特開 2024-123995 組換えＦｃ結合性タンパク質発現用プラスミドおよびそれを用いた前記タンパク質製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024123995

(43)【公開日】2024-09-12

(54)【発明の名称】組換えＦｃ結合性タンパク質発現用プラスミドおよびそれを用いた前記タンパク質製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/70 20060101AFI20240905BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240905BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20240905BHJP

【ＦＩ】

C12N15/70 Z ZNA

C12N1/21

C12P21/00 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023031862

(22)【出願日】2023-03-02

(71)【出願人】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】井上 成彰

(72)【発明者】

【氏名】渡邉 遼子

(72)【発明者】

【氏名】寺尾 陽介

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG20

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA20

4B065AA26X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA60

(57)【要約】

【課題】 遺伝子組換え技術を用いてＦｃ結合性タンパク質を効率的に製造可能なプラスミド、およびそれを用いて前記タンパク質を効率的に製造する方法を提供すること。
【解決の手段】 前記プラスミドにＯｍｐＡシグナルペプチドまたはＯｍｐＡシグナルペプチドのうち１もしくは数残基を置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じたオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを含ませることで、前記課題を解決する。
【選択図】 図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ペリプラズムに前記タンパク質を分泌させるためのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む、前記タンパク質を発現させるためのプラスミドであって、
前記シグナルペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド、または当該オリゴペプチドのうち、１もしくは数残基を置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じたオリゴペプチドである、前記プラスミド。

【請求項2】

Ｆｃ結合性タンパク質が以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択される、請求項１に記載のプラスミド；
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じ、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまで、および配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。

【請求項3】

請求項１または２に記載のプラスミドを用いて宿主を形質転換して得られる、形質転換体。

【請求項4】

宿主が大腸菌である、請求項３に記載の形質転換体。

【請求項5】

請求項３に記載の形質転換体を培養することで前記形質転換体からＦｃ結合性タンパク質を発現させる工程と、前記形質転換体から当該タンパク質を単離する工程とを含む、前記タンパク質の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組換えＦｃ結合性タンパク質発現用プラスミドおよびそれを用いた前記タンパク質の製造方法に関する。特に本発明は、宿主ペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを用いることで前記タンパク質を効率的に製造可能なプラスミド、およびそれを用いた前記タンパク質の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質は細胞内で合成された後、そのまま細胞内に留まるものと、分泌タンパク質として細胞外へ放出されるものとが知られている。また大腸菌などを宿主として用いた組換えタンパク質生産では、細胞内膜と外膜の間のペリプラズム領域に前記タンパク質を分泌発現させる方法が知られている（特許文献１）。細胞内からペリプラズム領域へ組換えタンパク質が移送される際には、シグナルペプチドと呼ばれるオリゴペプチドの働きが重要である（特許文献１）。シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列の特徴として、以下の３つがあげられる（特許文献１）。
（ｉ）Ｎ末端領域には、アルギニンやリジンといった塩基性アミノ酸が少なくとも１つ含まれており、当該塩基性アミノ酸の側鎖の正電荷と細胞膜表面の負電荷とのイオン結合によりシグナルペプチドが細胞膜内へと移行する。
（ｉｉ）中心領域では、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンといった疎水性アミノ酸が多く含まれ、細胞膜内への貫通に関与する。
（ｉｉｉ）Ｃ末端領域では、細胞膜貫通後にシグナルペプチダーゼにより切断される特定のアミノ酸が認識部位として存在しており、当該認識部位で切断されることで成熟体タンパク質がペリプラズム領域や細胞外へと放出される。

【0003】

組換えタンパク質を宿主のペリプラズムに分泌発現させるには、前記タンパク質のＮ末端側に、ペリプラズムへの分泌発現を促進させるシグナルペプチドが付加された状態で発現させる必要がある。しかしながら、前記方法を用いた場合、活性型タンパク質としての生産性が低いという問題があった。またシグナルペプチドの改変により生産性を向上させた例も報告（特許文献１から４）されているが、工業的な生産には十分とはいえなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０００－１７５６８６号公報

【特許文献2】特開２００８－０７３０４４号公報

【特許文献3】ＷＯ２００８／０３２６５９号

【特許文献4】特開２０１４－２２３０６４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、遺伝子組換え技術を用いてＦｃ結合性タンパク質を効率的に製造可能なプラスミド、およびそれを用いて前記タンパク質を効率的に製造する方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、宿主ペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのシグナルペプチドを最適化することで、遺伝子組換え技術によるＦｃ結合性タンパク質の生産量が向上できることを見出し、本発明の完成に至った。

【0007】

すなわち本発明は、以下の発明を包含する：
（Ａ）Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ペリプラズムに前記タンパク質を分泌させるためのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む、前記タンパク質を発現させるためのプラスミドであって、
前記シグナルペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド、または当該オリゴペプチドのうち、１もしくは数残基を置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じたオリゴペプチドである、前記プラスミド。

【0008】

（Ｂ）Ｆｃ結合性タンパク質が以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択される、（Ａ）に記載のプラスミド；
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じ、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまで、および配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。

【0009】

（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に記載のプラスミドを用いて宿主を形質転換して得られる、形質転換体。

【0010】

（Ｄ）宿主が大腸菌である、（Ｃ）に記載の形質転換体。

【0011】

（Ｅ）（Ｃ）に記載の形質転換体を培養することで前記形質転換体からＦｃ結合性タンパク質を発現させる工程と、前記形質転換体から当該タンパク質を単離する工程とを含む、前記タンパク質の製造方法。

【発明の効果】

【0012】

本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を発現させるプラスミドに含まれる、ペリプラズムに前記タンパク質を分泌させるためのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、ＯｍｐＡシグナルペプチド、またはＯｍｐＡシグナルペプチドのうち１もしくは数残基を置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上生じたオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることで、ＭａｌＥシグナルペプチドを用いた時と比較し、前記タンパク質の生産量を大幅に向上できるため、遺伝子組換え技術を用いたＦｃ結合性タンパク質の製造効率を大幅に向上できる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ヒトＦｃＲｎのα鎖の概略図である。図中の数字は配列番号２に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナルペプチドの配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。

【図2】ヒトＦｃＲｎのβ鎖の概略図である。図中の数字は配列番号３に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナルペプチドの配列、Ｂ２Ｍはβ２ミクログロブリンを示している。

【図3】Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側に、ＭａｌＥシグナルペプチドを付加させたとき（比較例３）と、ＯｍｐＡシグナルペプチドを付加させたとき（実施例２）とで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産性を比較したＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示している。レーンＭは分子量マーカー、レーン１は精製工程の素通り画分、レーン２から４は溶出画分（１）から（３）の分析結果である。黒矢印でＦｃ結合性タンパク質のバンドを示している。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下に、本発明について詳細に説明する。

【0015】

本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を発現させるプラスミドに含まれる、ペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、
（Ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる天然型ＯｍｐＡシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０Ａ９１０の１番目から２１番目までの領域）をコードするポリヌクレオチド、または
（ＩＩ）前記（Ｉ）に記載のシグナルペプチドのうち、１もしくは数残基を置換、欠失、挿入もしくは付加のうち、いずれか１つ以上生じた（以下、これらを合わせて「改変した」とも表記する）以上オリゴヌクレオチド、
を用いることで、Ｆｃ結合性タンパク質を効率的に生産することを特徴としている。

【0016】

なお前記（ＩＩ）において、改変するアミノ酸残基の数（１もしくは数残基の改変）は、本発明の目的である、宿主内で発現した組換えタンパク質の、ペリプラズム領域への効率的な移行ができれば、特に限定はなく、一例として、１から５残基、１から４残基、１から３残基、１または２残基、および１残基のいずれかを意味する。なお２残基以上改変する場合、１アミノ酸残基の改変を複数設けてもよく、アミノ酸残基を２以上連続して改変
させてもよく、それらの組み合わせであってもよい。

【0017】

本発明のプラスミドは、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＡ）の５’末端側に前述したシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＢ）を付加したポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドＣ）を、プラスミドの適切な位置に挿入することで得られる。なお、前記ポリヌクレオチドＡに前記ポリヌクレオチドＢを付加させる際、前記ポリヌクレオチドＡと前記ポリヌクレオチドＢとの間にリンカーとして１から数アミノ酸残基からなる任意のオリゴペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを挿入してもよい。またポリヌクレオチドＣを挿入するプラスミドとしては、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、宿主が大腸菌の場合は、ｐＥＴプラスミド、ｐＵＣプラスミド、ｐＴｒｃプラスミド、ｐＣＤＦプラスミド、ｐＢＢＲプラスミドが例示できる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。本発明のプラスミドを用いて宿主を形質転換させるには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。

【0018】

本発明のプラスミドを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体（以下、単に本発明の形質転換体とする）を用いて製造するＦｃ結合性タンパク質に特に限定はなく、一例として、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩｃ（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）およびＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）があげられる。Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃＲｎである場合の好ましい態様として、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドがあげられる。
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニン（Ａ）から２９７番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸残基および配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシン（Ｉ）から１１９番目のメチオニン（Ｍ）までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただしこれらアミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基が改変され、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまで、および配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有し、かつ抗体結合活性を有するポリペプチド。

【0019】

なお配列番号２に記載のアミノ酸配列はヒトＦｃＲｎα鎖（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ５５８９９）の、配列番号３に記載のアミノ酸配列はヒトＦｃＲｎβ鎖（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ６１７６９）の、それぞれアミノ酸配列である。また配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２４番目のアラニン（Ａ）から２９７番目のセリン（Ｓ）までのアミノ酸残基はヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外（ＥＣ）領域（図１のＥＣ領域）に、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシン（Ｉ）から１１９番目のメチオニン（Ｍ）までのアミノ酸残基はヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）領域（図２のＢ２Ｍの領域）に、それぞれ相当する。

【0020】

前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドは、前述したヒトＦｃＲｎα鎖のＥＣ領域およびヒトＦｃＲｎβ鎖のＢ２Ｍ領域に相当する領域を少なくとも含んでいればよく、例えば、ヒトＦｃＲｎα鎖のＥＣ領域やヒトＦｃＲｎβ鎖のＢ２Ｍ領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１および図２のＳの領域）の全てまたは一部を含んでもよいし、ヒトＦｃＲｎα鎖のＥＣ領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭの領域）および細胞内領域（図１のＣの領域）の全てまたは一部を含んでもよい。

【0021】

本明細書において、ヒトＦｃＲｎα鎖のＥＣ領域およびヒトＦｃＲｎβ鎖のＢ２Ｍ領域に相当するアミノ酸残基を少なくとも含むＦｃ結合性タンパク質とは、当該タンパク質のアミノ酸配列にヒトＦｃＲｎα鎖のＥＣ領域に相当するアミノ酸配列およびヒトＦｃＲｎβ鎖のＢ２Ｍ領域に相当するアミノ酸配列を少なくとも含んでいればよく、ヒトＦｃＲｎα鎖のＥＣ領域に相当するアミノ酸残基とヒトＦｃＲｎβ鎖のＢ２Ｍ領域に相当するアミノ酸残基との順番は問わない。すなわちヒトＦｃＲｎβ鎖のＢ２Ｍ領域に相当するアミノ酸残基が、ヒトＦｃＲｎα鎖のＥＣ領域に相当するアミノ酸残基のＮ末端側にあってもよく、Ｃ末端側にあってもよい。またヒトＦｃＲｎα鎖のＥＣ領域に相当するアミノ酸残基とヒトＦｃＲｎβ鎖のＢ２Ｍ領域に相当するアミノ酸残基とが直結した態様であってもよく、ＧＳリンカー（グリシン（Ｇ）４残基とセリン（Ｓ）１残基からなるオリゴペプチドの繰り返しからなるリンカー）など公知のリンカーを介して結合した態様であってもよい。

【0022】

前記（ｉｉ）において「１もしくは数個」とは、ＦｃＲｎの立体構造におけるアミノ酸置換の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、一例として、１から５０個、１から３０個、１から２０個、１から１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個のいずれかを意味する。「１もしくは数個」のアミノ酸残基の改変は、例えば、免疫グロブリン結合活性を有する限り、特開２０１８－１８３０８７号公報、特開２０２１－０７３８８３号公報、特開２０２１－１３６９６７号公報および特開２０２２－０７６９９８号で開示の改変以外の位置に生じてよい。

【0023】

なお前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の改変（置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上）」には、前述した特定位置におけるアミノ酸改変の他に、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が生じてもよい。保守的置換は、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社、９、２００５）。また前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の改変」には、天然にも存在する変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。

【0024】

前記（ｉｉ）の一例として、
特開２０１８－１８３０８７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０２１－０７３８８３号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０２１－１３６９６７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、および
特開２０２２－０７６９９８号で開示のＦｃ結合性タンパク質、
があげられる。

【0025】

前記（ｉｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上あればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本明細書において「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列の相同性」とは、アミノ酸配列全体に対する相同性を意味する。アミノ酸配列間の「同一性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学，３１（３），羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学，３１（３），羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。

【0026】

本発明の形質転換体を作製する際に用いる宿主としては、ＣＯＳ（ＣＶ－１ Ｏｒｉｇｉｎ，ＳＶ４０）細胞およびＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞に代表される動物細胞や、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌やパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に代表される細菌や、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属およびシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に代表される酵母や、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に代表される糸状菌が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌を宿主とするのが好ましい。

【0027】

本発明の形質転換体を培養して得られた培養物からＦｃ結合性タンパク質を回収するには、発現の形態によって適宜選択すればよい。例えば、発現したタンパク質が宿主のペリプラズムに発現する場合は、培養液を遠心分離して得られる宿主を適切な緩衝液で懸濁し細胞破砕（物理的破砕、薬剤による破砕など）後、遠心分離により破砕残渣を除去する
ことで、発現したタンパク質を含む無細胞抽出液を得ればよく、発現したタンパク質が宿主のペリプラズムから培養上清に漏出する場合は、培養液を遠心分離して得られる培養上清から発現したタンパク質を回収すればよい。なお薬剤により宿主細胞を破砕する際は、例えば、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、６ｍＭ硫酸マグネシウム、２５０Ｕ／Ｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社製）、０．３ｇ／Ｌリゾチーム、０．４％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商品名）、０．５％（ｗ／ｖ）臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよび５０ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（特開２０１３－２５２０９９号公報）や、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等の市販の抽出試薬を用いて破砕するとよい。

【0028】

回収したＦｃ結合性タンパク質を含む溶液は、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、Ｆｃ結合性タンパク質を高純度に調製できる。クロマトグラフィーを用いて精製を行なう際は、アプライ液の導入量や前記クロマトグラフィー担体のタンパク吸着性能などによって決定した量の担体を、適切なオープンカラム等に充填して行なえばよい。

【0029】

また、クロマトグラフィー用担体は、アプライ液を導入する前に、あらかじめ適切な緩衝液（トリス／トリス塩酸塩緩衝液、グリシン／水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸塩緩衝液等）により平衡化しておくとよい。前述の方法で回収したタンパク質を含む溶液を、平衡化したクロマトグラフィー用担体に導入することで前記タンパク質を担体に吸着させ、平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄する。その後、溶出用緩衝液を用いて吸着した前記タンパク質を溶出させることで精製された前記タンパク質を含む溶液が得られる。

【実施例0030】

以下、実施例および比較例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

【0031】

比較例１ プラスミドベクターの作製（シグナルペプチド：ＭａｌＥ）
ペリプラズムにタンパク質を分泌させるためのシグナルペプチドとして、ＭａｌＥシグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までのアミノ酸配列）、配列番号５）を選択し、以下に示す方法でプラスミドベクターを作製した。

【0032】

（１）以下に示す２段階ＰＣＲにより、ＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（１－１）表１の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとした反応を５サイクル繰り返すことで、１段階目のＰＣＲを実施した。なお、オリゴヌクレオチドは、配列番号６（５’－ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号７（５’－ＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号８（５’－ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号９（５’－ＴＴＧＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。

【0033】

【表1】

【0034】

（１－２）表２の反応液組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル繰り返すことで、２段階目のＰＣＲを実施した。なお、鋳型は（１－１）で得られた１段階目のＰＣＲ産物を用い、ＰＣＲプライマーは配列番号１０（５’－ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）および配列番号１１（５’－ＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を用いた。

【0035】

【表2】

【0036】

（２）（１）に記載の２段階ＰＣＲにより作製した、ＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化したプラスミドベクターｐＥＴ－２６ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にライゲーションし、これを用いて塩化カルシウム法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換した。

【0037】

（３）得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン硫酸塩（ナカライテスク）を含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、プラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥを抽出した。

【0038】

（４）鋳型ＤＮＡとして（３）で得られたプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥを、ＰＣＲプライマーとして配列番号１２（５’－ＡＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＧ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１３（５’－ＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は、（１－２）と同様な方法でＰＣＲを実施した。

【0039】

（５）（４）のＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｈＩとＮｄｅＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＳｐｈＩとＮｄｅＩで消化したｐＥＴＭａｌＥにライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。

【0040】

（６）（５）の形質転換体を培養後、プラスミドを抽出した（ｐＥＴＭａｌＥ－ｐ７と命名）。

【0041】

比較例２ Ｆｃ結合性タンパク質を発現させるためのプラスミドの作製（シグナルペプチド：ＭａｌＥ）
配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌのＣ末端側にシステインタグ（アミノ酸配列：ＣＲＮＤＴＣＧ、配列番号３１）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｎ＿ｍ７－ＣＲＮＤＴＣＧ）をコードするポリヌクレオチドを、以下に示す方法で比較例１で作製した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ－ｐ７に挿入することで、前記タンパク質を発現可能なプラスミドを作製した。なお配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２４番目から２９７番目までの配列からなる天然型ヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域および配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち２１番目から１１９番目までの配列からなる同β鎖のβ２ミクログロブリン領域を含む、配列番号４に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質に対し、以下に示す７箇所のアミノ酸置換を導入したポリペプチドである；
配列番号４の１７２番目（配列番号１では７１番目）のシステイン（Ｃ）がアルギニン（Ｒ）に置換
配列番号３の１７９番目（配列番号１では７８番目）のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換
配列番号３の２５２番目（配列番号１では１５１番目）のグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換
配列番号３の２９３番目（配列番号１では１９２番目）のアルギニン（Ｒ）がロイシン（Ｌ）に置換
配列番号３の２９７番目（配列番号１では１９６番目）のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換
配列番号３の３３３番目（配列番号１では２３２番目）のグルタミン（Ｑ）がロイシン（Ｌ）に置換
配列番号３の３９６番目（配列番号１では２９５番目）のリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換。

【0042】

（１）鋳型ＤＮＡとして特開２０１８－１８３０８７号公報に記載の方法で作製した、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５）を含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌを、ＰＣＲプライマーとして配列番号１６（５’－ＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＣ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）および配列番号１７（５’－ＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＧＡＴＴＣＧＧＣ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、それぞれ用い、表２の反応組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６３℃で３０秒間の第２ステップ、６８℃で１分間の第３ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。

【0043】

（２）（１）で得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。当該精製したＰＣＲ産物をＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＰＣＲ１と命名した。

【0044】

（３）鋳型ＤＮＡとして比較例１で作製したプラスミドベクターｐＥＴＭａｌＥ－ｐ７を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１８（５’－ＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＡ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）および配列番号１９（５’－ＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、それぞれ用い、表２の反応組成のもと、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６３℃で３０秒間の第２ステップ、６８℃で７分間の第３ステップを１サイクルとした反応を３０サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。

【0045】

（４）（３）で得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、（２）に記載の方法で精製した。当該精製したＰＣＲ産物をＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＰＣＲ２と命名した。

【0046】

（５）（２）で得られた精製ＰＣＲ産物ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＰＣＲ１および（４）で得られた精製ＰＣＲ産物ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＰＣＲ２を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。

【0047】

（６）得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン硫酸塩（ナカライテスク）を含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能なプラスミドを抽出した（ｐＥＴＭａｌＥ－ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧ－ｐ７と命名）。

【0048】

（７）（６）で作製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ－ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧ－ｐ７のうち、ＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌをコードするポリヌクレオチド、システインタグをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、全自動ＤＮＡシークエンサーＧｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ３５００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて塩基配列を解析し、所望の配列（すなわち、配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列）であることを確認した。なお当該解析の際、配列番号２１（５’－ＧＧＡＴＣＴＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＣＣＴ－３’）、配列番号２２（５’－ＡＴＧＧＧＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴＡＣＧＣＣＡＡＡ－３’）、配列番号２３（５’－ＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣ－３’）、配列番号２４（５’－ＣＡＣＧＣＴＧＧＴＣＴＣＧＣＧＣＡＡＣＣ－３’）および配列番号２５（５’－ＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ－３’）に記載のオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。

【0049】

プラスミドｐＥＴＭａｌＥ－ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧ－ｐ７により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２０に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号２６に、それぞれ示す。なお配列番号２０において、１番目のメチオニン（Ｍ）から２６番目のアラニン（Ａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）であり、２７番目のイソロイシン（Ｉ）から１２５番目のメチオニン（Ｍ）までがヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域に相当するアミノ酸配列（配列番号３に記載のアミノ酸配列の２１番目から１１９番目までの領域）であり、１２６番目のグリシン（Ｇ）から１５０番目のセリン（Ｓ）までがＧＳリンカー配列であり、１５１番目のアラニン（Ａ）から４２４番目のセリン（Ｓ）までがヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域に相当するアミノ酸配列（配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目から２９７番目までの領域であり、４２５番目から４３０番目までのヒスチジン（Ｈ）がヒスチジンタグ配列であり、４３１番目のシステイン（Ｃ）から４３７番目のグリシン（Ｇ）までがシステインタグ配列である。

【0050】

実施例１ Ｆｃ結合性タンパク質を発現させるためのプラスミドの作製（シグナルペプチド：ＯｍｐＡ）
配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、シグナルペプチドをＭａｌＥシグナルペプチド（配列番号５）からＯｍｐＡシグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ、配列番号１）に置換したポリペプチド（配列番号２７）を設計し、当該ポリペプチドを発現可能なプラスミドを作製した。

【0051】

（１）鋳型ＤＮＡとして比較例２で作製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ－ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧ－ｐ７を、ＰＣＲプライマーとして配列番号２８（５’－ＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴＣＣＡＡＧＴＡＴＡＣＴＣＡＣＧ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）および配列番号２９（５’－ＧＧＴＡＧＣＧＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＧＣＡＡＴＣＧＣＧＡＴＡＧＣＴＧＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣ－３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、それぞれ用いた他は、比較例２（３）と同様な方法でＰＣＲを実施した。

【0052】

（２）（１）で得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、比較例２（２）に記載の方法で精製した。当該精製したＰＣＲ産物をＯｍｐＡ－ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＰＣＲ１と命名した。

【0053】

（３）（２）で得られた精製ＰＣＲ産物ＯｍｐＡ－ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＰＣＲ１を、比較例２（５）に記載の方法でライゲーションおよび形質転換を行ない、得られた形質転換体を、比較例２（６）に記載の方法で培養し、プラスミドを抽出した（ｐＥＴＯｍｐＡ－ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧ－ｐ７と命名）。

【0054】

（４）（３）で作製したプラスミドｐＥＴＯｍｐＡ－ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧ－ｐ７のうち、ＯｍｐＡシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌをコードするポリヌクレオチド、システインタグをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、比較例２（７）に記載の方法で塩基配列を解析し、所望の配列（すなわち、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列）であることを確認した。プラスミドｐＥＴＯｍｐＡ－ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧ－ｐ７のポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号３２に示す。

【0055】

プラスミドｐＥＴＯｍｐＡ－ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧ－ｐ７により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２７に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号３０に、それぞれ示す。なお配列番号２７において、１番目のメチオニン（Ｍ）から２１番目のアラニン（Ａ）までがＯｍｐＡシグナルペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）であり、２２番目のイソロイシン（Ｉ）から１２０番目のメチオニン（Ｍ）までがヒトＦｃＲｎβ鎖のβ２ミクログロブリン領域に相当するアミノ酸配列（配列番号３に記載のアミノ酸配列の２１番目から１１９番目までの領域）であり、１２１番目のグリシン（Ｇ）から１４５番目のセリン（Ｓ）までがＧＳリンカー配列であり、１４６番目のアラニン（Ａ）から４１９番目のセリン（Ｓ）までがヒトＦｃＲｎα鎖の細胞外領域に相当するアミノ酸配列（配列番号２に記載のアミノ酸配列の２４番目から２９７番目までの領域であり、４２０番目から４２５番目までのヒスチジン（Ｈ）がヒスチジンタグ配列であり、４２６番目のシステイン（Ｃ）から４３２番目のグリシン（Ｇ）までがＣ末端側に付加したシステインタグ配列である。

【0056】

実施例２ Ｆｃ結合性タンパク質の発現（シグナルペプチド：ＯｍｐＡ）
（１）実施例１で作製したプラスミドｐＥＴＯｍｐＡ－ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧ－ｐ７で大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換し得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬの２ＹＴ液体培地（１６ｇ／ＬのＴｒｙｐｔｏｎｅ、１０ｇ／ＬのＹｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。

【0057】

（２）５Ｌのバッフルフラスコに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１Ｌの２ＹＴ液体培地に（１）の前培養液を６０ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。

【0058】

（３）培養開始２時間後、氷上にて冷却し、終濃度０．０５ｍＭとなるようＩＰＴＧ（ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ＴｈｉｏＧａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。

【0059】

（４）培養終了後、培養液を４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することで菌体を回収した。

【0060】

（５）形質転換体の培養液より菌体を回収後、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２．４ｍＭの硫酸マグネシウム、５０００Ｕｎｉｔ／ＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社製）、０．００６％（ｗ／ｖ）のリゾチーム、および０．６％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商品名）を含む１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、室温で２時間の抽出を行なった後、菌体抽出液について４℃で２０分間、１５０００ｒｐｍの遠心分離を行なうことで、ＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧを含むタンパク質抽出液を得た。

【0061】

（６）（５）で得たＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧを含むタンパク質抽出液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した５ｍＬのＮｉ－ＮＴＡアガロース（富士フイルム和光純薬社製）を充填したエコノパックカラム（バイオラッド社製）にアプライした。２０ｍＭのイミダゾール、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、３００ｍＭのイミダゾール、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出することでＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧを含むタンパク質粗精製液を得た。

【0062】

（７）（６）で得たＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧを含むタンパク質粗精製液を１Ｍ塩酸（富士フイルム和光純薬社製）を用いてｐＨ６．０に調整した。

【0063】

（８）（７）で得たｐＨ調整後のＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧを含むタンパク質粗精製液を、あらかじめ１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した１ｍＬのＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｃｙｔｉｖａ社製）を充填したポリプレップカラム（バイオラッド社製）にアプライした。平衡化に使用した緩衝液で洗浄後、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出することでＦｃＲｎ＿ｍ７ＭＧｄｅｌ－ＣＲＮＤＴＣＧを得た。

【0064】

（９）（８）で得られた素通り画分および溶出画分（１）から（３）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に供し、ＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）染色液（富士フイルム和光純薬社製）を用いて染色した。

【0065】

比較例３ Ｆｃ結合性タンパク質の発現（シグナルペプチド：ＭａｌＥ）
形質転換体として、比較例２で作製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥ－ＦｃＲｎ＿ｍ７－ＣＲＮＤＴＣＧ－ｐ７で大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換し得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を用いた他は、実施例２と同様の方法でＦｃ結合性タンパク質を発現させ、精製工程で得られた素通り画分および溶出画分（１）から（３）をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。

【0066】

実施例２および比較例３のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図３に示す。シグナルペプチドとしてＯｍｐＡシグナルペプチド（配列番号１）を用いることで（実施例２）、ＭａｌＥ（配列番号５）をシグナルペプチドとして用いたとき（比較例３）と比較し、Ｆｃ結合性タンパク質に相当するバンド（約４５ｋＤａ、図３のうち黒矢印で示したバンド）が顕著に濃くなっており、発現量が顕著に向上していることがわかる。

【0067】

さらに、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ １０．０、Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの溶出画分（１）から（３）にそれぞれ含まれるＦｃ結合性タンパク質に相当するバンドの輝度の合計を定量した結果、実施例２で得られたＦｃ結合性タンパク質の量は比較例１のＦｃ結合性タンパク質の量と比べて、３．７６倍向上していることが明らかとなった。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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