特開2024-127129多孔質粒子、液体クロマトグラフィー担体、液体クロマトグラフィー装置、および生体高分子の分離精製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024127129
(43)【公開日】2024-09-20
(54)【発明の名称】多孔質粒子、液体クロマトグラフィー担体、液体クロマトグラフィー装置、および生体高分子の分離精製方法
(51)【国際特許分類】
B01J 20/282 20060101AFI20240912BHJP
G01N 30/88 20060101ALI20240912BHJP
B01J 20/285 20060101ALI20240912BHJP
【ＦＩ】
B01J20/282
G01N30/88 J
G01N30/88 D
B01J20/285 T
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023036046
(22)【出願日】2023-03-08
(71)【出願人】
【識別番号】311002067
【氏名又は名称】ＪＮＣ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】滝沢 和宏
(72)【発明者】
【氏名】松本 吉裕
(72)【発明者】
【氏名】岩本 恵里
(72)【発明者】
【氏名】門井 賢司
(72)【発明者】
【氏名】名嘉真 剛
(57)【要約】
【課題】充填剤をカラムに充填した従来の装置を用いて、高処理速度でのバイオ医薬品などの精製を行うための技術を提供すること。
【解決手段】多孔質粒子であって、略球状で、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる連通孔構造を有しており、かつ前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通しており、前記多孔質粒子を内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムに充填して、純水を移動相として、カラム温度２５℃および流量０．４ｍＬ／分で、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーを通液したときの、前記シリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上であることを特徴とする、多孔質粒子。
【選択図】図１
【解決手段】多孔質粒子であって、略球状で、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる連通孔構造を有しており、かつ前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通しており、前記多孔質粒子を内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムに充填して、純水を移動相として、カラム温度２５℃および流量０．４ｍＬ／分で、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーを通液したときの、前記シリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上であることを特徴とする、多孔質粒子。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多孔質粒子であって、
略球状で、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる連通孔構造を有しており、かつ前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通しており、
前記多孔質粒子を内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムに充填して、純水を移動相として、カラム温度２５℃および流量０．４ｍＬ／分で、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーを通液したときの、前記シリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上であることを特徴とする、多孔質粒子。
略球状で、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる連通孔構造を有しており、かつ前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通しており、
前記多孔質粒子を内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムに充填して、純水を移動相として、カラム温度２５℃および流量０．４ｍＬ／分で、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーを通液したときの、前記シリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上であることを特徴とする、多孔質粒子。
【請求項2】
細孔径が６５０ｎｍ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の多孔質粒子。
【請求項3】
リガンドにより修飾された多孔質粒子であって、
略球状で、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる連通孔構造を有しており、かつ前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通しており、
細孔径が４００ｎｍ以上であることを特徴とする、多孔質粒子。
略球状で、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる連通孔構造を有しており、かつ前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通しており、
細孔径が４００ｎｍ以上であることを特徴とする、多孔質粒子。
【請求項4】
主成分が酢酸セルロースまたはセルロースである、請求項１～３のいずれか１項に記載の多孔質粒子。
【請求項5】
メジアン径が４０～２００μｍである、請求項１～３のいずれか１項に記載の多孔質粒子。
【請求項6】
ＢＥＴ多点法による比表面積が１～２００ｍ２／ｇである、請求項１～３のいずれか１項に記載の多孔質粒子。
【請求項7】
請求項１または２に記載の多孔質粒子に対して、リガンド修飾した、請求項１または２に記載の多孔質粒子。
【請求項8】
前記リガンドがイオン交換基を含むリガンド、アフィニティーリガンド、および疎水性基を含むリガンドからなる群から選択される一以上である、請求項７に記載の多孔質粒子。
【請求項9】
請求項１～３のいずれか１項に記載の多孔質粒子を含む、液体クロマトグラフィー担体。
【請求項10】
請求項９に記載の液体クロマトグラフィー担体を充填した分離カラムを含む、液体クロマトグラフィー装置。
【請求項11】
生体高分子の分離精製方法であって、
請求項１０に記載の液体クロマトグラフィー装置を用いて生体高分子を分離精製する工程を含む、分離精製方法。
請求項１０に記載の液体クロマトグラフィー装置を用いて生体高分子を分離精製する工程を含む、分離精製方法。
【請求項12】
前記生体高分子の大きさが１～１００ｎｍである、請求項１１に記載の分離精製方法。
【請求項13】
前記生体高分子が抗体である、請求項１１に記載の分離精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、大孔径の多孔質粒子、およびこれを用いた高処理速度でのクロマトグラフィー技術に関する。
【背景技術】
【0002】
バイオ医薬品などの分離・精製に用いるクロマトグラフィーにおいて、多孔質粒子は大きな表面積を持つことから結合容量が高い材料として利用されてきた。近年では、多孔質粒子の細孔を連続孔にすることで粒子内部の連通孔の空隙も吸着サイトとして利用できるようにする取り組みが行われている（特許文献１、２、３）。また、従来の多孔質粒子が抗体、タンパク質、核酸等の通常５～１０ｎｍの範囲のサイズの生体分子の分離のために最適化しているのに対し、ウイルス等のより大きな粒子の結合容量を大きくするために、多孔質粒子の細孔径を大きくすることで細孔内に大きな粒子が吸着できるようにする取り組みが行われている（特許文献４）。
【0003】
近年ではバイオ医薬品などの生産性向上のために、単位時間当たりに目的物質を結合させる能力が注目されるようになっている。この能力は、単位体積当たり、単位時間あたりに結合される目的物質量（ｍｇ／ｍＬ／ｍｉｎ））で表され、分離・精製に用いるクロマトグラフィー吸着材料を少なくすること及び／又は分離・精製に要する時間を短くすることにつながる。従来の多孔質粒子への結合には目的物質の粒子の孔内への拡散が律速となることから、特に、滞留時間が１分を下回るような高処理速度では、粒子を充填したカラムへの滞留時間を短くするために流速を上げると、目的物質の粒子への結合容量が顕著に低下するため、流速の向上が生産性向上につながらないという問題がある。このような高処理速度での結合容量低下問題を解決する方法として、多孔質粒子の代わりにメンブレンやモノリス、ファイバーを使用したクロマトグラフィー精製法が知られている。こうした材料では広く開いた繊維の間を液が通過するため拡散律速になりにくく、結合容量の流速依存性を小さくできるという特徴がある。しかしながら、メンブレンやモノリス、ファイバーは従来用いられてきたカラムに充填することができず、専用の容器が必要であるという問題がある。また、メンブレンやモノリス、ファイバーを用いると、閉塞した際に急激に圧力が上昇してしまうという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】国際公開第２０１６／０１３５６８号
【特許文献2】国際公開第２０１７／０２６４２４号
【特許文献3】特開２０２０－０２６５１１号公報
【特許文献4】特表２０２２－５１５７６９号公報
【特許文献5】国際公開第２０１５／０２９７９０号
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】W.M. Deen, F.G. Smith III, J. Membr. Sci. 1982, 12, 217-237
【非特許文献2】P DePhillips , A M Lenhoff , J Chromatogr A. 2000, 883, 39-54
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記の通り、バイオ医薬品などの分離・精製効率の向上のために、単位体積当たり、単
位時間あたりに結合される目的物質量（生産性）を向上させると同時に、従来の設備である充填カラムを活用することができ、閉塞のリスクが小さい精製法が求められる。
位時間あたりに結合される目的物質量（生産性）を向上させると同時に、従来の設備である充填カラムを活用することができ、閉塞のリスクが小さい精製法が求められる。
【0007】
そこで本発明は、充填剤をカラムに充填した従来の装置を用いて、高処理速度でのバイオ医薬品などの精製を行うための技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる特定の連通孔構造を有し、かつ比較的大きな連通孔を有する多孔質粒子を見出し、この多孔質粒子をクロマトグラフィー担体として用いることで、高流速条件であっても高い吸着量を維持できることを見出したことにより、本発明を完成させた。
【0009】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］多孔質粒子であって、
略球状で、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる連通孔構造を有しており、かつ前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通しており、
前記多孔質粒子を内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムに充填して、純水を移動相として、カラム温度２５℃および流量０．４ｍＬ／分で、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーを通液したときの、前記シリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上であることを特徴とする、多孔質粒子。
［２］細孔径が６５０ｎｍ以上であることを特徴とする、［１］に記載の多孔質粒子。
［３］リガンドにより修飾された多孔質粒子であって、
略球状で、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる連通孔構造を有しており、かつ前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通しており、
細孔径が４００ｎｍ以上であることを特徴とする、多孔質粒子。
［４］主成分が酢酸セルロースまたはセルロースである、［１］～［３］のいずれかに記載の多孔質粒子。
［５］メジアン径が４０～２００μｍである、［１］～［４］のいずれかに記載の多孔質粒子。
［６］ＢＥＴ多点法による比表面積が１～２００ｍ２／ｇである、［１］～［５］のいずれかに記載の多孔質粒子。
［７］［１］または［２］に記載の多孔質粒子に対して、リガンド修飾した、［１］、［２］および［４］～［６］のいずれかに記載の多孔質粒子。
［８］前記リガンドがイオン交換基を含むリガンド、アフィニティーリガンド、および疎水性基を含むリガンドからなる群から選択される一以上である、［３］または［７］に記載の多孔質粒子。
［９］［１］～［８］のいずれかに記載の多孔質粒子を含む、液体クロマトグラフィー担体。
［１０］［９］に記載の液体クロマトグラフィー担体を充填した分離カラムを含む、液体クロマトグラフィー装置。
［１１］生体高分子の分離精製方法であって、
［１０］に記載の液体クロマトグラフィー装置を用いて生体高分子を分離精製する工程を含む、分離精製方法。
［１２］前記生体高分子の大きさが１～１００ｎｍである、［１１］に記載の分離精製方法。
［１３］前記生体高分子が抗体である、［１１］または［１２］に記載の分離精製方法。
［１］多孔質粒子であって、
略球状で、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる連通孔構造を有しており、かつ前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通しており、
前記多孔質粒子を内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムに充填して、純水を移動相として、カラム温度２５℃および流量０．４ｍＬ／分で、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーを通液したときの、前記シリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上であることを特徴とする、多孔質粒子。
［２］細孔径が６５０ｎｍ以上であることを特徴とする、［１］に記載の多孔質粒子。
［３］リガンドにより修飾された多孔質粒子であって、
略球状で、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる連通孔構造を有しており、かつ前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通しており、
細孔径が４００ｎｍ以上であることを特徴とする、多孔質粒子。
［４］主成分が酢酸セルロースまたはセルロースである、［１］～［３］のいずれかに記載の多孔質粒子。
［５］メジアン径が４０～２００μｍである、［１］～［４］のいずれかに記載の多孔質粒子。
［６］ＢＥＴ多点法による比表面積が１～２００ｍ２／ｇである、［１］～［５］のいずれかに記載の多孔質粒子。
［７］［１］または［２］に記載の多孔質粒子に対して、リガンド修飾した、［１］、［２］および［４］～［６］のいずれかに記載の多孔質粒子。
［８］前記リガンドがイオン交換基を含むリガンド、アフィニティーリガンド、および疎水性基を含むリガンドからなる群から選択される一以上である、［３］または［７］に記載の多孔質粒子。
［９］［１］～［８］のいずれかに記載の多孔質粒子を含む、液体クロマトグラフィー担体。
［１０］［９］に記載の液体クロマトグラフィー担体を充填した分離カラムを含む、液体クロマトグラフィー装置。
［１１］生体高分子の分離精製方法であって、
［１０］に記載の液体クロマトグラフィー装置を用いて生体高分子を分離精製する工程を含む、分離精製方法。
［１２］前記生体高分子の大きさが１～１００ｎｍである、［１１］に記載の分離精製方法。
［１３］前記生体高分子が抗体である、［１１］または［１２］に記載の分離精製方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、生体高分子などの目的物質の分離・精製の際に、高流速条件であって
も大きな吸着容量を達成できる。
も大きな吸着容量を達成できる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明の多孔質粒子の形状は略球状である。ここでいう略球状とは、例えば、長径（最も長い径）が、短径（最も短い径）に対し、２倍以下である。本発明の多孔質粒子は、長径と短径とが同じ長さに近いことが好ましく、真球形であることがより好ましい。
【0013】
本発明の多孔質粒子は、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる連通孔構造を有しており、かつ前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通している。三次元ネットワーク状の骨格と連通孔を有しているかどうかは、例えば、前記粒子の断面の共焦点レーザー顕微鏡観察、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察の測定結果から判断することができる。また、前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通していることは、例えば、本発明の多孔質粒子の内部断面写真により確認できる。本発明の多孔質粒子は、前記連通孔が粒子表面において塞がれることなく、粒子の表面において開口している。多孔質粒子が上記のような連通孔構造を有することで、多孔質粒子の粒子表面だけでなく粒子内部の連通孔の空隙も目的物質の吸着サイトとして利用できるため、目的物質の分離・精製効率が向上する。
【0014】
なお、「前記連通孔が粒子表面から内部にかけて貫通している」とは、連通孔が粒子表面の開口部から粒子内部を通り、当該粒子表面以外の表面まで通じている状態（すなわち、連通孔の両端部が粒子表面に通じている状態）だけでなく、粒子表面から内部まで通じているが、内部から当該粒子表面以外の表面までは通じていない状態（すなわち、連通孔の端部の一方のみが粒子表面に通じている状態）を含む。また、粒子表面の開口部から内部にかけて通じる連通孔は、１以上の他の連通孔と連続して粒子内部の空隙を形成していてもよい。
【0015】
本発明の多孔質粒子は、以下の（１）～（２）のうちいずれか一つ以上の特性を満たす。
（１）多孔質粒子を内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムに充填して、純水を移動相として、カラム温度２５℃および流量０．４ｍＬ／分で、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーを通液したときの、前記シリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上である。
（２）リガンドにより修飾された状態での多孔質粒子の細孔径が４００ｎｍ以上である。
（１）多孔質粒子を内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムに充填して、純水を移動相として、カラム温度２５℃および流量０．４ｍＬ／分で、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーを通液したときの、前記シリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上である。
（２）リガンドにより修飾された状態での多孔質粒子の細孔径が４００ｎｍ以上である。
【0016】
（１）多孔質粒子を内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムに充填して、純水を移動相として、カラム温度２５℃および流量０．４ｍＬ／分で、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーを通液したときの、前記シリカ微粒子の保持時間は１５．０分以上であり、好ましくは１５．５分以上であり、より好ましくは１５．８分以上である。また、上限値は、好ましくは３０．０分以下であり、より好ましくは２５．０分以下であり、さらに好ましくは２０．０分以下である。ここで、カラムに充填する多孔質粒子は、リガンドにより修飾されていない状態の多孔質粒子である。
具体的には、多孔質粒子のカラムへの充填方法としては、多孔質粒子を純水で分散させてスラリーにした後、カラム（例えば、ステンレス製カラム（東ソー製））に充填し、さらに純水を流量０．４ｍＬ／分で１時間以上流して圧密化させる。その後、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーを流量０．４ｍＬ／分でカラムに通液する。シリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーの分散媒および保持時間測定時の移動相には、純水を用いる。また、カラム温度は２５℃に調整する。粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子としては、例えば、ｓｉｃａｓｔｅｒ（製造番号：４３－００－１０２、ｍｉｃｒｏｍｏｄ製）等の市販のシリカ微粒子を用いることができる。
なお、「保持時間」とは、試料をカラムに注入してから、溶出ピークまでにかかる時間である。溶出ピークは例えば、ＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）を用いることにより、ＲＩ検出強度が最大になる値から求めることができる。
前記シリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上である場合、高流速条件においても生体高分子などの目的物質の動的吸着容量を高い値のまま維持できるようになる。
具体的には、多孔質粒子のカラムへの充填方法としては、多孔質粒子を純水で分散させてスラリーにした後、カラム（例えば、ステンレス製カラム（東ソー製））に充填し、さらに純水を流量０．４ｍＬ／分で１時間以上流して圧密化させる。その後、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーを流量０．４ｍＬ／分でカラムに通液する。シリカ微粒子を５ｍｇ／ｍＬ含むスラリーの分散媒および保持時間測定時の移動相には、純水を用いる。また、カラム温度は２５℃に調整する。粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子としては、例えば、ｓｉｃａｓｔｅｒ（製造番号：４３－００－１０２、ｍｉｃｒｏｍｏｄ製）等の市販のシリカ微粒子を用いることができる。
なお、「保持時間」とは、試料をカラムに注入してから、溶出ピークまでにかかる時間である。溶出ピークは例えば、ＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）を用いることにより、ＲＩ検出強度が最大になる値から求めることができる。
前記シリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上である場合、高流速条件においても生体高分子などの目的物質の動的吸着容量を高い値のまま維持できるようになる。
【0017】
クロマトグラフィーの分野においては、多孔質粒子の細孔径を評価する場合、分子量２００万のデキストランを排除限界分子量として測定を行うことが一般的である（特許文献５）。このことは、分子量２００万のデキストランが多孔質粒子内部に入り込むことができないことが前提になっている。
デキストランやポリエチレンオキサイドがソフトマテリアルであり、液中を移動しながら変形して粒子の細孔に入ることができるのに対し、シリカなどの無機物の微粒子は剛体球であり変形できないことから粒子の細孔に入りにくい性質を有する（非特許文献１）。このため、一般的に、分子量２００万のデキストランやＳｔｏｋｅｓ径が４０ｎｍを超える分子量７８万のポリエチレンオキサイドに比べて、粒子径がより小さい粒子径３０ｎｍのシリカ微粒子の方が保持時間が短くなる。ここで、本発明の多孔質粒子をカラムに充填した場合、剛体球であり粒子径のより大きい粒子である粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上であり、従来の多孔質粒子と比較して保持時間が長い。このことは、本発明の多孔質粒子が、剛体球である粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子も粒子内部に入り込めるほど細孔径の大きい連通孔を有していることを示す。
デキストランやポリエチレンオキサイドがソフトマテリアルであり、液中を移動しながら変形して粒子の細孔に入ることができるのに対し、シリカなどの無機物の微粒子は剛体球であり変形できないことから粒子の細孔に入りにくい性質を有する（非特許文献１）。このため、一般的に、分子量２００万のデキストランやＳｔｏｋｅｓ径が４０ｎｍを超える分子量７８万のポリエチレンオキサイドに比べて、粒子径がより小さい粒子径３０ｎｍのシリカ微粒子の方が保持時間が短くなる。ここで、本発明の多孔質粒子をカラムに充填した場合、剛体球であり粒子径のより大きい粒子である粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上であり、従来の多孔質粒子と比較して保持時間が長い。このことは、本発明の多孔質粒子が、剛体球である粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子も粒子内部に入り込めるほど細孔径の大きい連通孔を有していることを示す。
【0018】
また、一般に球状の多孔質粒子をカラムに充填した場合、粒子間空隙率は３０～４０％となることが知られている（非特許文献２）。ここでいう粒子間空隙率とは、カラム内部における粒子間の隙間の全体積をカラム全体の体積で割ったものである。例えば、試料が内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラム内部の充填された粒子間の隙間のみを通ってくると仮定した場合、流量０．４ｍＬ／分のときの保持時間は、理論的には、１０．７～１４．３分となり、この時間がシリカ微粒子等の排除粒子の保持時間となる。本発明の多孔質粒子は粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子の保持時間が１５．０分以上である。このように、排除粒子保持時間との比較からも、本発明の多孔質粒子は、粒子間の隙間だけでなく、粒子内部に粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子が入り込めるほど細孔径の大きい連通孔を有していることが示される。
【0019】
本発明の多孔質粒子の細孔径は、６５０ｎｍ以上であることが好ましい。なお、ここでは、多孔質粒子は、リガンドにより修飾されていない状態のものを指す。
本発明の多孔質粒子のように細孔径の大きい粒子の細孔径を評価する場合、細孔に入らない排除粒子を用意するのが困難であるため、上記の理論的な保持時間から排除粒子保持時間を仮定して細孔径の推算に用いることも、粒子間の細孔径の大きさを比較するうえで有効である。
すなわち、上記の理論的な保持時間から排除粒子保持時間を仮定して推算した際の、リ
ガンドにより修飾されていない状態の多孔質粒子の細孔径が、６５０ｎｍ以上であることが好ましく、８００ｎｍ以上であることがより好ましく、１０００ｎｍ以上であることがさらに好ましい。上限値は、２０００ｎｍ以下であることが好ましく、１８００ｎｍ以下であることがより好ましく、１７００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。
細孔径の推算値は、例えば、以下の手順により、ポリエチレンオキサイドの保持時間に基づいて算出することができる。
本発明の多孔質粒子のように細孔径の大きい粒子の細孔径を評価する場合、細孔に入らない排除粒子を用意するのが困難であるため、上記の理論的な保持時間から排除粒子保持時間を仮定して細孔径の推算に用いることも、粒子間の細孔径の大きさを比較するうえで有効である。
すなわち、上記の理論的な保持時間から排除粒子保持時間を仮定して推算した際の、リ
ガンドにより修飾されていない状態の多孔質粒子の細孔径が、６５０ｎｍ以上であることが好ましく、８００ｎｍ以上であることがより好ましく、１０００ｎｍ以上であることがさらに好ましい。上限値は、２０００ｎｍ以下であることが好ましく、１８００ｎｍ以下であることがより好ましく、１７００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。
細孔径の推算値は、例えば、以下の手順により、ポリエチレンオキサイドの保持時間に基づいて算出することができる。
【0020】
本発明のリガンドにより修飾されていない状態での多孔質粒子を内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムに充填して、純水を移動相として、カラム温度２５℃および流量０．４ｍＬ／分で、ポリエチレンオキサイドを５ｍｇ／ｍＬ含む溶液を通液したときの、ポリエチレンオキサイドの保持時間を測定する。
具体的には、多孔質粒子のカラムへの充填方法としては、多孔質粒子を純水で分散させてスラリーにした後、カラム（例えば、ステンレス製カラム（東ソー製））に充填し、さらに純水を流量０．４ｍＬ／分で１時間以上流して圧密化させる。その後、重量平均分子量１０６のポリエチレングリコール、測定サンプル（標準ポリエチレンオキサイド）、および排除粒子（例えば、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子）を５ｍｇ／ｍＬ含む各溶液またはスラリーを流量０．４ｍＬ／分でカラムに通液する。各溶液またはスラリーの溶媒または分散媒、および保持時間測定時の移動相には、純水を用いる。また、カラム温度は２５℃に調整する。ＲＩ検出強度が最大になる値を溶出ピークとし、その時間を保持時間とする。測定装置としては、例えば、１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いることができる。
具体的には、多孔質粒子のカラムへの充填方法としては、多孔質粒子を純水で分散させてスラリーにした後、カラム（例えば、ステンレス製カラム（東ソー製））に充填し、さらに純水を流量０．４ｍＬ／分で１時間以上流して圧密化させる。その後、重量平均分子量１０６のポリエチレングリコール、測定サンプル（標準ポリエチレンオキサイド）、および排除粒子（例えば、粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子）を５ｍｇ／ｍＬ含む各溶液またはスラリーを流量０．４ｍＬ／分でカラムに通液する。各溶液またはスラリーの溶媒または分散媒、および保持時間測定時の移動相には、純水を用いる。また、カラム温度は２５℃に調整する。ＲＩ検出強度が最大になる値を溶出ピークとし、その時間を保持時間とする。測定装置としては、例えば、１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いることができる。
【0021】
（ｉ）移動相の総体積ＶＴ（ｍＬ）を「重量平均分子量１０６のポリエチレングリコールの保持時間（分）×流速（ｍＬ／分）×カラム体積（ｍＬ）」の式により算出する。重量平均分子量１０６のポリエチレングリコールとしては、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＰＥＧ１０６を使用することができる。
（ｉｉ）粒子間の空隙体積Ｖ０（ｍＬ）を「排除粒子保持時間（分）×流速（ｍＬ／分）×カラム体積（ｍＬ）」の式により算出する。
（ｉｉ）粒子間の空隙体積Ｖ０（ｍＬ）を「排除粒子保持時間（分）×流速（ｍＬ／分）×カラム体積（ｍＬ）」の式により算出する。
【0022】
排除粒子保持時間を求める。排除粒子としては、例えば、ｓｉｃａｓｔｅｒ（製造番号：４３－００－１０２、ｍｉｃｒｏｍｏｄ製）等の市販の粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子を用いることができる。
細孔径の小さい多孔質粒子の場合は、分子量の大きい高分子やシリカ微粒子を細孔内に入らない排除粒子として扱えるため、分子量の大きい高分子やシリカ微粒子の保持時間から排除粒子保持時間を求めることができる。しかし、細孔径の大きい多孔質粒子の場合は、分子量の大きい高分子やシリカ微粒子も細孔内に入ってしまうため、排除粒子保持時間の算出が困難である。
ここで、一般に球状の多孔質粒子をカラムに充填した場合、粒子間空隙率は３０～４０％となることが知られており（非特許文献１）、試料が内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラム内部の充填された粒子間の隙間のみを通ってくると仮定した場合、流量０．４ｍＬ／分のときの保持時間は、理論的には、１０．７～１４．３分となる。後述するように、製造例４～６の粒子は細孔径が比較的小さいため、剛体球である粒子径１００ｎｍシリカ微粒子が細孔内にほとんど入らないと推測される。そして、製造例４～６における粒子径１００ｎｍシリカ微粒子の保持時間は、いずれも１３～１４分の範囲内であった。そこで、製造例４～６におけるシリカ微粒子の保持時間の平均値に基づき、排除粒子保持時間の値を１３．６分に固定してＶ０を算出する。
細孔径の小さい多孔質粒子の場合は、分子量の大きい高分子やシリカ微粒子を細孔内に入らない排除粒子として扱えるため、分子量の大きい高分子やシリカ微粒子の保持時間から排除粒子保持時間を求めることができる。しかし、細孔径の大きい多孔質粒子の場合は、分子量の大きい高分子やシリカ微粒子も細孔内に入ってしまうため、排除粒子保持時間の算出が困難である。
ここで、一般に球状の多孔質粒子をカラムに充填した場合、粒子間空隙率は３０～４０％となることが知られており（非特許文献１）、試料が内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラム内部の充填された粒子間の隙間のみを通ってくると仮定した場合、流量０．４ｍＬ／分のときの保持時間は、理論的には、１０．７～１４．３分となる。後述するように、製造例４～６の粒子は細孔径が比較的小さいため、剛体球である粒子径１００ｎｍシリカ微粒子が細孔内にほとんど入らないと推測される。そして、製造例４～６における粒子径１００ｎｍシリカ微粒子の保持時間は、いずれも１３～１４分の範囲内であった。そこで、製造例４～６におけるシリカ微粒子の保持時間の平均値に基づき、排除粒子保持時間の値を１３．６分に固定してＶ０を算出する。
【0023】
（ｉｉｉ）測定サンプルの溶出体積ＶＲ（ｍＬ）を「測定サンプルの保持時間（分）」×流速（ｍＬ／分）×カラム体積（ｍＬ）」の式により算出する。測定サンプルとしては、例えば、東ソー製の、重量平均分子量２．３６×１０４Ｄａ（ＳＥ－２）、３．７６×１
０４Ｄａ（ＳＥ－５）、１．０７×１０５Ｄａ（ＳＥ－８）、１．４９×１０５Ｄａ（ＳＥ－１５）、２．８×１０５Ｄａ（ＳＥ－３０）、５．８×１０５Ｄａ（ＳＥ－７０）、および７．８６×１０５Ｄａ（ＳＥ－１５０）のポリエチレンオキサイドを使用することができる。また、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の、重量平均分子量２０４４０Ｄａ（ＰＥＧ２１３００）、１５２６０Ｄａ（ＰＥＧ１６１００）、７４６０Ｄａ（ＰＥＧ７８３０）、４１１０Ｄａ（ＰＥＧ４０４０）、１０２０Ｄａ（ＰＥＧ１０１０）、６２０Ｄａ（ＰＥＧ６１０）、４００Ｄａ（ＰＥＧ４００）のポリエチレングリコールを使用することができる。
０４Ｄａ（ＳＥ－５）、１．０７×１０５Ｄａ（ＳＥ－８）、１．４９×１０５Ｄａ（ＳＥ－１５）、２．８×１０５Ｄａ（ＳＥ－３０）、５．８×１０５Ｄａ（ＳＥ－７０）、および７．８６×１０５Ｄａ（ＳＥ－１５０）のポリエチレンオキサイドを使用することができる。また、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の、重量平均分子量２０４４０Ｄａ（ＰＥＧ２１３００）、１５２６０Ｄａ（ＰＥＧ１６１００）、７４６０Ｄａ（ＰＥＧ７８３０）、４１１０Ｄａ（ＰＥＧ４０４０）、１０２０Ｄａ（ＰＥＧ１０１０）、６２０Ｄａ（ＰＥＧ６１０）、４００Ｄａ（ＰＥＧ４００）のポリエチレングリコールを使用することができる。
【0024】
（ｉｖ）分配係数Ｋｄを以下の式にて算出する。
Ｋｄ＝（ＶＲ－Ｖ０）／（ＶＴ－Ｖ０）
Ｋｄ＝（ＶＲ－Ｖ０）／（ＶＴ－Ｖ０）
【0025】
（ｖ）”The Hydrodynamic Radii of Macromolecules and Their Effect on Red Blood Cell Aggregation” (J. K. Armstrong, et al., Biophysical Journal, 2004, 87, 4259-4270) を参考に、各測定サンプルの重量平均分子量Ｍｗ（Ｄａ）及び固有粘度［η］（ｍＬ／ｇ）に基づき、測定サンプルの粘度半径ｒｓ（ｎｍ）を以下の式により算出する。
ｒｓ＝（３［η］Ｍｗ／１０πＮ）１／３×１０７
［式中、Ｎはアボガドロ数を表す。］
ｒｓ＝（３［η］Ｍｗ／１０πＮ）１／３×１０７
［式中、Ｎはアボガドロ数を表す。］
【0026】
（ｖｉ）単一の細孔径であると仮定すると、分配係数Ｋｄと粒子の径深（hydraulic radius）ｒｈｙｄは以下の式で表される。
Ｋｄ＝（１－ｒｓ／ｒｈｙｄ）２
Ｋｄ＝（１－ｒｓ／ｒｈｙｄ）２
【0027】
各測定サンプルを測定したときのＫｄの０．５乗を縦軸、前記各測定サンプルの粘度半径ｒｓを横軸にとって、式 Ｋｄ
０．５＝１－ｒｓ／ｒｈｙｄを基に線形近似したときの傾きから－１／ｒｈｙｄを求めようとしたところ、実際の多孔質粒子では細孔径に分布があり、測定サンプルの粘度半径が５ｎｍ以下の場合（例えば、測定サンプルがＰＥＧ２１３００～ＰＥＧ４００の場合）とそれ以上の場合（例えば、測定サンプルがＳＥ－１５０～ＳＥ－２の場合）の間で傾きに大きな差があった。そこで、生体高分子の吸着に影響する大きな細孔の細孔径を算出するために、粘度半径が５ｎｍ以上である標準ポリエチレンオキサイドの各サンプルを測定したときのＫｄの０．５乗を縦軸、前記各サンプルの粘度半径ｒｓを横軸にとって、下記式を基に線形近似したときの傾きから－１／ｒｈｙｄを求める。
Ｋｄ ０．５＝Ｃ－ｒｓ／ｒｈｙｄ
［式中、Ｃは線形近似したときの切片を表す。］
Ｋｄ ０．５＝Ｃ－ｒｓ／ｒｈｙｄ
［式中、Ｃは線形近似したときの切片を表す。］
【0028】
（ｖｉｉ）粒子の細孔がシリンダー型の貫通孔であると仮定すると、粒子の細孔径ｒｐｏｒｅと径深ｒｈｙｄは以下の式で表される。
ｒｐｏｒｅ＝ｒｈｙｄ×２
上記式より、粒子の細孔径ｒｐｏｒｅを粒子の細孔径の推定値として算出する。
ｒｐｏｒｅ＝ｒｈｙｄ×２
上記式より、粒子の細孔径ｒｐｏｒｅを粒子の細孔径の推定値として算出する。
【0029】
本発明のリガンドにより修飾されていない状態での多孔質粒子の粒子内空隙率（粒子内部の空隙率）εｐは、特に限定されないが、５０～９７％であることが好ましく、６０～９５％であることがより好ましく、７０～９０％であることがさらに好ましい。εｐが上記範囲内であれば、粒子の強度を維持しつつ、高流速条件であっても動的吸着容量を大きくしやすくなる。εｐは、細孔径の推算値の算出において求める粒子間の空隙体積Ｖ０と移動相の総体積ＶＴから、下記の式で求めることができる。
εｐ＝（ＶＴ－Ｖ０）／（Ｖｃ－Ｖ０）
［式中、ＶＣはカラム体積（ｍＬ）を表す。］
εｐ＝（ＶＴ－Ｖ０）／（Ｖｃ－Ｖ０）
［式中、ＶＣはカラム体積（ｍＬ）を表す。］
【0030】
（２）リガンドにより修飾された状態での多孔質粒子の細孔径は、４００ｎｍ以上であり、７００ｎｍ以上であることが好ましく、７５０ｎｍ以上であることがより好ましい。上限値は、１８００ｎｍ以下であることが好ましく、１５００ｎｍ以下であることがより好ましく、１２００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。
リガンドにより修飾された多孔質粒子の細孔径は、多孔質粒子を圧密化させる際のカラム充填液として、純水の代わりに濃度０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液を用いること、および重量平均分子量１０６のポリエチレングリコール、測定サンプル（標準ポリエチレンオキサイド）、および排除粒子を含む各溶液またはスラリーの溶媒または分散媒と、保持時間測定時の移動相として、純水の代わりに濃度１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液を用いること以外は、リガンドにより修飾されていない多孔質粒子の細孔径の算出方法と同様の手順により算出することができる。
リガンドにより修飾された多孔質粒子の細孔径は、多孔質粒子を圧密化させる際のカラム充填液として、純水の代わりに濃度０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液を用いること、および重量平均分子量１０６のポリエチレングリコール、測定サンプル（標準ポリエチレンオキサイド）、および排除粒子を含む各溶液またはスラリーの溶媒または分散媒と、保持時間測定時の移動相として、純水の代わりに濃度１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液を用いること以外は、リガンドにより修飾されていない多孔質粒子の細孔径の算出方法と同様の手順により算出することができる。
【0031】
リガンドにより修飾された状態での多孔質粒子の粒子内空隙率εｐは、４０％～９５％が好ましく、５０％～９０％がより好ましく、６０％～８５％であることがさらに好ましい。εｐが上記範囲内であれば、粒子の強度を維持しつつ、高流速条件であっても動的吸着容量を大きくしやすくなる。εｐは、細孔径の推算値の算出において求める粒子間の空隙体積Ｖ０と移動相の総体積ＶＴから、下記の式で求めることができる。
εｐ＝（ＶＴ－Ｖ０）／（Ｖｃ－Ｖ０）
［式中、ＶＣはカラム体積（ｍＬ）を表す。］
εｐ＝（ＶＴ－Ｖ０）／（Ｖｃ－Ｖ０）
［式中、ＶＣはカラム体積（ｍＬ）を表す。］
【0032】
本発明の多孔質粒子は、上記（１）～（２）の特性のうちいずれか１つ以上の特性を満たす多孔質粒子であれば特に限定されないが、例えば、以下の多孔質粒子が挙げられる。
合成高分子系多孔質粒子、天然高分子系多孔質粒子等の有機系多孔質粒子；無機系多孔質粒子；これらを組み合わせた有機－有機複合系多孔質粒子や有機－無機複合系多孔質粒子等が挙げられる。天然高分子系多孔質粒子としては、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類系多孔質粒子（好ましくは架橋多糖類系多孔質粒子）が挙げられる。無機系多孔質粒子としては、ガラス、シリカゲル、金属、金属酸化物等で構成されるものが挙げられる。
合成高分子系多孔質粒子、天然高分子系多孔質粒子等の有機系多孔質粒子；無機系多孔質粒子；これらを組み合わせた有機－有機複合系多孔質粒子や有機－無機複合系多孔質粒子等が挙げられる。天然高分子系多孔質粒子としては、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類系多孔質粒子（好ましくは架橋多糖類系多孔質粒子）が挙げられる。無機系多孔質粒子としては、ガラス、シリカゲル、金属、金属酸化物等で構成されるものが挙げられる。
【0033】
これらの中でも、有機系多孔質粒子が好ましく、高分子系多孔質粒子がより好ましく、多糖類系多孔質粒子がさらに好ましい。また、多糖類系多孔質粒子の中でも、多孔質セルロース粒子が好ましい。多孔質セルロース粒子の主成分は、酢酸セルロースまたはセルロースが好ましく、タンパク質の非特異吸着がなく、高流速での通液で粒子形状が崩れないほど十分な強度を持つことから、酢酸セルロースまたはセルロースをケン化および架橋したものであることがより好ましい。
【0034】
なお、ここでいう主成分とは、多孔質セルロース粒子中の含有量が５０質量％以上である成分を意味する。多孔質セルロース粒子の主成分が酢酸セルロースまたはセルロースである場合、多孔質セルロース粒子中のセルロース及び／又は酢酸セルロースの含有量は、６０質量％～１００質量％であることが好ましく、７０質量％～１００質量％であることがより好ましい。また、酢酸セルロースの酢化度は、４５～５７％であることが好ましい。
【0035】
本発明の多孔質粒子のメジアン径は、特に限定されないが、好ましくは４０～２００μｍであり、より好ましくは５０～１２０μｍであり、さらに好ましくは６０～１００μｍである。４０μｍ以上であれば圧力損失を低くでき、２００μｍ以下であれば粒子の表面積を増やして生体高分子を多く結合させることができる。なお、ここでいうメジアン径は、例えば、粒度分布測定装置：ＨＯＲＩＢＡ製 Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｐａｒｔｉｃａ ＬＡ－９６０を使用してメジアン径を測定することにより算出することができる。
【0036】
本発明の多孔質粒子のＢＥＴ多点法による比表面積は、好ましくは１～２００ｍ２／ｇである。ＢＥＴ多点法による比表面積は、例えば、一昼夜凍結乾燥した後、１００℃、２時間、真空脱気して前処理をし、その後、高速比表面積／細孔分布測定装置（マイクロトラックベル製ＢＥＬＳＯＲＰ ＭＡＸＩＩ）を用いることにより測定し、測定温度が７７．３Ｋ、相対圧力が０．０５から０．３０の３点以上の圧力範囲において、固体表面に吸着した窒素ガス量の測定から得た吸着等温線（直線）から求めることができる。
【0037】
本発明の多孔質粒子の製造方法は、特に制限されないが、例えば、多孔質粒子が多孔質セルロース粒子である場合、（ａ）酢酸セルロースを酢酸セルロースが可溶な溶媒と酢酸セルロースが不溶な溶媒との混合溶媒に加熱溶解して、酢酸セルロース溶液を調製する工程と、（ｂ）前記酢酸セルロース溶液を、乳化安定剤を含む水中に分散させて、分散系を得る工程と、（ｃ）前記分散系を冷却し、酢酸セルロース粒子を析出させる工程を含む方法であって、前記混合溶媒が水と混和しない有機溶媒である方法により製造される。
【0038】
多孔質セルロース粒子製造工程の（ａ）について、（ａ）工程においては、原料の酢酸セルロースを混合溶媒に溶解して、酢酸セルロース溶液を調製する。酢酸セルロースは、天然の高分子であるセルロースを酢酸エステル化することにより得られる半合成高分子である。本発明において使用される酢酸セルロースは、一般的に酢酸セルロースと定義され得るものであれば特に限定されないが、重合度５０～３００、かつ酢化度が４５～５７％であることが好ましい。重合度５０～３００、かつ酢化度が４５～５７％である酢酸セルロースを使用することにより、より多くの種類の溶剤に溶解させることができる。
【0039】
（ａ）工程において、混合溶媒中の酢酸セルロースの割合は０．１～５０質量％が好ましく、５～２０質量％がさらに好ましい。この範囲であれば、均一な溶液が得られ、直径の揃った開口部を有する多孔質粒子が得られやすい。また、冷却した時に相分離による析出が生じやすく強度が十分なものとなり、略球状の粒子形状を維持しやすくなる。また酢酸セルロース溶液における酢酸セルロース濃度が低いほど、得られる多孔質粒子の粒径は小さく、細孔径は大きくなる傾向にある。また、酢酸セルロース溶液における酢酸セルロース濃度が高いほど粒子内空隙率εｐは小さくなる傾向にある。
【0040】
（ａ）工程において、前記酢酸セルロース溶液が可溶な溶媒、すなわち良溶媒は、酢酸セルロースを溶解できるものであれば特に限定されないが、水への溶解度の低い有機溶媒が好ましい。ここでいう良溶媒とは、溶質が溶媒単独に溶解し、固形物を含まない透明な溶液が得られるものをいう。特にここでは、溶媒の沸点以下の温度において好ましくは１質量％以上の溶液が得られる溶媒のことをいう。溶媒は、１種類を単独で使用しても、２種類以上の溶媒を混合して使用してもよい。具体的にはベンジルアルコール、酢酸エチル、シクロヘキサノン、イソホロン、およびこれらの混合物を挙げることができる。中でも、連通孔を空けるという点において、ベンジルアルコールが好ましい。
【0041】
（ａ）工程において、前記酢酸セルロース溶液が不溶な溶媒、すなわち貧溶媒は、アルコール類、グリコール類、エーテル類、エステル類、およびこれらの混合物を挙げることができる。貧溶媒とは良溶媒と比較して溶質に対して溶解性がないか又は溶解性の低い溶媒のことをいい、具体的には溶媒の沸点以下の温度において溶媒単独で溶質を溶解できず、透明な溶液が得られないものをいう。特にここでは好ましくは溶媒の沸点以下の温度において溶質を１質量％以上溶解できない溶媒のことをいう。水への溶解度の低い溶媒が好ましい。特に、アルコール類であることが好ましい。アルコール類は、低級アルコール類であることが好ましく、さらに連通孔を空けるという点において、１－ヘキサノールであることがより好ましい。
【0042】
（ａ）工程においては、混合溶媒における酢酸セルロースが可溶な溶媒すなわち良溶媒と酢酸セルロースが不溶な溶媒、すなわち貧溶媒の体積比は、５：９５から９５：５であることが好ましい。混合溶媒に含まれる貧溶媒の比率が高いほど、連通孔の平均径は大きくなる傾向にある。
【0043】
（ａ）工程において、混合溶媒は水と混和しない有機溶媒である。水と混和してしまうと、（ｂ）工程において、分散系を得ることができない。
【0044】
（ａ）工程においては、混合溶媒に高分子である第三成分を含有させることができる。第三成分の高分子としては、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールが好ましく、ポリプロピレングリコールがより好ましい。
【0045】
（ａ）工程において、第三成分がポリプロピレングリコールである場合、その分子量は、特に限定されないが、製造工程中の取扱い性と多孔質粒子が有する細孔径の観点から、１００～３０００の平均分子量（Ｍｗ）であることが好ましい。また第三成分の高分子の分子量が高いほど、細孔径は大きくなる傾向にある。
【0046】
（ａ）工程において、多孔質粒子の細孔径の観点から、混合溶媒中の第三の成分の濃度は０．１～１０質量％であることが好ましく、第三成分の濃度が高いほど、細孔径は大きくなる傾向にある。
【0047】
（ａ）工程においては、加熱溶解において、加熱温度は、例えば、５０～１３０℃の範囲が好ましい。この温度範囲において、酢酸セルロースが混合溶媒に溶解することが好ましい。この加熱溶解の時間は特に限定されず、例えば、加熱時間は３～２４時間とすることができる。
【0048】
多孔質セルロース粒子製造工程の（ｂ）について、乳化安定剤を溶解した高温水中に、前記酢酸セルロース溶液を分散させる。この工程における、酢酸セルロース溶液と高温水との体積比は、酢酸セルロース溶液を分散相、高温水を連続相とする分散系が得られる範囲であれば、特に限定はされない。安定な分散系を得る観点からは、酢酸セルロース溶液と高温水との体積比（分散相／連続相）は１．０以下であることが、好ましい。また高温水の温度は、５０～１００℃であることが好ましく、６０～９５℃であることがより好ましい。
【0049】
（ｂ）工程において、分散させる方法に関しては、公知の方法を任意に適用することができる。例えば、攪拌機などのミキサーを用いる方法、ホモジナイザーを用いる方法、超音波を用いる方法などがある。また、一般的にマイクロリアクターと称されるものを用いて、細いノズルから酢酸セルロース溶液を押し出して液滴を得る方法や、均一な細直径の多孔質膜から酢酸セルロース溶液、もしくは酢酸セルロース溶液と水と乳化安定剤の混合物を押し出してせん断をかける方法などがある。中でも、簡便な方法であることから、攪拌機により分散させる方法が好ましい。
【0050】
（ｂ）工程において、乳化安定剤としては、前記分散系の安定性を高め、粒子の凝集を防ぐ効果があるものであれば、特に限定されない。例えば、でんぷん、ペクチン、アルギン酸、アルギン酸塩、ゼラチンなどの天然高分子、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどの天然高分子加工物、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニルの部分ケン化物などのアルコール性ＯＨ含有合成高分子、スルホン化スチロールなどのＳＯ３Ｈ基含有高分子、アクリル酸エステルなどのＣＯＯＨ基含有高分子、ポリビニルピロリドンなどの含窒素合成高分子、硫酸バリウムやタルク、ベントナイト、酸化チタンなどの無機物質粉末、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどの
アニオン界面活性剤、アルキルトリメチルアンモニウム塩などのカチオン界面活性剤、アルキルジメチルアミンオキシドなどの両性界面活性剤、脂肪酸ソルビタンエステルなどのノニオン界面活性剤、またはこれらの混合物などを挙げることができる。特に、分散系を安定させるという観点から、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、またはこれらの混合物であることが好ましい。
アニオン界面活性剤、アルキルトリメチルアンモニウム塩などのカチオン界面活性剤、アルキルジメチルアミンオキシドなどの両性界面活性剤、脂肪酸ソルビタンエステルなどのノニオン界面活性剤、またはこれらの混合物などを挙げることができる。特に、分散系を安定させるという観点から、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、またはこれらの混合物であることが好ましい。
【0051】
（ｂ）工程において使用する乳化安定剤の添加量は、分散系を安定させるという観点から、高温水における濃度として０．０１質量％以上が好ましい。かかる濃度範囲において、乳化安定剤の添加量を多くすると、得られる多孔質セルロース粒子の粒径は小さくなる傾向にある。反対に、乳化安定剤の添加量が少ないと、得られる多孔質セルロース粒子の粒径は大きくなる傾向にある。
【0052】
多孔質セルロース粒子製造工程の（ｃ）においては、上記（ｂ）で得られた分散液を冷却する。冷却することにより熱誘起相分離が起こり、連通孔構造を有する多孔質セルロース粒子を得ることができる。
【0053】
（ｃ）工程において、分散系を冷却する温度は、酢酸セルロースが析出する温度であれば特に限定されない。しかし、多孔質セルロース粒子が十分に析出できるという点で、冷却する温度は０℃～５０℃であることが好ましい。
【0054】
（ｃ）工程において、分散系の冷却速度は、０．１℃／ｍｉｎ～１０℃／ｍｉｎであることが好ましく、０．１℃／ｍｉｎ～５℃／ｍｉｎであることがより好ましく、０．１℃／ｍｉｎ～２℃／ｍｉｎであることがさらに好ましい。冷却速度を調整することにより目的に応じた細孔径をもつ粒子を得ることができる。
【0055】
上記製造方法により、酢酸セルロースを原料とする多孔質セルロース粒子を得ることができる。この酢酸セルロースを原料とする多孔質セルロース粒子に親水性を持たせる場合は、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化化合物等の溶液中で鹸化して、酢酸セルロースをセルロースとする事ができる。
【0056】
本発明の多孔質粒子は、さらに、ケン化および架橋されていてもよい。ケン化および架橋処理は、公知の方法により行うことができ、例えば、多孔質セルロース粒子の架橋処理は、特開２００９－２４２７７０号などを参照して行うことができる。
架橋剤としては、セルロースの水酸基と反応結合し得る官能基を２つ以上もつものならば架橋剤として使用でき、例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリンなどのハロヒドリン；２官能性ビスエポキシド（ビスオキシラン）；グリセロールポリグリシジルエーテルなどの多官能性ポリエポキシド（ポリオキシラン）が挙げられる。
架橋剤としては、セルロースの水酸基と反応結合し得る官能基を２つ以上もつものならば架橋剤として使用でき、例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリンなどのハロヒドリン；２官能性ビスエポキシド（ビスオキシラン）；グリセロールポリグリシジルエーテルなどの多官能性ポリエポキシド（ポリオキシラン）が挙げられる。
【0057】
本発明の多孔質粒子は、リガンドにより修飾されていてもよい。すなわち、本発明の多孔質粒子の反応性官能基の少なくとも一部がリガンドにより修飾されていてもよい。リガンドは、多孔質粒子の表面に直接結合する、もしくは、粒子表面に導入されたエポキシ基やホルミル基、ビニル基等を介して結合する化合物であって、吸着対象と親和性を有するものであれば特に限定されない。例えば、公知のイオン交換基を含むリガンド、アフィニティーリガンド、疎水性基を含むリガンド、荷電基を含むリガンドなどが挙げられ、これらは単独で導入してもよく、複数を適宜組み合わせて導入してもよい。
【0058】
イオン交換基としては、例えば、２－ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、カルボキシメチル（ＣＭ）基、スルホン酸基、４級アンモニウム（Ｑ）基などが挙げられる。
疎水性基としては、例えば、フェニル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－オクチル基、ｎ－オクタデシル基などが挙げられる。
また、イオン交換基と疎水基を併せ持ついわゆるミックスモードの分離に使える公知のリガンドを用いてもよい。
アフィニティーリガンドとしては、例えば、硫酸エステル基を含むリガンド（例えば、硫酸化多糖）、プロテインＡ、抗体等のタンパク吸着用リガンドやポリリジン等のポリカチオン、ヘパリンやポリグルタミン酸、リン酸エステル基等を含むポリアニオンなどの機能性高分子等が挙げられる。
疎水性基としては、例えば、フェニル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－オクチル基、ｎ－オクタデシル基などが挙げられる。
また、イオン交換基と疎水基を併せ持ついわゆるミックスモードの分離に使える公知のリガンドを用いてもよい。
アフィニティーリガンドとしては、例えば、硫酸エステル基を含むリガンド（例えば、硫酸化多糖）、プロテインＡ、抗体等のタンパク吸着用リガンドやポリリジン等のポリカチオン、ヘパリンやポリグルタミン酸、リン酸エステル基等を含むポリアニオンなどの機能性高分子等が挙げられる。
【0059】
精製目的に応じて任意のリガンドにより修飾されている多孔質粒子を用いることができる。リガンドとしては、イオン交換基を含むリガンド、アフィニティーリガンド、および疎水性基を含むリガンドからなる群から選択される一以上が好ましい。
【0060】
本発明の多孔質粒子が、スルホン酸基を含むリガンドや硫酸エステル基を含むリガンドなどの、硫黄元素を含有するリガンドにより修飾されている場合、多孔質粒子の硫黄含有量は、０．１重量％～１０．０重量％であることが好ましく、１．０重量％～５．０重量％であることがより好ましい。
硫黄含有量は、硫黄元素を含有するリガンドの修飾量の指標であり、硫黄含有量が多いほど、硫黄元素を含有するリガンドの修飾量が多いことを示す。硫黄含有量は、例えば、リガンド修飾した多孔質粒子を乾燥させ、全自動元素分析装置ｖａｒｉｏ ＥＬ ｃｕｂｅ（Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ製）を用いたＣＨＮＳ（Ｃａｒｂｏｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｌｆｕｒ）元素分析により乾燥重量当たりの硫黄含有量（重量％）を求めることで、算出することができる。
硫黄含有量は、硫黄元素を含有するリガンドの修飾量の指標であり、硫黄含有量が多いほど、硫黄元素を含有するリガンドの修飾量が多いことを示す。硫黄含有量は、例えば、リガンド修飾した多孔質粒子を乾燥させ、全自動元素分析装置ｖａｒｉｏ ＥＬ ｃｕｂｅ（Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ製）を用いたＣＨＮＳ（Ｃａｒｂｏｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｌｆｕｒ）元素分析により乾燥重量当たりの硫黄含有量（重量％）を求めることで、算出することができる。
【0061】
硫黄含有量は、リガンドを有する化合物（２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、デキストラン硫酸ナトリウムなど）の添加量などによって調整することができ、精製目的などに応じて適宜決定すればよい。
【0062】
リガンドは、公知の方法によって導入でき、リガンド修飾された多孔質粒子は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー用の担体として好適に用いることができる。本発明の多孔質粒子は、その細孔径の大きさから、生体高分子を目的物質とする分離精製に適しており、アフィニティーリガンド、荷電基、疎水基などを導入したクロマトグラフィー担体は、生体高分子の精製に好ましく使用できる。
【0063】
精製される生体高分子の大きさは１～１００ｎｍであることが好ましく、１～２５ｎｍであることがより好ましく、５～１０ｎｍであることがさらに好ましい。上記範囲であれば、生体高分子が本発明の多孔質粒子の細孔に入り込みやすいため、高流速条件であっても高い吸着量を維持することが容易になる。
【0064】
生体高分子としては、ポリペプチド、例えば大腸菌、酵母、動物細胞における発現によって得た後に慣用的な方法で単離されたポリペプチド、タンパク質、合成ポリペプチドや合成タンパク質等の合成物、および、核酸（例えば、ＤＮＡなど）、並びに、それらの誘導体、（例えば、糖タンパク質、ＤＮＡコンジュゲート）、ウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス、インフルエンザウイルス）などが挙げられる。これらの中でも、生体高分子としては、ポリペプチド、タンパク質およびこれらの誘導体が好ましく、タンパク質およびその誘導体、特に抗体がより好ましい。
【0065】
本発明の液体クロマトグラフィー担体は、本発明の多孔質粒子を含む。
また、本発明の液体クロマトグラフィー装置は、本発明の液体クロマトグラフィー担体
を充填した分離カラムを含む。
分離カラムは、本発明の液体クロマトグラフィー担体が充填されていること以外は、通常の液体クロマトグラフィーの分離カラムと同様である。具体的には、カラム容器と当該カラム容器に充填された本発明の液体クロマトグラフィー担体とを備える分離カラムが挙げられる。
また、本発明の液体クロマトグラフィー装置は、本発明の液体クロマトグラフィー担体
を充填した分離カラムを含む。
分離カラムは、本発明の液体クロマトグラフィー担体が充填されていること以外は、通常の液体クロマトグラフィーの分離カラムと同様である。具体的には、カラム容器と当該カラム容器に充填された本発明の液体クロマトグラフィー担体とを備える分離カラムが挙げられる。
【0066】
分離カラムへの、本発明の液体クロマトグラフィー担体の充填方法については、特に限定されないが、例えば、ｆｌｏｗ ｐａｃｋｉｎｇやｄｙｎａｍｉｃ ａｘｉａｌ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ、ｐａｃｋ－ｉｎ－ｐｌａｃｅで行うことができる。
【0067】
本発明の液体クロマトグラフィー装置は、本発明の液体クロマトグラフィー担体を充填した分離カラムを含むこと以外は、従来の液体クロマトグラフィー装置を使用することができる。本発明の液体クロマトグラフィー装置は、ＨＰＬＣやＬＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳ／ＭＳ等の各分析装置の一部を構成してもよい。液体クロマトグラフィー装置は、例えば、試料溶液の導入部として、オートサンプラーを有し、試料溶液を分離カラムへ送液する送液装置を有し、分離カラムで、分離された試料を光学的に検出する検出部を有している。検出部での検出結果は、デジタル情報として液体クロマトグラフ内のデータ処理装置において、必要な分析処理が行われ、印刷装置又は表示装置などの出力装置に出力される。あるいは、他のデータ処理装置またはデータ記憶媒体へ出力してもよい。
【0068】
本発明の生体高分子の分離精製方法は、本発明の液体クロマトグラフィー装置を用いて生体高分子を分離精製する工程を含む。本発明の生体高分子の分離精製方法によれば、高流速条件、例えば、生体高分子を含む移動相のカラム滞留時間を２０秒以下、１０秒以下、７．５秒以下などの短いカラム滞留時間とする条件であっても、単位体積当たり、単位時間あたりに結合される目的の生体高分子の生産性を向上させることができる。なお、「カラム滞留時間」とは、「生体高分子を含む移動相を分離カラムに注入する際の流速」で、「カラム体積」を除算した値を意味する。
生体高分子に関する説明は、上記の記載を援用する。
生体高分子に関する説明は、上記の記載を援用する。
【実施例0069】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の態様に限定されるものではない。
【0070】
以下の手順により、製造例１～製造例７の粒子を作製した。なお、製造例１～３および７は実施例に相当し、製造例４～６は比較例に相当する。
【0071】
［製造例１］
・造粒工程
（１）酢酸セルロース１００ｇ（Ｌ－２０、（株）ダイセル社製）を、ベンジルアルコール３９１ｇ、１－ヘキサノール２７６ｇ、およびポリプロピレングリコール（和光純薬試薬、ジオール型、平均分子量１，０００）１４ｇの混合溶媒に加えて攪拌した。
（２）昇温して１２０℃で４時間撹拌することにより酢酸セルロースを溶解し、透明な酢酸セルロース溶液を得た。
（３）ＰＶＡ（ＪＰ－１８Ｅ、日本酢ビ・ポバール（株）社製）２ｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC１１４０、ダイセルミライズ（株）社製）３０ｇを混合溶媒
で飽和した純水２３００ｇに加え、昇温して８０℃で１時間以上攪拌、溶解することで、分散媒を得た。
（４）分散媒２３００ｇに前記酢酸セルロース溶液７７０ｇを素早く注ぎ、８０℃にて攪拌して分散系を得た。続いてこの分散系を３５℃まで冷却し、球状の酢酸セルロース粒子を得た。
（５）得られた酢酸セルロース粒子を大量の水、次いでメタノールで十分に洗浄した後、純水で再び洗浄した。
・造粒工程
（１）酢酸セルロース１００ｇ（Ｌ－２０、（株）ダイセル社製）を、ベンジルアルコール３９１ｇ、１－ヘキサノール２７６ｇ、およびポリプロピレングリコール（和光純薬試薬、ジオール型、平均分子量１，０００）１４ｇの混合溶媒に加えて攪拌した。
（２）昇温して１２０℃で４時間撹拌することにより酢酸セルロースを溶解し、透明な酢酸セルロース溶液を得た。
（３）ＰＶＡ（ＪＰ－１８Ｅ、日本酢ビ・ポバール（株）社製）２ｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC１１４０、ダイセルミライズ（株）社製）３０ｇを混合溶媒
で飽和した純水２３００ｇに加え、昇温して８０℃で１時間以上攪拌、溶解することで、分散媒を得た。
（４）分散媒２３００ｇに前記酢酸セルロース溶液７７０ｇを素早く注ぎ、８０℃にて攪拌して分散系を得た。続いてこの分散系を３５℃まで冷却し、球状の酢酸セルロース粒子を得た。
（５）得られた酢酸セルロース粒子を大量の水、次いでメタノールで十分に洗浄した後、純水で再び洗浄した。
【0072】
・ケン化工程
（１）得られた酢酸セルロース粒子６３０ｇ－ｗｅｔ（含水率６．８６）を１０７２ｇの純水と２４２ｇのメタノールの混合液に加え、温度を３５℃にして３０分間攪拌した。
（２）２０１ｇの２０％ＮａＯＨを加え、３５℃で２時間攪拌して反応させることでケン化した。
（３）３０℃以下に冷却して酢酸で中和した後、純水で十分に洗浄した後、得られたケン化セルロース球状粒子を目開き１０６μｍと目開き３２μｍの篩に通し、粒径３２～１０６μｍのケン化セルロース粒子を得た。
（１）得られた酢酸セルロース粒子６３０ｇ－ｗｅｔ（含水率６．８６）を１０７２ｇの純水と２４２ｇのメタノールの混合液に加え、温度を３５℃にして３０分間攪拌した。
（２）２０１ｇの２０％ＮａＯＨを加え、３５℃で２時間攪拌して反応させることでケン化した。
（３）３０℃以下に冷却して酢酸で中和した後、純水で十分に洗浄した後、得られたケン化セルロース球状粒子を目開き１０６μｍと目開き３２μｍの篩に通し、粒径３２～１０６μｍのケン化セルロース粒子を得た。
【0073】
・架橋工程
（１）得られたケン化セルロース粒子９６．４ｇ－ｗｅｔ（含水率７．９３）を１９４ｇの純水に分散させた後、７８．６ｇのＮａ２ＳＯ４を溶解させた。
（２）温度を５０℃にして３０分間撹拌した後、４．０ｇの４８％ＮａＯＨと０．６９ｇのＮａＢＨ４を投入し、３０分間かけて溶解、反応させた。
（３）溶解後、３６．４ｍＬの４８％ＮａＯＨ溶液と６２ｇのエピクロロヒドリンをそれぞれ８等分した量を、３０分おきにおよそ４時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。温度を３０℃以下に冷却し、酢酸を加えて中和した。
（５）反応混合物をろ過してゲルを回収し、純水でろ過洗浄し、架橋した多孔質粒子を得た。
（１）得られたケン化セルロース粒子９６．４ｇ－ｗｅｔ（含水率７．９３）を１９４ｇの純水に分散させた後、７８．６ｇのＮａ２ＳＯ４を溶解させた。
（２）温度を５０℃にして３０分間撹拌した後、４．０ｇの４８％ＮａＯＨと０．６９ｇのＮａＢＨ４を投入し、３０分間かけて溶解、反応させた。
（３）溶解後、３６．４ｍＬの４８％ＮａＯＨ溶液と６２ｇのエピクロロヒドリンをそれぞれ８等分した量を、３０分おきにおよそ４時間かけて添加した。
（４）添加終了後、温度５０℃で１６時間反応させた。温度を３０℃以下に冷却し、酢酸を加えて中和した。
（５）反応混合物をろ過してゲルを回収し、純水でろ過洗浄し、架橋した多孔質粒子を得た。
【0074】
［製造例２］
（１）酢酸セルロース６８１ｇ（Ｌ－２０、（株）ダイセル社製）を、ベンジルアルコール２６７１ｇ、１－ヘキサノール１８８３ｇ、およびポリプロピレングリコール（和光純薬試薬、ジオール型、平均分子量１，０００）９７ｇの混合溶媒に加えて攪拌した。
（２）昇温して１２０℃で４時間撹拌することにより酢酸セルロースを溶解し、透明な酢酸セルロース溶液を得た。
（３）ＰＶＡ（ＪＰ－１８Ｅ、日本酢ビ・ポバール（株）社製）１４ｇ、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC１１４０、ダイセルミライズ（株）社製）２５２ｇ
を、混合溶媒で飽和した純水１８ｋｇに加え、昇温して８０℃で１時間以上攪拌、溶解することで、分散媒を得た。
（４）分散媒１６ｋｇに前記酢酸セルロース溶液５３００ｇを注ぎ、８０℃にて攪拌して分散系を得た。続いてこの分散系を約１時間で８０℃から３５℃まで冷却し、球状の酢酸セルロース粒子を得た。
（５）得られた酢酸セルロース粒子を大量の水、次いでメタノールで十分に洗浄した後、純水で再び洗浄した。得られた酢酸セルロース粒子を製造例１と同様の手順でケン化した後、得られたケン化セルロース球状粒子を目開き１５０μｍと目開き４５μｍの篩に通し、粒径４５～１５０μｍのケン化セルロース粒子を得た。その後、製造例１と同様の手順で架橋を行い、架橋した多孔質粒子を得た。
（１）酢酸セルロース６８１ｇ（Ｌ－２０、（株）ダイセル社製）を、ベンジルアルコール２６７１ｇ、１－ヘキサノール１８８３ｇ、およびポリプロピレングリコール（和光純薬試薬、ジオール型、平均分子量１，０００）９７ｇの混合溶媒に加えて攪拌した。
（２）昇温して１２０℃で４時間撹拌することにより酢酸セルロースを溶解し、透明な酢酸セルロース溶液を得た。
（３）ＰＶＡ（ＪＰ－１８Ｅ、日本酢ビ・ポバール（株）社製）１４ｇ、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム（CMC１１４０、ダイセルミライズ（株）社製）２５２ｇ
を、混合溶媒で飽和した純水１８ｋｇに加え、昇温して８０℃で１時間以上攪拌、溶解することで、分散媒を得た。
（４）分散媒１６ｋｇに前記酢酸セルロース溶液５３００ｇを注ぎ、８０℃にて攪拌して分散系を得た。続いてこの分散系を約１時間で８０℃から３５℃まで冷却し、球状の酢酸セルロース粒子を得た。
（５）得られた酢酸セルロース粒子を大量の水、次いでメタノールで十分に洗浄した後、純水で再び洗浄した。得られた酢酸セルロース粒子を製造例１と同様の手順でケン化した後、得られたケン化セルロース球状粒子を目開き１５０μｍと目開き４５μｍの篩に通し、粒径４５～１５０μｍのケン化セルロース粒子を得た。その後、製造例１と同様の手順で架橋を行い、架橋した多孔質粒子を得た。
【0075】
［製造例３］
製造例２と同様に調製した酢酸セルロースと分散媒を混合攪拌して得た分散系を約５０分間かけて８０℃から３５℃まで冷却し、球状の酢酸セルロース粒子を得た。
得られた酢酸セルロース粒子を製造例２と同様の手順でケン化、分級および架橋して、架橋した多孔質粒子を得た。
製造例２と同様に調製した酢酸セルロースと分散媒を混合攪拌して得た分散系を約５０分間かけて８０℃から３５℃まで冷却し、球状の酢酸セルロース粒子を得た。
得られた酢酸セルロース粒子を製造例２と同様の手順でケン化、分級および架橋して、架橋した多孔質粒子を得た。
【0076】
［製造例４］
製造例２と同様に調製した酢酸セルロースと分散媒を混合攪拌して得た分散系を約９０分間で８０℃から３５℃まで冷却し、球状の酢酸セルロース粒子を得た。
得られた酢酸セルロース粒子を製造例２と同様の手順でケン化、分級および架橋して、架橋した多孔質粒子を得た。
製造例２と同様に調製した酢酸セルロースと分散媒を混合攪拌して得た分散系を約９０分間で８０℃から３５℃まで冷却し、球状の酢酸セルロース粒子を得た。
得られた酢酸セルロース粒子を製造例２と同様の手順でケン化、分級および架橋して、架橋した多孔質粒子を得た。
【0077】
［製造例５］
酢酸セルロース１００ｇ（Ｌ－２０、（株）ダイセル社製）を、ベンジルアルコール３９１ｇ、１－ヘキサノール２７６ｇ、およびポリプロピレングリコール（和光純薬試薬、ジオール型、平均分子量１，０００）７ｇの混合溶媒に加えて攪拌した。その後製造例１と同様の手順で球状の酢酸セルロース粒子を得た。
得られた酢酸セルロース粒子を製造例１と同様の手順でケン化、分級および架橋して、架橋した多孔質粒子を得た。
酢酸セルロース１００ｇ（Ｌ－２０、（株）ダイセル社製）を、ベンジルアルコール３９１ｇ、１－ヘキサノール２７６ｇ、およびポリプロピレングリコール（和光純薬試薬、ジオール型、平均分子量１，０００）７ｇの混合溶媒に加えて攪拌した。その後製造例１と同様の手順で球状の酢酸セルロース粒子を得た。
得られた酢酸セルロース粒子を製造例１と同様の手順でケン化、分級および架橋して、架橋した多孔質粒子を得た。
【0078】
［製造例６］
・造粒工程
（１）１００ｇのチオシアン酸カルシウム６０重量％水溶液に６．４ｇの結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ株式会社製、商品名：セオラスＰＨ１０１）を加え、１１０～１２０℃に加熱して溶解した。
（２）この溶液に界面活性剤としてソルビタンモノオレエート６ｇを添加し、１３０～１４０℃に予め加熱したｏ－ジクロロベンゼン４８０ｍＬ中に滴下して攪拌分散した。
（３）上記分散液を４０℃以下まで冷却し、メタノール１９０ｍＬ中に注ぎ、粒子の懸濁液を得た。
（４）懸濁液を濾過分別し、粒子をメタノール１９０ｍＬにて洗浄し、濾過分別した。この洗浄操作を数回行った。
（５）大量の水で洗浄した後、球状セルロース粒子を得た。
（６）この球状セルロース粒子を目開き１２５μｍと目開き５３μｍの篩に通し、粒径５３μｍ～１２５μｍのセルロース粒子を得た。
・造粒工程
（１）１００ｇのチオシアン酸カルシウム６０重量％水溶液に６．４ｇの結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ株式会社製、商品名：セオラスＰＨ１０１）を加え、１１０～１２０℃に加熱して溶解した。
（２）この溶液に界面活性剤としてソルビタンモノオレエート６ｇを添加し、１３０～１４０℃に予め加熱したｏ－ジクロロベンゼン４８０ｍＬ中に滴下して攪拌分散した。
（３）上記分散液を４０℃以下まで冷却し、メタノール１９０ｍＬ中に注ぎ、粒子の懸濁液を得た。
（４）懸濁液を濾過分別し、粒子をメタノール１９０ｍＬにて洗浄し、濾過分別した。この洗浄操作を数回行った。
（５）大量の水で洗浄した後、球状セルロース粒子を得た。
（６）この球状セルロース粒子を目開き１２５μｍと目開き５３μｍの篩に通し、粒径５３μｍ～１２５μｍのセルロース粒子を得た。
【0079】
・架橋工程
（１）得られたセルロース粒子１００ｇに１２１ｇの純水を加え、攪拌しながら加温した。３０℃に到達したところで４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．３ｇとＮａＢＨ４ ０．５ｇとを加え、撹拌した。初期アルカリ濃度は０．６９％（ｗ／ｗ）であった。
（２）３０分後、６０ｇのＮａ２ＳＯ４を反応液に加え、溶解させた。混合物の温度が５０℃に到達した時点で、２時間撹拌を継続した。
（３）５０℃で混合物の撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン５０ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、この混合物を温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）この混合物を温度４０℃以下に冷却した後、酢酸２．６ｇを加え、中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、架橋したセルロース粒子を得た。
（１）得られたセルロース粒子１００ｇに１２１ｇの純水を加え、攪拌しながら加温した。３０℃に到達したところで４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．３ｇとＮａＢＨ４ ０．５ｇとを加え、撹拌した。初期アルカリ濃度は０．６９％（ｗ／ｗ）であった。
（２）３０分後、６０ｇのＮａ２ＳＯ４を反応液に加え、溶解させた。混合物の温度が５０℃に到達した時点で、２時間撹拌を継続した。
（３）５０℃で混合物の撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン５０ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、この混合物を温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）この混合物を温度４０℃以下に冷却した後、酢酸２．６ｇを加え、中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、架橋したセルロース粒子を得た。
【0080】
［製造例７］
（１）酢酸セルロース２８ｇ（Ｌ－２０、（株）ダイセル社製）をベンジルアルコール１１０ｇ、１－ヘキサノール７７ｇ、ポリプロピレングリコール（和光純薬試薬、ジオール型、平均分子量１，０００）４ｇの混合溶媒に加えて攪拌した。
（２）昇温して１２０℃で４時間撹拌することにより酢酸セルロースを溶解し、透明な酢酸セルロース溶液を得た。
（３）ＰＶＡ（ＪＰ－１８Ｅ、日本酢ビ・ポバール（株）社製）０．４６ｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ１１４０、ダイセルミライズ（株）社製）６．８ｇ
を混合溶媒で飽和した純水５７０ｇに加え、昇温して８０℃で１時間以上攪拌、溶解することで、分散媒を得た。
（４）分散媒５７７ｇに前記酢酸セルロース溶液２１９ｇを注ぎ、８０℃にて攪拌して分散系を得た。続いてこの分散系を約１時間で８０℃から３５℃まで冷却し、球状の酢酸セルロース粒子を得た。
（５）得られた酢酸セルロース粒子を大量の水、次いでメタノールで十分に洗浄した後、純水で再び洗浄した。得られた酢酸セルロース粒子を製造例１と同様の手順でケン化した後、得られたケン化セルロース球状粒子を目開き１５０μｍと目開き４５μｍの篩に通し、粒径４５～１５０μｍのケン化セルロース粒子を得た。その後、製造例１と同様の手順で架橋を行い、架橋した多孔質粒子を得た。
（１）酢酸セルロース２８ｇ（Ｌ－２０、（株）ダイセル社製）をベンジルアルコール１１０ｇ、１－ヘキサノール７７ｇ、ポリプロピレングリコール（和光純薬試薬、ジオール型、平均分子量１，０００）４ｇの混合溶媒に加えて攪拌した。
（２）昇温して１２０℃で４時間撹拌することにより酢酸セルロースを溶解し、透明な酢酸セルロース溶液を得た。
（３）ＰＶＡ（ＪＰ－１８Ｅ、日本酢ビ・ポバール（株）社製）０．４６ｇ、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ１１４０、ダイセルミライズ（株）社製）６．８ｇ
を混合溶媒で飽和した純水５７０ｇに加え、昇温して８０℃で１時間以上攪拌、溶解することで、分散媒を得た。
（４）分散媒５７７ｇに前記酢酸セルロース溶液２１９ｇを注ぎ、８０℃にて攪拌して分散系を得た。続いてこの分散系を約１時間で８０℃から３５℃まで冷却し、球状の酢酸セルロース粒子を得た。
（５）得られた酢酸セルロース粒子を大量の水、次いでメタノールで十分に洗浄した後、純水で再び洗浄した。得られた酢酸セルロース粒子を製造例１と同様の手順でケン化した後、得られたケン化セルロース球状粒子を目開き１５０μｍと目開き４５μｍの篩に通し、粒径４５～１５０μｍのケン化セルロース粒子を得た。その後、製造例１と同様の手順で架橋を行い、架橋した多孔質粒子を得た。
【0081】
［実施例１］
・リガンド修飾工程
４０ｇの純水に２１ｇの２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸を溶解させた後、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液を８．４ｇ加えて中和し、さらに製造例１により得られた多孔質粒子２０ｇ－ｗｅｔを加えてスラリーとした。反応容器の減圧および窒素ガス充填を３回実施した後、窒素雰囲気下の状態で撹拌しながら、０．１７ｍｏｌ／ｍＬの硝酸水溶液９．５ｍＬに硝酸アンモニウムセリウムを０．９ｇ溶解させた液を反応容器にゆっくりと投入した。投入後、窒素雰囲気下の状態のまま反応容器を４０℃に昇温し、１６時間反応させた。反応混合物をろ過してゲルを回収し、純水で３回洗浄した。次に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸８０ｍＬで１０回洗浄した後、純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。その後、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム８０ｍＬで洗浄し、最後に純水で洗浄液が中性になるまでろ過洗浄し、リガンド修飾した多孔質粒子を得た。
・リガンド修飾工程
４０ｇの純水に２１ｇの２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸を溶解させた後、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液を８．４ｇ加えて中和し、さらに製造例１により得られた多孔質粒子２０ｇ－ｗｅｔを加えてスラリーとした。反応容器の減圧および窒素ガス充填を３回実施した後、窒素雰囲気下の状態で撹拌しながら、０．１７ｍｏｌ／ｍＬの硝酸水溶液９．５ｍＬに硝酸アンモニウムセリウムを０．９ｇ溶解させた液を反応容器にゆっくりと投入した。投入後、窒素雰囲気下の状態のまま反応容器を４０℃に昇温し、１６時間反応させた。反応混合物をろ過してゲルを回収し、純水で３回洗浄した。次に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸８０ｍＬで１０回洗浄した後、純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。その後、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム８０ｍＬで洗浄し、最後に純水で洗浄液が中性になるまでろ過洗浄し、リガンド修飾した多孔質粒子を得た。
【0082】
［実施例２］
製造例２で得られた架橋した多孔質粒子を用いたほかは、実施例１と同様の手順でリガンド修飾反応を行い、リガンド修飾した多孔質粒子を得た。
製造例２で得られた架橋した多孔質粒子を用いたほかは、実施例１と同様の手順でリガンド修飾反応を行い、リガンド修飾した多孔質粒子を得た。
【0083】
［実施例３］
製造例３で得られた架橋した多孔質粒子を用いたほかは、実施例１と同様の手順でリガンド修飾反応を行い、リガンド修飾した多孔質粒子を得た。
製造例３で得られた架橋した多孔質粒子を用いたほかは、実施例１と同様の手順でリガンド修飾反応を行い、リガンド修飾した多孔質粒子を得た。
【0084】
［実施例４］
・リガンド修飾工程
（エポキシ化工程）
（１）製造例７より得られた架橋した多孔質粒子６０ｇ－ｗｅｔ（含水率５．０１）を１０３ｍＬの純水に加えて撹拌した。
（２）内部温度を３０℃に調整し、エピクロロヒドリン５８．５ｇを添加した。
（３）１５分撹拌後、４８％ＮａＯＨ水溶液５４．７ｇを添加して２時間反応を行った。（４）反応終了後、酢酸で中和した後、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄し、エポキシ活性化多孔質粒子を得た。
（５）エポキシ活性化多孔質粒子１．０ｇを１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液３．０ｍＬとともに３０℃に温度設定した振盪機で１時間振盪し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸で滴定することによりエポキシ量を定量した。このエポキシ基量は２２９μｍｏｌ／ｇ－ｄｒｙであった。
（硫酸化多糖の結合工程）
（１）デキストラン硫酸ナトリウムＤＳ－５００（名糖産業株式会社製）４．０ｇを、５１ｍＬの純水に加え、デキストラン硫酸ナトリウムが完全に溶解するまで撹拌した。
（２）エポキシ活性化多孔質粒子３０ｇ－ｗｅｔを、反応器内に加えた。
（３）良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１５分撹拌後、硫酸ナトリウム２０
．７ｇ、りん酸水素二ナトリウム２２．１ｇ、４８％ＮａＯＨ水溶液３．２ｇを添加した。
（４）４０℃に温度を上げて、６時間反応を行った。
（５）反応終了後、純水２３．８ｍＬに４８％ＮａＯＨ水溶液３．３ｍＬおよびテトラヒドロほう酸ナトリウム０．５ｇを溶解させた溶液を加え、さらに１６時間反応させた。
（６）反応後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄しデキストラン硫酸化された多孔質粒子を得た。
・リガンド修飾工程
（エポキシ化工程）
（１）製造例７より得られた架橋した多孔質粒子６０ｇ－ｗｅｔ（含水率５．０１）を１０３ｍＬの純水に加えて撹拌した。
（２）内部温度を３０℃に調整し、エピクロロヒドリン５８．５ｇを添加した。
（３）１５分撹拌後、４８％ＮａＯＨ水溶液５４．７ｇを添加して２時間反応を行った。（４）反応終了後、酢酸で中和した後、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄し、エポキシ活性化多孔質粒子を得た。
（５）エポキシ活性化多孔質粒子１．０ｇを１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液３．０ｍＬとともに３０℃に温度設定した振盪機で１時間振盪し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸で滴定することによりエポキシ量を定量した。このエポキシ基量は２２９μｍｏｌ／ｇ－ｄｒｙであった。
（硫酸化多糖の結合工程）
（１）デキストラン硫酸ナトリウムＤＳ－５００（名糖産業株式会社製）４．０ｇを、５１ｍＬの純水に加え、デキストラン硫酸ナトリウムが完全に溶解するまで撹拌した。
（２）エポキシ活性化多孔質粒子３０ｇ－ｗｅｔを、反応器内に加えた。
（３）良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１５分撹拌後、硫酸ナトリウム２０
．７ｇ、りん酸水素二ナトリウム２２．１ｇ、４８％ＮａＯＨ水溶液３．２ｇを添加した。
（４）４０℃に温度を上げて、６時間反応を行った。
（５）反応終了後、純水２３．８ｍＬに４８％ＮａＯＨ水溶液３．３ｍＬおよびテトラヒドロほう酸ナトリウム０．５ｇを溶解させた溶液を加え、さらに１６時間反応させた。
（６）反応後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄しデキストラン硫酸化された多孔質粒子を得た。
【0085】
［比較例１］
製造例４で得られた架橋した多孔質粒子を用いたほかは、実施例１と同様の手順でリガンド修飾反応を行い、リガンド修飾した多孔質粒子を得た。
製造例４で得られた架橋した多孔質粒子を用いたほかは、実施例１と同様の手順でリガンド修飾反応を行い、リガンド修飾した多孔質粒子を得た。
【0086】
［比較例２］
製造例５で得られた架橋した多孔質粒子を用いたほかは、実施例１と同様の手順でリガンド修飾反応を行い、リガンド修飾した多孔質粒子を得た。
製造例５で得られた架橋した多孔質粒子を用いたほかは、実施例１と同様の手順でリガンド修飾反応を行い、リガンド修飾した多孔質粒子を得た。
【0087】
［比較例３］
・リガンド修飾工程
６４．４ｇの純水に８．７ｇの２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸を溶解させた後、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液を３．４ｇ加えて中和し、さらに製造例６により得られた多孔質粒子８０ｇ－ｗｅｔを加えてスラリーとした。反応容器の減圧および窒素ガス充填を３回実施した後、窒素雰囲気下の状態で撹拌しながら、０．１７ｍｏｌ／ｍＬの硝酸水溶液１８．１ｍＬに硝酸アンモニウムセリウムを５．１９ｇ溶解させた液を反応容器にゆっくりと投入した。投入後、窒素雰囲気下の状態のまま反応容器を４０℃に昇温し、１６時間反応させた。反応混合物をろ過してゲルを回収し、純水で３回洗浄した。次に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸８０ｍＬで１０回洗浄した後、純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。その後、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム８０ｍＬで洗浄し、最後に純水で洗浄液が中性になるまでろ過洗浄し、リガンド修飾した多孔質粒子を得た。
・リガンド修飾工程
６４．４ｇの純水に８．７ｇの２－アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸を溶解させた後、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液を３．４ｇ加えて中和し、さらに製造例６により得られた多孔質粒子８０ｇ－ｗｅｔを加えてスラリーとした。反応容器の減圧および窒素ガス充填を３回実施した後、窒素雰囲気下の状態で撹拌しながら、０．１７ｍｏｌ／ｍＬの硝酸水溶液１８．１ｍＬに硝酸アンモニウムセリウムを５．１９ｇ溶解させた液を反応容器にゆっくりと投入した。投入後、窒素雰囲気下の状態のまま反応容器を４０℃に昇温し、１６時間反応させた。反応混合物をろ過してゲルを回収し、純水で３回洗浄した。次に１ｍｏｌ／Ｌ硫酸８０ｍＬで１０回洗浄した後、純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。その後、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム８０ｍＬで洗浄し、最後に純水で洗浄液が中性になるまでろ過洗浄し、リガンド修飾した多孔質粒子を得た。
【0088】
［比較例４］
リガンド修飾した多孔質粒子として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から購入した強陽イオン交換樹脂ＰＯＲＯＳ ＸＳを用いた。
リガンド修飾した多孔質粒子として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から購入した強陽イオン交換樹脂ＰＯＲＯＳ ＸＳを用いた。
【0089】
［比較例５］
リガンド修飾した多孔質粒子として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から購入した強陽イオン交換樹脂ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳを用いた。
リガンド修飾した多孔質粒子として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．から購入した強陽イオン交換樹脂ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳを用いた。
【0090】
［比較例６］
・リガンド修飾工程
（エポキシ化工程）
（１）製造例６より得られた架橋した多孔質粒子４０ｇ－ｗｅｔを３０ｍＬの純水に加えて撹拌した。
（２）内部温度を３０℃に調整し、エピクロロヒドリン２４．７ｇを添加した。
（３）１５分撹拌後、４８％ＮａＯＨ水溶液２３．１ｇを添加して２時間反応を行った。（４）反応終了後、酢酸で中和した後、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄し、エポキシ活性化多孔質粒子を得た。
（５）エポキシ活性化多孔質粒子１．０ｇを１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液３．０ｍＬとともに３０℃に温度設定した振盪機で１時間振盪し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸で滴定することによりエポキシ量を定量した。このエポキシ基量は２３０μｍｏｌ／ｇ－ｄｒｙであ
った。
（硫酸化多糖の結合工程）
（１）デキストラン硫酸ナトリウムＤＳ－５００（名糖産業株式会社製）３．３ｇを、２５．６ｍＬの純水に加え、デキストラン硫酸ナトリウムが完全に溶解するまで撹拌した。（２）エポキシ活性化多孔質粒子４０ｇ－ｗｅｔを、反応器内に加えた。
（３）良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１５分撹拌後、硫酸ナトリウム１６．７ｇ、りん酸水素二ナトリウム２６．８ｇ、４８％ＮａＯＨ水溶液２．６ｇを添加した。
（４）４０℃に温度を上げて、６時間反応を行った。
（５）反応終了後、純水２８．３ｍＬに４８％ＮａＯＨ水溶液３．１ｍＬおよびテトラヒドロほう酸ナトリウム０．２ｇを溶解させた溶液を加え、さらに１６時間反応させた。
（６）反応後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄しデキストラン硫酸化された多孔質粒子を得た。
・リガンド修飾工程
（エポキシ化工程）
（１）製造例６より得られた架橋した多孔質粒子４０ｇ－ｗｅｔを３０ｍＬの純水に加えて撹拌した。
（２）内部温度を３０℃に調整し、エピクロロヒドリン２４．７ｇを添加した。
（３）１５分撹拌後、４８％ＮａＯＨ水溶液２３．１ｇを添加して２時間反応を行った。（４）反応終了後、酢酸で中和した後、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄し、エポキシ活性化多孔質粒子を得た。
（５）エポキシ活性化多孔質粒子１．０ｇを１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液３．０ｍＬとともに３０℃に温度設定した振盪機で１時間振盪し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸で滴定することによりエポキシ量を定量した。このエポキシ基量は２３０μｍｏｌ／ｇ－ｄｒｙであ
った。
（硫酸化多糖の結合工程）
（１）デキストラン硫酸ナトリウムＤＳ－５００（名糖産業株式会社製）３．３ｇを、２５．６ｍＬの純水に加え、デキストラン硫酸ナトリウムが完全に溶解するまで撹拌した。（２）エポキシ活性化多孔質粒子４０ｇ－ｗｅｔを、反応器内に加えた。
（３）良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１５分撹拌後、硫酸ナトリウム１６．７ｇ、りん酸水素二ナトリウム２６．８ｇ、４８％ＮａＯＨ水溶液２．６ｇを添加した。
（４）４０℃に温度を上げて、６時間反応を行った。
（５）反応終了後、純水２８．３ｍＬに４８％ＮａＯＨ水溶液３．１ｍＬおよびテトラヒドロほう酸ナトリウム０．２ｇを溶解させた溶液を加え、さらに１６時間反応させた。
（６）反応後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄しデキストラン硫酸化された多孔質粒子を得た。
【0091】
［測定法１：メジアン径の測定］
上記製造例１～７、実施例１～４、比較例１～６で得られた粒子について、粒度分布を測定し、メジアン径を求めた。測定に使用した装置は、以下の通りである。
装置：Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｐａｒｔｉｃａ ＬＡ－９６０（ＨＯＲＩＢＡ製）
上記装置を使用してメジアン径を測定した。
上記製造例１～７、実施例１～４、比較例１～６で得られた粒子について、粒度分布を測定し、メジアン径を求めた。測定に使用した装置は、以下の通りである。
装置：Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｐａｒｔｉｃａ ＬＡ－９６０（ＨＯＲＩＢＡ製）
上記装置を使用してメジアン径を測定した。
【0092】
［測定法２：架橋粒子の保持時間の測定、細孔径の推算、粒子内空隙率の推算］
上記製造例１～７で得られた粒子について、内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのステンレス製カラム（東ソー製）に充填した後、表１に示す各試料の保持時間を測定した。充填方法は、粒子を純水で分散させてスラリーにした後、カラムに充填し、さらに純水を流量０．４ｍＬ／分で１時間以上流して圧密化させた。各試料の分散媒および各試料の保持時間を測定する際の移動相には、純水を用いた。また、測定する際のカラム温度は２５℃に調整した。ＲＩ検出強度が最大になる値を溶出ピークとし、その時間を保持時間とした。測定装置として１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いた。
上記製造例１～７で得られた粒子について、内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのステンレス製カラム（東ソー製）に充填した後、表１に示す各試料の保持時間を測定した。充填方法は、粒子を純水で分散させてスラリーにした後、カラムに充填し、さらに純水を流量０．４ｍＬ／分で１時間以上流して圧密化させた。各試料の分散媒および各試料の保持時間を測定する際の移動相には、純水を用いた。また、測定する際のカラム温度は２５℃に調整した。ＲＩ検出強度が最大になる値を溶出ピークとし、その時間を保持時間とした。測定装置として１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いた。
【0093】
【表1】
【0094】
粒子の細孔径は下記の手順で算出した。
（ｉ）移動相の総体積ＶＴ（ｍＬ）を「重量平均分子量１０６のポリエチレングリコール（ＰＥＧ１０６）の保持時間（分）×流速（ｍＬ／分）×カラム体積（ｍＬ）」の式により算出した。なお、流速０．４ｍＬ／分、カラム体積１４．３４ｍＬとして、ＶＴを算出した。
（ｉｉ）粒子間の空隙体積Ｖ０（ｍＬ）は「排除粒子保持時間（分）×流速（ｍＬ／分）×カラム体積（ｍＬ）」の式により算出した。なお、流速０．４ｍＬ／分、カラム体積１４．３４ｍＬとして、Ｖ０を算出した。また、排除粒子保持時間の値は、いずれの製造例においても、１３．６分（すなわち、製造例４～６におけるシリカ微粒子の保持時間の平均値）に固定してＶ０を算出した。
（ｉ）移動相の総体積ＶＴ（ｍＬ）を「重量平均分子量１０６のポリエチレングリコール（ＰＥＧ１０６）の保持時間（分）×流速（ｍＬ／分）×カラム体積（ｍＬ）」の式により算出した。なお、流速０．４ｍＬ／分、カラム体積１４．３４ｍＬとして、ＶＴを算出した。
（ｉｉ）粒子間の空隙体積Ｖ０（ｍＬ）は「排除粒子保持時間（分）×流速（ｍＬ／分）×カラム体積（ｍＬ）」の式により算出した。なお、流速０．４ｍＬ／分、カラム体積１４．３４ｍＬとして、Ｖ０を算出した。また、排除粒子保持時間の値は、いずれの製造例においても、１３．６分（すなわち、製造例４～６におけるシリカ微粒子の保持時間の平均値）に固定してＶ０を算出した。
【0095】
（ｉｉｉ）測定サンプル（標準ポリエチレンオキサイド）の溶出体積ＶＲ（ｍＬ）を「測定サンプルの保持時間（分）」×流速（ｍＬ／分）×カラム体積（ｍＬ）」の式により算出した。なお、流速０．４ｍＬ／分、カラム体積１４．３４ｍＬとして、ＶＲを算出した。
【0096】
（ｉｖ）分配係数Ｋｄを以下の式にて算出した。
Ｋｄ＝（ＶＲ－Ｖ０）／（ＶＴ－Ｖ０）
Ｋｄ＝（ＶＲ－Ｖ０）／（ＶＴ－Ｖ０）
【0097】
（ｖ）測定サンプルの粘度半径ｒｓ（ｎｍ）を、各測定サンプルの重量平均分子量Ｍｗ（Ｄａ）及び固有粘度［η］（ｍＬ／ｇ）に基づき、以下の式により算出した。
ｒｓ＝（３［η］Ｍｗ／１０πＮ）１／３×１０７
［式中、Ｎはアボガドロ数を表す。］
ｒｓ＝（３［η］Ｍｗ／１０πＮ）１／３×１０７
［式中、Ｎはアボガドロ数を表す。］
【0098】
（ｖｉ）単一の細孔径であると仮定すると、分配係数Ｋｄと粒子の径深（hydraulic radius）ｒｈｙｄは以下の式で表される。
Ｋｄ＝（１－ｒｓ／ｒｈｙｄ）２
Ｋｄ＝（１－ｒｓ／ｒｈｙｄ）２
【0099】
なお、表１に示す各試料と同様に、表２に示すＰＥＧ－２１３００～ＰＥＧ－４００までの７サンプルについても保持時間を測定したが、以下の理由から、表２に示す前記７サンプルの測定結果は細孔径の推算に用いなかった。すなわち、各測定サンプルを測定したときのＫｄの０．５乗を縦軸、前記各測定サンプルの粘度半径ｒｓを横軸にとって、式 Ｋｄ
０．５＝１－ｒｓ／ｒｈｙｄを基に線形近似したときの傾きから－１／ｒｈｙｄを求めようとしたところ、実際の多孔質粒子では細孔径に分布があり、測定サンプルの粘度半径が５ｎｍ以下の領域（測定サンプルがＰＥＧ２１３００～ＰＥＧ４００の場合）とそれ以上の場合（測定サンプルがＳＥ－１５０～ＳＥ－２の場合）の間で傾きに大きな差があった。そこで、生体高分子の吸着に影響する大きな細孔の細孔径を算出するために、粘度半径が５ｎｍ以上であるＳＥ－１５０～ＳＥ－２までの７サンプルのポリエチレンオキサイドを測定したときのＫｄの０．５乗を縦軸、前記各サンプルの粘度半径ｒｓを横軸にとって、下記式を基に線形近似したときの傾きから－１／ｒｈｙｄを求めた。
Ｋｄ ０．５＝Ｃ－ｒｓ／ｒｈｙｄ
［式中、Ｃは線形近似したときの切片を表す。］
Ｋｄ ０．５＝Ｃ－ｒｓ／ｒｈｙｄ
［式中、Ｃは線形近似したときの切片を表す。］
【0100】
（ｖｉｉ）粒子の細孔がシリンダー型の貫通孔であると仮定すると、粒子の細孔径ｒｐｏｒｅと径深ｒｈｙｄは以下の式で表される。
ｒｐｏｒｅ＝ｒｈｙｄ×２
上記式より、粒子の細孔径ｒｐｏｒｅを粒子の細孔径の推算値として算出した。
ｒｐｏｒｅ＝ｒｈｙｄ×２
上記式より、粒子の細孔径ｒｐｏｒｅを粒子の細孔径の推算値として算出した。
【0101】
粒子の粒子内空隙率εｐは、細孔径の推算値の算出において求める粒子間の空隙体積Ｖ０と移動相の総体積ＶＴから、下記の式で算出した。
εｐ＝（ＶＴ－Ｖ０）／（Ｖｃ－Ｖ０）
なお、カラム体積Ｖｃ＝１４．３４ｍＬとして計算した。
εｐ＝（ＶＴ－Ｖ０）／（Ｖｃ－Ｖ０）
なお、カラム体積Ｖｃ＝１４．３４ｍＬとして計算した。
【0102】
［測定法３：リガンド修飾粒子の保持時間の測定、細孔径の推算、粒子内空隙率の推算］
実施例１～４、比較例１～６の粒子について、内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのステンレス製カラム（東ソー製）に充填した後、各試料の保持時間を測定した。圧密化させる際のカラム充填液を濃度０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液、各試料の分散媒または溶媒および保持時間測定時の移動相を濃度１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液にしたほかは、製造例１～７の粒子の保持時間の測定と同様の手順で測定した。前記塩化ナトリウム水溶液中ではシリカ製ナノ粒子が凝集して沈殿するためシリカ製ナノ粒子を測定に用いなかったほかは、表１と同様のサンプルを用いて保持時間を測定した。また、粒子の細孔径も、上記架橋粒子の細孔径の推算と同様の手順で算出した。ただし、比較例３の粒子は細孔径が小さいためか、分子量５８万～分子量７８．６万のポリエチレンオキサイドの保持時間の分子量依存性が小さく、細孔径を過大評価する懸念があったため、ＳＥ－３０～ＳＥ－２までの５サンプルのＫｄを用いて細孔径を算出した。さらに、比較例６の粒子はＳＥ－１５０～ＳＥ－５の保持時間がいずれも約１２．４分となり、排除粒子保持時間が仮定値である１３．６分を下回ったため、比較例６のみ排除粒子保持時間を１２．４分として細孔径を推算した。また、比較例６の細孔径を算出するためのサンプルとして、表２に示すＰＥＧ－２１３００～ＰＥＧ－４００までの７サンプルを測定したときのＫｄを用いて細孔径を推算した。また、粒子内空隙率も、上記架橋粒子の粒子内空隙率の推算と同様の手順で算出した。
実施例１～４、比較例１～６の粒子について、内径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍのステンレス製カラム（東ソー製）に充填した後、各試料の保持時間を測定した。圧密化させる際のカラム充填液を濃度０．１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液、各試料の分散媒または溶媒および保持時間測定時の移動相を濃度１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液にしたほかは、製造例１～７の粒子の保持時間の測定と同様の手順で測定した。前記塩化ナトリウム水溶液中ではシリカ製ナノ粒子が凝集して沈殿するためシリカ製ナノ粒子を測定に用いなかったほかは、表１と同様のサンプルを用いて保持時間を測定した。また、粒子の細孔径も、上記架橋粒子の細孔径の推算と同様の手順で算出した。ただし、比較例３の粒子は細孔径が小さいためか、分子量５８万～分子量７８．６万のポリエチレンオキサイドの保持時間の分子量依存性が小さく、細孔径を過大評価する懸念があったため、ＳＥ－３０～ＳＥ－２までの５サンプルのＫｄを用いて細孔径を算出した。さらに、比較例６の粒子はＳＥ－１５０～ＳＥ－５の保持時間がいずれも約１２．４分となり、排除粒子保持時間が仮定値である１３．６分を下回ったため、比較例６のみ排除粒子保持時間を１２．４分として細孔径を推算した。また、比較例６の細孔径を算出するためのサンプルとして、表２に示すＰＥＧ－２１３００～ＰＥＧ－４００までの７サンプルを測定したときのＫｄを用いて細孔径を推算した。また、粒子内空隙率も、上記架橋粒子の粒子内空隙率の推算と同様の手順で算出した。
【0103】
【表2】
試料濃度は５ｍｇ／ｍＬとし、測定には各試料を１０μｌ使用した。
【0104】
［測定法４：リガンド付加粒子の硫黄含有量の測定］
上記実施例１～４、比較例１～６の粒子を乾燥させ、ＣＨＮＳ（Ｃａｒｂｏｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｌｆｕｒ）元素分析により乾燥重量当たりの硫黄含有量（重量％）を求めた。測定に使用した装置は、以下の通りである。
装置：全自動元素分析装置ｖａｒｉｏ ＥＬ ｃｕｂｅ（Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ製）
上記装置を使用して硫黄含有量を測定した。
上記実施例１～４、比較例１～６の粒子を乾燥させ、ＣＨＮＳ（Ｃａｒｂｏｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｌｆｕｒ）元素分析により乾燥重量当たりの硫黄含有量（重量％）を求めた。測定に使用した装置は、以下の通りである。
装置：全自動元素分析装置ｖａｒｉｏ ＥＬ ｃｕｂｅ（Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ製）
上記装置を使用して硫黄含有量を測定した。
【0105】
［測定法５：ポリクローナル抗体を用いた１０％動的結合容量（ＤＢＣ）の測定および単位時間、単位容積あたりの１０％動的結合容量（ＤＢＣ）の算出］
（１）使用機器および試薬
ＬＣシステム ：ＡＫＴＡ ａｖａｎｔ ２５（登録商標）
バッファー ：酢酸バッファーｐＨ５．０（０．０５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む）
ポリクローナル抗体：γ－グロブリン、人血清由来（和光純薬）
カラム ：直径６．７ｍｍ、長さ３０ｍｍ
（１）使用機器および試薬
ＬＣシステム ：ＡＫＴＡ ａｖａｎｔ ２５（登録商標）
バッファー ：酢酸バッファーｐＨ５．０（０．０５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む）
ポリクローナル抗体：γ－グロブリン、人血清由来（和光純薬）
カラム ：直径６．７ｍｍ、長さ３０ｍｍ
【0106】
（２）測定方法
まずポリクローナル抗体をバッファーに溶かし２ｍｇ／ｍＬの抗体溶液を作製した。そして各カラムに上記のリガンド修飾した粒子（実施例１～４、比較例１～６の粒子）を隙間のないよう充填した。次にカラムをＬＣシステムに接続しバッファーを流して、カラム流出液のＵＶ（紫外線吸光度、２８０ｎｍ）と電気伝導度、ｐＨが一定になるまで平衡化した。その後、ベースラインのＵＶをゼロにした。次にカラムに抗体溶液を流速８．４８ｍＬ／分（カラム滞留時間７．５秒）で流した。カラム流出液のＵＶをモニターし、カラム流出液のＵＶが、予め測定しておいた抗体溶液のＵＶの１０％に到達するまでに抗体溶液を流した時間を読み取った。以下の式により抗体の１０％動的結合容量を求めた。なお、この分析は２５℃の部屋で行った。
｛抗体溶液濃度（ｍｇ／ｍＬ）×抗体溶液を流し始めてから予め測定しておいた抗体溶液のＵＶの１０％に到達するまでの時間（分）×流速（ｍＬ／分）－デッドボリューム｝／カラム体積＝１０％動的結合容量（ｍｇ／ｍＬ）
［式中、デッドボリュームは、システム配管体積とカラム空隙体積を足した体積（ｍＬ）である。］
まずポリクローナル抗体をバッファーに溶かし２ｍｇ／ｍＬの抗体溶液を作製した。そして各カラムに上記のリガンド修飾した粒子（実施例１～４、比較例１～６の粒子）を隙間のないよう充填した。次にカラムをＬＣシステムに接続しバッファーを流して、カラム流出液のＵＶ（紫外線吸光度、２８０ｎｍ）と電気伝導度、ｐＨが一定になるまで平衡化した。その後、ベースラインのＵＶをゼロにした。次にカラムに抗体溶液を流速８．４８ｍＬ／分（カラム滞留時間７．５秒）で流した。カラム流出液のＵＶをモニターし、カラム流出液のＵＶが、予め測定しておいた抗体溶液のＵＶの１０％に到達するまでに抗体溶液を流した時間を読み取った。以下の式により抗体の１０％動的結合容量を求めた。なお、この分析は２５℃の部屋で行った。
｛抗体溶液濃度（ｍｇ／ｍＬ）×抗体溶液を流し始めてから予め測定しておいた抗体溶液のＵＶの１０％に到達するまでの時間（分）×流速（ｍＬ／分）－デッドボリューム｝／カラム体積＝１０％動的結合容量（ｍｇ／ｍＬ）
［式中、デッドボリュームは、システム配管体積とカラム空隙体積を足した体積（ｍＬ）である。］
【0107】
なお、デッドボリュームは、カラム流出液のＵＶ（紫外線吸光度、２８０ｎｍ）と電気伝導度、ｐＨが一定になるまで、濃度１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して平衡化した後、カラム体積の１％程度の量の２ｍｇ／ｍＬの抗体溶液を注入し、その後、再び濃度１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム溶液を流したときにＵＶピークが検出されるまでの塩化ナトリウム溶液の流量を測定することで、求めた。
【0108】
また、上記の式から算出した１０％動的結合容量（ｍｇ／ｍＬ）の値を用いて、以下の式により、カラム滞留時間７．５秒の条件下での単位時間、単位容積あたりの抗体の１０％動的結合容量（ｍｇ／ｍＬ／分）を求めた。
１０％動的結合容量（ｍｇ／ｍＬ）／カラム体積（ｍＬ）／０．１２５（分）＝単位時間、単位容積あたりの１０％動的結合容量（ｍｇ／ｍＬ／分）
１０％動的結合容量（ｍｇ／ｍＬ）／カラム体積（ｍＬ）／０．１２５（分）＝単位時間、単位容積あたりの１０％動的結合容量（ｍｇ／ｍＬ／分）
【0109】
［測定法６：ＳＥＭ観察］
日立ハイテクノロジーズ製の超高分解能電界放出形走査電子顕微鏡「ＳＵ８０２０」を使用して、ＳＥＭ観察を行った。前処理として凍結乾燥した製造例１～３の粒子に、撮影のため、Ａｕコーティングを行った。電子顕微鏡写真では、得られた粒子がほぼ真球状であり、表面および断面に連通孔があることが認められる（図１～５）。
日立ハイテクノロジーズ製の超高分解能電界放出形走査電子顕微鏡「ＳＵ８０２０」を使用して、ＳＥＭ観察を行った。前処理として凍結乾燥した製造例１～３の粒子に、撮影のため、Ａｕコーティングを行った。電子顕微鏡写真では、得られた粒子がほぼ真球状であり、表面および断面に連通孔があることが認められる（図１～５）。
【0110】
各製造例、実施例および比較例の評価結果を表３～５、図６に示す。
表３において、製造例１～７の粒子のメジアン径、細孔径、粒子内空隙率、および粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子の保持時間を示す。
表３において、製造例１～７の粒子のメジアン径、細孔径、粒子内空隙率、および粒子径１００ｎｍのシリカ微粒子の保持時間を示す。
【0111】
【表3】
【0112】
表４において、実施例１～４および比較例１～６の粒子のメジアン径、細孔径、粒子内空隙率、修飾したリガンドの有する官能基の種類、硫黄含有量、カラム滞留時間７．５秒でのγ‐グロブリンの１０％動的吸着容量、およびその単位時間、単位容積あたりの動的吸着容量を示す。
【0113】
【表4】
【0114】
【産業上の利用可能性】
【0115】
本発明では、三次元ネットワーク状の骨格とその空隙からなる大きな連通孔を有しており、かつ前記連通孔が粒子表面から内部まで貫通している多孔質粒子と、前記多孔質粒子をカラムに充填して用いた、高処理速度でのクロマトグラフィー精製法を示した。本発明は、バイオ医薬品などの分離・精製効率の向上のために、単位体積当たり、単位時間あたりに結合される目的物質量（生産性）を向上させると同時に、従来の設備である充填カラムを活用することができ、閉塞のリスクを小さくすることができる。そのため、バイオ医薬品などの分離・精製プロセスにおいて、高処理量、高処理速度が達成でき、産業上非常に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】