ホーム > 特許ランキング > キッコーマン株式会社
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024128054
(43)【公開日】2024-09-20
(54)【発明の名称】グルコースデヒドロゲナーゼを用いた持続血糖測定
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/32 20060101AFI20240912BHJP
C12N 9/04 20060101ALI20240912BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240912BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20240912BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/32 ZNA
C12N9/04
C12M1/34 D
C12Q1/32
C12N15/53
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024109940
(22)【出願日】2024-07-09
(62)【分割の表示】P 2022160290の分割
【原出願日】2017-12-04
(31)【優先権主張番号】P 2017111102
(32)【優先日】2017-06-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2017153711
(32)【優先日】2017-08-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 公開Ａ 集会名：米国糖尿病学会、第７７回科学的セッション 開催日：平成２９年６月９日～１３日 公開日：平成２９年６月１１日 公開Ｂ 刊行物名：米国糖尿病学会、第７７回科学的セッション 公開日：平成２９年６月１１日 公開Ｃ 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ．ｄｉａｂｅｔｅｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｐｒｅｖｉｏｕｓ－ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ－ｓｅｓｓｉｏｎｓ－ａｂｓｔｒａｃｔｓ－ｐｏｓｔｅｒｓ－ａｎｄ－ｗｅｂｃａｓｔｓ ｈｔｔｐｓ：／／ａｄａ．ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｐｏｓｔｅｒｓ．ｃｏｍ／ｅｐｓＡｂｓｔｒａｃｔＡＤＡ．ｃｆｍ？ｉｄ＝１ 公開日：平成２９年６月１１日
(71)【出願人】
【識別番号】000004477
【氏名又は名称】キッコーマン株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】鉞 陽介
(57)【要約】
【課題】溶存酸素の影響を受けにくく、長期間のモニタリング可能な持続血糖測定方法、
及びそのためのデバイスを提供すること。
【解決手段】本発明は、(a) pH 7.0にて40℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性
１００％のうち、３５％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は(b) pH 7.0にて
40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％以上のデヒドロ
ゲナーゼ活性が保持される、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を用いる
、持続血糖測定方法及び装置に関する。さらに脱糖鎖処理されたグルコースデヒドロゲナ
ーゼ及び糖鎖付加部位の改変されたグルコースデヒドロゲナーゼが提供される。
【選択図】なし
及びそのためのデバイスを提供すること。
【解決手段】本発明は、(a) pH 7.0にて40℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性
１００％のうち、３５％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は(b) pH 7.0にて
40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％以上のデヒドロ
ゲナーゼ活性が保持される、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を用いる
、持続血糖測定方法及び装置に関する。さらに脱糖鎖処理されたグルコースデヒドロゲナ
ーゼ及び糖鎖付加部位の改変されたグルコースデヒドロゲナーゼが提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
(a) pH 7.4にて40℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、３５
％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は
(b) pH 7.4にて40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％
以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、
FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を用いる、グルコース測定方法。
％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は
(b) pH 7.4にて40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％
以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、
FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を用いる、グルコース測定方法。
【請求項2】
前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、配列番号３、４、１４又は
２２と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
（FAD-GDH）からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
２２と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
（FAD-GDH）からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、糖鎖富化されたものである
、請求項２に記載の方法。
、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、脱糖鎖処理されたものであ
るか又は糖鎖付加部位の改変により付加糖鎖量が低減された変異体である、請求項２に記
載の方法。
るか又は糖鎖付加部位の改変により付加糖鎖量が低減された変異体である、請求項２に記
載の方法。
【請求項5】
前記糖鎖付加部位の改変が、
配列番号１の25位、101位、143位、156位、172位、198位、205位、214位、256位、247位
、268位、353位、365位、379位、401位、402位、417位、430位、459位、496位、及び550
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置におけるアスパラギン
以外のアミノ酸への置換であるか、
配列番号１の27位、103位、145位、158位、174位、200位、207位、216位、249位、258位
、270位、355位、367位、381位、403位、404位、419位、432位、461位、498位、及び552
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及び
トレオニン以外のアミノ酸への置換であるか、並びに／又は
配列番号１の26位、102位、144位、157位、173位、199位、206位、215位、257位、248位
、269位、354位、366位、380位、402位、403位、418位、431位、460位、497位及び551位
にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへ
の置換である、請求項４に記載の方法。
配列番号１の25位、101位、143位、156位、172位、198位、205位、214位、256位、247位
、268位、353位、365位、379位、401位、402位、417位、430位、459位、496位、及び550
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置におけるアスパラギン
以外のアミノ酸への置換であるか、
配列番号１の27位、103位、145位、158位、174位、200位、207位、216位、249位、258位
、270位、355位、367位、381位、403位、404位、419位、432位、461位、498位、及び552
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及び
トレオニン以外のアミノ酸への置換であるか、並びに／又は
配列番号１の26位、102位、144位、157位、173位、199位、206位、215位、257位、248位
、269位、354位、366位、380位、402位、403位、418位、431位、460位、497位及び551位
にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへ
の置換である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
(a) pH 7.4にて40℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、３５
％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は
(b) pH 7.4にて40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％
以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、
FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を含むグルコースセンサーを備えてな
る、連続グルコースモニタリングデバイス。
％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は
(b) pH 7.4にて40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％
以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、
FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を含むグルコースセンサーを備えてな
る、連続グルコースモニタリングデバイス。
【請求項7】
前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、配列番号３、４、１４又は
２２と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
（FAD-GDH）からなる群より選択されるものである、請求項６に記載のデバイス。
２２と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ
（FAD-GDH）からなる群より選択されるものである、請求項６に記載のデバイス。
【請求項8】
前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、糖鎖富化されたものである
、請求項７に記載のデバイス。
、請求項７に記載のデバイス。
【請求項9】
前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、脱糖鎖処理されたものであ
るか又は糖鎖付加部位の改変により付加糖鎖量が低減された変異体である、請求項７に記
載のデバイス。
るか又は糖鎖付加部位の改変により付加糖鎖量が低減された変異体である、請求項７に記
載のデバイス。
【請求項10】
配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１２、１４又は２２と７０％以上のアミノ
酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼであって、
配列番号１の25位、101位、143位、156位、172位、198位、205位、214位、256位、247
位、268位、353位、365位、379位、401位、402位、417位、430位、459位、496位、及び55
0位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置におけるアスパラギン
以外のアミノ酸への置換であるか、
配列番号１の27位、103位、145位、158位、174位、200位、207位、216位、249位、258位
、270位、355位、367位、381位、403位、404位、419位、432位、461位、498位、及び552
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及び
トレオニン以外のアミノ酸への置換であるか、並びに／又は
配列番号１の26位、102位、144位、157位、173位、199位、206位、215位、257位、248位
、269位、354位、366位、380位、402位、403位、418位、431位、460位、497位及び551位
にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへ
の置換である、糖鎖付加部位の改変を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、低
減された糖鎖を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼであって、
配列番号１の25位、101位、143位、156位、172位、198位、205位、214位、256位、247
位、268位、353位、365位、379位、401位、402位、417位、430位、459位、496位、及び55
0位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置におけるアスパラギン
以外のアミノ酸への置換であるか、
配列番号１の27位、103位、145位、158位、174位、200位、207位、216位、249位、258位
、270位、355位、367位、381位、403位、404位、419位、432位、461位、498位、及び552
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及び
トレオニン以外のアミノ酸への置換であるか、並びに／又は
配列番号１の26位、102位、144位、157位、173位、199位、206位、215位、257位、248位
、269位、354位、366位、380位、402位、403位、418位、431位、460位、497位及び551位
にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへ
の置換である、糖鎖付加部位の改変を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、低
減された糖鎖を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
【請求項11】
a)配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がセリン及びトレオニン以外のアミ
ノ酸に置換されている、
b)配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸に置換
されている、
c)配列番号１の２４９位に対応する位置のアミノ酸がセリン及びトレオニン以外のアミノ
酸に置換されている、及び／又は
d)配列番号１の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸に置換
されている、
請求項１０に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
ノ酸に置換されている、
b)配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸に置換
されている、
c)配列番号１の２４９位に対応する位置のアミノ酸がセリン及びトレオニン以外のアミノ
酸に置換されている、及び／又は
d)配列番号１の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸に置換
されている、
請求項１０に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
【請求項12】
A)配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されている、
B)配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている、
C)配列番号１の２４９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されている、及
び／又は
D)配列番号１の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
請求項１０又は１１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
B)配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている、
C)配列番号１の２４９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されている、及
び／又は
D)配列番号１の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
請求項１０又は１１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
【請求項13】
i) 配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されており、かつ
配列番号１の２４９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されている、
ii) 配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されており、か
つ配列番号１の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
又は
iii) 配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されており、
配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されており、配列番号１
の２４９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されており、かつ配列番号１
の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
請求項１０～１２のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
配列番号１の２４９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されている、
ii) 配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されており、か
つ配列番号１の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
又は
iii) 配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されており、
配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されており、配列番号１
の２４９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されており、かつ配列番号１
の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
請求項１０～１２のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼを用いた持続血糖測定方法及び装置に関する。
【背景技術】
【0002】
血中グルコース濃度（血糖値）は、糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病の診断及び
管理には、連続グルコースモニタリング（CGM）システムが重要である。CGMシステムは数
日～１、２週間の期間、血中グルコースレベルを測定することが出来る。CGMシステムは
グルコースセンサーを有する。CGMは、持続血糖測定、或いは連続グルコースモニタリン
グと呼ばれる（本明細書ではこれらの用語は相互に置き換え可能とする）。
管理には、連続グルコースモニタリング（CGM）システムが重要である。CGMシステムは数
日～１、２週間の期間、血中グルコースレベルを測定することが出来る。CGMシステムは
グルコースセンサーを有する。CGMは、持続血糖測定、或いは連続グルコースモニタリン
グと呼ばれる（本明細書ではこれらの用語は相互に置き換え可能とする）。
【0003】
グルコースレベルの測定はグルコースオキシダーゼ(GOD)を用いて行うことができる。G
ODはグルコースを酸化する際に、酸素を電子受容体とする。これは測定サンプル中に存在
する溶存酸素の影響を受けうる。我々の知る限り、現在の市販CGMデバイスはいずれもGOD
に基づく。特定のGOD、例えばアスペルギルス属、例えばAspergillus niger等の微生物に
由来するGODは、過酷な熱条件下でも活性を保持することが知られている（非特許文献１
）。そのため、CGMデバイスでは、一般に、熱安定なGODが用いられている。
ODはグルコースを酸化する際に、酸素を電子受容体とする。これは測定サンプル中に存在
する溶存酸素の影響を受けうる。我々の知る限り、現在の市販CGMデバイスはいずれもGOD
に基づく。特定のGOD、例えばアスペルギルス属、例えばAspergillus niger等の微生物に
由来するGODは、過酷な熱条件下でも活性を保持することが知られている（非特許文献１
）。そのため、CGMデバイスでは、一般に、熱安定なGODが用いられている。
【0004】
Burkholderia cepacia由来のGDHを用いてCGMデバイスの構築が検討されている。しかし
ながら、GODを用いたCGMやBurkholderia cepacia由来のGDHを用いて構築したCGMデバイス
は、１日に数回のキャリブレーションが必要である（例えば非特許文献２）。これはGOD
やGDHが時間経過により失活しているからであると考えられる。
ながら、GODを用いたCGMやBurkholderia cepacia由来のGDHを用いて構築したCGMデバイス
は、１日に数回のキャリブレーションが必要である（例えば非特許文献２）。これはGOD
やGDHが時間経過により失活しているからであると考えられる。
【0005】
特許文献１は、ムコール属由来のGDHを開示している。
非特許文献３はMucor prainii由来のFAD-GDHを開示している。当該文献には、GOD（E.C
. 1.1.3.4）がその高い熱安定性と高いグルコース選択性のため、アンペロメトリー用グ
ルコースセンサーとして広く使用されてきたことが記載されている。
非特許文献３はMucor prainii由来のFAD-GDHを開示している。当該文献には、GOD（E.C
. 1.1.3.4）がその高い熱安定性と高いグルコース選択性のため、アンペロメトリー用グ
ルコースセンサーとして広く使用されてきたことが記載されている。
【0006】
特許文献２は、Burkholderia cepacia由来のGDHを開示している。開示されているGDHは
膜結合性タンパク質であり、シトクロムドメインを有する。B. cepacia由来のGDHのアミ
ノ酸配列はムコール属由来のFAD依存性GDHと類似していない。
膜結合性タンパク質であり、シトクロムドメインを有する。B. cepacia由来のGDHのアミ
ノ酸配列はムコール属由来のFAD依存性GDHと類似していない。
【0007】
特許文献３はMucor guilliermondii (MgGDH)由来のGDHを開示している。
特許文献４はMucor hiemalis (MhGDH) 由来のGDHを開示している。この文献には、MhGD
HのSMBG用センサーへの応用が開示されている。
特許文献４はMucor hiemalis (MhGDH) 由来のGDHを開示している。この文献には、MhGD
HのSMBG用センサーへの応用が開示されている。
【0008】
特許文献５はCircinella simplex由来のCsGDH及びCircinella sp.由来のCRGDHを開示し
ている。
ている。
【0009】
特許文献６はMucor RD056860由来のMrdGDHを開示している。この文献には、MrdGDHのSM
BG用センサーへの応用が開示されている。
BG用センサーへの応用が開示されている。
【0010】
特許文献７はMucor subtilissimus由来のMsGDHを開示している。
特許文献８及び特許文献９は、それぞれ、M. prainii由来のGDHを開示している。
非特許文献４は、セロビオースデヒドロゲナーゼを用いた酵素センサーについて、脱糖
鎖により応答電流が上がる、すなわちセンサー感度が上がることを記載している。しかし
ながら一般的に、糖鎖修飾された酵素について脱糖鎖を行うと、安定性が低下することが
知られていた（非特許文献５）。
特許文献８及び特許文献９は、それぞれ、M. prainii由来のGDHを開示している。
非特許文献４は、セロビオースデヒドロゲナーゼを用いた酵素センサーについて、脱糖
鎖により応答電流が上がる、すなわちセンサー感度が上がることを記載している。しかし
ながら一般的に、糖鎖修飾された酵素について脱糖鎖を行うと、安定性が低下することが
知られていた（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】国際公開第2015/099112号（US2016/0319246)
【特許文献2】国際公開第2002/036779号（US2004/0023330)
【特許文献3】国際公開第2013/051682号
【特許文献4】特開2013-116102号
【特許文献5】国際公開第2013/022074号（US2014/0154777)
【特許文献6】特開2013-176363号
【特許文献7】特開2013-176364号
【特許文献8】国際公開第2012/169512号（US2014/0287445)
【特許文献9】国際公開第2015/129475号（EP3112461)
【特許文献10】国際公開第2017/1957665号
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 278, No. 27, Issue of July 4, pp. 24324-24333, 2003
【非特許文献2】Sekimoto, et al., American Diabetes Association, 76th Scientific Sessions, 2016, 881-P-2016
【非特許文献3】Satake, et al., J Biosci Bioeng. 2015 Nov;120(5):498-503
【非特許文献4】Anal Bioanal Chem (2013) 405:3637-3658
【非特許文献5】Nippon Nogeikagaku Kaishi(1993) Vol.67 (6),46-47
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明は、溶存酸素の影響を受けにくく、長期間のモニタリング可能な連続グルコース
モニタリング（CGM）方法、及びそのためのデバイスを提供することを目的とする。
モニタリング（CGM）方法、及びそのためのデバイスを提供することを目的とする。
【0014】
CGMは、理論上はGDH又はGODを有するグルコースセンサーにより実装できる。グルコー
スデヒドロゲナーゼはグルコースを脱水素するに当たり、電子アクセプターを用いる。こ
れは溶存酸素の影響を受けにくいため、測定に有利であり得る。
スデヒドロゲナーゼはグルコースを脱水素するに当たり、電子アクセプターを用いる。こ
れは溶存酸素の影響を受けにくいため、測定に有利であり得る。
【0015】
しかしながら本発明者の知る限り、現在市販されているCGMデバイスはいずれもGODに基
づく。これはGODの熱安定性に起因するものと考えられる。特定のGOD、例えばアスペルギ
ルス属、例えばAspergillus niger等の微生物に由来するGODは、過酷な熱条件下でも活性
を保持することが知られている（非特許文献１）。GODは、GDHと比較して、過酷な熱条件
下ではより高い活性を保持することが知られており、グルコースセンサーに適した酵素に
ついては特にそうである。これはGODがGDHよりも安定であることを示唆している。
づく。これはGODの熱安定性に起因するものと考えられる。特定のGOD、例えばアスペルギ
ルス属、例えばAspergillus niger等の微生物に由来するGODは、過酷な熱条件下でも活性
を保持することが知られている（非特許文献１）。GODは、GDHと比較して、過酷な熱条件
下ではより高い活性を保持することが知られており、グルコースセンサーに適した酵素に
ついては特にそうである。これはGODがGDHよりも安定であることを示唆している。
【課題を解決するための手段】
【0016】
このような中で本発明者は、驚くべきことに特定のFAD依存性グルコースデヒドロゲナ
ーゼが、現在のCGMに使用されている公知のGODと比較して、より高い長期安定性を有する
ことを見出し、本発明を完成させた。このFAD-GDH酵素は種々の用途において有用であり
、例えばグルコース測定や、連続グルコースモニタリングに用いることができる。さらに
本発明者は、脱糖鎖処理されたGDHや糖鎖付加部位を改変され付加糖鎖の低減されたGDHを
製造し試験したところ、安定してグルコースを測定しうることを見出し、本発明を完成さ
せた。
ーゼが、現在のCGMに使用されている公知のGODと比較して、より高い長期安定性を有する
ことを見出し、本発明を完成させた。このFAD-GDH酵素は種々の用途において有用であり
、例えばグルコース測定や、連続グルコースモニタリングに用いることができる。さらに
本発明者は、脱糖鎖処理されたGDHや糖鎖付加部位を改変され付加糖鎖の低減されたGDHを
製造し試験したところ、安定してグルコースを測定しうることを見出し、本発明を完成さ
せた。
【0017】
すなわち、本発明は以下の実施形態を包含する。
[１] (a) pH 7.4にて40℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、
３５％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は
(b) pH 7.4にて40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％
以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、
FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を用いる、グルコース測定方法。
[２] 前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、配列番号３、４、１４
又は２２と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナ
ーゼ（FAD-GDH）からなる群より選択されるものである、１に記載の方法。
[３] 前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、糖鎖富化されたもので
ある、２に記載の方法。
[４] 前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、脱糖鎖処理されたもの
であるか又は糖鎖付加部位の改変により付加糖鎖量が低減された変異体である、２に記載
の方法。
[５] 前記糖鎖付加部位の改変が、
配列番号１の25位、101位、143位、156位、172位、198位、205位、214位、256位、247位
、268位、353位、365位、379位、401位、402位、417位、430位、459位、496位、及び550
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置におけるアスパラギン
以外のアミノ酸への置換であるか、
配列番号１の27位、103位、145位、158位、174位、200位、207位、216位、249位、258位
、270位、355位、367位、381位、403位、404位、419位、432位、461位、498位、及び552
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及び
トレオニン以外のアミノ酸への置換であるか、並びに／又は
配列番号１の26位、102位、144位、157位、173位、199位、206位、215位、257位、248位
、269位、354位、366位、380位、402位、403位、418位、431位、460位、497位及び551位
にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへ
の置換である、４に記載の方法。
[６] (a) pH 7.4にて40℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、
３５％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は
(b) pH 7.4にて40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％
以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、
FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を含むグルコースセンサーを備えてな
る、連続グルコースモニタリングデバイス。
[７] 前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、配列番号３、４、１４
又は２２と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナ
ーゼ（FAD-GDH）からなる群より選択されるものである、６に記載のデバイス。
[８] 前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、糖鎖富化されたもので
ある、７に記載のデバイス。
[９] 前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、脱糖鎖処理されたもの
であるか又は糖鎖付加部位の改変により付加糖鎖量が低減された変異体である、７に記載
のデバイス。
[１０] 配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１２、１４又は２２と７０％以上の
アミノ酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼであって、
配列番号１の25位、101位、143位、156位、172位、198位、205位、214位、256位、247
位、268位、353位、365位、379位、401位、402位、417位、430位、459位、496位、及び55
0位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置におけるアスパラギン
以外のアミノ酸への置換であるか、
配列番号１の27位、103位、145位、158位、174位、200位、207位、216位、249位、258位
、270位、355位、367位、381位、403位、404位、419位、432位、461位、498位、及び552
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及び
トレオニン以外のアミノ酸への置換であるか、並びに／又は
配列番号１の26位、102位、144位、157位、173位、199位、206位、215位、257位、248位
、269位、354位、366位、380位、402位、403位、418位、431位、460位、497位及び551位
にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへ
の置換である、糖鎖付加部位の改変を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、低
減された糖鎖を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
[１１] a)配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がセリン及びトレオニン以外
のアミノ酸に置換されている、
b)配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸に置換
されている、
c)配列番号１の２４９位に対応する位置のアミノ酸がセリン及びトレオニン以外のアミノ
酸に置換されている、及び／又は
d)配列番号１の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸に置換
されている、
１０に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
[１２] A)配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されてい
る、
B)配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている、
C)配列番号１の２４９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されている、及
び／又は
D)配列番号１の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
１０又は１１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
[１３]i) 配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されており、
かつ配列番号１の２４９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されている、
ii) 配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されており、か
つ配列番号１の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
又は
iii) 配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されており、
配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されており、配列番号１
の２４９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されており、かつ配列番号１
の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
１０～１２のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
[１] (a) pH 7.4にて40℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、
３５％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は
(b) pH 7.4にて40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％
以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、
FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を用いる、グルコース測定方法。
[２] 前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、配列番号３、４、１４
又は２２と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナ
ーゼ（FAD-GDH）からなる群より選択されるものである、１に記載の方法。
[３] 前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、糖鎖富化されたもので
ある、２に記載の方法。
[４] 前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、脱糖鎖処理されたもの
であるか又は糖鎖付加部位の改変により付加糖鎖量が低減された変異体である、２に記載
の方法。
[５] 前記糖鎖付加部位の改変が、
配列番号１の25位、101位、143位、156位、172位、198位、205位、214位、256位、247位
、268位、353位、365位、379位、401位、402位、417位、430位、459位、496位、及び550
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置におけるアスパラギン
以外のアミノ酸への置換であるか、
配列番号１の27位、103位、145位、158位、174位、200位、207位、216位、249位、258位
、270位、355位、367位、381位、403位、404位、419位、432位、461位、498位、及び552
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及び
トレオニン以外のアミノ酸への置換であるか、並びに／又は
配列番号１の26位、102位、144位、157位、173位、199位、206位、215位、257位、248位
、269位、354位、366位、380位、402位、403位、418位、431位、460位、497位及び551位
にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへ
の置換である、４に記載の方法。
[６] (a) pH 7.4にて40℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、
３５％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は
(b) pH 7.4にて40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％
以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、
FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を含むグルコースセンサーを備えてな
る、連続グルコースモニタリングデバイス。
[７] 前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、配列番号３、４、１４
又は２２と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナ
ーゼ（FAD-GDH）からなる群より選択されるものである、６に記載のデバイス。
[８] 前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、糖鎖富化されたもので
ある、７に記載のデバイス。
[９] 前記FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）が、脱糖鎖処理されたもの
であるか又は糖鎖付加部位の改変により付加糖鎖量が低減された変異体である、７に記載
のデバイス。
[１０] 配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１２、１４又は２２と７０％以上の
アミノ酸配列同一性を有するFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼであって、
配列番号１の25位、101位、143位、156位、172位、198位、205位、214位、256位、247
位、268位、353位、365位、379位、401位、402位、417位、430位、459位、496位、及び55
0位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置におけるアスパラギン
以外のアミノ酸への置換であるか、
配列番号１の27位、103位、145位、158位、174位、200位、207位、216位、249位、258位
、270位、355位、367位、381位、403位、404位、419位、432位、461位、498位、及び552
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及び
トレオニン以外のアミノ酸への置換であるか、並びに／又は
配列番号１の26位、102位、144位、157位、173位、199位、206位、215位、257位、248位
、269位、354位、366位、380位、402位、403位、418位、431位、460位、497位及び551位
にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへ
の置換である、糖鎖付加部位の改変を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、低
減された糖鎖を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
[１１] a)配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がセリン及びトレオニン以外
のアミノ酸に置換されている、
b)配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸に置換
されている、
c)配列番号１の２４９位に対応する位置のアミノ酸がセリン及びトレオニン以外のアミノ
酸に置換されている、及び／又は
d)配列番号１の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン以外のアミノ酸に置換
されている、
１０に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
[１２] A)配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されてい
る、
B)配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている、
C)配列番号１の２４９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されている、及
び／又は
D)配列番号１の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
１０又は１１に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
[１３]i) 配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されており、
かつ配列番号１の２４９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されている、
ii) 配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されており、か
つ配列番号１の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
又は
iii) 配列番号１の１０３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されており、
配列番号１の２４７位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されており、配列番号１
の２４９位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されており、かつ配列番号１
の３６５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
１０～１２のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
【0018】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-111102号及び日本国特
許出願番号2017-153711号の開示内容を包含する。
許出願番号2017-153711号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【0019】
本発明によれば、FAD-GDHをセンサーに備えたCGM装置、及び当該装置を用いるCGM方法
を提供できる。ほとんどのGODに基づくCGMシステムは、一定期間ごとに、例えば12時間お
きに、センサーの全寿命にわたり指先穿刺によるキャリブレーションを必要とする。これ
はCGMデバイスが使用される30-40℃の周囲温度ではセンサー酵素の活性が急激に低下する
ためである。これに対して、本発明のCGM装置及び方法は、指先穿刺によるキャリブレー
ションの必要なしに、或いはより低頻度のキャリブレーションのみにて使用することがで
き、これは使用者の負担を減らしQOLを向上させるものであり、CGMデバイスにとって実用
上有用である。
を提供できる。ほとんどのGODに基づくCGMシステムは、一定期間ごとに、例えば12時間お
きに、センサーの全寿命にわたり指先穿刺によるキャリブレーションを必要とする。これ
はCGMデバイスが使用される30-40℃の周囲温度ではセンサー酵素の活性が急激に低下する
ためである。これに対して、本発明のCGM装置及び方法は、指先穿刺によるキャリブレー
ションの必要なしに、或いはより低頻度のキャリブレーションのみにて使用することがで
き、これは使用者の負担を減らしQOLを向上させるものであり、CGMデバイスにとって実用
上有用である。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1-1】各種由来のGDHのマルチプルアライメントを示す。MpGDHはMucor prainii由来GDH（配列番号１）であり、MhGDHはMucor hiemalis由来GDH（配列番号３）であり、MrdGDHはMucor RD056860由来GDH（配列番号４）であり、MsGDHはMucor subtilissimus由来GDH（配列番号５）であり、MgGDHはMucor guilliermondii由来GDH（配列番号６）であり、CsGDHはCircinella simplex由来GDH（配列番号７）であり、CrGDHはCircinella属由来GDH（配列番号８）であり、McGDHはMucor circinelloides由来GDH（配列番号９）である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
（FAD-GDHの作用原理および活性測定法）
FAD-GDHは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ-δ-ラクトン
を生成する反応を触媒する。
FAD-GDHは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ-δ-ラクトン
を生成する反応を触媒する。
【0022】
FAD-GDHの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメト
サルフェート(PMS)および2,6-ジクロロインドフェノール(DCIP)を用いた以下の系を用い
て測定することができる。
（反応１） D-グルコ－ス ＋ PMS（酸化型）
→ D-グルコノ-δ-ラクトン ＋ PMS（還元型）
（反応２） PMS（還元型） ＋ DCIP（酸化型）
→ PMS（酸化型） ＋ DCIP（還元型）
サルフェート(PMS)および2,6-ジクロロインドフェノール(DCIP)を用いた以下の系を用い
て測定することができる。
（反応１） D-グルコ－ス ＋ PMS（酸化型）
→ D-グルコノ-δ-ラクトン ＋ PMS（還元型）
（反応２） PMS（還元型） ＋ DCIP（酸化型）
→ PMS（酸化型） ＋ DCIP（還元型）
【0023】
（反応１）において、グルコースの酸化に伴い、PMS（還元型）が生成する。続いて進
行する（反応２）により、PMS（還元型）が酸化されるのに伴ってDCIPが還元される。こ
の「DCIP（酸化型）」の消失度合を波長600nmにおける吸光度の変化量として検知し、こ
の変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
行する（反応２）により、PMS（還元型）が酸化されるのに伴ってDCIPが還元される。こ
の「DCIP（酸化型）」の消失度合を波長600nmにおける吸光度の変化量として検知し、こ
の変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
【0024】
FAD-GDHの活性は、以下の手順に従って測定する。100mMリン酸緩衝液（pH7.0） 2.05mL
、1M D-グルコース溶液 0.6mLおよび2mM DCIP溶液 0.15mLを混合し、37℃で5分間保温す
る。次いで、15mM PMS溶液 0.1mLおよび酵素サンプル溶液0.1mLを添加し、反応を開始す
る。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う600nmにおける
吸光度の１分間あたりの減少量（ΔA600）を求め、次式に従いGDH活性を算出する。この
際、GDH活性は、37℃において濃度200mMのD-グルコース存在下で１分間に1μmolのDCIPを
還元する酵素量を１Ｕと定義する。
、1M D-グルコース溶液 0.6mLおよび2mM DCIP溶液 0.15mLを混合し、37℃で5分間保温す
る。次いで、15mM PMS溶液 0.1mLおよび酵素サンプル溶液0.1mLを添加し、反応を開始す
る。反応開始時、および経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う600nmにおける
吸光度の１分間あたりの減少量（ΔA600）を求め、次式に従いGDH活性を算出する。この
際、GDH活性は、37℃において濃度200mMのD-グルコース存在下で１分間に1μmolのDCIPを
還元する酵素量を１Ｕと定義する。
【0025】
【数1】
【0026】
なお、式中の3.0は反応試薬＋酵素試薬の液量(mL)、16.3は本活性測定条件におけるミ
リモル分子吸光係数(cm2/μmol)、0.1は酵素溶液の液量(mL)、1.0はセルの光路長(cm)、
ΔA600blankは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開
始した場合の600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量、dfは希釈倍数を表す。
リモル分子吸光係数(cm2/μmol)、0.1は酵素溶液の液量(mL)、1.0はセルの光路長(cm)、
ΔA600blankは酵素の希釈に用いた緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開
始した場合の600nmにおける吸光度の1分間あたりの減少量、dfは希釈倍数を表す。
【0027】
（FAD-GDHのアミノ酸配列）
FAD-GDHは、配列番号３若しくは配列番号４若しくは配列番号１４若しくは配列番号２
２で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と同一性の高い、例えば７０％以上、７
５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上
、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上同
一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個（例えば１５個、１４個
、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２
個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものであり得る。
FAD-GDHは、配列番号３若しくは配列番号４若しくは配列番号１４若しくは配列番号２
２で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と同一性の高い、例えば７０％以上、７
５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上
、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上同
一なアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１もしくは数個（例えば１５個、１４個
、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２
個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものであり得る。
【0028】
また、FAD-GDHには、熱安定性を向上させる変異、マルトースへの反応性を低減させる
変異、温度依存性を改善させる変異や、pHや特定の物質などへの耐性を向上させる変異の
ような変異、例えばそのような効果を奏する各種公知の変異を任意に組み合わせてもよい
。
変異、温度依存性を改善させる変異や、pHや特定の物質などへの耐性を向上させる変異の
ような変異、例えばそのような効果を奏する各種公知の変異を任意に組み合わせてもよい
。
【0029】
アミノ酸置換の導入方法としては、例えばランダムに変異を導入する方法あるいは想定
した位置に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。前者としては、エラープローン
PCR法(Techniques,1,11-15,(1989))や、増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしや
すく、改変を生じやすいXL1-Redコンピテントセル（STRATAGENE社製）を用いる方法等が
ある。また、後者として、目的タンパク質の結晶構造解析により立体構造を構築し、その
情報をもとに目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、市販のQuick Change
Site Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社製）等により部位特異的変異を導入する
方法がある。あるいは、目的タンパク質と相同性の高い公知のタンパク質の立体構造を用
いてモデリングを行い、目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、部位特異
的変異を導入することもできる。
した位置に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。前者としては、エラープローン
PCR法(Techniques,1,11-15,(1989))や、増殖の際、プラスミドの複製にエラーを起こしや
すく、改変を生じやすいXL1-Redコンピテントセル（STRATAGENE社製）を用いる方法等が
ある。また、後者として、目的タンパク質の結晶構造解析により立体構造を構築し、その
情報をもとに目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、市販のQuick Change
Site Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社製）等により部位特異的変異を導入する
方法がある。あるいは、目的タンパク質と相同性の高い公知のタンパク質の立体構造を用
いてモデリングを行い、目的の効果を付与すると予想されるアミノ酸を選択し、部位特異
的変異を導入することもできる。
【0030】
FAD-GDHには、上記の同一性の範囲内で各種のバリエーションが想定されるが、各種FAD
-GDHの酵素科学的性質が本明細書に記載するFAD-GDHと同様である限り、それらは全て本
発明に含まれ得る。
-GDHの酵素科学的性質が本明細書に記載するFAD-GDHと同様である限り、それらは全て本
発明に含まれ得る。
【0031】
また、FAD-GDHにおいて、アミノ酸配列が配列番号３若しくは配列番号４若しくは配列
番号１４若しくは配列番号２２又はこれと８０％以上のアミノ酸配列同一性を有すること
が重要であり、それが天然から取得されたものか、人工合成による配列であるかを問わな
い。例えばGDHは、発現宿主に応じてコドン最適化された遺伝子によりコードされるもの
であり得る。
番号１４若しくは配列番号２２又はこれと８０％以上のアミノ酸配列同一性を有すること
が重要であり、それが天然から取得されたものか、人工合成による配列であるかを問わな
い。例えばGDHは、発現宿主に応じてコドン最適化された遺伝子によりコードされるもの
であり得る。
【0032】
（FAD-GDHの長期安定性）
GODやFAD-GDHの長期安定性は、本明細書中に記載の活性測定方法及び長期安定性測定方
法に記載した条件において評価される。長期安定性は、初期活性及び所定期間経過後の残
存活性から決定する。初期活性と残存活性の比を計算するために、酵素活性は、初期状態
及び加温後において同じ条件で測定する。試験の初期状態における活性を１００％とし、
例えば30-40℃の周囲温度で所定期間、例えば１日～３週間にわたり酵素を加温し、その
後の残存活性を測定する。ある実施形態において、保存試験の溶液のpHは6.9～7.4、例え
ば7.0である。これは血液のpHが中性付近であるためである。pHはPBSのようなリン酸緩衝
液などの慣用のバッファーにより調整しうるが、緩衝剤や緩衝液はこれに限らない。
GODやFAD-GDHの長期安定性は、本明細書中に記載の活性測定方法及び長期安定性測定方
法に記載した条件において評価される。長期安定性は、初期活性及び所定期間経過後の残
存活性から決定する。初期活性と残存活性の比を計算するために、酵素活性は、初期状態
及び加温後において同じ条件で測定する。試験の初期状態における活性を１００％とし、
例えば30-40℃の周囲温度で所定期間、例えば１日～３週間にわたり酵素を加温し、その
後の残存活性を測定する。ある実施形態において、保存試験の溶液のpHは6.9～7.4、例え
ば7.0である。これは血液のpHが中性付近であるためである。pHはPBSのようなリン酸緩衝
液などの慣用のバッファーにより調整しうるが、緩衝剤や緩衝液はこれに限らない。
【0033】
ある実施形態において、FAD-GDHは、pH 7.0にて、
(a) 30-40℃、例えば40℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、
３５％以上、３６％以上、３７％以上、３８％以上、３９％以上、４０％以上、４５％以
上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、例えば６５％以上、７０％以上、７５％以上
、例えば８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８９％以上、９０％以上、
例えば９５％、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上のデヒドロゲナ
ーゼ活性が保持される、
(b) 30-40℃、例えば40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、
２２％以上、２３％以上、２４％以上、２５％以上、２６％以上、２７％以上、２８％以
上、２９％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、例えば４５％以上、５０％以上
、５５％以上、例えば６０％以上、７０％以上、７５％以上、例えば８０％以上、８１％
以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８
９％以上、９０％以上、例えば９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例え
ば９９％のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、または
(c) 30-40℃、例えば40℃で３週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、
１９％以上、２０％以上、２１％以上、２２％以上、２３％以上、２４％以上、２５％以
上、２６％以上、２７％以上、２８％以上、２９％以上、３０％以上、例えば３５％以上
、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、例えば６０％、７０％以上、７５
％以上、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、例えば９５％以上、９６％以上、
９７％以上、９８％以上、例えば９９％のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、長期安定
性（連続グルコースモニタリングに適した安定性）を有し得る。ある実施形態において、
この性質は、必ずしも、酵素の熱安定性（例えば55℃15分の熱処理後の残存活性）と相関
するわけではない。
(a) 30-40℃、例えば40℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、
３５％以上、３６％以上、３７％以上、３８％以上、３９％以上、４０％以上、４５％以
上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、例えば６５％以上、７０％以上、７５％以上
、例えば８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８９％以上、９０％以上、
例えば９５％、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上のデヒドロゲナ
ーゼ活性が保持される、
(b) 30-40℃、例えば40℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、
２２％以上、２３％以上、２４％以上、２５％以上、２６％以上、２７％以上、２８％以
上、２９％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、例えば４５％以上、５０％以上
、５５％以上、例えば６０％以上、７０％以上、７５％以上、例えば８０％以上、８１％
以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８
９％以上、９０％以上、例えば９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例え
ば９９％のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、または
(c) 30-40℃、例えば40℃で３週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、
１９％以上、２０％以上、２１％以上、２２％以上、２３％以上、２４％以上、２５％以
上、２６％以上、２７％以上、２８％以上、２９％以上、３０％以上、例えば３５％以上
、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、例えば６０％、７０％以上、７５
％以上、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、例えば９５％以上、９６％以上、
９７％以上、９８％以上、例えば９９％のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、長期安定
性（連続グルコースモニタリングに適した安定性）を有し得る。ある実施形態において、
この性質は、必ずしも、酵素の熱安定性（例えば55℃15分の熱処理後の残存活性）と相関
するわけではない。
【0034】
（FAD-GDHをコードする遺伝子の取得）
ある実施形態において、FAD-GDHをコードする遺伝子は、例えば特許文献４又は特許文
献６の開示に基づき取得することができる。これとアミノ酸配列同一性の高いFAD-GDHを
取得するには、遺伝子工学的手法を利用することができる。FAD-GDHをコードする遺伝子
（以下、FAD-GDH遺伝子）を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクロー
ニング方法を用いればよい。FAD-GDHを取得するには、FAD-GDH生産能を有する公知の微生
物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (WI
LEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNA又はmRNAを抽出することができる
。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体
DNA又はcDNAを用いて、染色体DNA又はcDNAのライブラリーを作製することができる。
ある実施形態において、FAD-GDHをコードする遺伝子は、例えば特許文献４又は特許文
献６の開示に基づき取得することができる。これとアミノ酸配列同一性の高いFAD-GDHを
取得するには、遺伝子工学的手法を利用することができる。FAD-GDHをコードする遺伝子
（以下、FAD-GDH遺伝子）を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクロー
ニング方法を用いればよい。FAD-GDHを取得するには、FAD-GDH生産能を有する公知の微生
物菌体や種々の細胞から、常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (WI
LEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNA又はmRNAを抽出することができる
。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体
DNA又はcDNAを用いて、染色体DNA又はcDNAのライブラリーを作製することができる。
【0035】
ついで、公知のFAD-GDHのアミノ酸配列情報に基づき、適当なプローブDNAを合成して、
これを用いて染色体DNA又はcDNAのライブラリーから基質特異性の高いFAD-GDH遺伝子を選
抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーDNAを作製して、5
’RACE法や3’RACE法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（PCR法）により、基質特異性の
高いFAD-GDHをコードする目的の遺伝子断片を含むDNAを増幅させ、これらのDNA断片を連
結させて、目的のFAD-GDH遺伝子の全長を含むDNAを得ることができる。
これを用いて染色体DNA又はcDNAのライブラリーから基質特異性の高いFAD-GDH遺伝子を選
抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーDNAを作製して、5
’RACE法や3’RACE法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（PCR法）により、基質特異性の
高いFAD-GDHをコードする目的の遺伝子断片を含むDNAを増幅させ、これらのDNA断片を連
結させて、目的のFAD-GDH遺伝子の全長を含むDNAを得ることができる。
【0036】
取得されたFAD-GDH遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるFAD-GDHの
酵素科学的性質を指標に選択を行う方法を採用し得る。
出発物質であるFAD-GDH遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意
の方法で行うことができる。すなわち、FAD-GDH遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれ
た組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工
学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、
N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若し
くは5-ブロモウラシル等を挙げることができる。
酵素科学的性質を指標に選択を行う方法を採用し得る。
出発物質であるFAD-GDH遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意
の方法で行うことができる。すなわち、FAD-GDH遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれ
た組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工
学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、
N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若し
くは5-ブロモウラシル等を挙げることができる。
【0037】
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり
、現実に所望の変異をFAD-GDH遺伝子において惹起することができる限り特に限定されな
い。通常、好ましくは0.5～12Mの上記薬剤濃度において、20～80℃の反応温度下で10分間
以上、好ましくは10～180分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。
紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、
p24～30、1989年6月号）。
、現実に所望の変異をFAD-GDH遺伝子において惹起することができる限り特に限定されな
い。通常、好ましくは0.5～12Mの上記薬剤濃度において、20～80℃の反応温度下で10分間
以上、好ましくは10～180分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。
紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、
p24～30、1989年6月号）。
【0038】
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Site-Specific Mutagenesisと
して知られる手法を用いることができる。例えば、Kramer法 (Nucleic Acids Res.,12,94
41(1984):Methods Enzymol.,154,350(1987):Gene,37,73(1985))、Eckstein法(Nucleic Ac
ids Res.,13,8749(1985):Nucleic Acids Res.,13,8765(1985):Nucleic Acids Res,14,967
9(1986))、Kunkel法(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A.,82,488(1985)：Methods Enzymol.,
154,367(1987))等が挙げられる。DNA中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例
えば市販のキット(Transformer Mutagenesis Kit;Clonetech社、EXOIII/Mung Bean Delet
ion Kit;Stratagene製、Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製な
ど）の利用が挙げられる。
して知られる手法を用いることができる。例えば、Kramer法 (Nucleic Acids Res.,12,94
41(1984):Methods Enzymol.,154,350(1987):Gene,37,73(1985))、Eckstein法(Nucleic Ac
ids Res.,13,8749(1985):Nucleic Acids Res.,13,8765(1985):Nucleic Acids Res,14,967
9(1986))、Kunkel法(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A.,82,488(1985)：Methods Enzymol.,
154,367(1987))等が挙げられる。DNA中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例
えば市販のキット(Transformer Mutagenesis Kit;Clonetech社、EXOIII/Mung Bean Delet
ion Kit;Stratagene製、Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製な
ど）の利用が挙げられる。
【0039】
また、一般的なポリメラーゼチェインリアクション(Polymerase Chain Reaction)とし
て知られる手法を用いることもできる(Technique,1,11(1989))。なお、上記遺伝子改変法
の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望のFAD-GDH遺伝子を合成することも
できる。
て知られる手法を用いることもできる(Technique,1,11(1989))。なお、上記遺伝子改変法
の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望のFAD-GDH遺伝子を合成することも
できる。
【0040】
上記のような任意の方法により選択されたFAD-GDH遺伝子のDNA塩基配列の決定又は確認
を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000（ベックマン・コ
ールター社製）等を用いれば良い。
を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000（ベックマン・コ
ールター社製）等を用いれば良い。
【0041】
（FAD-GDHの由来となる天然型FAD-GDHの例）
FAD-GDHは、他の公知のFAD-GDHより取得することもできる。公知のFAD-GDHの由来微生
物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さ
らに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコー
ル(Mucor)属、アブシジア(Absidia)属、アクチノムコール(Actinomucor)属、シルシネラ(
Circinella)属由来のFAD-GDH等が挙げられる。
FAD-GDHは、他の公知のFAD-GDHより取得することもできる。公知のFAD-GDHの由来微生
物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さ
らに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコー
ル(Mucor)属、アブシジア(Absidia)属、アクチノムコール(Actinomucor)属、シルシネラ(
Circinella)属由来のFAD-GDH等が挙げられる。
【0042】
Mucor属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Mucor p
rainii、Mucor javanicus、Mucor circinelloides f. circinelloides、Mucor guillierm
ondii、Mucor hiemalis f. silvaticus、Mucor subtilissimus、Mucor dimorphosporus等
が挙げられる。より具体的には、Mucor prainii、Mucor javanicus、Mucor circinelloid
es f. circinelloides、Mucor guilliermondii NBRC9403、特許文献４に記載のMucor hie
malis、Mucor hiemalis f. silvaticus NBRC6754、Mucor subtilissimus NBRC6338、特許
文献６に記載のMucor RD056860、Mucor dimorphosporus NBRC5395等が挙げられる。Absid
ia属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Absidia cyli
ndrospora、Absidia hyalosporaを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に
記載のAbsidia cylindrospora、Absidia hyalosporaを挙げることができる。Actinomucor
属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Actinomucor el
egansを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のActinomucor elegans
を挙げることができる。Circinella属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微
生物の例としては、Circinella minor、Circinella mucoroides、Circinella muscae、Ci
rcinella rigida、Circinella simplex、Circinella umbellataを挙げることができる。
より具体的には、Circinella minor NBRC6448、Circinella mucoroides NBRC4453、Circi
nella muscae NBRC6410、Circinella rigida NBRC6411、Circinella simplex NBRC6412、
Circinella umbellata NBRC4452、Circinella umbellata NBRC5842、Circinella RD05542
3及びCircinella RD055422を挙げることができる。なお、NBRC菌株およびRD菌株はNBRC（
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）の保管菌株である。
rainii、Mucor javanicus、Mucor circinelloides f. circinelloides、Mucor guillierm
ondii、Mucor hiemalis f. silvaticus、Mucor subtilissimus、Mucor dimorphosporus等
が挙げられる。より具体的には、Mucor prainii、Mucor javanicus、Mucor circinelloid
es f. circinelloides、Mucor guilliermondii NBRC9403、特許文献４に記載のMucor hie
malis、Mucor hiemalis f. silvaticus NBRC6754、Mucor subtilissimus NBRC6338、特許
文献６に記載のMucor RD056860、Mucor dimorphosporus NBRC5395等が挙げられる。Absid
ia属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Absidia cyli
ndrospora、Absidia hyalosporaを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に
記載のAbsidia cylindrospora、Absidia hyalosporaを挙げることができる。Actinomucor
属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Actinomucor el
egansを挙げることができる。より具体的には、特許文献５に記載のActinomucor elegans
を挙げることができる。Circinella属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微
生物の例としては、Circinella minor、Circinella mucoroides、Circinella muscae、Ci
rcinella rigida、Circinella simplex、Circinella umbellataを挙げることができる。
より具体的には、Circinella minor NBRC6448、Circinella mucoroides NBRC4453、Circi
nella muscae NBRC6410、Circinella rigida NBRC6411、Circinella simplex NBRC6412、
Circinella umbellata NBRC4452、Circinella umbellata NBRC5842、Circinella RD05542
3及びCircinella RD055422を挙げることができる。なお、NBRC菌株およびRD菌株はNBRC（
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）の保管菌株である。
【0043】
（FAD-GDH遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞）
上述のように得られたFAD-GDH遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド
、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み
込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をするこ
とができる。
上述のように得られたFAD-GDH遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド
、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み
込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をするこ
とができる。
【0044】
原核宿主細胞の一例としては、エシェリヒア属に属する微生物、例えば大腸菌K-12株、
エシェリヒア・コリーBL21(DE3)、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH
5α、エシェリヒア・コリーW3110、エシェリヒア・コリーC600等（いずれもタカラバイオ
社製）が挙げられる。それらを形質転換し、又は、それらに形質導入して、DNAが導入さ
れた宿主細胞（形質転換体）を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方
法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシ
ウムイオンの存在下で組み換えDNAの移入を行う方法などを採用することができる、更に
エレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばECOS
Competent エシェリヒア・コリーBL21(DE3)；ニッポンジーン製）を用いても良い。
エシェリヒア・コリーBL21(DE3)、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH
5α、エシェリヒア・コリーW3110、エシェリヒア・コリーC600等（いずれもタカラバイオ
社製）が挙げられる。それらを形質転換し、又は、それらに形質導入して、DNAが導入さ
れた宿主細胞（形質転換体）を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方
法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシ
ウムイオンの存在下で組み換えDNAの移入を行う方法などを採用することができる、更に
エレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばECOS
Competent エシェリヒア・コリーBL21(DE3)；ニッポンジーン製）を用いても良い。
【0045】
真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、
例えば、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、サッカロマイセス(Saccharomyce
s)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺
伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含ま
れていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、TRP1のような、宿主の栄養要
求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で目的遺伝子を
発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、
ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとし
ては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、ADH1プロモーター等が挙げられる。酵母
への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法(MethodsMo
l. Cell. Biol., 5, 255-269(1995))やエレクトロポレーション(J Microbiol Methods 55
(2003)481-484)等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラス
ト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えばよい。
例えば、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、サッカロマイセス(Saccharomyce
s)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺
伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含ま
れていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、TRP1のような、宿主の栄養要
求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で目的遺伝子を
発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、
ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとし
ては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、ADH1プロモーター等が挙げられる。酵母
への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法(MethodsMo
l. Cell. Biol., 5, 255-269(1995))やエレクトロポレーション(J Microbiol Methods 55
(2003)481-484)等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラス
ト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えばよい。
【0046】
また、例えば、真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス(Aspergillus)属やト
リコデルマ(Tricoderma)属のようなカビ細胞が挙げられる。カビ細胞の形質転換体の作製
方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、GDHをコードする遺伝子が発現する態様
で宿主糸状菌に挿入する方法が挙げられる。具体的には、GDHをコードする遺伝子を発現
誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次
いでGDHをコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主糸状菌を形質転換するこ
とにより、GDHをコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では
、宿主糸状菌を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター－GDHをコードす
る遺伝子－ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを
ＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
リコデルマ(Tricoderma)属のようなカビ細胞が挙げられる。カビ細胞の形質転換体の作製
方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、GDHをコードする遺伝子が発現する態様
で宿主糸状菌に挿入する方法が挙げられる。具体的には、GDHをコードする遺伝子を発現
誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次
いでGDHをコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主糸状菌を形質転換するこ
とにより、GDHをコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では
、宿主糸状菌を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター－GDHをコードす
る遺伝子－ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターを
ＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
【0047】
GDHをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法は特に限定されな
いが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する
手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主糸状菌内に導入する手法などが挙
げられる。
いが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する
手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主糸状菌内に導入する手法などが挙
げられる。
【0048】
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同
な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主糸状菌のゲノム中に挿入することが
できる。自身の高発現プロモーター制御下で宿主糸状菌内で過剰発現することにより、セ
ルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは特に限定
されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領
域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子
（ａｌｐ）プロモーター領域などが挙げられる。
な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主糸状菌のゲノム中に挿入することが
できる。自身の高発現プロモーター制御下で宿主糸状菌内で過剰発現することにより、セ
ルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは特に限定
されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領
域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子
（ａｌｐ）プロモーター領域などが挙げられる。
【0049】
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、糸状菌の形質転
換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主糸状菌を常法により形質転
換することができる。
換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主糸状菌を常法により形質転
換することができる。
【0050】
そのような、好適なベクター－宿主系としては、宿主糸状菌中でGDHを生産させ得る系
であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Mol. Gen
. Genet. 218, 99-104, 1989）及び糸状菌の系などが挙げられる。
であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Mol. Gen
. Genet. 218, 99-104, 1989）及び糸状菌の系などが挙げられる。
【0051】
ＤＮＡコンストラクトは宿主糸状菌の染色体に導入して用いることが好ましいが、この
他の方法として、自律複製型のベクター（Ozeki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem.
59, 1133 (1995)）にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない
形で用いることもできる。
他の方法として、自律複製型のベクター（Ozeki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem.
59, 1133 (1995)）にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない
形で用いることもできる。
【0052】
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマ
ーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒ
Ｇ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、
ハイグロマイシンＢオリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる
。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞中でGDHをコードする遺伝子を過剰発現する
ことを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサ
ー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されない
が、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プ
ロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーターなどが挙げられる。ターミネータ
ーもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、
ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
ーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒ
Ｇ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、
ハイグロマイシンＢオリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる
。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞中でGDHをコードする遺伝子を過剰発現する
ことを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサ
ー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されない
が、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プ
ロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーターなどが挙げられる。ターミネータ
ーもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、
ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
【0053】
ＤＮＡコンストラクトにおいて、GDHをコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入するG
DHをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は
必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコン
ストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
DHをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は
必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコン
ストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
【0054】
ＤＮＡコンストラクトの一実施態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイ
トにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモータ
ー、GDHをコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子
を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
トにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモータ
ー、GDHをコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子
を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
【0055】
糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、
例えば、宿主糸状菌のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化
カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Mol. Gen. Genet. 218, 99-104,
1989、特開２００７－２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換
糸状菌を再生させるための培地は、用いる宿主糸状菌と形質転換マーカー遺伝子とに応じ
て適切なものを用いる。例えば、宿主糸状菌としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質
転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換糸状菌の再生は、例
えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（デ
ィフコ社）で行うことができる。
例えば、宿主糸状菌のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化
カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Mol. Gen. Genet. 218, 99-104,
1989、特開２００７－２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換
糸状菌を再生させるための培地は、用いる宿主糸状菌と形質転換マーカー遺伝子とに応じ
て適切なものを用いる。例えば、宿主糸状菌としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質
転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換糸状菌の再生は、例
えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（デ
ィフコ社）で行うことができる。
【0056】
また、例えば、本発明の形質転換糸状菌を得るために、相同組換えを利用して、宿主糸
状菌が本来染色体上に有するGDHをコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高
発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧ
などの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、
特開２０１１－２３９６８１に記載の実施例１や図１を参照して、GDHをコードする遺伝
子の上流領域－形質転換マーカー遺伝子－高発現プロモーター－GDHをコードする遺伝子
の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、GDHをコード
する遺伝子の上流領域及びGDHをコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために
利用される。GDHをコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含
むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好まし
い。
状菌が本来染色体上に有するGDHをコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高
発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧ
などの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、
特開２０１１－２３９６８１に記載の実施例１や図１を参照して、GDHをコードする遺伝
子の上流領域－形質転換マーカー遺伝子－高発現プロモーター－GDHをコードする遺伝子
の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、GDHをコード
する遺伝子の上流領域及びGDHをコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために
利用される。GDHをコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含
むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好まし
い。
【0057】
本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、GDHの酵素活性が認められる条件
下で本発明の形質転換糸状菌を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるGDHの活
性を確認することにより行うことができる。
下で本発明の形質転換糸状菌を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるGDHの活
性を確認することにより行うことができる。
【0058】
また、本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、形質転換糸状菌から染色体
ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能な
ＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。
ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能な
ＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。
【0059】
例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マ
ーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想
定の長さの産物が生じることを確認する。
ーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想
定の長さの産物が生じることを確認する。
【0060】
（ハイスループットスクリーニング）
GDHはさらに、機能性GDH変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供
することができる。例えば変異導入したGDH遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のラ
イブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリ
ーニングに供してもよく、又は液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリー
ニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリア
ルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ（例えばChem. Rev. 105 (11): 4
056-72, 2005）、イーストディスプレイ（例えばComb Chem High Throughput Screen. 20
08;11(2): 127-34）、バクテリアルディスプレイ（例えばCurr Opin Struct Biol 17: 47
4-80, 2007）等を用いて、変異GDHの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる
。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics
for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9)
: 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。GDHバリアントのスクリーニングに使用しうる超
ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組
み入れる。例えばエラープローンPCR法によりライブラリーを構築することができる。ま
た飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の領域や位置又はそれらに対応する領域や
位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気
コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約10の7乗の変異体を取得しうる
。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソ
フトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体
デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成するこ
とができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供
しうる。細胞を選別する際にはGDH活性の有無を利用しうる。これには例えば上記のGDHが
作用すれば発色する組成とした反応液を用いてもよい。例えばDCIPを用いる場合は、96ウ
ェルプレート、192ウェルプレート、384ウェルプレート、9600ウェルプレート等及びプレ
ートリーダーを用いて600nmの吸光度を測定してもよい。変異導入と選別は複数回反復し
てもよい。
GDHはさらに、機能性GDH変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供
することができる。例えば変異導入したGDH遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のラ
イブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリ
ーニングに供してもよく、又は液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリー
ニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリア
ルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ（例えばChem. Rev. 105 (11): 4
056-72, 2005）、イーストディスプレイ（例えばComb Chem High Throughput Screen. 20
08;11(2): 127-34）、バクテリアルディスプレイ（例えばCurr Opin Struct Biol 17: 47
4-80, 2007）等を用いて、変異GDHの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる
。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics
for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9)
: 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。GDHバリアントのスクリーニングに使用しうる超
ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組
み入れる。例えばエラープローンPCR法によりライブラリーを構築することができる。ま
た飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の領域や位置又はそれらに対応する領域や
位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気
コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約10の7乗の変異体を取得しうる
。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソ
フトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体
デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成するこ
とができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供
しうる。細胞を選別する際にはGDH活性の有無を利用しうる。これには例えば上記のGDHが
作用すれば発色する組成とした反応液を用いてもよい。例えばDCIPを用いる場合は、96ウ
ェルプレート、192ウェルプレート、384ウェルプレート、9600ウェルプレート等及びプレ
ートリーダーを用いて600nmの吸光度を測定してもよい。変異導入と選別は複数回反復し
てもよい。
【0061】
（FAD-GDH酵素の製造方法）
FAD-GDH酵素は、上述のように取得したFAD-GDHを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主
細胞中に含まれるFAD-GDH遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からFAD-GDHを単離する
ことにより製造すればよい。
FAD-GDH酵素は、上述のように取得したFAD-GDHを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主
細胞中に含まれるFAD-GDH遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からFAD-GDHを単離する
ことにより製造すればよい。
【0062】
上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、
肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以
上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類
の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用い
られる。
肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以
上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類
の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用い
られる。
【0063】
培地の初発pHは、限定されないが、例えば、pH 6～9に調整することができる。培養は
、10～42℃の培養温度、好ましくは25℃前後の培養温度で4～24時間、さらに好ましくは2
5℃前後の培養温度で4～8時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施す
ればよい。
、10～42℃の培養温度、好ましくは25℃前後の培養温度で4～24時間、さらに好ましくは2
5℃前後の培養温度で4～8時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施す
ればよい。
【0064】
培養終了後、該培養物よりFAD-GDH酵素を採取する。これには、通常の公知の酵素採取
手段を用いればよい。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、
もしくはリゾチームやヤタラーゼ等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエ
ン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることが
できる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレ
プトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、FAD-GD
Hの粗酵素を得る。
手段を用いればよい。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、
もしくはリゾチームやヤタラーゼ等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエ
ン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることが
できる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレ
プトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、FAD-GD
Hの粗酵素を得る。
【0065】
FAD-GDHの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製さ
れた酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等
を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用
いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈
降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分
画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたFAD-GD
H酵素標品を得ることができる。
れた酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等
を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用
いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈
降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分
画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたFAD-GD
H酵素標品を得ることができる。
【0066】
（FAD-GDHを用いたグルコース測定方法）
本発明はまた、FAD-GDHを含むグルコースアッセイキットを提供する。FAD-GDHを用いて
血中のグルコース（血糖値）を測定することができる。
本発明はまた、FAD-GDHを含むグルコースアッセイキットを提供する。FAD-GDHを用いて
血中のグルコース（血糖値）を測定することができる。
【0067】
グルコースアッセイキットには、少なくとも１回のアッセイに十分な量のFAD-GDHを含
む。典型的には、グルコースアッセイキットは、FAD-GDHに加えて、アッセイに必要な緩
衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含
む。グルコース測定法やグルコースアッセイキットに用いるFAD-GDHは、種々の形態で、
例えば、凍結乾燥された試薬として、又は適切な保存溶液中に溶解されて提供することが
できる。
む。典型的には、グルコースアッセイキットは、FAD-GDHに加えて、アッセイに必要な緩
衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液を含
む。グルコース測定法やグルコースアッセイキットに用いるFAD-GDHは、種々の形態で、
例えば、凍結乾燥された試薬として、又は適切な保存溶液中に溶解されて提供することが
できる。
【0068】
グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下の
よう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはFAD-GDH、電子受容体、
そして反応促進剤としてN-(2-アセトアミド)イミド２酢酸(ADA)、ビス(2-ヒドロキシエチ
ル)イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、炭酸ナトリウムおよびイミダ
ゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持さ
せておく。ここで、必要に応じてpH緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含
む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電
子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する
吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エン
ドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化か
ら、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作成したキャリブレーションカーブを元にし
て、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
よう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはFAD-GDH、電子受容体、
そして反応促進剤としてN-(2-アセトアミド)イミド２酢酸(ADA)、ビス(2-ヒドロキシエチ
ル)イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、炭酸ナトリウムおよびイミダ
ゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持さ
せておく。ここで、必要に応じてpH緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含
む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電
子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する
吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エン
ドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化か
ら、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作成したキャリブレーションカーブを元にし
て、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
【0069】
この方法において使用できるメディエーター及び発色試薬としては、例えば、2,6-ジク
ロロフェノールインドフェノール(DCPIP)を電子受容体として添加し、600nmにおける吸光
度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、電子受容体と
してフェナジンメトサルフェート(PMS)を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウム
ブルー(NTB)を加え、570nm吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定
し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する電子
受容体および発色試薬はこれらに限定されない。
ロロフェノールインドフェノール(DCPIP)を電子受容体として添加し、600nmにおける吸光
度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、電子受容体と
してフェナジンメトサルフェート(PMS)を、さらに発色試薬としてニトロテトラゾリウム
ブルー(NTB)を加え、570nm吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定
し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する電子
受容体および発色試薬はこれらに限定されない。
【0070】
（FAD-GDHを含むグルコースセンサー）
本発明はまた、FAD-GDHを用いるグルコースセンサーを開示する。ある実施形態におい
てグルコースセンサーは、FAD-GDHを含む作用電極、参照電極及び対極を有する。作用電
極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にFAD-GDHを固定
化する。さらに、又はこれとは別に、作用電極上に電子メディエーターを固定化してもよ
い。対極は白金電極やPt/C等の慣用の電極でありうる。参照電極はAg/AgCl電極などの慣
用の電極でありうる。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス
中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還
元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディ
エーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを
組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いてFAD-GDHをカーボ
ン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッ
キングする。本発明のFAD-GDH変異体は、保護膜により保護してグルコースセンサーに用
いることができる。保護膜としては、センサーに使用されている酵素を保護するための既
知の保護膜や一般的な保護膜を使用しうる。
本発明はまた、FAD-GDHを用いるグルコースセンサーを開示する。ある実施形態におい
てグルコースセンサーは、FAD-GDHを含む作用電極、参照電極及び対極を有する。作用電
極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にFAD-GDHを固定
化する。さらに、又はこれとは別に、作用電極上に電子メディエーターを固定化してもよ
い。対極は白金電極やPt/C等の慣用の電極でありうる。参照電極はAg/AgCl電極などの慣
用の電極でありうる。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス
中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還
元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディ
エーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを
組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いてFAD-GDHをカーボ
ン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッ
キングする。本発明のFAD-GDH変異体は、保護膜により保護してグルコースセンサーに用
いることができる。保護膜としては、センサーに使用されている酵素を保護するための既
知の保護膜や一般的な保護膜を使用しうる。
【0071】
ある実施形態では、保護膜として、膜中に酵素を担持する酵素膜を使用しうる。酵素膜
は、GDH酵素とアルブミンのようなタンパク質とを架橋剤（グルタルアルデヒド等）で固
定化して形成しうる。酵素膜は、第1の透過膜の上に形成しうる（選択透過膜ともいう）
。その後、第１透過膜上の酵素膜の上にさらに第2の透過膜を形成してもよい（制限透過
膜ともいう）。制限透過膜はシリコーン膜、フッ素系ポリマー膜、ウレタンポリマー膜、
ポリカーボネート膜から形成され得る。第1透過膜、酵素膜、第2透過膜は0.1～10μmの厚
みであり得る。選択透過膜は、過酸化水素のみ透過させ、測定を妨害する物質の透過を防
ぐものであり得る。制限透過膜は、汚染物質の吸着を防ぎ、グルコースの透過を制限する
ものであり得る。各透過膜は微小孔を有してもよく、それにより物質の透過が制限されう
る。
は、GDH酵素とアルブミンのようなタンパク質とを架橋剤（グルタルアルデヒド等）で固
定化して形成しうる。酵素膜は、第1の透過膜の上に形成しうる（選択透過膜ともいう）
。その後、第１透過膜上の酵素膜の上にさらに第2の透過膜を形成してもよい（制限透過
膜ともいう）。制限透過膜はシリコーン膜、フッ素系ポリマー膜、ウレタンポリマー膜、
ポリカーボネート膜から形成され得る。第1透過膜、酵素膜、第2透過膜は0.1～10μmの厚
みであり得る。選択透過膜は、過酸化水素のみ透過させ、測定を妨害する物質の透過を防
ぐものであり得る。制限透過膜は、汚染物質の吸着を防ぎ、グルコースの透過を制限する
ものであり得る。各透過膜は微小孔を有してもよく、それにより物質の透過が制限されう
る。
【0072】
ある実施形態において保護膜は、酵素層を基板に形成し、当該基板を保護膜溶液に浸漬
して被膜することにより作製しうる。GDHを含む酵素層には、ポリアクリル酸ナトリウム
、トレハロース、グルコマンナン等の添加剤を使用しうる。保護膜溶液は、ポリ―４―ビ
ニルピリジン溶液等であり得るが、これに限らない。
して被膜することにより作製しうる。GDHを含む酵素層には、ポリアクリル酸ナトリウム
、トレハロース、グルコマンナン等の添加剤を使用しうる。保護膜溶液は、ポリ―４―ビ
ニルピリジン溶液等であり得るが、これに限らない。
【0073】
グルコースセンサーの製造方法は公知文献にあり、例えばLiu, et. al., Anal. Chem.
2012, 84, 3403-3409及びTsujimura, et. al., J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 14432-14
437が挙げられる（参照によりいずれもその全内容を本明細書に組み入れるものとする。
）。公知の方法においてGODの代わりにGDHを用いることができる。
2012, 84, 3403-3409及びTsujimura, et. al., J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 14432-14
437が挙げられる（参照によりいずれもその全内容を本明細書に組み入れるものとする。
）。公知の方法においてGODの代わりにGDHを用いることができる。
【0074】
例えば、オスミウム錯体を含むポリマーなどのレドックスポリマーを、HEPES緩衝液な
どの適切な緩衝液中のポリエチレングリコールなどの別のポリマー中に存在するGDHと混
合して、グルコースセンシング試薬を調製することができる。オスミウム錯体は、2,2'-
ビピリジンのようなビピリジン分子、2,2'-ビイミダゾールのようなビイミダゾール分子
、2-(2-ピリジル）イミダゾールのようなピリジン-イミダゾール化合物またはそれらの組
み合わせを含む1以上の化合物と錯体形成したオスミウム錯体であり得る。錯体を形成す
る有機分子は、必要に応じて、メチル基またはエチル基などのC1～C6アルキルなどのアル
キル基で置換されていてもよい。一実施形態では、オスミウム錯体は、以下のとおりであ
り得る：
[Os有機分子複合体]－[ポリマー]
錯体を形成する有機分子の1つは、場合により、リンカーを介してポリマーに結合され
てもよい。したがって、別の実施形態では、オスミウム錯体は以下の通りであり得る：
[Os有機分子複合体]－[リンカー]－[ポリマー]
例示的な分子は、Oharaら、Anal Chem. 1993 Dec 1; 65（23）：3512-7及びAntiochia
ら、Materials Sciences and Applications Vol. 4 No.7 A2（2013）（両方とも参考とし
て全内容を本明細書に組み入れる）にある。オスミウム錯体を含むポリマーの例には、ポ
リ（1-ビニルイミダゾール）で錯体化されたオスミウムビス（2,2'-ビピリジン）クロラ
イド、ポリ（4-ビニルピリジン）錯体化オスミウムビス（2,2'-ビピリジン）クロライド
、ポリ（1-ビニルイミダゾール）n－[オスミウム（4,4'-ジメチル-2,2'-ビピリジル）2Cl
2]2+/+およびそれらの誘導体が挙げられる。
どの適切な緩衝液中のポリエチレングリコールなどの別のポリマー中に存在するGDHと混
合して、グルコースセンシング試薬を調製することができる。オスミウム錯体は、2,2'-
ビピリジンのようなビピリジン分子、2,2'-ビイミダゾールのようなビイミダゾール分子
、2-(2-ピリジル）イミダゾールのようなピリジン-イミダゾール化合物またはそれらの組
み合わせを含む1以上の化合物と錯体形成したオスミウム錯体であり得る。錯体を形成す
る有機分子は、必要に応じて、メチル基またはエチル基などのC1～C6アルキルなどのアル
キル基で置換されていてもよい。一実施形態では、オスミウム錯体は、以下のとおりであ
り得る：
[Os有機分子複合体]－[ポリマー]
錯体を形成する有機分子の1つは、場合により、リンカーを介してポリマーに結合され
てもよい。したがって、別の実施形態では、オスミウム錯体は以下の通りであり得る：
[Os有機分子複合体]－[リンカー]－[ポリマー]
例示的な分子は、Oharaら、Anal Chem. 1993 Dec 1; 65（23）：3512-7及びAntiochia
ら、Materials Sciences and Applications Vol. 4 No.7 A2（2013）（両方とも参考とし
て全内容を本明細書に組み入れる）にある。オスミウム錯体を含むポリマーの例には、ポ
リ（1-ビニルイミダゾール）で錯体化されたオスミウムビス（2,2'-ビピリジン）クロラ
イド、ポリ（4-ビニルピリジン）錯体化オスミウムビス（2,2'-ビピリジン）クロライド
、ポリ（1-ビニルイミダゾール）n－[オスミウム（4,4'-ジメチル-2,2'-ビピリジル）2Cl
2]2+/+およびそれらの誘導体が挙げられる。
【0075】
溶液をカーボンセンサ上に堆積して、レドックスポリマーワイヤードGDHを含む作用電
極として機能する活性電極領域を形成することができる。膜ポリマーおよび架橋剤溶液の
混合物を添加して、センサー上に膜を形成することができる。膜は、ポリ（1-ビニルイミ
ダゾール）、ポリ（4-ビニルピリジン）、それらの誘導体または組み合わせなどのポリマ
ーを含みうる。上記のオスミウム錯体を含有するポリマーは、かかる膜ポリマーと組み合
わせて用いて、ヒドロゲルフィルムを形成しうる。
極として機能する活性電極領域を形成することができる。膜ポリマーおよび架橋剤溶液の
混合物を添加して、センサー上に膜を形成することができる。膜は、ポリ（1-ビニルイミ
ダゾール）、ポリ（4-ビニルピリジン）、それらの誘導体または組み合わせなどのポリマ
ーを含みうる。上記のオスミウム錯体を含有するポリマーは、かかる膜ポリマーと組み合
わせて用いて、ヒドロゲルフィルムを形成しうる。
【0076】
一実施形態では、グルコースセンサーは印刷電極を含みうる。この場合、絶縁基板上に
電極を形成しうる。具体的には、電極は、フォトリソグラフィ又はスクリーン印刷、グラ
ビア印刷またはフレキソ印刷などの印刷技術によって基板上に形成しうる。絶縁基板を構
成する材料としては、例えば、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、ポリエステル等が挙げられる。様々な溶媒または化学物質に対
して高い耐性を示す材料を使用しうる。
電極を形成しうる。具体的には、電極は、フォトリソグラフィ又はスクリーン印刷、グラ
ビア印刷またはフレキソ印刷などの印刷技術によって基板上に形成しうる。絶縁基板を構
成する材料としては、例えば、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、ポリエステル等が挙げられる。様々な溶媒または化学物質に対
して高い耐性を示す材料を使用しうる。
【0077】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入
れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジ
ンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極としてFAD-GDHを固定化した電
極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用い
る。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試
料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作成したキャリブレ
ーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジ
ンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極としてFAD-GDHを固定化した電
極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用い
る。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試
料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作成したキャリブレ
ーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【0078】
具体的な一例としては、グラッシーカーボン(GC)電極に1.5UのFAD-GDHを固定化し、グ
ルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、50mM リン酸カリウム緩衝
液(pH6.0)1.8ml、及び、1M ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム（フェリシアン化カリウム）
水溶液0.2mlを添加する。GC電極をポテンショスタットBAS100B/W(BAS製）に接続し、37℃
で溶液を撹拌し、銀塩化銀（飽和KCl）参照電極に対して+500mVを印加する。これらの系
に1M D-グルコース溶液を終濃度が1、2、3、4、5、10、20、30、40、50mMになるよう添加
し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（1、2
、3、4、5、10、20、30、40、50mM）に対してプロットし、検量線が作成する。これよりF
AD結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能とな
る。
ルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、50mM リン酸カリウム緩衝
液(pH6.0)1.8ml、及び、1M ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム（フェリシアン化カリウム）
水溶液0.2mlを添加する。GC電極をポテンショスタットBAS100B/W(BAS製）に接続し、37℃
で溶液を撹拌し、銀塩化銀（飽和KCl）参照電極に対して+500mVを印加する。これらの系
に1M D-グルコース溶液を終濃度が1、2、3、4、5、10、20、30、40、50mMになるよう添加
し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（1、2
、3、4、5、10、20、30、40、50mM）に対してプロットし、検量線が作成する。これよりF
AD結合型グルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能とな
る。
【0079】
ある実施形態において、本発明は、上記のFAD-GDHを含むグルコースセンサーを有する
持続血糖測定デバイス（装置）を提供する。持続血糖測定デバイスは、２４時間～２週間
の血糖値の変動を把握することが可能となるCGM(continuous glucose monitoring)デバイ
スやFGM(Flash glucose monitoring)デバイスを含みうる。またある実施形態において、
本発明は、本発明のFAD-GDHを用いる持続血糖測定方法を提供する。
持続血糖測定デバイス（装置）を提供する。持続血糖測定デバイスは、２４時間～２週間
の血糖値の変動を把握することが可能となるCGM(continuous glucose monitoring)デバイ
スやFGM(Flash glucose monitoring)デバイスを含みうる。またある実施形態において、
本発明は、本発明のFAD-GDHを用いる持続血糖測定方法を提供する。
【0080】
ある実施形態において、持続血糖測定（CGM）は、再キャリブレーション有りで又は無
しで行うことができる。ある実施形態において再キャリブレーション頻度を従来法よりも
低く設定することができ、例えば再キャリブレーションを2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13又は14日毎に行うことができる。
しで行うことができる。ある実施形態において再キャリブレーション頻度を従来法よりも
低く設定することができ、例えば再キャリブレーションを2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13又は14日毎に行うことができる。
【0081】
ある実施形態において、本発明のCGMデバイスは、皮膚の下に配置するためのグルコー
スセンサーを有しうる。センサーは一定期間、例えば1日～３週間、装着されうる。セン
サーは使い捨て型であってもよく、再利用可能であってもよい。センサーは、組織と酵素
の直接接触を防ぐためのセンサーメンブレン層を有し得る。センサーは、アプリケーター
を用いて腹部に挿入するよう設計しうる。ある実施形態において、本発明は発信機及びセ
ンサーから発信機への連結部をさらに有するCGMデバイスを提供する。発信機はインプラ
ントせずともよい。好ましくは発信機は、電波受信機と通信可能である。CGMデバイスは
さらに、グルコースレベルを連続的に表示する電気的受信機を有し得る。CGMデバイスは
場合により、キャリブレーション用のフィンガースティック（指先穿刺部材）を有し得る
。CGMデバイスは使用説明書を有し得る。
スセンサーを有しうる。センサーは一定期間、例えば1日～３週間、装着されうる。セン
サーは使い捨て型であってもよく、再利用可能であってもよい。センサーは、組織と酵素
の直接接触を防ぐためのセンサーメンブレン層を有し得る。センサーは、アプリケーター
を用いて腹部に挿入するよう設計しうる。ある実施形態において、本発明は発信機及びセ
ンサーから発信機への連結部をさらに有するCGMデバイスを提供する。発信機はインプラ
ントせずともよい。好ましくは発信機は、電波受信機と通信可能である。CGMデバイスは
さらに、グルコースレベルを連続的に表示する電気的受信機を有し得る。CGMデバイスは
場合により、キャリブレーション用のフィンガースティック（指先穿刺部材）を有し得る
。CGMデバイスは使用説明書を有し得る。
【0082】
GODの酵素活性は公知の方法により測定しうる。例えばGODの酵素活性は、GDH活性を測
定する方法、例えば電子を受容するメディエーターが過剰に存在する条件下で測定しうる
。或いはGODの酵素活性は、酸素をアクセプターとするアッセイ系により測定しうる。ま
た、GODの酵素活性は、供給者の使用説明書に従い決定しうる。残存活性比を算出するた
めに、初期活性及び残存活性は同じ系で測定する。
定する方法、例えば電子を受容するメディエーターが過剰に存在する条件下で測定しうる
。或いはGODの酵素活性は、酸素をアクセプターとするアッセイ系により測定しうる。ま
た、GODの酵素活性は、供給者の使用説明書に従い決定しうる。残存活性比を算出するた
めに、初期活性及び残存活性は同じ系で測定する。
【0083】
ある実施形態において、FAD-GDHは、糖鎖富化されたものであり得る。例えば、FAD-GDH
を産生する発現宿主の種類や培養条件を最適化して、糖鎖富化されたFAD-GDHを取得し得
る。富化された糖鎖量は、例えばSDS-PAGEで解析することができる。配列番号１２のFAD-
GDHについて、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１１を用いて算出する場合、配列番号
１で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨの分子量は７０ｋＤａである。
ある実施形態において糖鎖が富化されたFAD-GDHは、アミノ酸配列から推定される分子量
と比較して、SDS-PAGEにおいて分子量が10kDa、20kDa、又は30ｋDa以上増大しうる。ある
実施形態において糖鎖が富化されたFAD-GDHは、アミノ酸配列から推定される分子量と比
較して、SDS-PAGEにおいて分子量が10%以上、20%以上、30%以上増大しうる。糖鎖富化さ
れたFAD-GDHは、糖鎖富化されていない通常のFAD-GDHと比較して、安定性が増大しうる。
これは酵素安定性が要求される用途において有用となりうる。
を産生する発現宿主の種類や培養条件を最適化して、糖鎖富化されたFAD-GDHを取得し得
る。富化された糖鎖量は、例えばSDS-PAGEで解析することができる。配列番号１２のFAD-
GDHについて、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１１を用いて算出する場合、配列番号
１で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨの分子量は７０ｋＤａである。
ある実施形態において糖鎖が富化されたFAD-GDHは、アミノ酸配列から推定される分子量
と比較して、SDS-PAGEにおいて分子量が10kDa、20kDa、又は30ｋDa以上増大しうる。ある
実施形態において糖鎖が富化されたFAD-GDHは、アミノ酸配列から推定される分子量と比
較して、SDS-PAGEにおいて分子量が10%以上、20%以上、30%以上増大しうる。糖鎖富化さ
れたFAD-GDHは、糖鎖富化されていない通常のFAD-GDHと比較して、安定性が増大しうる。
これは酵素安定性が要求される用途において有用となりうる。
【0084】
ある実施形態において、FAD-GDHは、脱糖鎖処理されたものであり得る。例えば、糖鎖
を切断する酵素をFAD-GDHに作用させて、脱糖鎖処理を行うことができる。糖鎖切断酵素
としては、例えばN-グリカナーゼ、エンドグリコシダーゼ等が挙げられ、EndoH(New Engl
and Biolab社製)やPNGase F(New England Biolab社製)等を利用することができるがこれ
に限らない。糖鎖切断するにあたり、脱糖鎖キット（Enzymatic Deglycosylation Kit、P
ZM製）等を用いることもできる。別の実施形態において、FAD-GDHは、糖鎖付加部位の改
変により付加糖鎖量が低減されたFAD-GDH変異体であり得る。すなわち、本発明は、糖鎖
付加部位の改変により低減された糖鎖を有するFAD-GDH変異体を提供する。N型糖鎖付加部
位は一般に、N-X-T/S（ここでXはプロリン以外の任意のアミノ酸）モチーフを有すること
が知られている。また、O型糖鎖はタンパク質分子表面に位置するセリン若しくはトレオ
ニンに結合している。よってN型糖鎖の場合には当該モチーフにおけるNをN以外のアミノ
酸に置換することで、又はT若しくはSを、T及びS以外のアミノ酸に置換することで、又は
Xをプロリンに置換することで、糖鎖が付加されないように当該モチーフを改変し得る。
糖鎖付加部位を改変された又は脱糖鎖処理されたFAD-GDHは、糖鎖付加部位を改変されて
いない若しくは脱糖鎖処理されていない通常のFAD-GDHと比較して、センサーに用いた場
合の感度向上が期待される。一般に、糖鎖修飾を受けた酵素は、脱糖鎖処理すると安定性
が低減することが知られている。ところが本発明のFAD-GDHは、驚くべきことに、脱糖鎖
処理しても安定性がさほど低下しなかった。また本発明の糖鎖付加部位の改変により付加
糖鎖量が低減されたFAD-GDH変異体は、驚くべきことに、改変前のGDHと比較して安定性が
さほど低下しなかった。これは酵素安定性の要求される用途、例えばCGM用途において有
用となりうる。また、糖鎖の多い酵素は、糖鎖修飾が不均一となる傾向がある。脱糖鎖処
理されたFAD-GDHは、脱糖鎖処理されていない通常のFAD-GDHと比較して、修飾糖鎖がより
均一であることが期待される。これは測定の再現性などにおいて有利となりうる。糖鎖付
加部位を改変され付加糖鎖量が低減された変異体についても同様である。
を切断する酵素をFAD-GDHに作用させて、脱糖鎖処理を行うことができる。糖鎖切断酵素
としては、例えばN-グリカナーゼ、エンドグリコシダーゼ等が挙げられ、EndoH(New Engl
and Biolab社製)やPNGase F(New England Biolab社製)等を利用することができるがこれ
に限らない。糖鎖切断するにあたり、脱糖鎖キット（Enzymatic Deglycosylation Kit、P
ZM製）等を用いることもできる。別の実施形態において、FAD-GDHは、糖鎖付加部位の改
変により付加糖鎖量が低減されたFAD-GDH変異体であり得る。すなわち、本発明は、糖鎖
付加部位の改変により低減された糖鎖を有するFAD-GDH変異体を提供する。N型糖鎖付加部
位は一般に、N-X-T/S（ここでXはプロリン以外の任意のアミノ酸）モチーフを有すること
が知られている。また、O型糖鎖はタンパク質分子表面に位置するセリン若しくはトレオ
ニンに結合している。よってN型糖鎖の場合には当該モチーフにおけるNをN以外のアミノ
酸に置換することで、又はT若しくはSを、T及びS以外のアミノ酸に置換することで、又は
Xをプロリンに置換することで、糖鎖が付加されないように当該モチーフを改変し得る。
糖鎖付加部位を改変された又は脱糖鎖処理されたFAD-GDHは、糖鎖付加部位を改変されて
いない若しくは脱糖鎖処理されていない通常のFAD-GDHと比較して、センサーに用いた場
合の感度向上が期待される。一般に、糖鎖修飾を受けた酵素は、脱糖鎖処理すると安定性
が低減することが知られている。ところが本発明のFAD-GDHは、驚くべきことに、脱糖鎖
処理しても安定性がさほど低下しなかった。また本発明の糖鎖付加部位の改変により付加
糖鎖量が低減されたFAD-GDH変異体は、驚くべきことに、改変前のGDHと比較して安定性が
さほど低下しなかった。これは酵素安定性の要求される用途、例えばCGM用途において有
用となりうる。また、糖鎖の多い酵素は、糖鎖修飾が不均一となる傾向がある。脱糖鎖処
理されたFAD-GDHは、脱糖鎖処理されていない通常のFAD-GDHと比較して、修飾糖鎖がより
均一であることが期待される。これは測定の再現性などにおいて有利となりうる。糖鎖付
加部位を改変され付加糖鎖量が低減された変異体についても同様である。
【0085】
糖鎖付加部位の改変としては、配列番号１の25位、101位、143位、156位、172位、198
位、205位、214位、256位、247位、268位、353位、365位、379位、401位、402位、417位
、430位、459位、496位、及び550位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1
以上の位置におけるアスパラギン以外のアミノ酸への置換、
配列番号１の27位、103位、145位、158位、174位、200位、207位、216位、249位、258位
、270位、355位、367位、381位、403位、404位、419位、432位、461位、498位、及び552
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及び
トレオニン以外のアミノ酸への置換、並びに
配列番号１の26位、102位、144位、157位、173位、199位、206位、215位、257位、248位
、269位、354位、366位、380位、402位、403位、418位、431位、460位、497位及び551位
にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへ
の置換が挙げられる。本発明の糖鎖付加部位を改変された変異体は、このようなアミノ酸
置換を１以上、例えば１～６３、１～６０、１～５０、１～４０、１～３４、２～２５、
３～２０、例えば４～１４有し得る。
位、205位、214位、256位、247位、268位、353位、365位、379位、401位、402位、417位
、430位、459位、496位、及び550位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1
以上の位置におけるアスパラギン以外のアミノ酸への置換、
配列番号１の27位、103位、145位、158位、174位、200位、207位、216位、249位、258位
、270位、355位、367位、381位、403位、404位、419位、432位、461位、498位、及び552
位にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及び
トレオニン以外のアミノ酸への置換、並びに
配列番号１の26位、102位、144位、157位、173位、199位、206位、215位、257位、248位
、269位、354位、366位、380位、402位、403位、418位、431位、460位、497位及び551位
にそれぞれ対応する位置からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへ
の置換が挙げられる。本発明の糖鎖付加部位を改変された変異体は、このようなアミノ酸
置換を１以上、例えば１～６３、１～６０、１～５０、１～４０、１～３４、２～２５、
３～２０、例えば４～１４有し得る。
【0086】
他の由来のGDHについても、配列番号１の所定の位置に対応する当該他の由来のGDH中の
位置にアミノ酸置換を行うことができる。以下に、対応する位置を示す。
位置にアミノ酸置換を行うことができる。以下に、対応する位置を示す。
【0087】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0088】
例えば表中、配列番号１の１０１位に対応する位置及びアミノ酸は、Mucor circinello
ides由来のMcGDH（配列番号９）では、１０２位のアスパラギンである。他の位置につい
ても同様に表から読み取ることができる。なお、２５位については、図１－１において、
MpGDH（配列番号１）の２５位と２６位の間にギャップが挿入され、MrdGDH、MsGDH、McGD
Hと対応する位置が見かけ上一致していない。しかしながらMpGDH（配列番号１）に関し、
ギャップを２４位と２５位の間に挿入すれば、それらの位置は対応することとなる。さら
に、MrdGDH、MsGDH、McGDHは、N-X-T/Sモチーフを有しており、このモチーフは糖鎖が付
加されうると考えられる。よって便宜上、上記の表に示した２５位に関連する位置も本明
細書では「対応する位置」に含めるものとする。
ides由来のMcGDH（配列番号９）では、１０２位のアスパラギンである。他の位置につい
ても同様に表から読み取ることができる。なお、２５位については、図１－１において、
MpGDH（配列番号１）の２５位と２６位の間にギャップが挿入され、MrdGDH、MsGDH、McGD
Hと対応する位置が見かけ上一致していない。しかしながらMpGDH（配列番号１）に関し、
ギャップを２４位と２５位の間に挿入すれば、それらの位置は対応することとなる。さら
に、MrdGDH、MsGDH、McGDHは、N-X-T/Sモチーフを有しており、このモチーフは糖鎖が付
加されうると考えられる。よって便宜上、上記の表に示した２５位に関連する位置も本明
細書では「対応する位置」に含めるものとする。
【0089】
ある実施形態において、本発明のFAD-GDH変異体は上記のアミノ酸置換を複数、例えば
２～３４有する多重変異体であり得る。本明細書において多重変異体を「／」記号を用い
て示すことがある。例えばある実施形態において本発明のFAD-GDH変異体は配列番号１の
１０３位に対応する位置にアミノ酸置換を有し、配列番号１の３６５位に対応する位置に
アミノ酸置換を有する二重変異体であり得る。この二重変異体を本明細書において「Ｓ１
０３／Ｎ３６５」又は「１０３／３６５」変異体と記載することがあるが、これらは同義
である。例えばある実施形態において本発明のFAD-GDH変異体は配列番号１の１０３位に
対応する位置にグルタミンへのアミノ酸置換（１０３Ｑ）を有し、配列番号１の３６５位
に対応する位置にアスパラギン酸へのアミノ酸置換（３６５Ｄ）を有する二重変異体であ
り得る。この二重変異体を本明細書において「Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３６５Ｄ」又は「１０３Ｑ
／３６５Ｄ」と記載することがあるが、これらは同義である。
２～３４有する多重変異体であり得る。本明細書において多重変異体を「／」記号を用い
て示すことがある。例えばある実施形態において本発明のFAD-GDH変異体は配列番号１の
１０３位に対応する位置にアミノ酸置換を有し、配列番号１の３６５位に対応する位置に
アミノ酸置換を有する二重変異体であり得る。この二重変異体を本明細書において「Ｓ１
０３／Ｎ３６５」又は「１０３／３６５」変異体と記載することがあるが、これらは同義
である。例えばある実施形態において本発明のFAD-GDH変異体は配列番号１の１０３位に
対応する位置にグルタミンへのアミノ酸置換（１０３Ｑ）を有し、配列番号１の３６５位
に対応する位置にアスパラギン酸へのアミノ酸置換（３６５Ｄ）を有する二重変異体であ
り得る。この二重変異体を本明細書において「Ｓ１０３Ｑ／Ｎ３６５Ｄ」又は「１０３Ｑ
／３６５Ｄ」と記載することがあるが、これらは同義である。
【0090】
以下、同様の標記方法により本発明が包含するGDH多重変異体の一部を例示する。表で
は位置は便宜上配列番号１の位置を示しているが、変異体における位置は配列番号１の所
定の位置に対応する（当該変異体中の）位置である。
は位置は便宜上配列番号１の位置を示しているが、変異体における位置は配列番号１の所
定の位置に対応する（当該変異体中の）位置である。
【0091】
なお、糖鎖付加部位はN-X-T/Sモチーフであることから、モチーフ中のNをNではないア
ミノ酸に置換することで、又は、モチーフ中のT/SをT/S以外のアミノ酸に置換することで
、又はモチーフ中のXをPに置換することで、酵素に付加される糖鎖を低減することができ
る。本願明細書では便宜上、３アミノ酸モチーフの最初と最後のアミノ酸対を「<A:B>」
と表記する。この表記において、「:」の左の位置Aが、N-X-T/Sモチーフ中のNに相当する
位置を示し、「:」の右の位置Bが、N-X-T/Sモチーフ中のT/Sに相当する位置を示す。また
、下記表において「<A:B>」と表記する場合、「:」の左の位置AはNではない任意のアミノ
酸へ置換され、「:」の右の位置Bは、TでもSでもない任意のアミノ酸へ置換されることを
意味するものとする。また、モチーフ中の位置Aのみ置換しBは置換しない場合は「<A:
>」と表記する。同様にモチーフ中の位置Bのみ置換しAは置換しない場合は「< :B>」と
表記する。また、単変異「<C: >」と単変異「< :D>」とを「／」で区切って二重変異
体「<C: >/< :D>」を示すこともできる。この表記の都合上、例えば「<247: >/<
:249>」と「<247:249>」とは同義となる。
ミノ酸に置換することで、又は、モチーフ中のT/SをT/S以外のアミノ酸に置換することで
、又はモチーフ中のXをPに置換することで、酵素に付加される糖鎖を低減することができ
る。本願明細書では便宜上、３アミノ酸モチーフの最初と最後のアミノ酸対を「<A:B>」
と表記する。この表記において、「:」の左の位置Aが、N-X-T/Sモチーフ中のNに相当する
位置を示し、「:」の右の位置Bが、N-X-T/Sモチーフ中のT/Sに相当する位置を示す。また
、下記表において「<A:B>」と表記する場合、「:」の左の位置AはNではない任意のアミノ
酸へ置換され、「:」の右の位置Bは、TでもSでもない任意のアミノ酸へ置換されることを
意味するものとする。また、モチーフ中の位置Aのみ置換しBは置換しない場合は「<A:
>」と表記する。同様にモチーフ中の位置Bのみ置換しAは置換しない場合は「< :B>」と
表記する。また、単変異「<C: >」と単変異「< :D>」とを「／」で区切って二重変異
体「<C: >/< :D>」を示すこともできる。この表記の都合上、例えば「<247: >/<
:249>」と「<247:249>」とは同義となる。
【0092】
【表2-1】
【0093】
【表2-2】
【0094】
【表2-3】
【0095】
【表2-4】
【0096】
上記の各「<A:B>」に関し、最初のアミノ酸Aと最後のアミノ酸Bとの間のアミノ酸（モ
チーフN-X-T/S中のX）をプロリンに置換してもよい。プロリンに置換しうる対応する位置
は、図１及び表１から特定することができる。
チーフN-X-T/S中のX）をプロリンに置換してもよい。プロリンに置換しうる対応する位置
は、図１及び表１から特定することができる。
【0097】
本発明の変異体は表２－１に記載の位置に変異を有する単変異体であり得る。
本発明の変異体は表２－２に記載の位置に変異を有する二重変異体であり得る。
本発明の変異体は表２－３に記載の位置に変異を有する三重変異体であり得る。
本発明の変異体は表２－４に記載の位置に変異を有する四重変異体であり得る。
本発明の変異体は、上記表に記載の変異を組み合わせた２重～３４重変異体であり得る
。これらの変異体の各位置に関し、置換アミノ酸は表１に記載のものであり得る。
本発明の変異体は表２－２に記載の位置に変異を有する二重変異体であり得る。
本発明の変異体は表２－３に記載の位置に変異を有する三重変異体であり得る。
本発明の変異体は表２－４に記載の位置に変異を有する四重変異体であり得る。
本発明の変異体は、上記表に記載の変異を組み合わせた２重～３４重変異体であり得る
。これらの変異体の各位置に関し、置換アミノ酸は表１に記載のものであり得る。
【0098】
具体的な変異体を例示すると、本発明の変異体は、S103Q、N247S、T249N、N365D、S103
Q/N247S、S103Q/T249N、S103Q/N365D、N247S/T249N、N247S/N365D、T249N/N365D、S103Q/
N247S/T249N、S103Q/N247S/N365D、S103Q/T249N/N365D、N247S/T249N/N365D、又はS103Q/
N247S/T249N/N365Dの変異を有し得る。これらの場合において、位置はいずれも配列番号
１の位置に対応する当該GDH中の位置を意味する。例えば配列番号１、３、４、５、６、
７、８、９、１２、１４、２２又はこれらと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５
％以上、９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するGDH
に、これらの変異を導入しうる。
Q/N247S、S103Q/T249N、S103Q/N365D、N247S/T249N、N247S/N365D、T249N/N365D、S103Q/
N247S/T249N、S103Q/N247S/N365D、S103Q/T249N/N365D、N247S/T249N/N365D、又はS103Q/
N247S/T249N/N365Dの変異を有し得る。これらの場合において、位置はいずれも配列番号
１の位置に対応する当該GDH中の位置を意味する。例えば配列番号１、３、４、５、６、
７、８、９、１２、１４、２２又はこれらと７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５
％以上、９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するGDH
に、これらの変異を導入しうる。
【0099】
また、上記のような多重変異体を作出するにあたっては、上述の各種の置換以外の位置
における置換を組み合わせることもできる。このような置換の位置は、単独で置換を導入
した場合には、上述の置換部位におけるもののように顕著な効果を奏さないものであって
も、上述の置換部位と組み合わせて導入することによって、相乗的に効果を奏するもので
あり得る。
における置換を組み合わせることもできる。このような置換の位置は、単独で置換を導入
した場合には、上述の置換部位におけるもののように顕著な効果を奏さないものであって
も、上述の置換部位と組み合わせて導入することによって、相乗的に効果を奏するもので
あり得る。
【0100】
本発明のFAD-GDH変異体は、例えば、まず任意の方法で、配列番号１、３、４、１４若
しくは２２のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列をコードする遺伝子を入手し、配列番
号１の所定の位置に対応する位置におけるいずれかの位置にアミノ酸置換を導入すること
により得ることもできる。
しくは２２のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列をコードする遺伝子を入手し、配列番
号１の所定の位置に対応する位置におけるいずれかの位置にアミノ酸置換を導入すること
により得ることもできる。
【0101】
本明細書にいう、「配列番号１のアミノ酸配列に対応する位置」とは、配列番号１のア
ミノ酸配列と、他のアミノ酸配列とをアラインさせた場合に、そのアラインメントにおけ
る同一の位置を意味する。他のアミノ酸配列としては、配列番号１、３、４、１４若しく
は２２と高いアミノ酸配列同一性（例えば７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％
以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８
０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５%以上、８６％以上
、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％
以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以
上）を有するアミノ酸配列が挙げられる。なお、アミノ酸配列の同一性は、GENETYX Ver.
11（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、
又はDNASIS Pro（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等
のプログラムにより計算することができる。
ミノ酸配列と、他のアミノ酸配列とをアラインさせた場合に、そのアラインメントにおけ
る同一の位置を意味する。他のアミノ酸配列としては、配列番号１、３、４、１４若しく
は２２と高いアミノ酸配列同一性（例えば７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％
以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８
０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５%以上、８６％以上
、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％
以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以
上）を有するアミノ酸配列が挙げられる。なお、アミノ酸配列の同一性は、GENETYX Ver.
11（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、
又はDNASIS Pro（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等
のプログラムにより計算することができる。
【0102】
上記の「配列番号１のアミノ酸配列に対応する位置」を特定する方法としては、例えば
、リップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、FAD-
GDHのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行
うことができる。FAD-GDHのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、ア
ミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、対応するアミノ酸残基の各FAD-GDH配列に
おける配列中の位置を決めることが可能である。特にアミノ酸配列同一性が７０％以上の
アミノ酸配列を比較する場合に決めることが可能である。対応する位置は、三次元構造中
で同位置に存在すると考えられ、対象となるFAD-GDHの保存安定性に関して類似した効果
を有することが合理的に推定できる。なお、GDHによっては、アライメントの結果、特定
のドメインやループが欠失している等により配列番号１の所定の位置に対応する位置が存
在しない場合もあり得るが、そのような場合には当該対応する位置の存在ない位置はアミ
ノ酸置換するに及ばず、対応する位置を決定できる他の位置にアミノ酸置換を導入すれば
よい。
、リップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、FAD-
GDHのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行
うことができる。FAD-GDHのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、ア
ミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、対応するアミノ酸残基の各FAD-GDH配列に
おける配列中の位置を決めることが可能である。特にアミノ酸配列同一性が７０％以上の
アミノ酸配列を比較する場合に決めることが可能である。対応する位置は、三次元構造中
で同位置に存在すると考えられ、対象となるFAD-GDHの保存安定性に関して類似した効果
を有することが合理的に推定できる。なお、GDHによっては、アライメントの結果、特定
のドメインやループが欠失している等により配列番号１の所定の位置に対応する位置が存
在しない場合もあり得るが、そのような場合には当該対応する位置の存在ない位置はアミ
ノ酸置換するに及ばず、対応する位置を決定できる他の位置にアミノ酸置換を導入すれば
よい。
【0103】
（相同性領域について）
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、GENETYX Ver.11（ゼネティックス社製）のマキシ
マムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはDNASIS Pro（日立ソリューショ
ンズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算
することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のGDHをアライメント
したときに、該２以上のGDHにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。
こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、GENETYX Ver.11（ゼネティックス社製）のマキシ
マムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはDNASIS Pro（日立ソリューショ
ンズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算
することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のGDHをアライメント
したときに、該２以上のGDHにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。
こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
【0104】
また、２以上のGDHにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばC
LUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴ
リズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判
断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸
置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメント
により、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸
によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の
相同性領域（保存領域）を決定できる。
LUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴ
リズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判
断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸
置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメント
により、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸
によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の
相同性領域（保存領域）を決定できる。
【0105】
本明細書において「相同性領域」とは、２以上のGDHをアライメントしたときに、ある
基準となるGDHと比較対象のGDHの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似
アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８
以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ
酸配列の配列同一性が７０％以上であるGDHをアライメントした。このうち、配列番号１
で示されるMucor属GDHを基準として第３１位～４１位は同一アミノ酸からなり、よって相
同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるＭｕｃｏｒ属GDHを基準として、３
１位～４１位、５８～６２位、７１～８５位、１０６～１１６位、１１９～１２７位、１
３２～１３４位、１３６～１４４位、１５０～１５３位、１６７～１７１位、２１９～２
２５位、２５３～２６２位、２７７～２８１位、３０１～３０３位、３０５～３１２位、
３１４～３１９位、３２４～３２６位、３３２～３３７位、３３９～３４６位、３４８～
３５４位、３８６～３９４位、４１５～４１７位、４５４～４５９位、４７６～４８４位
、４８６～４９１位、５０８～５１１位、５１８～５２０位、５２２～５２４位、５２６
～５２８位、５６４～５７９位、５８４～５８６位、５９２～５９５位、５９７～５９９
位、６０７～６１７位、及び６２５～６３０位は相同性領域に該当しうる。
基準となるGDHと比較対象のGDHの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似
アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８
以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ
酸配列の配列同一性が７０％以上であるGDHをアライメントした。このうち、配列番号１
で示されるMucor属GDHを基準として第３１位～４１位は同一アミノ酸からなり、よって相
同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるＭｕｃｏｒ属GDHを基準として、３
１位～４１位、５８～６２位、７１～８５位、１０６～１１６位、１１９～１２７位、１
３２～１３４位、１３６～１４４位、１５０～１５３位、１６７～１７１位、２１９～２
２５位、２５３～２６２位、２７７～２８１位、３０１～３０３位、３０５～３１２位、
３１４～３１９位、３２４～３２６位、３３２～３３７位、３３９～３４６位、３４８～
３５４位、３８６～３９４位、４１５～４１７位、４５４～４５９位、４７６～４８４位
、４８６～４９１位、５０８～５１１位、５１８～５２０位、５２２～５２４位、５２６
～５２８位、５６４～５７９位、５８４～５８６位、５９２～５９５位、５９７～５９９
位、６０７～６１７位、及び６２５～６３０位は相同性領域に該当しうる。
【0106】
本発明のGDHは、配列番号１、３、４、１４若しくは２２に示されるアミノ酸配列を有
するGDHとアライメントしたときに５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、
７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、
８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、
９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、例えば９９％以上の全長ア
ミノ酸配列同一性を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。さらに、本発明の
GDH変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１、３、若しくは４における
相同性領域のアミノ酸配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％
、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、例えば９９％以上の配列同一性を有する。糖鎖付加部位に変異を有す
る本発明のGDH変異体についても同様である。
するGDHとアライメントしたときに５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、
７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、
８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、
９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、例えば９９％以上の全長ア
ミノ酸配列同一性を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。さらに、本発明の
GDH変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１、３、若しくは４における
相同性領域のアミノ酸配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％
、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％
、９７％、９８％、例えば９９％以上の配列同一性を有する。糖鎖付加部位に変異を有す
る本発明のGDH変異体についても同様である。
【0107】
ある実施形態において、本発明に係るFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼは、持続
血糖測定用若しくは連続グルコースモニタリング用である。別の実施形態において、本発
明に係るFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼは、グルコース測定用である。測定は定
性的又は定量的であり得る。ある実施形態において、本発明に係るFAD依存性グルコース
デヒドロゲナーゼは、高感度のグルコース測定に用いることができる。これらの方法に用
いるキットやデバイス、センサー、組成物も提供される。
血糖測定用若しくは連続グルコースモニタリング用である。別の実施形態において、本発
明に係るFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼは、グルコース測定用である。測定は定
性的又は定量的であり得る。ある実施形態において、本発明に係るFAD依存性グルコース
デヒドロゲナーゼは、高感度のグルコース測定に用いることができる。これらの方法に用
いるキットやデバイス、センサー、組成物も提供される。
【0108】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲
は、それらの例により何ら限定されるものではない。
は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例0109】
１．Mucor RD056860由来GDH遺伝子及びMucor hiemalis由来GDH遺伝子の調製
特許文献６の開示を参考に、配列番号４のアミノ酸配列を有するMrdGDHをコードする塩
基配列を全合成した（配列番号１０）。また特許文献４の開示を参考に、配列番号３のア
ミノ酸配列を有するMhGDHをコードする塩基配列を全合成した（配列番号１１）。
特許文献６の開示を参考に、配列番号４のアミノ酸配列を有するMrdGDHをコードする塩
基配列を全合成した（配列番号１０）。また特許文献４の開示を参考に、配列番号３のア
ミノ酸配列を有するMhGDHをコードする塩基配列を全合成した（配列番号１１）。
【0110】
次いで、これらの遺伝子を酵母発現プラスミドpYES2/CTに組み入れた（それぞれpYES2/
CT-MrdGDH及びpYES2/CT-MhGDH）。得られた組換え体プラスミドについて、マルチキャピ
ラリーDNA解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ(Thermo Fi
sher Scientific社製）により塩基配列を確認した。
CT-MrdGDH及びpYES2/CT-MhGDH）。得られた組換え体プラスミドについて、マルチキャピ
ラリーDNA解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ(Thermo Fi
sher Scientific社製）により塩基配列を確認した。
【0111】
２．Mucor RD056860由来GDHをコードする遺伝子が挿入されたプラスミド又はMucor hiema
lis由来GDHをコードする遺伝子が挿入されたプラスミドの宿主への導入とGDH活性の確認
その後、S.cerevisiae用形質転換キット（Invitrogen社製）により、pYES2/CT-MrdGDH
又はpYES2/CT-MhGDHを用いてINVSc1株（Invitrogen社製）を形質転換することにより、GD
Hを発現する酵母形質転換体Sc-MrdGDH及びSc-MhGDH株を取得した。
lis由来GDHをコードする遺伝子が挿入されたプラスミドの宿主への導入とGDH活性の確認
その後、S.cerevisiae用形質転換キット（Invitrogen社製）により、pYES2/CT-MrdGDH
又はpYES2/CT-MhGDHを用いてINVSc1株（Invitrogen社製）を形質転換することにより、GD
Hを発現する酵母形質転換体Sc-MrdGDH及びSc-MhGDH株を取得した。
【0112】
３．Mucor属由来GDH遺伝子の宿主への導入とGDH活性の確認
大まかに説明すると、まずMucor属由来GDH（MpGDH、配列番号１）にN66Y/N68G/C88A/Q2
33R/T387C/E554D/L557V/S559Kの各変異を導入した改変GDH(MpGDH-M1)をコードする遺伝子
を取得した。MpGDH-M1のアミノ酸配列は配列番号１２に示し、その遺伝子の塩基配列は配
列番号１３に示す。プラスミド酵母発現プラスミドpYES2/CTのマルチクローニングサイト
に対象遺伝子であるMpGDH-M1遺伝子を常法により挿入させたDNAコンストラクトを作製し
た。pYES2/CTのマルチクローニングサイトにあるIn-Fusion Cloning Siteにて、MpGDH-M1
遺伝子を、上記したIn-Fusion HD Cloning Kitを使用して、キットに添付されたプロトコ
ールに従って連結して、コンストラクト用プラスミド(pYES2/CT-MpGDH-M1)を得た。
大まかに説明すると、まずMucor属由来GDH（MpGDH、配列番号１）にN66Y/N68G/C88A/Q2
33R/T387C/E554D/L557V/S559Kの各変異を導入した改変GDH(MpGDH-M1)をコードする遺伝子
を取得した。MpGDH-M1のアミノ酸配列は配列番号１２に示し、その遺伝子の塩基配列は配
列番号１３に示す。プラスミド酵母発現プラスミドpYES2/CTのマルチクローニングサイト
に対象遺伝子であるMpGDH-M1遺伝子を常法により挿入させたDNAコンストラクトを作製し
た。pYES2/CTのマルチクローニングサイトにあるIn-Fusion Cloning Siteにて、MpGDH-M1
遺伝子を、上記したIn-Fusion HD Cloning Kitを使用して、キットに添付されたプロトコ
ールに従って連結して、コンストラクト用プラスミド(pYES2/CT-MpGDH-M1)を得た。
【0113】
得られた組換え体プラスミドpYES2/CT-MpGDH-M1を鋳型として、配列番号１６－２１の
合成オリゴヌクレオチド、KOD-Plus-（東洋紡社製）を用い、以下の条件でPCR反応を行っ
た。
合成オリゴヌクレオチド、KOD-Plus-（東洋紡社製）を用い、以下の条件でPCR反応を行っ
た。
【0114】
すなわち、10×KOD-Plus-緩衝液を5μl、dNTPが各2mMになるよう調製されたdNTPs混合
溶液を5μl、25mMのMgSO4溶液を2μl、鋳型となるMpGDH-M1遺伝子を連結させたDNAコンス
トラクトを50ng、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ15pmol、KOD-Plus-を1Unit加え
て、滅菌水により全量を50μlとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペン
ドルフ社製）を用いて、94℃で2分間インキュベートし、続いて、「94℃、15秒」－「50
℃、30秒」－「68℃、8分」のサイクルを30回繰り返した。
溶液を5μl、25mMのMgSO4溶液を2μl、鋳型となるMpGDH-M1遺伝子を連結させたDNAコンス
トラクトを50ng、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ15pmol、KOD-Plus-を1Unit加え
て、滅菌水により全量を50μlとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペン
ドルフ社製）を用いて、94℃で2分間インキュベートし、続いて、「94℃、15秒」－「50
℃、30秒」－「68℃、8分」のサイクルを30回繰り返した。
【0115】
反応液の一部を1.0%アガロースゲルで電気泳動し、約8,000bpのDNAが特異的に増幅され
ていることを確認した。こうして得られたDNAを制限酵素DpnI(NEW ENGLAND BIOLABS社製
）で処理し、残存している鋳型DNAを切断した後、大腸菌JM109を形質転換し、LB-amp寒天
培地に展開した。生育したコロニーをLB-amp培地[1%(W/V) バクトトリプトン、0.5%(W/V)
ペプトン、0.5%(W/V) NaCl、50μg/ml Ampicillin]2.5mlに接種して、37℃で20時間振と
う培養し、培養物を得た。この培養物を7,000rpmで、5分間遠心分離することにより集菌
して菌体を得た。次いで、この菌体よりQIAGEN tip-100(キアゲン社製）を用いて組換え
体プラスミドを抽出して精製し、DNA2.5μgを得た。該プラスミド中のMpGDH-M1をコード
するDNAの塩基配列を、マルチキャピラリーDNA解析システムApplied Biosystems 3130xl
ジェネティックアナライザ(Life Technologies社製）を用いて決定し、その結果、配列番
号１記載のアミノ酸配列の１７５位のアラニンをシステインに、２１４位のアスパラギン
をシステインに、及び４６６位のグリシンをアスパラギン酸に置換した変異体であるMpGD
H-M1/A175C/N214C/G466D（配列番号１４）をコードするDNAコンストラクトを得た(pYES2/
CT-M2)（配列番号１５）。その後、S.cerevisiae用形質転換キット（Invitrogen社製）に
より、pYES2/CT-M2を用いてINVSc1株（Invitrogen社製）を形質転換することにより、GDH
を発現する酵母形質転換体Sc-M2株を取得した。
ていることを確認した。こうして得られたDNAを制限酵素DpnI(NEW ENGLAND BIOLABS社製
）で処理し、残存している鋳型DNAを切断した後、大腸菌JM109を形質転換し、LB-amp寒天
培地に展開した。生育したコロニーをLB-amp培地[1%(W/V) バクトトリプトン、0.5%(W/V)
ペプトン、0.5%(W/V) NaCl、50μg/ml Ampicillin]2.5mlに接種して、37℃で20時間振と
う培養し、培養物を得た。この培養物を7,000rpmで、5分間遠心分離することにより集菌
して菌体を得た。次いで、この菌体よりQIAGEN tip-100(キアゲン社製）を用いて組換え
体プラスミドを抽出して精製し、DNA2.5μgを得た。該プラスミド中のMpGDH-M1をコード
するDNAの塩基配列を、マルチキャピラリーDNA解析システムApplied Biosystems 3130xl
ジェネティックアナライザ(Life Technologies社製）を用いて決定し、その結果、配列番
号１記載のアミノ酸配列の１７５位のアラニンをシステインに、２１４位のアスパラギン
をシステインに、及び４６６位のグリシンをアスパラギン酸に置換した変異体であるMpGD
H-M1/A175C/N214C/G466D（配列番号１４）をコードするDNAコンストラクトを得た(pYES2/
CT-M2)（配列番号１５）。その後、S.cerevisiae用形質転換キット（Invitrogen社製）に
より、pYES2/CT-M2を用いてINVSc1株（Invitrogen社製）を形質転換することにより、GDH
を発現する酵母形質転換体Sc-M2株を取得した。
【0116】
(酵母発現FAD-GDHの保存安定性評価)
酵母形質転換体Sc-MrdGDHまたはSc-M2を、5mLの前培養用液体培地[0.67%(w/v)アミノ酸
不含有イーストニトロゲンベース(BD)、0.192%(w/v)ウラシル不含有酵母合成ドロップア
ウト培地用添加物（sigma社製）、2.0%(w/v)ラフィノース]中で、30℃にて24時間培養し
た。その後、前培養液1mLを4mLの本培養用液体培地[0.67%(w/v)アミノ酸不含有イースト
ニトロゲンベース、0.192%(w/v)ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、2
.5%(w/v)D-ガラクトース、0.75%(w/v)ラフィノース]に加えて、30℃で16時間培養する。
この培養液を遠心分離（10,000×g、4℃、3分間）により菌体と培養上清に分離し、培養
上清液を回収した。この培養上清液3mlをアミコンウルトラ 0.5mlにより50μlまで濃縮し
、１×ＰＢＳ溶液に置換した。これを試験サンプルとして用いた。
酵母形質転換体Sc-MrdGDHまたはSc-M2を、5mLの前培養用液体培地[0.67%(w/v)アミノ酸
不含有イーストニトロゲンベース(BD)、0.192%(w/v)ウラシル不含有酵母合成ドロップア
ウト培地用添加物（sigma社製）、2.0%(w/v)ラフィノース]中で、30℃にて24時間培養し
た。その後、前培養液1mLを4mLの本培養用液体培地[0.67%(w/v)アミノ酸不含有イースト
ニトロゲンベース、0.192%(w/v)ウラシル不含有酵母合成ドロップアウト培地用添加物、2
.5%(w/v)D-ガラクトース、0.75%(w/v)ラフィノース]に加えて、30℃で16時間培養する。
この培養液を遠心分離（10,000×g、4℃、3分間）により菌体と培養上清に分離し、培養
上清液を回収した。この培養上清液3mlをアミコンウルトラ 0.5mlにより50μlまで濃縮し
、１×ＰＢＳ溶液に置換した。これを試験サンプルとして用いた。
【0117】
酵母形質転換体Sc-MhGDHについても、上記と同様の手順で試験サンプルを調製すること
ができる。また、これに代えてカタログ番号GLD3 (フナコシ社)のグルコースデヒドロゲ
ナーゼを用いることもできる（なお、GLD3酵素のN末端アミノ酸配列を解析したところ、
配列番号３のMucor hiemalis由来GDHの配列と同一であったため、この酵素はMucor hiema
lis由来である蓋然性が高い）。本実施例では、フナコシ社から入手した、カタログ名GLD
3のグルコースデヒドロゲナーゼを以下の試験に用いた。なお、GLD3についてはアミコン
ウルトラ 0.5ml(30kDaカットオフ)を用いて限外ろ過を行い、さらに、ゲルろ過クロマト
グラフィーにより低分子成分を除去し、pH 7.4のPBSに置換した。
ができる。また、これに代えてカタログ番号GLD3 (フナコシ社)のグルコースデヒドロゲ
ナーゼを用いることもできる（なお、GLD3酵素のN末端アミノ酸配列を解析したところ、
配列番号３のMucor hiemalis由来GDHの配列と同一であったため、この酵素はMucor hiema
lis由来である蓋然性が高い）。本実施例では、フナコシ社から入手した、カタログ名GLD
3のグルコースデヒドロゲナーゼを以下の試験に用いた。なお、GLD3についてはアミコン
ウルトラ 0.5ml(30kDaカットオフ)を用いて限外ろ過を行い、さらに、ゲルろ過クロマト
グラフィーにより低分子成分を除去し、pH 7.4のPBSに置換した。
【0118】
４．FAD-GDHの保存安定性試験
次に、製造したFAD-GDH、及び入手したGLD3をpH 7.4のPBS溶液(2ml)中で40℃にて、所
定の期間加温した。次いで所定期間経過後の残存活性を測定した。
次に、製造したFAD-GDH、及び入手したGLD3をpH 7.4のPBS溶液(2ml)中で40℃にて、所
定の期間加温した。次いで所定期間経過後の残存活性を測定した。
【0119】
GDH活性の測定方法は、所定期間経過後、各サンプルのFAD-GDH活性を上記に記したGDH
活性の測定方法に基づいて測定し、４０℃で保存する直前の酵素活性を１００％としたと
きの、４０℃、所定期間経過後の活性値を「活性残存率（％）」として算出した。
活性の測定方法に基づいて測定し、４０℃で保存する直前の酵素活性を１００％としたと
きの、４０℃、所定期間経過後の活性値を「活性残存率（％）」として算出した。
【0120】
試験の結果、1週間後では、MrdGDHは37%、GLD3は88%の酵素活性が残存した。2週間後で
は、MrdGDHは24%、GLD3は83%の酵素活性が残存した。3週間後では、MrdGDHは22%の酵素活
性が残存した。なお、麹菌で発現させた精製GDH-MrdGDHと、酵母で発現させた透析後の粗
酵素MrdGDHとで、保存安定性が変わらなかったことを確認した。一般に酵母で発現させた
方が、糖鎖付加量が多く、本実施例においても酵母発現させたGDHの方が分子量が大きく
なっていることをSDS-PAGEで確認した。
は、MrdGDHは24%、GLD3は83%の酵素活性が残存した。3週間後では、MrdGDHは22%の酵素活
性が残存した。なお、麹菌で発現させた精製GDH-MrdGDHと、酵母で発現させた透析後の粗
酵素MrdGDHとで、保存安定性が変わらなかったことを確認した。一般に酵母で発現させた
方が、糖鎖付加量が多く、本実施例においても酵母発現させたGDHの方が分子量が大きく
なっていることをSDS-PAGEで確認した。
【0121】
これらのFAD-GDHは、長期安定性が高く、連続グルコースモニタリング用途に適してい
ることが見出された。
ることが見出された。
【0122】
（比較例）
CGMに用いられているGODなどの、公知のGODのCGM安定性を試験した。試験方法は上記実
施例と同じであり、ただしGDHの代わりに各種GODを用いた。
CGMに用いられているGODなどの、公知のGODのCGM安定性を試験した。試験方法は上記実
施例と同じであり、ただしGDHの代わりに各種GODを用いた。
【0123】
Aspergillus sp.由来GODを東洋紡社より入手した（カタログ番号GLO-201, ここではGOD
-2という)。Aspergillus niger由来GODを和光純薬工業社より入手した（カタログ番号074
-02401, ここではGOD-3という。別のAspergillus niger由来GODをSigma-Aldrich社より入
手した(カタログ番号Type VII, ここではGOD-4という)。
-2という)。Aspergillus niger由来GODを和光純薬工業社より入手した（カタログ番号074
-02401, ここではGOD-3という。別のAspergillus niger由来GODをSigma-Aldrich社より入
手した(カタログ番号Type VII, ここではGOD-4という)。
【0124】
各GOD酵素の1 mg/ml溶液をPBS溶液で置き換え、40℃にて所定期間加温した。1週間後及
び2週間後にGOD活性を測定した。残存活性は、上記実施例と同様に測定し、初期活性を１
００％としたときの残存活性率（％）を算出した。
び2週間後にGOD活性を測定した。残存活性は、上記実施例と同様に測定し、初期活性を１
００％としたときの残存活性率（％）を算出した。
【0125】
1週間後では、GOD-3は22%、GOD-4は22%、GOD-2は30%の酵素活性が残存した。２週間後
では、GOD-3は9%、GOD-4は8%、GOD-2は13%の酵素活性が残存した。
では、GOD-3は9%、GOD-4は8%、GOD-2は13%の酵素活性が残存した。
【0126】
なお、これらのGODは、55℃15分の熱処理後の残存活性%は、上記のGDHを同様に熱処理
した場合よりも高く、すなわち、より熱安定性が高かった。
した場合よりも高く、すなわち、より熱安定性が高かった。
【0127】
５．追加実施例
プラスミドpUC19のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるMpGDH-M2遺伝子を常
法により挿入させたDNAコンストラクトを作製した。pUC19のマルチクローニングサイトに
あるIn-Fusion Cloning Siteにて、MpGDH-M2遺伝子を、上記したIn-Fusion HD Cloning K
itを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プ
ラスミド(pUC19-MpGDH-M2)を得た。この遺伝子をコウジカビ（Aspergillus sojae; アス
ペルギルス・ソーヤ）で発現させ、そのGDH活性を評価した。
プラスミドpUC19のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるMpGDH-M2遺伝子を常
法により挿入させたDNAコンストラクトを作製した。pUC19のマルチクローニングサイトに
あるIn-Fusion Cloning Siteにて、MpGDH-M2遺伝子を、上記したIn-Fusion HD Cloning K
itを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プ
ラスミド(pUC19-MpGDH-M2)を得た。この遺伝子をコウジカビ（Aspergillus sojae; アス
ペルギルス・ソーヤ）で発現させ、そのGDH活性を評価した。
【0128】
Ｄｏｕｂｌｅ－ｊｏｉｎｔ ＰＣＲ（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，２００４年，第４１巻，ｐ９７３－９８１）を行い、５’アーム領域～Ｐｙ
ｒＧ遺伝子（ウラシル栄養要求性マーカー）～ＴＥＦ１プロモーター遺伝子～フラビン結
合型ＧＤＨ遺伝子～３’アーム領域から成るカセットを構築し、下記の手順でアスペルギ
ルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、
コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）の形質転換に用いた。５００ｍｌ容三角
フラスコ中の２０ｍＭウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地１００ｍｌに、
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の分生子を接種し、３０
℃で約２０時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラス
トを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇの対象遺伝子挿入ＤＮＡコンストラ
クトを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ
）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐ
Ｈ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとし
て形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
ｏｌｏｇｙ，２００４年，第４１巻，ｐ９７３－９８１）を行い、５’アーム領域～Ｐｙ
ｒＧ遺伝子（ウラシル栄養要求性マーカー）～ＴＥＦ１プロモーター遺伝子～フラビン結
合型ＧＤＨ遺伝子～３’アーム領域から成るカセットを構築し、下記の手順でアスペルギ
ルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、
コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）の形質転換に用いた。５００ｍｌ容三角
フラスコ中の２０ｍＭウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地１００ｍｌに、
アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の分生子を接種し、３０
℃で約２０時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラス
トを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇの対象遺伝子挿入ＤＮＡコンストラ
クトを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ
）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐ
Ｈ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとし
て形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
【0129】
得られた形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ウリジン要求性を相補する遺伝子である
ｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、
目的の遺伝子が導入された株として選択できた。得られた菌株の中から目的の形質転換体
を、ＰＣＲで確認して選抜した。MpGDH-M2の遺伝子により形質転換した形質転換アスペル
ギルス・ソーヤを用いて、それぞれのGDH生産を行った。
ｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、
目的の遺伝子が導入された株として選択できた。得られた菌株の中から目的の形質転換体
を、ＰＣＲで確認して選抜した。MpGDH-M2の遺伝子により形質転換した形質転換アスペル
ギルス・ソーヤを用いて、それぞれのGDH生産を行った。
【0130】
２００ｍｌ容三角フラスコ中のＤＰＹ液体培地（１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（
ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ
４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０；ｐＨ未調整）40ｍｌに、各菌株の分生
子を接種し、３０℃で４日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培
養物から菌体をろ過し、得られた培地上清画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５， ３
０Ｋ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で１０ｍLまで濃縮し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２
０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６０
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出さ
せ、GDH活性を示す画分を回収し、MpGDH-M2の精製標品を得た。
ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ
４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０；ｐＨ未調整）40ｍｌに、各菌株の分生
子を接種し、３０℃で４日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培
養物から菌体をろ過し、得られた培地上清画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５， ３
０Ｋ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で１０ｍLまで濃縮し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２
０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６０
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出さ
せ、GDH活性を示す画分を回収し、MpGDH-M2の精製標品を得た。
【0131】
また、上記４．と同様の保存安定性試験の結果、試験前の100%に対し、１週間後では配
列番号１４のFAD-GDH、すなわちM2は、89%の酵素活性が残存した。ただし、GDH濃度は終
濃度1mg/mlに調製して実施した。2週間後ではM2は75%の酵素活性が残存した。3週間後で
は74%の酵素活性が残存した。これは、酵母で発現させたM2の保存安定性とほとんど同等
であった。
列番号１４のFAD-GDH、すなわちM2は、89%の酵素活性が残存した。ただし、GDH濃度は終
濃度1mg/mlに調製して実施した。2週間後ではM2は75%の酵素活性が残存した。3週間後で
は74%の酵素活性が残存した。これは、酵母で発現させたM2の保存安定性とほとんど同等
であった。
【0132】
次に、M2に糖鎖切断酵素としてエンドグリコシダーゼH(EndoH、New England Biolab社)
を、製造業者の使用説明書に記載の条件にて試薬を混合し、30℃で24時間作用させた。そ
の後、HiLoad 26/60 superdex200(GEヘルスケア社製)によるゲルろ過クロマトグラフィー
精製を行うことで、脱糖鎖処理されたM2を精製した。EndoH処理後の酵素が脱糖鎖された
ことはSDS-PAGEにて確認した。
を、製造業者の使用説明書に記載の条件にて試薬を混合し、30℃で24時間作用させた。そ
の後、HiLoad 26/60 superdex200(GEヘルスケア社製)によるゲルろ過クロマトグラフィー
精製を行うことで、脱糖鎖処理されたM2を精製した。EndoH処理後の酵素が脱糖鎖された
ことはSDS-PAGEにて確認した。
【0133】
次いで、脱糖鎖処理されたM2（EndoH-M2）について、上記４．と同じFAD-GDHの保存安
定性試験を行った。ただし、GDH濃度は終濃度1mg/mlに調製した。その結果、試験前の100
%に対し、１週間後ではEndoH-M2は、94%の酵素活性が残存した。2週間後ではEndoH-M2は8
5%の酵素活性が残存した。3週間後では81%の酵素活性が残存した。すなわち糖鎖を有する
M2と比較して、脱糖鎖処理されたM2は、驚くべきことに、むしろ保存安定性が向上してい
た。
定性試験を行った。ただし、GDH濃度は終濃度1mg/mlに調製した。その結果、試験前の100
%に対し、１週間後ではEndoH-M2は、94%の酵素活性が残存した。2週間後ではEndoH-M2は8
5%の酵素活性が残存した。3週間後では81%の酵素活性が残存した。すなわち糖鎖を有する
M2と比較して、脱糖鎖処理されたM2は、驚くべきことに、むしろ保存安定性が向上してい
た。
【0134】
６．追加実施例
次に、ＭｐＧＤＨと９３％のアミノ酸配列同一性を有する、配列番号２２のMpGDH-M3を
用いて、同様に保存安定性が良好か検証した（以下、単にM3ということがある）。MpGDH-
M3のアミノ酸配列は配列番号２２に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号２３に示す。
上記と同様にプラスミド酵母発現プラスミドpYES2/CTのマルチクローニングサイトに対象
遺伝子であるMpGDH-M3遺伝子を常法により挿入させたDNAコンストラクトを作製した。次
いで、酵母形質転換体を作製し、MpGDH-M3を含む培養上清液を回収した。上記と同様にPB
Sに置換した試験サンプルを作製し、40℃における保存安定性を評価した。その結果、試
験前の100%に対し、１週間後ではEndoH-M2は、95%の酵素活性が残存した。なお、麹菌に
より発現させたMpGDH-M3を用いた保存安定性評価でも同様の結果が得られた。
次に、ＭｐＧＤＨと９３％のアミノ酸配列同一性を有する、配列番号２２のMpGDH-M3を
用いて、同様に保存安定性が良好か検証した（以下、単にM3ということがある）。MpGDH-
M3のアミノ酸配列は配列番号２２に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号２３に示す。
上記と同様にプラスミド酵母発現プラスミドpYES2/CTのマルチクローニングサイトに対象
遺伝子であるMpGDH-M3遺伝子を常法により挿入させたDNAコンストラクトを作製した。次
いで、酵母形質転換体を作製し、MpGDH-M3を含む培養上清液を回収した。上記と同様にPB
Sに置換した試験サンプルを作製し、40℃における保存安定性を評価した。その結果、試
験前の100%に対し、１週間後ではEndoH-M2は、95%の酵素活性が残存した。なお、麹菌に
より発現させたMpGDH-M3を用いた保存安定性評価でも同様の結果が得られた。
【0135】
続いて、M3に対してN型糖鎖付加モチーフ(N-X-S/T)に対して変異導入し、糖鎖付加量を
減少させた変異体を作成し、保存安定性を評価した。配列番号２３の塩基配列を鋳型とし
て用いて下記の表に記載の配列番号２４－２９の合成オリゴヌクレオチド、KOD-Plus-（
東洋紡社製）を用い、上記と同様の条件でPCR反応を行い、部位特異的変異を導入した。
減少させた変異体を作成し、保存安定性を評価した。配列番号２３の塩基配列を鋳型とし
て用いて下記の表に記載の配列番号２４－２９の合成オリゴヌクレオチド、KOD-Plus-（
東洋紡社製）を用い、上記と同様の条件でPCR反応を行い、部位特異的変異を導入した。
【表3】
【0136】
pYES2/CTに挿入された各GDH遺伝子を上記と同様に、pUC19のマルチクローニングサイト
にあるIn-Fusion Cloning Siteにて、MpGDH-M3/N247S/T249N遺伝子とMpGDH-M3/S103Q/N36
5D遺伝子を、上記したIn-Fusion HD Cloning Kitを使用して、キットに添付されたプロト
コールに従って連結して、コンストラクト用プラスミド(pUC19-MpGDH-M3/N247S/T249N、p
UC19-MpGDH-M3/S103Q/N365D)を得た。この遺伝子をコウジカビ（Aspergillus sojae; ア
スペルギルス・ソーヤ）で発現させ、そのGDH活性を評価した。
にあるIn-Fusion Cloning Siteにて、MpGDH-M3/N247S/T249N遺伝子とMpGDH-M3/S103Q/N36
5D遺伝子を、上記したIn-Fusion HD Cloning Kitを使用して、キットに添付されたプロト
コールに従って連結して、コンストラクト用プラスミド(pUC19-MpGDH-M3/N247S/T249N、p
UC19-MpGDH-M3/S103Q/N365D)を得た。この遺伝子をコウジカビ（Aspergillus sojae; ア
スペルギルス・ソーヤ）で発現させ、そのGDH活性を評価した。
【0137】
上記と同様に培養を行い、得られた培地上清画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５，
３０Ｋ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で１０ｍLまで濃縮し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含
む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６
０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶
出させ、GDH活性を示す画分を回収し、MpGDH-M3/N247S/T249N、MpGDH-M3/S103Q/N365Dの
精製標品を得た。
３０Ｋ ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で１０ｍLまで濃縮し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含
む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６
０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶
出させ、GDH活性を示す画分を回収し、MpGDH-M3/N247S/T249N、MpGDH-M3/S103Q/N365Dの
精製標品を得た。
【0138】
また、上記４．と同様の保存安定性試験の結果、試験前の100%に対し、１週間後ではMp
GDH-M3/N247S/T249Nは、90%の酵素活性が残存し、MpGDH-M3/S103Q/N365Dは、90%の酵素活
性が残存した。すなわち、糖鎖付加モチーフに変異導入しGDHの糖鎖量を減少させても、4
0℃で１週間保存後に90%以上の活性が残存することが分かり、非常に安定であることが示
された。GDHは多数の糖鎖付加部位（N-X-T/Sモチーフ）を有することが知られている。上
記では代表例として４箇所を変異させたが、他の公知の糖鎖付加部位を変異させても、同
様にGDHの糖鎖量は低減するが、そのようなバリアントについても、同様の残存活性を示
す蓋然性が高いと考えられる。
GDH-M3/N247S/T249Nは、90%の酵素活性が残存し、MpGDH-M3/S103Q/N365Dは、90%の酵素活
性が残存した。すなわち、糖鎖付加モチーフに変異導入しGDHの糖鎖量を減少させても、4
0℃で１週間保存後に90%以上の活性が残存することが分かり、非常に安定であることが示
された。GDHは多数の糖鎖付加部位（N-X-T/Sモチーフ）を有することが知られている。上
記では代表例として４箇所を変異させたが、他の公知の糖鎖付加部位を変異させても、同
様にGDHの糖鎖量は低減するが、そのようなバリアントについても、同様の残存活性を示
す蓋然性が高いと考えられる。
【0139】
以上のように、本発明のFAD-GDHは、保存安定性（長期安定性）に優れ、長期間にわた
り活性を保持した。また、本発明のFAD-GDHは脱糖鎖処理しても保存安定性が良好であっ
た。これは持続血糖測定、例えばCGMにおいて、特に有用である。
り活性を保持した。また、本発明のFAD-GDHは脱糖鎖処理しても保存安定性が良好であっ
た。これは持続血糖測定、例えばCGMにおいて、特に有用である。
【0140】
本発明を例示により説明したが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の変法を行
うことができる。
うことができる。
【0141】
配列の簡単な説明
配列番号１ Mucor prainii GDH(MpGDH) aa
配列番号２ MpGDH遺伝子 DNA
配列番号３ Mucor hiemalis GDH(MhGDH) aa
配列番号４ Mucor RD056860 GDH(MrdGDH) aa
配列番号５ Mucor subtilissimus GDH(MsGDH) aa
配列番号６ Mucor guilliermondii GDH(MgGDH) aa
配列番号７ Circinella simplex GDH(CsGDH) aa
配列番号８ Circinella属 GDH(CrGDH) aa
配列番号９ Mucor circinelloides GDH(McGDH) aa
配列番号１０ MrdGDH遺伝子 DNA
配列番号１１ MhGDH遺伝子 DNA
配列番号１２ MpGDH-M1 aa (M1)
配列番号１３ MpGDH-M1遺伝子DNA
配列番号１４ MpGDH-M1/A175C/N214C/G466D aa （M2）
配列番号１５ MpGDH-M2遺伝子DNA
配列番号１６－２１ プライマー
配列番号２２ MpGDH-M3 aa
配列番号２３ MpGDH-M3遺伝子DNA
配列番号２４－２９ プライマー
配列番号１ Mucor prainii GDH(MpGDH) aa
配列番号２ MpGDH遺伝子 DNA
配列番号３ Mucor hiemalis GDH(MhGDH) aa
配列番号４ Mucor RD056860 GDH(MrdGDH) aa
配列番号５ Mucor subtilissimus GDH(MsGDH) aa
配列番号６ Mucor guilliermondii GDH(MgGDH) aa
配列番号７ Circinella simplex GDH(CsGDH) aa
配列番号８ Circinella属 GDH(CrGDH) aa
配列番号９ Mucor circinelloides GDH(McGDH) aa
配列番号１０ MrdGDH遺伝子 DNA
配列番号１１ MhGDH遺伝子 DNA
配列番号１２ MpGDH-M1 aa (M1)
配列番号１３ MpGDH-M1遺伝子DNA
配列番号１４ MpGDH-M1/A175C/N214C/G466D aa （M2）
配列番号１５ MpGDH-M2遺伝子DNA
配列番号１６－２１ プライマー
配列番号２２ MpGDH-M3 aa
配列番号２３ MpGDH-M3遺伝子DNA
配列番号２４－２９ プライマー
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-09
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ） ｐＨ ７．４にて４０℃で１週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、３５％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、又は
（ｂ） ｐＨ ７．４にて４０℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、
ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ－ＧＤＨ）を用いる、グルコース測定方法。
（ｂ） ｐＨ ７．４にて４０℃で２週間にわたり加温した場合に、初期活性１００％のうち、２２％以上のデヒドロゲナーゼ活性が保持される、
ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ－ＧＤＨ）を用いる、グルコース測定方法。