計１．５質量％濃度の多糖混合水溶液を１ｍＬ充填したディスポーザブルシリンジの先端部をアダプターキャップの円筒部に嵌め込んで接続し、シリンジのプランジャーを人力で押圧し、勢い良くシリンジ内の多糖混合液を容器内へと射出して培地と瞬時に混合させることで、多糖終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）の液体培地組成物（以下、ＡＬＧ／ＤＡＧ／ＭＣ配合保存培地と表記）を作製した。
【0070】
〔調製例３〕
ＡＬＧ／ＤＡＧ／ＰＥＧ４ｋ配合保存培地の調製方法
０．６７質量部の脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を、９９．３３質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことで、０．６７質量部のＤＡＧ水溶液を作製した。２．６６質量部のアルギン酸ナトリウム（ＡＬＧ）（キミカアルギンＩＬ－２、株式会社キミカ製）を、９７．３４質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、撹拌により溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、２．６６質量部のＡＬＧ水溶液を作製した。２質量部のポリエチレングリコール４，０００（ＰＥＧ４ｋ）（平均分子量２，７００～３，３００、富士フイルム和光純薬社製）を、９８質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、撹拌し溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、２質量部のＰＥＧ４ｋ水溶液を作製した。
ＡＬＧ／ＤＡＧ／ＰＥＧ４ｋ配合保存培地の調製方法
０．６７質量部の脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を、９９．３３質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことで、０．６７質量部のＤＡＧ水溶液を作製した。２．６６質量部のアルギン酸ナトリウム（ＡＬＧ）（キミカアルギンＩＬ－２、株式会社キミカ製）を、９７．３４質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、撹拌により溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、２．６６質量部のＡＬＧ水溶液を作製した。２質量部のポリエチレングリコール４，０００（ＰＥＧ４ｋ）（平均分子量２，７００～３，３００、富士フイルム和光純薬社製）を、９８質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、撹拌し溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、２質量部のＰＥＧ４ｋ水溶液を作製した。
【0071】
つぎに、安全キャビネット内で、ガラス製培地ビンに０．６７質量部のＤＡＧ水溶液を２０ｍＬ、２．６６質量部のＡＬＧ水溶液を１０ｍＬ、２質量部のＰＥＧ４ｋ水溶液を１０ｍＬ加え、ピペッティングにより無菌的に混合し、計１．５質量％濃度のポリマー混合水溶液を作製した。
【0072】
つぎに、培地作製キット（日産化学 ＦＣｅＭ（登録商標）－ｓｅｒｉｅｓ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用し、保存培地の作製を行った。上述の肝芽培養培地を、上述キット付属の５０ｍＬコニカルチューブに４９ｍＬ分注し、キットの構成品であるアダプターキャップを装着した。上述の計１．５質量％濃度のポリマー混合水溶液を１ｍＬ充填したディスポーザブルシリンジの先端部をアダプターキャップの円筒部に嵌め込んで接続し、シリンジのプランジャーを人力で押圧し、勢い良くシリンジ内のポリマー混合液を容器内へと射出して培地と瞬時に混合させることで、ポリマー終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）の液体培地組成物（以下、ＡＬＧ／ＤＡＧ／ＰＥＧ４ｋ配合保存培地と表記）を作製した。
【0073】
〔調製例４〕
ＡＬＧ／ＤＡＧ／ＨＰＣ配合保存培地の調製方法
０．６７質量部の脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を、９９．３３質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことで、０．６７質量部のＤＡＧ水溶液を作製した。２．６６質量部のアルギン酸ナトリウム（ＡＬＧ）（キミカアルギンＩＬ－２、株式会社キミカ製）を、９７．３４質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、撹拌により溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、２．６６質量部のＡＬＧ水溶液を作製した。２質量部のヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）（ＮＩＳＳＯ ＨＰＣ－Ｍ、日本曹達社製）を、９８質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、撹拌し溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、２質量部のＨＰＣ水溶液を作製した。
ＡＬＧ／ＤＡＧ／ＨＰＣ配合保存培地の調製方法
０．６７質量部の脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を、９９．３３質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことで、０．６７質量部のＤＡＧ水溶液を作製した。２．６６質量部のアルギン酸ナトリウム（ＡＬＧ）（キミカアルギンＩＬ－２、株式会社キミカ製）を、９７．３４質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、撹拌により溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、２．６６質量部のＡＬＧ水溶液を作製した。２質量部のヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）（ＮＩＳＳＯ ＨＰＣ－Ｍ、日本曹達社製）を、９８質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、撹拌し溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、２質量部のＨＰＣ水溶液を作製した。
【0074】
つぎに、安全キャビネット内で、ガラス製培地ビンに０．６７質量部のＤＡＧ水溶液を２０ｍＬ、２．６６質量部のＡＬＧ水溶液を１０ｍＬ、２質量部のＨＰＣ水溶液を１０ｍＬ加え、ピペッティングにより無菌的に混合し、計１．５質量％濃度のポリマー混合水溶液を作製した。
【0075】
つぎに、培地作製キット（日産化学 ＦＣｅＭ（登録商標）－ｓｅｒｉｅｓ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用し、保存培地の作製を行った。上述の肝芽培養培地を、上述のキット付属の５０ｍＬコニカルチューブに４９ｍＬ分注し、キットの構成品であるアダプターキャップを装着した。上述の計１．５質量％濃度のポリマー混合水溶液を１ｍＬ充填したディスポーザブルシリンジの先端部をアダプターキャップの円筒部に嵌め込んで接続し、シリンジのプランジャーを人力で押圧し、勢い良くシリンジ内の多糖混合液を容器内へと射出して培地と瞬時に混合させることで、多糖終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）の液体培地組成物（以下、ＡＬＧ／ＤＡＧ／ＨＰＣ配合保存培地と表記）を作製した。
【0076】
〔調製例５〕
ＡＬＧ／ＤＡＧ／ＣＭＣ配合保存培地の調製方法
０．６７質量部の脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を、９９．３３質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことで、０．６７質量部のＤＡＧ水溶液を作製した。２．６６質量部のアルギン酸ナトリウム（ＡＬＧ）（キミカアルギンＩＬ－２、株式会社キミカ製）を、９７．３４質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、撹拌により溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、２．６６質量部のＡＬＧ水溶液を作製した。２質量部のカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）（富士フイルム和光純薬社製）を、９８質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことで、２質量部のＣＭＣ水溶液を作製した。
ＡＬＧ／ＤＡＧ／ＣＭＣ配合保存培地の調製方法
０．６７質量部の脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を、９９．３３質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことで、０．６７質量部のＤＡＧ水溶液を作製した。２．６６質量部のアルギン酸ナトリウム（ＡＬＧ）（キミカアルギンＩＬ－２、株式会社キミカ製）を、９７．３４質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、撹拌により溶解後、０．２２μｍ滅菌フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇフィルターシステム４３０７６７、コーニング社製）に通液させることで、２．６６質量部のＡＬＧ水溶液を作製した。２質量部のカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）（富士フイルム和光純薬社製）を、９８質量部の精製水を入れたガラス製培地ビンに加え、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分）を行うことで、２質量部のＣＭＣ水溶液を作製した。
【0077】
つぎに、安全キャビネット内で、ガラス製培地ビンに０．６７質量部のＤＡＧ水溶液を２０ｍＬ、２．６６質量部のＡＬＧ水溶液を１０ｍＬ、２質量部のＣＭＣ水溶液を１０ｍＬ加え、ピペッティングにより無菌的に混合し、計１．５質量％濃度の多糖混合水溶液を作製した。
【0078】
つぎに、培地作製キット（日産化学 ＦＣｅＭ（登録商標）－ｓｅｒｉｅｓ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用し、保存培地の作製を行った。上述の肝芽培養培地を、上述のキット付属の５０ｍＬコニカルチューブに４９ｍＬ分注し、キットの構成品であるアダプターキャップを装着した。上述の計１．５質量％濃度の多糖混合水溶液を１ｍＬ充填したディスポーザブルシリンジの先端部をアダプターキャップの円筒部に嵌め込んで接続し、シリンジのプランジャーを人力で押圧し、勢い良くシリンジ内の多糖混合液を容器内へと射出して培地と瞬時に混合させることで、多糖終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）の液体培地組成物（以下、ＡＬＧ／ＤＡＧ／ＣＭＣ配合保存培地と表記）を作製した。
【0079】
〔実施例１〕
［実験方法］
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の培養法
細胞培養ディッシュあるいは細胞培養プレートをｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｎｉｐｐｉ、０．７～０．９μｇ／ｃｍ２）で３７℃、１時間コーティングし、ＰＢＳで洗浄した。凍結保存ヒトｉＰＳＣ（Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株またはＱＨＪＩ０１ｓ０４株、京都大学より入手）を３７℃の温水に２分間浸漬し、手で振盪しながら融解させた。細胞保存液の９倍量のＳｔｅｍＦｉｔ培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）に細胞保存液を懸濁し、１５０－２００ｘｇ、５分間の遠心操作を行った。細胞上清を除き、ＡＫ０２培地にＹ－２７６３２（１０μＭ）を加えた培地に細胞を懸濁し、０．３６～１．８ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度でヒトｉＰＳＣを播種した。培養１日目にＡＫ０２培地に交換し、以降１日おきに培地交換を行った。継代に関しては、直径１０ｃｍの細胞培養ディッシュで一週間培養したヒトｉＰＳＣをＰＢＳで洗浄した後、Ａｃｃｕｔａｓｅ２ｍｌを加え３７℃で５分から１０分間処理し、細胞を剥離した。ＡＫ０２培地２ｍｌを加えて、１５ｍｌのチューブに細胞を移し、１５０－２００ｘｇ、５ｍｉｎの遠心操作を行った。細胞上清を除き、ＡＫ０２培地にＹ－２７６３２（１０μＭ）を加えた培地に細胞を懸濁し、０．３６～１．８ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度でヒトｉＰＳＣを播種した。
［実験方法］
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の培養法
細胞培養ディッシュあるいは細胞培養プレートをｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｎｉｐｐｉ、０．７～０．９μｇ／ｃｍ２）で３７℃、１時間コーティングし、ＰＢＳで洗浄した。凍結保存ヒトｉＰＳＣ（Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株またはＱＨＪＩ０１ｓ０４株、京都大学より入手）を３７℃の温水に２分間浸漬し、手で振盪しながら融解させた。細胞保存液の９倍量のＳｔｅｍＦｉｔ培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）に細胞保存液を懸濁し、１５０－２００ｘｇ、５分間の遠心操作を行った。細胞上清を除き、ＡＫ０２培地にＹ－２７６３２（１０μＭ）を加えた培地に細胞を懸濁し、０．３６～１．８ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度でヒトｉＰＳＣを播種した。培養１日目にＡＫ０２培地に交換し、以降１日おきに培地交換を行った。継代に関しては、直径１０ｃｍの細胞培養ディッシュで一週間培養したヒトｉＰＳＣをＰＢＳで洗浄した後、Ａｃｃｕｔａｓｅ２ｍｌを加え３７℃で５分から１０分間処理し、細胞を剥離した。ＡＫ０２培地２ｍｌを加えて、１５ｍｌのチューブに細胞を移し、１５０－２００ｘｇ、５ｍｉｎの遠心操作を行った。細胞上清を除き、ＡＫ０２培地にＹ－２７６３２（１０μＭ）を加えた培地に細胞を懸濁し、０．３６～１．８ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度でヒトｉＰＳＣを播種した。
【0080】
ｉＰＳＣからの肝前駆細胞への分化誘導法
細胞培養ディッシュあるいは細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）をｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｎｉｐｐｉ、０．４～０．６μｇ／ｃｍ２）で３７℃、１時間コーティングし、ＰＢＳで洗浄した。直径１０ｃｍの細胞培養ディッシュで一週間培養したヒトｉＰＳＣをＰＢＳ洗浄後にＡｃｃｕｔａｓｅ２ｍｌを加え３７℃で５分から１０分間処理し、細胞を剥離した。細胞回収・遠心後に細胞上清を除き、ＲＰＭＩ培地にペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、Ｂ２７（２％）、Ｗｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）を加えた培地に細胞を懸濁し、ラミニンコートしたディッシュに５～１０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種した。培養１日目と３日目に、ＲＰＭＩ培地にペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、Ｂ２７（２％）、Ｗｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｓｏｄｉｕｍ Ｂｕｔｙｒａｔｅ（０．５ｍＭ）を加えた培地に交換した。培養４日目にＲＰＭＩ培地にペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、Ｂ２７（２％）、Ｗｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地に交換した。培養６日目の細胞を、内胚葉細胞Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ（ＤＥ）とした。培養６日目と培養８日目に、ＲＰＭＩ培地にペニシリン／ストレプトマイシン（１％）Ｂ２７（２％）、ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ－４（２０ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地に交換した。培養１０日目の細胞を、ｉＰＳ細胞由来の肝前駆細胞Ｈｅｐａｔｉｃ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ（「ｉＰＳ－ＨＥ」と称することがある）とした。
細胞培養ディッシュあるいは細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）をｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｎｉｐｐｉ、０．４～０．６μｇ／ｃｍ２）で３７℃、１時間コーティングし、ＰＢＳで洗浄した。直径１０ｃｍの細胞培養ディッシュで一週間培養したヒトｉＰＳＣをＰＢＳ洗浄後にＡｃｃｕｔａｓｅ２ｍｌを加え３７℃で５分から１０分間処理し、細胞を剥離した。細胞回収・遠心後に細胞上清を除き、ＲＰＭＩ培地にペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、Ｂ２７（２％）、Ｗｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）を加えた培地に細胞を懸濁し、ラミニンコートしたディッシュに５～１０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種した。培養１日目と３日目に、ＲＰＭＩ培地にペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、Ｂ２７（２％）、Ｗｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｓｏｄｉｕｍ Ｂｕｔｙｒａｔｅ（０．５ｍＭ）を加えた培地に交換した。培養４日目にＲＰＭＩ培地にペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、Ｂ２７（２％）、Ｗｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地に交換した。培養６日目の細胞を、内胚葉細胞Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ（ＤＥ）とした。培養６日目と培養８日目に、ＲＰＭＩ培地にペニシリン／ストレプトマイシン（１％）Ｂ２７（２％）、ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ－４（２０ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地に交換した。培養１０日目の細胞を、ｉＰＳ細胞由来の肝前駆細胞Ｈｅｐａｔｉｃ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ（「ｉＰＳ－ＨＥ」と称することがある）とした。
【0081】
ｉＰＳＣからの血管内皮細胞への分化誘導法
ｉＰＳＣからの血管内皮細胞への分化誘導は既報に従って行った（Ｓｅｋｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０２０）。概要を説明すると、肝前駆細胞と同様にｉＰＳＣを播種し、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にＹ－２７６３２（１０μＭ）を加えた培地で１日培養を行った。翌日にＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％Ｂ２７、ＣＨＩＲ９９０２１（８μＭ）、ＢＭＰ－４（２５ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地に交換し、３日間培養後にＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ培地にＶＥＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（２μＭ）を加えた培地に交換した。分化誘導開始から７日目にＦＡＣＳによりＣＤ３１やＣＤ１４４の発現を確認することで品質のチェックを行った。得られた血管内皮細胞は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ培地にＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地を用いて、フィブロネクチンコートした培養ディッシュ上で継代し、拡大培養を行った。本プロセスにより得られたｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞を「ｉＰＳＣ－ＥＣ」と称することがある。
ｉＰＳＣからの血管内皮細胞への分化誘導は既報に従って行った（Ｓｅｋｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０２０）。概要を説明すると、肝前駆細胞と同様にｉＰＳＣを播種し、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にＹ－２７６３２（１０μＭ）を加えた培地で１日培養を行った。翌日にＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％Ｂ２７、ＣＨＩＲ９９０２１（８μＭ）、ＢＭＰ－４（２５ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地に交換し、３日間培養後にＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ培地にＶＥＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（２μＭ）を加えた培地に交換した。分化誘導開始から７日目にＦＡＣＳによりＣＤ３１やＣＤ１４４の発現を確認することで品質のチェックを行った。得られた血管内皮細胞は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ培地にＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地を用いて、フィブロネクチンコートした培養ディッシュ上で継代し、拡大培養を行った。本プロセスにより得られたｉＰＳ細胞由来の血管内皮細胞を「ｉＰＳＣ－ＥＣ」と称することがある。
【0082】
ｉＰＳＣからの間葉系細胞への分化誘導法
ｉＰＳＣからの間葉系細胞への分化誘導は既報に従って行った（Ｓｅｋｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０２０）。概要を説明すると、肝前駆細胞と同様２－８ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でｉＰＳＣを播種し、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にＹ－２７６３２（１０μＭ）を加えた培地で４－６日培養を行った。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％Ｂ２７、ＣＨＩＲ９９０２１（８μＭ）、ＢＭＰ－４（２５ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地に交換し、３日間培養後にＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％Ｂ２７、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（２ｎｇ／ｍｌ）、ＰＤＧＦＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地に交換した。３日後にＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ培地にＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＤＧＦＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地に交換し３日間培養を行った。本プロセスにより得られたｉＰＳ細胞由来の間葉系幹細胞を「ｉＰＳＣ－ＭＣ」と称することがある。
ｉＰＳＣからの間葉系細胞への分化誘導は既報に従って行った（Ｓｅｋｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０２０）。概要を説明すると、肝前駆細胞と同様２－８ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でｉＰＳＣを播種し、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にＹ－２７６３２（１０μＭ）を加えた培地で４－６日培養を行った。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％Ｂ２７、ＣＨＩＲ９９０２１（８μＭ）、ＢＭＰ－４（２５ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地に交換し、３日間培養後にＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％Ｂ２７、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（２ｎｇ／ｍｌ）、ＰＤＧＦＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地に交換した。３日後にＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ培地にＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＤＧＦＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えた培地に交換し３日間培養を行った。本プロセスにより得られたｉＰＳ細胞由来の間葉系幹細胞を「ｉＰＳＣ－ＭＣ」と称することがある。
【0083】
肝芽作製法
小型肝芽の作製に関しては、マイクロパターンウェルプレートＥｌｐｌａｓｉａ ＲＢ ５００ ４００ ＮＡ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）２４ウェルプレート１ウェル当たりヒトｉＰＳＣ－ＨＥ ２．３－５ｘ１０５ｃｅｌｌｓとｉＰＳＣ－ＥＣ ０．５－３．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓとｉＰＳＣ－ＭＣ ０．５－３．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓを肝芽培養培地に懸濁し、播種した。肝芽培養培地は、ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＶＥＣ１培地（コージンバイオ）を１：１で混合した培地に２．５％ＦＢＳ、２．５μｇ／ｍｌインスリン、０．２５μｇ／ｍｌハイドロコルチゾン、５ｕｇ／ｍＬホロトランスフェリン、１０ｎｇ／ｍＬ Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、２５ｎＭデキサメタゾンを加えたものである。肝芽は３７℃、５％ＣＯ２環境下で４８時間培養を行い、脱アシル化ジェランガムとアルギン酸を含む液体組成物での保存に供した。未保存群に関しては、培養後４８時間の小型肝芽を肝芽融合に用いた。
小型肝芽の作製に関しては、マイクロパターンウェルプレートＥｌｐｌａｓｉａ ＲＢ ５００ ４００ ＮＡ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）２４ウェルプレート１ウェル当たりヒトｉＰＳＣ－ＨＥ ２．３－５ｘ１０５ｃｅｌｌｓとｉＰＳＣ－ＥＣ ０．５－３．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓとｉＰＳＣ－ＭＣ ０．５－３．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓを肝芽培養培地に懸濁し、播種した。肝芽培養培地は、ＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＶＥＣ１培地（コージンバイオ）を１：１で混合した培地に２．５％ＦＢＳ、２．５μｇ／ｍｌインスリン、０．２５μｇ／ｍｌハイドロコルチゾン、５ｕｇ／ｍＬホロトランスフェリン、１０ｎｇ／ｍＬ Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、２５ｎＭデキサメタゾンを加えたものである。肝芽は３７℃、５％ＣＯ２環境下で４８時間培養を行い、脱アシル化ジェランガムとアルギン酸を含む液体組成物での保存に供した。未保存群に関しては、培養後４８時間の小型肝芽を肝芽融合に用いた。
【0084】
肝芽融合法
肝芽作製２４時間後、マイクロパターンウェルプレートＥｌｐｌａｓｉａ ＲＢ ５００ ４００ ＮＡ （Ｃｏｒｎｉｎｇ）より小型肝芽を回収した。回収した小型肝芽を６ウェルセルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ）上に肝芽同士を近接させ配置した。６ウェルセルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ）を使用する際には、肝芽培養培地２ｍｌ／ｗｅｌｌとし、小型肝芽２４００個を配置した。セルカルチャーインサート上にシリコン枠（Ｃｕｌｔｕｒｅ－Ｉｎｓｅｒｔ ２ｗｅｌｌ／３ｗｅｌｌ，ｉｂｉｄｉ）を使用することも可能である。インサート表面はコラーゲンＩでコーティングを行った。その後、３７℃、５％ＣＯ２環境下で７日間培養を行った。配置直後および配置後７日後の時点で蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ）、共焦点顕微鏡ＳＰ５を用いて写真撮影を行った。培養７日後に培地を回収した。
肝芽作製２４時間後、マイクロパターンウェルプレートＥｌｐｌａｓｉａ ＲＢ ５００ ４００ ＮＡ （Ｃｏｒｎｉｎｇ）より小型肝芽を回収した。回収した小型肝芽を６ウェルセルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ）上に肝芽同士を近接させ配置した。６ウェルセルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ）を使用する際には、肝芽培養培地２ｍｌ／ｗｅｌｌとし、小型肝芽２４００個を配置した。セルカルチャーインサート上にシリコン枠（Ｃｕｌｔｕｒｅ－Ｉｎｓｅｒｔ ２ｗｅｌｌ／３ｗｅｌｌ，ｉｂｉｄｉ）を使用することも可能である。インサート表面はコラーゲンＩでコーティングを行った。その後、３７℃、５％ＣＯ２環境下で７日間培養を行った。配置直後および配置後７日後の時点で蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ）、共焦点顕微鏡ＳＰ５を用いて写真撮影を行った。培養７日後に培地を回収した。
【0085】
肝芽の保存
小型肝芽は、調製例１で調製したＡＬＧ／ＤＡＧ配合保存培地中に懸濁し、５％ＣＯ２環境下で８日間培養を行った。３７℃以外の温度帯については、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ・ＣＯ２（三菱ガス化学）を用いた。懸濁密度は１２０－４８０肝芽／ｍＬの範囲で実施した。培養温度は４～３７℃の範囲で実施した。８日間培養後、Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを保存溶液の１／１０～等量程度加え混合した後、２００ｘｇ、２分間遠心操作をすることで肝芽の回収を行った。
小型肝芽は、調製例１で調製したＡＬＧ／ＤＡＧ配合保存培地中に懸濁し、５％ＣＯ２環境下で８日間培養を行った。３７℃以外の温度帯については、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ・ＣＯ２（三菱ガス化学）を用いた。懸濁密度は１２０－４８０肝芽／ｍＬの範囲で実施した。培養温度は４～３７℃の範囲で実施した。８日間培養後、Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを保存溶液の１／１０～等量程度加え混合した後、２００ｘｇ、２分間遠心操作をすることで肝芽の回収を行った。
【0086】
肝芽形態評価および肝芽生存率評価
回収した肝芽は、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒ ｄｕｏｓ（Ｓｃｒｅｅｎ）を用いて肝芽数、肝芽サイズ、真円率の測定を行った。また、ＢＺ－Ｘ８１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ）により蛍光撮影を行った。回収した肝芽の生存率の評価は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ３Ｄ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。
また、肝芽保存中の培養上清を回収し、冷凍保存した。上清を室温にて解凍後、バイオプロファイルＦＬＥＸ２（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）にてグルコース、乳酸、グルタミン、グルタミン酸、アンモニウムイオン、ｐＨを測定した。
回収した肝芽は、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒ ｄｕｏｓ（Ｓｃｒｅｅｎ）を用いて肝芽数、肝芽サイズ、真円率の測定を行った。また、ＢＺ－Ｘ８１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ）により蛍光撮影を行った。回収した肝芽の生存率の評価は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ３Ｄ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。
また、肝芽保存中の培養上清を回収し、冷凍保存した。上清を室温にて解凍後、バイオプロファイルＦＬＥＸ２（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）にてグルコース、乳酸、グルタミン、グルタミン酸、アンモニウムイオン、ｐＨを測定した。
【0087】
ＥＬＩＳＡを用いた融合型肝芽の機能評価
融合型肝芽培養６日目に培地交換を行ない、２４時間後に培地を回収し、培養上清中のアルブミンを市販のＥＬＩＳＡキット（それぞれＢｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により測定した。
融合型肝芽培養６日目に培地交換を行ない、２４時間後に培地を回収し、培養上清中のアルブミンを市販のＥＬＩＳＡキット（それぞれＢｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により測定した。
【0088】
【0089】
肝芽の形態解析を行った結果、２７℃保存群においてコントロール群と比較して肝芽直径の増大（それぞれ平均１５６．１μｍ、１４３．２５μｍ）が認められた。３７℃保存群においては、様々なサイズの肝芽が含まれ、肝芽の融合や肝芽の分解が生じていることが示唆された（図２左）。肝芽真円率については、未保存群の０．９１に対し、３７℃保存群において０．８４と減少していた（図２中央）。肝芽回収率については、未保存群に対し、３７℃保存群において６８．０％と有意に減少していた（図２右）。
【0090】
肝内胚葉細胞をＧｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）、血管内皮細胞をＫｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ（ＫＯ）でそれぞれ標識してあるため、肝芽保存後に蛍光観察を実施して肝芽健全性の確認を実施した（図３）。その結果、２７℃保存群においてはＧＦＰ・ＫＯともにコントロール群と同程度の蛍光強度を保持しており、肝芽健全性が保持されていることが示唆された（図３）。一方で、４℃保存群においてはＧＦＰの蛍光強度が低下し、３７℃保存群においてはＫＯの蛍光強度が低下しており、肝芽健全性が保持されていないことが示唆された（図３）。また、保存剤がない状態では、すべての肝芽が一塊となっており、保存剤が肝芽の分散維持に必須であることが示された（図３）。
【0091】
細胞内ＡＴＰによる肝芽生存率の評価を実施した結果、４℃、３７℃保存群においては未保存群と比較して顕著なＡＴＰ量の低下が認められた一方で、２７℃保存群においては未保存群との間に有意な差は認められなかった（図４左）。２７℃保存群においては未保存群と比較してＡＴＰに変化がなく、今回の３条件の中では最も肝芽保存に適した条件であると考えられた（図４左）。尚、１７℃保存群に対して細胞内ＡＴＰによる肝芽生存率の評価を実施した結果、１７℃保存群においては未保存群との間に有意な差は認められなかった（データ示さず）。これらの結果から、肝芽の保存温度は、１５～３４℃程度が有効であることが示唆された。
【0092】
ヒトアルブミン（ｈＡＬＢ）解析も肝芽生存率のデータと同様、２７℃保存群において最も高い値を示していた。未保存群よりも有意に高いｈＡＬＢ値を示していたことから、保存中に肝芽の分化促進の可能性が示唆された（図４右）。
【0093】
最後に、肝芽保存後の培地成分解析を実施した結果、３７℃保存群においてグルコース、ｐＨの減少が認められ、グルタミン酸、乳酸の増加が認められた（図５）。３７℃に静置した培地中では細胞の有無に関わらずグルタミンが減少し、アンモニアが増加していた（図５）。３７℃保存群においては、培地中の栄養分が消費されることによる肝芽保存状態の悪化が示唆された。以上の結果より、２７℃、５％ＣＯ２条件が最適な肝芽保存条件であることが示された。
【0094】
肝芽保存密度の検討
肝芽保存密度について図１と同様の実験を行った。未保存群をコントロールとして、２７℃、５％ＣＯ２環境下、１２００ＬＢ／２．５ｍｌ、１２００ＬＢ／５ｍｌ、および１２００ＬＢ／１０ｍｌの条件で８日間保存した群を比較した（図６）。
肝芽保存密度について図１と同様の実験を行った。未保存群をコントロールとして、２７℃、５％ＣＯ２環境下、１２００ＬＢ／２．５ｍｌ、１２００ＬＢ／５ｍｌ、および１２００ＬＢ／１０ｍｌの条件で８日間保存した群を比較した（図６）。
【0095】
肝芽の形態解析を行った結果、全群においてコントロール群と比較して肝芽直径の増大が認められた（図６左、未保存群平均１４４．３４μｍ；１２００ＬＢ／２．５ｍｌ保存群、平均１４９．９３μｍ；１２００ＬＢ／５ｍｌ保存群、平均１４４．２１μｍ；１２００ＬＢ／１０ｍｌ保存群、平均１５３．５７μｍ）。肝芽の真円率に関しては、いずれの群においても０．８７前後と差は認められなかった（図６中央）。肝芽回収率に関しては、未保存群と比較して１２００ＬＢ／２．５ｍｌ保存群において８５．２％と有意な減少が認められた一方、１２００ＬＢ／５ｍｌ保存群と１２００ＬＢ／１０ｍｌ保存群においてはそれぞれ９８．８％、９１．６％と高い回収率を示し、未保存群との間に有意差は認められなかった（図６右）。
【0096】
肝芽保存後に蛍光観察した結果、２７℃保存群においては肝内胚葉細胞のＧＦＰ・血管内皮細胞のＫＯともにコントロール群と同程度の蛍光強度を保持しており、肝芽健全性が保持されていることが示された（図７）。
【0097】
細胞内ＡＴＰによる肝芽生存率の評価を実施した結果、全群においてコントロール群と比較して有意な上昇が認められた（図８左）。ｈＡＬＢ分泌については、全群においてコントロール群と比較して有意な差は認められなかった（図８右）。
【0098】
最後に、肝芽保存後の培地成分解析を実施した結果、１２００ＬＢ／２．５ ｍｌ保存群においてグルコースの減少、グルタミン酸・乳酸の増加が認められた（図９）。
【0099】
以上の結果より、２７℃、５％ＣＯ２、１２００ＬＢ／５ｍｌ以下の肝芽密度が最適な肝芽保存条件であることが示された。
【0100】
肝芽保存溶液の検討
調製例１、２、３、４、５で調製した各保存培地を用いて保存した肝芽について、８日間の保存後にＡＴＰ量、ｈＡＬＢ分泌量、肝芽回収率を測定し比較を行った（図１０）。
調製例１、２、３、４、５で調製した各保存培地を用いて保存した肝芽について、８日間の保存後にＡＴＰ量、ｈＡＬＢ分泌量、肝芽回収率を測定し比較を行った（図１０）。
【0101】
【産業上の利用可能性】
【0102】
本発明によれば、生物学的機能を良好に保持した器官芽を長時間保存できる。加えて、本発明によれば、器官芽の保管や輸送時の温度管理が容易となる。従って、本発明は例えば臓器移植に関する医療及び学術分野において極めて有益である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
