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2024-128049人工遺伝子及び遺伝子変異方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024128049

(43)【公開日】2024-09-20

(54)【発明の名称】人工遺伝子及び遺伝子変異方法

(51)【国際特許分類】

C12N 15/09 20060101AFI20240912BHJP

C12N 15/11 20060101ALI20240912BHJP

C12N 15/12 20060101ALI20240912BHJP

C12N 15/29 20060101ALI20240912BHJP

C12N 15/31 20060101ALI20240912BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240912BHJP

C12N 15/10 20060101ALI20240912BHJP

C12Q 1/02 20060101ALI20240912BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 Z

C12N15/11 Z

C12N15/12

C12N15/29

C12N15/31

C12N15/63 Z

C12N15/10 200Z

C12Q1/02

【審査請求】有

【請求項の数】19

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024109543

(22)【出願日】2024-07-08

(62)【分割の表示】P 2021539287の分割

【原出願日】2020-08-07

(31)【優先権主張番号】P 2019147468

(32)【優先日】2019-08-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人科学技術振興機構「低ＣＯ２と低環境負荷を実現する微細藻バイオリファイナリーの創出に関する国立研究開発法人産業技術総合研究所による研究開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(71)【出願人】

【識別番号】504171134

【氏名又は名称】国立大学法人筑波大学

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫敏史

(72)【発明者】

【氏名】岩田康嗣

(72)【発明者】

【氏名】富田かな子

(72)【発明者】

【氏名】鈴木石根

(72)【発明者】

【氏名】森岡諒

(72)【発明者】

【氏名】楊天景

(57)【要約】

【課題】遺伝子組み換え規制の対象とならず、かつ標的遺伝子に局在的な変異を導入し、変異導入時にその変異を定量化することができる人工遺伝子及び遺伝子変異方法を提供する。
【解決手段】人工遺伝子は、少なくとも一部のＤＮＡの塩基における¹⁵Ｎの存在比が自然の存在比を越えている。また、遺伝子変異方法は、¹⁵Ｎが生体細胞内の特定ＤＮＡに偏在する状況を作成する第１ステップと、¹⁵Ｎが共鳴核反応を生じるエネルギーで陽子線を照射する第２ステップと、を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも一部のＤＮＡの塩基における¹⁵Ｎの存在比が自然の存在比を越えている、
人工遺伝子。

【請求項2】

¹⁵Ｎ非標識のプライマー配列と、¹⁵Ｎ標識のデオキシリボヌクレオチドとを含む、
請求項１に記載の人工遺伝子。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の人工遺伝子と、
前記人工遺伝子に結合されたベクターと、
を含む、人工遺伝子。

【請求項4】

複数の生体分子結合部位を有し、前記複数の生体分子結合部位のうち少なくとも一部において、遺伝子配列が変異している、
請求項１又は２に記載の人工遺伝子。

【請求項5】

前記生体分子がタンパク質である、請求項４に記載の人工遺伝子。

【請求項6】

¹⁵Ｎ非標識の人工遺伝子であって、
複数の生体分子結合部位を有し、
前記複数の生体分子結合部位のうち少なくとも一部は遺伝子配列が変異しており、
前記複数の生体分子結合部位のいずれかに、¹⁵Ｎ標識された生体分子が結合可能である、
人工遺伝子。

【請求項7】

前記複数の生体分子結合部位のうち遺伝子配列が変異していない部位に前記¹⁵Ｎ標識された生体分子が結合可能である、請求項６に記載の人工遺伝子。

【請求項8】

前記生体分子がタンパク質である、請求項７に記載の人工遺伝子。

【請求項9】

請求項６から８のいずれか１項に記載の人工遺伝子と、
前記複数の生体分子結合部位のいずれかに結合可能な¹⁵Ｎ標識された生体分子と、
を備えるキット。

【請求項10】

ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することと、
¹⁵Ｎが共鳴核反応を起こすエネルギーを有する陽子線を前記ＤＮＡに照射することと、
を含む、遺伝子を変異させる方法。

【請求項11】

前記ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することが、前記ＤＮＡのＮを¹⁵Ｎで置換することを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することが、前記ＤＮＡの近傍を¹⁵Ｎで標識することを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することが、前記ＤＮＡに¹⁵Ｎで標識された生体分子を結合させることを含む、請求項１０又は１２に記載の方法。

【請求項14】

前記生体分子がタンパク質である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

生体細胞内で前記ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識する、請求項１０から１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記生体細胞内の前記ＤＮＡ以外の細胞成分における¹⁵Ｎを自然存在比に保ち、前記ＤＮＡにおける¹⁵Ｎの存在比を自然存在比より大きくする、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記生体細胞内で前記ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することが、¹⁵Ｎ標識のデオキシリボヌクレオチドとグルタミン合成酵素の阻害剤を前記生体細胞に与えることを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。

【請求項18】

前記生体細胞内で前記ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することが、¹⁵Ｎ標識のデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチド還元酵素の阻害剤を前記生体細胞に与えることを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。

【請求項19】

前記生体細胞内で前記ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することが、¹⁵Ｎ非標識のグルタミンを前記生体細胞に与えることをさらに含む、請求項１７又は１８に記載の方法。

【請求項20】

前記共鳴核反応を検出することをさらに含む、請求項１０から１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記検出することにおいて、４．４３ＭｅＶのγ線量の計測する、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

計測されたγ線量に基づいて、前記ＤＮＡで生じた変異数を算出することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記算出することにおいて、¹⁵Ｎ原子数が既知の標準試料で起きる共鳴核反応で生じるγ線量を参照する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記¹⁵Ｎが共鳴核反応を起こすエネルギーを変化させることをさらに含む、請求項１０から２３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、人工遺伝子及び遺伝子変異方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生物多様性に関わる該生物の機能、取り分けオイル、多糖、及び色素などの自然産物を高密度で生産する藻類の生産代謝機能は、エネルギー、飲食物、栄養食品、化粧品、及び製薬など幅広い分野で注目されている。藻類の高生産性をもつ株の創製には、生産に関わる目的とする遺伝子（標的遺伝子）を改変するゲノム編集が用いられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１８－０００１２９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

人は野生の生物をさまざまな目的に応じて利用する過程で、その目的により合致した表現型をもつ株を選別し、交配・育種して、その目的達成に有利な性質を持つ生物を利用してきた。近年それら生物のゲノムＤＮＡ配列が比較的容易に解析できるようになり、その遺伝子情報を理解することで、それら生物が有益な表現型を持つ原因を明らかにできるようになった。また、ゲノム編集技術の発達により、特定の遺伝子・ＤＮＡ領域を任意に改変することも可能である。しかしながら、細胞核へＤＮＡやゲノム編集手段を導入・挿入する技術が確立していない生物も多数あり、全ての生物で遺伝子組換え・ゲノム編集の技術が確立されているわけではない。かつゲノムＤＮＡ上の機能が解明されている遺伝子領域は全体の一部であるため、どんな有益な生物でも望み通りに改変できる訳ではない。またゲノム編集技術が、遺伝子組み換え生物に対する規制であるカルタヘナ議定書（生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書、２０００年１月、生物多様性条約特別締約国会議再開会合にて採択）と同じ取り扱い規制を受ける判決が欧州司法裁判所で下され、各国で取扱いの議論が続いている。

【0005】

そこで今日でも、遺伝子組換えとみなされない、γ線や重イオンビーム照射やＤＮＡ修飾試薬などを用いた突然変異導入による育種は、産業利用において不可欠である（例えば特許文献１参照）。しかし、従来の突然変異育種法は、どの程度ＤＮＡに損傷を与えたかを直接評価する定量的手法を持たない。そのため、致死率や色素形成など容易に判別可能な表現型の変化を間接的な変異効率の指標として、照射線量や処理量が決められている。さらに照射によってランダムに導入される突然変異では、目的の表現型を有する株を膨大な個体数の処理群から労力と時間を掛けてスクリーニングする必要がある。しかし、スクリーニング結果が得られるまでは、目的とする遺伝子変異が生じているか否かも不明である。

【0006】

そこで、本発明は、遺伝子組み換え規制の対象とならず、かつ標的遺伝子に局在的な変異を導入し、変異導入時にその変異を定量化することができる人工遺伝子及び遺伝子変異方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

後に図５を参照して詳細に説明するように、¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応における、１２．９６８６ＭｅＶ準位の¹⁶Ｏ^*がα粒子を放出して¹²Ｃ^*の第１励起準位１１．６００７ＭｅＶに脱励起する（ｐ，α₁γ）反応チャネルにおいて、陽子線に比べて高い電離作用をもつα（⁴Ｈｅ原子核）と、¹²Ｃと、が、反応二次粒子として放出される。また、反応ごとに¹²Ｃ^*の第１励起準位から基底状態に脱励起して４．４３ＭｅＶのγ線が放出される。本発明者らは、鋭意研究の末、高い電離作用をもつ反応二次粒子の放出は、¹⁵ＮがＤＮＡ内部、もしくはその近傍にある場合には、¹⁵Ｎ近傍の生体分子に対して、局所的に高い電離作用を及ぼし、ＤＮＡに目的とする遺伝子変異を生じせしめる確率が高くなることを見出した。また、本発明者らは、核反応ごとに放出される４．４３ＭｅＶのγ線は容易に計数が可能であり、かつ当該γ線は陽子線照射によって生じるＤＮＡの遺伝子変異量を反映しているため、ビーム照射時に４．４３ＭｅＶのγ線を計数することにより、ＤＮＡの遺伝子変異量を定量可能であることを見出した。

【0008】

また、本発明者らは、¹⁵Ｎ標識したＤＮＡ試料、もしくは¹⁵Ｎ＿ＤＮＡを含む生体細胞などの生体試料への陽子線照射において、陽子線のエネルギーを共鳴エネルギーから共鳴エネルギーを越える高いエネルギーまで、例えば一定のエネルギー刻み幅で変化させて設定することにより、標的試料内で、表面から内部に亙り分布する¹⁵Ｎに対して、くまなく¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応を生じさせることが可能になり得ることを見出した。

【0009】

本発明者らの上記知見の少なくとも一部に基づく本発明の一態様に係る人工遺伝子は、少なくとも一部のＤＮＡの塩基における¹⁵Ｎの存在比が自然の存在比を越えている。¹⁵Ｎの存在比は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、あるいは９８％以上である。

【0010】

上記態様において、¹⁵Ｎ非標識のプライマー配列と、¹⁵Ｎ標識のデオキシリボヌクレオチドとを含んでもよい。

【0011】

上記態様において、上記態様に記載の人工遺伝子と、他の人工遺伝子とを結紮して形成されていてもよい。他の人工遺伝子はベクターであってもよい。

【0012】

上記態様において、複数の生体分子結合部位を有し、複数の生体分子結合部位のうち少なくとも一部において、遺伝子配列が変異していてもよい。生体分子はタンパク質であってもよい。

【0013】

本発明の一態様に係る人工遺伝子は、¹⁵Ｎ非標識の人工遺伝子であって、複数の生体分子結合部位を有し、複数の生体分子結合部位のうち少なくとも一部は遺伝子配列が変異しており、複数の生体分子結合部位のいずれかに、¹⁵Ｎ標識された生体分子が結合可能である。¹⁵Ｎで標識された生体分子はタンパク質であってもよい。複数の生体分子結合部位のうち遺伝子配列が変異していない部位に¹⁵Ｎ標識された生体分子が結合可能であってもよい。

【0014】

本発明の一態様に係るキットは、上記の¹⁵Ｎ非標識の人工遺伝子と、複数の生体分子結合部位のいずれかに結合可能な¹⁵Ｎ標識された生体分子と、を備える。

【0015】

本発明の一態様に係る遺伝子を変異させる方法は、ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することと、¹⁵Ｎが共鳴核反応を起こすエネルギーを有する陽子線をＤＮＡに照射することと、を含む。

【0016】

上記態様において、ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することが、ＤＮＡのＮを¹⁵Ｎで置換することを含んでいてもよい。あるいは、ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することが、ＤＮＡの近傍を¹⁵Ｎで標識することを含んでいてもよい。ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することが、ＤＮＡに¹⁵Ｎで標識された生体分子を結合させることを含んでいてもよい。¹⁵Ｎで標識された生体分子がタンパク質であってもよい。

【0017】

上記態様において、生体細胞内のＤＮＡを¹⁵Ｎで標識してもよい。

【0018】

上記態様において、生体細胞内のＤＮＡ以外の細胞成分における¹⁵Ｎを自然存在比に保ち、ＤＮＡにおける¹⁵Ｎの存在比を自然存在比より大きくしてもよい。

【0019】

上記態様において、生体細胞内でＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することが、¹⁵Ｎ標識のデオキシリボヌクレオチドとグルタミン合成酵素の阻害剤を生体細胞に与えることを含んでいてもよい。

【0020】

上記態様において、生体細胞内でＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することが、¹⁵Ｎ標識のデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチド還元酵素の阻害剤を生体細胞に与えることを含んでいてもよい。

【0021】

上記態様において、生体細胞内で前記ＤＮＡを¹⁵Ｎで標識することが、¹⁵Ｎ非標識のグルタミンを生体細胞に与えることをさらに含んでいてもよい。

【0022】

上記態様において、共鳴核反応を検出することをさらに含んでもよい。

【0023】

上記態様において、検出することにおいて、４．４３ＭｅＶのγ線量を計測してもよい。

【0024】

上記態様において、計測されたγ線量に基づいて、ＤＮＡで生じた変異数を算出することをさらに含んでもよい。

【0025】

上記態様において、算出することにおいて、¹⁵Ｎ原子数が既知の標準試料で起きる共鳴核反応で生じるγ線量を参照してもよい。

【0026】

上記態様において、¹⁵Ｎが共鳴核反応を起こすエネルギーを変化させてもよい。

【発明の効果】

【0027】

本発明によれば、遺伝子組み換え規制の対象とならず、且つ標的遺伝子に局在的な変異を導入し、変異導入時にその変異を定量化することができる人工遺伝子及び遺伝子変異方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】本発明の実施形態に係る遺伝子変異方法において、それぞれの塩基対に存在するＮを¹⁵Ｎで置換したＤＮＡ分子を表す図である。

【図2】ＤＮＡ分子において共鳴核反応が生じる様子を示す図である。

【図3】従来技術である重イオンビーム照射による遺伝子変異法を用いる場合を示す図である。

【図4】８４個の塩基対で構成される人工ＤＮＡ標準試料を示す図である。

【図5】 ¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応を示す図である。

【図6】ＤＮＡ切断の有無を判別する手法の概略図である。

【図7】ＤＮＡ鎖のうち一方の鎖にどれだけ切断が起こったかを識別する方法の概要を示す図である。

【図8】細胞内における含窒素有機化合物の合成を示す図である。

【図9】ＭＳＸ及び¹⁵Ｎ非標識したグルタミンを投与した場合に細胞内において核酸のみを¹⁵Ｎ標識する新たな手法を説明する図である。

【図10】核酸合成経路において、ＤＮＡのみを¹⁵Ｎで標識する手法を説明する図である。

【図11】標的遺伝子又はその近傍のみを¹⁵Ｎ標識する新たな手法について説明する図である

【図12】ｐＵＣ４－ＫＩＸＸ環状プラスミドの遺伝子構造を示す図である。

【図13】 ¹⁵Ｎ＿ｐＵＣ４－ＫＩＸＸプラスミド試料の¹⁵Ｎ（ｐ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応の共鳴曲線を示すグラフである。

【図14】プラスミドへの陽子線照射量と、遺伝子の損傷との関係を示すグラフである。陽子線照射されたプラスミドは大腸菌に導入され、大腸菌はアンピシリンを添加した培地で培養された。

【図15】プラスミドへの陽子線照射量と、遺伝子の損傷との関係を示すグラフである。陽子線照射されたプラスミドは大腸菌に導入され、大腸菌はカナマイシンを添加した培地で培養された。

【図16】プラスミドへの陽子線照射量と、遺伝子の損傷との関係を示すグラフである。陽子線照射されたプラスミドは大腸菌に導入され、大腸菌はアンピシリンとカナマイシンを添加した培地で培養された。

【発明を実施するための形態】

【0029】

添付図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。なお、各図において、同一の符号を付したものは、同一又は同様の構成を有する。

【0030】

生体内の窒素元素Ｎは、酵素などのタンパク質はじめ、ＤＮＡに至る細胞成分内に散在している。本実施形態に係る遺伝子変異方法では、その内自然存在比０．３６４％で存在する¹⁵Ｎ同位体が標的遺伝子に濃縮して偏在する状況を作製し、¹⁵Ｎと¹Ｈが¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応を起こすエネルギーで陽子線を標的遺伝子に照射することで、標的遺伝子に大きな変異を生じさせる。

【0031】

遺伝子を構成するＤＮＡ２本鎖において、アデニン（Ａ）には５個の窒素原子がプリン環及びアミノ基として結合し、チミン（Ｔ）にはピリミジン環に２個の窒素原子が結合して、ＤＮＡ２本鎖のアデニン－チミン対（ＡＴ対）では窒素原子が７個存在する。同様にグアニン（Ｇ）には５個の窒素原子が結合し、シトシン（Ｃ）には３個結合して、ＤＮＡ２本鎖のグアニン－シトシン対（ＧＣ対）では８個の窒素原子が存在する。

【0032】

図１は、それぞれの塩基対に存在するＮを¹⁵Ｎで置換したＤＮＡ分子を表し、自然に¹⁵Ｎが存在する同位体比率を２７５．５倍に濃縮して¹⁵Ｎに標識した状態を示している。なお、自然界における¹⁵Ｎの存在比は０．３６４％である。

【0033】

図２は、ＤＮＡ分子において共鳴核反応が生じる様子を示す。¹⁵Ｎ標識ＤＮＡ内の１個の¹⁵Ｎ原子核と陽子が¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応を起こすと、¹⁵Ｎは消失して、反応前の¹⁵Ｎ原子の結合位置を中心に⁴Ｈｅと¹²Ｃ原子核が互いに反対方向にほぼ等方的に放出され、直ぐに電子を捕獲してイオンとして物質内を通過する。そのイオン飛跡に沿った近傍原子では、高密度の電子励起が生じる。

【0034】

電子励起を受ける確率は、反応中心からの距離の二乗に反比例して減少し、反応中心から遠方に在る原子ほど小さい。すなわち、¹⁵Ｎが共鳴核反応を起こす場合、¹⁵Ｎ原子の結合位置の近傍原子が局所的に高い確率で電子励起を受けることになり、¹⁵Ｎ原子の結合位置近傍のＤＮＡに局所的な変異が生じ易くなる。

【0035】

図３は、従来技術である重イオンビーム照射による遺伝子変異法を用いる場合を示す。従来技術である重イオンビーム照射による遺伝子変異法では、重イオンがＤＮＡの外部からＤＮＡ全域に亘り一定密度で入射するため、重イオンの飛跡に沿ったＤＮＡ近傍原子が電子励起を受け、変異が生じる確率は、ＤＮＡ全域に亘りほぼ同じである。

【0036】

これに対して、本実施形態の方法では、標的遺伝子又は標的遺伝子近傍における¹⁵Ｎ同位体比率を高め、高い確率で、¹⁵Ｎ原子の結合位置近傍のＤＮＡに局所的な変異を生じさせることができる。

【0037】

本実施形態において、標的遺伝子又はその近傍で¹⁵Ｎ同位体比率を高め、濃縮する技法は、本来自然界に０．３６４％で存在し、生体細胞内にも同比率で存在する¹⁵Ｎをそのまま利用する技術である。また、そのＤＮＡ中の¹⁵Ｎに陽子線を照射して生じせしめる¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応は、宇宙線の地表付近のハドロン成分中で最も多く存在する陽子線が地表生物にランダムに降り注ぎ、そのＤＮＡ中に存在する¹⁵Ｎ原子核と衝突して生じる核反応と同じであり、生体細胞への同様な効果がもたらされる。

【0038】

すなわち、標的遺伝子又はその近傍で¹⁵Ｎ同位体比率を高め、濃縮する技法、その技法によって¹⁵Ｎ標識された生体細胞へ陽子線を照射して¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応を生じせしめて標的遺伝子の変異確率を高めることは、地球上で生命誕生以来、生命が自然にさらされその遺伝子情報の変異を受けて来た過程を加速させる手法に過ぎず、従来の放射線（ＵＶ、Ｘ線、γ線、重イオン）照射による突然変異株を作出する手法と、基本的メカニズムの原理は何ら変わるものではない。したがって本実施形態に係る遺伝子変異方法は、遺伝子組み換え技術とは根本的に原理が異なるものであり、遺伝子組み換え技術に対する規制の対象にはならずに、標的遺伝子に大きな変異導入を可能にする優れた特徴をもった手法である。

【0039】

生体細胞内の標的遺伝子又は標的遺伝子近傍における¹⁵Ｎ同位体比率を高めたＤＮＡ試料に対して陽子線を照射することで生じるＤＮＡ変異の定量化には、¹⁵Ｎ原子数が明確に規定された¹⁵Ｎ標識ＤＮＡ標準試料の構築が必要である。

【0040】

¹⁵Ｎ標識ＤＮＡ標準試料を構築することで、¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応で放出される４．４３ＭｅＶのγ線量と、ＤＮＡ内の¹⁵Ｎ濃度との較正データを取得することが可能になる。４．４３ＭｅＶのγ線の線量較正値を取得することで、¹⁵Ｎ標識した生体細胞に対して陽子線照射と同時に共鳴核反応で放出される４．４３ＭｅＶのγ線量を計測し、較正値と比較して、生体細胞内のＤＮＡに生じた変異数が定量可能になる。

【0041】

本実施形態に係る遺伝子変異方法では、¹⁵Ｎ標識された塩基対で構成されるＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）によって人工的に合成した標準試料を構築した。構築された人工ＤＮＡの標準試料は、分子生物学、生化学、生体機能的に重要な塩基配列で構成されることが望ましい。

【0042】

図４は、８４個の塩基対で構成される人工ＤＮＡ標準試料を示す図である。人工ＤＮＡ標準試料は、例えば、以下の方法で作製される。５’末端に¹⁵Ｎ非標識、すなわち¹⁴Ｎを自然存在比９９．６３６％で含むＴＡＣＧＴＴＡＡＡＴＣ配列構造のプライマーＯＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿Ｆと、¹⁵Ｎ標識、すなわち¹⁵Ｎを存在比９８％以上で含むデオキシヌクレオシド三リン酸¹⁵Ｎ－ｌａｂｅｌｅｄｄＮＴＰｓ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）７３個とから、ポリメラーゼ連鎖反応法によってオリゴヌクレオチドＯＲ＿ＷＴ＿Ｆが合成される。また、５’末端に¹⁵Ｎ非標識のＴＧＣＡＡＣＣＡＴＴ配列構造をもつプライマーＯＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿Ｒと、¹⁵Ｎ標識デオキシヌクレオシド三リン酸¹⁵Ｎ－ｌａｂｅｌｅｄｄＮＴＰｓ７４個とから、ポリメラーゼ連鎖反応法によってオリゴヌクレオチドＯＲ＿ＷＴ＿Ｒが合成される。さらに、ＯＲ＿ＷＴ＿ＦとＯＲ＿ＷＴ＿Ｒとが水素結合によって互いに塩基対を形成して、¹⁵Ｎ標識オリゴヌクレオチド２本鎖ＤＮＡ¹⁵Ｎ－ｌａｂｅｌｅｄＯＲ＿ＤＮＡが形成される。これを標準試料とする。

【0043】

¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡは、¹⁵Ｎ非標識プライマーＯＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿Ｆ／＿Ｒと、¹⁵Ｎ標識デオキシリボヌクレオチド¹⁵Ｎ－ｌａｂｅｌｅｄｄＮＭＰｓ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）と、を合わせて８４個のＤＮＡ塩基対（８４ｂｐｓ）で構成される。その塩基配列の内訳は、プライマーを除くＯＲ＿ＷＴ＿Ｆの７３ｂｐｓにおいて、¹⁵Ｎ－ｌａｂｅｌｅｄｄＡＭＰ：１９個、¹⁵Ｎ－ｌａｂｅｌｅｄｄＴＭＰ：２２個、¹⁵Ｎ－ｌａｂｅｌｅｄｄＧＭＰ：１７個、¹⁵Ｎ－ｌａｂｅｌｅｄｄＣＭＰ：１５個である。また、プライマーを除くＯＲ＿ＷＴ＿Ｒの７４ｂｐｓにおいて、¹⁵Ｎ－ｌａｂｅｌｅｄｄＡＭＰ：２３個、¹⁵Ｎ－ｌａｂｅｌｅｄｄＴＭＰ：２０個、¹⁵Ｎ－ｌａｂｅｌｅｄｄＧＭＰ：１６個、¹⁵Ｎ－ｌａｂｅｌｅｄｄＣＭＰ：１５個である。これらを下記表１にまとめた。

【0044】

【表1】

【0045】

¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ全体に含まれるＮ（¹⁴Ｎ＋¹⁵Ｎ）の総数は６２３個である。¹⁵Ｎ標識の標準的な純度は９８％以上であり、その純度に従って¹⁴Ｎと¹⁵Ｎの同位体存在比率が変わる。¹⁵Ｎ標識純度が９８％の場合、ＯＲ＿ＤＮＡ全体の¹⁵Ｎは５３８．２９個である。理想的に¹⁵Ｎ標識純度１００％では、ＯＲ＿ＤＮＡ全体の¹⁵Ｎは最大個数５４９．２７個であり、全窒素原子数の８８．１７％にあたる（表１参照）。¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡの分子量は、同じく¹⁵Ｎ標識純度に依存して、５２，４６７ｇ／ｍｏｌ以上、最大で５２，４７７．９５ｇ／ｍｏｌである。

【0046】

図５は、¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応を示す。¹⁵Ｎで標識した生体試料に対して陽子線を照射する場合、¹⁵Ｎ原子核と陽子の重心系における両者の原子核の結合エネルギー１２．１２７７ＭｅＶと、¹⁶Ｏ^*複合原子核の第２励起準位１２．９６８６ＭｅＶとのエネルギー差である０．８４０９ＭｅＶ（実験室系の陽子エネルギーに換算して０．９８７ＭｅＶ）で両者の原子核が衝突すると、共鳴的に両者が結合して¹⁶Ｏ^*複合原子核が形成される。１２．９６８６ＭｅＶ準位の¹⁶Ｏ^*は直ぐに、α粒子を放出して¹²Ｃ^*の第１励起準位１１．６００７ＭｅＶに脱励起する第１の反応チャネルと、α粒子を放出して¹²Ｃの基底状態７．１６１６ＭｅＶに脱励起する第２の反応チャネルと、γ線のみを放出して¹⁶Ｏの基底状態０ＭｅＶに脱励起する第３の反応チャネルとの、３種類の反応チャネルが生じる。それぞれ（ｐ，α₁γ）、（ｐ，α₀）、（ｐ，γ₀）と核反応式で表記する。

【0047】

本実施形態で利用する（ｐ，α₁γ）反応チャネルの特徴は、陽子線に比べて高い電離作用をもつα（⁴Ｈｅ原子核）と、¹²Ｃと、が、反応二次粒子として放出されることと、反応ごとに¹²Ｃ^*の第１励起準位から基底状態に脱励起して４．４３ＭｅＶのγ線が放出されることと、である。（ｐ，α₀）反応チャネルでは、γ線の放出はなく、また（ｐ，γ₀）反応チャネルでは、高い電離作用をもつ反応二次粒子の放出がない。高い電離作用をもつ反応二次粒子の放出は、¹⁵ＮがＤＮＡ内部、もしくはその近傍にある場合には、¹⁵Ｎ近傍の生体分子に対して、局所的に高い電離作用を及ぼし、ＤＮＡに目的とする遺伝子変異を生じせしめる確率が高くなるという効果を奏する。さらに、核反応ごとに放出される４．４３ＭｅＶのγ線は容易に計数が可能であり、かつ当該γ線は陽子線照射によって生じるＤＮＡの遺伝子変異量を反映している。そのため、ビーム照射時に４．４３ＭｅＶのγ線を計数することにより、ＤＮＡの遺伝子変異量を定量可能であるという効果を奏する。

【0048】

¹⁶Ｏ^*第２励起準位との共鳴エネルギーは、両者の原子核衝突におけるクーロン障壁ポテンシャルより遥かに低い。そのため、両者の原子核衝突エネルギーが、¹⁶Ｏ^*複合原子核の第２励起準位幅として規定される共鳴エネルギー幅３００ｅＶを越え、共鳴エネルギーから外れると、急激に反応断面積が低下する。すなわち、¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡに対して共鳴エネルギーで入射する陽子線は、入射エネルギーのゆらぎが共鳴エネルギー幅に収まる範囲内でのみ¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応を生じせしめる。

【0049】

実際の陽子線照射では、共鳴エネルギー幅と陽子ビームのエネルギー拡がり、典型的には１ｋｅＶ程度とのたたみ込み積分演算によって共鳴エネルギー幅が決まり、陽子が物質中を通過する際のエネルギー損失分を共鳴エネルギーに加算して陽子線照射エネルギーを決定する。すなわち¹⁵Ｎ標識したＤＮＡ試料、もしくは¹⁵Ｎ＿ＤＮＡを含む生体細胞などの生体試料への陽子線照射において、陽子線のエネルギーを共鳴エネルギーから共鳴エネルギーを越える高いエネルギーまで、例えば一定のエネルギー刻み幅で変化させて設定することにより、標的試料内で、表面から内部に亙り分布する¹⁵Ｎに対して、くまなく¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応を生じさせることが可能になり得る。エネルギーの変化幅と刻み幅は、標的とする試料に応じて選定すればよく、¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応の共鳴曲線を取得して、これを決定してもよい。例えば、図１３を参照。

【0050】

¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応で生成された¹²Ｃ^*とαは互いに反対方向に放出され、陽子線の入射方向と同じ方向に放出されたとき運動エネルギーが最大値Ｅ（ｍａｘ）となり、¹²Ｃ^*とαそれぞれにＥ_C（ｍａｘ）＝０．６２５２ＭｅＶ、Ｅ_He（ｍａｘ）＝１．２８０６ＭｅＶとなる。また、¹²Ｃ^*とαが陽子線の入射方向と反対方向に放出されたとき運動エネルギーは最小値Ｅ（ｍｉｎ）となり、Ｅ_C（ｍｉｎ）＝０．１４３７ＭｅＶ、Ｅ_He（ｍｉｎ）＝０．７９９１ＭｅＶとなる。¹²Ｃ^*とαは放出後すぐに電子を捕獲して¹²Ｃ、⁴Ｈｅイオンとなり、物質中を進行する。

【0051】

¹²Ｃと⁴Ｈｅイオンは、常にこれらのエネルギー範囲の値をもって、¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料を通過する。その飛程に沿った近傍原子、とりわけ半径５ｎｍ以上１０ｎｍ以下の近傍原子を電子励起する。標的試料が、¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料ではなく、真核単細胞藻類など細胞壁や細胞内器官をもつ生体試料であり、細胞壁や細胞内器官などを陽子が通過する際のエネルギー損失を予め考慮して、共鳴エネルギーより高いエネルギーで陽子線照射を行う場合においても、陽子線と¹⁵Ｎ標識ＤＮＡ又はＤＮＡ近傍の¹⁵Ｎ標識試料との¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応では、陽子線の照射エネルギーに関わらず、¹²Ｃと⁴Ｈｅ反応生成イオンは一定エネルギーで放出され、その飛跡に沿った近傍原子を一定強度で励起することが本手法の特徴である。

【0052】

さらに、¹²Ｃと⁴Ｈｅ反応生成イオンの電子励起は線エネルギー付与（ｌｉｎｅａｒｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ，ＬＥＴ（ＭｅＶｃｍ²／ｇ））で与えられ、¹²Ｃと⁴Ｈｅ反応生成イオンが放出されるエネルギー範囲にわたって変化し、標的試料の構成元素の一つである炭素ＣへのＬＥＴは、¹²Ｃ反応生成イオンで２．５１×１０³ ＭｅＶｃｍ²／ｇ以上、最大で４．７０×１０³ ＭｅＶｃｍ²／ｇとなり、⁴Ｈｅ反応生成イオンでは、１．７３×１０³ ＭｅＶｃｍ²／ｇ以上、最大で１．９９×１０³ ＭｅＶｃｍ²／ｇである。この値は、陽子が共鳴エネルギーで¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料を通過する際のＬＥＴと比較して１７．２倍以上、最大で２７．１倍高い。したがって、本手法では、¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料はじめ生体試料に対して、¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応の生成イオンによる電子励起が陽子線照射による電子励起より圧倒的に高いという特徴を示し、標的遺伝子を¹⁵Ｎ標識することで、選択的に大きな変異を導入することを可能にしている。

【0053】

¹²Ｃと⁴Ｈｅ反応生成イオンのＬＥＴの値は、典型的な重イオン照射（例えば３２０ＭｅＶのＣイオン照射におけるＣへのＬＥＴである０．５８×１０³ ＭｅＶｃｍ²／ｇ）と比較して４．３倍以上、最大で８．１倍高い。さらには、ＤＮＡ内部又はＤＮＡ近傍から¹²Ｃと⁴Ｈｅ反応生成イオンが放出されることから、¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料及びＤＮＡ又はＤＮＡ近傍で¹⁵Ｎ標識された生体細胞において、１回の¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応によって¹⁵Ｎ近傍遺伝子に高い確率で変異が生じる。したがって、本手法は、反応生成核¹²Ｃの第１励起準位から放出される４．４３ＭｅＶγ線を計測することにより、¹⁵Ｎ近傍に生じる遺伝子変異数を直接定量することが可能である。

【0054】

陽子線照射によって¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料に生じた変異は、ＤＮＡの修復機能を有する生体試料とは異なり、ＤＮＡの修復は行われない。したがって、¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料の変異を調べることで、陽子線照射による純粋な物理的な変異状況が明らかになる。¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料に生じた変異を調べる手法の一つは、細菌などの細胞質内に存在する環状形状をもつＤＮＡ、環状プラスミドベクターを利用してＤＮＡ切断の有無を判別する手法である。

【0055】

図６は、図４に示す人工遺伝子を別の人工遺伝子に結紮した人工遺伝子と、ＤＮＡ切断の有無を判別する手法の概略を示す。感染症の治療に用いられるβ－ラクタム系抗生物質であるアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）に耐性を示す大腸菌遺伝子を組み入れて人工的に合成された線形プラスミド（Ｔ－ｖｅｃｔｏｒｐＭＤ１９、２，６９２塩基対）に¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡを結紮して環状にしたプラスミドベクターを大腸菌の培地に投入する。環状にしたプラスミドベクターは大腸菌に摂り込まれ、アンピシリンに耐性のある大腸菌が増殖する。¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡが予め陽子線照射によって切断されている場合、プラスミドベクターは環状にならず、大腸菌の細胞内で分解されて安定した遺伝子にならないため、大腸菌はアンピシリンに耐性が無く死滅する。¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡを結紮した環状プラスミドベクターにおいて、切断された¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡが多く含まれるほど、大腸菌の増殖は遅くなる。¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料、¹⁵Ｎ非標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料、¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料で陽子線未照射の各試料をＴ－ｖｅｃｔｏｒｐＭＤ１９に結紮し、それぞれをアンピシリン含有培地に投入して大腸菌コロニー数を比較した。¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料は、¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応と陽子ビームによりＤＮＡ変異が生じる。¹⁵Ｎ非標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料は、陽子ビームのみによりＤＮＡ変異が生じる。陽子線未照射試料は、ＤＮＡ変異が生じない。この評価手法により、¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡへの陽子線照射によるＤＮＡ変異の相対的導入頻度が明らかになる。

【0056】

¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡが陽子線照射によって切断された状態をより直接的に調べる方法として、³²Ｐ放射性同位元素を含有するリン酸基を付与し、電気泳動により１塩基の分解能で断片を分離する手法がある。この手法により、ＤＮＡ鎖のうち一方の鎖にどれだけ切断が起こったかが識別可能になる。

【0057】

図７は、ＤＮＡ鎖のうち一方の鎖にどれだけ切断が起こったかを識別する方法の概要を示す。まず、¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡのＰＣＲ試料合成前に、ＯＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿Ｆ又はＯＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿Ｒのどちらか一方のプライマーをＡＴＰでリン酸化しておき、ＰＣＲ試料合成時に一方のＤＮＡ鎖の５’末端にのみリン酸基のついたＤＮＡ断片を合成する。陽子ビーム照射後、［γ?³²Ｐ］－ＡＴＰを用いてリン酸基のついていない方のＤＮＡ鎖のみ³²Ｐで標識する。塩濃度が低く尿素を含み且つ薄いゲルで高電圧により電気泳動することで、熱がかかり１本鎖の状態（変性状態）でＤＮＡを分離すると、１塩基の違いでＤＮＡを区別可能になる。１塩基の違いをゲル電気泳動で区別できるため、ランダムに切断が可能なのか、ある特定の塩基の近傍のみが切断を受けやすいのかを識別可能である。

【0058】

生体細胞内のＤＮＡを¹⁵Ｎで標識する場合、生体細胞を構成するＤＮＡ以外の窒素元素を含有する細胞内分子、例えば細胞の形成や代謝機能を制御する酵素などのタンパク質に存在する窒素原子、あるいはリボソームを形成するｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ、アミノ酸を運搬するｔｒａｎｓｆｅｒＲＮＡ、及びリボソーム上でアミノ酸配列を規定するｍｅｓｓｅｎｇｅｒＲＮＡなど細胞内で多様な機能をもつＲＮＡに存在する窒素元素と、ＤＮＡを構成する窒素元素とを区別し、ＤＮＡのみを¹⁵Ｎ標識する。

【0059】

細胞内で窒素は、アミノ酸、ヌクレオチド、タンパク質、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、一部のリン脂質など多様な含窒素有機化合物に利用されている。それらの含窒素有機化合物はいずれも無機窒素のアンモニウムイオンＮＨ₄ ⁺がグルタミン合成酵素によりグルタミン酸と反応し、グルタミンとして有機化合物に固定されることで、最初の有機含窒素化合物が作られる（アンモニア同化）。グルタミン酸合成酵素により、グルタミンから２－オキソグルタル酸にアミノ基が転移されて、２分子のグルタミン酸が生じる。このようにして作られるグルタミン、グルタミン酸がそのまま変形することにより、あるいは、アミノ基転移反応により、数々の含窒素有機化合物が合成される。

【0060】

図８は、細胞内における含窒素有機化合物の合成経路を示す。含窒素化合物は、細胞内で再びアンモニアに分解されてリサイクルされている。アミノ酸は様々な用途で構造タンパク質、酵素、核酸、及び脂質の合成に用いられている。一方、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドから遺伝子情報の継体伝搬によってＤＮＡ合成が進む。人工的に合成された¹⁵Ｎ標識デオキシリボヌクレオチドを培地に投与すると、それが細胞内に摂り込まれ、一部は分解されてアンモニウムイオンが合成され、タンパク質合成が始まる。ＤＮＡのみを¹⁵Ｎ標識するためには、そのプロセスを阻害して¹⁵Ｎ標識のタンパク質が合成されないように、グルタミン合成酵素の阻害剤であるＭＳＸ（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ）を投与する。

【0061】

図９は、ＭＳＸ及び¹⁵Ｎ非標識したグルタミンを投与した場合に細胞内において核酸のみを¹⁵Ｎ標識する新たな手法を示す。グルタミン合成酵素の活性部位にグルタミン酸とアミノ基としてのアンモニアが結合してグルタミンを合成して、グルタミン合成酵素からグルタミンが遊離する。ところが、ＭＳＸの構造式にはＨＮ＝Ｓ＝Ｏ構造があり、それがグルタミンの構造式Ｈ₂Ｎ－ＣＨ＝Ｏに類似している。また、ＭＳＸには強い活性部位があり、グルタミン酸とアンモニアが結合するとＭＳＸから離脱できずにグルタミン合成が停止する。すなわちグルタミンからグルタミン酸合成酵素によりグルタミン酸が合成される回路が断たれて、¹⁵Ｎ標識タンパク質は合成されなくなる。しかし多様な目的で必要とされるタンパク質の合成が断たれないように、¹⁵Ｎ非標識のグルタミンを培地に投与する。それによって¹⁴Ｎ存在比が９９．６３７％の構造タンパク質、酵素、一部のＤＮＡ・ＲＮＡが合成される。細胞内に摂り込まれた¹⁵Ｎ標識デオキシリボヌクレオチドの内、アンモニア合成に預からない残りの¹⁵Ｎ標識デオキシリボヌクレオチドによってＤＮＡが合成されるため、細胞内で¹⁵Ｎ標識が成されるのはＤＮＡのみに限定されることになる。

【0062】

さらに、細胞内の核酸合成経路において、ＤＮＡのみを¹⁵Ｎで標識する過程を図１０により詳細に示す。先ず¹⁵Ｎで標識したＤＮＡを合成するため、（１）４種類の塩基をそれぞれ¹⁵Ｎで標識したデオキシリボヌクレオチドを培地に加えて細胞を培養する。次に、細胞内では、ＤＮＡを合成するデオキシリボヌクレオチドは、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）によってリボヌクレオチドからのみ合成されるため、（２）ＲＮＲの阻害剤（ｉ－ＲＮＲ）を投与して、¹⁵Ｎで標識されていないデオキシリボヌクレオチドが細胞内で合成されることが無い条件を形成する。細胞内ではさらに、（３）デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの間で塩基が転位され、細胞外から投入されたデオキシリボヌクレオチドの¹⁵Ｎ標識塩基が、細胞内でリボヌクレオチドの塩基に転位し、そのまま¹⁵Ｎ＿ＲＮＡが合成され得る。また逆にリボヌクレオチドの¹⁵Ｎで標識されていない塩基がデオキシリボヌクレオチドの塩基に転位することもある。しかし、（４）細胞内の¹⁴Ｎ＿アミノ酸などから代謝される¹⁴Ｎ＿リボヌクレオチドの量が、（２）のＲＮＲが阻害されることで多くなり、¹⁵Ｎ＿デオキシリボヌクレオチドからリボヌクレオチドへの塩基転位量は抑制され得る。なお、（１）で¹⁵Ｎ＿ＤＮＡ合成に必要な量を越えて、過剰に¹⁵Ｎ＿デオキシリボヌクレオチドを培地に投入すると、（３）において¹⁵Ｎ＿塩基がデオキシリボヌクレオチドからリボヌクレオチドに転位される可能性が生じ得る。したがって、¹⁵Ｎ＿ＤＮＡの合成効率が高く、¹⁵Ｎ＿ＲＮＡの合成が抑えられるように、培地への¹⁵Ｎ＿デオキシリボヌクレオチドの投入量は適宜調整することが可能である。

【0063】

図１１は、標的遺伝子又はその近傍のみを¹⁵Ｎ標識する新たな手法を示す。図４に示す¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡの塩基配列は、大腸菌を宿主として寄生するウイルスのラムダ（λ）ファージの遺伝子の一部であり、λファージが宿主の大腸菌を死滅させることなく寄生するために、自ら増殖を抑止するための制御遺伝子である。¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡは３カ所のＣｒｏタンパク質結合部位をもち、Ｃｒｏタンパク質がどれか一カ所の部位に結合すると、制御遺伝子が活性化する。３カ所の結合部位の内、遺伝子配列が変異した箇所を導入すると、制御遺伝子が活性化する頻度が制御される。図４の説明では、ポリメラーゼ連鎖反応法で¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡを作製する方法を説明した。これに対し、８４塩基対のＯＲ＿ＤＮＡを¹⁵Ｎ非標識で合成した後、培地に投入することによって、制御遺伝子に摂り込んだ大腸菌に、¹⁵Ｎ標識したＣｒｏタンパク質を投与すると、¹⁵Ｎ標識Ｃｒｏタンパク質は大腸菌の制御遺伝子に結合する。その状態で陽子線照射を行うことで、¹⁵Ｎ標識Ｃｒｏタンパク質が結合している特定遺伝子近傍で¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応が起きる。この手法により、特定遺伝子に高い確率で変異を生じさせることが可能になる。

【0064】

［実施例１：¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料への陽子線照射結果］
（１）¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料の作成
［ＯＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿Ｒのリン酸化］
陽子線照射後のＤＮＡ破断評価を想定したリン酸化過程について説明する。ＡＴＰ（１０ｍＭ＝ｍｍｏｌ／Ｌ）：１６ μＬ、ＯＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿Ｒ（１００ μＭ）：１０ μＬ、１０倍希釈バッファー液：１６ μＬ、Ｔ４ＰＮＫ：８ μＬ、滅菌水：１１０ μＬを３７ ℃で３５分間反応させた後、７２ ℃に昇温して反応を停止し、ＰＣＩ抽出（ＰｈｅｎｏｌＣｈｌｏｒｏｆｏｒｍＩｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ（２５：２４：１）ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）によってタンパク質、脂質を除去したのち、エタノール固定して抽出した。

【0065】

［ＰＣＲ法による¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡの合成］
また、リン酸化したプライマーの有り無の２種類を合成した。耐熱性ＤＮＡ合成酵素（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ）：０．５ μＬ、５倍希釈バッファー液：１０ μＬ、¹⁵Ｎ標識（¹⁵Ｎ純度９８％以上）ｄＮＴＰ：６ μＬ、ＯＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿Ｆ（１０ μＭ）：２．５ μＬ、ＯＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿ＲＰ（リン酸化プライマー１０ μＭ）：７．５ μＬ、テンプレート：１ μＬ、滅菌水：２２．５ μＬ、耐熱性ＤＮＡ合成酵素（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ）：０．５ μＬ、５倍希釈バッファー液：１０ μＬ、¹⁵Ｎ標識（¹⁵Ｎ純度９８％以上）ｄＮＴＰ：６ μＬ、ＯＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿Ｆ（１０ μＭ）：２．５ μＬ、ＯＲ＿ｐｒｉｍｅｒ＿Ｒ（リン酸化なしプライマー１０ μＭ）：２．５ μＬ、テンプレート：１ μＬ、滅菌水：２７．５ μＬ、をそれぞれＰＣＲ３５サイクル（９８ ℃－１０分、３１ ℃－２０分、７２ ℃－３０分）行って終了した。電気泳動法にて８４塩基対ＤＮＡが合成されていることを確認した。

【0066】

（２）陽子線照射
¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料、¹⁵Ｎ非標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料をＡｕ基板に滴下して照射試料を作成した。ＯＲ＿ＤＮＡ溶液濃度は３１．２ｎｇ／μＬ、滴下量１３ μＬ、滴下面積０．２３ｃｍ²の滴下試料中には、４．７×１０¹²ＤＮＡが含まれ、それぞれのＤＮＡには５３８個以上の¹⁵Ｎ原子が結合している。試料面積当たりに換算して、１．１×１０¹⁶ ｃｍ^-2であった。陽子ビーム照射は、国立研究開発法人産業技術総合研究所つくばセンターの４ＭＶペレトロン静電加速器及び国立大学法人筑波大学研究基盤総合センターの１ＭＶタンデム型静電加速器を利用して行った。ビーム電流は０．１ｎＡ～５ｎＡ、ビーム照射面積は０．０７１ｃｍ²であった。¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応で放出される４．４３ＭｅＶのγ線は、原子番号８３のＢｉを含む高エネルギーγ線では最も検出効率の高いＢＧＯ（Ｂｉ₄Ｇｅ₃Ｏ₁₂結晶シンチレーター、比重７．３ｇｃｍ^-3、直径７６．２ｍｍ×長さ７９．２ｍｍ）検出器を照射試料から２４ｍｍの距離の真空外に設置して検出を行った。検出器の検出可能な立体角は全方位角の１０％である。４．４３ＭｅＶのγ線に対する検出感度を最大０．１とすると、４．４３ＭｅＶのγ線に対する検出効率は最大１％程度である。¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ試料に対して一定エネルギーで陽子線照射を行った場合に４．４３ＭｅＶγ線の計数４，０００ｃｏｕｎｔｓ、エネルギーを８ｋｅＶにわたり８点照射した全計数は２５，０００ｃｏｕｎｔｓであった。検出効率を考慮すると、少なくとも２．５×１０⁶の¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡで¹⁵Ｎ共鳴核反応による変異が生じたことになる。

【0067】

（３）¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡの線形プラスミドベクターへの結紮：
［¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡへのＡ突出末端の作成］
陽子線照射した¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡ（９ｎｇ／μＬ）：６．９ μＬ、バッファー液（Ｅｘｔａｑ）１ μＬ、Ｅｘｔａｑ０．１ μＬ、ｄＡＴＰ（１０ｍＭ）２ μＬ、未照射試料ＯＲ＿ＤＮＡ（８ｎｇ／μＬ）：６．９ μＬ、１０倍希釈バッファー液（Ｅｘｔａｑ）１ μＬ、Ｅｘｔａｑ０．１ μＬ、ｄＡＴＰ（１０ｍＭ）２ μＬ、ネガティブインサートＤＮＡ試料：６．９ μＬ、１０倍希釈バッファー液（Ｅｘ＿ｔａｑ）１ μＬ、Ｅｘ＿ｔａｑ０．１ μＬ、ｄＡＴＰ（１０ｍＭ）２ μＬ、コントロールインサートＣＩ試料（１０ｎｇ／μＬ）：６．９ μＬ、１０倍希釈バッファー液（Ｅｘ＿ｔａｑ）１ μＬ、Ｅｘ＿ｔａｑ０．１ μＬ、ｄＡＴＰ（１０ｍＭ）２μＬの４種類の混合溶液を準備し、７２ ℃で１時間反応させた。

【0068】

［線形プラスミドベクターとの結紮］
線形プラスミドベクター（Ｔ－ＶｅｃｔｏｒｐＭＤ１９、２，６９２塩基対）に、氷上で上記４種類の混合溶液を混合させて３０分間放置後、４２ ℃で３０秒温熱ショックを与えて形質転換効率を高めた。

【0069】

［アンピシリン耐性大腸菌培養］
Ｍ９培地で温度３７ ℃、１８０ｒｐｍの振騰培養した大腸菌（ＪＭ１０９）を、４種類の環状プラスミドベクターを投与したアンピシリン含有培地に植え付け、ＪＭ１０９のコロニー形成を比較した。ビーム未照射試料を結紮した環状プラスミドベクターを投与した培地では、コロニー数４６個／１１ｎｇＤＮＡであったのに対し、ビーム照射した¹⁵Ｎ標識ＯＲ＿ＤＮＡを結紮した環状プラスミドベクターを投与した培地では、コロニー数１３個／１１ｎｇＤＮＡと１／３以下に減少した。

【0070】

［実施例２：大腸菌生体試料への陽子線照射結果］
陽子ビーム照射は基本的には真空中で行うため、まず大腸菌（ＪＭ１０９）をフリーズドライ状態にし、その耐性を調べた。ＪＭ１０９大腸菌溶液１０ μＬをエッペンチューブに入れ、一旦液体窒素温度で氷結した試料と、液体窒素で氷結しない試料に分け、それぞれを－２０ ℃で真空乾燥機に入れて４時間放置した後、取り出して４ ℃の状態でさらに２４時間放置し、フリーズドライ試料を作成した。この時点におけるＪＭ１０９大腸菌の生存率は、液体窒素で氷結した試料で２６．８％、液体窒素で氷結しない試料では３９．１％であった。

【0071】

ＪＭ１０９大腸菌は５億１４００万の塩基対ＤＮＡをもち、このＤＮＡを２種類の方法で¹⁵Ｎ標識を行った。一つは、¹⁵Ｎ標識したアンモニウムイオンを投入した培地で、グルタミン合成酵素の阻害剤であるＭＳＸを投与せずに培養したＪＭ１０９大腸菌で、タンパク質、核酸始め細部内の全ての窒素が¹⁵Ｎ標識されている（試料Ｆ）。もう一方は、¹⁵Ｎ標識したデオキシヌクレオチドを投入した培地で、ＭＳＸと¹⁵Ｎ非標識のグルタミンを投与して培養したＪＭ１０９大腸菌で、ＤＮＡとＲＮＡのみが¹⁵Ｎ標識された生体試料である（試料Ｄ）。

【0072】

２種類の¹⁵Ｎ標識したＪＭ１０９大腸菌と¹⁵Ｎ非標識のＪＭ１０９大腸菌（試料Ｅ）の３種類の溶液を準備して、陽子線照射試料を作成した。それぞれの照射試料の大腸菌濃度、溶液滴下量、滴下面積、滴下した細胞数、細胞数の面積密度、¹⁵Ｎ面積密度は以下の通りである。

【0073】

［試料Ｄ］
大腸菌濃度：３．１７×１０⁸ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、溶液滴下量：１０ μＬ、滴下面積：１．２６ｃｍ²、滴下した細胞数：３．１７×１０⁶ ｃｅｌｌｓ、細胞数の面積密度：２．５２×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、¹⁵Ｎ面積密度：９．５０×１０¹³ ｃｍ^-2。

【0074】

［試料Ｅ］
大腸菌濃度：３．１７×１０⁸ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、溶液滴下量：１０ μＬ、滴下面積：１．２０ｃｍ²、滴下した細胞数：３．１７×１０⁶ ｃｅｌｌｓ、細胞数の面積密度：２．６４×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、¹⁵Ｎ面積密度：３．６６×１０¹¹ ｃｍ^-2。

【0075】

［試料Ｆ］
大腸菌濃度：８．６２×１０⁷ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、溶液滴下量：２０ μＬ、滴下面積：１．５６ｃｍ²、滴下した細胞数：１．７２×１０⁶ ｃｅｌｌｓ、細胞数の面積密度：１．１１×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、¹⁵Ｎ面積密度：４．１８×１０¹³ ｃｍ^-2。

【0076】

陽子線照射と同時に計測した４．４３ＭｅＶのγ線量から、Ｄ試料のＤＮＡ及びＲＮＡのみが¹⁵Ｎ標識された¹⁵Ｎ量は、Ｆ試料の細胞内全域の窒素が¹⁵Ｎで標識された場合の４４．６分の１であることが明らかになった。

【0077】

［実施例３：¹⁵Ｎ標識薬剤耐性遺伝子プラスミド試料への陽子線照射結果］
（１）ｐＵＣ４－ＫＩＸＸプラスミド及びその作成方法
図１２は、ｐＵＣ４－ＫＩＸＸプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄＤＮＡ）の遺伝子構造を示す。当該プラスミドはアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ－Ｒ）とＯｒｉを持つ遺伝子ｐＵＣ４（２６０５ｂｐｓ（塩基対））にカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ－Ｒ、１２４８ｂｐｓ）が挿入された環状プラスミド（３８５３ｂｐｓ）である。２種類の薬剤耐性遺伝子のプロモーターと転写領域が占める遺伝子サイズは、アンピシリン耐性遺伝子が９３４ｂｐｓ、カナマイシン耐性遺伝子が９５３ｂｐｓ、プラスミドの複製に必要な領域Ｏｒｉでは６２１ｂｐｓである。それぞれの遺伝子領域ごとの塩基対の種類と¹⁵Ｎ数（置換率１００％）を表２に示す。

【表2】

【0078】

以下の方法により、¹⁵Ｎを自然存在比で含有するプラスミドと、¹⁵Ｎを９８％以上含有するプラスミドを生成した。¹⁵Ｎを自然存在比（０．３６４％）で含有するＮＨ₄Ｃｌを窒素源とするＭ９最少培地を２５０ｍＬ作製した。また、¹⁵Ｎを９８％以上に含有する¹⁵ＮＨ₄Ｃｌを窒素源とするＭ９最少培地を２５０ｍＬ作製した。具体的には、それぞれのＭ９最少培地は、Ｎａ₂ＨＰＯ₄（１５ｇ）、ＫＨ₂ＰＯ₄（７．５ｇ）、ＮａＣｌ（１．２５ｇ）、ＮＨ₄Ｃｌ（２．５ｇ）、１Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）ＭｇＳＯ₄（２５０ μＬ）、２０％（ｗ／ｖ）ｇｌｕｃｏｓｅ２．５ｍＬ、及び１ＭＣａＣｌ₂（２５ μＬ）を２５０ｍＬの超純水に溶解し、オートクレーブした後、室温まで冷ましてから１％Ｔｈｉａｍｉｎｅ－ＨＣｌを２５０ μＬ添加して作製した。それぞれの培地で、ｐＵＣ４－ＫＩＸＸプラスミドを持つ大腸菌（ＪＭ１０９）を培養した。具体的には、Ｍ９最小培地へ大腸菌を２５ μＬ加えて、２日間、３７ ℃、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、大腸菌を回収し、プラスミド抽出キットＰｌａｓｍｉｄＭｉｄｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を利用してプラスミドを精製した。プラスミドを滅菌水に溶解し、蛍光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｎｅｎｃｅ）でＤＮＡ濃度を定量して１１５ｎｇ／μＬに濃度を調整した。以上の手法によって、¹⁵Ｎを自然存在比で含有するプラスミドである¹⁴Ｎ＿ｐＵＣ４－ＫＩＸＸと、¹⁵Ｎを９８％以上含有するプラスミドである¹⁵Ｎ＿ｐＵＣ４－ＫＩＸＸを生成した。

【0079】

（２）ｐＵＣ４－ＫＩＸＸプラスミドへの陽子線照射
２種類のプラスミド試料はＳｉウエハー基板に１ μＬ滴下して乾燥させた後、真空槽に設置し、試料に対して陽子ビームを照射した。陽子ビーム照射は国立大学法人筑波大学研究基盤総合センターの１ＭＶタンデム型静電加速器を利用して行った。陽子線照射の条件は、実施例２の（２）と同様である。図１３に、¹⁵Ｎ＿ｐＵＣ４－ＫＩＸＸプラスミド試料の¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応の共鳴曲線を示す。参考として、¹⁵Ｎ標識デオキシリボヌクレオチド¹⁵Ｎ標識－ｄＧＴＰに対して取得した共鳴曲線も示す。陽子線照射は陽子エネルギーを８９０ｋｅＶ～９０６ｋｅＶまで４ｋｅＶ毎に変えて３種類の線量に分けて照射を行った。３種類の照射量を表３に示す。

【表3】

【0080】

（３）陽子線照射したプラスミドの形質転換
１×１０¹⁰ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの大腸菌５０ μＬに陽子線照射プラスミドを８．６ｎｇ加え、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によってプラスミドを大腸菌の細胞内に導入した。電気穿孔過程では、直流電場を電圧１５００Ｖ、電気抵抗２００ Ω，静電容量２５μＦで３．５～３．７ｍｓ間通電を行った。１ｍＬのＬＢ培地を加えて、一時間浸透培養を行った（３７ ℃、２００ｒｐｍ）。この培養過程で、陽子線照射でプラスミドが損傷して環状が切断されて線形になったプラスミドは大腸菌の細胞内で複製されないため、陽子線照射したプラスミドの内、環状を維持したプラスミドのみが増幅されて形質転換される。

【0081】

（４）薬剤耐性遺伝子の損傷程度評価
２種類の薬剤を加えた３種類の培養プレートを準備した。（ａ）アンピシリン１００ μｇ／ｍＬ、（ｂ）カナマイシン５０ μｇ／ｍＬ、（ｃ）アンピシリン１００ μｇ／ｍＬ＋カナマイシン５０ μｇ／ｍＬのそれぞれの培養プレートに、陽子線照射したプラスミドを形質転換した大腸菌を１００ μＬずつ蒔いて、コロニーの形成数を調べた。コントロール試料として、未照射のプラスミドも同様に薬剤を投入した３種類の培養プレートに１００ μＬずつ蒔いた。図１４、図１５、及び図１６に、薬剤を加えた３種類の培養プレートにおけるコロニー発現数を示す。縦軸はコントロール試料のコロニー発現数（＝１．０）で規格化した量を表し、３回の測定の平均値を示す。誤差は３回の測定結果の上限と下限を示す。いずれの図の１０ μＣにおけるコロニーの発現数は０であったが、検出限界の値を図にプロットした。縦軸は、陽子線照射によって、プラスミドの２種類の薬剤耐性遺伝子が損傷することなく正常に機能する割合を示している。総照射量２．５ μＣでは、¹⁵Ｎ＿ｐＵＣ４－ＫＩＸＸプラスミドが誤差を越えてより照射損傷を受けたことを表している。この結果は、¹⁵Ｎ（¹Ｈ，α₁γ）¹²Ｃ共鳴核反応が陽子線の電離作用を越えて遺伝子に大きな損傷を与えることを示している。なお、図１４では総照射量が概ね５．０ μＣ以上になると、遺伝子は非特異的な損傷を受けているものと考えられる。

【0082】

以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。実施形態が備える各要素並びにその配置、材料、条件、形状及びサイズ等は、例示したものに限定されるわけではなく適宜変更することができる。また、異なる実施形態で示した構成同士を部分的に置換し又は組み合わせることが可能である。

【図1】