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特開2024-124748コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセット及びコムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024124748
(43)【公開日】2024-09-13
(54)【発明の名称】コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセット及びコムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6888 20180101AFI20240906BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240906BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20240906BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240906BHJP
A01H 6/46 20180101ALI20240906BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20240906BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6888 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/37
C12Q1/6869 Z
A01H6/46
C12N15/29
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023032641
(22)【出願日】2023-03-03
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100211199
【弁理士】
【氏名又は名称】原田 さやか
(72)【発明者】
【氏名】川口 謙二
(72)【発明者】
【氏名】八田 浩一
(72)【発明者】
【氏名】大木 健広
(72)【発明者】
【氏名】大藤 泰雄
【テーマコード（参考）】
2B030
4B063
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD04
2B030CA05
2B030CB02
2B030CG05
4B063QA01
4B063QA07
4B063QQ04
4B063QQ09
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS28
4B063QS32
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットを提供すること。
【解決手段】２Ａ染色体上のコムギ縞萎縮病抵抗性に関連する遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーを含む、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセット。
【選択図】図１５
【解決手段】２Ａ染色体上のコムギ縞萎縮病抵抗性に関連する遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーを含む、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセット。
【選択図】図１５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットであって、以下の（１）～（４）：
（１）（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（２）（ｉ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（３）（ｉ）配列番号５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（４）（ｉ）配列番号７の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号７の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号８の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号８の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含む、プライマーセット。
（１）（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（２）（ｉ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（３）（ｉ）配列番号５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（４）（ｉ）配列番号７の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号７の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号８の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号８の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含む、プライマーセット。
【請求項2】
コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットであって、以下の（５）～（７）：
（５）（ｉ）配列番号９の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号９の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１０の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（６）（ｉ）配列番号１１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（７）（ｉ）配列番号１３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含む、プライマーセット。
（５）（ｉ）配列番号９の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号９の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１０の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（６）（ｉ）配列番号１１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（７）（ｉ）配列番号１３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含む、プライマーセット。
【請求項3】
コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットであって、以下の（８）：
（８）（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
を含む、プライマーセット。
（８）（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
を含む、プライマーセット。
【請求項4】
コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、請求項１に記載のプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの量に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法。
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、請求項１に記載のプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの量に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法。
【請求項5】
コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、請求項２に記載のプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法。
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、請求項２に記載のプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法。
【請求項6】
コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、請求項３に記載のプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の塩基の多型に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法。
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、請求項３に記載のプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の塩基の多型に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法。
【請求項7】
前記（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の塩基の多型に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程が、
（ＩＩ－１）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを制限酵素処理すること、及び
（ＩＩ－２）制限酵素処理により得られたＤＮＡ断片の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定すること
を含む、請求項６に記載の方法。
（ＩＩ－１）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを制限酵素処理すること、及び
（ＩＩ－２）制限酵素処理により得られたＤＮＡ断片の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定すること
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物における配列番号１７に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物における対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、コムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程を含む、方法。
【請求項9】
前記コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物が北海２４０号又は北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物であって、前記コムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程の前に、
（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程を含む、請求項８に記載の方法。
（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を作出する方法であって、請求項４～９のいずれか一項に記載の方法を用いて前記コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程を含む、方法。
【請求項11】
請求項１０に記載の方法により得られるコムギ属植物。
【請求項12】
請求項１１に記載のコムギ属植物から得られた種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセット及びコムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
コムギ縞萎縮病は保毒したＰｏｌｙｍｙｘａ ｇｒａｍｉｎｉｓの媒介によるコムギ縞萎縮ウイルスの感染によって引き起こされる土壌伝染性の病害である。国内では小麦の主産地で多発し、汚染圃場の面積は年々拡大している。コムギ縞萎縮ウイルスは、判別品種の抵抗性反応の違いとＲＮＡ配列からＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型の３つのタイプに分類されている（非特許文献１、非特許文献２）。コムギ縞萎縮病を発病したコムギ属植物は、葉が斑点状又は筋状の黄化を示し、被害が甚大な場合は大幅な減収を引き起こすため、小麦の安定生産には防除が不可欠である。コストの観点から、土壌処理剤による防除は行われず、対策は抵抗性品種の導入に限られている。
【0003】
通常、コムギ縞萎縮病の抵抗性を有する個体を選抜する際、コムギ縞萎縮病抵抗性の個体又はその後代と交配後に、汚染圃場における圃場試験又は接種試験による病徴観察やＥＬＩＳＡ法によるウイルス検定によりその抵抗性を判別する（非特許文献３）。また、染色体上の抵抗性遺伝子に連鎖したＤＮＡマーカーも用いられている。
【0004】
コムギ縞萎縮病抵抗性を有する個体を選抜するためのＤＮＡマーカーに関し、特許文献１には、５ＡＬ染色体上のコムギ縞萎縮病抵抗性に関連する遺伝子座に連鎖したＤＮＡマーカーが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】中国特許出願公開第１０２２６０６６９号明細書
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】大藤泰雄「日本におけるコムギ縞萎縮ウイルスの病原性の分化と判別条件」Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｅｎｔ．Ｔｏｈｏｋｕ Ｒｅｇ．１０５，７３－９６（２００６）
【非特許文献2】Ohkiet al., "Biological and Genetic Diversity of Wheat yellow mosaic virus(Genus Bymovirus)", Phytopathology 104 (3): 313-319 (2014).
【非特許文献3】大藤泰雄「コムギ縞萎縮病の発生生態に関する研究」Ｂｕｌｌ．Ｎａｔｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｅｎｔ．Ｔｏｈｏｋｕ Ｒｅｇ．１０４，１７－７４（２００５）
【非特許文献4】Ishikawa et al., "MultifamilyQTL analysis and comprehensive design of genotypes for high-quality soft wheat",PLOS ONE 15 (3): e0230326 (2020).
【非特許文献5】Ishikawa et al., "Anefficient approach for the development of genome-specific markers inallohexaploid wheat (Triticum aestivum L.) and its application in theconstruction of high-density linkage maps of the D genome", DNA Research 25(3): 317-326 (2018).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
これまでに、抵抗性品種の作出のために、コムギ縞萎縮病の抵抗性遺伝子を導入することが積極的に試みられている。作出においてコムギ縞萎縮病の抵抗性を判定するためのマーカーとしては、国内では主として２ＤＬ、３ＢＳ、５ＡＬ、６ＤＬ染色体上の抵抗性遺伝子に連鎖したＤＮＡマーカーが用いられているが、抵抗性を打破する変異株の出現に備えて、新たな抵抗性遺伝子を探索することが必要である。
【0008】
本発明は、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセット、及びコムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、Ｉ型及びＩＩ型のコムギ縞萎縮病に対して抵抗性を示す品種として知られる北海２４０号が、圃場試験においてＩＩＩ型のコムギ縞萎縮病に対しても抵抗性を有することを見出した。さらに、北海２４０号の２Ａ染色体上にＩＩ型及びＩＩＩ型のコムギ縞萎縮病に対する抵抗性における新たな主働ＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｕｓ、量的形質遺伝子座）が存在すること及び該主働ＱＴＬの近傍のＤＮＡマーカーを用いるとコムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定可能であることを見出し、本開示を完成させた。
【0010】
すなわち、本開示は、以下の［１］～［１４］に関する。
［１］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットであって、以下の（１）～（４）：
（１）（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（２）（ｉ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（３）（ｉ）配列番号５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（４）（ｉ）配列番号７の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号７の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号８の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号８の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含む、プライマーセット。
［２］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットであって、以下の（５）～（７）：
（５）（ｉ）配列番号９の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号９の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１０の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（６）（ｉ）配列番号１１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（７）（ｉ）配列番号１３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含む、プライマーセット。
［３］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットであって、以下の（８）：
（８）（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
を含む、プライマーセット。
［４］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、［１］に記載のプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの量に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法。
［５］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、［２］に記載のプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法。
［６］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、［３］に記載のプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の塩基の多型に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法。
［７］上記（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の塩基の多型に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程が、
（ＩＩ－１）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを制限酵素処理すること、及び
（ＩＩ－２）制限酵素処理により得られたＤＮＡ断片の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定すること
を含む、［６］に記載の方法。
［８］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物における配列番号１７に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物における対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、コムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程を含む、方法。
［９］上記コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物が北海２４０号又は北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物であって、上記コムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程の前に、（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程を含む、［８］に記載の方法。
［１０］コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を作出する方法であって、［４］～［９］のいずれか一つに記載の方法を用いて上記コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程を含む、方法。
［１１］［１０］に記載の方法により得られるコムギ属植物。
［１２］［１１］に記載のコムギ属植物から得られた種子。
［１３］上記コムギ属植物が普通系である、［１］～［１２］のいずれか一つに記載のプライマーセット、方法、コムギ属植物又は種子。
［１４］上記コムギ属植物がパンコムギである、［１］～［１２］のいずれか一つに記載のプライマーセット、方法、コムギ属植物又は種子。
［１］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットであって、以下の（１）～（４）：
（１）（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（２）（ｉ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（３）（ｉ）配列番号５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（４）（ｉ）配列番号７の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号７の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号８の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号８の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含む、プライマーセット。
［２］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットであって、以下の（５）～（７）：
（５）（ｉ）配列番号９の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号９の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１０の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（６）（ｉ）配列番号１１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（７）（ｉ）配列番号１３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含む、プライマーセット。
［３］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットであって、以下の（８）：
（８）（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
を含む、プライマーセット。
［４］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、［１］に記載のプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの量に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法。
［５］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、［２］に記載のプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法。
［６］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、［３］に記載のプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の塩基の多型に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法。
［７］上記（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の塩基の多型に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程が、
（ＩＩ－１）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを制限酵素処理すること、及び
（ＩＩ－２）制限酵素処理により得られたＤＮＡ断片の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定すること
を含む、［６］に記載の方法。
［８］コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物における配列番号１７に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物における対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、コムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程を含む、方法。
［９］上記コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物が北海２４０号又は北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物であって、上記コムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程の前に、（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程を含む、［８］に記載の方法。
［１０］コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を作出する方法であって、［４］～［９］のいずれか一つに記載の方法を用いて上記コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程を含む、方法。
［１１］［１０］に記載の方法により得られるコムギ属植物。
［１２］［１１］に記載のコムギ属植物から得られた種子。
［１３］上記コムギ属植物が普通系である、［１］～［１２］のいずれか一つに記載のプライマーセット、方法、コムギ属植物又は種子。
［１４］上記コムギ属植物がパンコムギである、［１］～［１２］のいずれか一つに記載のプライマーセット、方法、コムギ属植物又は種子。
【発明の効果】
【0011】
本開示のプライマーセット及び方法によれば、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性をＤＮＡマーカーにより判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】参考例２において、ＩＩ型コムギ縞萎縮病に汚染された圃場での圃場試験におけるＥＬＩＳＡ値に基づく感染プロットを示す図である。
【図3】参考例４において、ｓｎｐ４２１５により判別された遺伝子型毎のＩＩＩ型コムギ縞萎縮病に汚染された圃場での圃場試験におけるＤＩについて系統数のヒストグラムとして表した図である。
【図4】参考例５において、ｓｎｐ４２１５により判別された遺伝子型毎のＩＩ型コムギ縞萎縮病に汚染された圃場での圃場試験におけるＥＬＩＳＡ値について箱ひげ図として表した図である。
【図5】参考例６において、既報のＤＮＡマーカーによる遺伝子型の判別結果と、ＥＬＩＳＡ値に基づくコムギ縞萎縮病罹病性／抵抗性評価の結果の相関を示す図である。
【図6】実施例１において、新規の７種類のマーカーによる遺伝子型の判別結果と、ＥＬＩＳＡ値に基づくコムギ縞萎縮病罹病性／抵抗性評価の結果の相関を示す図である。
【図7】実施例２において、新規の優性マーカーであるＮＨＫ４（配列番号１，２）によりナンブコムギ、北海２４０号及びそのＲＩＬｓから抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅し、アガロースゲル電気泳動により泳動した結果を示す図である。図中において、Ｎとして示された２つのレーンがナンブコムギ、Ｈとして示された２つのレーンが北海２４０号であり、その他のレーンがＲＩＬｓ（又は分子量マーカー）である。
【図8】実施例２において、新規の共優性マーカーであるＮＨＫ７５（配列番号９，１０）によりナンブコムギ、北海２４０号及びそのＲＩＬｓから抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅し、アガロースゲル電気泳動により泳動した結果を示す図である。図中において、Ｎとして示された２つのレーンがナンブコムギ、Ｈとして示された２つのレーンが北海２４０号であり、その他のレーンがＲＩＬｓ（又は分子量マーカー）である。
【図9】実施例２において、新規の優性マーカーであるＮＨＫ７６（配列番号３，４）によりナンブコムギ、北海２４０号及びそのＲＩＬｓから抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅し、アガロースゲル電気泳動により泳動した結果を示す図である。図中において、Ｎとして示された２つのレーンがナンブコムギ、Ｈとして示された２つのレーンが北海２４０号であり、その他のレーンがＲＩＬｓ（又は分子量マーカー）である。
【図10】実施例２において、新規の優性マーカーであるＮＨＫ７７（配列番号５，６）によりナンブコムギ、北海２４０号及びそのＲＩＬｓから抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅し、アガロースゲル電気泳動により泳動した結果を示す図である。図中においてＮとして示された２つのレーンがナンブコムギ、Ｈとして示された２つのレーンが北海２４０号であり、その他のレーンがＲＩＬｓ（又は分子量マーカー）である。
【図11】実施例２において、新規の優性マーカーであるＮＨＫ８５（配列番号７，８）によりナンブコムギ、北海２４０号及びそのＲＩＬｓから抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅し、アガロースゲル電気泳動により泳動した結果を示す図である。図中において、Ｎとして示された２つのレーンがナンブコムギ、Ｈとして示された２つのレーンが北海２４０号であり、その他のレーンがＲＩＬｓ（又は分子量マーカー）である。
【図12】実施例２において、新規の共優性マーカーであるＮＨＫ１１４（配列番号１１，１２）によりナンブコムギ、北海２４０号及びそのＲＩＬｓから抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅し、アガロースゲル電気泳動により泳動した結果を示す図である。図中において、Ｎとして示された２つのレーンがナンブコムギ、Ｈとして示された２つのレーンが北海２４０号であり、その他のレーンがＲＩＬｓ（又は分子量マーカー）である。
【図13】実施例２において、新規の共優性マーカーであるＮＨＫ１３７（配列番号１３，１４）によりナンブコムギ、北海２４０号及びそのＲＩＬｓから抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅し、アガロースゲル電気泳動により泳動した結果を示す図である。図中において、Ｎとして示された２つのレーンがナンブコムギ、Ｈとして示された２つのレーンが北海２４０号であり、その他のレーンがＲＩＬｓ（又は分子量マーカー）である。
【図14】実施例３において、ナンブコムギと北海２４０号の２Ａ染色体上に検出された一塩基多型を示す図である。
【図15】実施例３において、新規のＣＡＰｓマーカー（配列番号１５，１６）によりナンブコムギ、北海２４０号及びそのＲＩＬｓから抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅し、制限酵素処理した後にアガロースゲル電気泳動により泳動した結果を示す図である。
【図16】実施例４において、新規のＣＡＰｓマーカー（配列番号１５，１６）による遺伝子型の判別結果と、ＥＬＩＳＡ値に基づくコムギ縞萎縮病罹病性／抵抗性評価の結果の相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本開示を実施するための形態について詳細に説明するが、本開示は以下の実施形態に限定されるものではない。
【0014】
本開示において、「植物」は、特段の限定がない限り、植物全体、植物細胞、植物プロトプラスト、植物カルス、又は植物の部分、例えば、胚、花粉、胚珠、配偶子、種子、葉、花、枝、果実、茎、根、葯等を含む。
【0015】
本開示において、コムギ属植物とは、イネ科コムギ属（学名：Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）に属する植物を意味する。
【0016】
コムギ属植物は、染色体数が１４でありゲノムがＡＡで表される一粒系（２倍体）、染色体数が２８でありゲノムがＡＡＢＢで表される二粒系（４倍体）、染色体数が４２でありゲノムがＡＡＢＢＤＤで表される普通系（６倍体）の３つに分類される。二粒系のコムギ属植物としては、例えばデュラムコムギ（学名：Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ、マカロニコムギとも呼ばれる。）等を挙げることができ、普通系のコムギ属植物としては、例えばパンコムギ（学名：Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、普通コムギとも呼ばれる。）及びスペルトコムギ（学名：Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐｅｌｔａ）等を挙げることができる。
【0017】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本開示に係るＤＮＡマーカーは２Ａ染色体上のコムギ縞萎縮病抵抗性に関連する遺伝子座に連鎖したものであるため、本開示に係るコムギ属植物は、一粒系、二粒系又は普通系のいずれであってもよい。栽培及び加工のしやすさの観点から、本開示に係るコムギ属植物は、普通系であることが好ましく、パンコムギ又はパンコムギ由来のコムギ属植物であることがより好ましく、パンコムギであることがさらに好ましい。
【0018】
コムギ縞萎縮病は、コムギ縞萎縮ウイルス（Ｗｈｅａｔ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ、ＷＹＭＶ）により引き起こされる土壌伝染性のウイルス病害である。ＷＹＭＶは、土壌中に生息する微生物であるＰｏｌｙｍｙｘａｇｒａｍｉｎｉｓにより媒介される。
【0019】
コムギ縞萎縮ウイルスは、判別品種の抵抗性反応の違いとＲＮＡ配列からＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型の３つのタイプに分類されている。具体的には、判別品種としてナンブコムギ、フクホコムギ及び北海２４０号を設定した場合に、接種試験においてナンブコムギ及びフクホコムギは抵抗性を示さないが北海２４０号は抵抗性を示すＩ型、ナンブコムギは抵抗性を示さないがフクホコムギ及び北海２４０号は抵抗性を示すＩＩ型並びにすべての判別品種が抵抗性を示さないＩＩＩ型に分類されており、わが国においては、宮城県以南ではＩ型が優占し，岩手県以北はＩＩ型が優占することが明らかとなっている（非特許文献１）。
【0020】
本開示において、Ｉ型コムギ縞萎縮病とは、Ｉ型コムギ縞萎縮ウイルスによるコムギ縞萎縮病を意味する。本開示において、ＩＩ型コムギ縞萎縮病とは、ＩＩ型コムギ縞萎縮ウイルスによるコムギ縞萎縮病を意味する。本開示において、ＩＩＩ型コムギ縞萎縮病とは、ＩＩＩ型コムギ縞萎縮ウイルスによるコムギ縞萎縮病を意味する。
【0021】
本開示において、「コムギ属植物がコムギ縞萎縮病に感染する」とは、「コムギ属植物がコムギ縞萎縮病に罹病する」ことを意味する。本開示において、「コムギ属植物がコムギ縞萎縮病に罹病する」とは、「コムギ属植物が、体内で一定のウイルス濃度を超えた状態又はコムギ縞萎縮病の病徴程度が観察される状態に達する」ことを意味する。コムギ属植物がコムギ縞萎縮病に罹病したこと及びその病徴の程度は、達観による病徴観察や、ＥＬＩＳＡ法等により決定することができる。
【0022】
本開示の一側面は、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットに関する。
【0023】
本開示の一側面に係るプライマーセットは、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するために、コムギ属植物から抽出されたＤＮＡ（以下では、「サンプル」とも呼ぶ。）をＰＣＲにより増幅することに用いられる。
【0024】
本開示においてＤＮＡの抽出に用いられるコムギ属植物の器官等の部分は、抽出されたＤＮＡからコムギ縞萎縮病抵抗性を判定することができるものであれば特に限定されず、例えば胚、花粉、胚珠、配偶子、種子、葉、花、枝、果実、茎、根、葯等であってよく、好ましくは種子、葉、花、茎又は葯であり、より好ましくは種子又は葉であり、更に好ましくは葉である。また、ＤＮＡ抽出の方法についても特に限定されず、通常用いられる方法、例えばMurray MG, Thompson WF, Nucleic Acids Research, 8, 4321－4326 (1980)に記載の方法（ＣＴＡＢ法）等により行うことができる。
【0025】
本開示において、コムギ縞萎縮病抵抗性とは、コムギ属植物が土壌中に存在するＰｏｌｙｍｙｘａ ｇｒａｍｉｎｉｓが保毒するＷＹＭＶの感染に対する抵抗性を意味する。すなわち、本開示におけるコムギ縞萎縮病抵抗性は、ＷＹＭＶ感染性の土壌での圃場試験を含む栽培における土壌感染に対する抵抗性を意味する一方で、接種試験における抵抗性を意味するものではない。また、本開示において、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物とは、ＷＹＭＶ感染性の土壌での圃場試験においてコムギ縞萎縮病抵抗性を示すコムギ属植物を意味し、コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物とは、ＷＹＭＶ感染性の土壌での圃場試験においてコムギ縞萎縮病罹病性を示すコムギ属植物を意味する。
【0026】
本開示において抵抗性が判定されるコムギ縞萎縮病は、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型のいずれであってもよい。すなわち、例えば本開示の一側面に係るプライマーセットは、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型のいずれの判定に用いることができる。本開示において抵抗性が判定されるコムギ縞萎縮病は好ましくはＩＩ型又はＩＩＩ型であり、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＩＩＩ型コムギ縞萎縮病はＩ型コムギ縞萎縮病の原因となるＷＹＭＶが一定の耐性を獲得した変異株による病害であると考えられている（非特許文献２）ため、ＩＩ型及びＩＩＩ型のコムギ縞萎縮病に対して抵抗性であるコムギ属植物は、Ｉ型に対しても抵抗性である可能性が極めて高い。例えば、ＩＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性である北海２４０号は、接種試験においてＩ型コムギ縞萎縮病に対しても抵抗性を示す（非特許文献１）。
【0027】
本開示の一側面に係るプライマーセットは、以下の（１）～（４）：
（１）（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（２）（ｉ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（３）（ｉ）配列番号５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（４）（ｉ）配列番号７の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号７の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号８の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号８の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセット、以下の（５）～（７）：
（５）（ｉ）配列番号９の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号９の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１０の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（６）（ｉ）配列番号１１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（７）（ｉ）配列番号１３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセット又は以下の（８）：
（８）（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
を含むプライマーセットである。配列番号１～１６の塩基配列からなるプライマーを以下に示す。
配列番号１：ＣＴＣＧＡＣＧＡＡＧＧＴＴＴＧＣＡＴＧＧ（フォワードプライマー）
配列番号２：ＣＣＴＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＣ（リバースプライマー）
配列番号３：ＧＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＴＡＡＡＧＴＧＧＧＧＧ（フォワードプライマー）配列番号４：ＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＣＣ（リバースプライマー）
配列番号５：ＧＧＧＧＧＡＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣ（フォワードプライマー）
配列番号６：ＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＣＣ（リバースプライマー）
配列番号７：ＧＧＴＧＡＧＡＴＧＣＡＴＴＧＴＣＴＴＣＡＧＣ（フォワードプライマー）
配列番号８：ＡＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣ（リバースプライマー）
配列番号９：ＣＧＣＡＴＧＣＴＣＴＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ（フォワードプライマー）
配列番号１０：ＣＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＣＧ（リバースプライマー）
配列番号１１：ＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＣＴＴＴＧＡＣＣＧ（フォワードプライマー）
配列番号１２：ＴＴＡＣＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣ（リバースプライマー）
配列番号１３：ＴＧＧＧＴＧＧＴＣＣＴＡＧＧＴＡＡＧＧＧ（フォワードプライマー）
配列番号１４：ＴＡＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＣ（リバースプライマー）
配列番号１５：ＴＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴＴＣＣＣ（フォワードプライマー）
配列番号１６：ＴＴＣＣＡＡＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＧＡＣ（リバースプライマー）
（１）（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（２）（ｉ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（３）（ｉ）配列番号５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（４）（ｉ）配列番号７の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号７の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号８の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号８の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセット、以下の（５）～（７）：
（５）（ｉ）配列番号９の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号９の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１０の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（６）（ｉ）配列番号１１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（７）（ｉ）配列番号１３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセット又は以下の（８）：
（８）（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
を含むプライマーセットである。配列番号１～１６の塩基配列からなるプライマーを以下に示す。
配列番号１：ＣＴＣＧＡＣＧＡＡＧＧＴＴＴＧＣＡＴＧＧ（フォワードプライマー）
配列番号２：ＣＣＴＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＣ（リバースプライマー）
配列番号３：ＧＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＴＡＡＡＧＴＧＧＧＧＧ（フォワードプライマー）配列番号４：ＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＣＣ（リバースプライマー）
配列番号５：ＧＧＧＧＧＡＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣ（フォワードプライマー）
配列番号６：ＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＣＣ（リバースプライマー）
配列番号７：ＧＧＴＧＡＧＡＴＧＣＡＴＴＧＴＣＴＴＣＡＧＣ（フォワードプライマー）
配列番号８：ＡＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣ（リバースプライマー）
配列番号９：ＣＧＣＡＴＧＣＴＣＴＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ（フォワードプライマー）
配列番号１０：ＣＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＣＧ（リバースプライマー）
配列番号１１：ＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＣＴＴＴＧＡＣＣＧ（フォワードプライマー）
配列番号１２：ＴＴＡＣＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣ（リバースプライマー）
配列番号１３：ＴＧＧＧＴＧＧＴＣＣＴＡＧＧＴＡＡＧＧＧ（フォワードプライマー）
配列番号１４：ＴＡＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＣ（リバースプライマー）
配列番号１５：ＴＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴＴＣＣＣ（フォワードプライマー）
配列番号１６：ＴＴＣＣＡＡＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＧＡＣ（リバースプライマー）
【0028】
本明細書において、ヌクレオチド塩基の一文字コードは、国際純正・応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の定める塩基表記に従い使用している。プライマーは、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ若しくは類似体、又は縮重塩基（Ｍ、Ｒ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｋ）からなっていてよい。
【0029】
本明細書において、「配列同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのＤＮＡ塩基配列をアラインさせた場合の最適なアラインメントにおける、オーバーラップする全ＤＮＡ塩基配列に対する同一塩基の割合（％）を意味する。アラインメントの作成及び配列同一性の算出には、例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ提供 ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）を用いることができる。
【0030】
各プライマーの長さは、目的のＤＮＡ領域を増幅可能である限り特に制限されないが、例えば、１５塩基～５０塩基、１６塩基～４０塩基、１７塩基～３５塩基、１８塩基～３０塩基、１８塩基～２６塩基又は１９塩基～２３塩基等であってよい。
【0031】
本開示の一側面に係るプライマーセットが含むことができるプライマーは、該プライマーが配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列からなるプライマーでない場合、一実施形態において、配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマーであってよく、配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を３’末端側に含むヌクレオチドからなるプライマーであることが好ましく、配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列のヌクレオチドからなるプライマーであることがより好ましい。上記プライマーにおける配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列との配列同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％であってもよい。
【0032】
他の一実施形態において、本開示の一側面に係るプライマーセットが含むことができるプライマーは、該プライマーが配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列からなるプライマーでない場合、配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列に０～４個の変異が導入された塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマーであってよく、配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列に０～４個の変異が導入された塩基配列を３’末端側に含むヌクレオチドからなるプライマーであることが好ましく、配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列に０～４個の変異が導入された塩基配列のヌクレオチドからなるプライマーであることがより好ましい。変異は、置換、欠失、挿入及び不可から選択される同一又は異なる変異であってよく、一塩基置換、一塩基欠失、一塩基挿入及び一塩基付加から選択されてもよい。上記プライマーにおける塩基配列に導入される変異の数は、０～４個、０～３個、０～２個、１～３個又は１若しくは２個であってもよい。
【0033】
他の一実施形態において、本開示の一側面に係るプライマーセットが含むことができるプライマーは、該プライマーが配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列からなるプライマーでない場合、配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列の３’末端又は５’末端に０～４個のヌクレオチド付加又は欠失を含む塩基配列を含むプライマーであってよく、配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列の３’末端又は５’末端に０～４個のヌクレオチド付加又は欠失を含む塩基配列を３’末端側に含むプライマーであることが好ましく、配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列の３’末端又は５’末端に０～４個のヌクレオチド付加又は欠失を含む塩基配列からなるプライマーであることがより好ましい。上記プライマーにおける塩基配列のヌクレオチド付加又は欠失される塩基の数は、０～４個、０～３個、０～２個、１～３個又は１若しくは２個であってもよい。
【0034】
各プライマーは、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、又は化学的手段により検出可能な標識を有するものであってもよい。検出可能な標識としては、例えば、標識アビジン（例えば、蛍光標識ストレプトアビジン）で検出するビオチン、ハプテン、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド及びローダミン）、電子密度試薬、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ）、及び放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ及び１２５Ｉ）が挙げられる。標識は、例えば、配列番号１～１６のいずれかに示される塩基配列からなるプライマーと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列よりも５’末側に標識を有していてもよく、リンカーを介して標識されていてもよい。
【0035】
これらのプライマーは、当業者が通常行う方法により製造することができ、例えば液相又は固相における核酸合成により製造することができ、また適切な合成委託業者に合成を委託して入手することもできる。
【0036】
本開示の一側面に係るプライマーセットを用いると、ＰＣＲ法により、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性に関連する２Ａ染色体上の遺伝子座におけるＤＮＡの一部領域を増幅することができる。ＰＣＲで増幅する際のＤＮＡ増幅反応としては、上記プライマーセットを用いてＰＣＲで増幅できる限り特に制限されないが、例えば、非等温条件下での増幅反応であるＰＣＲ法や、これを応用したリアルタイムＰＣＲ法等であってよい。例えば、被験コムギ属植物からＤＮＡ抽出し、そのＤＮＡを鋳型として上記プライマーセットを用いてＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅することであってよい。ＤＮＡ増幅反応を行う際の反応液組成、温度サイクル条件の温度及び反応時間等は、核酸増幅法の種類、プライマーのＴｍ値、使用する機器の仕様等を考慮して当業者が適宜設定することができる。ＰＣＲ法の場合、例えば、反応液は、鋳型及び上記プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼの他、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、マグネシウムイオン、１以上の塩類、トリスバッファ（Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ）、ＥＤＴＡ、グリセロール及びｐＨバッファからなる群から選択される１以上を含んでいてもよい。また、例えば、９０℃～９８℃で３０秒～１８０秒間の初期変性工程後、９０℃～９８℃で５秒～１８０秒間の変性工程、５５℃～６８℃で１０秒～６０秒間のアニーリング工程及び７０℃～７５℃で３０秒～７００秒の伸長工程を１サイクルとして、２０サイクル～５０サイクル行い、６８℃～７２℃で１２０秒～３６０秒の最終伸長工程を行う条件で核酸増幅反応を実施してもよい。また、例えば、９５℃～９８℃で６０秒～１２０秒の初期変性工程後、９５℃～９８℃で２０秒～３０秒間の変性工程、５５℃～６０℃で２０秒～３０秒間のアニーリング工程及び７０℃～７５℃で３０秒～６０秒の伸長工程を１サイクルとして、３８サイクル～４２サイクル行い、６８℃～７２℃で２４０秒～３００秒の最終伸長工程を行う条件で核酸増幅反応を実施してもよい。
【0037】
本開示の一側面に係る以下の（１）～（４）：
（１）（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（２）（ｉ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（３）（ｉ）配列番号５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（４）（ｉ）配列番号７の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号７の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号８の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号８の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセットに含まれるプライマーは、優性マーカーである。すなわち、サンプルがコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物から得られたものである場合には該プライマーセットを用いたＰＣＲによりＤＮＡの一部領域が増幅される一方で、サンプルがコムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物から得られたものである場合にはＤＮＡの増幅が生じないため、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅の有無を指標として、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定することができる。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅の有無は、当業者が通常行う方法により評価することができ、例えば、アガロースゲル電気泳動、プローブを用いた蛍光分析又は吸光度測定等により確認できる。
（１）（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（２）（ｉ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（３）（ｉ）配列番号５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（４）（ｉ）配列番号７の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号７の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号８の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号８の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセットに含まれるプライマーは、優性マーカーである。すなわち、サンプルがコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物から得られたものである場合には該プライマーセットを用いたＰＣＲによりＤＮＡの一部領域が増幅される一方で、サンプルがコムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物から得られたものである場合にはＤＮＡの増幅が生じないため、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅の有無を指標として、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定することができる。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅の有無は、当業者が通常行う方法により評価することができ、例えば、アガロースゲル電気泳動、プローブを用いた蛍光分析又は吸光度測定等により確認できる。
【0038】
本開示の一側面に係る以下の（５）～（７）：
（５）（ｉ）配列番号９の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号９の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１０の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（６）（ｉ）配列番号１１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（７）（ｉ）配列番号１３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセットに含まれるプライマーは、共優性マーカーの一種であるＳＳＲマーカー（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔマーカー）である。ＳＳＲ（単純反復配列、マイクロサテライトとも呼ばれる。）は、特定の数塩基からなるモチーフが複数回繰り返される配列であり、遺伝子型に依存してＳＳＲの繰り返しの反復数が異なりうることが知られている。ＳＳＲマーカーは、ＳＳＲの繰り返しの反復数が異なることに由来したＰＣＲで増幅されたＤＮＡの長さの違いを指標として、遺伝子型を判別することができる。本開示に係るＳＳＲマーカーにおいては、コムギ属植物から得られたサンプルについて該プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅されるＤＮＡの長さが、既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物から得られたサンプルにおいて増幅されるＤＮＡの長さと一致する場合に、該コムギ属植物がコムギ縞萎縮病抵抗性であると判定することができる。ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡの長さは、当業者が通常行う方法により評価することができ、例えば、アガロースゲル電気泳動における分子量マーカーとの比較やフラグメント解析、ＤＮＡシーケンシング等により確認することができる。例えば、得られた増幅産物は、ＤＮＡシーケンサー等の適切な機器で分析してもよい。また、例えば、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを用いて行ってもよく、この方法によれば、アガロースゲル電気泳動により目視で判断できない数塩基の差異も確認することができる。既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物としては、例えば北海２４０号又は北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を用いることができる。なお、本明細書において、「北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性の植物」とは、例えば、北海２４０号を使用して交配により作出した植物（例えば、超雄系統）、葯培養により作出した半数体を倍加した植物及び遺伝子組み換え技術等により作出した植物等であって、コムギ縞萎縮病に対して抵抗性を示すものを意味する。
（５）（ｉ）配列番号９の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号９の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１０の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（６）（ｉ）配列番号１１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（７）（ｉ）配列番号１３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセットに含まれるプライマーは、共優性マーカーの一種であるＳＳＲマーカー（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔマーカー）である。ＳＳＲ（単純反復配列、マイクロサテライトとも呼ばれる。）は、特定の数塩基からなるモチーフが複数回繰り返される配列であり、遺伝子型に依存してＳＳＲの繰り返しの反復数が異なりうることが知られている。ＳＳＲマーカーは、ＳＳＲの繰り返しの反復数が異なることに由来したＰＣＲで増幅されたＤＮＡの長さの違いを指標として、遺伝子型を判別することができる。本開示に係るＳＳＲマーカーにおいては、コムギ属植物から得られたサンプルについて該プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅されるＤＮＡの長さが、既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物から得られたサンプルにおいて増幅されるＤＮＡの長さと一致する場合に、該コムギ属植物がコムギ縞萎縮病抵抗性であると判定することができる。ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡの長さは、当業者が通常行う方法により評価することができ、例えば、アガロースゲル電気泳動における分子量マーカーとの比較やフラグメント解析、ＤＮＡシーケンシング等により確認することができる。例えば、得られた増幅産物は、ＤＮＡシーケンサー等の適切な機器で分析してもよい。また、例えば、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを用いて行ってもよく、この方法によれば、アガロースゲル電気泳動により目視で判断できない数塩基の差異も確認することができる。既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物としては、例えば北海２４０号又は北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を用いることができる。なお、本明細書において、「北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性の植物」とは、例えば、北海２４０号を使用して交配により作出した植物（例えば、超雄系統）、葯培養により作出した半数体を倍加した植物及び遺伝子組み換え技術等により作出した植物等であって、コムギ縞萎縮病に対して抵抗性を示すものを意味する。
【0039】
本開示の一側面に係る以下の（８）：
（８）（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
を含むプライマーセットに含まれるプライマーは、ＣＡＰｓマーカー（ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅマーカー）である。すなわち、コムギ属植物から得られたサンプルについて該プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡにおける遺伝子の多型から、コムギ縞萎縮病抵抗性を判定することができ、遺伝子の多型は、例えばフラグメント解析、ＤＮＡシーケンシング又はｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ法等により検出することができる。遺伝子の多型からコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する際には、例えばコムギ属植物から得られたサンプルについて該プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを制限酵素処理した際のＤＮＡ断片の長さが、既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物から得られたサンプルにおいて同様の処理をした場合のＤＮＡ断片の長さと一致する場合に、該コムギ属植物がコムギ縞萎縮病抵抗性であると判定することができる。ＤＮＡ断片の長さは、当業者が通常行う方法により測定することができ、例えばＤＮＡ断片の分子量をその指標としてもよく、ＤＮＡ断片の分子量の指標としては、例えばアガロースゲル電気泳動における泳動距離を用いることができ、またＤＮＡシーケンシングにより測定することもできる。コムギ縞萎縮病抵抗性であると判定される場合における長さが一致するＤＮＡ断片の数は、例えば１つであってよく、２つであってもよく、２つ以上であってもよく、３つ以上であってもよい。既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物としては、例えば北海２４０号又は北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を用いることができる。制限酵素としては、例えばＢｓｍＦＩ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＦＩ）、ＢｓｉＹＩ、ＭｎｌＩ、ＢｓｃＧＩ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＦｉｎＩ及びＨｇａＩ等を用いることができる。
（８）（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
を含むプライマーセットに含まれるプライマーは、ＣＡＰｓマーカー（ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅマーカー）である。すなわち、コムギ属植物から得られたサンプルについて該プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡにおける遺伝子の多型から、コムギ縞萎縮病抵抗性を判定することができ、遺伝子の多型は、例えばフラグメント解析、ＤＮＡシーケンシング又はｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ法等により検出することができる。遺伝子の多型からコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する際には、例えばコムギ属植物から得られたサンプルについて該プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを制限酵素処理した際のＤＮＡ断片の長さが、既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物から得られたサンプルにおいて同様の処理をした場合のＤＮＡ断片の長さと一致する場合に、該コムギ属植物がコムギ縞萎縮病抵抗性であると判定することができる。ＤＮＡ断片の長さは、当業者が通常行う方法により測定することができ、例えばＤＮＡ断片の分子量をその指標としてもよく、ＤＮＡ断片の分子量の指標としては、例えばアガロースゲル電気泳動における泳動距離を用いることができ、またＤＮＡシーケンシングにより測定することもできる。コムギ縞萎縮病抵抗性であると判定される場合における長さが一致するＤＮＡ断片の数は、例えば１つであってよく、２つであってもよく、２つ以上であってもよく、３つ以上であってもよい。既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物としては、例えば北海２４０号又は北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を用いることができる。制限酵素としては、例えばＢｓｍＦＩ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＦＩ）、ＢｓｉＹＩ、ＭｎｌＩ、ＢｓｃＧＩ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＦｉｎＩ及びＨｇａＩ等を用いることができる。
【0040】
本開示においてコムギ縞萎縮病抵抗性であると判定されるコムギ属植物は、１対の相同染色体の少なくとも一方において、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物と一致した増幅パターン（増幅の有無若しくは塩基長）又は遺伝子の多型を示すゲノムＤＮＡを含むコムギ属植物であってよい。本開示の好ましい一実施形態においてコムギ縞萎縮病抵抗性であると判定されるコムギ属植物は、１対の相同染色体の両方において、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物と一致した増幅パターン（増幅の有無若しくは塩基長）又は遺伝子の多型を示すゲノムＤＮＡを含むコムギ属植物である。
【0041】
本開示の他の一側面は、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、以下の（１）～（４）：
（１）（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（２）（ｉ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（３）（ｉ）配列番号５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（４）（ｉ）配列番号７の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号７の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号８の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号８の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの量に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法、である。上述したように、これらのプライマーセットに含まれるプライマーは、優性マーカーであるから、サンプルがコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物から得られたものである場合には該プライマーセットを用いたＰＣＲによりＤＮＡの一部領域が増幅される一方で、サンプルがコムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物から得られたものである場合にはＤＮＡの増幅が生じないため、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅の有無を指標として、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定することができる。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅の有無は、当業者が通常行う方法により評価することができ、例えばアガロースゲル電気泳動、プローブを用いた蛍光分析又は吸光度測定等により確認できる。
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、以下の（１）～（４）：
（１）（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（２）（ｉ）配列番号３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（３）（ｉ）配列番号５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（４）（ｉ）配列番号７の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号７の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号８の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号８の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの量に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法、である。上述したように、これらのプライマーセットに含まれるプライマーは、優性マーカーであるから、サンプルがコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物から得られたものである場合には該プライマーセットを用いたＰＣＲによりＤＮＡの一部領域が増幅される一方で、サンプルがコムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物から得られたものである場合にはＤＮＡの増幅が生じないため、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅の有無を指標として、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定することができる。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅の有無は、当業者が通常行う方法により評価することができ、例えばアガロースゲル電気泳動、プローブを用いた蛍光分析又は吸光度測定等により確認できる。
【0042】
本開示の他の一側面は、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、以下の（５）～（７）：
（５）（ｉ）配列番号９の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号９の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１０の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（６）（ｉ）配列番号１１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（７）（ｉ）配列番号１３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法、である。上述したように、これらプライマーセットに含まれるプライマーは、共優性マーカーの一種であるＳＳＲマーカーであるから、ＳＳＲの繰り返しの反復数が異なることに由来したＰＣＲで増幅されたＤＮＡの長さの違いを指標として、遺伝子型を判別することができる。本開示に係るＳＳＲマーカーにおいては、コムギ属植物から得られたサンプルについて該プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅されるＤＮＡの長さが、既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物から得られたサンプルにおいて増幅されるＤＮＡの長さと一致する場合に、該コムギ属植物がコムギ縞萎縮病抵抗性であると判定することができる。ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡの長さは、当業者が通常行う方法により評価することができ、例えば、アガロースゲル電気泳動における分子量マーカーとの比較やフラグメント解析、ＤＮＡシーケンシング等により確認することができる。例えば、得られた増幅産物は、ＤＮＡシーケンサー等の適切な機器で分析してもよい。また、例えば、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを用いて行ってもよく、この方法によれば、アガロースゲル電気泳動により目視で判断できない数塩基の差異も確認することができる。既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物としては、例えば北海２４０号又は北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を用いることができる。
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、以下の（５）～（７）：
（５）（ｉ）配列番号９の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号９の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１０の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１０の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（６）（ｉ）配列番号１１の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１１の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１２の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１２の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
（７）（ｉ）配列番号１３の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１３の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１４の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
からなる群より選択される１つ以上を含むプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法、である。上述したように、これらプライマーセットに含まれるプライマーは、共優性マーカーの一種であるＳＳＲマーカーであるから、ＳＳＲの繰り返しの反復数が異なることに由来したＰＣＲで増幅されたＤＮＡの長さの違いを指標として、遺伝子型を判別することができる。本開示に係るＳＳＲマーカーにおいては、コムギ属植物から得られたサンプルについて該プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅されるＤＮＡの長さが、既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物から得られたサンプルにおいて増幅されるＤＮＡの長さと一致する場合に、該コムギ属植物がコムギ縞萎縮病抵抗性であると判定することができる。ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡの長さは、当業者が通常行う方法により評価することができ、例えば、アガロースゲル電気泳動における分子量マーカーとの比較やフラグメント解析、ＤＮＡシーケンシング等により確認することができる。例えば、得られた増幅産物は、ＤＮＡシーケンサー等の適切な機器で分析してもよい。また、例えば、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを用いて行ってもよく、この方法によれば、アガロースゲル電気泳動により目視で判断できない数塩基の差異も確認することができる。既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物としては、例えば北海２４０号又は北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を用いることができる。
【0043】
本開示の他の一側面は、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、以下の（８）：
（８）（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
を含むプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の塩基の多型に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法である。上述したように、これらのプライマーセットに含まれるプライマーは、ＣＡＰｓマーカー（ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅマーカー）である。すなわち、コムギ属植物から得られたサンプルについて該プライマーセットを用いたＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡにおける遺伝子の多型から、コムギ縞萎縮病抵抗性を判定することができ、遺伝子の多型は、例えばフラグメント解析、ＤＮＡシーケンシング又はｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ法等により検出することができる。遺伝子の多型からコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する際には、例えばコムギ属植物から得られたサンプルについて該プライマーセットを用いたＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡを制限酵素処理した際のＤＮＡ断片の長さが、既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物から得られたサンプルにおいて同様の処理をした場合のＤＮＡ断片の長さと一致する場合に、該コムギ属植物がコムギ縞萎縮病抵抗性であると判定することができる。すなわち、一実施形態において、（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の塩基の多型に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程が、
（ＩＩ－１）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを制限酵素処理すること、及び
（ＩＩ－２）制限酵素処理により得られたＤＮＡ断片の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定すること
を含んでもよい。ＤＮＡ断片の長さは、当業者が通常行う方法により評価することができ、例えばＤＮＡ断片の分子量をその指標としてもよく、ＤＮＡ断片の分子量の指標としては、例えばアガロースゲル電気泳動における泳動距離を用いることができ、またＤＮＡシーケンシングにより測定することもできる。コムギ縞萎縮病抵抗性であると判定される場合における長さが一致するＤＮＡ断片の数は、例えば１つであってよく、２つであってもよく、２つ以上であってもよく、３つ以上であってもよい。既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物としては、例えば北海２４０号又は北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を用いることができる。制限酵素としては、例えばＢｓｍＦＩ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＦＩ）、ＢｓｉＹＩ、ＭｎｌＩ、ＢｓｃＧＩ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＦｉｎＩ及びＨｇａＩ等を用いることができ、好ましくはＢｓｍＦＩである。
（Ｉ）コムギ属植物のＤＮＡにおいて、以下の（８）：
（８）（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー；
を含むプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程、及び
（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の塩基の多型に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程
を含む、方法である。上述したように、これらのプライマーセットに含まれるプライマーは、ＣＡＰｓマーカー（ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅマーカー）である。すなわち、コムギ属植物から得られたサンプルについて該プライマーセットを用いたＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡにおける遺伝子の多型から、コムギ縞萎縮病抵抗性を判定することができ、遺伝子の多型は、例えばフラグメント解析、ＤＮＡシーケンシング又はｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ法等により検出することができる。遺伝子の多型からコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する際には、例えばコムギ属植物から得られたサンプルについて該プライマーセットを用いたＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡを制限酵素処理した際のＤＮＡ断片の長さが、既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物から得られたサンプルにおいて同様の処理をした場合のＤＮＡ断片の長さと一致する場合に、該コムギ属植物がコムギ縞萎縮病抵抗性であると判定することができる。すなわち、一実施形態において、（ＩＩ）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ領域の塩基の多型に基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程が、
（ＩＩ－１）ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを制限酵素処理すること、及び
（ＩＩ－２）制限酵素処理により得られたＤＮＡ断片の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定すること
を含んでもよい。ＤＮＡ断片の長さは、当業者が通常行う方法により評価することができ、例えばＤＮＡ断片の分子量をその指標としてもよく、ＤＮＡ断片の分子量の指標としては、例えばアガロースゲル電気泳動における泳動距離を用いることができ、またＤＮＡシーケンシングにより測定することもできる。コムギ縞萎縮病抵抗性であると判定される場合における長さが一致するＤＮＡ断片の数は、例えば１つであってよく、２つであってもよく、２つ以上であってもよく、３つ以上であってもよい。既知のコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物としては、例えば北海２４０号又は北海２４０号に由来するコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を用いることができる。制限酵素としては、例えばＢｓｍＦＩ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＦＩ）、ＢｓｉＹＩ、ＭｎｌＩ、ＢｓｃＧＩ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＦｉｎＩ及びＨｇａＩ等を用いることができ、好ましくはＢｓｍＦＩである。
【0044】
本開示の他の一側面は、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法であって、コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物における配列番号１７に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物における対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、コムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程を含む、方法、である。この場合、コムギ属植物のゲノムＤＮＡにおいて、コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物のゲノムＤＮＡにおける配列番号１７に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡの遺伝子型が、コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物のゲノムＤＮＡと一致する場合には、該コムギ属植物はコムギ縞萎縮病罹病性と判定され、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物のゲノムＤＮＡと一致する場合には、該コムギ属植物はコムギ縞萎縮病抵抗性と判定される。一実施形態においては、コムギ属植物のゲノムＤＮＡにおいて、コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物のゲノムＤＮＡにおける配列番号１７に記載の塩基配列の１１３番目、２３９番目、２８４番目、３０５番目及び／又は３０６番目に対応する塩基の多型が、コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物のゲノムＤＮＡにおける多型と一致する場合には、該コムギ属植物はコムギ縞萎縮病罹病性と判定され、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物のゲノムＤＮＡにおける多型と一致する場合には、該コムギ属植物はコムギ縞萎縮病抵抗性と判定される。特定の一実施形態においては、コムギ属植物のゲノムＤＮＡにおいて、コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物のゲノムＤＮＡにおける配列番号１７に記載の塩基配列の１１３番目に対応する塩基がアデニンである場合、２３９番目に対応する塩基がシトシンである場合、２８４番目に対応する塩基がシトシンである場合、３０５番目に対応する塩基がシトシンである場合、及び／又は３０６番目に対応する塩基がシトシンである場合には、該コムギ属植物はコムギ縞萎縮病罹病性と判定され、コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物のゲノムＤＮＡにおける配列番号１７に記載の塩基配列の１１３番目のアデニンが欠失している場合、２３９番目のシトシンがアデニンとなっている場合、２８４番目のシトシンがグアニンとなっている場合、３０５番目のシトシンがアデニンとなっている場合、及び／又は３０６番目のシトシンがチミンとなっている場合には、該コムギ属植物はコムギ縞萎縮病抵抗性と判定される。本明細書において「対応するゲノムＤＮＡ」とは、通常同じ染色体の同じ遺伝子座に存在するゲノムＤＮＡを意味し、例えば、配列番号１７に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡは、配列番号１７を挟み込むように設計したプライマーのセットを用いたＰＣＲにより増幅することができる。一実施形態において、上記コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物は北海２４０号であってよく、上記コムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程の前に、（ｉ）配列番号１５の塩基配列からなるプライマー若しくは配列番号１５の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマー、及び（ｉｉ）配列番号１６の塩基配列を含むプライマー若しくは配列番号１６の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチドからなるプライマーを含むプライマーセットを用いてＤＮＡの一部領域をＰＣＲで増幅する工程を含んでよい。また一実施形態において、コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物における配列番号１７に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物における対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型の検出は、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを制限酵素処理すること及び制限酵素処理により得られたＤＮＡ断片の長さに基づいてコムギ縞萎縮病抵抗性を判定することを含んでもよい。コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物（例えばナンブコムギ）における配列番号１７に記載の塩基配列からなるゲノムＤＮＡに対応するゲノムＤＮＡと、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物（例えば北海２４０号）における対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの間には、複数の塩基の多型が存在することから、これらの少なくとも１つを検出可能な方法を用いて遺伝子の多型を検出することにより、コムギ縞萎縮病抵抗性を判定することができる。遺伝子の多型は、例えばフラグメント解析、ＤＮＡシーケンシング又はｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ法等により検出することができる。
【0045】
配列番号１７：ＴＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＣＣＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＡＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＧＣＧＴＴＡＣＣＡＣＧＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＡＴＧＡＴＡＴＡＣＴＡＴＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＣＧＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧＣＣＧＧＴＣＴＣＴＴＴＣＧＣＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＣＧＴＣＣＡＡＣＣＣＣＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＴＣＡＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＡＣＣＧＡＡＣＣＡＣＣＡＴＡＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＧＧＴＣＣＣＣＧＣＧＡＣＴＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＴＧＡＴＣＣＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＧＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＧＡＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＧＣＴＣＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＴＣＧＣＴＣＧＣＴＴＧＣＴＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＡＡＴＧＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＧＧＡＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＴＴＧＡＡＣＴＣＡＧＧＴＧＡＧＣＴＣＧＣＧＡＡＴＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡＧＡＴＡＴＴＡＧＴＣＧＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＴＴＧＧＡＡ
【0046】
これらのコムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法におけるＤＮＡの抽出に用いられるコムギ属植物の器官等の部分、ＤＮＡ抽出の方法、プライマーセット、ＰＣＲ法及びコムギ属植物等は、本開示の一側面に係るプライマーセットにおいて説明したものと同様のものを用いることができる。
【0047】
本開示の他の一側面は、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を作出する方法であって、本開示の一側面に係るコムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する方法を用いて上記コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定する工程を含む、方法である。コムギ属植物を作出する方法は、さらに、コムギ縞萎縮病抵抗性と判定されたコムギ属植物を選抜することを含んでもよい。判定する対象であるコムギ属植物は、交配後代コムギ属植物であってよく、北海２４０号又は北海２４０号に由来するコムギ属植物の交配後代コムギ属植物を片親又は両親とするコムギ属植物であってもよい。交配後代コムギ属植物は、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を片親又は両親として交配することにより得られた雑種第１代（Ｆ１）であってもよく、さらなる交配により得られた雑種第２代（Ｆ２）以降の植物、例えば、Ｆ３、Ｆ４であってもよく、例えば、Ｆ１を両親のいずれかのコムギ属植物と戻し交雑をした第１代（ＢＣ１）であってもよく、さらに戻し交雑をした第２代（ＢＣ２）以降の植物であってもよい。
【0048】
コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を作出する方法は、例えば、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物とコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を交配することを含んでもよく、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物とコムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物を交配することを含んでもよい。コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物及びコムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物としては、既にコムギ縞萎縮病抵抗性であることが明らかとなっている品種を用いてもよいし、本開示の一側面に係るコムギ縞萎縮病抵抗性の判定方法によりコムギ縞萎縮病抵抗性を判定したコムギ属植物を用いてもよい。また、選抜した後、さらに交配をしてもよい。例えば、より優れた形質を有する交配後代植物を得るために、例えば、近親交配、戻し交雑及び連続戻し交雑等を行ってもよい。例えば、選抜したコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物をさらにコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物又はコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物と交配してもよい。
【0049】
本開示の一側面に係るコムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物を作出する方法により、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物及びその種子を得ることができる。
【実施例0050】
以下、本開示を実施例に基づきより具体的に説明する。ただし、本開示は以下の実施例に限定されるものではない。
【0051】
［参考例１：圃場試験における、ナンブコムギ及び北海２４０号のＩＩＩ型コムギ縞萎縮病に対する抵抗性］
ＩＩＩ型コムギ縞萎縮病に汚染された圃場においてナンブコムギ、北海２４０号及び対象品種を栽培し、達観による病徴程度から抵抗性を検討した。
ＩＩＩ型コムギ縞萎縮病に汚染された圃場においてナンブコムギ、北海２４０号及び対象品種を栽培し、達観による病徴程度から抵抗性を検討した。
【0052】
非特許文献１においてＩＩＩ型コムギ縞萎縮病に対して罹病性品種に分類されたナンブコムギ及び北海２４０号、並びに罹病性対象品種である農林６１号、シロガネコムギ、イワイノダイチ及びチクゴイズミの種子を、ＩＩＩ型コムギ縞萎縮病に汚染された圃場（福岡県柳川市）に１条１０粒を１区画として１１月に播種し、翌年３月の発病調査に供試した。
【0053】
圃場において、達観により、各品種のコムギ縞萎縮病への罹病に由来すると認められる病徴の程度を評価した。評価は以下に示す発病指数（ＤＩ）を用いて行い、ナンブコムギについて２から５区画、北海２４０号について２から３区画、罹病性対象品種については２から４区画で評価した。３月に３度達観調査を実施し、そのうちの最高値を各区のＤＩとし、その平均値を算出した。結果を表１に示す。
【0054】
発病指数（ＤＩ）
６：１区画すべての個体が枯死
５：１区間で一部個体が枯死
４：病徴が激しく、明らかに生育が抑制
３：植物体全体で病徴が観察
２：縞萎縮病に特徴的な症状を確認（葉の明らかな黄化やかすり状の斑点など）
１：葉がわずかに黄化
０：生育異常なし
６：１区画すべての個体が枯死
５：１区間で一部個体が枯死
４：病徴が激しく、明らかに生育が抑制
３：植物体全体で病徴が観察
２：縞萎縮病に特徴的な症状を確認（葉の明らかな黄化やかすり状の斑点など）
１：葉がわずかに黄化
０：生育異常なし
【0055】
【表1】
【0056】
結果として、ナンブコムギについては罹病性対象品種と同程度にＩＩＩ型コムギ縞萎縮病への罹病に由来すると認められる顕著な病徴が認められた一方で、北海２４０号については病徴の程度が小さくなり、非特許文献１において両者ともにＩＩＩ型コムギ縞萎縮病罹病性品種に分類されたことと一致しなかった。この原因としては、非特許文献１における試験（接種試験）と参考例１における試験（圃場試験）の間では、試験方法が異なることが考えられる。すなわち、参考例１の試験の結果から、北海２４０号がＩＩＩ型コムギ縞萎縮病感染性の圃場においてＩＩＩ型コムギ縞萎縮病に対して抵抗性であるという新規の知見が見出された。
【0057】
［参考例２：圃場試験における、ナンブコムギ及び北海２４０号のＩＩ型コムギ縞萎縮病に対する抵抗性］
ＩＩ型コムギ縞萎縮病に汚染された圃場においてナンブコムギ、北海２４０号及び対象品種を栽培し、ＥＬＩＳＡ法により抵抗性を検討した。
ＩＩ型コムギ縞萎縮病に汚染された圃場においてナンブコムギ、北海２４０号及び対象品種を栽培し、ＥＬＩＳＡ法により抵抗性を検討した。
【0058】
非特許文献１においてＩＩ型コムギ縞萎縮病に対して罹病性品種に分類されたナンブコムギ及び抵抗性品種に分類された北海２４０号、罹病性対象品種であるホクシン（北見６６号）及びきたほなみ並びに抵抗性対象品種であるゆめちから及びゆめちから２０２０の種子を、ＩＩ型コムギ縞萎縮ウイルスに汚染された圃場（北海道伊達市・帯広市）に１０月上旬に播種し、翌年４月に発病調査に供試した。
【0059】
各区画において、３個体のコムギの地上部から葉を採取し、生重の約４０倍量のＴＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５ｖ／ｖ％含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４））を加えて乳鉢ですりつぶした（ＥＬＩＳＡ被検液）。９６ウェルプレートの各ウェルに、γ－グロブリン濃度基準で０．５μｇ／ｍＬのＷＹＭＶ抗体を含有する溶液（ＷＹＭＶ抗体液）を１ウェルあたり２００μＬずつ添加し、３７℃で２時間静置した。ＷＹＭＶ抗体液を除去し、ＴＰＢＳで３回洗浄した。各ウェルに、ＥＬＩＳＡ被検液を２００μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置した。ＥＬＩＳＡ被検液を除去し、ＴＰＢＳで３回洗浄した。γ－グロブリン濃度基準で１μｇ／ｍＬの、アルカリンホスファターゼ標識されたＷＹＭＶ抗体を含有する溶液（標識ＷＹＭＶ抗体液）を１ウェルあたり２００μＬずつ添加し、３７℃で２時間静置した。ＷＹＭＶ抗体液を除去し、ＴＰＢＳで３回洗浄した。各ウェルに、ｐ－ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを１ｍｇ／ｍＬ含有する１０ｖ／ｖ％ジエタノールアミン水溶液（基質液）を２００μＬずつ添加し、室温で２時間静置した。マイクロウェルプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ＰＲＯ Ｍ）を用いて、各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【0060】
抵抗性の質的な評価として、ＥＬＩＳＡ被検液を用いて上述した測定を行った場合の吸光度が、滅菌土壌で栽培したコムギ地上部の葉を用いて上述した測定を行った場合の吸光度が４倍以上の場合には、ＥＬＩＳＡ被検液の調製に使用した葉を採取した区画に含まれるコムギがコムギ縞萎縮病に感染している、４倍未満である場合には感染していないとし、各品種における感染した区画の数についてのプロット（感染プロット数）を作成した。結果を図１に示す。
【0061】
また、抵抗性の量的な評価として、ＥＬＩＳＡ被検液を用いて上述した測定を行った場合の吸光度を、同量のＴＰＢＳを用いて上述した測定を行った場合の吸光度で除した値をＥＬＩＳＡ値とし、各品種におけるＥＬＩＳＡ値をナンブコムギ及び北海２４０号ではｎ＝６－８、対象品種ではｎ＝４について算出し、その平均値を算出した。結果を表２に示す。
【0062】
【表2】
【0063】
結果として、ナンブコムギは罹病性対象品種と同様に感染に分類される感染プロットを与え、かつＥＬＩＳＡ値が高くなった一方で、北海２４０号は抵抗性対象品種と同様に感染に分類される感染プロットを与えず、かつＥＬＩＳＡ値が低くなったことから、ＩＩ型コムギ縞萎縮病感染性の圃場において、ナンブコムギはＩＩ型コムギ縞萎縮病罹病性、北海２４０号はＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性であることが示された。
【0064】
［参考例３：ＱＴＬ解析による、コムギ縞萎縮病抵抗性に関与する染色体領域の特定］
ナンブコムギ及び北海２４０号の葉の約５０ｍｇから、文献（Murray MG,Thompson WF, Nucleic Acids Research, 8, 4321－4326 (1980)）記載の方法（ＣＴＡＢ法）により、ＤＮＡを抽出した。非特許文献４において、ナンブコムギと北海２４０号との間で多型が得られた４８０個のＤＮＡマーカーを選抜し、非特許文献５に記載の方法によってアンプリコンシークエンス反応を実施した。
ナンブコムギ及び北海２４０号の葉の約５０ｍｇから、文献（Murray MG,Thompson WF, Nucleic Acids Research, 8, 4321－4326 (1980)）記載の方法（ＣＴＡＢ法）により、ＤＮＡを抽出した。非特許文献４において、ナンブコムギと北海２４０号との間で多型が得られた４８０個のＤＮＡマーカーを選抜し、非特許文献５に記載の方法によってアンプリコンシークエンス反応を実施した。
【0065】
シーケンシング解析結果と、参考例１及び２の結果に基づき、遺伝子連鎖解析ソフトウェアＪｏｉｎＭａｐ４．０(Van Ooijen, J. W., and R. E. Voorrips. "JoinMap Version4.0." Software for the calculation of genetic linkage maps. Kyazma BV,Wageningen (2006).)を用いて連鎖地図を作成し、ＭａｐＱＴＬ（登録商標）６（VanOoijen, J. W., "MapQTL6" Software for the mapping of quantitativetrait loci in experimental populations of diploid species. Kyazma BV,Wageningen (2009).）を用いてＱＴＬを検出した。連鎖地図の作成にあたっては、ＤＮＡマーカーのうち、分離にゆがみがあるものや、欠損が多いマーカーについてはＱＴＬ検出対象から削除した。２Ａ染色体における結果を図２ｂ及び表３に示す。図２ｂにおいて、ＬＯＤ（ｌｏｇａｒｉｔｈｍ ｏｆ ｏｄｄｓ）とは、抵抗性遺伝子との連鎖を仮定した場合の尤度と、連鎖していないと仮定した場合の尤度の比の常用対数であり、一般にＬＯＤが３．０以上（連鎖が無いと仮定した場合と比較して連鎖する確率が１０００倍以上高い）であると、信頼性の高いＱＴＬであると判断される。表３において、ＰＶＥ（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｖａｒｉａｎｃｅ ｅｘｐｌａｉｎｅｄ）とは、表現型分散のうち、ＱＴＬの効果によって生じる分散の割合（寄与率）であり、寄与率が高いほど、表現型への効果が高いＱＴＬであることを意味する。表３において、Ａｄｄｉｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔとは、顕性ホモ型と潜性ホモ型の遺伝子型値の差の半分の値を示し、顕性ホモとヘテロ型の遺伝子型値の差又はヘテロ型と潜性ホモ型の遺伝子型値の差に該当するパラメータである。なお、図２ｂに示されたＤＮＡマーカーの配列は、公知文献（Ishikawa et al., "Developing core marker sets for effectivegenomic-assisted selection in wheat and barley breeding programs", BreedingScience 72: 257－266 (2022)）において開示されている。
【0066】
なお、参考例１及び２に示した結果に加えて、参考例１の試験年が２００７年において栽培したＲＩＬｓについても、シーケンス解析結果及びＥＬＩＳＡ法による感染有無の判別結果を用いて感染プロットを作成し、ＱＴＬの検出に供した。この場合において、ＲＩＬｓの感染プロットは、後述する参考例４において得たコムギ属植物の葉を用いて、参考例２と同様の方法に従って得た基質液添加後の溶液における呈色反応に基づいて判定することによって、ＩＩＩ型コムギ縞萎縮病への感染の有無を判別し、作成した。この場合の結果を、図２ｂ及び表３に「２００７＿感染プロット」として示す。
【0067】
【表3】
【0068】
結果として、北海２４０号の２Ａ染色体上に、ＩＩ型及びＩＩＩ型の両方のコムギ縞萎縮病の抵抗性に関与する主働ＱＴＬが検出された。
【0069】
［参考例４：主働ＱＴＬ近傍のＤＮＡマーカーを用いた、コムギ属植物のＩＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性の判定］
参考例３において北海２４０号の２Ａ染色体上に見出されたコムギ縞萎縮病の抵抗性に関与する主働ＱＴＬの近傍のＤＮＡマーカーであるｓｎｐ４２１５を用いて、コムギ属植物のＩＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性を判定可能であるかを検討した。判定対象としては、参考例１においてＩＩＩ型コムギ縞萎縮病罹病性であったナンブコムギと参考例１においてＩＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性であった北海２４０号を交配することにより得られたＲＩＬｓ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ、組換え近交系）を用いた。
参考例３において北海２４０号の２Ａ染色体上に見出されたコムギ縞萎縮病の抵抗性に関与する主働ＱＴＬの近傍のＤＮＡマーカーであるｓｎｐ４２１５を用いて、コムギ属植物のＩＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性を判定可能であるかを検討した。判定対象としては、参考例１においてＩＩＩ型コムギ縞萎縮病罹病性であったナンブコムギと参考例１においてＩＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性であった北海２４０号を交配することにより得られたＲＩＬｓ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ、組換え近交系）を用いた。
【0070】
ナンブコムギと北海２４０号の交配種子からＦ２集団を作出した。その後の世代では個体から１粒のみを採種し、世代を促進する単粒法（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｅｅｄ Ｄｅｓｃｅｎｔ法、ＳＳＤ法）により、Ｆ６～Ｆ１１集団として、ＲＩＬｓを作出した。
【0071】
得られたＲＩＬｓの種子を、参考例１と同様の方法により播種し、４カ月後に達観により発病程度（ＤＩ）を系統ごとに決定した。参考例３において、コムギ縞萎縮病の抵抗性に関与する主働ＱＴＬの近傍のＤＮＡマーカーとして見出されたｓｎｐ４２１５（配列番号１８、１９）を用いて判別された遺伝子型ごとに、達観による発病程度（ＤＩ）をヒストグラムとして表した結果を図３に示す。
【0072】
ｓｎｐ４２１５
配列番号１８：ＧＡＡＣＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＧＧＧＴ（フォワードプライマー）
配列番号１９：ＡＡＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＧＴＴ（リバースプライマー）
配列番号１８：ＧＡＡＣＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＧＧＧＴ（フォワードプライマー）
配列番号１９：ＡＡＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＧＴＴ（リバースプライマー）
【0073】
結果として、ｓｎｐ４２１５がナンブコムギ型であった系統においては発病程度（ＤＩ）の値が大きく、ＩＩＩ型コムギ縞萎縮病に罹病しやすい傾向があったのに対し、北海２４０号型であった系統においては発病程度（ＤＩ）の値が小さく、ＩＩＩ型コムギ縞萎縮病に罹病しづらい、すなわちＩＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性を示すことが明らかとなった。
【0074】
［参考例５：主働ＱＴＬ近傍のＤＮＡマーカーを用いた、コムギ属植物のＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性の判定］
参考例３において北海２４０号の２Ａ染色体上に見出されたコムギ縞萎縮病の抵抗性に関与する主働ＱＴＬの近傍のＤＮＡマーカーであるｓｎｐ４２１５を用いて、コムギ属植物のＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性を判定可能であるかを検討した。判定対象としては、参考例１においてＩＩ型コムギ縞萎縮病罹病性であったナンブコムギと参考例１においてＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性であった北海２４０号を交配することにより得られたＲＩＬｓ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ、組換え近交系）を用いた。
参考例３において北海２４０号の２Ａ染色体上に見出されたコムギ縞萎縮病の抵抗性に関与する主働ＱＴＬの近傍のＤＮＡマーカーであるｓｎｐ４２１５を用いて、コムギ属植物のＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性を判定可能であるかを検討した。判定対象としては、参考例１においてＩＩ型コムギ縞萎縮病罹病性であったナンブコムギと参考例１においてＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性であった北海２４０号を交配することにより得られたＲＩＬｓ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅｓ、組換え近交系）を用いた。
【0075】
参考例４と同様の方法により得られたＲＩＬｓの種子を、参考例２と同様の方法により播種し、５カ月後にＥＬＩＳＡを行ってＥＬＩＳＡ値を算出した。参考例３においてｓｎｐ４２１５（配列番号１８、１９）を用いて判別された遺伝子型ごとに、ＥＬＩＳＡ値を箱ひげ図として表した結果を、図４に示す。図中、＊＊＊は、スチューデントのｔ検定において、ｐ値が０．００１未満であったことを示す。
【0076】
結果として、ｓｎｐ４２１５を用いた判別により遺伝子型がナンブコムギ型であると判別された系統においてはＥＬＩＳＡ値が大きく、ＩＩ型コムギ縞萎縮病に罹病しやすい傾向があったのに対し、遺伝子型が北海２４０号型であると判別された系統においてはＥＬＩＳＡ値が小さく、ＩＩ型コムギ縞萎縮病に罹病しづらい、すなわちＩＩ型コムギ縞萎縮病抵抗性を示すことが明らかとなった。
【0077】
［参考例６：既報のマーカーを用いた、２Ａ染色体のコムギ縞萎縮病抵抗性原因遺伝子の存在領域の絞り込み］
コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーを設計するために、既報のマーカーにおける遺伝子型の判別結果とコムギ縞萎縮病抵抗性／罹病性の相関関係から、２Ａ染色体上のコムギ縞萎縮病抵抗性原因遺伝子の存在領域の絞り込みを行った。
コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーを設計するために、既報のマーカーにおける遺伝子型の判別結果とコムギ縞萎縮病抵抗性／罹病性の相関関係から、２Ａ染色体上のコムギ縞萎縮病抵抗性原因遺伝子の存在領域の絞り込みを行った。
【0078】
参考例３において北海２４０号の２Ａ染色体上に見出されたコムギ縞萎縮病の抵抗性に関与する主働ＱＴＬの近傍のＤＮＡマーカー５種類（ｔａｒｃ０４９７、ｓｎｐ４２１５、ｓｎｐ４２１２、ｔａｒｃ０４９３、ｔａｒｃ１６８５）及びｔａｒｃ０４９７とｓｎｐ４２１５の間の領域に対応する既報のＤＮＡマーカーＸｃｆａ２２０１（配列番号２０、２１）の計６種類のマーカーを用いて、ナンブコムギ、北海２４０号及び参考例５においてＥＬＩＳＡ値を測定したＲＩＬｓの１５系統について、それぞれの遺伝子型がナンブコムギ型又は北海２４０号型のいずれであるかを判別し、参考例５において測定したＥＬＩＳＡ値から決定される各ＲＩＬｓのコムギ縞萎縮病抵抗性／罹病性との相関関係を調べた。各ＲＩＬｓのコムギ縞萎縮病抵抗性／罹病性については、２０１７年及び２０１８年の測定から算出したＥＬＩＳＡ値のうち、少なくとも片方の年におけるＥＬＩＳＡ値が３．０以上であるＲＩＬｓを、罹病性であるとした。結果を図５に示す。
【0079】
Ｘｃｆａ２２０１
配列番号２０：ＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＴＣＡＴＴＧＡＣＣＣ（フォワードプライマー）
配列番号２１：ＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＧ（リバースプライマー）
配列番号２０：ＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＴＣＡＴＴＧＡＣＣＣ（フォワードプライマー）
配列番号２１：ＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＧ（リバースプライマー）
【0080】
結果として、ｓｎｐ４２１５及びｓｎｐ４２１２において北海２４０号型の遺伝子型を有すると判別されたＲＩＬｓ８種類のうち７種類においてコムギ縞萎縮病抵抗性を示し、かつナンブコムギ型の遺伝子型を有する判別されたＲＩＬｓ７種類全てにおいてコムギ縞萎縮病罹病性を示したのに対し、その上流のマーカーであるＸｃｆａ２２０１及び下流のマーカーであるｔａｒｃ０４９３においてはそのような相関は見られなかったことから、コムギ属植物の２Ａ染色体上のコムギ縞萎縮病抵抗性原因遺伝子は、Ｘｃｆａ２２０１により増幅される領域とｔａｒｃ０４９３により増幅される領域の間に存在することが明らかとなった。
【0081】
［実施例１：コムギ属植物の２Ａ染色体上のコムギ縞萎縮病抵抗性に関与する共分離領域の特定と、優性マーカー及び共優性マーカーの開発］
参考例６においてｓｎｐ４２１５及びｓｎｐ４２１２を用いてナンブコムギ型の遺伝子型を有すると判別されたがコムギ縞萎縮病罹病性を示したＲＩＬｓであるＮＨＲＩＬｓ－０１５において、ｓｎｐ４２１２及びその上流のマーカーを用いると北海２４０号型の遺伝子型を有すると判別される一方で、ｔａｒｃ０４９３及びその下流のマーカーを用いるとナンブコムギ型の遺伝子型を有すると判別される点を踏まえると、コムギ属植物の２Ａ染色体上のコムギ縞萎縮病抵抗性の原因遺伝子は、ｓｎｐ４２１２により増幅される領域とｔａｒｃ０４９３により増幅される領域の間の領域に存在すると考えられる。そこで、該領域に対応するＤＮＡマーカーを複数開発し、コムギ縞萎縮病抵抗性／罹病性との相関関係を調べるとともに、共分離領域（ＤＮＡマーカーによる遺伝子型の判別結果と、表現型の罹病性／抵抗性が一致するゲノムＤＮＡ領域）の特定を試みた。
参考例６においてｓｎｐ４２１５及びｓｎｐ４２１２を用いてナンブコムギ型の遺伝子型を有すると判別されたがコムギ縞萎縮病罹病性を示したＲＩＬｓであるＮＨＲＩＬｓ－０１５において、ｓｎｐ４２１２及びその上流のマーカーを用いると北海２４０号型の遺伝子型を有すると判別される一方で、ｔａｒｃ０４９３及びその下流のマーカーを用いるとナンブコムギ型の遺伝子型を有すると判別される点を踏まえると、コムギ属植物の２Ａ染色体上のコムギ縞萎縮病抵抗性の原因遺伝子は、ｓｎｐ４２１２により増幅される領域とｔａｒｃ０４９３により増幅される領域の間の領域に存在すると考えられる。そこで、該領域に対応するＤＮＡマーカーを複数開発し、コムギ縞萎縮病抵抗性／罹病性との相関関係を調べるとともに、共分離領域（ＤＮＡマーカーによる遺伝子型の判別結果と、表現型の罹病性／抵抗性が一致するゲノムＤＮＡ領域）の特定を試みた。
【0082】
ｓｎｐ４２１２により増幅される領域とｔａｒｃ０４９３により増幅される領域の間の領域に対応するＤＮＡマーカーとして、上流から順にＮＨＫ４（優性マーカー、配列番号１，２）、ＮＨＫ７５（共優性マーカー、配列番号９，１０）、ＮＨＫ７６（優性マーカー、配列番号３，４）、ＮＨＫ７７（優性マーカー、配列番号５，６）、ＮＨＫ８５（優性マーカー、配列番号７，８）、ＮＨＫ１１４（共優性マーカー、配列番号１１，１２）及びＮＨＫ１３７（共優性マーカー、配列番号１３，１４）の計７種類のマーカーを設計及び開発した。設計及び開発は、プライマーデザインに使用可能な既報（Lianming Du et al., " Krait: an ultrafast tool for genome-wide survey of microsatellitesand primer design", Bioinformatics 34 (4): 681-683 (2018).）のソフトウェアＫｒａｉｔを用いて、コムギ属植物のリファレンスゲノムであるＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇ）のレファレンスゲノム（ＩＷＧＳＣ ＲｅｆＳｅｑ ｖ２．０）の２Ａ染色体上のＳＳＲ領域を探索し、発見された各ＳＳＲを増幅するプライマーをＫｒａｉｔを用いて設計することにより行った。開発したプライマーを用いて、ＰＣＲによってＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、滅菌水８．２μＬ、ｇｏｔａｑ ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（プロメガ社製）１０．０μＬ、プライマーセットに含まれる各々のプライマーの１０μＭ溶液の０．４μＬずつ並びに増幅対象のＤＮＡを含む滅菌水１．０μＬの合計２０μＬを、まず９４℃で３分間インキュベートし、続いて５４～６０℃と７２℃で１分間ずつ交互にインキュベートするサイクルを３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で５分間インキュベートすることにより行った。参考例６と同様の方法により、各ＲＩＬｓにおける各ＤＮＡマーカーによる遺伝子型を判別し、遺伝子型と、コムギ縞萎縮病抵抗性／罹病性の相関関係について調べた。結果を図６に示す。
【0083】
結果として、ＮＨＫ７５、ＮＨＫ７６、ＮＨＫ７７、ＮＨＫ８５及びＮＨＫ１１４において、北海２４０号型の遺伝子型を有すると判別されたＲＩＬｓ８種類全ておいてコムギ縞萎縮病抵抗性を示し、かつナンブコムギ型の遺伝子型を有すると判別されたＲＩＬｓ７種類全てにおいてコムギ縞萎縮病罹病性を示したのに対し、ＮＨＫ４及びＮＨＫ１３７においてはそのような相関関係は見られなかった。よって、共分離領域が特定され、コムギ属植物の２Ａ染色体上のコムギ縞萎縮病抵抗性の原因遺伝子は、ＮＨＫ４により増幅される領域とＮＨＫ１３７により増幅される長さ１．５Ｍｂｐの領域の間の領域に存在することが明らかとなった。特定された共分離領域からアノテーションすることにより、以下の表４に示す候補遺伝子が特定された。表４においては、上が上流、下が下流である。
【0084】
【表4】
【0085】
また、開発した７つのＤＮＡマーカーについて着目すると、各マーカーにより「北海２４０号型の遺伝子型を有すると判別する」ことを「抵抗性と判定する」こと、「ナンブコムギ型の遺伝子型を有すると判別する」ことを「罹病性と判定する」こととした場合、コムギ縞萎縮病罹病性のＲＩＬｓ８系統及び抵抗性の７系統の合計１５系統のうち、ＮＨＫ７５、ＮＨＫ７６、ＮＨＫ７７、ＮＨＫ８５及びＮＨＫ１１４においては１５系統（１００％）で、ＮＨＫ４では１４系統（９３％）で、ＮＨＫ１３７においては１３系統（８７％）でコムギ縞萎縮病抵抗性／罹病性を正しく判定することができたことから、開発した７つのＤＮＡマーカーは、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットに含まれるマーカーとして利用可能であることが示された。
【0086】
［実施例２：優性マーカー及び共優性マーカーを用いたコムギ縞萎縮病抵抗性の判定］
実施例１で開発した７種類のマーカーを用いて、北海２４０号とナンブコムギとを交配して参考例１と同様の方法で作出したＲＩＬｓについて、実施例１と同様の方法によりサンプル調製及びＤＮＡの増幅をした後に、３％アガロースゲルを用いて常法によりゲル電気泳動及び染色することによって、泳動パターンからコムギ縞萎縮病抵抗性の判定が可能であるかを検討した。ＮＨＫ４（優性マーカー、配列番号１，２）の結果を図７に示す。ＮＨＫ７５（共優性マーカー、配列番号９，１０）の結果を図８に示す。ＮＨＫ７６（優性マーカー、配列番号３，４）の結果を図９に示す。ＮＨＫ７７（優性マーカー、配列番号５，６）の結果を図１０に示す。ＮＨＫ８５（優性マーカー、配列番号７，８）の結果を図１１に示す。ＮＨＫ１１４（共優性マーカー、配列番号１１，１２）の結果を図１２に示す。ＮＨＫ１３７（共優性マーカー、配列番号１３，１４）結果を図１３に示す。図中において、Ｎとして示された２つのレーンがナンブコムギ、Ｈとして示された２つのレーンが北海２４０号であり、その他のレーンがＲＩＬｓ（又は分子量マーカー）である。
実施例１で開発した７種類のマーカーを用いて、北海２４０号とナンブコムギとを交配して参考例１と同様の方法で作出したＲＩＬｓについて、実施例１と同様の方法によりサンプル調製及びＤＮＡの増幅をした後に、３％アガロースゲルを用いて常法によりゲル電気泳動及び染色することによって、泳動パターンからコムギ縞萎縮病抵抗性の判定が可能であるかを検討した。ＮＨＫ４（優性マーカー、配列番号１，２）の結果を図７に示す。ＮＨＫ７５（共優性マーカー、配列番号９，１０）の結果を図８に示す。ＮＨＫ７６（優性マーカー、配列番号３，４）の結果を図９に示す。ＮＨＫ７７（優性マーカー、配列番号５，６）の結果を図１０に示す。ＮＨＫ８５（優性マーカー、配列番号７，８）の結果を図１１に示す。ＮＨＫ１１４（共優性マーカー、配列番号１１，１２）の結果を図１２に示す。ＮＨＫ１３７（共優性マーカー、配列番号１３，１４）結果を図１３に示す。図中において、Ｎとして示された２つのレーンがナンブコムギ、Ｈとして示された２つのレーンが北海２４０号であり、その他のレーンがＲＩＬｓ（又は分子量マーカー）である。
【0087】
結果として、全てのマーカーにおいて、全てのＲＩＬｓがナンブコムギに一致するパターンか、北海２４０号に一致するパターンのいずれかに明確に弁別可能であったことから、実施例１で開発した７つのＤＮＡマーカーは、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットに含まれるマーカーとして利用可能であることが示された。
【0088】
［実施例３：ＣＡＰＳマーカーの設計及び、設計したマーカーを用いたゲノムＤＮＡにおけるヌクレオチドの塩基の多型の検出］
実施例１において見出した共分離領域に含まれる表４に示した遺伝子のうち、ｍＲＮＡ＿１３．１（Ｐｒｏｂａｂｌｅ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａｔ３ｇ５６０５０）及びｍＲＮＡ＿１３．２（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＤＬ１）は、糸状菌病やウイルス病等の病害の抵抗性に関連する遺伝子であることが報告されている。そこで、これらの遺伝子において、北海２４０号とナンブコムギとの間に遺伝子の多型が見られるかを検討した。検討に当たっては、実施例１と同様の方法によって、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｓｐｒｉｎｇのリファレンスゲノムを元に、遺伝子の全長を包括して増幅が可能なプライマーセットを開発した。開発したプライマーセットを用いて、ＰＣＲによってＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、滅菌水３３μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製、ＫＯＤ－４Ｂ）５．０μＬ、２ｍＭのｄＴＮＰ溶液（東洋紡社製、ＮＴＰ－２０１）５．０μＬ、２５ｍＭの硫酸マグネシウム水溶液３．０μＬ、Ｋｏｄ－ｐｌｕｓ－ｎｅｏ(東洋紡社製）１．０μＬ、プライマーセットに含まれる各々のプライマーの１０μＭ溶液の１．０μＬずつ並びに増幅対象のＤＮＡを含む滅菌水１．０μＬの合計５０μＬを、まず９４℃で２分間インキュベートし、続いて９８℃で１０秒間と７４℃で５分間とで交互にインキュベートするサイクルを５サイクル繰り返し、続いて９８℃で１０秒間と７２℃で５分間とで交互にインキュベートするサイクルを５サイクル繰り返し、続いて９８℃で１０秒間と７０℃で５分間とで交互にインキュベートするサイクルを５サイクル繰り返し、最後に９８℃で１０秒間と６８℃で５分間とで交互にインキュベートするサイクルを２０サイクル繰り返すことにより行った。得られた増幅産物をフォーキングシークエンスに供した。なお、フォーキングシーケンスは、ＦＡＳＭＡＣ社のＤＮＡシーケンス解析 Ｐｒｅｍｉｘ２解析サービスによって行われた。結果を図１４に示す。図中、０８８８００－Ｎはナンブコムギの遺伝子、０８８８００－Ｈは北海２４０号の遺伝子をそれぞれ表し、０８８８００－Ｈにおける「・」は、そのＤＮＡにおける塩基が０８８８００－Ｎにおける対応するゲノムＤＮＡに含まれる塩基と同一であることを表し、０８８８００－Ｈにおける「－」は、その真上に位置する０８８８００－Ｎにおける塩基が、０８８８００－Ｈにおいては欠失していたことを表す。結果として、５箇所に遺伝子の多型が観測された。具体的には、北海２４０号の遺伝子において、ナンブコムギの遺伝子における配列番号１７に記載の塩基配列の１１３番目のアデニンに対応する塩基が欠失し、２３９番目のシトシンに対応する塩基がアデニンになっており、２８４番目のシトシンに対応する塩基がグアニンになっており、３０５番目のシトシンに対応する塩基がアデニンになっており、かつ、３０６番目のシトシンに対応する塩基がチミンになっていた。したがって、図１４に示したナンブコムギ（コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物）の染色体の一部領域におけるゲノムＤＮＡ、すなわち以下に示す配列番号１７のゲノムＤＮＡと、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物における対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、コムギ縞萎縮病抵抗性を判定できることが強く示唆された。
実施例１において見出した共分離領域に含まれる表４に示した遺伝子のうち、ｍＲＮＡ＿１３．１（Ｐｒｏｂａｂｌｅ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａｔ３ｇ５６０５０）及びｍＲＮＡ＿１３．２（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＤＬ１）は、糸状菌病やウイルス病等の病害の抵抗性に関連する遺伝子であることが報告されている。そこで、これらの遺伝子において、北海２４０号とナンブコムギとの間に遺伝子の多型が見られるかを検討した。検討に当たっては、実施例１と同様の方法によって、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｓｐｒｉｎｇのリファレンスゲノムを元に、遺伝子の全長を包括して増幅が可能なプライマーセットを開発した。開発したプライマーセットを用いて、ＰＣＲによってＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、滅菌水３３μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡社製、ＫＯＤ－４Ｂ）５．０μＬ、２ｍＭのｄＴＮＰ溶液（東洋紡社製、ＮＴＰ－２０１）５．０μＬ、２５ｍＭの硫酸マグネシウム水溶液３．０μＬ、Ｋｏｄ－ｐｌｕｓ－ｎｅｏ(東洋紡社製）１．０μＬ、プライマーセットに含まれる各々のプライマーの１０μＭ溶液の１．０μＬずつ並びに増幅対象のＤＮＡを含む滅菌水１．０μＬの合計５０μＬを、まず９４℃で２分間インキュベートし、続いて９８℃で１０秒間と７４℃で５分間とで交互にインキュベートするサイクルを５サイクル繰り返し、続いて９８℃で１０秒間と７２℃で５分間とで交互にインキュベートするサイクルを５サイクル繰り返し、続いて９８℃で１０秒間と７０℃で５分間とで交互にインキュベートするサイクルを５サイクル繰り返し、最後に９８℃で１０秒間と６８℃で５分間とで交互にインキュベートするサイクルを２０サイクル繰り返すことにより行った。得られた増幅産物をフォーキングシークエンスに供した。なお、フォーキングシーケンスは、ＦＡＳＭＡＣ社のＤＮＡシーケンス解析 Ｐｒｅｍｉｘ２解析サービスによって行われた。結果を図１４に示す。図中、０８８８００－Ｎはナンブコムギの遺伝子、０８８８００－Ｈは北海２４０号の遺伝子をそれぞれ表し、０８８８００－Ｈにおける「・」は、そのＤＮＡにおける塩基が０８８８００－Ｎにおける対応するゲノムＤＮＡに含まれる塩基と同一であることを表し、０８８８００－Ｈにおける「－」は、その真上に位置する０８８８００－Ｎにおける塩基が、０８８８００－Ｈにおいては欠失していたことを表す。結果として、５箇所に遺伝子の多型が観測された。具体的には、北海２４０号の遺伝子において、ナンブコムギの遺伝子における配列番号１７に記載の塩基配列の１１３番目のアデニンに対応する塩基が欠失し、２３９番目のシトシンに対応する塩基がアデニンになっており、２８４番目のシトシンに対応する塩基がグアニンになっており、３０５番目のシトシンに対応する塩基がアデニンになっており、かつ、３０６番目のシトシンに対応する塩基がチミンになっていた。したがって、図１４に示したナンブコムギ（コムギ縞萎縮病罹病性のコムギ属植物）の染色体の一部領域におけるゲノムＤＮＡ、すなわち以下に示す配列番号１７のゲノムＤＮＡと、コムギ縞萎縮病抵抗性のコムギ属植物における対応するゲノムＤＮＡ間のヌクレオチドの塩基の多型に基づいて、コムギ縞萎縮病抵抗性を判定できることが強く示唆された。
【0089】
配列番号１７：ＴＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＣＣＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＡＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＡＧＣＧＴＴＡＣＣＡＣＧＴＣＡＡＧＣＣＴＴＴＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＡＴＧＡＴＡＴＡＣＴＡＴＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＣＧＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧＣＣＧＧＴＣＴＣＴＴＴＣＧＣＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＣＧＴＣＣＡＡＣＣＣＣＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＴＣＡＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＣＡＣＣＧＡＡＣＣＡＣＣＡＴＡＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＧＧＴＣＣＣＣＧＣＧＡＣＴＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣＧＴＧＡＴＣＣＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＧＡＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＧＡＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＣＣＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＧＣＴＣＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＴＣＧＣＴＣＧＣＴＴＧＣＴＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＧＣＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＡＡＴＧＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＧＧＡＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＴＴＧＡＡＣＴＣＡＧＧＴＧＡＧＣＴＣＧＣＧＡＡＴＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＡＧＡＴＡＴＴＡＧＴＣＧＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＴＴＧＧＡＡ
【0090】
続いて、上述した配列番号１７における変異を検出するＣＡＰｓマーカーとして、配列番号１８及び１９に示すプライマーを設計及び開発した。設計及び開発は、ｄＣＡＰｓｆｉｎｄｅｒ（Neff MM, Turk E and Kalishman M, "Web-based Primer Design forSingle Nucleotide Polymorphism Analysis." Trends in Genetics 18, 613-615(2002).）によってマーカーを作成する位置を特定し、その領域を増幅可能なマーカーをＰｒｉｍｅｒｂｌａｓｔ（アメリカ国立衛生研究所）を用いて作成した。開発したＣＡＰｓマーカーを用いて、ナンブコムギ、北海２４０号及びそのＲＩＬｓ３系統から参考例３と同様の方法によりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、滅菌水８．０μＬにｇｏｔａｑ ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（プロメガ社製）１０．０μＬ、配列番号１８及び１９のプライマーの１０μＭ溶液を０．５μＬずつ並びに増幅対象のＤＮＡを含む滅菌水１．０μＬの合計２０μＬを、まず９４℃で４分間インキュベートし、続いて９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７２℃で２分間インキュベートするサイクルを３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で５分間インキュベートすることにより行った。得られた増幅されたＤＮＡを含有する溶液５μＬに、ＣｕｔＳｍａｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ（１０Ｘ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ社製）１．０μＬ、ＢｓｍＦＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）０．２μＬ及び滅菌水３．８μＬを添加した合計１０μＬの溶液を６５℃で一晩インキュベートすることにより、制限酵素処理した後、３％アガロースゲルを用いた常法によりゲル電気泳動及び染色することによって、泳動パターンからコムギ縞萎縮病抵抗性の判定が可能であるかを検討した。結果を図１５に示す。
【0091】
結果として、ナンブコムギ及び北海２４０号は互いに異なった泳動パターンを与え、かつ全てのＲＩＬｓはそのいずれかと一致する泳動パターンを与えたことから、開発したＣＡＰｓマーカーを用いて、配列番号１７に示したゲノムＤＮＡにおけるヌクレオチドの塩基の多型を検出可能であることが示された。
【0092】
［実施例４：ＣＡＰｓマーカーを用いたコムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性の判定］
実施例１において試験した１５種類のＲＩＬｓについて、実施例３と同様の方法により、それぞれの遺伝子型がナンブコムギ型又は北海２４０号型のいずれであるかを判別した。実施例１の結果と合わせて表した結果を図１６に示す。なお、図１６に示すように、配列番号１８及び１９で示されるＣＡＰｓマーカーにおいて増幅される領域は、ＮＨＫ４の下流かつＮＨＫ７５の上流に位置する。
実施例１において試験した１５種類のＲＩＬｓについて、実施例３と同様の方法により、それぞれの遺伝子型がナンブコムギ型又は北海２４０号型のいずれであるかを判別した。実施例１の結果と合わせて表した結果を図１６に示す。なお、図１６に示すように、配列番号１８及び１９で示されるＣＡＰｓマーカーにおいて増幅される領域は、ＮＨＫ４の下流かつＮＨＫ７５の上流に位置する。
【0093】
結果として、「北海２４０号型の遺伝子型を有すると判別する」ことを「抵抗性と判定する」こと、「ナンブコムギ型の遺伝子型を有すると判別する」ことを「罹病性と判定する」こととした場合、コムギ縞萎縮病罹病性のＲＩＬｓ８系統及び抵抗性の７系統の合計１５系統のうち、１４系統（９３％）において縞萎縮病抵抗性／罹病性を正しく判定することができたことから、開発したＣＡＰｓマーカーは、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性を判定するためのプライマーセットに含まれるマーカーとして利用可能であることが示された。
【0094】
他方で、参考例６において、ｓｎｐ４２１２及びその上流のマーカーを用いると北海２４０号型の遺伝子型を有すると判別される一方で、ｔａｒｃ０４９３及びその下流のマーカーを用いるとナンブコムギ型の遺伝子型を有すると判別されるＲＩＬｓであるＮＨＲＩＬｓ－０１５においては、開発したＣＡＰｓマーカーを用いてもナンブコムギ型の遺伝子型を有する、すなわちコムギ縞萎縮病罹病性であると判定されてしまった（実際には抵抗性）。よって、ＣＡＰｓマーカーの開発において着目したｍＲＮＡ＿１３．１（Ｐｒｏｂａｂｌｅ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａｔ３ｇ５６０５０）及びｍＲＮＡ＿１３．２（Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＤＬ１）は、コムギ属植物のコムギ縞萎縮病抵抗性に関与する２Ａ染色体上の原因遺伝子ではなく、原因遺伝子はこれらよりもさらに下流の領域（長さ６３９ｋｂｐ）に存在することが明らかとなった。該領域に存在するその他の病害関連遺伝子としてはｍＲＮＡ＿１４．１（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｅ１ ２）、ｍＲＮＡ＿１８．１（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｌｐｈａ）、ｍＲＮＡ＿１９．１（Ｈｅａｔ ｓｔｒｅｓｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ａ－２ｂ）、ｍＲＮＡ＿２０．１（ＡＢＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びｍＲＮＡ＿２４．１（ＣＡＳＰ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４Ｂ１）を挙げることができ、これらに対するＣＡＰｓマーカー又はＳＳＲマーカー等のＤＮＡマーカーを設計・開発することにより、より高い確率でコムギ縞萎縮病抵抗性／罹病性を正しく判定することができるプライマーセットを開発できると考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】