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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024126404
(43)【公開日】2024-09-20
(54)【発明の名称】タンパク質を蛍光標識する方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/13 20060101AFI20240912BHJP
【ＦＩ】
C07K1/13 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023034762
(22)【出願日】2023-03-07
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和４年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業「持続可能な標識法による時間無制限オルガネラ動態イメージング」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】蓑島 維文
(72)【発明者】
【氏名】飯嶋 航平
(72)【発明者】
【氏名】レジャ、シャヒ、イマーム
(72)【発明者】
【氏名】菊地 和也
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA70
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA50
4H045FA52
(57)【要約】 （修正有）
【課題】光褪色の影響を抑制した、タンパク質を蛍光標識する方法を提供する。
【解決手段】タンパク質を蛍光標識する方法であって、標識対象であるタンパク質には標識用タグが結合されており、前記標識用タグが結合されたタンパク質とプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記標識用タグと前記プローブが解離定数０．１～１００μＭの強度で結合して前記タンパク質を蛍光標識することを含む方法であり、前記標識用タグは、ＯＢＰ（Odorant binding protein）またはＯＢＰ変異体であり、前記プローブは、下記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩である、タンパク質を蛍光標識する方法。
【選択図】なし
【解決手段】タンパク質を蛍光標識する方法であって、標識対象であるタンパク質には標識用タグが結合されており、前記標識用タグが結合されたタンパク質とプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記標識用タグと前記プローブが解離定数０．１～１００μＭの強度で結合して前記タンパク質を蛍光標識することを含む方法であり、前記標識用タグは、ＯＢＰ（Odorant binding protein）またはＯＢＰ変異体であり、前記プローブは、下記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩である、タンパク質を蛍光標識する方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象であるタンパク質には標識用タグが結合されており、
前記標識用タグが結合されたタンパク質とプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記標識用タグと前記プローブが解離定数０．１～１００μＭの強度で結合して前記タンパク質を蛍光標識することを含む方法であり、
前記標識用タグは、ＯＢＰ（Odorant binding protein）またはＯＢＰ変異体であり、
前記プローブは、下記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩である、タンパク質を蛍光標識する方法。
式中、Ｒは、以下の式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）であり、
（なお、式中、＊は結合位置を表す）
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
であり（Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して炭素数１～６のアルキル基である）、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
標識対象であるタンパク質には標識用タグが結合されており、
前記標識用タグが結合されたタンパク質とプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記標識用タグと前記プローブが解離定数０．１～１００μＭの強度で結合して前記タンパク質を蛍光標識することを含む方法であり、
前記標識用タグは、ＯＢＰ（Odorant binding protein）またはＯＢＰ変異体であり、
前記プローブは、下記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩である、タンパク質を蛍光標識する方法。
【化48】
【化49】
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
【化50】
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
【請求項2】
前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体のアミノ酸配列が、
１）配列表の配列番号４０～４２で表されるアミノ酸配列、
２）配列表の配列番号３８で表されるアミノ酸配列において、第２番目から第１５番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合するアミノ酸配列である、及び
３）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合するアミノ酸配列からなる群から選択される一つである、請求項１記載のタンパク質を蛍光標識する方法。
１）配列表の配列番号４０～４２で表されるアミノ酸配列、
２）配列表の配列番号３８で表されるアミノ酸配列において、第２番目から第１５番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合するアミノ酸配列である、及び
３）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合するアミノ酸配列からなる群から選択される一つである、請求項１記載のタンパク質を蛍光標識する方法。
【請求項3】
前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を得ることが、
前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、
前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を発現可能なプラスミドもしくはベクターを得ること、
細胞内で前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を発現させること、または、発現した前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を単離することを含む、
請求項１に記載のタンパク質を蛍光標識する方法。
前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、
前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を発現可能なプラスミドもしくはベクターを得ること、
細胞内で前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を発現させること、または、発現した前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を単離することを含む、
請求項１に記載のタンパク質を蛍光標識する方法。
【請求項4】
式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩を含む、請求項１～３のいずれかの方法に用いるための組成物。
式中、Ｒは、以下の式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）であり、
（なお、式中、＊は結合位置を表す）
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
であり（Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して炭素数１～６のアルキル基である）、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
【化51】
【化52】
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
【化53】
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
【請求項5】
請求項４に記載の組成物と、プラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キットであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記標識用タグは、ＯＢＰ（Odorant binding protein）もしくはＯＢＰ変異体であり、
前記プラスミドまたはベクターは、
１）標識対象であるタンパク質を発現させるための塩基配列、および
２－１）配列表の配列番号６、配列番号２２または配列番号３２で表される塩基配列、
２－２）配列表の配列番号３９で表される塩基配列において、第１番目から第４５番目の塩基が欠失した塩基配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合する塩基配列であるか、または
２－３）上記１）または２）の塩基配列のいずれかの塩基配列の１～数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合する塩基配列
を含むプラスミドまたはベクターであるキット。
式中、Ｒは、以下の式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）であり、
（なお、式中、＊は結合位置を表す）
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
であり（Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して炭素数１～６のアルキル基である）、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
前記プラスミドまたはベクターは、標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記標識用タグは、ＯＢＰ（Odorant binding protein）もしくはＯＢＰ変異体であり、
前記プラスミドまたはベクターは、
１）標識対象であるタンパク質を発現させるための塩基配列、および
２－１）配列表の配列番号６、配列番号２２または配列番号３２で表される塩基配列、
２－２）配列表の配列番号３９で表される塩基配列において、第１番目から第４５番目の塩基が欠失した塩基配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合する塩基配列であるか、または
２－３）上記１）または２）の塩基配列のいずれかの塩基配列の１～数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合する塩基配列
を含むプラスミドまたはベクターであるキット。
【化54】
【化55】
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
【化56】
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
【請求項6】
式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩。
式中、Ｒは、以下の式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）であり、
（なお、式中、＊は結合位置を表す）
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
であり（Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して炭素数１～６のアルキル基である）、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
【化57】
【化58】
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
【化59】
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質を蛍光標識する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質の蛍光標識法は細胞イメージングなどの実験と組み合わせ、タンパク質の局在、発現、動態を観察するために有用なツールである。とりわけ、近年は個々のタンパク質の挙動を直接観察できる１分子イメージングや、細胞内の微細構造を明らかにする超解像イメージングといった顕微鏡技術の進歩と組み合わせさらに広がりを見せている。
【0003】
従来のタンパク質の蛍光標識法として、緑色蛍光タンパク質（GFP）に代表される蛍光タンパク質を用いた方法（非特許文献１）が広く用いられている。これは遺伝子工学的手法を使い、見たいタンパク質と融合遺伝子を作って発現させることで蛍光標識するものである。また、化学合成された蛍光色素を反応性のアミノ酸残基、あるいはタグタンパク質を介して共有結合によって標識する手法（非特許文献２、非特許文献３）も知られている。しかしながら、１分子・超解像イメージングに使う顕微鏡においては高輝度のレーザー光照射を用いるため、これらの標識法において、イメージング中の光褪色が近年の課題となっている。光褪色は蛍光色素が励起後、酸素等の分子と反応して光らない物質へと変換されることで起こるとされており、高輝度のレーザー照射下では蛍光タンパク質では数秒、蛍光色素でも数分のうちに褪色が起こる。上記の標識法は見たいタンパク質に対して不可逆的に標識するため、一度褪色した色素からは蛍光シグナルを得ることはできない。
【0004】
近年、非共有結合を使った標識法はいくつかのグループから報告されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。
【0005】
例えば、ＰＤＢ：５Ｊ７４の標識化合物として以下の化合物が報告されている（非特許文献３）。この標識化合物は、Ｋｄが３８ｎＭであり、タンパク質と結合した標識化合物の入れ替わりの速度が遅いという欠点がある。
【0006】
【化1】
【0007】
また、ＰＤＢ：７ＡＶＢの標識化合物として以下の化合物が報告されている（非特許文献４）。この標識化合物がＫｄが１３０ｎＭであるが、標識化合物の光安定性が低いという欠点がある。
【0008】
【化2】
【0009】
すなわち、イメージング中の光褪色の影響を抑制する方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】R.Y. Tsien, Annu. Rev. Biochem., 1998, 67, 509.
【非特許文献2】G.V. Los, et al. ACS Chem. Biol. 2008, 3, 373
【非特許文献3】A. Keppler, et al. Nat. Biotechnol. 2003, 21, 86.
【非特許文献4】C. Szent-Gyorgyi et al. Nat. Biotechnol., 2008, 26, 235.
【非特許文献5】M.-A. Plamont et al. PNAS., 2015, 113, 497.
【非特許文献6】N.G. Bozhanova, et al. Chem. Sci. 2017, 8, 7138.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
そこで、本発明は、光褪色の影響を抑制した、タンパク質を蛍光標識する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、タンパク質を可逆的に標識することにより、光褪色の影響を抑制することを見出した。すなわち、タンパク質に標識用タグを付しておき、プローブとその標識用タグを結合させることにより、蛍光標識させる。また、プローブとその標識用タグの結合が可逆的かつ速く交換が起こることにより、褪色した結合プローブは結合していないプローブと入れ替わるため、見かけ上の蛍光標識状態は保たれる。その結果、光褪色の影響を抑制することが可能である。この方法では、標識用タグとプローブの結合および解離の速度が速いこと、標識用タグとプローブの結合時に蛍光強度が上昇すること、およびプローブ自体の光安定性が高いことが必要である。
【0013】
本発明においては、前記標識用タグとして、匂い分子結合タンパク質（Ｏｄｏｒａｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＯＢＰ）及びその変異体を用いた。また、プローブとして、特定の化合物を選択した。これらのプローブは、水溶液中では蛍光を発光しないが、標識用タグと結合することにより強度の強い蛍光を発する。また、この蛍光は標識用タグであるＯＢＰと結合後、水溶液中で高い光安定性を示す。さらに、このプローブと標識用タグの結合は、解離定数がμＭ前後であり、比較的弱く、結合および解離の速度が速い。このような特徴を組み合わせることにより、本発明者らは、光褪色の影響を抑制した、タンパク質を蛍光標識する方法を完成した。
【0014】
本発明は、
タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象であるタンパク質には標識用タグが結合されており、
前記標識用タグが結合されたタンパク質とプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記標識用タグと前記プローブが解離定数０．１～１００μＭの強度で結合して前記タンパク質を蛍光標識することを含む方法であり、
前記標識用タグは、ＯＢＰ（Odorant binding protein）またはＯＢＰ変異体であり、
前記プローブは、下記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩である、タンパク質を蛍光標識する方法である。
タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象であるタンパク質には標識用タグが結合されており、
前記標識用タグが結合されたタンパク質とプローブまたはその塩とを反応させることにより、前記標識用タグと前記プローブが解離定数０．１～１００μＭの強度で結合して前記タンパク質を蛍光標識することを含む方法であり、
前記標識用タグは、ＯＢＰ（Odorant binding protein）またはＯＢＰ変異体であり、
前記プローブは、下記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩である、タンパク質を蛍光標識する方法である。
【0015】
【化3】
【0016】
式中、Ｒは、以下の式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）であり、
【0017】
【化4】
【0018】
（なお、式中、＊は結合位置を表す）
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
【0019】
【化5】
【0020】
であり（Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して炭素数１～６のアルキル基である）、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
【発明の効果】
【0021】
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法は、光褪色の影響を抑制することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法で用いるプローブは、単独で水溶液中に存在しても、蛍光を発しない。しかしそのプローブが前記標識用タグと結合すると、大幅に蛍光を発する。本発明のタンパク質を蛍光標識する方法においては、前記標識用タグと前記プローブが解離定数０．１～１００μＭの強度で結合するため、結合が比較的弱く、かつ結合速度および解離速度が速い。そのため、前記標識用タグと結合する前記プローブが素早く入れ替わり、蛍光を発し続けることができる。その結果、光褪色の影響を抑制しつつ、長時間、蛍光を発し続けることができる。
【0024】
ＯＢＰ（Ｏｄｏｒａｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＯＢＰ）は、匂い分子結合タンパク質である。また、このＯＢＰは、１７０のアミノ酸残基（配列表の配列番号３８）により構成されており、比較的小さな（１９ｋＤａ）タンパク質である。このＯＢＰの２９，６２、８２，１０８番目のアルギニン残基およびリシン残基がプローブとの結合ポケットの入り口である。
【0025】
ＯＢＰのアミノ酸配列としては、例えば、ヒト由来のＯＢＰのアミノ酸配列、すなわち、配列表の配列番号３８で表されるアミノ酸配列が挙げられる。ＯＢＰのアミノ酸配列としては、他の由来を有するものでもよく、ＮＣＢＩＧｅｎｅ／Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｍＲＮＡ）／Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｓｅに記載のアミノ酸配列を利用してもよい。
【0026】
ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列としては、ＯＢＰのアミノ酸配列のうち、アミノ酸のいずれか１～１０個を別のアミノ酸に置き換えたもの、ＯＢＰのアミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列の、いずれか１～１０個を別のアミノ酸に置き換えたものが挙げられる。ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列としては、例えば、ヒト由来のＯＢＰアミノ酸配列、すなわち、配列表の配列番号３８で表されるアミノ酸配列の第２番目から第１５番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列のシステイン（Ｃｙｓ）のいずれか１～３個をセリン（Ｓｅｒ）に、リシン（Ｌｙｓ）のいずれか１～３個をアスパラギン（Ａｓｎ）に置き換えた、アミノ酸配列が挙げられる。具体的には、ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列としては、例えば、ヒト由来のＯＢＰアミノ酸配列、すなわち、配列表の配列番号３８で表されるアミノ酸配列の第２番目から第１５番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列の第９９番目のシステイン（Ｃｙｓ）をセリン（Ｓｅｒ）に、第１１２番目のリシン（Ｌｙｓ）をアスパラギン（Ａｓｎ）に置き換え、さらに先頭にメチオニン（Ｍｅｔ）を付した、ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号４０）が挙げられる。本願明細書中、これらのアミノ酸配列を、便宜的に第１世代ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列と呼ぶ。また、このアミノ酸配列から発現される変異体を、第１世代のＯＢＰ変異体と呼ぶ。
【0027】
また、ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列としては、ＯＢＰのアミノ酸配列のうち、アミノ酸のいずれか１～１０個を別のアミノ酸に置き換えたもの、ＯＢＰのアミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列の、いずれか１～１０個を別のアミノ酸に置き換えたものが挙げられる。ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列としては、例えば、ヒト由来のＯＢＰアミノ酸配列、すなわち、配列表の配列番号３８で表されるアミノ酸配列の第２番目から第１５番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列のシステイン（Ｃｙｓ）のいずれか１～３個をセリン（Ｓｅｒ）に、リシン（Ｌｙｓ）のいずれか１～３個をアスパラギン（Ａｓｎ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）に、アルギニン（Ａｒｇ）のいずれか１～３個をグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置き換えた、アミノ酸配列が挙げられる。具体的には、ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列としては、例えば、ヒト由来のＯＢＰアミノ酸配列、すなわち、配列表の配列番号３８で表されるアミノ酸配列の第２番目から第１５番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列の第９９番目のシステイン（Ｃｙｓ）をセリン（Ｓｅｒ）に、第１１２番目のリシン（Ｌｙｓ）をアスパラギン（Ａｓｎ）に、２９番目のアルギニン（Ａｒｇ）をグルタミン酸（Ｇｌｕ）に、６２番目のリシン（Ｌｙｓ）をグルタミン酸（Ｇｌｕ）に、８２番目のリシン（Ｌｙｓ）をグルタミン酸（Ｇｌｕ）に、１０８番目のアルギニン（Ａｒｇ）をグルタミン酸（Ｇｌｕ）に置き換え、さらに先頭にメチオニン（Ｍｅｔ）を付した、ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号４１）が挙げられる。本願明細書中、これらのアミノ酸配列を、便宜的に第２世代ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列と呼ぶ。また、このアミノ酸配列から発現される変異体を、第２世代のＯＢＰ変異体と呼ぶ。
【0028】
また、ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列としては、ＯＢＰのアミノ酸配列のうち、アミノ酸のいずれか１～１０個を別のアミノ酸に置き換えたもの、ＯＢＰのアミノ酸配列の一部のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列の、いずれか１～１０個を別のアミノ酸に置き換えたものが挙げられる。ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列としては、例えば、ヒト由来のＯＢＰアミノ酸配列、すなわち、配列表の配列番号３８で表されるアミノ酸配列の第２番目から第１５番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列のシステイン（Ｃｙｓ）のいずれか１～３個をセリン（Ｓｅｒ）に、リシン（Ｌｙｓ）のいずれか１～３個をアスパラギン（Ａｓｎ）に、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のいずれか１～３個をグルタミン（Ｇｌｎ）および／またはメチオニン（Ｍｅｔ）に置き換えた、アミノ酸配列が挙げられる。具体的には、配列表の配列番号３８で表されるアミノ酸配列の第２番目から第１５番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列の第９９番目のシステイン（Ｃｙｓ）をセリン（Ｓｅｒ）に、第１１２番目のリシン（Ｌｙｓ）をアスパラギン（Ａｓｎ）に、第５３番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）をグルタミン（Ｇｌｎ）に、第９７番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）をメチオニン（Ｍｅｔ）に置き換え、さらに先頭にメチオニン（Ｍｅｔ）を付した、ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号４２）が挙げられる。本願明細書中、これらのアミノ酸配列を、便宜的に第３世代ＯＢＰ変異体のアミノ酸配列と呼ぶ。また、このアミノ酸配列から発現される変異体を、第３世代のＯＢＰ変異体と呼ぶ。
【0029】
標識用タグが結合されたタンパク質は、前記のように、標識対象であるタンパク質に標識用タグが結合されている。このタンパク質と前記標識用タグは、リンカーで結合されてもよい。このリンカーとしては、グリシン、セリン等のアミノ酸０～３０個から構成されたペプチドが挙げられる。
【0030】
標識用タグが結合されたタンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得るには、標識用タグが結合されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用い、通常の方法に従い、そのようなプラスミド若しくはベクターを調製することができる。本発明において、ベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくは、標識用タグが結合されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入するためのポリヌクレオチドをいい、プラスミドを含むものをいう。なお、ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。標識用タグが結合されたタンパク質を発現可能とする配列は、当業者であれば、導入する細胞の種類に応じて適宜選択しうる。プラスミド及びベクターは、標識用タグが結合されたタンパク質の発現を調節する配列（例えば、発現誘導プロモーターや制御配列）を含んでもよい。
【0031】
細胞内で標識用タグが結合されたタンパク質を発現させるには、標識用タグが結合されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは、標識用タグが結合されたタンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを用いて、通常の方法に従って行うことができる。
【0032】
発現した標識用タグが結合されたタンパク質を単離するには、通常の方法に従って行うことができる。
【0033】
本発明の蛍光標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。
【0034】
本発明の蛍光標識する方法において、前記標識用タグが第１世代のＯＢＰ変異体の場合、
用いられる式（Ｉ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。
用いられる式（Ｉ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。
【0035】
本発明の蛍光標識する方法において、前記標識用タグが第２世代のＯＢＰ変異体の場合、
用いられる式（Ｉ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。
用いられる式（Ｉ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。
【0036】
本発明の蛍光標識する方法において、前記標識用タグが第３世代のＯＢＰ変異体の場合、
用いられる式（Ｉ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。
用いられる式（Ｉ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。
【0037】
本発明の蛍光標識する方法において用いられる式（ＩＩ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｎは、１～１２が好ましく、１～１１がより好ましい。
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｎは、１～１２が好ましく、１～１１がより好ましい。
【0038】
本発明の蛍光標識する方法において、前記標識用タグが第１世代のＯＢＰ変異体の場合、
用いられる式（ＩＩ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｎは、２～１０が好ましく、３～１０がより好ましい。
用いられる式（ＩＩ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｎは、２～１０が好ましく、３～１０がより好ましい。
【0039】
本発明の蛍光標識する方法において、前記標識用タグが第２世代のＯＢＰ変異体の場合、
用いられる式（ＩＩ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｎは、２～１０が好ましく、４～１０がより好ましい。
用いられる式（ＩＩ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｎは、２～１０が好ましく、４～１０がより好ましい。
【0040】
本発明の蛍光標識する方法において、前記標識用タグが第３世代のＯＢＰ変異体の場合、
用いられる式（ＩＩ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｎは、１～１０が好ましく、１～６がより好ましい。
用いられる式（ＩＩ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｎは、１～１０が好ましく、１～６がより好ましい。
【0041】
本発明の蛍光標識する方法において用いられる式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｍは、２～８が好ましく、３～６がより好ましい。
【0042】
本発明の蛍光標識する方法において、前記標識用タグが第１世代のＯＢＰ変異体の場合、
用いられる式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｍは、２～８が好ましく、３～６がより好ましい。
用いられる式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｍは、２～８が好ましく、３～６がより好ましい。
【0043】
本発明の蛍光標識する方法において、前記標識用タグが第２世代のＯＢＰ変異体の場合、
用いられる式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｍは、２～８が好ましく、３～６がより好ましい。
用いられる式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｍは、２～８が好ましく、３～６がより好ましい。
【0044】
本発明の蛍光標識する方法において、前記標識用タグが第３世代のＯＢＰ変異体の場合、
用いられる式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｍは、２～８が好ましく、３～６がより好ましい。
用いられる式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｍは、２～８が好ましく、３～６がより好ましい。
【0045】
式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物は、酸または塩基との塩であってもよい。そのような塩としては、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミンとの塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸との塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸との塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩が挙げられる。
【0046】
式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
【0047】
本発明の蛍光標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩は、は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよい。
【0048】
本発明の蛍光標識する方法において用いられる、前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を得ることは、例えば、
前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、
前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を発現可能なプラスミドもしくはベクターを得ること、
細胞内で前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を発現させること、または、発現した前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を単離することを含む方法により行うことができる。前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識タグをコードするポリヌクレオチド、標識対象であるタンパク質をコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、前記ポリヌクレオチドを発現可能なプラスミド若しくはベクターを調製することができる。
前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、
前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を発現可能なプラスミドもしくはベクターを得ること、
細胞内で前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を発現させること、または、発現した前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を単離することを含む方法により行うことができる。前記標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識タグをコードするポリヌクレオチド、標識対象であるタンパク質をコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、前記ポリヌクレオチドを発現可能なプラスミド若しくはベクターを調製することができる。
【0049】
本発明の蛍光標識する方法において、
前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体のアミノ酸配列は、
１）配列表の配列番号４０～４２で表されるアミノ酸配列、
２）配列表の配列番号３８で表されるアミノ酸配列において、第２番目から第１５番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合するアミノ酸配列である、及び
３）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合するアミノ酸配列からなる群から選択される一つであるのが好ましい。
前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体のアミノ酸配列は、
１）配列表の配列番号４０～４２で表されるアミノ酸配列、
２）配列表の配列番号３８で表されるアミノ酸配列において、第２番目から第１５番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合するアミノ酸配列である、及び
３）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１～数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合するアミノ酸配列からなる群から選択される一つであるのが好ましい。
【0050】
また、本発明は、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩を含む、本発明の蛍光標識する方法に用いるための組成物である。
【0051】
【化6】
【0052】
式中、Ｒは、以下の式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）であり、
【0053】
【化7】
【0054】
（なお、式中、＊は結合位置を表す）
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
【0055】
【化8】
【0056】
であり（Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して炭素数１～６のアルキル基である）、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
【0057】
また、本発明は、前記組成物と、プラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キットである。前記プラスミドまたはベクターは、標識用タグが結合された標識対象であるタンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターである。また、前記標識用タグは、ＯＢＰ（Odorant binding protein）もしくはＯＢＰ変異体である。
【0058】
前記キットにおいて、好ましくは、前記プラスミドまたはベクターは、
１）標識対象であるタンパク質を発現させるための塩基配列、および
２－１）配列表の配列番号６、配列番号２２、または配列番号３２で表される塩基配列、
２－２）配列表の配列番号３９で表される塩基配列において、第１番目から第４５番目の塩基が欠失した塩基配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合する塩基配列であるか、または
２－３）上記１）または２）の塩基配列のいずれかの塩基配列の１～数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合する塩基配列
を含むプラスミドまたはベクターである。
１）標識対象であるタンパク質を発現させるための塩基配列、および
２－１）配列表の配列番号６、配列番号２２、または配列番号３２で表される塩基配列、
２－２）配列表の配列番号３９で表される塩基配列において、第１番目から第４５番目の塩基が欠失した塩基配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合する塩基配列であるか、または
２－３）上記１）または２）の塩基配列のいずれかの塩基配列の１～数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記ＯＢＰまたはＯＢＰ変異体は、前記式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩と解離定数０．１～１００μＭの強度で結合する塩基配列
を含むプラスミドまたはベクターである。
【0059】
【化9】
【0060】
式中、Ｒは、以下の式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）であり、
【0061】
【化10】
【0062】
（なお、式中、＊は結合位置を表す）
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
【0063】
【化11】
【0064】
であり（Ｒ2およびＲ3は、互いに独立して炭素数１～６のアルキル基である）、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
【0065】
本発明の前記キットは、さらに、前記プラスミド又はベクターを導入するための宿主細胞、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。
【0066】
本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、
式（Ｉ）の化合物は、Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。
式（Ｉ）の化合物は、Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。
【0067】
本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、
式（ＩＩ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｎは、１～１２が好ましく、１～１１がより好ましい。
式（ＩＩ）の化合物は、
Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｎは、１～１２が好ましく、１～１１がより好ましい。
【0068】
本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、
式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｍは、２～８が好ましく、３～６がより好ましい。
式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｒは式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）が好ましく、式（ｉ）または式（ｉｉ）がより好ましい。Ｒが式（ｉ）、式（ｉｉ）または式（ｉｉｉ）の場合、Ｒ1は－ＮＲ2Ｒ3が好ましい。ｍは、２～８が好ましく、３～６がより好ましい。
【0069】
本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、式（Ｉ）の化合物としては、以下の化合物が好ましい。これらの好ましい式（Ｉ）の化合物は、本発明における蛍光標識する方法、組成物等においても好ましく用いられる。
【0070】
【化12】
【0071】
本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、式（ＩＩ）の化合物としては、以下の化合物が好ましい。これらの好ましい式（ＩＩ）の化合物は、本発明における蛍光標識する方法、組成物等においても好ましく用いられる。
【0072】
【化13】
【0073】
本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、式（ＩＩＩ）の化合物としては、以下の化合物が好ましい。これらの好ましい式（ＩＩＩ）の化合物は、本発明における蛍光標識する方法、組成物等においても好ましく用いられる。
【0074】
【化14】
【0075】
また、本発明は、
式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩である。
式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩である。
【0076】
【化15】
【0077】
式中、Ｒは、以下の式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）であり、
【0078】
【化16】
【0079】
（なお、式中、＊は結合位置を表す）
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
Ｒ1は、－ＮＲ2Ｒ3、－ＣＨ2ＣＯＯＨまたは
【0080】
【化17】
Ｙは、ＯまたはＳであり、
ｎは、１～１２の整数であり、
ｍは、１～８の整数である。
【0081】
式（Ｉ）の化合物としては、以下の化合物が好ましい。この好ましい式（Ｉ）の化合物は、本発明における蛍光標識する方法、組成物等においても好ましく用いられる。
【0082】
【化18】
【0083】
式（ＩＩ）の化合物としては、以下の化合物が好ましい。これらの好ましい式（ＩＩ）の化合物は、本発明における蛍光標識する方法、組成物等においても好ましく用いられる。
【0084】
【化19】
【0085】
式（ＩＩＩ）の化合物としては、以下の化合物が好ましい。これらの好ましい式（ＩＩＩ）の化合物は、本発明における蛍光標識する方法、組成物等においても好ましく用いられる。
【0086】
【化20】
【0087】
式（Ｉ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、購入してもよい。
【0088】
式（ＩＩ）の化合物は、例えば、下記スキームに従い、製造することができる。なお、出発原料である式（ＩＶ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、購入してもよい。
【0089】
【化21】
【0090】
例えば、式（Ｉ）の化合物と、式（ＩＶ）の化合物との縮合反応は、従来公知の縮合剤を用いて行うことができる。縮合剤としては、例えば、カルボジイミド系、イミダゾール系、トリアジン系、ホスホニウム系、ウロニウム系、ハロニウム系などが知られている。カルボジイミド系縮合剤としては、１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－３－エチルカルボジイミド（ＥＤＣＩ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などが挙げられる。前記イミダゾール系縮合剤としては、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１，１’－カルボニルジ（１，２，４－トリアゾール）（ＣＤＴ）などが挙げられる。前記トリアジン系縮合剤としては、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ－ＭＭ）などが挙げられる。ホスホニウム系縮合剤としては、１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＢＯＰ）、１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＰｙＢＯＰ）などが挙げられる。ウロニウム系縮合剤としては、｛｛［（１－シアノ－２－エトキシー２－オキソエチリデン）アミノ］オキシ｝－４－モルホリノメチレン｝ジメチルアンモニウムヘキサンフルオロリン酸塩（ＣＯＭＵ）などが挙げられる。ハロニウム系縮合剤としては、２－クロロ－１，３－ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＣＩＰ）が挙げられる。
【0091】
式（ＩＩＩ）の化合物は、例えば、下記スキームに従い、製造することができる。なお、出発原料である式（Ｖ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、購入してもよい。
【0092】
【化22】
【0093】
例えば、式（Ｉ）の化合物と、式（Ｖ）の化合物との縮合反応は、従来公知の縮合剤を用いて行うことができる。縮合剤としては、前記式（Ｉ）の化合物と、式（ＩＶ）の化合物との縮合反応と同様のものを用いることができる。
【0094】
［実施例］
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＰｙＢＯＰ：ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＨＡＴＵ：１－（（ジメチルアミノ）（ジメチルイミノ）メチル）－１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－オキシド ヘキサフルオロホスフェート
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＰｙＢＯＰ：ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＨＡＴＵ：１－（（ジメチルアミノ）（ジメチルイミノ）メチル）－１Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－オキシド ヘキサフルオロホスフェート
【0095】
＜実施例＞
試薬は、入手できる最も高いグレードのものであり、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、およびシグマ－アルドリッチジャパン株式会社から購入したものを精製せずに用いた。
試薬は、入手できる最も高いグレードのものであり、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、およびシグマ－アルドリッチジャパン株式会社から購入したものを精製せずに用いた。
【0096】
フラッシュカラムクロマトグラフィーはＩｓｏｒｅｌａ Ｏｎｅ（（株）バイオタージ・ジャパン製）ＮＭＲスペクトルは、1Ｈ－ＮＭＲ用には５００ＭＨｚで、13Ｃ－ＮＭＲ用には１２５ＭＨｚで、テトラメチルシランを内部標準として用い、AVANCE III HD 500装置（（株）ブルカージャパン製）で測定した。質量スペクトル（ESI）は、Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ－Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ（（株）日本ウォーターズ製）、およびＪＥＯＬ ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＰ（（株）日本電子製）で測定した。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）は、ＪＥＯＬ ＪＭＳ－ＤＸ３０３（（株）日本電子製）で測定した。吸収スペクトルは、Ｖ－６５０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（（株）日本分光製）を用いて測定した。蛍光スペクトルは、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ－７０００（(株)日立ハイテク製）を用いて測定した。
【0097】
＜実施例１：式（２）の化合物の製造＞
【0098】
【化23】
【0099】
フレームドライ、窒素置換した５０ｍＬ三ツ口ナスフラスコに式（１）の化合物（J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 12360-12365に従い製造した。５０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（７３ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（４９μＬ，０．２８ｍｍｏｌ），及びN,N-ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）－メタノール（５ｍＬ）を氷浴上で加え、１時間撹拌した。その後、６－アミノヘキサン酸（１８ｍｇ, ０.１４ｍｍｏｌ）を加えた。溶媒を留去、乾燥後、得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸含有アセトニトリル）により精製し、式（２）の化合物を２３.５ｍｇ（０．０６８ｍｍｏｌ，収率４９％）で得た。
【0100】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.83 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 8.73 (s, 1H), 7.46 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.68 (q, J = 2.5 Hz, J = 9.0 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 2.5 Hz 1H), 3.43 (q, J = 7.0 Hz, J = 13.0 Hz, 2H), 3.11 (s, 6H), 2.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.66-1.32 (broad, 10H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 177.4, 163.0, 162.7, 157.1, 154.4, 148.2, 130.8, 110.9, 110.1, 108.7, 97.0, 40.2, 39.6, 33.7, 29.3, 28.8, 28.7, 26.7, 24.5.
HRMS (ESI+) [M+H]+, 計算値375.1914, 測定値375.1922。
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 177.4, 163.0, 162.7, 157.1, 154.4, 148.2, 130.8, 110.9, 110.1, 108.7, 97.0, 40.2, 39.6, 33.7, 29.3, 28.8, 28.7, 26.7, 24.5.
HRMS (ESI+) [M+H]+, 計算値375.1914, 測定値375.1922。
【0101】
＜実施例２：式（３）の化合物の製造＞
【0102】
【化24】
【0103】
フレームドライ、窒素置換した５０ｍＬ三ツ口ナスフラスコに式（１）の化合物（４０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（８８ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ），N,N-ジイソプロピルエチルアミン（５９μＬ，０．３４ｍｍｏｌ），及びメタノール（１５ｍＬ）を氷浴上で加え、１時間撹拌した。その後、８－アミノオクタン酸（３２ｍｇ, ０.２０ｍｍｏｌ）を加えた。溶媒を留去、乾燥後、得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸含有アセトニトリル）により精製し、式（３）の化合物を１５．４ｍｇ（０．０４１ｍｍｏｌ，収率２４％）で得た。
【0104】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.83 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 8.73 (s, 1H), 7.46 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.68 (q, J = 2.5 Hz, J = 9.0 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 2.5 Hz 1H), 3.43 (q, J = 7.0 Hz, J = 13.0 Hz, 2H), 3.11 (s, 6H), 2.35 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.66-1.32 (broad, 10H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 177.4, 163.0, 162.7, 157.1, 154.4, 148.2, 130.8, 110.9, 110.1, 108.7, 97.0, 40.2, 39.6, 33.7, 29.3, 28.8, 28.7, 26.7, 24.5.
HRMS (ESI+) [M+H]+, 計算値375.1914, 測定値 375.1922。
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 177.4, 163.0, 162.7, 157.1, 154.4, 148.2, 130.8, 110.9, 110.1, 108.7, 97.0, 40.2, 39.6, 33.7, 29.3, 28.8, 28.7, 26.7, 24.5.
HRMS (ESI+) [M+H]+, 計算値375.1914, 測定値 375.1922。
【0105】
＜実施例３：式（４）の化合物の製造＞
【0106】
【化25】
【0107】
フレームドライ、窒素置換した５０ｍＬ三ツ口ナスフラスコに式（１）の化合物（４５ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（９８．１ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ），N,N-ジイソプロピルエチルアミン（６６μＬ，０．３８ｍｍｏｌ），及びメタノール（１８ｍＬ）を氷浴上で加え、１時間撹拌した。その後、１０－アミノデカン酸（４３．２ｍｇ, ０.２３ｍｍｏｌ）を加えた。溶媒を留去、乾燥後、得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸含有アセトニトリル）により精製し、式（４）の化合物を９．１ｍｇ（０．０２３ｍｍｏｌ，収率１２％）で得た。
【0108】
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 8.84 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 8.74 (s, 1H), 7.46 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.68 (q, J = 2.5 Hz, J = 9.0 Hz, 1H), 6.51 (d, J = 2.5 Hz 1H), 3.43 (q, J = 7.0 Hz, J = 13.0 Hz, 2H), 3.12 (s, 6H),2.34 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.67-1.31 (broad, 14H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 177.3, 163.1, 162.7, 157.2, 154.4, 148.2, 130.9, 110.8, 110.1, 108.7, 97.0, 40.2, 39.7, 33.7, 29.4, 29.0, 28.9, 28.8, 28.8, 26.7, 24.6.
HRMS (ESI+) [M+H]+, 計算値403.2227, 測定値403.2237。
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 177.3, 163.1, 162.7, 157.2, 154.4, 148.2, 130.9, 110.8, 110.1, 108.7, 97.0, 40.2, 39.7, 33.7, 29.4, 29.0, 28.9, 28.8, 28.8, 26.7, 24.6.
HRMS (ESI+) [M+H]+, 計算値403.2227, 測定値403.2237。
【0109】
＜実施例４：式（５）の化合物の製造＞
【化26】
【0110】
フレームドライ、窒素置換した５０ｍＬ三ツ口ナスフラスコに式（１）の化合物（５０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１０９ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ），N,N-ジイソプロピルエチルアミン（７３μＬ，０．４２ｍｍｏｌ），N,N－ジメチルホルムアミド（５ｍＬ），及びメタノール（５ｍＬ）を氷浴上で加え、１時間撹拌した。その後、１２－アミノドデカン酸（６９ｍｇ, ０.６９ｍｍｏｌ）を加えた。溶媒を留去、乾燥後、得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸含有アセトニトリル）により精製し、式（５）の化合物を１６．０ｍｇ（０．０３７ｍｍｏｌ，収率１８％）で得た。
【0111】
δ 8.83 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 8.75 (s, 1H), 7.46 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.67 (q, J = 2.5 Hz, J = 9.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 2.5 Hz 1H), 3.11 (s, 6H), 3.43 (q, J = 7.0 Hz, J = 13.0 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.66-1.25 (broad, 18H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 177.3, 163.0, 162.7, 157.2, 154.4, 148.3, 130.9, 110.9, 110.1, 108.7, 97.0, 40.2, 39.7, 33.7, 29.7, 29.5, 29.1, 29.1, 29.0, 28.8, 28.7, 26.8, 24.6.
HRMS (ESI+) [M+H]+, 計算値431.2540, 測定値431.2545。
13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 177.3, 163.0, 162.7, 157.2, 154.4, 148.3, 130.9, 110.9, 110.1, 108.7, 97.0, 40.2, 39.7, 33.7, 29.7, 29.5, 29.1, 29.1, 29.0, 28.8, 28.7, 26.8, 24.6.
HRMS (ESI+) [M+H]+, 計算値431.2540, 測定値431.2545。
【0112】
＜実施例５：式（７）の化合物の製造＞
【化27】
【0113】
フレームドライ、窒素置換した５０ｍＬ三ツ口ナスフラスコに式（６）の化合物（Asian, J. Org. Chem. 2014, 3, 1089-1096.に従い製造した。１０.０ｍｇ，０．０３５３ｍｍｏｌ），HATU（１６.０ｍｇ，０．０４２４ｍｍｏｌ），N,N-ジイソプロピルエチルアミン（１３μＬ，０．０７１ｍｍｏｌ），及びN,N-ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）を氷浴上で加え、１－１．５時間撹拌した。その後、６－アミノヘキサン酸（７．０ｍｇ, ０.０５３ｍｍｏｌ）をN,N-ジメチルホルムアミド（０．６７ｍＬ），及びメタノール（０．３３ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。溶媒を留去、乾燥後、得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％トリエチルアミン水溶液／０．１％トリエチルアミン含有アセトニトリル）により精製し、式（７）の化合物を２.８ｍｇ（０．００７１ｍｍｏｌ，収率２０％）で得た。
【0114】
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 8.84 (s,1H), 8.68 (t, J = 5.5 Hz, 1 H), 8.35 (s, 1 H), 7.88 (d, J= 9.5 Hz, 1H), 7.57 (s, 1 H), 7.29 (dd, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 3.11 (s, 6H, -N(CH3)2), 2.21 (t, J = 7 Hz, 2 H), 1.56-1.49 (m, 4 H, -CH2), 1.34-1.31 (m, 2 H, -CH2).
13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 174.9, 161.9, 161.6, 151.3, 150.9, 148.4, 138.4, 131.8, 130.8, 123.6, 116.9, 116.0, 114.7, 109.1, 104.0, 34.1, 29.3, 26.5, 24.7.
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値397.1758, 測定値 397.1764。
13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 174.9, 161.9, 161.6, 151.3, 150.9, 148.4, 138.4, 131.8, 130.8, 123.6, 116.9, 116.0, 114.7, 109.1, 104.0, 34.1, 29.3, 26.5, 24.7.
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値397.1758, 測定値 397.1764。
【0115】
＜実施例６：式（８）の化合物の製造＞
【化28】
【0116】
フレームドライ、窒素置換した５０ｍＬ三ツ口ナスフラスコに式（６）の化合物（１０.０ｍｇ，０．０３５３ｍｍｏｌ），HATU（１６.０ｍｇ，０．０４２４ｍｍｏｌ），N,N-ジイソプロピルエチルアミン（１３μＬ，０．０７１ｍｍｏｌ），及びN,N-ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）を氷浴上で加え、１－１．５時間撹拌した。その後、８－アミノオクタン酸（８．４２ｍｇ, ０.０５３ｍｍｏｌ）をN,N-ジメチルホルムアミド（０．６７ｍＬ），及びメタノール（０．３３ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。溶媒を留去、乾燥後、得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％トリエチルアミン水溶液／０．１％トリエチルアミン含有アセトニトリル）により精製し、式（８）の化合物を２.８ｍｇ（０．００６６ｍｍｏｌ，収率１４％）で得た。
【0117】
1H NMR (DMSO-d6; 500 MHz): δ 8.83 (s,1H), 8.67 (t, J = 5.5 Hz, 1 H), 8.35 (s, 1 H), 7.88 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.57 (s, 1 H), 7.29 (dd, J = 9 Hz, J = 2.5 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 2 Hz, 1H), 3.11 (s, 6H, -N(CH3)2), 2.20 (t, J = 7 Hz, 2 H), 1.56-1.49 (m, 4 H, -CH2), 1.30 (br, 6 H, -CH2).
13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 175.0, 161.9, 161.6, 151.3, 150.9, 148.4, 138.4, 131.8, 130.8, 123.6, 116.9, 116.0, 114.8, 109.1, 104.0, 34.1, 29.5, 29.0, 28.9, 26.8, 24.9.
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値425.2071, 測定値425.2069。
13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 175.0, 161.9, 161.6, 151.3, 150.9, 148.4, 138.4, 131.8, 130.8, 123.6, 116.9, 116.0, 114.8, 109.1, 104.0, 34.1, 29.5, 29.0, 28.9, 26.8, 24.9.
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値425.2071, 測定値425.2069。
【0118】
＜実施例７：式（９）の化合物の製造＞
【化29】
【0119】
フレームドライ、窒素置換した５０ｍＬ三ツ口ナスフラスコに式（６）の化合物（１０.０ｍｇ，０．０３５３ｍｍｏｌ），HATU（１６.０ｍｇ，０．０４２４ｍｍｏｌ），N,N-ジイソプロピルエチルアミン（１３μＬ，０．０７１ｍｍｏｌ），及びN,N-ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）を氷浴上で加え、１－１．５時間撹拌した。その後、１０－アミノデカン酸（１２ｍｇ, ０.０６４ｍｍｏｌ）をN,N-ジメチルホルムアミド（０．６７ｍＬ），及びメタノール（０．３３ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。溶媒を留去、乾燥後、得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％トリエチルアミン水溶液／０．１％トリエチルアミン含有アセトニトリル）により精製し、式（９）の化合物を３．１ｍｇ（０．００６８ｍｍｏｌ，収率１９％）で得た。
【0120】
1H NMR (DMSO-d6; 500 MHz): δ 8.84 (s,1H), 8.68 (t, J = 5.5 Hz, 1 H), 8.35 (s, 1 H), 7.88 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.57 (s, 1 H), 7.29 (dd, J = 9.5 Hz, J = 2.5 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 3.11 (s, 6H, -N(CH3)2), 2.13 (br, 2 H), 1.54-1.48 (m, 4 H, -CH2), 1.30-1.26 (m, 10 H, -CH2)
13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 175.0, 161.9, 161.6, 151.3, 150.9, 148.4, 138.4, 131.8, 130.8, 123.6, 116.9, 116.0, 114.7, 109.1, 104.0, 34.2, 29.5, 29.3, 29.2, 29.1, 29.0, 26.9, 25.0.
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値452.2311, 測定値452.2312。
13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 175.0, 161.9, 161.6, 151.3, 150.9, 148.4, 138.4, 131.8, 130.8, 123.6, 116.9, 116.0, 114.7, 109.1, 104.0, 34.2, 29.5, 29.3, 29.2, 29.1, 29.0, 26.9, 25.0.
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値452.2311, 測定値452.2312。
【0121】
＜実施例８：式（１０）の化合物の製造＞
【化30】
【0122】
フレームドライ、窒素置換した５０ｍＬ三ツ口ナスフラスコに式（６）の化合物（１０.０ｍｇ，０．０３５３ｍｍｏｌ），HATU（１６.０ｍｇ，０．０４２４ｍｍｏｌ），N,N-ジイソプロピルエチルアミン（１３μＬ，０．０７１ｍｍｏｌ），及びN,N-ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）を氷浴上で加え、１－１．５時間撹拌した。その後、１２－アミノドデカン酸（１１．４ｍｇ, ０.０５３ｍｍｏｌ）をN,N-ジメチルホルムアミド（０．６７ｍＬ），及びメタノール（０．３３ｍＬ）に溶解させた溶液を加えた。溶媒を留去、乾燥後、得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％トリエチルアミン水溶液／０．１％トリエチルアミン含有アセトニトリル）により精製し、式（１０）の化合物を１．９ｍｇ（０．００４０ｍｍｏｌ，収率１１％）で得た。
【0123】
1H NMR (DMSO-d6; 500 MHz): δ 8.83 (s,1H), 8.67 (t, J = 5.5 Hz, 1 H), 8.35 (s, 1 H), 7.88 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.57 (s, 1 H), 7.29 (dd, J = 9.5 Hz, J = 2.5 Hz, 1H), 6.96 (d, J = 2 Hz, 1H), 3.11 (s, 6H, -N(CH3)2), 2.16 (t, J = 7 Hz, 2 H), 1.54-1.45 (m, 4 H, -CH2), 1.34-1.31 (m, 14 H, -CH2).
13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 175.0, 161.9, 161.6, 151.3, 150.9, 148.4, 138.4, 131.8, 130.8, 123.6, 116.9, 116.0, 114.7, 109.1, 104.0, 34.3, 29.5, 29.4, 29.4, 29.2, 29.2, 29.1, 26.9, 25.1.
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値480.2624, 測定値480.2622。
13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 175.0, 161.9, 161.6, 151.3, 150.9, 148.4, 138.4, 131.8, 130.8, 123.6, 116.9, 116.0, 114.7, 109.1, 104.0, 34.3, 29.5, 29.4, 29.4, 29.2, 29.2, 29.1, 26.9, 25.1.
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値480.2624, 測定値480.2622。
【0124】
＜実施例９：式（１１）の化合物の製造＞
【化31】
【0125】
フレームドライ、窒素置換した５０ｍＬ三ツ口ナスフラスコに式（６）の化合物（１０.０ｍｇ，０．０３５３ｍｍｏｌ），HATU（１６.０ｍｇ，０．０４２４ｍｍｏｌ），N,N-ジイソプロピルエチルアミン（１３μＬ，０．０７１ｍｍｏｌ），及びN,N-ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）、を氷浴上で加え、１時間撹拌した。その後、N,N-ジメチル-１,３-ジアミノプロパン（５.４１ｍｇ, ０.０５２９ｍｍｏｌ）を加えた。溶媒を留去、乾燥後、得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％トリエチルアミン水溶液／０．１％トリエチルアミン含有アセトニトリル）により精製し、式（１１）の化合物を２. ６ｍｇ（０．００７１ｍｍｏｌ，収率２０％）で得た。
【0126】
1H NMR (500 MHz, CDCL3)δ9.05(s, 1H), 8.90(s, 1H), 7.97(s, 1H), 7.78(d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.42(s, 1H), 7.14(dd, J = 9.0 Hz, J = 2.0 Hz, 1H), 6.79(d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.53(q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.15(s, 6H, a), 2.42(t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.27(s, 6H, k), 1.81(quin, J = 7.0 Hz, 2H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3)δ162.2, 162.2, 151.3, 150.5, 148.5, 138.3, 130.8, 130.3, 123.7, 116.2, 115.4, 114.8, 109.4, 103.8, 57.4, 45.3, 40.3, 38.2, 27.2.;
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値368.1968, 測定値 368.1972。
13C NMR (125 MHz, CDCl3)δ162.2, 162.2, 151.3, 150.5, 148.5, 138.3, 130.8, 130.3, 123.7, 116.2, 115.4, 114.8, 109.4, 103.8, 57.4, 45.3, 40.3, 38.2, 27.2.;
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値368.1968, 測定値 368.1972。
【0127】
＜実施例１０：式（１２）の化合物の製造＞
【化32】
【0128】
フレームドライ、窒素置換した５０ｍＬ三ツ口ナスフラスコに式（６）の化合物（１０.０ｍｇ，０．０３５３ｍｍｏｌ）、HATU（１６.０ｍｇ，０．０４２４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１３μＬ，０．０７１ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）、を氷浴上で加え、１時間撹拌した。その後、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，６－ジアミノヘキサン（ACS Chem. Neurosci. 2019, 10, 3635-3661.に従い製造した, ７．６４ｍｇ, ０.０５２９ｍｍｏｌ）を加えて３時間撹拌した。溶媒を留去、乾燥後、得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％トリエチルアミン水溶液／０．１％トリエチルアミン含有アセトニトリル）により精製し、式（１２）の化合物を２. ６ｍｇ（０．００７１ｍｍｏｌ，収率２０％）で得た。
【0129】
1H NMR (500 MHz, CDCl3)δ 9.05(s, 1H, m), 8.90(s, 1H, g), 7.97(s, 1H, e), 7.78(d, 1H, c, J = 9.0 Hz), 7.42(s, 1H, f), 7.14(dd, 1H, b, J = 9.0 Hz, J = 2.0 Hz), 6.79(d, 1H, d, J = 2.0 Hz), 3.53(q, 2H, h, J = 7.0 Hz), 3.15(s, 6H, a), 2.42(t, 2H, j, J = 7.0 Hz), 2.27(s, 6H, k), 1.81(quin, 2H, i, J = 7.0 Hz);
13C NMR (125 MHz, CDCl3)δ 162.2, 162.2, 151.3, 150.5, 148.5, 138.3, 130.8, 130.3, 123.7, 116.2, 115.4, 114.8, 109.4, 103.8, 57.4, 45.3, 40.3, 38.2, 27.2;
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値410.2443, 測定値 410.2449。
13C NMR (125 MHz, CDCl3)δ 162.2, 162.2, 151.3, 150.5, 148.5, 138.3, 130.8, 130.3, 123.7, 116.2, 115.4, 114.8, 109.4, 103.8, 57.4, 45.3, 40.3, 38.2, 27.2;
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値410.2443, 測定値 410.2449。
【0130】
＜実施例１１：式（１３）の化合物の製造＞
【0131】
【化33】
【0132】
フレームドライ、窒素置換した２０ｍＬ三ツ口ナスフラスコに式（１）の化合物（１０．０ｍｇ，０．０４２９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２５．０ｍｇ，０．０６６３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）、及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを氷浴上で加え、１時間撹拌した。その後、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，６－ジアミノヘキサン（１２．０ｍｇ，０．０８２７ｍｍｏｌ）を加えて３時間撹拌した。溶媒を留去、乾燥後、得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％トリエチルアミン水溶液／０．１％トリエチルアミン含有アセトニトリル）により精製し、式（１３）の化合物を６．０ｍｇ（０．０１７ｍｍｏｌ，収率３９％）で得た。
【0133】
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.78(t, J = 4.5 Hz, 1H), 8.73(s, 1H), 7.48(d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.70(dd, J = 9.0 Hz, Jbd = 2.0 Hz, 1H), 6.53(d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.44(q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.13(s, 6H), 2.93(t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.75(s, 6H), 1.85(m, 2H), 1.65(m, 2H),1.45 (m, 4H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3)δ 163.0 162.8 157.2 154.5 148.2 130.9 110.9 110.2 108.7 97.0 58.0 43.2 43.0 40.3 39.2 29.2 26.3 24.3;
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値360.2287, 測定値 360.2280。
13C NMR (125 MHz, CDCl3)δ 163.0 162.8 157.2 154.5 148.2 130.9 110.9 110.2 108.7 97.0 58.0 43.2 43.0 40.3 39.2 29.2 26.3 24.3;
HRMS (FAB+) [M+H]+, 計算値360.2287, 測定値 360.2280。
【0134】
＜実施例１２：式（１４）の化合物の合成＞
工程１：式（２１）の化合物の製造
工程１：式（２１）の化合物の製造
【0135】
【化34】
【0136】
３０ｍＬナスフラスコに式（２０）の化合物（Tetrahedron 2016, 72, 3232.に従い製造した。３１４ｍｇ，１.７９ｍｍｏｌ）、１８―クラウン６―エーテル（５６８ｍｇ，２．１５ｍｍｏｌ）、及び１０％ｗ/ｗ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）と１、４―ジオキサン（１０ｍＬ）（１０ｍＬ）を加え、溶液を還流させながら１２０℃で１６時間撹拌した。室温まで放冷後、氷浴上で２ＭＨＣｌ水溶液をｐＨが１になるまで加えた。有機層を酢酸エチルで抽出、水で洗浄した後に乾燥、濃縮しシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し無色固体として式（２１）の化合物を２１６ｍｇ（１.１１ｍｍｏｌ，収率６２％）で得た。
【0137】
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 13.2 (bs, 1H), 8.24 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.62 (dd, J = 7.0 Hz, 1.0 Hz, 1H), 2.75 (d, J = 1.0 Hz, 3H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ164.9, 154.9, 151.0, 135.9, 133.0, 127.0, 120.9, 17.5;
HRMS (FAB+) [M+Na]+, 計算値217.0048, 測定値 217.0047。
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ164.9, 154.9, 151.0, 135.9, 133.0, 127.0, 120.9, 17.5;
HRMS (FAB+) [M+Na]+, 計算値217.0048, 測定値 217.0047。
【0138】
工程２：式（２２）の化合物の製造
【0139】
【化35】
【0140】
フレームドライ、窒素置換した１００ｍＬナスフラスコに式（２１）の化合物（３００ｍｇ，１．５４ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（１９６ｍｇ，１．８５ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（１ｍＬ）、及びジＮ,Ｎ―ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）を加え、８０℃で１６時間撹拌した。得られた混合物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、無色固体として式（２２）の化合物を３００ｍｇ（１．２０ｍｍｏｌ，収率７８％）で得た。
【0141】
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ8.24 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 7.0 Hz, 1.5 Hz, 1H), 3.99(s, 3H), 2.75 (d, J = 1.5 Hz, 3H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ165.3 156.0 152.0 137.8 134.1 127.2 120.7 52.6 18.6;
HRMS(FAB+) [M+Na]+, 計算値231.0204, 測定値 231.0214。
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ165.3 156.0 152.0 137.8 134.1 127.2 120.7 52.6 18.6;
HRMS(FAB+) [M+Na]+, 計算値231.0204, 測定値 231.0214。
【0142】
工程３：式（２３）の化合物の製造
【0143】
【化36】
【0144】
フレームドライ、窒素置換した５０ｍＬナスフラスコに式（２２）の化合物（１１０ｍｇ，０.５２８ｍｍｏｌ）、Ｎ―ブロモスクシンイミド（９４.０ｍｇ，０.５２８ｍｍｏｌ）、過酸化ベンゾイル（触媒量）、３３％臭化水素酢酸溶液（３３μＬ）、及び四塩化炭素（３．５ｍＬ）を加え、７５℃で１６時間撹拌した。得られた混合物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、無色固体として式（２３）の化合物を３０ｍｇ（０．１０４ｍｍｏｌ，収率２０％）で得た。
【0145】
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ8.29 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.94(s, 2H), 4.01 (s, 3H);
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ164.8 154.0 152.2 135.9 133.6 128.3 123.2 52.8 27.5;
HRMS(FAB+) [M+H]+, 計算値286.9490, 測定値 286.9501。
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ164.8 154.0 152.2 135.9 133.6 128.3 123.2 52.8 27.5;
HRMS(FAB+) [M+H]+, 計算値286.9490, 測定値 286.9501。
【0146】
工程４：式（１４）の化合物の製造
【0147】
【化37】
【0148】
フレームドライ、窒素置換した２０ｍＬナスフラスコに式（２３）の化合物（２０ｍｇ，０.０６９７ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（５７．８ｍｇ，０.４１８ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノー２－ヒドロキシベンゾアルデヒド（Chem.Asian J. 2010, 5, 2053.に従い製造した。１３．８ｍｇ，０．０８３６ｍｍｏｌ）、及びＮ、Ｎ―ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）を加え、１２５℃で１６時間撹拌した。溶媒を留去し、乾燥後に水酸化リチウム（８．７７ｍｇ、０．３６６ｍｍｍｏｌ）, 水（１ｍＬ）、及びテトラヒドロフラン（１ｍＬ）を加えて溶液を還流しながら９５℃で３時間撹拌した。得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸含有アセトニトリル）により精製し、式（１４）の化合物を３．０ｍｇ（０．００８８４ｍｍｏｌ，収率１６％）で得た。
【0149】
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ8.41 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.16 (s, 1H), 8.14 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.85 (dd, J = 7.5 Hz, J = 1.5 Hz, 1H), 3.03 (s, 6H);
13C NMR (125 MHz, DMSO) δ164.7 156.3 151.8 150.2 149.8 147.4 130.2 125.7 121.8 121.2 120.7 117.9 110.9 110.2 92.9 39.9;
HRMS(FAB+) [M]+, 計算値339.0678, 測定値 339.0661。
13C NMR (125 MHz, DMSO) δ164.7 156.3 151.8 150.2 149.8 147.4 130.2 125.7 121.8 121.2 120.7 117.9 110.9 110.2 92.9 39.9;
HRMS(FAB+) [M]+, 計算値339.0678, 測定値 339.0661。
【0150】
＜実施例１３：式（１５）の化合物の製造
【0151】
【化38】
【0152】
フレームドライ、窒素置換した５０ｍＬ三ツ口ナスフラスコに式（６）の化合物（１０．０ｍｇ，０．０３５３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１６．０ｍｇ，０．０４２４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）、及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを氷浴上で加え、１時間撹拌した。その後、グリシンｔｅｒｔブチル塩酸塩（８．８８ｍｇ，０．０５３０ｍｍｏｌ）を加えた。溶媒を留去、乾燥後、得られた混合物をジクロロメタン（１ｍＬ）とトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）の混合溶媒中で、１時間撹拌した。得られた混合物をＨＰＬＣ（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸含有アセトニトリル）により精製し、式（１５）の化合物を２．５ｍｇ（０．００７３ｍｍｏｌ，収率２１％）で得た。
【0153】
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.01(t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.89(s, 1H), 8.38(s, 1H), 7.89(d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.58(s, 1H), 7.30(dd, J = 9.5 Hz, J = 2.5 Hz, 1H), 6.97(d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.06(d, J = 5.5 Hz, 2H), 3.2(s, 6H) ;
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ168.6 162.6 162.1 151.5 150.8 149.1 138.6 131.2 130.5 123.9 116.3 115.0 114.8 109.6 103.9 82.1 28.1;
HRMS (FAB+) [M+Na]+, 計算値363.0957, 測定値 363.0954。
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ168.6 162.6 162.1 151.5 150.8 149.1 138.6 131.2 130.5 123.9 116.3 115.0 114.8 109.6 103.9 82.1 28.1;
HRMS (FAB+) [M+Na]+, 計算値363.0957, 測定値 363.0954。
【0154】
＜実施例１４＞
ＯＢＰの製造
（１）ＯＢＰ－Ｈｉｓ（Ｃ末端にＨｉｓタグを融合させたＯＢＰ）の遺伝子を持つ大腸菌の製造］
ＯＢＰのＤＮＡ断片は ｐＵＣＦａ－ＯＢＰ２ａ（合成遺伝子としてＦＡＳＭＡＣより購入）をテンプレートとして、プライマー（配列番号１－４）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片と、ｐＥＴ２１ｂ（＋）のそれぞれをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、ライゲーションすることでｐＥＴ２１ｂ（＋）－ＯＢＰ－Ｈｉｓを得た。シークエンス解析により、目的プラスミドの配列（配列番号５）であることを確認した。
ＯＢＰの製造
（１）ＯＢＰ－Ｈｉｓ（Ｃ末端にＨｉｓタグを融合させたＯＢＰ）の遺伝子を持つ大腸菌の製造］
ＯＢＰのＤＮＡ断片は ｐＵＣＦａ－ＯＢＰ２ａ（合成遺伝子としてＦＡＳＭＡＣより購入）をテンプレートとして、プライマー（配列番号１－４）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片と、ｐＥＴ２１ｂ（＋）のそれぞれをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、ライゲーションすることでｐＥＴ２１ｂ（＋）－ＯＢＰ－Ｈｉｓを得た。シークエンス解析により、目的プラスミドの配列（配列番号５）であることを確認した。
【0155】
（２）組み換えタンパク質ＯＢＰの作製、精製
１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを２０μＬ加えたＬＢ培地（２０ｍＬ）で、ｐＥＴ２１ｂ（＋）－ＯＢＰ－Ｈｉｓの遺伝子をもつ大腸菌を３７℃で１６時間培養した。続いて、３７℃に温めたＬＢ培地（１Ｌ）に１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを１ｍＬ加え、培養していたＬＢ培地（２０ｍＬ）を加えて３７℃で３．５時間培養を行った。ここにＩＰＴＧを終濃度３００μＭになるよう加えて３７℃で終夜培養した。この培養液を５０００ｒｐｍ、２０℃で２０分間遠心分離を行い、上清を取り除き、Ｂｉｎｄ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ １粒，ｐＨ８．０）を２０ｍＬ加え懸濁し、氷上で超音波により大腸菌を破砕した。その後、５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離を行い、上清をろ過し、ろ液をＮｉカラムに添加した。１時間撹拌後、２５ｍＬのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）をカラムに２回添加することで洗浄操作を行い、２５ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）をカラムに添加しＯＢＰ－Ｈｉｓを溶出させた。得られたＯＢＰ－Ｈｉｓをゲルろ過カラムクロマトグラフィーによって精製した。ゲルろ過用緩衝液としてＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を使用した。
１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを２０μＬ加えたＬＢ培地（２０ｍＬ）で、ｐＥＴ２１ｂ（＋）－ＯＢＰ－Ｈｉｓの遺伝子をもつ大腸菌を３７℃で１６時間培養した。続いて、３７℃に温めたＬＢ培地（１Ｌ）に１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを１ｍＬ加え、培養していたＬＢ培地（２０ｍＬ）を加えて３７℃で３．５時間培養を行った。ここにＩＰＴＧを終濃度３００μＭになるよう加えて３７℃で終夜培養した。この培養液を５０００ｒｐｍ、２０℃で２０分間遠心分離を行い、上清を取り除き、Ｂｉｎｄ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム，３００ｍＭ ＮａＣｌ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ １粒，ｐＨ８．０）を２０ｍＬ加え懸濁し、氷上で超音波により大腸菌を破砕した。その後、５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離を行い、上清をろ過し、ろ液をＮｉカラムに添加した。１時間撹拌後、２５ｍＬのＷａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）をカラムに２回添加することで洗浄操作を行い、２５ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）をカラムに添加しＯＢＰ－Ｈｉｓを溶出させた。得られたＯＢＰ－Ｈｉｓをゲルろ過カラムクロマトグラフィーによって精製した。ゲルろ過用緩衝液としてＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を使用した。
【0156】
＜実施例１５＞
組み換えタンパク質ＯＢＰ（第一世代のＯＢＰ変異体）の製造
（１）ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）－Ｈｉｓ，第１世代ＯＢＰの発現と精製
前記実施例１４（２）において、ｐＥＴ２１ｂ（＋）－ＯＢＰ－Ｈｉｓの遺伝子をもつ大腸菌の代わりにＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）－Ｈｉｓの遺伝子（ＯＢＰ（第一世代）－Ｈｉｓの遺伝子）をもつ大腸菌（配列番号６）を用いた以外は同様にして、組み換えタンパク質ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）－Ｈｉｓを得た。
組み換えタンパク質ＯＢＰ（第一世代のＯＢＰ変異体）の製造
（１）ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）－Ｈｉｓ，第１世代ＯＢＰの発現と精製
前記実施例１４（２）において、ｐＥＴ２１ｂ（＋）－ＯＢＰ－Ｈｉｓの遺伝子をもつ大腸菌の代わりにＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）－Ｈｉｓの遺伝子（ＯＢＰ（第一世代）－Ｈｉｓの遺伝子）をもつ大腸菌（配列番号６）を用いた以外は同様にして、組み換えタンパク質ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）－Ｈｉｓを得た。
【0157】
（２）ｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）の作製
ｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（ＯＲＩＧＥＮＥより購入）をテンプレートとして、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、プライマー（配列番号７，８）、プライマー（配列番号９，１０）を用いてＰＣＲにより得た。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的プラスミドのｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）（配列番号１１）であることを確認した。
ｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（ＯＲＩＧＥＮＥより購入）をテンプレートとして、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、プライマー（配列番号７，８）、プライマー（配列番号９，１０）を用いてＰＣＲにより得た。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的プラスミドのｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）（配列番号１１）であることを確認した。
【0158】
（３）ｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）－ＮＬＳの作製
ＮＬＳのＤＮＡ断片はｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＢＬ－ＮＬＳ（S. Watanabe et al. Chem. Eur.-J. 2011, 17, 8342-8349.）をテンプレートとして、プライマー（配列番号１２－１５）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片と（２）で得られたｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）をそれぞれＭｌｕＩとＮｏｔＩで制限酵素処理してライゲーションすることによりプラスミドを得た。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的プラスミドのｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）－ＮＬＳ（配列番号１６）であることを確認した。
ＮＬＳのＤＮＡ断片はｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＢＬ－ＮＬＳ（S. Watanabe et al. Chem. Eur.-J. 2011, 17, 8342-8349.）をテンプレートとして、プライマー（配列番号１２－１５）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片と（２）で得られたｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）をそれぞれＭｌｕＩとＮｏｔＩで制限酵素処理してライゲーションすることによりプラスミドを得た。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的プラスミドのｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）－ＮＬＳ（配列番号１６）であることを確認した。
【0159】
（４）ｐＫｍｃｌ－２ｘＣｏｘ８－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）の作製
ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）のＤＮＡ断片は、（２）で得られたｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）をテンプレートとして、プライマー（配列番号１７－２０）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片とｐＫｍｃｌ－２ｘＣｏｘ８－Ｈａｌｏ（Y. Matsui et al. Chem. Sci. 2017, 8, 8255-8264.）をそれぞれＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで制限酵素処理してライゲーションすることによりプラスミドを得た。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的遺伝子（配列番号２１）を含むプラスミドのｐＫｍｃｌ－２ｘＣｏｘ８－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）であることを確認した。
ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）のＤＮＡ断片は、（２）で得られたｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）をテンプレートとして、プライマー（配列番号１７－２０）を用いてＰＣＲにより得た。この増幅したＤＮＡ断片とｐＫｍｃｌ－２ｘＣｏｘ８－Ｈａｌｏ（Y. Matsui et al. Chem. Sci. 2017, 8, 8255-8264.）をそれぞれＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで制限酵素処理してライゲーションすることによりプラスミドを得た。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的遺伝子（配列番号２１）を含むプラスミドのｐＫｍｃｌ－２ｘＣｏｘ８－ＯＢＰ（Ｃ９９ＳＫ１１２Ｎ）であることを確認した。
【0160】
＜実施例１６＞
組み換えタンパク質ＯＢＰ（第二世代のＯＢＰ変異体）の製造
（１）ＯＢＰ（第２世代）－Ｈｉｓの発現と精製
実施例１４（２）において、ｐＥＴ２１ｂ（＋）－ＯＢＰ－Ｈｉｓの遺伝子をもつ大腸菌の代わりにＯＢＰ（第二世代）－Ｈｉｓの遺伝子をもつ大腸菌（配列番号２２）を用いた以外は同様にして、組み換えタンパク質ＯＢＰ（第２世代）－Ｈｉｓを得た。
組み換えタンパク質ＯＢＰ（第二世代のＯＢＰ変異体）の製造
（１）ＯＢＰ（第２世代）－Ｈｉｓの発現と精製
実施例１４（２）において、ｐＥＴ２１ｂ（＋）－ＯＢＰ－Ｈｉｓの遺伝子をもつ大腸菌の代わりにＯＢＰ（第二世代）－Ｈｉｓの遺伝子をもつ大腸菌（配列番号２２）を用いた以外は同様にして、組み換えタンパク質ＯＢＰ（第２世代）－Ｈｉｓを得た。
【0161】
（２）ｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第二世代）－ＮＬＳの作製
実施例１５（３）において作製したプラスミドを元に、実施例１５（２）で示した手順と同様にプライマー（配列番号２３－３０）を用いて作製した。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的プラスミドのｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第２世代）－ＮＬＳ（配列番号３１）であることを確認した。
実施例１５（３）において作製したプラスミドを元に、実施例１５（２）で示した手順と同様にプライマー（配列番号２３－３０）を用いて作製した。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的プラスミドのｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第２世代）－ＮＬＳ（配列番号３１）であることを確認した。
【0162】
＜実施例１７＞
組み換えタンパク質ＯＢＰ（第三世代のＯＢＰ変異体）の製造
（１）ＯＢＰ（第３世代）－Ｈｉｓの発現と精製
実施例１４（２）において、ｐＥＴ２１ｂ（＋）－ＯＢＰ－Ｈｉｓの遺伝子をもつ大腸菌の代わりにＯＢＰ（第３世代）－Ｈｉｓの遺伝子をもつ大腸菌（配列番号３２）を用いた以外は、同様にして，組み換えタンパク質ＯＢＰ（第３世代）－Ｈｉｓを得た。
組み換えタンパク質ＯＢＰ（第三世代のＯＢＰ変異体）の製造
（１）ＯＢＰ（第３世代）－Ｈｉｓの発現と精製
実施例１４（２）において、ｐＥＴ２１ｂ（＋）－ＯＢＰ－Ｈｉｓの遺伝子をもつ大腸菌の代わりにＯＢＰ（第３世代）－Ｈｉｓの遺伝子をもつ大腸菌（配列番号３２）を用いた以外は、同様にして，組み換えタンパク質ＯＢＰ（第３世代）－Ｈｉｓを得た。
【0163】
（２）ｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第三世代）－ＮＬＳの作製
実施例１５（３）において作製したプラスミドを元に、実施例１５（２）で示した手順と同様にプライマー（配列番号３３－３６）を用いて作製した。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的プラスミドのｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第３世代）－ＮＬＳ（配列番号３７）であることを確認した。
実施例１５（３）において作製したプラスミドを元に、実施例１５（２）で示した手順と同様にプライマー（配列番号３３－３６）を用いて作製した。得られたプラスミドは、シークエンス解析により、目的プラスミドのｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第３世代）－ＮＬＳ（配列番号３７）であることを確認した。
【0164】
[式（３）の化合物の蛍光強度]
【0165】
【化39】
【0166】
実施例１５（１）において得られた組み換えタンパク質ＯＢＰ（第一世代のＯＢＰ変異体）０～８０μＭと、式（３）の化合物（プローブ）１μＭを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液で混合した。蛍光スペクトルは２５℃、励起波長を４１３ｎｍ、励起／蛍光側スリットは５／２．５ｎｍとして測定した。Ｋｄは６．６μＭであった。ＯＢＰ（第１世代）５０μＭの際の蛍光スペクトルを図１に示す。
【0167】
[式（８）の化合物の蛍光強度]
【0168】
【化40】
【0169】
実施例１５（１）において得られた組み換えタンパク質ＯＢＰ（第一世代のＯＢＰ変異体）０～５０μＭと式（８）の化合物（プローブ）１μＭを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液で混合した。蛍光スペクトルは２５℃、励起波長を４６７ｎｍ、励起／蛍光側スリットは５／５ｎｍとして測定した。Ｋｄは９．４μＭであった。ＯＢＰ（第１世代）５０μＭの際の蛍光スペクトルを図２に示す。
【0170】
［長時間１分子イメージング］
ＫＯＨ洗浄とプラズマ洗浄処理を施したスライドガラスにアミノシランコートをし、NHS-PEGとNHS-PEG-biotinを混ぜてガラス表面をビオチンで修飾したチャンバーを作製した。ここにストレプトアビジンを添加し、さらに表面をストレプトアビジンでコートしたガラスを作製した。一方で、Ｋ３５１－ＯＢＰ（キネシン単量体にＯＢＰを融合させたタンパク質）にQuantTag Biotin Kit(BDK-2000)を使ってビオチン化を行った。ビオチン化したＫ３５１－ＯＢＰをストレプトアビジンでコートされたガラスに添加することで、表面にＯＢＰを固定化した。５０μＭの式（８）の化合物を２ｍＭのTroloxを含む緩衝液中に添加した。全反射照明顕微鏡（オリンパス製を元に改造）を用い、４８８ｎｍの励起光を照射し、対物レンズ（UPlanApu 100x/1.50 Oil、オリンパス製）により１００ｍｓの露光時間で観察した。
ＫＯＨ洗浄とプラズマ洗浄処理を施したスライドガラスにアミノシランコートをし、NHS-PEGとNHS-PEG-biotinを混ぜてガラス表面をビオチンで修飾したチャンバーを作製した。ここにストレプトアビジンを添加し、さらに表面をストレプトアビジンでコートしたガラスを作製した。一方で、Ｋ３５１－ＯＢＰ（キネシン単量体にＯＢＰを融合させたタンパク質）にQuantTag Biotin Kit(BDK-2000)を使ってビオチン化を行った。ビオチン化したＫ３５１－ＯＢＰをストレプトアビジンでコートされたガラスに添加することで、表面にＯＢＰを固定化した。５０μＭの式（８）の化合物を２ｍＭのTroloxを含む緩衝液中に添加した。全反射照明顕微鏡（オリンパス製を元に改造）を用い、４８８ｎｍの励起光を照射し、対物レンズ（UPlanApu 100x/1.50 Oil、オリンパス製）により１００ｍｓの露光時間で観察した。
【0171】
ＯＢＰ１分子に由来する輝点が観察され、２４時間後も輝点が観察された。式（８）の化合物とＯＢＰとの結合速度（kon）と本条件の濃度（Ｃ）から結合していない状態の時定数（τoff）を見積もると、／（kon×C）＝１１ミリ秒であり、露光時間より短いものである。この結果から、化合物が露光時間中に少なくとも一回はＯＢＰと結合が起こり、蛍光シグナルが検出されることが判る。このようにＯＢＰに素早く入れ替わりながら結合・解離を繰り返すことにより、ＯＢＰへの蛍光標識が見かけ上維持され、長時間の一分子イメージングが行われていることが確認された。
【0172】
[式（１２）の化合物の蛍光強度]
【0173】
【化41】
【0174】
実施例１６（１）において得られた組み換えタンパク質ＯＢＰ（第二世代のＯＢＰ変異体）０～５０μＭと式（１２）の化合物（プローブ）１μＭを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液で混合した。蛍光スペクトルは２５℃、励起波長を４６７ｎｍ、励起／蛍光側スリットは５／５ｎｍとして測定した。Ｋｄは４．９μＭであった。ＯＢＰ（第２世代）５μＭの際の蛍光スペクトルを図３に示す。図３には、ＯＢＰ（第２世代）の代わりに実施例１５（１）で得られたＯＢＰ１（第１世代）を用いた場合、およびＯＢＰが不在の場合の蛍光スペクトルも併せて示す。
【0175】
[式（１３）の化合物の蛍光強度]
【0176】
【化42】
【0177】
実施例１６（１）において得られた組み換えタンパク質ＯＢＰ（第二世代のＯＢＰ変異体）０～５０μＭと式（１３）の化合物（プローブ）１μＭを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液で混合した。蛍光スペクトルは２５℃、励起波長を４１３ｎｍ，励起／蛍光側スリットは５／２．５ｎｍとして測定した。Ｋｄは７３μＭであった。ＯＢＰ（第２世代）５μＭの際の蛍光スペクトルを図４に示す。図４には、ＯＢＰ（第２世代）の代わりに実施例１５（１）で得られたＯＢＰ１（第１世代）を用いた場合、およびＯＢＰが不在の場合の蛍光スペクトルも併せて示す。
【0178】
［ＯＢＰのプローブのＫｄ値］
【表1】
【0179】
前記表１から、本発明の化合物は組み換えタンパク質ＯＢＰに対しての結合が、解離定数にしてμＭ前後の値であること、すなわち、本発明の化合物と組み換えタンパク質ＯＢＰとの結合が比較的弱いことが判った。また、式（１３）の化合物および式（１２）の化合物はＯＢＰ１（第一世代のＯＢＰ変異体）よりもＯＢＰ２（第二世代のＯＢＰ変異体）におけるＫｄ値が低く、ＯＢＰ２の方が強く結合していた。これは式（１３）の化合物および式（１２）の化合物の有するカチオン性のＮ，Ｎ－ジメチルアミノ基がＯＢＰの結合ポケットに位置するアニオン性のアミノ酸残基に対して親和性を有することに起因するものと考えられる。一方で、式（４）の化合物および式（７）の化合物に対してはＯＢＰ２と比べてＯＢＰ１におけるＫｄ値がより低く、ＯＢＰ１の方が強く結合していた。これは、式（４）の化合物および式（７）の化合物の有するアニオン性のカルボキシ基がＯＢＰの結合ポケットに位置するカチオン性のアミノ酸残基に対して親和性を有することに起因するものと考えられる。
【0180】
［生細胞多色イメージング］
【0181】
【化43】
【0182】
［細胞の調製と遺伝子導入］
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）培地２ｍＬ中２４時間培養し、培地を除いた後に、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ＭＥＭ培地を２ｍＬ加えた。この細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ライフテクノロージー社製）を用いて、実施例１６（２）で得られたｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第二世代）－ＮＬＳ、および実施例１５（４）で得られたｐＫｍｃｌ－２ｘＣｏｘ８－ＯＢＰ（第一世代）の遺伝子を導入したもの、及び遺伝子を導入していないものを３７℃で２４時間インキュベーションを行った。その後、培地を除いた後、得られた細胞をハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＨＢＳＳ）１ｍＬで３回洗浄し、２μＭの式（４）の化合物および１μＭの式（１２）の化合物をそれぞれ含むＭＥＭ培地１ｍＬを加えた。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）培地２ｍＬ中２４時間培養し、培地を除いた後に、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ＭＥＭ培地を２ｍＬ加えた。この細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ライフテクノロージー社製）を用いて、実施例１６（２）で得られたｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第二世代）－ＮＬＳ、および実施例１５（４）で得られたｐＫｍｃｌ－２ｘＣｏｘ８－ＯＢＰ（第一世代）の遺伝子を導入したもの、及び遺伝子を導入していないものを３７℃で２４時間インキュベーションを行った。その後、培地を除いた後、得られた細胞をハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＨＢＳＳ）１ｍＬで３回洗浄し、２μＭの式（４）の化合物および１μＭの式（１２）の化合物をそれぞれ含むＭＥＭ培地１ｍＬを加えた。
【0183】
［蛍光イメージング実験］
上記の細胞の蛍光イメージングを共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０ｉ（オリンパス株式会社製）を用いて行った。式（４）の化合物由来の蛍光像を取得する際には、４０５ｎｍのレーザーを励起光として用い、４２０ｎｍ～５２０ｎｍの光を透過する蛍光フィルターを用い、６０倍バイオ対物レンズを用いた。式（１２）の化合物由来の蛍光像を取得する 際には、４７３ｎｍのレーザーを励起光として用い、４９０ｎｍ～５９０ｎｍの光を透過する蛍光フィルターを用い、６０倍バイオ対物レンズを用いて観測を行った。得られた結果を図５に示す。（ｘ）はリソソームマーカーを含む場合、（ｙ）はリソソームマーカー不在の場合である。（ａ）はリソソームマーカーとして用いる化合物が式（４）の化合物の場合、（ｂ）はリソソームマーカーとして用いる化合物が式（１２）の化合物の場合である。（ｃ）は位相コントラストで表したものである。図５から、シアン色の蛍光を示す式（４）の化合物はＯＢＰ（第一世代）を発現させたミトコンドリアを蛍光標識し、緑色の蛍光を示す式（１２）の化合物はＯＢＰ（第二世代）を発現させた核を蛍光標識することが判った。
上記の細胞の蛍光イメージングを共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０ｉ（オリンパス株式会社製）を用いて行った。式（４）の化合物由来の蛍光像を取得する際には、４０５ｎｍのレーザーを励起光として用い、４２０ｎｍ～５２０ｎｍの光を透過する蛍光フィルターを用い、６０倍バイオ対物レンズを用いた。式（１２）の化合物由来の蛍光像を取得する 際には、４７３ｎｍのレーザーを励起光として用い、４９０ｎｍ～５９０ｎｍの光を透過する蛍光フィルターを用い、６０倍バイオ対物レンズを用いて観測を行った。得られた結果を図５に示す。（ｘ）はリソソームマーカーを含む場合、（ｙ）はリソソームマーカー不在の場合である。（ａ）はリソソームマーカーとして用いる化合物が式（４）の化合物の場合、（ｂ）はリソソームマーカーとして用いる化合物が式（１２）の化合物の場合である。（ｃ）は位相コントラストで表したものである。図５から、シアン色の蛍光を示す式（４）の化合物はＯＢＰ（第一世代）を発現させたミトコンドリアを蛍光標識し、緑色の蛍光を示す式（１２）の化合物はＯＢＰ（第二世代）を発現させた核を蛍光標識することが判った。
【0184】
[式（１４）の化合物の蛍光強度]
【化44】
【0185】
実施例１５（１）において得られた組み換えタンパク質ＯＢＰ（第１世代のＯＢＰ変異体）５μＭと式（１４）の化合物（プローブ）１μＭを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液で混合した。蛍光スペクトルは２５℃、励起波長を５１５ｎｍ，励起／蛍光側スリットは１０／１０ｎｍとして測定した。得られた蛍光スペクトルを図６に示す。
【0186】
［式（８）の化合物と式（６）の化合物の蛍光強度］
【化45】
【0187】
［細胞の調製と遺伝子導入］
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）培地２ｍＬ中２４時間培養し、培地を除いた後に、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ＭＥＭ培地を２ｍＬ加えた。この細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ライフテクノロージー社製）を用いて、実施例１５（３）で得られたｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第一世代）－ＮＬＳを導入したものを３７℃で２４時間インキュベーションを行った。その後、培地を除いた後、得られた細胞をハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＨＢＳＳ）１ｍＬで３回洗浄し、１μＭの式（８）の化合物および１μＭの式（６）の化合物をそれぞれ含むＭＥＭ培地１ｍＬを加えた。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）培地２ｍＬ中２４時間培養し、培地を除いた後に、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ＭＥＭ培地を２ｍＬ加えた。この細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ライフテクノロージー社製）を用いて、実施例１５（３）で得られたｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第一世代）－ＮＬＳを導入したものを３７℃で２４時間インキュベーションを行った。その後、培地を除いた後、得られた細胞をハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＨＢＳＳ）１ｍＬで３回洗浄し、１μＭの式（８）の化合物および１μＭの式（６）の化合物をそれぞれ含むＭＥＭ培地１ｍＬを加えた。
【0188】
［蛍光イメージング実験］
上記の細胞の蛍光イメージングを共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０ｉ（オリンパス株式会社製）を用いて行った。式（８）の化合物由来の蛍光像を取得する際には、４７３ｎｍのレーザーを励起光として用い、４９０ｎｍ～５９０ｎｍの光を透過する蛍光フィルターを用い、６０倍バイオ対物レンズを用いた。式（６）の化合物由来の蛍光像を取得する際には、４７３ｎｍのレーザーを励起光として用い、４９０ｎｍ～５９０ｎｍの光を透過する蛍光フィルターを用い、６０倍バイオ対物レンズを用いて観測を行った。得られた結果を図７に示す。（ｘ）は式（８）の化合物を用いた場合、（ｙ）は式（６）の化合物を用いた場合である。（ａ）は蛍光表示、（ｂ）は位相コントラストで表したものである。図７から、式（６）の化合物の方が蛍光シグナルが低下しており、ＯＢＰの発現に依存しない非特異的な蛍光を抑えられることが判った。
上記の細胞の蛍光イメージングを共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０ｉ（オリンパス株式会社製）を用いて行った。式（８）の化合物由来の蛍光像を取得する際には、４７３ｎｍのレーザーを励起光として用い、４９０ｎｍ～５９０ｎｍの光を透過する蛍光フィルターを用い、６０倍バイオ対物レンズを用いた。式（６）の化合物由来の蛍光像を取得する際には、４７３ｎｍのレーザーを励起光として用い、４９０ｎｍ～５９０ｎｍの光を透過する蛍光フィルターを用い、６０倍バイオ対物レンズを用いて観測を行った。得られた結果を図７に示す。（ｘ）は式（８）の化合物を用いた場合、（ｙ）は式（６）の化合物を用いた場合である。（ａ）は蛍光表示、（ｂ）は位相コントラストで表したものである。図７から、式（６）の化合物の方が蛍光シグナルが低下しており、ＯＢＰの発現に依存しない非特異的な蛍光を抑えられることが判った。
【0189】
［式（６）の化合物の蛍光強度］
【化46】
【0190】
実施例１５（１）において得られた組み換えタンパク質ＯＢＰ（第一世代のＯＢＰ変異体）もしくは実施例１７（１）において得られた組み換えタンパク質ＯＢＰ（第三世代のＯＢＰ変異体）５μＭ、または組み換えタンパク質ＯＢＰ無しと式（６）の化合物（プローブ）１μＭを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液で混合した。蛍光スペクトルは２５℃、励起波長を４３０ｎｍ，励起／蛍光側スリットは５／２．５ｎｍとして測定した。Ｋｄは０．８２μＭであった。得られた蛍光スペクトルを図８に示す。
【0191】
［式（１５）の化合物の蛍光強度］
【化47】
【0192】
実施例１５（１）において得られた組み換えタンパク質ＯＢＰ（第一世代のＯＢＰ変異体）もしくは実施例１７（１）において得られた組み換えタンパク質ＯＢＰ（第三世代のＯＢＰ変異体）５μＭ、または組み換えタンパク質ＯＢＰ無しと式（１５）の化合物（プローブ）１μＭを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液で混合した。蛍光スペクトルは２５℃、励起波長を４５０ｎｍ，励起／蛍光側スリットは５／２．５ｎｍとして測定した。Ｋｄは１．１μＭであった。得られた蛍光スペクトルを図９に示す。
【0193】
［細胞の調製と遺伝子導入］
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）培地２ｍＬ中２４時間培養し、培地を除いた後に、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ＭＥＭ培地を２ｍＬ加えた。この細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ライフテクノロージー社製）を用いて、実施例１５（３）で得られたｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第一世代）－ＮＬＳまたは実施例１７（２）で得られたｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第三世代）－ＮＬＳを導入したものを３７℃で２４時間インキュベーションを行った。その後、培地を除いた後、得られた細胞をハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＨＢＳＳ）１ｍＬで３回洗浄し、１μＭの式（６）の化合物を含むＭＥＭ培地１ｍＬを加えた。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）培地２ｍＬ中２４時間培養し、培地を除いた後に、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ＭＥＭ培地を２ｍＬ加えた。この細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ライフテクノロージー社製）を用いて、実施例１５（３）で得られたｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第一世代）－ＮＬＳまたは実施例１７（２）で得られたｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第三世代）－ＮＬＳを導入したものを３７℃で２４時間インキュベーションを行った。その後、培地を除いた後、得られた細胞をハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＨＢＳＳ）１ｍＬで３回洗浄し、１μＭの式（６）の化合物を含むＭＥＭ培地１ｍＬを加えた。
【0194】
［蛍光イメージング実験］
上記の細胞の蛍光イメージングを共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０ｉ（オリンパス株式会社製）を用いて行った。式（６）の化合物由来の蛍光像を取得する際には、４７３ｎｍのレーザーを励起光として用い、４９０ｎｍ～５９０ｎｍの光を透過する蛍光フィルターを用い、６０倍バイオ対物レンズを用いた。得られた結果を図１０に示す。（ｘ）はｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第一世代）－ＮＬＳまたはｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第三世代）－ＮＬＳの導入無しの場合、（ｙ）はｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第一世代）－ＮＬＳを導入した場合、（ｚ）はｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第三世代）－ＮＬＳを導入した場合である。（ａ）は蛍光表示、（ｂ）は位相コントラストで表したものである。図１０から、式（６）の化合物はＯＢＰ（第一世代）よりもＯＢＰ（第三世代）に対してより強く結合し、大きな蛍光シグナルを生じることが判った。
上記の細胞の蛍光イメージングを共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ１０ｉ（オリンパス株式会社製）を用いて行った。式（６）の化合物由来の蛍光像を取得する際には、４７３ｎｍのレーザーを励起光として用い、４９０ｎｍ～５９０ｎｍの光を透過する蛍光フィルターを用い、６０倍バイオ対物レンズを用いた。得られた結果を図１０に示す。（ｘ）はｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第一世代）－ＮＬＳまたはｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第三世代）－ＮＬＳの導入無しの場合、（ｙ）はｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第一世代）－ＮＬＳを導入した場合、（ｚ）はｐＣＭＶ６－ＯＢＰ（第三世代）－ＮＬＳを導入した場合である。（ａ）は蛍光表示、（ｂ）は位相コントラストで表したものである。図１０から、式（６）の化合物はＯＢＰ（第一世代）よりもＯＢＰ（第三世代）に対してより強く結合し、大きな蛍光シグナルを生じることが判った。
【0195】
［配列］
配列番号１
GATGACGAATTCCATGCTGAGCTTTACCCTCGAAGAAG
配列番号２
GATGACGAATTCCATGCTGA
配列番号３
AAGATCAAGCTTATGCTCCAGAACACACGAG
配列番号４
AAGATCAAGCTTATGCTCCAGAA
配列番号５
ATGCTGAGCTTTACCCTCGAAGAAGAGGATATTACCGGTACTTGGTACGTCAAAGCGATGGTGGTGGATAAAGACTTTCCGGAAGATCGCCGTCCACGCAAAGTAAGTCCGGTCAAAGTTACCGCATTAGGAGGCGGTAATCTGGAAGCCACGTTTACCTTTATGCGCGAAGATCGGTGCATTCAGAAGAAGATTCTGATGCGCAAAACCGAAGAACCGGGCAAATTTTCCGCGTATGGCGGTCGTAAGCTGATCTATCTCCAGGAATTACCCGGTACAGATGACTACGTGTTCTACTGCAAAGATCAACGTCGTGGTGGACTTCGCTATATGGGCAAACTGGTTGGGCGCAATCCGAACACGAACCTTGAGGCTCTGGAAGAGTTCAAGAAACTGGTGCAGCATAAAGGGCTGTCTGAAGAGGACATCTTCATGCCTCTGCAAACAGGCTCGTGTGTTCTGGAGCATAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
配列番号６
ATGCTGAGCTTTACCCTCGAAGAAGAGGATATTACCGGTACTTGGTACGTCAAAGCGATGGTGGTGGATAAAGACTTTCCGGAAGATCGCCGTCCACGCAAAGTAAGTCCGGTCAAAGTTACCGCATTAGGAGGCGGTAATCTGGAAGCCACGTTTACCTTTATGCGCGAAGATCGGTGCATTCAGAAGAAGATTCTGATGCGCAAAACCGAAGAACCGGGCAAATTTTCCGCGTATGGCGGTCGTAAGCTGATCTATCTCCAGGAATTACCCGGTACAGATGACTACGTGTTCTACAGCAAAGATCAACGTCGTGGTGGACTTCGCTATATGGGCAACCTGGTTGGGCGCAATCCGAACACGAACCTTGAGGCTCTGGAAGAGTTCAAGAAACTGGTGCAGCATAAAGGGCTGTCTGAAGAGGACATCTTCATGCCTCTGCAAACAGGCTCGTGTGTTCTGGAGCATAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
配列番号７
CGACTACGTCTTTTACAGCAAAGACCAGCGCCGTG
配列番号８
CACGGCGCTGGTCTTTGCTGTAAAAGACGTAGTCG
配列番号９
CCTGCGCTACATGGGAAACCTTGTGGGTAGGAATC
配列番号１０
GATTCCTACCCACAAGGTTTCCCATGTAGCGCAGG
配列番号１１
ATGCTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAGGACAGGAGGCCCAGGAAGGTGTCCCCAGTGAAGGTGACAGCCCTGGGCGGTGGGAACTTGGAAGCCACGTTCACCTTCATGAGGGAGGATCGGTGCATCCAGAAGAAAATCCTGATGCGGAAGACGGAGGAGCCTGGCAAATTCAGCGCCTATGGGGGCAGGAAGCTCATATACCTGCAGGAGCTGCCCGGGACGGACGACTACGTCTTTTACAGCAAAGACCAGCGCCGTGGGGGCCTGCGCTACATGGGAAACCTTGTGGGTAGGAATCCTAATACCAACCTGGAGGCCCTGGAAGAATTTAAGAAATTGGTGCAGCACAAGGGACTCTCGGAGGAGGACATTTTCATGCCCCTGCAGACGGGAAGCTGCGTTCTCGAACAC
配列番号１２
GATGACACGCGTGGAGGATCTGGAGGATCTGA′
配列番号１３
GATGACACGCGTGGAGG
配列番号１４
AAGATCGCGGCCGCGTTACCTTTCTCTTTTTCTTAGGATCAAC
配列番号１５
AAGATCGCGGCCGCGT
配列番号１６
ATGCTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAGGACAGGAGGCCCAGGAAGGTGTCCCCAGTGAAGGTGACAGCCCTGGGCGGTGGGAACTTGGAAGCCACGTTCACCTTCATGAGGGAGGATCGGTGCATCCAGAAGAAAATCCTGATGCGGAAGACGGAGGAGCCTGGCAAATTCAGCGCCTATGGGGGCAGGAAGCTCATATACCTGCAGGAGCTGCCCGGGACGGACGACTACGTCTTTTACAGCAAAGACCAGCGCCGTGGGGGCCTGCGCTACATGGGAAAGCTTGTGGGTAGGAATCCTAATACCAACCTGGAGGCCCTGGAAGAATTTAAGAAATTGGTGCAGCACAAGGGACTCTCGGAGGAGGACATTTTCATGCCCCTGCAGACGGGAAGCTGCGTTCTCGAACAC
ACGCGTGGAGGATCTGGAGGATCTGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGGAAGGTTGATCCTAAGAAAAAGAGAAAGGTA
配列番号１７
GATGACGGATCCATGCTGTCCTTCACC
配列番号１８
GATGACGGATCCATGCTG
配列番号１９
AAGATCGAATTCTTAGTGTTCGAGAACGCAGCTT
配列番号２０
AAGATCGAATTCTTAGTGTTCGAG
配列番号２１
ATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGGGCTTGACAGGCTCGGCCCGGCGGCTCCCAGTGCCGCGCGCCAAGATCCATTCGTTGCCGCCGGAGGGGAAGCTTGGGATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGGGCTTGACAGGCTCGGCCCGGCGGCTCCCAGTGCCGCGCGCCAAGATCCATTCGTTGCCGCCGGAGGGGAAGCTCGGGGGATCCATGCTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAGGACAGGAGGCCCAGGAAGGTGTCCCCAGTGAAGGTGACAGCCCTGGGCGGTGGGAACTTGGAAGCCACGTTCACCTTCATGAGGGAGGATCGGTGCATCCAGAAGAAAATCCTGATGCGGAAGACGGAGGAGCCTGGCAAATTCAGCGCCTATGGGGGCAGGAAGCTCATATACCTGCAGGAGCTGCCCGGGACGGACGACTACGTCTTTTACAGCAAAGACCAGCGCCGTGGGGGCCTGCGCTACATGGGAAACCTTGTGGGTAGGAATCCTAATACCAACCTGGAGGCCCTGGAAGAATTTAAGAAATTGGTGCAGCACAAGGGACTCTCGGAGGAGGACATTTTCATGCCCCTGCAGACGGGAAGCTGCGTTCTCGAACACTAA
配列番号２２
ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCCGAATTCCATGCTGAGCTTTACCCTCGAAGAAGAGGATATTACCGGTACTTGGTACGTCAAAGCGATGGTGGTGGATAAAGACTTTCCGGAAGATGAACGTCCACGCAAAGTAAGTCCGGTCAAAGTTACCGCATTAGGAGGCGGTAATCTGGAAGCCACGTTTACCTTTATGCGCGAAGATCGGTGCATTCAGGAAAAGATTCTGATGCGCAAAACCGAAGAACCGGGCAAATTTTCCGCGTATGGCGGTCGTGAACTGATCTATCTCCAGGAATTACCCGGTACAGATGACTACGTGTTCTACAGCAAAGATCAACGTCGTGGTGGACTTGAATATATGGGCAACCTGGTTGGGCGCAATCCGAACACGAACCTTGAGGCTCTGGAAGAGTTCAAGAAACTGGTGCAGCATAAAGGGCTGTCTGAAGAGGACATCTTCATGCCTCTGCAAACAGGCTCGTGTGTTCTGGAGCATAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
配列番号２３
GACTTTCCGGAGGACGAGAGGCCCAGGAAGGTG
配列番号２４
CACCTTCCTGGGCCTCTCGTCCTCCGGAAAGTC
配列番号２５
GGATCGGTGCATCCAGGAGAAAATCCTGATGCGG
配列番号２６
CCGCATCAGGATTTTCTCCTGGATGCACCGATCC
配列番号２７
GCCTATGGGGGCAGGGAGCTCATATACCTGCAG
配列番号２８
CTGCAGGTATATGAGCTCCCTGCCCCCATAGGC
配列番号２９
CGCCGTGGGGGCCTGGAGTACATGGGAAACCTTG
配列番号３０
CAAGGTTTCCCATGTACTCCAGGCCCCCACGGCG
配列番号３１
ATGCTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAGGACGAGAGGCCCAGGAAGGTGTCCCCAGTGAAGGTGACAGCCCTGGGCGGTGGGAACTTGGAAGCCACGTTCACCTTCATGAGGGAGGATCGGTGCATCCAGGAGAAAATCCTGATGCGGAAGACGGAGGAGCCTGGCAAATTCAGCGCCTATGGGGGCAGGGAGCTCATATACCTGCAGGAGCTGCCCGGGACGGACGACTACGTCTTTTACAGCAAAGACCAGCGCCGTGGGGGCCTGGAGTACATGGGAAACCTTGTGGGTAGGAATCCTAATACCAACCTGGAGGCCCTGGAAGAATTTAAGAAATTGGTGCAGCACAAGGGACTCTCGGAGGAGGACATTTTCATGCCCCTGCAGACGGGAAGCTGCGTTCTCGAACACACGCGTGGAGGATCTGGAGGATCTGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGGAAGGTTGATCCTAAGAAAAAGAGAAAGGTA
配列番号３２
ATGCTGAGCTTTACCCTCGAAGAAGAGGATATTACCGGTACTTGGTACGTCAAAGCGATGGTGGTGGATAAAGACTTTCCGGAAGATCGCCGTCCACGCAAAGTAAGTCCGGTCAAAGTTACCGCATTAGGAGGCGGTAATCTGGAAGCCACGTTTACCCAGATGCGCGAAGATCGGTGCATTCAGAAGAAGATTCTGATGCGCAAAACCGAAGAACCGGGCAAATTTTCCGCGTATGGCGGTCGTAAGCTGATCTATCTCCAGGAATTACCCGGTACAGATGACTACGTGATGTACAGCAAAGATCAACGTCGTGGTGGACTTCGCTATATGGGCAACCTGGTTGGGCGCAATCCGAACACGAACCTTGAGGCTCTGGAAGAGTTCAAGAAACTGGTGCAGCATAAAGGGCTGTCTGAAGAGGACATCTTCATGCCTCTGCAAACAGGCTCGTGTGTTCTGGAGCATAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
配列番号３３
GTTCACCCAGATGAGGGAGGATCGG
配列番号３４
CCCTCATCTGGGTGAACGTGGCTTC
配列番号３５
CTACGTCATGTACAGCAAAGACC
配列番号３６
GCTGTACATGACGTAGTCGTCC
配列番号３７
ATGCTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAGGACAGGAGGCCCAGGAAGGTGTCCCCAGTGAAGGTGACAGCCCTGGGCGGTGGGAACTTGGAAGCCACGTTCACCCAGATGAGGGAGGATCGGTGCATCCAGAAGAAAATCCTGATGCGGAAGACGGAGGAGCCTGGCAAATTCAGCGCCTATGGGGGCAGGAAGCTCATATACCTGCAGGAGCTGCCCGGGACGGACGACTACGTCATGTACAGCAAAGACCAGCGCCGTGGGGGCCTGCGCTACATGGGAAACCTTGTGGGTAGGAATCCTAATACCAACCTGGAGGCCCTGGAAGAATTTAAGAAATTGGTGCAGCACAAGGGACTCTCGGAGGAGGACATTTTCATGCCCCTGCAGACGGGAAGCTGCGTTCTCGAACACACGCGTGGAGGATCTGGAGGATCTGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGGAAGGTTGATCCTAAGAAAAAGAGAAAGGTA
配列番号３８
MASMTGGQQMGRDPNSLSFTLEEEDITGTWYVKAMVVDKDFPEDRRPRKVSPVKVTALGGGNLEATFTFMREDRCIQKKILMRKTEEPGKFSAYGGRKLIYLQELPGTDDYVFYCKDQRRGGLRYMGKLVGRNPNTNLEALEEFKKLVQHKGLSEEDIFMPLQTGSCVLEH
配列番号３９
ATGAAGACCCTGTTCCTGGGTGTCACGCTCGGCCTGGCCGCTGCCCTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAGGACAGGAGGCCCAGGAAGGTGTCCCCAGTGAAGGTGACAGCCCTGGGCGGTGGGAACTTGGAAGCCACGTTCACCTTCATGAGGGAGGATCGGTGCATCCAGAAGAAAATCCTGATGCGGAAGACGGAGGAGCCTGGCAAATTCAGCGCCTATGGGGGCAGGAAGCTCATATACCTGCAGGAGCTGCCCGGGACGGACGACTACGTCTTTTACTGCAAAGACCAGCGCCGTGGGGGCCTGCGCTACATGGGAAAGCTTGTGGGTAGGAATCCTAATACCAACCTGGAGGCCCTGGAAGAATTTAAGAAATTGGTGCAGCACAAGGGACTCTCGGAGGAGGACATTTTCATGCCCCTGCAGACGGGAAGCTGCGTTCTCGAACAC
配列番号４０
MLSFTLEEEDITGTWYVKAMVVDKDFPEDRRPRKVSPVKVTALGGGNLEATFTFMREDRCIQKKILMRKTEEPGKFSAYGGRKLIYLQELPGTDDYVFYSKDQRRGGLRYMGNLVGRNPNTNLEALEEFKKLVQHKGLSEEDIFMPLQTGSCVLEH
配列番号４１
MLSFTLEEEDITGTWYVKAMVVDKDFPEDERPRKVSPVKVTALGGGNLEATFTFMREDRCIQEKILMRKTEEPGKFSAYGGRELIYLQELPGTDDYVFYSKDQRRGGLEYMGNLVGRNPNTNLEALEEFKKLVQHKGLSEEDIFMPLQTGSCVLEH
配列番号４２
MLSFTLEEEDITGTWYVKAMVVDKDFPEDRRPRKVSPVKVTALGGGNLEATFTQMREDRCIQKKILMRKTEEPGKFSAYGGRKLIYLQELPGTDDYVMYSKDQRRGGLRYMGNLVGRNPNTNLEALEEFKKLVQHKGLSEEDIFMPLQTGSCVLEH
配列番号１
GATGACGAATTCCATGCTGAGCTTTACCCTCGAAGAAG
配列番号２
GATGACGAATTCCATGCTGA
配列番号３
AAGATCAAGCTTATGCTCCAGAACACACGAG
配列番号４
AAGATCAAGCTTATGCTCCAGAA
配列番号５
ATGCTGAGCTTTACCCTCGAAGAAGAGGATATTACCGGTACTTGGTACGTCAAAGCGATGGTGGTGGATAAAGACTTTCCGGAAGATCGCCGTCCACGCAAAGTAAGTCCGGTCAAAGTTACCGCATTAGGAGGCGGTAATCTGGAAGCCACGTTTACCTTTATGCGCGAAGATCGGTGCATTCAGAAGAAGATTCTGATGCGCAAAACCGAAGAACCGGGCAAATTTTCCGCGTATGGCGGTCGTAAGCTGATCTATCTCCAGGAATTACCCGGTACAGATGACTACGTGTTCTACTGCAAAGATCAACGTCGTGGTGGACTTCGCTATATGGGCAAACTGGTTGGGCGCAATCCGAACACGAACCTTGAGGCTCTGGAAGAGTTCAAGAAACTGGTGCAGCATAAAGGGCTGTCTGAAGAGGACATCTTCATGCCTCTGCAAACAGGCTCGTGTGTTCTGGAGCATAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
配列番号６
ATGCTGAGCTTTACCCTCGAAGAAGAGGATATTACCGGTACTTGGTACGTCAAAGCGATGGTGGTGGATAAAGACTTTCCGGAAGATCGCCGTCCACGCAAAGTAAGTCCGGTCAAAGTTACCGCATTAGGAGGCGGTAATCTGGAAGCCACGTTTACCTTTATGCGCGAAGATCGGTGCATTCAGAAGAAGATTCTGATGCGCAAAACCGAAGAACCGGGCAAATTTTCCGCGTATGGCGGTCGTAAGCTGATCTATCTCCAGGAATTACCCGGTACAGATGACTACGTGTTCTACAGCAAAGATCAACGTCGTGGTGGACTTCGCTATATGGGCAACCTGGTTGGGCGCAATCCGAACACGAACCTTGAGGCTCTGGAAGAGTTCAAGAAACTGGTGCAGCATAAAGGGCTGTCTGAAGAGGACATCTTCATGCCTCTGCAAACAGGCTCGTGTGTTCTGGAGCATAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
配列番号７
CGACTACGTCTTTTACAGCAAAGACCAGCGCCGTG
配列番号８
CACGGCGCTGGTCTTTGCTGTAAAAGACGTAGTCG
配列番号９
CCTGCGCTACATGGGAAACCTTGTGGGTAGGAATC
配列番号１０
GATTCCTACCCACAAGGTTTCCCATGTAGCGCAGG
配列番号１１
ATGCTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAGGACAGGAGGCCCAGGAAGGTGTCCCCAGTGAAGGTGACAGCCCTGGGCGGTGGGAACTTGGAAGCCACGTTCACCTTCATGAGGGAGGATCGGTGCATCCAGAAGAAAATCCTGATGCGGAAGACGGAGGAGCCTGGCAAATTCAGCGCCTATGGGGGCAGGAAGCTCATATACCTGCAGGAGCTGCCCGGGACGGACGACTACGTCTTTTACAGCAAAGACCAGCGCCGTGGGGGCCTGCGCTACATGGGAAACCTTGTGGGTAGGAATCCTAATACCAACCTGGAGGCCCTGGAAGAATTTAAGAAATTGGTGCAGCACAAGGGACTCTCGGAGGAGGACATTTTCATGCCCCTGCAGACGGGAAGCTGCGTTCTCGAACAC
配列番号１２
GATGACACGCGTGGAGGATCTGGAGGATCTGA′
配列番号１３
GATGACACGCGTGGAGG
配列番号１４
AAGATCGCGGCCGCGTTACCTTTCTCTTTTTCTTAGGATCAAC
配列番号１５
AAGATCGCGGCCGCGT
配列番号１６
ATGCTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAGGACAGGAGGCCCAGGAAGGTGTCCCCAGTGAAGGTGACAGCCCTGGGCGGTGGGAACTTGGAAGCCACGTTCACCTTCATGAGGGAGGATCGGTGCATCCAGAAGAAAATCCTGATGCGGAAGACGGAGGAGCCTGGCAAATTCAGCGCCTATGGGGGCAGGAAGCTCATATACCTGCAGGAGCTGCCCGGGACGGACGACTACGTCTTTTACAGCAAAGACCAGCGCCGTGGGGGCCTGCGCTACATGGGAAAGCTTGTGGGTAGGAATCCTAATACCAACCTGGAGGCCCTGGAAGAATTTAAGAAATTGGTGCAGCACAAGGGACTCTCGGAGGAGGACATTTTCATGCCCCTGCAGACGGGAAGCTGCGTTCTCGAACAC
ACGCGTGGAGGATCTGGAGGATCTGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGGAAGGTTGATCCTAAGAAAAAGAGAAAGGTA
配列番号１７
GATGACGGATCCATGCTGTCCTTCACC
配列番号１８
GATGACGGATCCATGCTG
配列番号１９
AAGATCGAATTCTTAGTGTTCGAGAACGCAGCTT
配列番号２０
AAGATCGAATTCTTAGTGTTCGAG
配列番号２１
ATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGGGCTTGACAGGCTCGGCCCGGCGGCTCCCAGTGCCGCGCGCCAAGATCCATTCGTTGCCGCCGGAGGGGAAGCTTGGGATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGGGCTTGACAGGCTCGGCCCGGCGGCTCCCAGTGCCGCGCGCCAAGATCCATTCGTTGCCGCCGGAGGGGAAGCTCGGGGGATCCATGCTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAGGACAGGAGGCCCAGGAAGGTGTCCCCAGTGAAGGTGACAGCCCTGGGCGGTGGGAACTTGGAAGCCACGTTCACCTTCATGAGGGAGGATCGGTGCATCCAGAAGAAAATCCTGATGCGGAAGACGGAGGAGCCTGGCAAATTCAGCGCCTATGGGGGCAGGAAGCTCATATACCTGCAGGAGCTGCCCGGGACGGACGACTACGTCTTTTACAGCAAAGACCAGCGCCGTGGGGGCCTGCGCTACATGGGAAACCTTGTGGGTAGGAATCCTAATACCAACCTGGAGGCCCTGGAAGAATTTAAGAAATTGGTGCAGCACAAGGGACTCTCGGAGGAGGACATTTTCATGCCCCTGCAGACGGGAAGCTGCGTTCTCGAACACTAA
配列番号２２
ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCCGAATTCCATGCTGAGCTTTACCCTCGAAGAAGAGGATATTACCGGTACTTGGTACGTCAAAGCGATGGTGGTGGATAAAGACTTTCCGGAAGATGAACGTCCACGCAAAGTAAGTCCGGTCAAAGTTACCGCATTAGGAGGCGGTAATCTGGAAGCCACGTTTACCTTTATGCGCGAAGATCGGTGCATTCAGGAAAAGATTCTGATGCGCAAAACCGAAGAACCGGGCAAATTTTCCGCGTATGGCGGTCGTGAACTGATCTATCTCCAGGAATTACCCGGTACAGATGACTACGTGTTCTACAGCAAAGATCAACGTCGTGGTGGACTTGAATATATGGGCAACCTGGTTGGGCGCAATCCGAACACGAACCTTGAGGCTCTGGAAGAGTTCAAGAAACTGGTGCAGCATAAAGGGCTGTCTGAAGAGGACATCTTCATGCCTCTGCAAACAGGCTCGTGTGTTCTGGAGCATAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
配列番号２３
GACTTTCCGGAGGACGAGAGGCCCAGGAAGGTG
配列番号２４
CACCTTCCTGGGCCTCTCGTCCTCCGGAAAGTC
配列番号２５
GGATCGGTGCATCCAGGAGAAAATCCTGATGCGG
配列番号２６
CCGCATCAGGATTTTCTCCTGGATGCACCGATCC
配列番号２７
GCCTATGGGGGCAGGGAGCTCATATACCTGCAG
配列番号２８
CTGCAGGTATATGAGCTCCCTGCCCCCATAGGC
配列番号２９
CGCCGTGGGGGCCTGGAGTACATGGGAAACCTTG
配列番号３０
CAAGGTTTCCCATGTACTCCAGGCCCCCACGGCG
配列番号３１
ATGCTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAGGACGAGAGGCCCAGGAAGGTGTCCCCAGTGAAGGTGACAGCCCTGGGCGGTGGGAACTTGGAAGCCACGTTCACCTTCATGAGGGAGGATCGGTGCATCCAGGAGAAAATCCTGATGCGGAAGACGGAGGAGCCTGGCAAATTCAGCGCCTATGGGGGCAGGGAGCTCATATACCTGCAGGAGCTGCCCGGGACGGACGACTACGTCTTTTACAGCAAAGACCAGCGCCGTGGGGGCCTGGAGTACATGGGAAACCTTGTGGGTAGGAATCCTAATACCAACCTGGAGGCCCTGGAAGAATTTAAGAAATTGGTGCAGCACAAGGGACTCTCGGAGGAGGACATTTTCATGCCCCTGCAGACGGGAAGCTGCGTTCTCGAACACACGCGTGGAGGATCTGGAGGATCTGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGGAAGGTTGATCCTAAGAAAAAGAGAAAGGTA
配列番号３２
ATGCTGAGCTTTACCCTCGAAGAAGAGGATATTACCGGTACTTGGTACGTCAAAGCGATGGTGGTGGATAAAGACTTTCCGGAAGATCGCCGTCCACGCAAAGTAAGTCCGGTCAAAGTTACCGCATTAGGAGGCGGTAATCTGGAAGCCACGTTTACCCAGATGCGCGAAGATCGGTGCATTCAGAAGAAGATTCTGATGCGCAAAACCGAAGAACCGGGCAAATTTTCCGCGTATGGCGGTCGTAAGCTGATCTATCTCCAGGAATTACCCGGTACAGATGACTACGTGATGTACAGCAAAGATCAACGTCGTGGTGGACTTCGCTATATGGGCAACCTGGTTGGGCGCAATCCGAACACGAACCTTGAGGCTCTGGAAGAGTTCAAGAAACTGGTGCAGCATAAAGGGCTGTCTGAAGAGGACATCTTCATGCCTCTGCAAACAGGCTCGTGTGTTCTGGAGCATAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
配列番号３３
GTTCACCCAGATGAGGGAGGATCGG
配列番号３４
CCCTCATCTGGGTGAACGTGGCTTC
配列番号３５
CTACGTCATGTACAGCAAAGACC
配列番号３６
GCTGTACATGACGTAGTCGTCC
配列番号３７
ATGCTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAGGACAGGAGGCCCAGGAAGGTGTCCCCAGTGAAGGTGACAGCCCTGGGCGGTGGGAACTTGGAAGCCACGTTCACCCAGATGAGGGAGGATCGGTGCATCCAGAAGAAAATCCTGATGCGGAAGACGGAGGAGCCTGGCAAATTCAGCGCCTATGGGGGCAGGAAGCTCATATACCTGCAGGAGCTGCCCGGGACGGACGACTACGTCATGTACAGCAAAGACCAGCGCCGTGGGGGCCTGCGCTACATGGGAAACCTTGTGGGTAGGAATCCTAATACCAACCTGGAGGCCCTGGAAGAATTTAAGAAATTGGTGCAGCACAAGGGACTCTCGGAGGAGGACATTTTCATGCCCCTGCAGACGGGAAGCTGCGTTCTCGAACACACGCGTGGAGGATCTGGAGGATCTGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGGAAGGTTGATCCTAAGAAAAAGAGAAAGGTA
配列番号３８
MASMTGGQQMGRDPNSLSFTLEEEDITGTWYVKAMVVDKDFPEDRRPRKVSPVKVTALGGGNLEATFTFMREDRCIQKKILMRKTEEPGKFSAYGGRKLIYLQELPGTDDYVFYCKDQRRGGLRYMGKLVGRNPNTNLEALEEFKKLVQHKGLSEEDIFMPLQTGSCVLEH
配列番号３９
ATGAAGACCCTGTTCCTGGGTGTCACGCTCGGCCTGGCCGCTGCCCTGTCCTTCACCCTGGAGGAGGAGGATATCACAGGGACCTGGTACGTGAAGGCCATGGTGGTCGATAAGGACTTTCCGGAGGACAGGAGGCCCAGGAAGGTGTCCCCAGTGAAGGTGACAGCCCTGGGCGGTGGGAACTTGGAAGCCACGTTCACCTTCATGAGGGAGGATCGGTGCATCCAGAAGAAAATCCTGATGCGGAAGACGGAGGAGCCTGGCAAATTCAGCGCCTATGGGGGCAGGAAGCTCATATACCTGCAGGAGCTGCCCGGGACGGACGACTACGTCTTTTACTGCAAAGACCAGCGCCGTGGGGGCCTGCGCTACATGGGAAAGCTTGTGGGTAGGAATCCTAATACCAACCTGGAGGCCCTGGAAGAATTTAAGAAATTGGTGCAGCACAAGGGACTCTCGGAGGAGGACATTTTCATGCCCCTGCAGACGGGAAGCTGCGTTCTCGAACAC
配列番号４０
MLSFTLEEEDITGTWYVKAMVVDKDFPEDRRPRKVSPVKVTALGGGNLEATFTFMREDRCIQKKILMRKTEEPGKFSAYGGRKLIYLQELPGTDDYVFYSKDQRRGGLRYMGNLVGRNPNTNLEALEEFKKLVQHKGLSEEDIFMPLQTGSCVLEH
配列番号４１
MLSFTLEEEDITGTWYVKAMVVDKDFPEDERPRKVSPVKVTALGGGNLEATFTFMREDRCIQEKILMRKTEEPGKFSAYGGRELIYLQELPGTDDYVFYSKDQRRGGLEYMGNLVGRNPNTNLEALEEFKKLVQHKGLSEEDIFMPLQTGSCVLEH
配列番号４２
MLSFTLEEEDITGTWYVKAMVVDKDFPEDRRPRKVSPVKVTALGGGNLEATFTQMREDRCIQKKILMRKTEEPGKFSAYGGRKLIYLQELPGTDDYVMYSKDQRRGGLRYMGNLVGRNPNTNLEALEEFKKLVQHKGLSEEDIFMPLQTGSCVLEH
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】