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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024124262
(43)【公開日】2024-09-12
(54)【発明の名称】凝集誘起増強型ラマンプローブ又は蛍光プローブ
(51)【国際特許分類】
C07C 255/37 20060101AFI20240905BHJP
C07K 1/13 20060101ALI20240905BHJP
G01N 21/65 20060101ALI20240905BHJP
C07K 2/00 20060101ALN20240905BHJP
【ＦＩ】
C07C255/37 CSP
C07K1/13
G01N21/65
C07K2/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023032292
(22)【出願日】2023-03-02
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(71)【出願人】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100172683
【弁理士】
【氏名又は名称】綾 聡平
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100203208
【弁理士】
【氏名又は名称】小笠原 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】浦野 泰照
(72)【発明者】
【氏名】沖中 桃子
(72)【発明者】
【氏名】藤岡 礼任
(72)【発明者】
【氏名】小関 泰之
(72)【発明者】
【氏名】スプラット スペンサー ジョン
(72)【発明者】
【氏名】神谷 真子
(72)【発明者】
【氏名】河谷 稔
【テーマコード（参考）】
2G043
4H006
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G043AA04
2G043BA16
2G043CA04
2G043DA02
2G043EA03
2G043FA02
2G043FA06
2G043KA01
2G043KA02
2G043LA03
4H006AA01
4H006AB80
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA50
4H045EA50
4H045FA10
(57)【要約】
【解決課題】
酵素反応生成物の局所濃度を積極的に高めることで、新たな酵素活性検出ラマンプローブを提供すること。
【解決手段】
以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
酵素反応生成物の局所濃度を積極的に高めることで、新たな酵素活性検出ラマンプローブを提供すること。
【解決手段】
以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
（式中、
Ｒは、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、－Ｃ≡Ｎ、－Ｃ≡１５Ｎ、－１３Ｃ≡Ｎ、又は－１３Ｃ≡１５Ｎから選択され；
Ｙは、－ＮＲａ－Ｌ１、－Ｎ＝Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ２、－ＮＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｌ’又は－Ｏ－Ｌ’であり、
ここで、Ｌ１は、アミノ酸の部分構造であり、
Ｌ２は、アミノ酸残基又はＣ末端アミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造であり、
Ｒｃは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。）
Ｒは、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、－Ｃ≡Ｎ、－Ｃ≡１５Ｎ、－１３Ｃ≡Ｎ、又は－１３Ｃ≡１５Ｎから選択され；
Ｙは、－ＮＲａ－Ｌ１、－Ｎ＝Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ２、－ＮＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｌ’又は－Ｏ－Ｌ’であり、
ここで、Ｌ１は、アミノ酸の部分構造であり、
Ｌ２は、アミノ酸残基又はＣ末端アミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造であり、
Ｒｃは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。）
【請求項2】
Ｒの少なくとも１つは、アミノ基又はアルコキシ基であるか、あるいは、Ｒの少なくとも１つは一価の置換基である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項3】
以下の一般式（ＩＩ）で表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
（式中、Ｒ１、Ｒａ、Ｒｂ及びＹは、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１～６個のアルキル基である。）
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１～６個のアルキル基である。）
【請求項4】
Ｌ１のアミノ酸の部分構造は、アミノ酸、アミノ酸残基、ペプチド、アミノ酸又はペプチドの一部を構成している構造である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項5】
Ｌ２のアミノ酸残基は以下の式で表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
（式中、Ｒ’は、アミノ酸の側鎖を表す。）
【請求項6】
Ｌ’の糖類の部分構造は、それが結合しているＯと一緒になって、糖類又は糖類の一部を構成している構造である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項7】
Ｙが以下のいずれかで表される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項8】
以下のいずれかの構造を有する化合物又はその塩。
【請求項9】
一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むラマンプローブ。
【請求項10】
ｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能な請求項９に記載のラマンプローブ。
【請求項11】
細胞又は組織内の標的酵素を検出する方法であって、（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞又は組織内で標的酵素と反応することにより増強されるラマン散乱光を測定する工程を含む方法。
【請求項12】
ｅｐｒ－ＳＲＳ法を用いてラマン散乱光を測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
【請求項14】
細胞又は組織内の標的酵素を検出する方法であって、（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞又は組織内で標的酵素と反応することにより、発せられる又は増強される蛍光を測定する工程を含む方法。
【請求項15】
以下のいずれかの構造を有する化合物又はその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規の凝集誘起増強型ラマン又は蛍光プローブに関わる。
【背景技術】
【0002】
ペプチダーゼ（プロテアーゼ）はタンパク質やペプチドを加水分解する酵素であり、様々な生理機能にかかわるだけでなく、がんを始めとした疾患のバイオマーカーとしても注目を集めている。
したがって、特定のペプチダーゼ活性を可視化する技術は有用なバイオマーカーの探索や診断薬・治療薬開発に有用な基盤技術となりうる。実際に、本発明者らの研究グループではペプチダーゼ活性を高感度に蛍光検出可能なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型蛍光プローブを開発することで、がん患者手術切除検体におけるがん部位を迅速に蛍光検出することに成功している（非特許文献１）
したがって、特定のペプチダーゼ活性を可視化する技術は有用なバイオマーカーの探索や診断薬・治療薬開発に有用な基盤技術となりうる。実際に、本発明者らの研究グループではペプチダーゼ活性を高感度に蛍光検出可能なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型蛍光プローブを開発することで、がん患者手術切除検体におけるがん部位を迅速に蛍光検出することに成功している（非特許文献１）
【0003】
一方、蛍光はスペクトル幅が広いため、多色イメージングによって同時観察可能な酵素活性の種類は２～３種類に限られており、一つの検体をイメージングして得られる酵素活性の情報も制限されるという課題があった。この課題に対して、近年、本発明者らの研究グループでは、ラマンイメージングを用いて酵素活性を多重検出可能なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブを新たに開発し、酵素活性を多重イメージングする基盤技術を確立した（非特許文献２、図１参照）。
開発したラマンプローブは、酵素による反応前後で分子内のニトリルに由来するラマン信号強度が大きく増大するだけでなく、酵素反応生成物が細胞内リソソームに局在することで局所濃度が高くなり、さらなるラマン信号強度の増強が得られるという特性を有していた。
開発したラマンプローブは、酵素による反応前後で分子内のニトリルに由来するラマン信号強度が大きく増大するだけでなく、酵素反応生成物が細胞内リソソームに局在することで局所濃度が高くなり、さらなるラマン信号強度の増強が得られるという特性を有していた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ito, R., Kamiya, M. & Urano, Y. Molecular probes for fluorescence image-guided cancer surgery. Curr Opin Chem Biol 67, 102112 (2022).
【非特許文献2】Fujioka, H. et al. Multicolor Activatable Raman Probes for Simultaneous Detection of Plural Enzyme Activities. J Am Chem Soc 142, 20701-20707 (2020).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、酵素反応生成物の局所濃度を積極的に高めることで、新たな酵素活性検出ラマンプローブを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
かかる課題を解決するために、本発明者らは、溶液状態では発光せず、固体・凝集状態で発光する現象である凝集誘起発光（ＡＩＥ）に着目し、ＡＩＥ特性を示すことが報告されているＢｚＢＭＮを母核として選定し、この母核にラマンタグとなる基を導入するとともに、酵素との反応部位を組み込むためのアミノ基又は水酸基を導入したプローブ骨格構造を設計した。そして、この骨格構造に酵素基質となる部位を導入することにより、酵素との反応前は水溶液中で分散しているためラマン信号強度が低いが、酵素と反応することで凝集体を形成し、ラマン信号強度が向上するような新規な酵素活性検出プローブを得ることができることを見出し、本発明を完成した。
【0007】
即ち、本発明は、以下の構成を有するものである。
［１］ 以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
（式中、
Ｒは、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、－Ｃ≡Ｎ、－Ｃ≡１５Ｎ、－１３Ｃ≡Ｎ、又は－１３Ｃ≡１５Ｎから選択され；
Ｙは、－ＮＲａ－Ｌ１、－Ｎ＝Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ２、－ＮＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｌ’又は－Ｏ－Ｌ’であり、
ここで、Ｌ１は、アミノ酸の部分構造であり、
Ｌ２は、アミノ酸残基又はＣ末端アミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造であり、
Ｒｃは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。）
［２］Ｒの少なくとも１つは、アミノ基又はアルコキシ基であるか、あるいは、Ｒの少なくとも１つは一価の置換基である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］以下の一般式（ＩＩ）で表される、［１］に記載の化合物又はその塩。
（式中、Ｒ１、Ｒａ、Ｒｂ及びＹは、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１～６個のアルキル基である。）
［４］Ｌ１のアミノ酸の部分構造は、アミノ酸、アミノ酸残基、ペプチド、アミノ酸又はペプチドの一部を構成している構造である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］Ｌ２のアミノ酸残基は以下の式で表される、［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
（式中、Ｒ’は、アミノ酸の側鎖を表す。）
［６］Ｌ’の糖類の部分構造は、それが結合しているＯと一緒になって、糖類又は糖類の一部を構成している構造である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［７］Ｙが以下のいずれかで表される、［１］～［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［８］以下のいずれかの構造を有する化合物又はその塩。
［９］［１］～［８］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含むラマンプローブ。
［１０］ｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能な［９］に記載のラマンプローブ。
［１１］細胞又は組織内の標的酵素を検出する方法であって、（ａ）［１］～［８］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞又は組織内で標的酵素と反応することにより増強されるラマン散乱光を測定する工程を含む方法。
［１２］ｅｐｒ－ＳＲＳ法を用いてラマン散乱光を測定する、［１１］に記載の方法。
［１３］［１］～［８］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［１４］細胞又は組織内の標的酵素を検出する方法であって、（ａ）［１］～［８］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞又は組織内で標的酵素と反応することにより、発せられる又は増強される蛍光を測定する工程を含む方法。
［１５］以下のいずれかの構造を有する化合物又はその塩。
［１］ 以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
Ｒは、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４の同一又は異なる一価の置換基を示し：
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に、－Ｃ≡Ｎ、－Ｃ≡１５Ｎ、－１３Ｃ≡Ｎ、又は－１３Ｃ≡１５Ｎから選択され；
Ｙは、－ＮＲａ－Ｌ１、－Ｎ＝Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ２、－ＮＲｃ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｌ’又は－Ｏ－Ｌ’であり、
ここで、Ｌ１は、アミノ酸の部分構造であり、
Ｌ２は、アミノ酸残基又はＣ末端アミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造であり、
Ｒｃは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。）
［２］Ｒの少なくとも１つは、アミノ基又はアルコキシ基であるか、あるいは、Ｒの少なくとも１つは一価の置換基である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］以下の一般式（ＩＩ）で表される、［１］に記載の化合物又はその塩。
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１～６個のアルキル基である。）
［４］Ｌ１のアミノ酸の部分構造は、アミノ酸、アミノ酸残基、ペプチド、アミノ酸又はペプチドの一部を構成している構造である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］Ｌ２のアミノ酸残基は以下の式で表される、［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［６］Ｌ’の糖類の部分構造は、それが結合しているＯと一緒になって、糖類又は糖類の一部を構成している構造である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［７］Ｙが以下のいずれかで表される、［１］～［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［１０］ｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能な［９］に記載のラマンプローブ。
［１１］細胞又は組織内の標的酵素を検出する方法であって、（ａ）［１］～［８］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞又は組織内で標的酵素と反応することにより増強されるラマン散乱光を測定する工程を含む方法。
［１２］ｅｐｒ－ＳＲＳ法を用いてラマン散乱光を測定する、［１１］に記載の方法。
［１３］［１］～［８］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［１４］細胞又は組織内の標的酵素を検出する方法であって、（ａ）［１］～［８］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞又は組織内で標的酵素と反応することにより、発せられる又は増強される蛍光を測定する工程を含む方法。
［１５］以下のいずれかの構造を有する化合物又はその塩。
【発明の効果】
【0008】
本発明により、酵素との反応前は水溶液中で分散しているためラマン信号強度が低いが、酵素と反応することで凝集体を形成し、ラマン信号強度が向上するような新規な酵素活性検出プローブを提供することが可能である。
また、本発明の酵素活性検出プローブは、酵素と反応後は、ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２等が水溶液中で蛍光を発することから、蛍光プローブとしても使用することが可能である。
また、本発明の酵素活性検出プローブは、酵素と反応後は、ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２等が水溶液中で蛍光を発することから、蛍光プローブとしても使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】ラマン顕微鏡による生体観察の模式図を示す。
【図2】本発明の化合物の分子設計に基づく酵素活性検出プローブの非限定的例の概念図を示す。
【図3】カルボキシペプチダーゼを標的酵素とする場合の本発明の化合物の非限定的例の分子設計の概念図を示す。
【図4】ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２とｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮの吸収スペクトルと蛍光スペクトルを示す。
【図5】γ-グルタミルトランスペプチダーゼを添加した際のｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮの吸収スペクトル変化を示す。
【図6】ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮのＳＲＳ画像を示す。
【図7】ＥＰ－ＢｚＢＭＮの特性評価の結果を示す。
【図8】ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ及びＥＰ－ＢｚＢＭＮをＡ５４９細胞（ＧＧＴ高活性、ＤＰＰ４低活性）とＨ２２６細胞（ＧＧＴ低活性、ＤＰＰ４高活性）にアプライし、ＳＲＳイメージングで観察した結果を示す。
【図9】［１２Ｃ１５Ｎ］ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮと、［１２Ｃ１４Ｎ］ＥＰ－ＢｚＢＭＮを用いた多重検出の検討結果を示す。
【図10】ＢｚＢＭＮ－ＡＦ－Ｌｙｓ及びＣＰＭとの反応に伴う想定生成物のＢｚＢＭＮの水溶液中での吸収・蛍光スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個（Ｃ１～６）、炭素数１～１０個（Ｃ１～１０）、炭素数１～１５個（Ｃ１～１５）、炭素数１～２０個（Ｃ１～２０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１～８アルキルには、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。そのような置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
【0011】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【0012】
本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【0013】
本明細書中において、「アルコキシ基」とは、前記アルキル基が酸素原子に結合した構造であり、例えば直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせである飽和アルコキシ基が挙げられる。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、シクロブトキシ基、シクロプロピルメトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロプロピルエチルオキシ基、シクロブチルメチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルプロピルオキシ基、シクロブチルエチルオキシ基又はシクロペンチルメチルオキシ基等が好適な例として挙げられる。
【0014】
１．一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩
本発明の１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である（以下「本発明の化合物」とも言う）。
本発明の１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である（以下「本発明の化合物」とも言う）。
【0015】
【0016】
即ち、本発明の化合物は、凝集誘起発光（ＡＩＥ）特性を示すＢｚＢＭＮを母核として有し、この母核にラマンタグとなる基を導入するとともに、アミノ基又は水酸基を介して酵素基質となる部位を導入した構造を有するものである。本発明の化合物の分子設計に基づく酵素活性検出プローブの非限定的例の概念図を図２に示す。
理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明の化合物は、このような構造を有することにより、酵素との反応前は、水溶性の酵素基質を有することから、水溶液中で分散しているためラマン信号強度が低いが、酵素と反応することで、水溶性が低下し凝集体を形成し、ラマン信号強度が向上する。
本発明の化合物は、従来のプローブと比較して構造展開が容易であり、ラマン信号のさらなる多色化や、従来は検出することができなかったカルボキシペプチダーゼなど、幅広い種類の加水分解酵素検出が可能になる。さらに凝集によって強いラマン信号を発するため、分散状態の色素を観察する従来のラマンプローブよりも検出が容易になることが期待される。
理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明の化合物は、このような構造を有することにより、酵素との反応前は、水溶性の酵素基質を有することから、水溶液中で分散しているためラマン信号強度が低いが、酵素と反応することで、水溶性が低下し凝集体を形成し、ラマン信号強度が向上する。
本発明の化合物は、従来のプローブと比較して構造展開が容易であり、ラマン信号のさらなる多色化や、従来は検出することができなかったカルボキシペプチダーゼなど、幅広い種類の加水分解酵素検出が可能になる。さらに凝集によって強いラマン信号を発するため、分散状態の色素を観察する従来のラマンプローブよりも検出が容易になることが期待される。
【0017】
一般式（Ｉ）において、Ｒは、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４の同一又は異なる一価の置換基を示す。
Ｒが示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、アミノ基、アミド基、アルキルアミド基からなる群から選ばれることが好ましい。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒが示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲが示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒが示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒが示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４－カルボキシブトキシ基又は４－アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
Ｒが示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、アミノ基、アミド基、アルキルアミド基からなる群から選ばれることが好ましい。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒが示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲが示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒが示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒが示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４－カルボキシブトキシ基又は４－アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
【0018】
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒは何れも水素原子である。
【0019】
本発明のもう１つの好ましい側面においては、Ｒの少なくとも１つは、アミノ基又はアルコキシ基である。
【0020】
また、本発明のもう１つの好ましい側面においては、Ｒの少なくとも１つは一価の置換基である。この場合の一価の置換基は、上記した一価の置換基のうちのアミノ基、アルコキシ基以外の置換基である。
【0021】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４の同一又は異なる一価の置換基を示す。
【0022】
Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、アミノ基、アミド基、アルキルアミド基からなる群から選ばれることが好ましい。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒ１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４－カルボキシブトキシ基又は４－アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。更に、Ｒ１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４－カルボキシブトキシ基又は４－アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
【0023】
本発明の好ましい側面においては、Ｒ１は何れも水素原子である。
【0024】
一般式（Ｉ）において、Ｙは、標的酵素と反応する部位、酵素基質を含む部位である。Ｙは標的酵素の種類に応じて選択することができる。標的酵素がグリコシダーゼである場合は、Ｙは糖類に由来する基から選択され、標的酵素がペプチダーゼである場合は、Ｙはアミノ酸類に由来する基、アミノ酸類を含む基から選択される。
【0025】
一般式（Ｉ）において、Ｙは、－ＮＲａ－Ｌ１、－Ｎ＝Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ２、－ＮＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｌ’又は－Ｏ－Ｌ’である。
ここで、Ｌ１は、アミノ酸の部分構造であり、Ｌ２は、アミノ酸残基又はＣ末端アミノ酸残基を有するペプチドであり、Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造である。
また、Ｒａは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。
ここで、Ｌ１は、アミノ酸の部分構造であり、Ｌ２は、アミノ酸残基又はＣ末端アミノ酸残基を有するペプチドであり、Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造である。
また、Ｒａは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。
【0026】
標的酵素がアミノペプチダーゼである場合は、Ｙとして、－ＮＲａ－Ｌ１が好適に選択される。
Ｌ１は、アミノ酸の部分構造である。Ｌ１のアミノ酸の部分構造は、アミノ酸、アミノ酸残基、ペプチド、アミノ酸の一部又はペプチドの一部を構成している、
また、「アミノ酸の一部」には、アミノ酸の側鎖が－ＮＨと結合した場合の－ＮＨを除いた部分の構造（例えば、グルタミン酸の側鎖側のカルボキシル基と－ＮＨとの間にアミド結合を形成する場合のグルタミン酸残基部分等）も含まれる。
ペプチドの一部には、ペプチドを構成する一つのアミノ酸残基の側鎖が－ＮＨと結合した場合の－ＮＨを除いた部分の構造も含まれる。
Ｌ１は、アミノ酸の部分構造である。Ｌ１のアミノ酸の部分構造は、アミノ酸、アミノ酸残基、ペプチド、アミノ酸の一部又はペプチドの一部を構成している、
また、「アミノ酸の一部」には、アミノ酸の側鎖が－ＮＨと結合した場合の－ＮＨを除いた部分の構造（例えば、グルタミン酸の側鎖側のカルボキシル基と－ＮＨとの間にアミド結合を形成する場合のグルタミン酸残基部分等）も含まれる。
ペプチドの一部には、ペプチドを構成する一つのアミノ酸残基の側鎖が－ＮＨと結合した場合の－ＮＨを除いた部分の構造も含まれる。
【0027】
本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基の両方を有する化合物であれば任意の化合物を用いることができ、天然及び非天然のものを含む。中性アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は酸性アミノ酸のいずれであってもよく、それ自体が神経伝達物質などの伝達物質として機能するアミノ酸のほか、生理活性ペプチド（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドのほか、オリゴペプチドを含む）やタンパク質などのポリペプチド化合物の構成成分であるアミノ酸を用いることができ、例えばαアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸などであってもよい。アミノ酸としては、光学活性アミノ酸を用いることが好ましい。例えば、αアミノ酸についてはＤ－又はＬ－アミノ酸のいずれを用いてもよいが、生体において機能する光学活性アミノ酸を選択することが好ましい場合がある。
また、アミノ酸のＮ末端は、Ｎアセチル化されていてもよい。
また、アミノ酸のＣ末端はアミド化（例えば、エチルアミド等のアルキルアミド）あるいはエステル化されていてもよい。
また、アミノ酸のＮ末端は、Ｎアセチル化されていてもよい。
また、アミノ酸のＣ末端はアミド化（例えば、エチルアミド等のアルキルアミド）あるいはエステル化されていてもよい。
【0028】
本明細書において、Ｌ１の「アミノ酸残基」とは、アミノ酸のカルボキシル基からヒドロキシル基を除去した残りの部分構造に対応する構造をいう。
アミノ酸残基には、αアミノ酸の残基、βアミノ酸の残基、γアミノ酸の残基が含まれる。
本明細書において、「ペプチド」には、ペプチドのＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基からヒドロキシル基を除去した残りの部分構造に対応する構造も含まれる。
アミノ酸残基には、αアミノ酸の残基、βアミノ酸の残基、γアミノ酸の残基が含まれる。
本明細書において、「ペプチド」には、ペプチドのＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基からヒドロキシル基を除去した残りの部分構造に対応する構造も含まれる。
【0029】
標的ペプチダーゼが、γ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ－４）、又はカルパインであることができる。それゆえ、標的ペプチダーゼがγ－グルタミルトランスペプチダーゼである場合、アミノ酸の部分構造としては、γ－グルタミル基（後述する式（１）から－ＮＨを除いた部分の構造）であることが好ましい。また、標的ペプチダーゼがジペプチジルペプチダーゼ４である場合、アミノ酸の部分構造としては、プロリン残基を含むアシル基、プロリン残基を含むペプチドであることが好ましい。標的ペプチダーゼがカルパインである場合、アミノ酸の部分構造としては、例えば、システイン残基を含むアシル基であることができ、或いは、カルパイン基質として当該技術分野において公知のＳｕｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ（Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ）やＡｃＬＭを用いることもできる。
好ましいアミノ酸の部分構造としては、ＧＧＴ基質の「γ―グルタミル基」やＤＰＰ－４基質のジペプチド（アミノ酸―プロリンからなるジペプチド；ここで、アミノ酸は、例えば、グリシン、グルタミン酸、プロリン）、ＬＡＰ基質のロイシン残基などが挙げられる。
好ましいアミノ酸の部分構造としては、ＧＧＴ基質の「γ―グルタミル基」やＤＰＰ－４基質のジペプチド（アミノ酸―プロリンからなるジペプチド；ここで、アミノ酸は、例えば、グリシン、グルタミン酸、プロリン）、ＬＡＰ基質のロイシン残基などが挙げられる。
【0030】
本発明の１つの好ましい態様においては、Ｙは以下のいずれかから選択される。
【0031】
式（１）～（３）において、＊は、ベンゼン環と結合する箇所を表す。
【0032】
式（２）において、Ｒ１ａは、天然アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジン、システイン、トレオニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、プロリン）の側鎖を構成する基、非天然アミノ酸（シトルリン、ノルバリンなど）の側鎖を構成する基、置換又は無置換のアルキル基からなる群から選択される。
【0033】
式（３）において、Ｒ２ａは、天然アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジン、システイン、トレオニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、プロリン）の側鎖を構成する基、非天然アミノ酸（シトルリン、ノルバリンなど）の側鎖を構成する基、置換又は無置換のアルキル基からなる群から選択される。
は、アミノ基、Ｎアセチル化等されたアミノ基、１つまたは複数のアミノ酸がペプチド結合により連なった構造を表す。
【0034】
標的酵素がカルボキシペプチダーゼである場合は、Ｙとして、－Ｎ＝Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ２が好適に選択される。
ここで、カルボキシペプチダーゼを標的酵素とする場合は、アゾホルミル基の部位（－Ｎ＝Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－）を有することが重要である。即ち、ＢｚＢＭＮの母核にアミノ基（－ＮＨ２）を介して酵素基質を導入すると、カルボキシペプチダーゼはＣ末端アミノ酸のアミド結合を加水分解するため、反応後も分子内にカルボン酸が残留してしまい、大きな水溶性の変化を与えることが難しい。そこで、カルボキシペプチダーゼによる基質アミノ酸の加水分解に引き続き自発的脱炭酸・脱窒素反応を引き起こすアゾホルミル基を分子内に組み込むことで、カルボキシペプチダーゼとの反応により基質部位が脱離して、ＡＩＥ色素であるＢｚＢＭＮが放出される。カルボキシペプチダーゼを標的酵素とする場合の本発明の化合物の非限定的例の分子設計の概念図を図３に示す。
ここで、カルボキシペプチダーゼを標的酵素とする場合は、アゾホルミル基の部位（－Ｎ＝Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－）を有することが重要である。即ち、ＢｚＢＭＮの母核にアミノ基（－ＮＨ２）を介して酵素基質を導入すると、カルボキシペプチダーゼはＣ末端アミノ酸のアミド結合を加水分解するため、反応後も分子内にカルボン酸が残留してしまい、大きな水溶性の変化を与えることが難しい。そこで、カルボキシペプチダーゼによる基質アミノ酸の加水分解に引き続き自発的脱炭酸・脱窒素反応を引き起こすアゾホルミル基を分子内に組み込むことで、カルボキシペプチダーゼとの反応により基質部位が脱離して、ＡＩＥ色素であるＢｚＢＭＮが放出される。カルボキシペプチダーゼを標的酵素とする場合の本発明の化合物の非限定的例の分子設計の概念図を図３に示す。
【0035】
ここで、Ｌ２は、アミノ酸残基又はＣ末端アミノ酸残基を有するペプチドである。
【0036】
本発明においては、標的酵素がカルボキシペプチダーゼである場合に、Ｙとして－Ｎ＝Ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ２が好適に用いられることから、Ｌ２のアミノ酸残基は、好ましくは、Ｃ末端アミノ酸残基、即ち、アミノ酸のアミノ基から水素原子を１つ除去した残りの部分構造に対応する構造である。
【0037】
Ｌ２のアミノ酸残基は、好ましくは、以下の式で表される。
式（１ａ）において、Ｒ’は、アミノ酸の側鎖を表す。
【0038】
Ｌ２のアミノ酸残基としては、任意のアミノ酸の残基から選択される。アミノ酸としては、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジン、スレオニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、トリプトファン、チロシン、システイン、ヒスチジン、メチオニン、プロリン、オルニチン、Ｎ－メチルロイシン、２，３－ジアミノプロパン酸、２，４－ジアミノ酪酸、オルニチン、α－ヒドロキシロイシンなどが挙げられる。
本発明において、Ｌ２のアミノ酸残基は、好ましくは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン酸残基、グルタミン残基、アルギニン残基又はリジン残基である。
本発明において、Ｌ２のアミノ酸残基は、好ましくは、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン酸残基、グルタミン残基、アルギニン残基又はリジン残基である。
【0039】
また、Ｌ２のペプチドは、Ｃ末端アミノ酸残基を有するペプチドである。Ｌ２のペプチドとしては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドのほか、オリゴペプチドを含む。
Ｌ２のペプチドは、Ｃ末端アミノ酸残基がフェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン酸残基、グルタミン残基、アルギニン残基又はリジン残基であることが好ましい。
Ｌ２のペプチドは、Ｃ末端アミノ酸残基がフェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン酸残基、グルタミン残基、アルギニン残基又はリジン残基であることが好ましい。
【0040】
標的酵素がグリコシダーゼである場合は、Ｙとして、－ＮＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｌ’又は－Ｏ－Ｌ’が好適に用いられる。
【0041】
Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造である。
ここで、Ｌの糖類の部分構造は、糖類から１つの水酸基を除去した残りの部分構造に対応する構造をいう。糖類の部分構造は、Ｌ’が結合しているＯと一緒になって、糖類、糖類の一部を構成している。
ここで、Ｌの糖類の部分構造は、糖類から１つの水酸基を除去した残りの部分構造に対応する構造をいう。糖類の部分構造は、Ｌ’が結合しているＯと一緒になって、糖類、糖類の一部を構成している。
【0042】
糖類としては、β－Ｄ－グルコース、β－Ｄ－ガラクトース、β－Ｌ－ガラクトース、β－Ｄ－キシロース、α－Ｄ－マンノース、β－Ｄ－フコース、α－Ｌ－フコース、β－Ｌ－フコース、β－Ｄ－アラビノース、β－Ｌ－アラビノース、β－Ｄ－Ｎ－アセチルグルコサミン、β－Ｄ－Ｎ－アセチルガラクトサミン等が挙げられ、好ましくは、β－Ｄ－ガラクトースである。
【0043】
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｙは以下のいずれかから選択される。
【0044】
本発明の化合物の１つの好ましい態様は、以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩である。
【0045】
一般式（ＩＩ）において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を表す。
Ｒ２、Ｒ３がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ２及び／又はＲ３が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ２、Ｒ３がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ２及び／又はＲ３が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
【0046】
本発明の化合物の１つの好ましい態様は、以下のいずれかの構造を有する化合物又はその塩である。
【0047】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、本発明においては、これらの物質も用いることができる。
【0048】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、本発明においては、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体なども用いることができる。
【0049】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）で表される化合物を製造することができる。
【0050】
２．本発明のラマンプローブ又は蛍光プローブ
本発明のもう１つの実施形態は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むラマンプローブである（以下「本発明のラマンプローブ」ともいう）。
即ち、本発明の化合物は、酵素との反応前は水溶液中で分散しているためラマン信号強度が低いが、酵素と反応することで、水溶性が低下し凝集体を形成し、ラマン信号強度が向上するため、ラマンプローブとして好適に使用することができる。
本発明のもう１つの実施形態は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むラマンプローブである（以下「本発明のラマンプローブ」ともいう）。
即ち、本発明の化合物は、酵素との反応前は水溶液中で分散しているためラマン信号強度が低いが、酵素と反応することで、水溶性が低下し凝集体を形成し、ラマン信号強度が向上するため、ラマンプローブとして好適に使用することができる。
【0051】
本発明のラマンプローブは、ｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能なラマンプローブである。ｅｐｒ－ＳＲＳ法とは、前期共鳴 (electronic pre-resonance; epr)効果と誘導ラマン散乱 (stimulated Raman scattering; SRS) を組み合わせたラマンイメージング法である。
この方法では、分子の電子吸収帯よりやや長波長側の光によって励起する（前期共鳴条件）ため、光褪色や蛍光によるバックグラウンド上昇を抑えることができ、ストークス光による誘導放出によってさらに高感度なイメージングが実現できる。従来のＳＲＳ顕微鏡ではストークス光の波長変化に秒オーダーの時間がかかるため、スペクトル解析やスペクトルイメージングを行う際には測定時間が長くなってしまうのが課題の１つであったが、東京大学大学院工学系研究科電気系工学専攻の小関研究室で開発された高速ＳＲＳ分光顕微鏡では１秒当たり３０波数分変化させる高速イメージングが可能である（Ozeki, Y., Biological Imaging Based on Stimulated Raman Scattering. Seibutsu Butsuri, 2014. 54(6): p. 311-314）。当該高速ＳＲＳ分光顕微鏡の模式図を図２に示す。
高速ＳＲＳ分光顕微鏡を用いるラマンイメージング法は、上記のOzekiの論文を参照して行うことができる。また、高速ＳＲＳ分光顕微鏡でイメージングを行うに際しては、信号対雑音比を高めるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定ではデータを５～１０回程度、ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏでの測定ではデータを１００～１０００回程度取得して、平均化を行うことが好ましい。
この方法では、分子の電子吸収帯よりやや長波長側の光によって励起する（前期共鳴条件）ため、光褪色や蛍光によるバックグラウンド上昇を抑えることができ、ストークス光による誘導放出によってさらに高感度なイメージングが実現できる。従来のＳＲＳ顕微鏡ではストークス光の波長変化に秒オーダーの時間がかかるため、スペクトル解析やスペクトルイメージングを行う際には測定時間が長くなってしまうのが課題の１つであったが、東京大学大学院工学系研究科電気系工学専攻の小関研究室で開発された高速ＳＲＳ分光顕微鏡では１秒当たり３０波数分変化させる高速イメージングが可能である（Ozeki, Y., Biological Imaging Based on Stimulated Raman Scattering. Seibutsu Butsuri, 2014. 54(6): p. 311-314）。当該高速ＳＲＳ分光顕微鏡の模式図を図２に示す。
高速ＳＲＳ分光顕微鏡を用いるラマンイメージング法は、上記のOzekiの論文を参照して行うことができる。また、高速ＳＲＳ分光顕微鏡でイメージングを行うに際しては、信号対雑音比を高めるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定ではデータを５～１０回程度、ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏでの測定ではデータを１００～１０００回程度取得して、平均化を行うことが好ましい。
【0052】
この小関研の高速ＳＲＳ分光顕微鏡の励起光は８４３ｎｍであるため、当該ｅｐｒ－ＳＲＳ法の装置を用いる場合は、前期共鳴がかかる波長域がおよそ６５０～７５０ｎｍであるラマンプローブを用いるのが好ましい。
本発明のラマンプローブを用いる標的酵素の検出方法には、上記の高速ＳＲＳ分光顕微鏡を好適に用いることができるが、当該高速ＳＲＳ分光顕微鏡を用いた方法に限定されるものではない。
本発明のラマンプローブを用いる標的酵素の検出方法には、上記の高速ＳＲＳ分光顕微鏡を好適に用いることができるが、当該高速ＳＲＳ分光顕微鏡を用いた方法に限定されるものではない。
【0053】
即ち、本発明の１つの好ましい側面は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能なラマンプローブである。
【0054】
本発明のラマンプローブの使用方法は特に限定されず、従来公知のラマンプローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記式（Ｉ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、ラマンスペクトルを測定すればよい。本発明のラマンプローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
【0055】
また、本発明のもう１つの態様は、細胞又は組織内の標的酵素を検出する方法であって、（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含むラマンプローブを細胞又は組織内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞又は組織内で標的酵素と反応することにより増強されるラマン散乱光を測定する工程を含む方法、である（以下「本発明の検出方法」とも言う）。
ここで、細胞としては、正常細胞、癌細胞、神経細胞等が挙げられる。
ここで、細胞としては、正常細胞、癌細胞、神経細胞等が挙げられる。
【0056】
本発明の検出方法において、好ましくは、ラマン散乱光はｅｐｒ－ＳＲＳ法を用いて測定される。
【0057】
一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入するには、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織の試料に散布すること等により行うことができる。
【0058】
本発明の検出方法の対象となるがん細胞又はがん組織の種類として、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳腫瘍、食道がん、胃がん、胆管がん、肝がん、膵がん、頭頚部がん、腎がん、白血病、皮膚がん、甲状腺がんの細胞又は組織が挙げられる。
【0059】
本明細書において、「がん組織」の用語はがん細胞を含む任意の組織を意味している。「組織」の用語は臓器の一部又は全体を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【0060】
本発明の検出方法の１つの態様は、（ａ）２以上の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入する工程、及び（ｂ）当該２以上の化合物又はその塩が細胞又は組織内において、夫々、標的酵素と反応することにより増強されるラマン散乱光を測定する工程を含む、細胞又は組織内の２以上の標的酵素を検出する方法である。
【0061】
本発明の検出方法及び本発明のプローブによって、細胞に加えて、組織の状態で染色することができることから、本発明の検出方法及び本発明のプローブは、酵素活性パターンによるがんの診断方法にも用いることが可能である。
即ち、本発明のもう１つの実施態様は、（ａ）一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むラマンプローブを被検体に投与する工程、（ｂ）当該化合物又はその塩が被検体の細胞、組織又は臓器内で標的酵素と反応することにより増強されるラマン散乱光を測定する工程を含む、がんを診断する方法である（以下「本発明の診断方法」とも言う）。
投与方法としては、局所投与、経口投与、静脈内投与等が挙げられる。
本発明の診断方法の対象となるがんの種類として、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳腫瘍、食道がん、胃がん、胆管がん、肝がん、膵がん、頭頚部がん、腎がん、白血病、皮膚がん、甲状腺がんが挙げられる。
即ち、本発明のもう１つの実施態様は、（ａ）一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むラマンプローブを被検体に投与する工程、（ｂ）当該化合物又はその塩が被検体の細胞、組織又は臓器内で標的酵素と反応することにより増強されるラマン散乱光を測定する工程を含む、がんを診断する方法である（以下「本発明の診断方法」とも言う）。
投与方法としては、局所投与、経口投与、静脈内投与等が挙げられる。
本発明の診断方法の対象となるがんの種類として、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳腫瘍、食道がん、胃がん、胆管がん、肝がん、膵がん、頭頚部がん、腎がん、白血病、皮膚がん、甲状腺がんが挙げられる。
【0062】
本発明のもう１つの実施形態は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含む蛍光プローブである（以下「本発明の蛍光プローブ」ともいう）。
即ち、本発明の化合物は、酵素との反応前は水溶液中でほとんど蛍光を発しないのに対して、酵素と反応後は、ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２（又はＢｚＢＭＮ－ＯＨ又はＢｚＢＭＮ）は水溶液中で蛍光を発し、これは、水溶液中での凝集によるＡＩＥＥ特性による蛍光増強であると考えられる。したがって、本発明の化合物は蛍光プローブとしても好適に使用することが可能である。
即ち、本発明の化合物は、酵素との反応前は水溶液中でほとんど蛍光を発しないのに対して、酵素と反応後は、ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２（又はＢｚＢＭＮ－ＯＨ又はＢｚＢＭＮ）は水溶液中で蛍光を発し、これは、水溶液中での凝集によるＡＩＥＥ特性による蛍光増強であると考えられる。したがって、本発明の化合物は蛍光プローブとしても好適に使用することが可能である。
【0063】
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに本発明の化合物を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
【0064】
また、本発明のもう１つの態様は、細胞又は組織内の標的酵素を検出する方法であって、（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞又は組織内で標的酵素と反応することにより、発せられる又は増強される蛍光を測定する工程を含む方法
【0065】
本発明のもう１つの実施態様は、本発明のラマンプローブ又は蛍光プローブを含む、標的分子の検出用キットである。
【0066】
当該キットにおいて、通常、本発明のラマンプローブ又は蛍光プローブは溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
【0067】
また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
【実施例0068】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0069】
［原料］
合成に使用した全ての化学物質は、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチ（株）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ. から購入した。 さらに精製することなく使用した。
合成に使用した全ての化学物質は、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチ（株）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ. から購入した。 さらに精製することなく使用した。
【0070】
［測定機器］
ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒中を用い、Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００分光計［１Ｈ ４００ ＭＨｚ、１３Ｃ １００ ＭＨｚ］で得た。
高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒｏＴＯＦ ＩＩ－ＴＭ (ＥＳＩ)で得た。
ＨＰＬＣ精製は、Ｉｎｅｒｔｓｔｉｌ－ＯＤＳ－３カラム（Φ１０×２５０ｍｍ（セミ分取）およびΦ２０×２５０ｍｍ（分取））を備えたＪＡＳＣＯ ＰＵ－２０８０ Ｐｌｕｓポンプ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）およびＭＤ－２０１５検出器（ＪＡＳＣＯ）で行った。
ＨＰＬＣに使用した溶媒は、和光（株）より入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、中圧分取液体クロマトグラフＹＦＬＣ－Ａｌ５６０（山善株式会社）を用いて行った。
ＴＬＣは、シリカゲルプレートＦ２５４（０．２５ｍｍ（分析）；Ｍｅｒｃｋ、ＡＫＧ）で行った。
ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－２４５０分光光度計で得た。
蛍光スペクトルは、Ｆ－７０００ (日立)で取得した。
ＳＲＳスペクトルおよびＳＲＳ像は、東京大学大学院工学系研究科電気系工学専攻小関研究室で開発された高速ＳＲＳ分光顕微鏡で取得した。ポンプ光パルスおよびストークス光パルスの波長は８４３ｎｍおよび１０１４－１０４６ｎｍ、パルス時間幅は約５ピコ秒、スペクトル分解能は５／ｃｍである。水浸対物レンズを用い、その開口数は１．２である。フレームごとにストークス光パルスの波長を変化させ、５００×５００ピクセルの画像を毎秒３０フレーム取得した。信号対雑音比を高めるためにデータをｉｎ ｖｉｔｒｏでは５回、ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏでは３００～１０００回取得し、平均化を行った。
ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒中を用い、Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００分光計［１Ｈ ４００ ＭＨｚ、１３Ｃ １００ ＭＨｚ］で得た。
高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒｏＴＯＦ ＩＩ－ＴＭ (ＥＳＩ)で得た。
ＨＰＬＣ精製は、Ｉｎｅｒｔｓｔｉｌ－ＯＤＳ－３カラム（Φ１０×２５０ｍｍ（セミ分取）およびΦ２０×２５０ｍｍ（分取））を備えたＪＡＳＣＯ ＰＵ－２０８０ Ｐｌｕｓポンプ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）およびＭＤ－２０１５検出器（ＪＡＳＣＯ）で行った。
ＨＰＬＣに使用した溶媒は、和光（株）より入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、中圧分取液体クロマトグラフＹＦＬＣ－Ａｌ５６０（山善株式会社）を用いて行った。
ＴＬＣは、シリカゲルプレートＦ２５４（０．２５ｍｍ（分析）；Ｍｅｒｃｋ、ＡＫＧ）で行った。
ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－２４５０分光光度計で得た。
蛍光スペクトルは、Ｆ－７０００ (日立)で取得した。
ＳＲＳスペクトルおよびＳＲＳ像は、東京大学大学院工学系研究科電気系工学専攻小関研究室で開発された高速ＳＲＳ分光顕微鏡で取得した。ポンプ光パルスおよびストークス光パルスの波長は８４３ｎｍおよび１０１４－１０４６ｎｍ、パルス時間幅は約５ピコ秒、スペクトル分解能は５／ｃｍである。水浸対物レンズを用い、その開口数は１．２である。フレームごとにストークス光パルスの波長を変化させ、５００×５００ピクセルの画像を毎秒３０フレーム取得した。信号対雑音比を高めるためにデータをｉｎ ｖｉｔｒｏでは５回、ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏでは３００～１０００回取得し、平均化を行った。
【0071】
［合成実施例１］
以下のスキーム１により、本発明のγ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）活性検出ラマンプローブであるｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ（化合物１１）、ＥＰ－ＢｚＢＭＮ（化合物１２）を合成した。また、ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮのＣＮ基を１２Ｃ１５Ｎに同位体置換しｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ （１２Ｃ１５Ｎ）（化合物１３）を合成した。
以下のスキーム１により、本発明のγ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）活性検出ラマンプローブであるｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ（化合物１１）、ＥＰ－ＢｚＢＭＮ（化合物１２）を合成した。また、ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮのＣＮ基を１２Ｃ１５Ｎに同位体置換しｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ （１２Ｃ１５Ｎ）（化合物１３）を合成した。
【0072】
スキーム１：ＧＧＴ、ＤＰＰ４活性検出ラマンプローブの合成
【0073】
（１）化合物１の合成
マロン酸ジエチル（７００．４ｍｇ、４．３７ｍｍｏｌ）を３Ｍ １５Ｎアンモニウム水（５ｍＬ）に溶解し、室温で１９．５時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、エタノールを５ｍＬ加えて吸引濾過を行い、濾紙上の化合物をエタノールで洗浄し目的化合物（化合物１）（２９５．２ｍｇ、２．８４ｍｍｏｌ、収率６５％）を得た。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 127.0262; found, 127.0261 (0.1 mDa).
マロン酸ジエチル（７００．４ｍｇ、４．３７ｍｍｏｌ）を３Ｍ １５Ｎアンモニウム水（５ｍＬ）に溶解し、室温で１９．５時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、エタノールを５ｍＬ加えて吸引濾過を行い、濾紙上の化合物をエタノールで洗浄し目的化合物（化合物１）（２９５．２ｍｇ、２．８４ｍｍｏｌ、収率６５％）を得た。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 127.0262; found, 127.0261 (0.1 mDa).
【0074】
（２）化合物２の合成
化合物１（２９２．４ｍｇ、２．８１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、塩化ホスホニル（８８２．１ｍｇ、５．７５ｍｍｏｌ、２．１ｅｑ）をアセトニトリルに溶解し、アルゴン雰囲気下７５℃で加熱しながら１８時間撹拌した。反応液を濾過後、濾液の溶媒を減圧除去して得られた固体を氷冷下飽和食塩水（２ｍＬ）に再懸濁した。続いてジクロロメタンで抽出を行った後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで目的化合物（化合物２）の粗生成物（１０１．３ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ、収率５３％）を褐色のオイルとして得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに、次の反応に使用した。
化合物１（２９２．４ｍｇ、２．８１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、塩化ホスホニル（８８２．１ｍｇ、５．７５ｍｍｏｌ、２．１ｅｑ）をアセトニトリルに溶解し、アルゴン雰囲気下７５℃で加熱しながら１８時間撹拌した。反応液を濾過後、濾液の溶媒を減圧除去して得られた固体を氷冷下飽和食塩水（２ｍＬ）に再懸濁した。続いてジクロロメタンで抽出を行った後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで目的化合物（化合物２）の粗生成物（１０１．３ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ、収率５３％）を褐色のオイルとして得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに、次の反応に使用した。
【0075】
（３）化合物３の合成
３－ニトロベンジルブロミド（１１１０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、４－（ジエチルアミノ）サリチルアルデヒド（９６０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、炭酸カリウム（１４３０ｍｇ、１０．０ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下７０℃で加熱しながら１７．５時間撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて中和し、酢酸エチルで抽出した。さらに、有機層を水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物３）（９９０ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ、収率６０％）を黄色固体として得た。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 351.1315; found, 351.1323 (-0.8 mDa).
３－ニトロベンジルブロミド（１１１０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、４－（ジエチルアミノ）サリチルアルデヒド（９６０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、炭酸カリウム（１４３０ｍｇ、１０．０ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下７０℃で加熱しながら１７．５時間撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて中和し、酢酸エチルで抽出した。さらに、有機層を水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物３）（９９０ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ、収率６０％）を黄色固体として得た。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 351.1315; found, 351.1323 (-0.8 mDa).
【0076】
（４）化合物４の合成
化合物３（５１５ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、マロノニトリル（１２１μＬ、１．９ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）をエタノール／ジクロロメタン混液（２：１）（１５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミンを数滴加え、アルゴン雰囲気下６０℃で加熱しながら４時間撹拌した。反応液を吸引濾過し、濾紙上の化合物をエタノールで洗浄することで粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物４）（３９０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、収率６５％）を橙色固体として得た。
HRMS(ESI+): calcd for [M+Na]+, 399.1428; found, 399.1425 (0.3 mDa).
化合物３（５１５ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、マロノニトリル（１２１μＬ、１．９ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）をエタノール／ジクロロメタン混液（２：１）（１５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミンを数滴加え、アルゴン雰囲気下６０℃で加熱しながら４時間撹拌した。反応液を吸引濾過し、濾紙上の化合物をエタノールで洗浄することで粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物４）（３９０ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ、収率６５％）を橙色固体として得た。
HRMS(ESI+): calcd for [M+Na]+, 399.1428; found, 399.1425 (0.3 mDa).
【0077】
（５）化合物５の合成
化合物３（２０．０ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、マロノニトリル１５Ｎ置換体（化合物２）（５．０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）をエタノール／ジクロロメタン混液（２：１）（６ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミンを数滴加え、アルゴン雰囲気下６０℃で加熱しながら４時間撹拌後、８０℃で２時間撹拌した。反応液を吸引濾過し、濾紙上の化合物をエタノールで洗浄し目的化合物（化合物５）（１６．３ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ、収率７１％）を橙色固体として得た。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 401.1375; found, 401.1370 (0.5 mDa).
化合物３（２０．０ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、マロノニトリル１５Ｎ置換体（化合物２）（５．０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）をエタノール／ジクロロメタン混液（２：１）（６ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミンを数滴加え、アルゴン雰囲気下６０℃で加熱しながら４時間撹拌後、８０℃で２時間撹拌した。反応液を吸引濾過し、濾紙上の化合物をエタノールで洗浄し目的化合物（化合物５）（１６．３ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ、収率７１％）を橙色固体として得た。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 401.1375; found, 401.1370 (0.5 mDa).
【0078】
（６）化合物６の合成
ＢｚＢＭＮ－ＮＯ２（化合物４）（４０．０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、塩化スズ（ＩＩ）（１０４．３ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ）を酢酸エチルに（１０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下７０℃で加熱しながら１５．５時間撹拌した。さらに塩化スズ（ＩＩ）（１０５．０ｍｇ）を反応液に加え７０℃で加熱しながら１時間撹拌後、８０℃で２．５時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷冷した水に注ぎ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。得られた懸濁液の不溶物をセライト濾過で除去し、濾液を酢酸エチルで抽出した。さらに、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物６）（３０．０ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ、収率７９％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ1.16 (6H, t, J = 7.1 Hz), 3.39 (4H, q, J = 7.1 Hz), 5.05 (2H, s), 6.02 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.31 (1H, dd, J = 9.3, 2.3 Hz), 7.21 (1H, dd, J = 8.0, 2.2 Hz), 6.70 (1H, s), 6.75 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.17 (1H, t, J = 7.8 Hz), 8.08 (1H, s), 8.24 (1H, d, J = 9.3 Hz); HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 369.1686; found, 369.1695 (-0.9 mDa).
ＢｚＢＭＮ－ＮＯ２（化合物４）（４０．０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、塩化スズ（ＩＩ）（１０４．３ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ）を酢酸エチルに（１０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下７０℃で加熱しながら１５．５時間撹拌した。さらに塩化スズ（ＩＩ）（１０５．０ｍｇ）を反応液に加え７０℃で加熱しながら１時間撹拌後、８０℃で２．５時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷冷した水に注ぎ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した。得られた懸濁液の不溶物をセライト濾過で除去し、濾液を酢酸エチルで抽出した。さらに、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物６）（３０．０ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ、収率７９％）を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ1.16 (6H, t, J = 7.1 Hz), 3.39 (4H, q, J = 7.1 Hz), 5.05 (2H, s), 6.02 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.31 (1H, dd, J = 9.3, 2.3 Hz), 7.21 (1H, dd, J = 8.0, 2.2 Hz), 6.70 (1H, s), 6.75 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.17 (1H, t, J = 7.8 Hz), 8.08 (1H, s), 8.24 (1H, d, J = 9.3 Hz); HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 369.1686; found, 369.1695 (-0.9 mDa).
【0079】
（７）化合物７の合成
ＢｚＢＭＮ－ＮＯ２（１２Ｃ１５Ｎ）（化合物５）（７．２ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、塩化スズ（ＩＩ）（３６．１ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を酢酸エチル（２ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下８０℃で４時間撹拌した。反応液を飽和炭酸ナトリウム水溶液で中和し、酢酸エチルで抽出した。さらに飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物７）を黄色固体として得た。得られた全量を次の反応に使用した。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 371.1634; found, 371.1629 (0.5 mDa).
ＢｚＢＭＮ－ＮＯ２（１２Ｃ１５Ｎ）（化合物５）（７．２ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、塩化スズ（ＩＩ）（３６．１ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を酢酸エチル（２ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下８０℃で４時間撹拌した。反応液を飽和炭酸ナトリウム水溶液で中和し、酢酸エチルで抽出した。さらに飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物７）を黄色固体として得た。得られた全量を次の反応に使用した。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 371.1634; found, 371.1629 (0.5 mDa).
【0080】
（８）化合物８の合成
ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２（化合物６）（１２．０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＨ）－ＯｔＢｕ（１０．５２ｍｇ、０．０３５ｍｇ、１．０ｅｑ）、ＣＯＭＵ（１４．８５ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ＤＩＥＡ（６．０４ μＬ、０．０３５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下室温で２．５時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した後、酢酸エチルで抽出を行った。さらに、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで目的の粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物８）（２０．４ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、収率９２％）を橙色固体として得た。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 654.3262; found, 654.3262 (0.0 mDa).
ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２（化合物６）（１２．０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＨ）－ＯｔＢｕ（１０．５２ｍｇ、０．０３５ｍｇ、１．０ｅｑ）、ＣＯＭＵ（１４．８５ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ＤＩＥＡ（６．０４ μＬ、０．０３５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下室温で２．５時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した後、酢酸エチルで抽出を行った。さらに、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで目的の粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物８）（２０．４ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、収率９２％）を橙色固体として得た。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 654.3262; found, 654.3262 (0.0 mDa).
【0081】
（９）化合物９の合成
ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２（化合物６）（１１．０ ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｐｒｏ－ＯＨ（１２．７ｍｇ、０．０３２ｍｇ、１．０ｅｑ）、ＣＯＭＵ（１３．７ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、１．０ ｅｑ）、ＤＩＥＡ（５．５７μＬ、０．０３２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下室温で４時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した後、酢酸エチルで抽出を行った。さらに、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで目的の粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物９）の粗生成物を橙色固体として得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに、次の反応に全量使用した。
ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２（化合物６）（１１．０ ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｐｒｏ－ＯＨ（１２．７ｍｇ、０．０３２ｍｇ、１．０ｅｑ）、ＣＯＭＵ（１３．７ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、１．０ ｅｑ）、ＤＩＥＡ（５．５７μＬ、０．０３２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下室温で４時間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した後、酢酸エチルで抽出を行った。さらに、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで目的の粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物９）の粗生成物を橙色固体として得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに、次の反応に全量使用した。
【0082】
（１０）化合物１０の合成
ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２（１２Ｃ１５Ｎ）（化合物７）、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＨ）－ＯｔＢｕ（５．７６ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ＣＯＭＵ（８．１４ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ＤＩＥＡ（３．３１μＬ、０．０１９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下室温で４時間撹拌した。反応液を飽和炭酸ナトリウム水溶液で中和した後、酢酸エチルで抽出を行った。さらに、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで目的の粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物１０）の粗生成物（７．３ｍｇ）を橙色固体として得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに、次の反応に全量使用した。
ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２（１２Ｃ１５Ｎ）（化合物７）、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＨ）－ＯｔＢｕ（５．７６ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ＣＯＭＵ（８．１４ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ＤＩＥＡ（３．３１μＬ、０．０１９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下室温で４時間撹拌した。反応液を飽和炭酸ナトリウム水溶液で中和した後、酢酸エチルで抽出を行った。さらに、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで目的の粗生成物を得た。続けて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製を行い、目的化合物（化合物１０）の粗生成物（７．３ｍｇ）を橙色固体として得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに、次の反応に全量使用した。
【0083】
（１１）化合物１１の合成
化合物８（２０．４ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、トリフロロ酢酸を１ｍＬ加え、室温で３．５時間撹拌した。トルエンを加え溶媒を減圧除去した後、逆相カラムを用いて精製を行い、目的化合物（化合物１１）（１６．２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、収率ｑｕａｎｔ．）を橙色の固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.17 (6H, t, J = 7.1 Hz), 2.28 (2H, m), 2.72 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.50 (4H, q, J = 7.1 Hz), 4.11 (1H, t, J = 6.5 Hz), 5.25 (2H, s), 6.21 (1H, d, J = 2.1 Hz), 6.49 (1H, dd, J = 9.4, 2.1 Hz), 7.21 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.37 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.48 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.86 (1H, s), 8.10 (1H, s), 8.21 (1H, d, J = 9.4 Hz); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ12,9, 26.9, 33.2, 46.1, 53.5, 68.0, 71.4, 95.6, 107.1, 110.7, 117.0, 118.2, 119.8, 120.7, 124.0, 130.0, 131.6, 138.8, 140.4, 152.1, 156.2, 162.4, 171.6, 172.6; HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 498.2112; found, 498.2120 (-0.8 mDa).
化合物８（２０．４ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、トリフロロ酢酸を１ｍＬ加え、室温で３．５時間撹拌した。トルエンを加え溶媒を減圧除去した後、逆相カラムを用いて精製を行い、目的化合物（化合物１１）（１６．２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、収率ｑｕａｎｔ．）を橙色の固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.17 (6H, t, J = 7.1 Hz), 2.28 (2H, m), 2.72 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.50 (4H, q, J = 7.1 Hz), 4.11 (1H, t, J = 6.5 Hz), 5.25 (2H, s), 6.21 (1H, d, J = 2.1 Hz), 6.49 (1H, dd, J = 9.4, 2.1 Hz), 7.21 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.37 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.48 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.86 (1H, s), 8.10 (1H, s), 8.21 (1H, d, J = 9.4 Hz); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ12,9, 26.9, 33.2, 46.1, 53.5, 68.0, 71.4, 95.6, 107.1, 110.7, 117.0, 118.2, 119.8, 120.7, 124.0, 130.0, 131.6, 138.8, 140.4, 152.1, 156.2, 162.4, 171.6, 172.6; HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 498.2112; found, 498.2120 (-0.8 mDa).
【0084】
（１２）化合物１２の合成
化合物９をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、トリフロロ酢酸を１ｍＬ加え、室温で２．５時間撹拌した。反応液にトルエンを加え溶媒を減圧除去した後、高速液体クロマトグラフィーで精製を行い、目的化合物（化合物１２）（７．３ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、収率４１％ ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ）を橙色の固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.04 (6H, t, J = 7.1 Hz), 1.90-2.30 (6H, m), 2.54 (2H, dt, J = 7.1, 2.6 Hz), 3.37 (4H, q, J = 7.1 Hz), 3.65 (2H, t, J = 6.7 Hz), 4.29 (1H, dd, J = 7.4, 4.9 Hz), 4.50 (1H, dd, J = 8.1, 5.4 Hz), 5.14 (2H, s), 6.08 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.36 (1H, dd, J = 9.4, 2.2 Hz), 7.09 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.26 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.37 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.70 (1H, s), 7.97 (1H, s), 8.09 (1H, d, J = 9.4 Hz); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ12,9, 23.9, 28.0, 32.1, 40.5, 46.1, 54.6, 68.2, 70.7, 95.5, 107.2, 110.6, 122.1, 122.9, 124.1, 124.9, 126.8, 131.2, 131.7, 133.6, 140.0, 151.9, 153.2, 156.2, 162.2; HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 595.2639; found, 595.2651 (-1.2 mDa).
化合物９をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、トリフロロ酢酸を１ｍＬ加え、室温で２．５時間撹拌した。反応液にトルエンを加え溶媒を減圧除去した後、高速液体クロマトグラフィーで精製を行い、目的化合物（化合物１２）（７．３ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、収率４１％ ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ）を橙色の固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.04 (6H, t, J = 7.1 Hz), 1.90-2.30 (6H, m), 2.54 (2H, dt, J = 7.1, 2.6 Hz), 3.37 (4H, q, J = 7.1 Hz), 3.65 (2H, t, J = 6.7 Hz), 4.29 (1H, dd, J = 7.4, 4.9 Hz), 4.50 (1H, dd, J = 8.1, 5.4 Hz), 5.14 (2H, s), 6.08 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.36 (1H, dd, J = 9.4, 2.2 Hz), 7.09 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.26 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.37 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.70 (1H, s), 7.97 (1H, s), 8.09 (1H, d, J = 9.4 Hz); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ12,9, 23.9, 28.0, 32.1, 40.5, 46.1, 54.6, 68.2, 70.7, 95.5, 107.2, 110.6, 122.1, 122.9, 124.1, 124.9, 126.8, 131.2, 131.7, 133.6, 140.0, 151.9, 153.2, 156.2, 162.2; HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 595.2639; found, 595.2651 (-1.2 mDa).
【0085】
（１３）化合物１３の合成
化合物１０（７．３ｍｇ）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、トリフロロ酢酸を１ｍＬ加え、室温で２．５時間撹拌した。トルエンを加え溶媒を減圧除去した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製を行い、目的化合物（化合物１３）（２．５ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ、収率２７％ ｉｎ ３ ｓｔｅｐｓ）を橙色の固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.18 (6H, t, J = 7.0 Hz), 2.27 (2H, m), 2.72 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.51 (4H, q, J = 7.1 Hz), 4.10 (1H, t, J = 6.4 Hz), 5.26 (2H, s), 6.22 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.50 (1H, dd, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.21 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.38 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.48 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.85 (1H, s), 8.10 (1H, s), 8.21 (1H, d, J = 9.2 Hz); HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 478.2235; found, 478.2210 (2.5 mDa).
化合物１０（７．３ｍｇ）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、トリフロロ酢酸を１ｍＬ加え、室温で２．５時間撹拌した。トルエンを加え溶媒を減圧除去した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製を行い、目的化合物（化合物１３）（２．５ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ、収率２７％ ｉｎ ３ ｓｔｅｐｓ）を橙色の固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.18 (6H, t, J = 7.0 Hz), 2.27 (2H, m), 2.72 (2H, t, J = 7.0 Hz), 3.51 (4H, q, J = 7.1 Hz), 4.10 (1H, t, J = 6.4 Hz), 5.26 (2H, s), 6.22 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.50 (1H, dd, J = 9.2, 2.4 Hz), 7.21 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.38 (1H, t, J = 7.8 Hz), 7.48 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.85 (1H, s), 8.10 (1H, s), 8.21 (1H, d, J = 9.2 Hz); HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 478.2235; found, 478.2210 (2.5 mDa).
【0086】
［合成実施例２］
以下のスキーム２により、本発明のカルボキシペプチダーゼ活性検出ラマンプローブであるＢｚＢＭＮ－ＡＦＬｙｓ（化合物１８）を合成した。
以下のスキーム２により、本発明のカルボキシペプチダーゼ活性検出ラマンプローブであるＢｚＢＭＮ－ＡＦＬｙｓ（化合物１８）を合成した。
【0087】
スキーム２：カルボキシペプチダーゼ活性検出ラマンプローブの合成
【0088】
（１）化合物１４の合成
Ｈ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（５０．８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ピリジン（３０μＬ、０．３７５ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解し、－２０℃に冷却した。トリホスゲン（４４．５５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のジクロロメタン溶液（０．３ｍＬ）を少量ずつ滴下し、アルゴン雰囲気下－２０℃で０．５時間撹拌した。－２０℃に冷却した飽和塩化アンモニウム水溶液で中和し、－２０℃に冷却した飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで目的化合物（１４）の粗生成物を得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに次の反応に全量使用した。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 351.1896; found, 351.1908 (-1.2 mDa).
Ｈ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（５０．８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）、ピリジン（３０μＬ、０．３７５ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解し、－２０℃に冷却した。トリホスゲン（４４．５５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のジクロロメタン溶液（０．３ｍＬ）を少量ずつ滴下し、アルゴン雰囲気下－２０℃で０．５時間撹拌した。－２０℃に冷却した飽和塩化アンモニウム水溶液で中和し、－２０℃に冷却した飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで目的化合物（１４）の粗生成物を得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに次の反応に全量使用した。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 351.1896; found, 351.1908 (-1.2 mDa).
【0089】
（２）化合物１５の合成
ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２（化合物６）（２７．５ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を少量の氷と共に氷冷下で１２Ｍ塩酸（２ｍＬ）に溶解し、そこに亜硝酸ナトリウム（８．２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の１２Ｍ塩酸溶液（１ｍＬ）を滴下した。反応液をアルゴン雰囲気下４℃で０．５時間撹拌した。塩化スズ（ＩＩ）（２２．７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の１Ｍ塩酸溶液（１ｍＬ）を滴下し、氷冷下飽和炭酸ナトリウム水溶液で中和し、酢酸エチルで抽出を行い飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで目的化合物（１５）の粗生成物を得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに次の反応に全量使用した。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 384.1800; found, 384.1792 (0.8 mDa).
ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２（化合物６）（２７．５ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を少量の氷と共に氷冷下で１２Ｍ塩酸（２ｍＬ）に溶解し、そこに亜硝酸ナトリウム（８．２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の１２Ｍ塩酸溶液（１ｍＬ）を滴下した。反応液をアルゴン雰囲気下４℃で０．５時間撹拌した。塩化スズ（ＩＩ）（２２．７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）の１Ｍ塩酸溶液（１ｍＬ）を滴下し、氷冷下飽和炭酸ナトリウム水溶液で中和し、酢酸エチルで抽出を行い飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去することで目的化合物（１５）の粗生成物を得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに次の反応に全量使用した。
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 384.1800; found, 384.1792 (0.8 mDa).
【0090】
（３）化合物１６の合成
化合物１４、化合物１５及びＤＩＥＡ（２６．２μＬ、０．１５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下室温で２時間撹拌した。反応液は直接逆相カラムを用いて精製し、目的化合物（１６）（３０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ、収率５５％ ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ）およびその酸化体（化合物１７）（１２ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、収率２２％ ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ）の粗生成物をそれぞれ得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに次の反応に使用した。
化合物１４、化合物１５及びＤＩＥＡ（２６．２μＬ、０．１５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下室温で２時間撹拌した。反応液は直接逆相カラムを用いて精製し、目的化合物（１６）（３０ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ、収率５５％ ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ）およびその酸化体（化合物１７）（１２ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、収率２２％ ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ）の粗生成物をそれぞれ得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに次の反応に使用した。
【0091】
（４）化合物１７の合成
化合物１６（１５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）、二酸化マンガン（スパーテル１杯）をジクロロメタン（２ｍＬ）に加え、室温で２時間撹拌した。反応液をセライト濾過し、濾液の溶媒を減圧除去することで目的化合物（１７）（１２．５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、収率８３％）の粗生成物を得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに次の反応に全量使用した。
化合物１６（１５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）、二酸化マンガン（スパーテル１杯）をジクロロメタン（２ｍＬ）に加え、室温で２時間撹拌した。反応液をセライト濾過し、濾液の溶媒を減圧除去することで目的化合物（１７）（１２．５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、収率８３％）の粗生成物を得た。粗生成物はこれ以上の精製操作を行わずに次の反応に全量使用した。
【0092】
（５）化合物１８の合成
化合物１７（１２．５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、トリフロロ酢酸を１ｍＬ加えて、室温で２．５時間撹拌した。反応液にトルエンを加え溶媒を減圧除去した後、高速液体クロマトグラフィーで精製を行い、目的化合物（化合物１８）（５．５ｍｇ、０．００１０ｍｍｏｌ、収率５８％ ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ）を橙色の固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.16 (6H, t, J = 7.2 Hz), 1.50-2.20 (6H, m), 2.96 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.50 (4H, q, J = 6.8 Hz), 4.57 (1H, q, J = 4.8 Hz), 5.38 (2H, s), 6.23 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.50 (1H, dd, J = 9.2, 2.0 Hz), 7.67 (1H, t, J = 8.0 Hz), 7.78 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.97 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.07 (1H, s), 8.07 (1H, s), 8.20 (1H, d, J = 9.2 Hz); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ12,9, 19.8, 26.2, 26.7, 29.5, 30.8, 46.1, 52.3, 62.4, 68.1, 71.4, 95.6, 107.0, 110.7, 117.1, 118.5, 119.8, 120.7, 124.0, 130.4, 131.6, 138.9, 140.5, 152.0, 156.5, 162.4, 169.5, 172.0, 176.0; HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 554.2486; found, 554.2512 (-2.6 mDa).
化合物１７（１２．５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、トリフロロ酢酸を１ｍＬ加えて、室温で２．５時間撹拌した。反応液にトルエンを加え溶媒を減圧除去した後、高速液体クロマトグラフィーで精製を行い、目的化合物（化合物１８）（５．５ｍｇ、０．００１０ｍｍｏｌ、収率５８％ ｉｎ ２ ｓｔｅｐｓ）を橙色の固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.16 (6H, t, J = 7.2 Hz), 1.50-2.20 (6H, m), 2.96 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.50 (4H, q, J = 6.8 Hz), 4.57 (1H, q, J = 4.8 Hz), 5.38 (2H, s), 6.23 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.50 (1H, dd, J = 9.2, 2.0 Hz), 7.67 (1H, t, J = 8.0 Hz), 7.78 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.97 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.07 (1H, s), 8.07 (1H, s), 8.20 (1H, d, J = 9.2 Hz); 13C NMR (101 MHz, CD3OD) δ12,9, 19.8, 26.2, 26.7, 29.5, 30.8, 46.1, 52.3, 62.4, 68.1, 71.4, 95.6, 107.0, 110.7, 117.1, 118.5, 119.8, 120.7, 124.0, 130.4, 131.6, 138.9, 140.5, 152.0, 156.5, 162.4, 169.5, 172.0, 176.0; HRMS (ESI+): calcd for [M+Na]+, 554.2486; found, 554.2512 (-2.6 mDa).
【0093】
［実施例１］
ＧＧＴ活性検出プローブ（ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検討
ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮとＢｚＢＭＮ－ＮＨ２の水溶液中での溶解性を比較したところ、ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮはＰＢＳ中でもＤＭＳＯ中と同等の吸収スペクトルを有していたが、ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２はＰＢＳ中でＤＭＳＯ中よりも大幅に吸光度が減少し、長波長化した（図４）。
ＧＧＴ活性検出プローブ（ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検討
ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮとＢｚＢＭＮ－ＮＨ２の水溶液中での溶解性を比較したところ、ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮはＰＢＳ中でもＤＭＳＯ中と同等の吸収スペクトルを有していたが、ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２はＰＢＳ中でＤＭＳＯ中よりも大幅に吸光度が減少し、長波長化した（図４）。
【0094】
図４は、ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２とｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮの吸収スペクトルと蛍光スペクトルを示す。ＰＢＳ及びＤＭＳＯ中のＢｚＢＭＮ－ＮＨ２（ａ）およびＢｚＢＭＮ （ｂ）の吸収スペクトルであり、ＰＢＳ及びＤＭＳＯ中のＢｚＢＭＮ－ＮＨ２（ｃ） およびＢｚＢＭＮ（ｄ）の蛍光スペクトルである。
【0095】
色素が特定のモードでスタッキングすると、吸収スペクトルが長波長化することが知られており、ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２もＰＢＳ中で凝集している可能性が高いと考えられた。さらに、ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮはＰＢＳ中でほとんど蛍光を発しないのに対して、ＢｚＢＭＮ－ＮＨ２は水溶液中で６００ｎｍ付近に最大吸収を有する蛍光を発した。これは、ＰＢＳ中での凝集によるＡＩＥＥ特性による蛍光増強であると考えられる。
【0096】
さらに、標的酵素であるＧＧＴとｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮを反応させたところ、経時的な吸光度の減少とスペクトルの長波長化を認めた。吸光度の減少は、反応生成物のＰＢＳへの溶解性が悪く、測定キュベットへの吸着が経時的に増加したため水溶液中での実効濃度が低下したと考えられる。この反応は、ＧＧＴ特異的阻害剤であるＧＧｓＴｏｐによって抑制されたことから、ＧＧＴに由来した反応であると考えられた（図５）。
【0097】
図５は、ＰＢＳ中の４．４μＭ ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮの吸収スペクトルの変化を示す。添加剤：ＧＧＴ（１ユニット）（ａ）、ＧＧＴの阻害剤を含むＧＧＴ（１ユニット）、ＧＧｓＴｏｐ（１０μＭ）（ｂ）。
【0098】
さらに酵素反応をラマン顕微鏡で観察した。ラマン顕微鏡としては高感度のイメージングが可能な誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡を使用した。ＳＲＳ顕微鏡でｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮを観察したところ凝集はほとんど認めず、誘導ラマン散乱スペクトル（ＳＲＳスペクトル）でもニトリルのＣ≡Ｎ伸縮振動由来のピークはほとんど認めなかった。一方で、ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ溶液にＧＧＴを添加して観察したところ、視野内に大きな凝集を認め、その凝集からは非常に強いＳＲＳ信号を認めた。この凝集生成はＧＧＴ特異的阻害剤（ＧＧｓＴｏｐ）によって抑制されたことから、ＧＧＴによるものと考えられた（図６）。
【0099】
図６は、ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮのＳＲＳ画像を示す。ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮをＧＧＴなし（ａ、ｄ）またはＧＧＴあり（ｂ、ｅ）で２時間、ＰＢＳでインキュベートした。ＧＧＴの阻害剤であるＧＧｓＴｏｐも追加した（ｃ、ｆ）。ＳＲＳ画像は、２０００ｃｍ－１と２３００ｃｍ－１の間の画像を平均することによって作成した。スケールバー：１０μｍ。
【0100】
以上のように標的酵素との反応にともなって、プローブの水溶性が変化し凝集体が生成することで非常に強いラマン信号を得ることができたことから、分子設計のコンセプトを実証することができたと考えられる。
【0101】
【0102】
図７は、ＥＰ－ＢｚＢＭＮの特性評価の結果を示す。
（ａ）は、ＰＢＳおよびＤＭＳＯ中のＥＰ－ＢｚＢＭＮの吸収スペクトルを、（ｂ）は蛍光スペクトルを示す。
（ｃ－ｄ）は、ＰＢＳ中の６．３μＭ ＥＰ－ＢｚＢＭＮの吸収スペクトルの変化を示す。添加剤：ＤＰＰ４（０．０１５単位）（ｃ）、ＤＰＰ４の阻害剤を含むＤＰＰ４ （０．０１５単位）、シタグリプチン（１８μＭ）（ｄ）。
（ｅ－ｊ）は、 ＥＰ－ＢｚＢＭＮのＳＲＳ画像を示す。ＥＰ－ＢｚＢＭＮを、ＤＰＰ４なし（ｅ、ｈ）、またはＤＰＰ４あり（ｆ、ｉ）で、ＰＢＳ中で２時間インキュベートした。ＤＰＰ４の阻害剤であるシタグリプチンも追加した（ｇ、ｊ）。ＳＲＳ 画像は、２０００ｃｍ－１と２３００ｃｍ－１の間の画像を平均することによって作成した。スケールバー：１０μｍ。
（ａ）は、ＰＢＳおよびＤＭＳＯ中のＥＰ－ＢｚＢＭＮの吸収スペクトルを、（ｂ）は蛍光スペクトルを示す。
（ｃ－ｄ）は、ＰＢＳ中の６．３μＭ ＥＰ－ＢｚＢＭＮの吸収スペクトルの変化を示す。添加剤：ＤＰＰ４（０．０１５単位）（ｃ）、ＤＰＰ４の阻害剤を含むＤＰＰ４ （０．０１５単位）、シタグリプチン（１８μＭ）（ｄ）。
（ｅ－ｊ）は、 ＥＰ－ＢｚＢＭＮのＳＲＳ画像を示す。ＥＰ－ＢｚＢＭＮを、ＤＰＰ４なし（ｅ、ｈ）、またはＤＰＰ４あり（ｆ、ｉ）で、ＰＢＳ中で２時間インキュベートした。ＤＰＰ４の阻害剤であるシタグリプチンも追加した（ｇ、ｊ）。ＳＲＳ 画像は、２０００ｃｍ－１と２３００ｃｍ－１の間の画像を平均することによって作成した。スケールバー：１０μｍ。
【0103】
図７で示すように、ＥＰ－ＢｚＢＭＮはｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮと同様に、標的酵素ＤＰＰ４と反応して、凝集体を形成することで強いラマン信号を観察することができた。
【0104】
［実施例３］
生細胞での酵素活性イメージング
開発したＧＧＴ活性検出ラマンプローブｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ及びＥＰ－ＢｚＢＭＮが細胞でもそれぞれの標的酵素活性を検出可能か検討した。
ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ及びＥＰ－ＢｚＢＭＮをＡ５４９細胞（ＧＧＴ高活性、ＤＰＰ４低活性）とＨ２２６細胞（ＧＧＴ低活性、ＤＰＰ４高活性）にアプライし、ＳＲＳイメージングで観察した。結果を図８に示す。
図８は、プロテアーゼ活性のＳＲＳ画像である。
（ａ）は、１０ｍＭ ＧＧｓＴｏｐの非存在下または存在下で、５０μＭ ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮと３０分間インキュベートしたＡ５４９細胞またはＨ２２６細胞の ＳＲＳ画像である。２２１３ｃｍ－１の画像から２１９０ｃｍ－１の画像を差し引いて画像を作成した。
（ｂ）は、１８μＭシタグリプチンの非存在下または存在下で、５０μＭ ＥＰ－ＢｚＢＭＮと３０分間インキュベートしたＡ５４９細胞またはＨ２２６細胞のＳＲＳ 画像である。画像は、２２１０ｃｍ－１の画像から２１９０ｃｍ－１の画像を差し引いて作成した。スケールバー：１０μｍ。
生細胞での酵素活性イメージング
開発したＧＧＴ活性検出ラマンプローブｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ及びＥＰ－ＢｚＢＭＮが細胞でもそれぞれの標的酵素活性を検出可能か検討した。
ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ及びＥＰ－ＢｚＢＭＮをＡ５４９細胞（ＧＧＴ高活性、ＤＰＰ４低活性）とＨ２２６細胞（ＧＧＴ低活性、ＤＰＰ４高活性）にアプライし、ＳＲＳイメージングで観察した。結果を図８に示す。
図８は、プロテアーゼ活性のＳＲＳ画像である。
（ａ）は、１０ｍＭ ＧＧｓＴｏｐの非存在下または存在下で、５０μＭ ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮと３０分間インキュベートしたＡ５４９細胞またはＨ２２６細胞の ＳＲＳ画像である。２２１３ｃｍ－１の画像から２１９０ｃｍ－１の画像を差し引いて画像を作成した。
（ｂ）は、１８μＭシタグリプチンの非存在下または存在下で、５０μＭ ＥＰ－ＢｚＢＭＮと３０分間インキュベートしたＡ５４９細胞またはＨ２２６細胞のＳＲＳ 画像である。画像は、２２１０ｃｍ－１の画像から２１９０ｃｍ－１の画像を差し引いて作成した。スケールバー：１０μｍ。
【0105】
図８で示すように、標的酵素が高発現している細胞選択的に凝集の生成と強いＳＲＳ信号を認めた。凝集体生成はそれぞれの特異的阻害剤によって抑制されたことから、ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ及びＥＰ－ＢｚＢＭＮは生細胞においても標的酵素の活性を選択的にイメージングできた（図８）。
【0106】
［実施例４］
多重検出への応用
ラマンイメージングの強みを活かして酵素活性の多重検出を検討した。
まずニトリルの同位体置換によってラマン波数を変化させた［１２Ｃ１５Ｎ］ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮと、［１２Ｃ１４Ｎ］ＥＰ－ＢｚＢＭＮと混ぜ合わせてＡ５４９細胞、Ｈ２２６細胞にそれぞれ添加し、ＧＧＴ活性とＤＰＰ４活性を波数の違いから検出可能か検討した。
多重検出への応用
ラマンイメージングの強みを活かして酵素活性の多重検出を検討した。
まずニトリルの同位体置換によってラマン波数を変化させた［１２Ｃ１５Ｎ］ｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮと、［１２Ｃ１４Ｎ］ＥＰ－ＢｚＢＭＮと混ぜ合わせてＡ５４９細胞、Ｈ２２６細胞にそれぞれ添加し、ＧＧＴ活性とＤＰＰ４活性を波数の違いから検出可能か検討した。
【0107】
図９は、多重検出の試験の模式図（左図）と、Ａ５４９細胞およびＨ２２６細胞（低ＧＧＴ、高ＤＰＰ４）のＳＲＳ画像（右図）を示す。細胞をｇＧｌｕ－ＢｚＢＭＮ（１２Ｃ１５Ｎ）およびＥＰ－ＢｚＢＭＮ（１２Ｃ１４Ｎ）の混合物と共にインキュベートした。 ＬＵＴ ０－４０。スケールバー：１０μｍ。
【0108】
その結果、Ａ５４９細胞からは１２Ｃ≡１５Ｎ伸縮振動に由来すると考えられる低波数側のＳＲＳ信号が強く観測されたのに対して、Ｈ２２６細胞からは１２Ｃ≡１４Ｎ伸縮に由来すると考えられる高波数側のＳＲＳ信号が観察された（図９）。すなわち、Ａ５４９細胞ではＧＧＴ活性を、Ｈ２２６細胞ではＤＰＰ４活性を主として検出できたと考えられ、同位体置換したプローブを混ぜ合わせて使用した場合でも選択的に酵素活性をイメージングできることが示された。
【0109】
［実施例５］
カルボキシペプチダーゼ検出プローブ（ＢｚＢＭＮ－ＡＦ－Ｌｙｓ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検討
合成実施例２で合成したＢｚＢＭＮ－ＡＦ－Ｌｙｓ及びＣＰＭとの反応に伴う想定生成物のＢｚＢＭＮの水溶液中での吸収・蛍光スペクトルを図１０に示す。
図１０のａは、ＢｚＢＭＮ－ＡＦ－Ｌｙｓ及びＢｚＢＭＮの分子構造を示し、ｂ及びｃは、夫々、ＰＢＳ中１０μＭのＢｚＢＭＮ－ＡＦ－Ｌｙｓ及びＢｚＢＭＮの吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを示す。
カルボキシペプチダーゼ検出プローブ（ＢｚＢＭＮ－ＡＦ－Ｌｙｓ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検討
合成実施例２で合成したＢｚＢＭＮ－ＡＦ－Ｌｙｓ及びＣＰＭとの反応に伴う想定生成物のＢｚＢＭＮの水溶液中での吸収・蛍光スペクトルを図１０に示す。
図１０のａは、ＢｚＢＭＮ－ＡＦ－Ｌｙｓ及びＢｚＢＭＮの分子構造を示し、ｂ及びｃは、夫々、ＰＢＳ中１０μＭのＢｚＢＭＮ－ＡＦ－Ｌｙｓ及びＢｚＢＭＮの吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを示す。
【0110】
吸収スペクトルを比較するとＢｚＢＭＮ－ＡＦ－Ｌｙｓでは単峰性のメインピークを認めたのに対して、ＢｚＢＭＮはピークがなだらかに長波長化しており、スタッキング（凝集）している可能性があると考えられた。また、ＢｚＢＭＮ－ＡＦ－Ｌｙｓに対して同濃度のＢｚＢＭＮの蛍光スペクトルを比較すると、ＢｚＢＭＮの蛍光強度は極めて強かった。このことから、ＢｚＢＭＮ－ＡＦ－ＬｙｓがＣＰＭと反応してＢｚＢＭＮが放出されれば、凝集が生じ、蛍光・ラマン信号の増大が観察できる可能性が高いと考えられた。
【0111】
続いて、ＢｚＢＭＮ－ＡＦ－ＬｙｓをカルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）と反応させた蛍光スペクトルの変化を図１１に示す。反応はＰＢＳ中で１時間行った。
【0112】
図１１に示すように、ＣＰＭとの反応に伴う蛍光上昇を認めた。ＢｚＢＭＮ－ＡＦ－ＬｙｓがＣＰＭ活性検出蛍光プローブとして機能する可能性を示唆している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
