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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024130396
(43)【公開日】2024-09-30
(54)【発明の名称】植物ステロールの蓄積が増大したナス科植物
(51)【国際特許分類】
A01H 5/00 20180101AFI20240920BHJP
A01H 6/82 20180101ALI20240920BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20240920BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240920BHJP
【ＦＩ】
A01H5/00 A ZNA
A01H6/82
C12N15/29
C12N15/09 110
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023040082
(22)【出願日】2023-03-14
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り １．掲載アドレス、掲載年月日 ｈｔｔｐ：／／ｊｓｐｐ．ｏｒｇ／ａｎｎｕａｌｍｅｅｔｉｎｇ／６３／ａｂｓｔｒａｃｔｂｏｏｋ．ｐｈｐ、令和４年３月１５日 ［刊行物等］ １．集会名、開催日 第６３回日本植物生理学会年会、令和４年３月２２日 ［刊行物等］ １．刊行物名、発行者名、発行年月日 第３４回植物脂質シンポジウム プログラム 要旨集 Ｏ９のページ、第３４回植物脂質シンポジウム準備委員会、令和４年９月２０日 ［刊行物等］ １．集会名、開催日 第３４回植物脂質シンポジウム、令和４年９月２１日
(71)【出願人】
【識別番号】304021831
【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学
(71)【出願人】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(71)【出願人】
【識別番号】503359821
【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所
(71)【出願人】
【識別番号】304026696
【氏名又は名称】国立大学法人三重大学
(71)【出願人】
【識別番号】397022911
【氏名又は名称】学校法人甲南学園
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100188651
【弁理士】
【氏名又は名称】遠藤 広介
(72)【発明者】
【氏名】島田 貴士
(72)【発明者】
【氏名】尾亦 雄斗
(72)【発明者】
【氏名】江面 健太郎
(72)【発明者】
【氏名】菅野 茂夫
(72)【発明者】
【氏名】斉藤 和季
(72)【発明者】
【氏名】庄司 翼
(72)【発明者】
【氏名】森 哲哉
(72)【発明者】
【氏名】岡咲 洋三
(72)【発明者】
【氏名】上田 晴子
(72)【発明者】
【氏名】西村 いくこ
【テーマコード（参考）】
2B030
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD09
2B030CA17
2B030CA19
(57)【要約】
【課題】ステロールの蓄積が増大したナス科植物の提供。
【解決手段】ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物を用いる。
【選択図】なし
【解決手段】ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物を用いる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されている、ナス科植物。
【請求項2】
ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が抑制または阻害されている、請求項１に記載のナス科植物。
【請求項3】
ＨＩＳＥ１遺伝子が、以下の（ａ）～（ｇ）のいずれか一つのポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１または２に記載のナス科植物：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列と同一性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失または付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列と同一性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失または付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項4】
請求項３に記載のポリヌクレオチドにおいて、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択される変異が導入された、ナス科植物。
【請求項5】
配列番号２の塩基配列における変異が、配列番号２の塩基配列の塩基番号７８７の塩基欠失もしくは塩基置換、または塩基番号７８７と７８８との間の塩基付加である、請求項４に記載のナス科植物。
【請求項6】
前記変異により得られたタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸欠失変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端からのアミノ酸残基数が３００残基以下である、請求項４に記載のナス科植物。
【請求項7】
前記ナス科植物が、トマト、ジャガイモ、ナス、およびタバコからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１または２に記載のナス科植物。
【請求項8】
葉における遊離ステロールの含有量が１，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ新鮮重量以上であるか、果実における遊離ステロールの含有量が１５，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ乾燥重量以上である、請求項１または２に記載のナス科植物。
【請求項9】
葉におけるステロールエステルの含有量が野生型と比較して１０倍以上であるか、果実におけるステロールエステルの含有量が野生型と比較して２倍以上である、請求項１または２に記載のナス科植物。
【請求項10】
ドリコールを含んでなる、請求項１または２に記載のナス科植物。
【請求項11】
ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することを含んでなる、植物ステロールの蓄積が増大したナス科植物の作出方法。
【請求項12】
野生型の花粉をｈｉｓｅ１変異体に受粉させることを含んでなる、請求項１１に記載の植物ステロールの蓄積が増大したナス科植物の作出方法。
【請求項13】
ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することを含んでなる、ナス科植物の植物ステロール蓄積を増大する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、植物ステロールの蓄積が増大したナス科植物に関する。
【背景技術】
【0002】
植物ステロールは植物の脂質膜の主要成分であり、細胞の活動および膜の流動性に影響を与える。さらに、植物ステロールは、化学構造がコレステロールに類似しており、ヒトが摂取すると十二指腸においてコレステロールと競合的に働き、コレステロールの吸収を抑制する働きがあるため、コレステロールによる動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞などの生活習慣病の予防に期待されている。（非特許文献１）
【0003】
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）では、植物ステロール合成の律速酵素である３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル（ＨＭＧ）－ＣｏＡ還元酵素の量を制御する因子としてＨＩＧＨ ＳＴＥＲＯＬ ＥＳＴＥＲ １（Ａｔ－ＨＩＳＥ１）が知られている。非特許文献２には、シロイヌナズナに存在するＡｔＨＩＳＥ１遺伝子を破壊することにより、シロイヌナズナの葉中のステロールエステルが野生型に比べて約５倍多く過剰蓄積できることが記載されている。
【0004】
トマト(Solanum lycopersicum)は、ナス科植物であり、世界中で人気のある野菜である。植物には、上述の植物ステロールとして、通常、β-シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールの３つの主要なフィトステロールが含まれているが、これらフィトステロールに加えて、トマトにはシクロアルテノール、ラノステロール、α-アミリン、β-アミリン、δ-アミリン、ルペオール等のＣ３０Ｈ５０Ｏステロール種が含まれていることが知られている。
【0005】
しかしながら、上述のトマトをはじめとするナス科植物におけるＨＩＳＥ１については何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】久保光志他、“血清中植物性ステロールの高感度定量法の開発”［online］、２００７年５月１９日発表、第６８回分析化学討論会、［２０２３年３月３日検索］、インターネット＜URL : http://www.jsac.or.jp/tenbou/TT68/P15.html＞
【非特許文献2】Shimada et al, Nature Plants, 2019, Vol.5, pp.1154-1166
【発明の概要】
【0007】
本発明者らは、今般、ナス科植物であるトマトにおいてＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することにより、植物ステロールの蓄積が効果的に増大しうることを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【0008】
したがって、本発明は、ナス科植物において植物ステロールの蓄積が効果的に増大するための技術的手段を提供する。
【0009】
本発明は、以下の発明を包含する。
［１］ ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されている、ナス科植物。
［２］ ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が抑制または阻害されている、［１］に記載のナス科植物。
［３］ ＨＩＳＥ１遺伝子が、以下の（ａ）～（ｇ）のいずれか一つのポリヌクレオチドを含んでなる、［１］または［２］に記載のナス科植物：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列と同一性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失または付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
［４］ ［３］に記載のポリヌクレオチドにおいて、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択される変異が導入された、ナス科植物。
［５］ 配列番号２の塩基配列における変異が、配列番号２の塩基配列の塩基番号７８７の塩基欠失もしくは塩基置換、または塩基番号７８７と７８８との間の塩基付加である、［４］に記載のナス科植物。
［６］ 前記変異により得られたタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸欠失変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端からのアミノ酸残基数が３００残基以下である、［４］に記載のナス科植物。
［７］ 前記ナス科植物が、トマト、ジャガイモ、ナス、およびタバコからなる群から選択される少なくとも一種である、［１］～［６］のいずれか一つに記載のナス科植物。
［８］ 葉における遊離ステロールの含有量が１，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ新鮮重量以上であるか、果実における遊離ステロールの含有量が１５，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ乾燥重量以上である、［１］～［７］のいずれか一つに記載のナス科植物。
［９］ 葉におけるステロールエステルの含有量が野生型と比較して１０倍以上であるか、果実におけるステロールエステルの含有量が野生型と比較して２倍以上である、［１］～［８］のいずれか一つに記載のナス科植物。
［１０］ ドリコールを含んでなる、［１］～［９］のいずれか一つに記載のナス科植物。
［１１］ ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することを含んでなる、植物ステロールの蓄積が増大したナス科植物の作出方法。
［１２］ 野生型の花粉をｈｉｓｅ１変異体に受粉させることを含んでなる、［１１］に記載の植物ステロール蓄積が増大したナス科植物の作出方法。
［１３］ ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することを含んでなる、ナス科植物の植物ステロールの蓄積を増大する方法。
［１］ ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されている、ナス科植物。
［２］ ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が抑制または阻害されている、［１］に記載のナス科植物。
［３］ ＨＩＳＥ１遺伝子が、以下の（ａ）～（ｇ）のいずれか一つのポリヌクレオチドを含んでなる、［１］または［２］に記載のナス科植物：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列と同一性が９０％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失または付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
［４］ ［３］に記載のポリヌクレオチドにおいて、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択される変異が導入された、ナス科植物。
［５］ 配列番号２の塩基配列における変異が、配列番号２の塩基配列の塩基番号７８７の塩基欠失もしくは塩基置換、または塩基番号７８７と７８８との間の塩基付加である、［４］に記載のナス科植物。
［６］ 前記変異により得られたタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸欠失変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端からのアミノ酸残基数が３００残基以下である、［４］に記載のナス科植物。
［７］ 前記ナス科植物が、トマト、ジャガイモ、ナス、およびタバコからなる群から選択される少なくとも一種である、［１］～［６］のいずれか一つに記載のナス科植物。
［８］ 葉における遊離ステロールの含有量が１，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ新鮮重量以上であるか、果実における遊離ステロールの含有量が１５，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ乾燥重量以上である、［１］～［７］のいずれか一つに記載のナス科植物。
［９］ 葉におけるステロールエステルの含有量が野生型と比較して１０倍以上であるか、果実におけるステロールエステルの含有量が野生型と比較して２倍以上である、［１］～［８］のいずれか一つに記載のナス科植物。
［１０］ ドリコールを含んでなる、［１］～［９］のいずれか一つに記載のナス科植物。
［１１］ ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することを含んでなる、植物ステロールの蓄積が増大したナス科植物の作出方法。
［１２］ 野生型の花粉をｈｉｓｅ１変異体に受粉させることを含んでなる、［１１］に記載の植物ステロール蓄積が増大したナス科植物の作出方法。
［１３］ ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することを含んでなる、ナス科植物の植物ステロールの蓄積を増大する方法。
【0010】
本発明によれば、ナス科植物においてＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することにより植物ステロールの蓄積を効果的に増大させることができる。ここで、植物ステロールとしては、遊離ステロール、ステロールエステルが挙げられる。また、本発明によれば、ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することによりドリコールの蓄積を効果的に増大できる上で有利である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】植物における植物ステロール種（ステロール誘導体を含む）の生合成経路を示す。具体的には、ステロールエステル（ＳＥ）、ステリルグルコシド（ＳＧ）、およびアシル－ステリルグルコシド（ＡＳＧ）の生合成経路を示す。ＣｏＡはコエンザイムＡを示し、ＨＭＧ－ＣｏＡは３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル補酵素Ａを示し、ＨＭＧＲはＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素を示し、ＤＡＧはジアシルグリセロールを示し、ＴＡＧはトリアシルグリセロールを示す。矢印は、酵素反応を示す。
【図2】Ｓｌ－ＨＩＳＥ１遺伝子のタンパク質コーディング領域（coding sequence；ＣＤＳ）を示した図である。Ｓｌ－ｈｉｓｅ１変異体は、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１のＣＤＳのＤＮＡ配列における７８７番目のグリシンが欠失している。
【図3】播種後５日目の野生型およびＳｌ－ｈｉｓｅ１変異体の植物の写真である。バーは０．５ｃｍを示す。
【図4】播種後３週目の野生型およびＳｌ－ｈｉｓｅ１変異体の植物の写真である。バーは３ｃｍを示す。
【図5】野生型およびＳｌ－ｈｉｓｅ１雄しべの顕微鏡画像である。バーは１００μｍを示す。Ｓｌ－ｈｉｓｅ１雄しべの右の写真は拡大写真である。
【図6】アレキサンダー染色で染色された、野生型、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１ヘテロ接合体およびＳｌ－ｈｉｓｅ１ヘテロ接合体の花粉粒の顕微鏡画像である。バーは２０μｍを示す。
【図7】野生型およびＳｌ－ｈｉｓｅ１変異体の熟した果実との種子を示す（バーは１ｃｍを示す）。
【図8】野生型およびＳｌ－ｈｉｓｅ１変異体の果実をＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３で染色した蛍光顕微鏡画像および明視野画像、ならびにそれらの重ね合わせである。バーは２０μｍを示す。
【図9】野生型およびＳｌ－ｈｉｓｅ１変異体の２週齢の本葉をＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３で染色した蛍光顕微鏡画像および明視野画像、ならびにそれらの重ね合わせである。バーは１０μｍを示す。
【図10】野生型とＳｌ－ｈｉｓｅ１変異体の２週齢の葉における、遊離ステロールの含有量（葉の新鮮重量（ＦＷ）当たりの含有量）、ステロールエステル（ＳＥ）およびドリコールの［Ｍ＋ＮＨ４］＋のピーク強度の、１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（以下、ＰＣ２０：０ともいう）の［Ｍ＋Ｈ］＋種のピーク強度に対する相対強度を示した図である。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝３）。アスタリスクは、野生型との有意差を示す（ｐ＜０．０５、ｔ検定）。
【図11】野生型とＳｌ－ｈｉｓｅ１変異体の果実における、遊離ステロールの含有量（果実の乾燥重量（ＤＷ）当たりの含有量）、ステロールエステル（ＳＥ）およびドリコールの［Ｍ＋ＮＨ４］＋の、ＰＣ２０：０の［Ｍ＋Ｈ］＋種に対する相対強度を示した図である。エラーバーは標準偏差を示す（ｎ＝３）。アスタリスクは、野生型との有意差を示す（ｐ＜０．０５、ｔ検定）。
【発明の具体的説明】
【0012】
本発明は、ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物であることを一つの特徴とする。
【0013】
植物のステロール生合成経路（図１）では、まず、アセチルコエンザイムＡ（ＣｏＡ）を原料に３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル補酵素（ＨＭＧ－ＣｏＡ）が生成され、ＨＭＧ－ＣｏＡはＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素によりメバロン酸へと変換される。メバロン酸からファルネシル２リン酸が生成され、ファルネシル２リン酸からドリコールとスクアレンが生成される。次に、スクアレンから遊離ステロールが生成される。遊離ステロールは脂肪酸とのエステル反応により、ステロールエステルが生成される。一方、遊離ステロールからステリルグルコシド（ＳＧ）も生成され、次いでアシル－ステリルグルコシド（ＡＳＧ）が生成される。
【0014】
＜ＨＩＳＥ１遺伝子およびＨＩＳＥ１タンパク質＞
「ＨＩＳＥ１（ＨＩＧＨ ＳＴＥＲＯＬ ＥＳＴＥＲ １）」は、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）レベルを低下させて植物ステロール生合成を負に制御して、植物ステロールの過剰生産や過剰蓄積を防ぐ。シロイヌナズナでは、過剰な遊離ステロールは、ステロールアシル転移酵素（phospholipid sterol acyltransferase1：ＰＳＡＴ１）によってＳＥに変換され、脂肪滴（lipid droplet：ＬＤ）に分離されることが知られている。
「ＨＩＳＥ１（ＨＩＧＨ ＳＴＥＲＯＬ ＥＳＴＥＲ １）」は、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＲ）レベルを低下させて植物ステロール生合成を負に制御して、植物ステロールの過剰生産や過剰蓄積を防ぐ。シロイヌナズナでは、過剰な遊離ステロールは、ステロールアシル転移酵素（phospholipid sterol acyltransferase1：ＰＳＡＴ１）によってＳＥに変換され、脂肪滴（lipid droplet：ＬＤ）に分離されることが知られている。
【0015】
本発明の一実施態様によれば、本明細書においてＨＩＳＥ１とは、本発明の対象となる植物のＨＩＳＥ１である。本発明の対象となる植物のＨＩＳＥ１は、好ましくはナス科植物のＨＩＳＥ１であり、例えば、配列番号１で示される６５８残基のアミノ酸配列からなるトマトＨＩＳＥ１タンパク質（以下、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１ともいう）である。
【0016】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明のＨＩＳＥ１タンパク質は、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるタンパク質（野生型ＨＩＳＥ１タンパク質）だけではなく、植物において、植物ステロールの過剰蓄積を抑制することができるか、または植物ステロールの蓄積の増大を抑制できる、その変異体タンパク質もまた含む。
【0017】
したがって、本発明において、ＨＩＳＥ１タンパク質という場合、以下の（ａ）～（ｃ）のタンパク質：
（ａ）配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
を含むことが出来る。
ここで、上記（ｂ）および（ｃ）のタンパク質のアミノ酸配列からなるタンパク質は、植物ステロールの過剰蓄積を抑制することができるか、または植物ステロールの蓄積の増大を抑制できることが好ましい。
（ａ）配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、または
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
を含むことが出来る。
ここで、上記（ｂ）および（ｃ）のタンパク質のアミノ酸配列からなるタンパク質は、植物ステロールの過剰蓄積を抑制することができるか、または植物ステロールの蓄積の増大を抑制できることが好ましい。
【0018】
本発明の一実施態様によれば、タンパク質（ｂ）における「数個」とは、例えば、２～２０個が挙げられ、好ましくは２～１５個、より好ましくは２～１０個、さらに好ましくは２～７個、さらに好ましくは２～５個、さらに好ましくは２～４個、また、さらに好ましくは２～３個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換をいう。性質の類似するアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）等に分類することができる。
【0019】
本明細書において、アミノ酸配列の「同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときに、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＨＩＳＥ１の全アミノ酸残基に対する二つのアミノ酸配列間での同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。アミノ酸同一性は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質の検索システムを用いて算出することができる。
【0020】
本発明の別の実施態様によれば、本発明の対象となる植物のＨＩＳＥ１は、好ましくはメンブラリン様ドメイン（ＩＰＲ０１９１４４）を含む。トマトＨＩＳＥ１のメンブラリン様ドメインは、配列番号１で示すアミノ酸配列においてアミノ酸番号７～アミノ酸番号４５３のアミノ酸領域に相当する。本発明の対象となる植物のＨＩＳＥ１は、好ましくはかかるアミノ酸領域のアミノ酸配列に対して６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるメンブラリン様ドメインを含む。
【0021】
「ＨＩＳＥ１遺伝子」は、前記ＨＩＳＥ１タンパク質をコードする遺伝子である。ＨＩＳＥ１遺伝子の具体例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるＨＩＳＥ１タンパク質をコードするＨＩＳＥ１遺伝子が挙げられる。より具体的には、配列番号２で示される塩基配列からなるトマトＨＩＳＥ１遺伝子が挙げられる。しかしながら、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチドまたは配列番号２で示される塩基配列で示されるものに限定されるものではなく、配列番号２で示されるＨＩＳＥ１遺伝子がコードするＨＩＳＥ１タンパク質と機能的に同等の活性、すなわち植物ステロールの過剰蓄積を抑制することができるか、または植物ステロールの蓄積の増大を抑制できるＨＩＳＥ１変異体タンパク質やＨＩＳＥ１タンパク質オルソログをコードするＨＩＳＥ１遺伝子も包含する。
【0022】
本発明の一実施態様によれば、前述した通り、本発明のＨＩＳＥ１タンパク質には、タンパク質（ａ）～（ｃ）の少なくとも１種が含まれる。これらのタンパク質に基づいて、本発明のＨＩＳＥ１遺伝子には、タンパク質（ａ）～（ｃ）に対応するものとして、以下の（ａ）～（ｃ）のヌクレオチド：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
のいずれかのポリヌクレオチドが含まれる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
のいずれかのポリヌクレオチドが含まれる。
【0023】
ポリヌクレオチド（ｂ）および（ｃ）において、ポリヌクレオチドをコードするタンパク質（ｂ）および（ｃ）に関して、それぞれの態様における「１または数個のアミノ酸」、そしてアミノ酸配列の「同一性」については、前述した通りである。
【0024】
本発明の一実施態様によれば、前述した通り、本発明のＨＩＳＥ１遺伝子という場合、トマトＨＩＳＥ１タンパク質をコードする配列番号２で表される塩基配列（ヌクレオチド（ｄ））が含まれ、そしてこのポリヌクレオチド（ｄ）に基づいて得られるＨＩＳＥ１遺伝子の変異体もまた、含まれる。したがって、本発明のＨＩＳＥ１遺伝子として、以下の（ｄ）～（ｇ）ポリヌクレオチドを含むことができる：
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失または付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列と同一性が少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
ここで、上記（ｅ）～（ｇ）のポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列とタンパク質としての同等の機能、活性、または性質、すなわち、植物ステロールの過剰蓄積を抑制することができるか、または植物ステロールの蓄積の増大を抑制できるような、アミノ酸配列をコードすることが好ましい。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失または付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列と同一性が少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
ここで、上記（ｅ）～（ｇ）のポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列とタンパク質としての同等の機能、活性、または性質、すなわち、植物ステロールの過剰蓄積を抑制することができるか、または植物ステロールの蓄積の増大を抑制できるような、アミノ酸配列をコードすることが好ましい。
【0025】
本発明の一実施態様によれば、ポリヌクレオチド（ｅ）における「数個」とは、例えば、２～２０個が挙げられ、好ましくは２～１５個、より好ましくは２～１０個、さらに好ましくは２～７個、さらに好ましくは２～５個、さらに好ましくは２～４個、また、さらに好ましくは２～３個をいう。
【0026】
本明細書において塩基配列の「同一性」とは、二つの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときに、配列番号２で示される塩基配列からなるＨＩＳＥ遺伝子のコード配列の全塩基に対する二つの塩基配列間で同一塩基の割合（％）をいう。塩基配列の同一性は、ＣｌｕｓｔａｌＷやＢＬＡＳＴといった公知のソフトウェアを使用して決定することができる。
【0027】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ（する）」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件でハイブリダイズすることをいい、例えば、低塩濃度および／または高温の条件下でハイブリダイゼーションと洗浄を行うことが挙げられる。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ）、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」であってもよく、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件が挙げられる。「ストリンジェントな条件」の別の実施態様によれば、例えば、「６０℃、２４時間」の条件が挙げられる。また、「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件については、Green,M.R. and Sambrook,J., 2012, Molecular Cloning : A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載されているので参考にすることができる。
【0028】
ＨＩＳＥ１タンパク質の活性は、ＨＭＧＲタンパク質の量（例えば、イムノブロットによる）および／またはＨＭＧＲタンパク質の比活性を低下させる活性を意味する。本発明において、ＨＩＳＥ１タンパク質の変異体は、ＨＭＧＲタンパク質の量および／または比活性を低下させる限り、その活性の程度は特に限定されないが、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の約５０％以上の活性を有していればよい。ＨＭＧＲタンパク質の量および／またはＨＭＧＲタンパク質の比活性は、非特許文献２に記載の方法で測定することができる。
【0029】
また、本発明の植物において、ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が抑制また阻害されていることは、例えばリアルタイムＰＣＲ、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ等を用いてｍＲＮＡの量を定量することによって調べることができる。リアルタイムＰＣＲ等に用いるための適切なプライマーやＰＣＲの条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。
【0030】
＜ナス科植物＞
本発明で用いられるナス科植物としては、例えば、ナス属、トウガラシ属、タバコ属の植物が挙げられ、好ましくは、ナス属の植物である。ナス属の植物としては、特に限定されないが、好ましくは、トマト、ナス、ジャガイモである。トウガラシ属の植物としては、例えば、トウガラシ、ピーマン、パプリカが挙げられ、好ましくは、ピーマン、パプリカである。タバコ属の植物としては、特に限定されないが、好ましくは、タバコである。理論に拘束されるものではないが、ナス科植物の植物ステロールおよびその関連化合物は、他の植物に比べて種類が多く特有であることが知られている（Itkin M. et al., Science, 2013, Vol.341, Issue 6142, pp.175-9、Roshani Shakya et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, Vol.56, Issue 16, pp.6949-6958）。
本発明で用いられるナス科植物としては、例えば、ナス属、トウガラシ属、タバコ属の植物が挙げられ、好ましくは、ナス属の植物である。ナス属の植物としては、特に限定されないが、好ましくは、トマト、ナス、ジャガイモである。トウガラシ属の植物としては、例えば、トウガラシ、ピーマン、パプリカが挙げられ、好ましくは、ピーマン、パプリカである。タバコ属の植物としては、特に限定されないが、好ましくは、タバコである。理論に拘束されるものではないが、ナス科植物の植物ステロールおよびその関連化合物は、他の植物に比べて種類が多く特有であることが知られている（Itkin M. et al., Science, 2013, Vol.341, Issue 6142, pp.175-9、Roshani Shakya et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, Vol.56, Issue 16, pp.6949-6958）。
【0031】
植物の野生型とは、非改変の植物（例えば、ＨＩＳＥ１遺伝子の減弱化のための遺伝的変異導入前の植物）であり、トマトでは、例えば、矮性栽培品種である「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」を野生型トマト植物として用いてもよい。
【0032】
本発明において「植物」とは、植物体の全部としての植物体を構成する全領域とともに、植物体の一部としての植物体を構成する一部領域、具体的には、茎、葉、根、花、蕾、果実（果実は、果肉および果皮を含む）、種子、細胞、およびカルス等を包含する。
【0033】
＜ＨＩＳＥ１遺伝子の減弱化＞
「ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化」とは、非改変植物（例えば、野生型植物）に比べてＨＩＳＥ１タンパク質が正常に機能しないように改変され、ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が抑制または阻害されていることを意味する。したがって、ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物は、形質転換植物であってよい。ここで、「ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が抑制または阻害されている」とは、ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が、対象となる植物の野生型のそれと比較して低下していることをいう。例えば、遺伝子組換えによりＨＩＳＥ１遺伝子を改変することにより、野生型植物に対してＨＩＳＥ１タンパク質の分子の数が減少した場合、またはＨＩＳＥ１タンパク質の分子が全く生成されなくなった場合、あるいはＨＩＳＥ１タンパク質の分子当たりの活性が低下または喪失した場合等が含まれる。ＨＩＳＥ１タンパク質の分子の数は、ＨＩＳＥ１タンパク質をコードする遺伝子（ＨＩＳＥ１遺伝子）の発現量を低下させることにより減少させることができる。ＨＩＳＥ１遺伝子の発現量の低下には、ＨＩＳＥ１タンパク質ｍＲＮＡの転写量の低下、およびＨＩＳＥ１タンパク質ｍＲＮＡの翻訳量の低下が含まれる。また、ＨＩＳＥ１タンパク質の分子を全く生成させなくすること、ＨＩＳＥ１タンパク質の分子数を減少させることあるいはＨＩＳＥ１タンパク質の分子当たりの活性を低下または喪失させることは、ＨＩＳＥ１遺伝子を破壊することによって達成することができる。本発明の植物においてＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が低下している程度は、植物ステロールの蓄積が増大または増強される限り、特に限定しない。例えば、対象となる植物の野生型と比較して、ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上抑制、または１００％阻害されていてもよい。
「ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化」とは、非改変植物（例えば、野生型植物）に比べてＨＩＳＥ１タンパク質が正常に機能しないように改変され、ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が抑制または阻害されていることを意味する。したがって、ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物は、形質転換植物であってよい。ここで、「ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が抑制または阻害されている」とは、ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が、対象となる植物の野生型のそれと比較して低下していることをいう。例えば、遺伝子組換えによりＨＩＳＥ１遺伝子を改変することにより、野生型植物に対してＨＩＳＥ１タンパク質の分子の数が減少した場合、またはＨＩＳＥ１タンパク質の分子が全く生成されなくなった場合、あるいはＨＩＳＥ１タンパク質の分子当たりの活性が低下または喪失した場合等が含まれる。ＨＩＳＥ１タンパク質の分子の数は、ＨＩＳＥ１タンパク質をコードする遺伝子（ＨＩＳＥ１遺伝子）の発現量を低下させることにより減少させることができる。ＨＩＳＥ１遺伝子の発現量の低下には、ＨＩＳＥ１タンパク質ｍＲＮＡの転写量の低下、およびＨＩＳＥ１タンパク質ｍＲＮＡの翻訳量の低下が含まれる。また、ＨＩＳＥ１タンパク質の分子を全く生成させなくすること、ＨＩＳＥ１タンパク質の分子数を減少させることあるいはＨＩＳＥ１タンパク質の分子当たりの活性を低下または喪失させることは、ＨＩＳＥ１遺伝子を破壊することによって達成することができる。本発明の植物においてＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が低下している程度は、植物ステロールの蓄積が増大または増強される限り、特に限定しない。例えば、対象となる植物の野生型と比較して、ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性が、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上抑制、または１００％阻害されていてもよい。
【0034】
本発明の植物において、ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化する具体的方法としては、当該分野において公知の任意の方法を用いることができる。
【0035】
本発明の一実施態様によれば、限定しないが、既存の変異体の利用、変異原処理、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、および／または阻害剤の導入、あるいはその任意の組み合わせによって、ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することができる。以下、それぞれの方法について説明する。
【0036】
（既存の変異体の利用）
本明細書において「既存の変異体の利用」とは、当該技術分野で既に存在している変異体を利用することをいう。ここでいう「変異体」とは、標的遺伝子、すなわちＨＩＳＥ１遺伝子に変異を生じた植物体をいう。変異は、ＨＩＳＥ１遺伝子の野生型遺伝子における付加、欠失、および／または置換が含まれる。変異体は、変異を含むＨＩＳＥ１遺伝子の機能が欠損、阻害、または抑制されているものが好ましい。「既存の変異体」とは、過去に収集され、各種配布機関によって収集、保存、提供されており、適宜利用することができる変異体である。既存の変異体は人為的に作出されたものであってもよい。
本明細書において「既存の変異体の利用」とは、当該技術分野で既に存在している変異体を利用することをいう。ここでいう「変異体」とは、標的遺伝子、すなわちＨＩＳＥ１遺伝子に変異を生じた植物体をいう。変異は、ＨＩＳＥ１遺伝子の野生型遺伝子における付加、欠失、および／または置換が含まれる。変異体は、変異を含むＨＩＳＥ１遺伝子の機能が欠損、阻害、または抑制されているものが好ましい。「既存の変異体」とは、過去に収集され、各種配布機関によって収集、保存、提供されており、適宜利用することができる変異体である。既存の変異体は人為的に作出されたものであってもよい。
【0037】
（変異原処理）
本明細書において「変異原処理」とは、対象とする植物に対して突然変異を誘発する処理をいう。処理方法は特に限定しない。例えば、Ｘ線や紫外線等の電磁波または放射線を照射する処理、ニトロソグアニジン、ニトロソアミン、ブロモデオキシウリジン、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア、エタンスルホン酸メチル、ベンゾピレン、臭化エチジウム等の突然変異誘発剤を接触させる処理、ウイルスやトランスポゾン等を利用して核酸をゲノム中のランダムな位置に導入する処理等を挙げることができる。変異原処理によって、点変異や欠失変異、挿入変異等の突然変異が誘発される。変異原処理後、表現型等によりＨＩＳＥ１遺伝子に変異を生じた候補変異体を分離し、ＰＣＲにより遺伝子断片を増幅し、塩基配列決定によりＨＩＳＥ１遺伝子への変異導入を確認することで目的とするＨＩＳＥ１遺伝子の変異体を得ることができる。
本明細書において「変異原処理」とは、対象とする植物に対して突然変異を誘発する処理をいう。処理方法は特に限定しない。例えば、Ｘ線や紫外線等の電磁波または放射線を照射する処理、ニトロソグアニジン、ニトロソアミン、ブロモデオキシウリジン、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア、エタンスルホン酸メチル、ベンゾピレン、臭化エチジウム等の突然変異誘発剤を接触させる処理、ウイルスやトランスポゾン等を利用して核酸をゲノム中のランダムな位置に導入する処理等を挙げることができる。変異原処理によって、点変異や欠失変異、挿入変異等の突然変異が誘発される。変異原処理後、表現型等によりＨＩＳＥ１遺伝子に変異を生じた候補変異体を分離し、ＰＣＲにより遺伝子断片を増幅し、塩基配列決定によりＨＩＳＥ１遺伝子への変異導入を確認することで目的とするＨＩＳＥ１遺伝子の変異体を得ることができる。
【0038】
（遺伝子ノックダウン）
本明細書において「遺伝子ノックダウン」とは、ＨＩＳＥ１遺伝子の発現レベルを減少させる操作をいう。例えば、ＨＩＳＥ１遺伝子から転写されるＲＮＡにハイブリダイズすることのできるアンチセンスＤＮＡを用いて、ＲＮａｓｅＨによりＨＩＳＥ１遺伝子のｍＲＮＡを分解するアンチセンス法や、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを用いて標的ｍＲＮＡを分解することにより遺伝子の発現を転写後に抑制するＲＮＡ干渉法（ＲＮＡｉ）等が挙げられる。例えば、アンチセンス核酸やｓｈＲＮＡの発現ベクターを細胞に導入する方法や、人工核酸を含むアンチセンス核酸やｓｈＲＮＡを使用する方法が挙げられる。
本明細書において「遺伝子ノックダウン」とは、ＨＩＳＥ１遺伝子の発現レベルを減少させる操作をいう。例えば、ＨＩＳＥ１遺伝子から転写されるＲＮＡにハイブリダイズすることのできるアンチセンスＤＮＡを用いて、ＲＮａｓｅＨによりＨＩＳＥ１遺伝子のｍＲＮＡを分解するアンチセンス法や、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを用いて標的ｍＲＮＡを分解することにより遺伝子の発現を転写後に抑制するＲＮＡ干渉法（ＲＮＡｉ）等が挙げられる。例えば、アンチセンス核酸やｓｈＲＮＡの発現ベクターを細胞に導入する方法や、人工核酸を含むアンチセンス核酸やｓｈＲＮＡを使用する方法が挙げられる。
【0039】
（遺伝子ノックアウト）
本明細書において「遺伝子ノックアウト」とは、染色体上のＨＩＳＥ１遺伝子に挿入や欠失を加えることにより遺伝子の機能を破壊することをいう。遺伝子ノックアウトには、相同組換えを用いて内因性の遺伝子を改変する遺伝子ターゲティング法や、ＺＦＮやＴＡＬＥＮ等の人工のＤＮＡ切断酵素や、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ等の部位特異的ヌクレアーゼを用いるゲノム編集技術を用いることができ、好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼを用いるゲノム編集技術である。本発明における遺伝子ノックアウトは、条件付き遺伝子ノックアウトであってもよい。ここで、「条件付き遺伝子ノックアウト」とは、部位特異的および／または時期特異的な遺伝子ノックアウトをいう。条件付き遺伝子ノックアウトは、例えば、ＤＮＡ組換え酵素の認識配列をＨＩＳＥ１遺伝子の前後に導入し、部位特異的および／または時期特異的な活性を有するプロモーターの制御下でＤＮＡ組換え酵素を発現させ、部位特異的組換え反応を引き起こすことによって行うことができる。
本明細書において「遺伝子ノックアウト」とは、染色体上のＨＩＳＥ１遺伝子に挿入や欠失を加えることにより遺伝子の機能を破壊することをいう。遺伝子ノックアウトには、相同組換えを用いて内因性の遺伝子を改変する遺伝子ターゲティング法や、ＺＦＮやＴＡＬＥＮ等の人工のＤＮＡ切断酵素や、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ等の部位特異的ヌクレアーゼを用いるゲノム編集技術を用いることができ、好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼを用いるゲノム編集技術である。本発明における遺伝子ノックアウトは、条件付き遺伝子ノックアウトであってもよい。ここで、「条件付き遺伝子ノックアウト」とは、部位特異的および／または時期特異的な遺伝子ノックアウトをいう。条件付き遺伝子ノックアウトは、例えば、ＤＮＡ組換え酵素の認識配列をＨＩＳＥ１遺伝子の前後に導入し、部位特異的および／または時期特異的な活性を有するプロモーターの制御下でＤＮＡ組換え酵素を発現させ、部位特異的組換え反応を引き起こすことによって行うことができる。
【0040】
（阻害剤の導入）
本発明の形質転換植物等では、ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性を抑制または阻害するために、阻害剤を導入することができる。阻害剤は、ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性を直接的または間接的に抑制／阻害し得る阻害剤であれば、限定しない。
本発明の形質転換植物等では、ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性を抑制または阻害するために、阻害剤を導入することができる。阻害剤は、ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性を直接的または間接的に抑制／阻害し得る阻害剤であれば、限定しない。
【0041】
本発明の別の実施態様によれば、ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化する具体的方法としては、本発明のＨＩＳＥ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、ストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群から選択される変異を導入することにより、ＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性を抑制または阻害することができる。以下、それぞれの方法について説明する。
【0042】
（ストップコドン変異）
本明細書において「ストップコドン変異」とは、遺伝子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）に１または数個の塩基が挿入されることにより、挿入された部位のアミノ酸のコドンを終止コドンにするような塩基配列の変異を意味する。
本明細書において「ストップコドン変異」とは、遺伝子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）に１または数個の塩基が挿入されることにより、挿入された部位のアミノ酸のコドンを終止コドンにするような塩基配列の変異を意味する。
【0043】
（フレームシフト）
本明細書において「フレームシフト」とは、ＤＮＡに１個または数個（３の倍数ではない）の塩基の挿入や欠失が起こった結果、トリプレットのリーディングフレーム（読み枠）がずれてしまい、結果としてその挿入または欠失が生じた場所以降で野生型とは異なるアミノ酸配列を規定したり終止コドンが挿入されたりするような塩基配列の変異を意味する。
本明細書において「フレームシフト」とは、ＤＮＡに１個または数個（３の倍数ではない）の塩基の挿入や欠失が起こった結果、トリプレットのリーディングフレーム（読み枠）がずれてしまい、結果としてその挿入または欠失が生じた場所以降で野生型とは異なるアミノ酸配列を規定したり終止コドンが挿入されたりするような塩基配列の変異を意味する。
【0044】
（ヌル変異）
本明細書において「ヌル変異」とは、欠失や塩基置換などにより、全アミノ酸配列が発現されなくなるなど、機能を持つタンパク質が作れなくなるような塩基配列の変異を意味する。
本明細書において「ヌル変異」とは、欠失や塩基置換などにより、全アミノ酸配列が発現されなくなるなど、機能を持つタンパク質が作れなくなるような塩基配列の変異を意味する。
【0045】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化する具体的方法としては、ＨＩＳＥ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異を導入することが挙げられる。かかるＨＩＳＥ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの変異としては、配列番号２の塩基配列の塩基番号７８７の塩基欠失または塩基置換または塩基番号７８７と７８８の間の塩基付加が挙げられる。配列番号２の塩基番号７８７の塩基置換における置換後の塩基は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）のいずれであってもよく、好ましくは塩基番号７８７の塩基欠失である。配列番号２の塩基配列の塩基番号７８７と７８８の間の塩基付加における付加後の塩基としてはＡ、Ｃ、Ｔ、グアニン（Ｇ）のいずれであってもよく、好ましくはＧである。
【0046】
本発明のより好ましい実施態様によれば、ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化する具体的方法としては、ＨＩＳＥ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異を導入して、変異により得られたＨＩＳＥタンパク質が、ＨＩＳＥ１タンパク質のアミノ酸配列のＣ末端側のアミノ酸を欠失させた、ＨＩＳＥ１タンパク質Ｃ末端欠失変異体とすることが挙げられる。かかるＨＩＳＥ１タンパク質Ｃ末端欠失変異体における、ＨＩＳＥ１タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列）のＮ末端からのアミノ酸残基数としては、例えば、３５０残基以下が挙げられ、好ましくは３００残基以下であり、より好ましくは２８０残基以下であり、さらに好ましくは２７５残基以下であり、また、好ましくは２００残基以上、より好ましくは２３０残基以上、さらに好ましく２６０残基以上である。
【0047】
＜ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物の特性＞
本発明の一実施態様によれば、ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物（以下、「本発明のナス科植物」ともいう）は、植物ステロールの蓄積を増大することができる。かかる蓄積の増大は蓄積量の増大であってよい。ここで、植物ステロールとしては、遊離ステロール、ステロールエステル、またはそれらの組み合わせであってよい。遊離ステロールとしては、コレステロール、カンペステロール、スチグマステロール、β－シトステロール、Ｃ３０Ｈ５０Ｏステロールおよび２４－メチレンシクロアルタノールからなる群から選択される少なくとも一種が挙げられ、好ましくは、コレステロール、カンペステロール、スチグマステロール、β－シトステロール、Ｃ３０Ｈ５０Ｏステロールおよび２４－メチレンシクロアルタノールの組み合わせである。
本発明の一実施態様によれば、ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物（以下、「本発明のナス科植物」ともいう）は、植物ステロールの蓄積を増大することができる。かかる蓄積の増大は蓄積量の増大であってよい。ここで、植物ステロールとしては、遊離ステロール、ステロールエステル、またはそれらの組み合わせであってよい。遊離ステロールとしては、コレステロール、カンペステロール、スチグマステロール、β－シトステロール、Ｃ３０Ｈ５０Ｏステロールおよび２４－メチレンシクロアルタノールからなる群から選択される少なくとも一種が挙げられ、好ましくは、コレステロール、カンペステロール、スチグマステロール、β－シトステロール、Ｃ３０Ｈ５０Ｏステロールおよび２４－メチレンシクロアルタノールの組み合わせである。
【0048】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明のＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物において、葉における遊離ステロールの含有量（蓄積量）は、例えば１，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ新鮮重量以上、好ましくは１，５００ｐｍｏｌ／ｍｇ新鮮重量以上であり、より好ましくは１，８００ｐｍｏｌ／ｍｇ新鮮重量以上であり、また、好ましくは５，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ新鮮重量以下である。また、本発明のナス科植物の果実における遊離ステロールの含有量は、例えば１０，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ乾燥重量以上、好ましくは１５，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ乾燥重量以上、より好ましくは２０，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ乾燥重量以上、さらに好ましくは５０，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ乾燥重量以上であり、さらに好ましくは１００，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ乾燥重量以上であり、また、好ましくは３００，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ新鮮重量以下である。
【0049】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、本発明のＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物において、遊離ステロールの含有量を、野生型のナス科植物と比較して、例えば、１．５倍以上、好ましくは２倍以上、また、好ましくは２０倍以下に増大できる。特に、本発明のナス科植物において、葉における遊離ステロールの含有量は、野生型のナス科植物の葉と比較して、例えば１．５倍以上、好ましくは２倍以上であり、より好ましくは２．５倍以上であり、また、好ましくは１０倍以下である。また、本発明のナス科植物の果実における遊離ステロールの含有量は、野生型のナス科植物の果実と比較して、例えば２倍以上、好ましくは５倍以上であり、より好ましくは７倍以上であり、また、好ましくは２０倍以下である。
【0050】
本発明の植物における遊離ステロールの含有量の測定は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により測定される。上記測定としては、Yamashita, K. et al., J Chromatogr A (2007), 1173, pp.120-128に記載の手順に準じてステロールのピコリノイル誘導体化を行うことができ、Okazaki, Y. and Saito, K. (2018) Methods Mol Biol 1778, pp.157-169に記載の方法に従ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行うことができる。このような測定は、ＬＣ四重極飛行時間型（ＱＴＯＦ）ＭＳ（ＬＣ：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム、ＭＳ：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｑ－Ｔｏｆ）を用いることにより、簡便に行うことができる。ここで、より正確な濃度測定のためには、既知の濃度を有する内部標準を用いることが望ましく、内部標準としては通常各化合物を用いることができる。
【0051】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明のＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物において、ステロールエステルの含有量は、１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＣ２０：０）の［Ｍ＋Ｈ］＋種に対するステロールエステルの［Ｍ＋ＮＨ４］＋の相対強度として算出することができる。本発明のナス科植物の葉におけるステロールエステルの含有量は、ＰＣ２０：０の［Ｍ＋Ｈ］＋種に対する上記相対強度として、例えば０．５以上、好ましくは１以上であり、より好ましくは２以上であり、また、好ましくは５以下である。また、本発明のナス科植物の果実におけるステロールエステルの含有量は、ＰＣ２０：０の［Ｍ＋Ｈ］＋種に対する相対強度として、例えば０．５以上、好ましくは１以上であり、より好ましくは１．３以上であり、また、好ましくは５以下である。
ここで、ＰＣ２０：０は内部標準として添加され、その［Ｍ＋Ｈ］＋種のピーク強度は、以下のように求めることができる。最初に、葉の場合について説明する。まず、葉（約５０ｍｇ）を凍結し、振とう粉砕する。その後約１６倍量の抽出溶媒（１μＭの１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを含むメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル／メタノール＝３／１（ｖ／ｖ））を粉砕されたサンプルに入れ、激しく混合する。得られたホモジネートに約４倍量の水を加える。その後激しく攪拌し、氷上、暗所でインキュベーションした後遠心分離する。上層を新しいマイクロ遠心チューブに移し、遠心濃縮器を使用して有機相を室温で蒸発乾固させる。得られた残渣をエタノール（好ましくは、２００μＬ）に溶解し遠心分離する。得られた上清をガラスインサート付きのバイアルに移し、Okazaki, Y. and Saito, K. (2018) Methods Mol Biol 1778, pp.157-169に記載の方法に従ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行う。好ましくは試験例５の方法である。
次に、果実の場合について説明する。果実を凍結乾燥し粉砕する。乾燥果実粉末（約５ｇ）を約１６０倍量の抽出溶媒で抽出する。上層（例えば、１６０μＬ）を約５０倍量の水で洗浄後、濃縮乾固し、エタノール（例えば、２００μＬ）で溶解し、上記葉の場合と同様にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行う。好ましくは試験例５の方法である。
ここで、ＰＣ２０：０は内部標準として添加され、その［Ｍ＋Ｈ］＋種のピーク強度は、以下のように求めることができる。最初に、葉の場合について説明する。まず、葉（約５０ｍｇ）を凍結し、振とう粉砕する。その後約１６倍量の抽出溶媒（１μＭの１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを含むメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル／メタノール＝３／１（ｖ／ｖ））を粉砕されたサンプルに入れ、激しく混合する。得られたホモジネートに約４倍量の水を加える。その後激しく攪拌し、氷上、暗所でインキュベーションした後遠心分離する。上層を新しいマイクロ遠心チューブに移し、遠心濃縮器を使用して有機相を室温で蒸発乾固させる。得られた残渣をエタノール（好ましくは、２００μＬ）に溶解し遠心分離する。得られた上清をガラスインサート付きのバイアルに移し、Okazaki, Y. and Saito, K. (2018) Methods Mol Biol 1778, pp.157-169に記載の方法に従ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行う。好ましくは試験例５の方法である。
次に、果実の場合について説明する。果実を凍結乾燥し粉砕する。乾燥果実粉末（約５ｇ）を約１６０倍量の抽出溶媒で抽出する。上層（例えば、１６０μＬ）を約５０倍量の水で洗浄後、濃縮乾固し、エタノール（例えば、２００μＬ）で溶解し、上記葉の場合と同様にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行う。好ましくは試験例５の方法である。
【0052】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、本発明のＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物において、ステロールエステルの含有量は、野生型のナス科植物と比較して、例えば、２倍以上、好ましくは５倍以上に増大できる。特に、本発明のナス科植物において、葉におけるステロールエステルの含有量は、野生型のナス科植物の葉と比較して、例えば１０倍以上、好ましくは２０倍以上であり、より好ましくは１００倍以上である。好ましくは、ステロールエステルは野生型のナス科植物の葉では未検出であるものの、本発明のナス科植物の葉では検出されうる。また、本発明のナス科植物の果実におけるステロールエステルの含有量は、野生型のナス科植物の果実と比較して、例えば２倍以上、好ましくは５倍以上であり、より好ましくは６倍以上であり、また、好ましくは２０倍以下である。
【0053】
本発明の植物におけるステロールエステルの含有量の測定は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により測定される。上記測定としては、Okazaki, Y. and Saito, K. (2018) Methods Mol Biol 1778, pp.157-169に記載の手順に従って測定することができる。ここで、より正確な濃度測定のためには、既知の濃度を有する内部標準を用いることが望ましく、内部標準として１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＣ２０：０）を用いることができる。さらに、ステロールエステルの含有量は、ＰＣ２０：０の［Ｍ＋Ｈ］＋種のピーク強度に対するステロールエステルの［Ｍ＋ＮＨ４］＋のピーク強度の相対強度として求めることができる。
【0054】
本発明の別の実施態様によれば、ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物はドリコールを含むことができる。ドリコールは野生型のナス科植物では未検出であるものの、本発明のナス科植物では検出されうる。
【0055】
本発明の好ましい別の実施態様によれば、本発明のＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物において、ドリコールの含有量は、ＰＣ２０：０の［Ｍ＋Ｈ］＋種に対するドリコールの［Ｍ＋ＮＨ４］＋の相対強度として算出することができる。本発明のナス科植物の葉におけるドリコールの含有量は、ＰＣ２０：０の［Ｍ＋Ｈ］＋種に対する上記相対強度として、例えば０．０２以上、好ましくは０．０６以上であり、より好ましくは０．０７以上であり、また、好ましくは０．２以下である。本発明のナス科植物の果実におけるステロールエステルの含有量は、ＰＣ２０：０の［Ｍ＋Ｈ］＋種に対する上記相対強度として、例えば０．０２以上、好ましくは０．０８以上であり、より好ましくは０．１以上であり、また、好ましくは０．３以下である。ここで、ＰＣ２０：０の［Ｍ＋Ｈ］＋種については、上述のステロールエステルの場合と同様に求めることができる。
【0056】
本発明の植物におけるドリコールの含有量の測定は、ステロールエステルと同様の方法で測定される。
【0057】
本発明の別の実施態様によれば、ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物は野生型のナス科植物に比較して脂肪滴（ＬＤ）の数および／または面積が増えている。具体的には、本発明のナス科植物の果実におけるＬＤは野生型のナス科植物の果実と比較して増えている。また、本発明のナス科植物の葉におけるＬＤも野生型のナス科植物の葉と比較して増えている。本発明のナス科植物の葉におけるＬＤの数は、野生型のナス科植物の葉におけるＬＤの数と比較して、例えば２０倍以上、好ましくは３０倍以上であり、より好ましくは４０倍以上であり、また、好ましくは１５０倍以下である。また、本発明のナス科植物の葉におけるＬＤの面積は、野生型のナス科植物の葉におけるＬＤの面積と比較して、例えば５０倍以上、好ましくは１００倍以上であり、より好ましくは１２０倍以上であり、また、好ましくは２００倍以下である。本発明の植物におけるＬＤの数および面積は顕微鏡を用いて測定され、特に、面積はソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて計算できる。
【0058】
本発明の別の実施態様によれば、本発明のＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物の葉において、１，０００μｍ２あたりのＬＤの数は、例えば２個以上、好ましくは３個以上であり、より好ましくは４個以上である。また、本発明のナス科植物の葉における１，０００μｍ２あたりのＬＤの面積は、例えば２０μｍ２以上、好ましくは３０μｍ２以上、より好ましくは４０μｍ２以上である。
【0059】
本発明の別の実施態様によれば、ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物は部分的不稔表現型を示してもよく、例えば、雄性不稔性を示してもよい。ここで、雄性不稔性とは、植物個体が有する花器官のうち一部または全部の雄ずいの稔性が失われていることである。雄ずいの不稔性としては、雄ずいが正常に形成されず花粉が生産されないことによるもの、雄ずいが他の器官に置き換わり花粉が生産されないことによるもの、花粉は生産されたが稔性を有さないことによるもの等が挙げられる。本発明のナス科植物は、花粉の発達障害により生存能力を有しないことにより、雄性不稔性を示してもよい。
雄ずいの不稔は、雄ずいが花弁等の他の器官に置き換わる等を形態観察により調べてもよく、正常個体の雌ずいとの掛け合わせにより種子が形成されるかどうかによっても容易に調べることができ、花粉の生存能力についてはアレキサンダー染色により調べてもよい。
雄ずいの不稔は、雄ずいが花弁等の他の器官に置き換わる等を形態観察により調べてもよく、正常個体の雌ずいとの掛け合わせにより種子が形成されるかどうかによっても容易に調べることができ、花粉の生存能力についてはアレキサンダー染色により調べてもよい。
【0060】
＜植物ステロールの蓄積が増大したナス科植物の作出方法＞
本発明の植物ステロールの蓄積が増大したナス科植物の作出方法は、ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することを含むものである。さらに、かかる方法は植物のＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性を抑制または阻害することを含んでよい。
本発明の植物ステロールの蓄積が増大したナス科植物の作出方法は、ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することを含むものである。さらに、かかる方法は植物のＨＩＳＥ１タンパク質の発現または活性を抑制または阻害することを含んでよい。
【0061】
上記ＨＩＳＥ１遺伝子としては、上述の（ａ）～（ｇ）ポリヌクレオチドを含むものが挙げられる。
【0062】
本発明のナス科植物の作出方法としては、ナス科植物のＨＩＳＥ１遺伝子に、ＨＩＳＥ１遺伝子の減弱化のために変異を導入することが好ましい。上記変異としてはストップコドン変異、フレームシフト変異、およびヌル変異からなる群より選択される変異が挙げられる。かかる変異の導入方法としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ等の部位特異的ヌクレアーゼを用いるゲノム編集技術を用いる遺伝子ノックアウトや遺伝子ノックダウンが挙げられる。
【0063】
本発明の一実施態様によれば、上述の＜ＨＩＳＥ１遺伝子の減弱化＞に記載のように、配列番号２の塩基配列における変異として、配列番号２の塩基配列の塩基番号７８７の塩基欠失もしくは塩基置換、または塩基番号７８７と７８８の間の塩基付加が挙げられる。または、ＨＩＳＥ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異を導入して、ＨＩＳＥ１タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）のＣ末端側のアミノ酸を欠失させ、ＨＩＳＥ１タンパク質Ｃ末端欠失変異体とすることが挙げられる。
【0064】
さらに本発明は、本発明のＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物を育種親として、他のナス科植物と交配し、子孫植物としてＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物を取得することを含む、ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物の作出方法も提供する。上述のように、ナス科植物ではＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されることにより、花粉が生存能力を有さず雄性不稔性を示しうる。したがって、本発明の別の実施態様によれば、植物ステロールの蓄積が増大したナス科植物の作出方法として、野生型植物の花粉を、ＨＩＳＥ１遺伝子が減弱化されているナス科植物の変異体（ｈｉｓｅ１変異体ともいう）に受粉させることを含むことが好ましい。上記の遺伝的変異およびそれに起因する性質（植物ステロール蓄積の増大）を目的のナス科植物において固定することができる。得られた子孫植物については、目的の変異を有することを確認することが好ましい。変異の確認は、遺伝的変異を検出できる任意の方法により行えばよい。
【0065】
＜ナス科植物の植物ステロールの蓄積を増大させる方法＞
本発明の別の態様によれば、ナス科植物の植物ステロール蓄積を増大させる方法であって、ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することを含む方法が提供される。本発明の方法によれば、ナス科植物における植物ステロール蓄積を増大することができる。
本発明の別の態様によれば、ナス科植物の植物ステロール蓄積を増大させる方法であって、ＨＩＳＥ１遺伝子を減弱化することを含む方法が提供される。本発明の方法によれば、ナス科植物における植物ステロール蓄積を増大することができる。
【0066】
本発明の方法におけるＨＩＳＥ１遺伝子の減弱化は、上述した本発明のナス科植物や植物ステロール蓄積が増大したナス科植物の作出方法について説明したＨＩＳＥ１遺伝子の減弱化と同様にして行うことができる。
【0067】
以下に本発明において配列番号で示される塩基配列またはアミノ酸配列について記述する。
配列番号１：トマトＨＩＳＥ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号２：トマトＨＩＳＥ１遺伝子のコード配列の塩基配列を示す。
配列番号３：実施例で使用されるＳｌ－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡのプライマーの塩基配列
配列番号４：実施例で使用されるＳｌ－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡのプライマーの塩基配列
配列番号５：実施例で使用されるＳｌ－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡのプライマーの塩基配列
配列番号６：実施例で使用されるＳｌ－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡのプライマーの塩基配列
配列番号７：実施例で使用される１９３１０ｃ－ｓｔｏｐのプライマーの塩基配列
配列番号８：実施例で使用される１９３１０ｃ－ｓｔｏｐのプライマーの塩基配列
配列番号９：実施例で使用されるガイドＲＮＡのためのオリゴＤＮＡ
配列番号１０：実施例で使用されるガイドＲＮＡのためのオリゴＤＮＡ
配列番号１１：実施例で使用されるプライマーの塩基配列
配列番号１２：実施例で使用されるプライマーの塩基配列
配列番号１３：実施例で使用されるプライマーの塩基配列
配列番号１４：実施例で使用されるプライマーの塩基配列
配列番号１：トマトＨＩＳＥ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号２：トマトＨＩＳＥ１遺伝子のコード配列の塩基配列を示す。
配列番号３：実施例で使用されるＳｌ－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡのプライマーの塩基配列
配列番号４：実施例で使用されるＳｌ－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡのプライマーの塩基配列
配列番号５：実施例で使用されるＳｌ－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡのプライマーの塩基配列
配列番号６：実施例で使用されるＳｌ－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡのプライマーの塩基配列
配列番号７：実施例で使用される１９３１０ｃ－ｓｔｏｐのプライマーの塩基配列
配列番号８：実施例で使用される１９３１０ｃ－ｓｔｏｐのプライマーの塩基配列
配列番号９：実施例で使用されるガイドＲＮＡのためのオリゴＤＮＡ
配列番号１０：実施例で使用されるガイドＲＮＡのためのオリゴＤＮＡ
配列番号１１：実施例で使用されるプライマーの塩基配列
配列番号１２：実施例で使用されるプライマーの塩基配列
配列番号１３：実施例で使用されるプライマーの塩基配列
配列番号１４：実施例で使用されるプライマーの塩基配列
【実施例0068】
以下の試験例に基づいて本発明を説明するが、本発明はこれらの試験例に限定されるものではない。
【0069】
試験例１：トマトにおけるＨＩＳＥ１オルソログの同定
トマト(Solanum lycopersicum)の矮性栽培品種「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」を野生型として使用した。バーミキュライトを含む土壌で種子を発芽させ、２５°Ｃの連続光（１５０μＥｓ－１ｍ－２）で生育させた。
トマト(Solanum lycopersicum)の矮性栽培品種「Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ」を野生型として使用した。バーミキュライトを含む土壌で種子を発芽させ、２５°Ｃの連続光（１５０μＥｓ－１ｍ－２）で生育させた。
【0070】
トマトの推定ＨＩＳＥ１オルソログ（ＬＯＣ１０１２６５５３３およびＳｏｌｙｃ０４ｇ０２６２８０）は、Ａｔ－ＨＩＳＥ１（シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ＨＩＧＨ ＳＴＥＲＯＬ ＥＳＴＥＲ １）をクエリとして用いて、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のBasic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）およびSol Genomic Networkでの相同性検索によって特定された。Sol Genomic Network(SL4.0)のＢＬＡＳＴプログラムを使用した相同性検索により、Ｓｏｌｙｃ０４ｇ０２６２８０のタンパク質コード配列（ＣＤＳ）がＬＯＣ１０１２６５５３３のＣＤＳと類似していることが明らかになった。ここで、ＬＯＣ１０１２６５５３３のＣＤＳの＋１８８３ｂｐから＋１９７７ｂｐまでのＤＮＡ配列は、Ｓｏｌｙｃ０４ｇ０２６２８０のＣＤＳのイントロンと予想された。トマトＨＩＳＥ１オルソログ（ＬＯＣ１０１２６５５３３）はＡｔ－ＨＩＳＥ１アミノ酸配列（ＡＴ１Ｇ６０９９５）と６４％の同一性を有していた。同定された候補配列のドメインは、InterProScan（バージョン５．５９－９１．０）(Zdobnov and Apweiler,2001)を用いて検索した。その結果、候補タンパク質に「メンブラリン様ドメイン（ＩＰＲ０１９１４４）」が存在することが確認され、トマトのＨＩＳＥ１オルソログをＳｌ－ＨＩＳＥ１とした。
【0071】
トマトの果実におけるＳｌ－ＨＩＳＥ１のタンパク質コード配列を同定するために、RNeasy Plant Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）およびＤＮａｓｅ Ｉを使用して野生型のトマトの果実からトータルＲＮＡを単離した。逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡社製）を使用して、得られたトータルＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。Ｓｌ－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡ（－１７７～＋２，１１０ｂｐ；ここで、＋１ｂｐは転写開始部位を指す）は、プライマー5'-CACCTTGCAACCCCTACCCTATCT-3'（配列番号３）および5'-TTCTACATATCTGTCTCCAC-3'（配列番号４）を使用して、果実をテンプレートとして用いｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯクローニングを介してｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングして、サブクローニングベクターを生成した。前記ベクターのＤＮＡ配列解析により、クローン化されたＳ１－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡのＤＮＡ配列は配列番号２の通りであり、ＬＯＣ１０１２６５５３３の参照配列に対応することが明らかとなった。
【0072】
トマトの葉におけるＳｌ－ＨＩＳＥ１のタンパク質コード配列を特定するために、RNeasy Plant Mini KitおよびＤＮａｓｅ Ｉを用いて、３週齢の野生型のトマトの葉からトータルＲＮＡを分離した。逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅを使用して、得られたトータルＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。Ｓｌ－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡ（－１７７～＋２，１１０ｂｐ）は、プライマー5’-GCAGGCTCCGCGGCCTTGCAACCCCTACCCTATCT-3'（配列番号５）および5'-AGCTGGGTCGGCGCGTTCTACATATCTGTCTCCAC-3'（配列番号６）を使用して、葉をテンプレートとして用いｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。その後、終止コドンなしのＡＴ１Ｇ１９３１０（＋１～＋６８７ｂｐ、；ここで、＋１ｂｐは転写開始部位を指す）（１９３１０ｃ－ｓｔｏｐともいう）を、プライマー5'-CACCATGTCTGATGTCCCTTCTTG-3'（配列番号７）および 5'-GCTCAAGAAGAGAGAAAACA-3'（配列番号８）を使用して、シロイヌナズナｃＤＮＡをテンプレートとして用いＰＣＲ増幅した。１９３１０ｃ－ｓｔｏｐのＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯクローニングを介してｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯにクローニングして、サブクローニングベクターｐＥＮＴＲ－１９３１０を生成した。ｐＥＮＴＲ－１９３１０ベクターを２つの制限酵素ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩで消化した。次に、消化されたＤＮＡフラグメント（２，５５５ｂｐ、ｐＥＮＴＲ－ＣＵＴともいう）を精製し、サブクローニングに使用した。上記ｐＥＮＴＲ－１９３１０はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を利用したサブクローニングを行うためのベクターとして作製した。次に、エントリークローンを作成するために、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を使用して、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡのＰＣＲ産物をｐＥＮＴＲ－ＣＵＴとライゲーションした。前記ベクターのＤＮＡ配列解析により、クローン化されたＳ１－ＨＩＳＥ１ ｃＤＮＡのＤＮＡ配列も配列番号２の通りであり、ＬＯＣ１０１２６５５３３の参照配列に対応することが明らかとなった。
【0073】
試験例２：ベクターの構築とトマトの形質転換
トマトＳｌ－ＨＩＳＥ１の機能を調べるために、clustered regularly interspaced short palindromic repeats（ＣＲＩＳＰＲ）-Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１欠損変異体（単に、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１変異体ともいう）を生成した。Ｓｌ－ＨＩＳＥ１の６番目のエクソンをターゲットとするシングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築し、この構築物を用いて野生型ｃｖ（園芸品種）Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍにアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を介した形質転換を行った。
トマトＳｌ－ＨＩＳＥ１の機能を調べるために、clustered regularly interspaced short palindromic repeats（ＣＲＩＳＰＲ）-Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１欠損変異体（単に、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１変異体ともいう）を生成した。Ｓｌ－ＨＩＳＥ１の６番目のエクソンをターゲットとするシングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを構築し、この構築物を用いて野生型ｃｖ（園芸品種）Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍにアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を介した形質転換を行った。
【0074】
具体的には、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１変異体を生成するために、ＮＰＴＩＩ発現カセットを含むｐＤｅ－ＣＡＳ９（Fauser, F. et al., Plant J (2014), 79, pp.348-359の記載に基づき作成）とｐＥｎＣｈｉｍｅｒａ（Fauser, F. et al., Plant J (2014), 79, pp.348-359の記載に基づき作成）とを使用してゲノム編集用のベクターを構築した。ここで、オリジナルのｐＤｅ－ＣＡＳ９ベクターはＤｒ．Ｈ．Ｐｕｃｈｔａ（Fauser, F. et al., Plant J (2014), 79, pp.348-359）から提供されたものであり、オリジナルのｂａｒカセットをＮＰＴＩI発現カセットに置き換えている。ターゲット部位を配列番号２の塩基番号７８１から塩基番号８０３とした。なお、塩基番号７８１から塩基番号７８３のＣＣＣがプロトスペーサー隣接モチーフ（Proto-spacer adjacent motif；ＰＡＭ）である。ターゲット部位のガイドＲＮＡは以下のように設計された。まず、２つのオリゴＤＮＡ(5'-ATTGtggcgcaatctagcttcctc-3'（配列番号９）および5'-AAACgaggaagctagattgcgcca-3'（配列番号１０）)について、以下のサーマルサイクラー設定で反応が行われた：９５°Ｃで５分、５秒で９５℃から８５°Ｃに冷却（２°Ｃｓ-１）、８５°Ｃで１分、その後５分で８５℃から２５°Ｃに冷却（０．２°Ｃｓ-１）。ｐＥｎＣｈｉｍｅｒａベクターをＢｂｓＩ－ＨＦで消化し、精製した。ハイブリダイズしたオリゴＤＮＡが、Ｔａｋａｒａ Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＢｂｓＩ消化されたｐＥｎＣｈｉｍｅｒａベクターに挿入された。ライゲーション産物により大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換し、エントリークローンを得た。エントリークローンを、ＮＰＴＩＩ発現カセットを含むｐＤｅ－ＣＡＳ９に対してＬＲ反応させ、ゲノム編集用のＳｌ－ｈｉｓｅ１ベクターを得た。二成分Ｓｌ－ｈｉｓｅ１ベクターをＡ．ツメファシエンスＧＶ２２６０株に導入し、Sun et al., Plant Cell Physiol (2006), 47, pp.426-431に記載の方法に従って、Ａ．ツメファシエンスを介した形質転換によりトランスジェニックトマト植物を生成した。
【0075】
Ｓｌ－ＨＩＳＥ１に変異があるＴ０形質転換体（Ｓｌ－ｈｉｓｅ１）のゲノムＤＮＡについて、次のプライマーセットを使用してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を決定した：5’-acctggtagtgcagtggcttga-3’（配列番号１１）および5’-tcacgcaggatccacgaaagga-3’（配列番号１２）。
【0076】
その結果、上記形質転換体はＳｌ－ＨＩＳＥ１に１ｂｐの欠失を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－Ｓｌ－ＨＩＳＥ１変異株（Ｓｌ－ｈｉｓｅ１）であることが特定された（図２）。Ｓｌ－ＨＩＳＥ１は６５８アミノ酸のタンパク質をコードするが、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１突然変異体は、２７２アミノ酸の短縮型タンパク質をコードした。
【0077】
Ｓｌ－ｈｉｓｅ１変異体は果実の発達に異常があり雄性不稔であるため、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１変異体のめしべに野生型花粉を受粉させて果実とＦ１種子を得た。次に、Ｆ１植物を自家受粉させ、導入遺伝子を含まないＳｌ－ｈｉｓｅ１ヘテロ接合系統をＦ２植物の中から単離した。次に、野生型対立遺伝子に特異的なa derived cleaved amplified polymorphic sequence（ｄＣＡＰＳ）マーカーを用いて、２５０を超える分離Ｆ２個体の遺伝子型を特定した。具体的には、ｄＣＡＰＳ Ｆｉｎｄｅｒ ２．０を使用して、ｄＣＡＰＳマーカーを設計した。ＰＣＲは、トマトゲノムＤＮＡおよび次のプライマーセットを使用して実行された：5'-CCATTTATTTTTAGGGGTACTTGTTACTGCCCGCG-3'（配列番号１３）および5'-CGTTCACGCAGGATCCACGAAAGGAATAAAAAGTC-3'（配列番号１４）。野生型ゲノムに由来するＰＣＲ産物は、ＳａｃＩＩで切断された。
その結果、野生型：ヘテロ接合体：ホモ接合体＝８２：１６２：６であった。これは、カイ二乗検定で決定された予想される１：２：１（野生型：ヘテロ接合体：ホモ接合体）分離比に適合せず（ｐ＜０．００１）、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１ホモ接合変異体に成長異常があることを示唆した。
その結果、野生型：ヘテロ接合体：ホモ接合体＝８２：１６２：６であった。これは、カイ二乗検定で決定された予想される１：２：１（野生型：ヘテロ接合体：ホモ接合体）分離比に適合せず（ｐ＜０．００１）、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１ホモ接合変異体に成長異常があることを示唆した。
【0078】
Ｓｌ－ｈｉｓｅ１変異体は、さまざまな成長障害を示した。Ｓｌ－ｈｉｓｅ１植物は胚軸が短く（図３）、野生型よりもゆっくりと成長した（図４）。さらに、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１植物は正常に花を咲かせたが、果実の発育は妨げられた。したがって、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１がトマトの成長と繁殖力に重要な役割を果たしていることが示唆された。
【0079】
試験例３：雄しべと花粉の観察
Ｓｌ－ｈｉｓｅ１変異体の花は正常に見えたが、果実はほとんど発達しなかった。この部分的不稔表現型を調べるために、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１雄しべおよび花粉を観察した。
Ｓｌ－ｈｉｓｅ１変異体の花は正常に見えたが、果実はほとんど発達しなかった。この部分的不稔表現型を調べるために、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１雄しべおよび花粉を観察した。
【0080】
野生型およびＳｌ－ｈｉｓｅ１の雄しべを顕微鏡で観察した。顕微鏡の画像を図５に示す。Ｓｌ－ｈｉｓｅ１雄しべには花粉粒がほとんど認められないが、野生型雄しべには多くの花粉粒が存在した。したがって、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１変異体は花粉の発達に欠陥があると考えられる。
【0081】
花粉の生存能力はアレキサンダー染色を使用して評価した。アレキサンダー染色は、Alexander, M.P. (1969), Stain Technol 44, pp.117-122の方法に、若干の変更を加えて行った。具体的には、トマトの花をアレキサンダー染色液（１０％エタノール、０．０１％マラカイト グリーン、２５％グリセロール、５％フェノール、５％抱水クロラール、０．０５％酸性フクシン、０．００００２５％オレンジＧ、および１％氷酢酸）に５０℃で２４時間浸漬した。染色された花の花粉粒を顕微鏡（ＢＺ－Ｘ８００、キーエンス社）で観察した。その結果を図６に示す。野生型の花粉やＳｌ－ｈｉｓｅ１ヘテロ接合体の花粉は鮮やかに染色されている一方、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１ホモ接合体の花粉は染色されず、不規則にしわが寄っていた。したがって、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１花粉の生存能力がなかったことが示唆された。一方、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１雌しべに野生型花粉を受粉させた場合、果実と種子が得られ、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１雌しべと胚珠が機能していることが示された。したがって、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１欠損により花粉の発達障害が引き起こされたものと考えられる。
【0082】
試験例４：脂肪滴の観察
トマトの果実（ここで、果実は、外果皮、中果皮、内果皮を含む。なお、トマトにおいては、中果皮および内果皮が果肉に相当する。）は、種子を取り囲む。果実は母体組織（めしべ）に由来するため、野生型で受粉したＳｌ－ｈｉｓｅ１果実はＳｌ－ｈｉｓｅ１遺伝子型を持っている。したがって、これらの果実はＳｌ－ｈｉｓｅ１変異体である（図７）。
トマトの果実（ここで、果実は、外果皮、中果皮、内果皮を含む。なお、トマトにおいては、中果皮および内果皮が果肉に相当する。）は、種子を取り囲む。果実は母体組織（めしべ）に由来するため、野生型で受粉したＳｌ－ｈｉｓｅ１果実はＳｌ－ｈｉｓｅ１遺伝子型を持っている。したがって、これらの果実はＳｌ－ｈｉｓｅ１変異体である（図７）。
【0083】
ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３染色を使用して、トマトの果実におけるＬＤ形成に対するＳｌ－ｈｉｓｅ１変異の影響を調べた。具体的には、ＬＤを観察するために、トマトの果実を５μｇ／ｍＬ ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で染色し、蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ８００、キーエンス社）を用いて観察した。ＢＯＤＩＰＹ蛍光は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）フィルターを用いて観察した。
【0084】
果実の結果を図８に示す。野生型の果実にはほとんどＬＤが検出できなかったが、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１変異体の果実には多くのＬＤが検出された（図８）。この結果は、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１欠損が果実におけるＬＤの過剰蓄積を引き起こしたことを示唆している。
【0085】
果実と同様に、トマトの葉におけるＬＤ形成に対するＳｌ－ｈｉｓｅ１変異の影響を調べた。葉の結果を図９に示す。野生型の２週齢の本葉ではＬＤはほとんど検出されなかったものの、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１変異体の本葉にはいくつかのＬＤが検出された（図９）。さらに、葉におけるＬＤの数およびＬＤの面積を測定した。ここで、面積については、顕微鏡写真のＬＤの面積についてソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて計算を行った。その結果、１，０００μｍ２あたりのＬＤの数（ｎ＝５）は、野生型では０．０５±０．０８(平均±標準偏差、以下同じ)、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１変異体では４．２±１．６であった。また、１，０００μｍ２あたりのＬＤの面積（ｎ＝８）は、野生型では０．４±０．８μｍ２、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１変異体では５１．０±３．６μｍ２であった。野生型の葉よりもＳｌ－ｈｉｓｅ１変異体の方が有意に大きかった（ｐ＜０．０５、Ｔｕｋｅｙの検定）。これらの結果より、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１欠乏がトマトの葉のＬＤ増加につながることが示唆された。
【0086】
試験例５：トマトの葉と果実のリピドーム分析
トマトの葉の脂質組成に対するＳｌ－ＨＩＳＥ１欠乏の影響を調べるために、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて、リピドーム分析を行った。具体的には、ステロールエステル（ＳＥ）およびドリコールの分析を行った。まず、トマトの葉（約５０ｍｇ）をチューブに集め、液体窒素を使用して凍結した。これらのサンプルは、Ｓｈａｋｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｎｅｏ（ＢＭＳ社）により、ジルコニアビーズを使用して９００ｒｐｍで５分間振とうすることにより粉砕された。解凍を避けるために、サンプルとＳｈａｋｅ Ｍａｓｔｅｒアダプターは、各粉砕プロセスの直前に液体窒素で凍らせた。１６倍量の抽出溶媒（１μＭの１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むメチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル／メタノール＝３／１（ｖ／ｖ））をチューブ中の粉砕されたサンプルに入れ、激しく混合した。得られたホモジネートに４倍量の水を加えた。ボルテックスミキサーで激しく攪拌し、氷上、暗所で１５分間インキュベーションした後、ホモジネートを３，０００×ｇで５分間、４°Ｃで遠心分離した。上層（１６０μＬ）を新しい１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移した。遠心濃縮器（ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ ＳＰＤ２０１０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、有機相を室温で蒸発乾固させた。残渣を２００μＬのエタノールに溶解し、１５分、４°Ｃ、１０，０００×ｇで遠心分離した。得られた上清をガラスインサート付きのバイアルに移し、Okazaki, Y. and Saito, K. (2018) Methods Mol Biol 1778, pp.157-169に記載の方法に従ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行った。ＳＥおよびドリコールの含有量は、内部標準である１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＣ２０：０）の［Ｍ＋Ｈ］＋種に対するＳＥおよびドリコールの［Ｍ＋ＮＨ４］＋の相対強度として表示した。
トマトの葉の脂質組成に対するＳｌ－ＨＩＳＥ１欠乏の影響を調べるために、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて、リピドーム分析を行った。具体的には、ステロールエステル（ＳＥ）およびドリコールの分析を行った。まず、トマトの葉（約５０ｍｇ）をチューブに集め、液体窒素を使用して凍結した。これらのサンプルは、Ｓｈａｋｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｎｅｏ（ＢＭＳ社）により、ジルコニアビーズを使用して９００ｒｐｍで５分間振とうすることにより粉砕された。解凍を避けるために、サンプルとＳｈａｋｅ Ｍａｓｔｅｒアダプターは、各粉砕プロセスの直前に液体窒素で凍らせた。１６倍量の抽出溶媒（１μＭの１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むメチル ｔｅｒｔ－ブチルエーテル／メタノール＝３／１（ｖ／ｖ））をチューブ中の粉砕されたサンプルに入れ、激しく混合した。得られたホモジネートに４倍量の水を加えた。ボルテックスミキサーで激しく攪拌し、氷上、暗所で１５分間インキュベーションした後、ホモジネートを３，０００×ｇで５分間、４°Ｃで遠心分離した。上層（１６０μＬ）を新しい１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移した。遠心濃縮器（ＴｈｅｒｍｏＳａｖａｎｔ ＳＰＤ２０１０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、有機相を室温で蒸発乾固させた。残渣を２００μＬのエタノールに溶解し、１５分、４°Ｃ、１０，０００×ｇで遠心分離した。得られた上清をガラスインサート付きのバイアルに移し、Okazaki, Y. and Saito, K. (2018) Methods Mol Biol 1778, pp.157-169に記載の方法に従ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行った。ＳＥおよびドリコールの含有量は、内部標準である１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＣ２０：０）の［Ｍ＋Ｈ］＋種に対するＳＥおよびドリコールの［Ｍ＋ＮＨ４］＋の相対強度として表示した。
【0087】
次に、遊離ステロール（ＦＳ）の分析を行った。ここで、ＦＳとは、コレステロール、カンペステロール、スチグマステロール、β－シトステロール、Ｃ３０Ｈ５０Ｏステロールおよび２４－メチレンシクロアルタノールをいう。ＦＳの分析のうち、ピコリノイル誘導体化は、Yamashita, K. et al., J Chromatogr A (2007), 1173, pp.120-128に記載の方法に、若干の変更を加えて行った。上記ＳＥ等のリピドーム分析用に調製したサンプル溶液（７５μＬ）を、３．０μＭのコレステロール－ｄ７（コレステロール－２５，２６，２６，２６，２７，２７，２７－ｄ７、ＣＤＮ同位体）を含む１００μＬのエタノールと混合した。その後、遠心濃縮器を用いて有機溶媒を蒸発乾固させた。誘導体化試薬５０μＬを残渣に加え、室温で３０分間インキュベートした。ここで、誘導体化試薬は、ピコリン酸（９０ｍｇ）、４－ジメチルアミノピリジン（３０ｍｇ）、２－メチル－６－ニトロ安息香酸無水物（１５０ｍｇ）、テトラヒドロフラン（３ｍＬ）、およびトリエチルアミン（０．６ｍＬ）からなる。得られた反応混合物に、酢酸エチル（４００μＬ）および水（１，０００μＬ）を加え、激しく混合し、氷上に１０分間置いた。４，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上層（２００μＬ）を回収し、遠心濃縮機を用いて室温で乾燥させた。残渣をエタノール（２００μＬ）に溶解し、４，０００×ｇで１０分間、４°Ｃで遠心分離した。得られた上清を、ＬＣ四重極飛行時間型（ＱＴＯＦ）ＭＳ（ＬＣ：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム、ＭＳ：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｑ－Ｔｏｆ）を用いて、Okazaki, Y. and Saito, K. (2018) Methods Mol Biol 1778, pp.157-169に記載の方法に従ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ここで、ＦＳの含有量とは、コレステロール、カンペステロール、スチグマステロール、β－シトステロール、Ｃ３０Ｈ５０Ｏステロールおよび２４－メチレンシクロアルタノールの含有量の合計をいう。なお、ＦＳの含有量は各化合物の標準曲線に基づいて計算した。
【0088】
得られた結果を図１０に示す。ステロールエステル（ＳＥ）はＳｌ－ｈｉｓｅ１の葉に豊富に含まれていたものの、野生型の葉では検出されず、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１の葉に１００倍以上含まれていた（図１０）。ドリコールも同様であった（図１０）。ＦＳの含有量は、野生型の葉よりもＳｌ－ｈｉｓｅ１の葉の方が約３倍高かった（図１０）。ステロール生合成経路を図１に示す。なお、ＦＳの中で、両方の遺伝子型において、ｍ／ｚ５３２．４２（ＩＤ＝ｌｃｐ０８７７、イオンピーク［ピコリン酸エステル＋Ｈ］＋）において非常に豊富な化合物を検出した。ＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳの結果は、この化合物がＣ３０Ｈ５０Ｏステロールであることを示した。さらに、ステロール生合成経路の中間ステロールである２４－メチレンシクロアルタノールはＳｌ－ｈｉｓｅ１の葉で検出されたものの、野生型の葉では検出されなかった。これらの結果より、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１欠乏が、ＦＳ（特に、Ｃ３０Ｈ５０Ｏステロールおよび２４－メチルシクロアルタノール）およびＳＥの蓄積を促進することを示している。この点、シロイヌナズナの葉ではＨＩＳＥ１遺伝子の破壊によりステロールエステルが野生型に比べて約５倍多いことを考慮すると、トマトの葉において１００倍以上であることから顕著な増大といえる。
【0089】
トマトの果実のリピドーム分析は以下のように行った。トマトの果実を凍結乾燥し、Ｓｈａｋｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｎｅｏで粉砕した。乾燥果実粉末（５ｇ）を１６０倍量の抽出溶媒で抽出した。上層（１６０μＬ）を５０倍量の水で洗浄後、濃縮乾固し、エタノール２００μＬで溶解し、上記葉のＳＥ等のリピドーム分析と同様にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。さらに、ＦＳの分析に関しても上記葉と同様に行った。
【0090】
得られた結果を図１１に示す。ＳＥの含有量は、野生型の果実よりもＳｌ－ｈｉｓｅ１の果実の方が約１０倍高く、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１の果実にもＳＥが過剰に蓄積していた（図１１）。ドリコールはＳｌ－ｈｉｓｅ１の葉に含まれていたものの、野生型の葉では検出されなかった（図１１）。ＦＳの含有量は、野生型の果実よりもＳｌ－ｈｉｓｅ１の果実の方が約１１倍高かった（図１１）。ＦＳについては、葉と同様に、果実には主にＣ３０Ｈ５０Ｏステロールが含まれていた。Ｓｌ－ｈｉｓｅ１果実中のＣ３０Ｈ５０Ｏステロールの含有量は、野生型果実よりも２０．８倍高かった。Ｃ３０Ｈ５０Ｏステロールは、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１および野生型果実でそれぞれ総ＦＳの約８３．７％および約４６．９％を占めていた。Ｓｌ－ｈｉｓｅ１果実では２４－メチレンシクロアルタノールが検出されたが、野生型果実では検出されなかった。これらの結果は、Ｓｌ－ｈｉｓｅ１葉のように、ＦＳとＳＥがＳｌ－ｈｉｓｅ１果実に過剰に蓄積することを示唆した。まとめると、これらの結果は、Ｓｌ－ＨＩＳＥ１が主にＦＳ、ＳＥおよびドリコールの生成に影響を与えることを示唆した。
【0091】
＜配列情報＞
【表1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】