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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024133016
(43)【公開日】2024-10-01
(54)【発明の名称】β－ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法
(51)【国際特許分類】
C07H 19/048 20060101AFI20240920BHJP
【ＦＩ】
C07H19/048
【審査請求】未請求
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024040265
(22)【出願日】2024-03-14
(31)【優先権主張番号】P 2023042342
(32)【優先日】2023-03-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000006035
【氏名又は名称】三菱ケミカル株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100142309
【弁理士】
【氏名又は名称】君塚 哲也
(74)【代理人】
【識別番号】100140774
【弁理士】
【氏名又は名称】大浪 一徳
(72)【発明者】
【氏名】杉山 友亮
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 栄治
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 薫平
【テーマコード（参考）】
4C057
【Ｆターム（参考）】
4C057AA10
4C057BB02
4C057CC03
4C057DD03
4C057LL05
4C057LL18
4C057LL21
(57)【要約】
【課題】不純物を含有するＮＭＮから、より高純度のＮＭＮを得ることができるβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供すること。
【解決手段】酸性条件下、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液を活性炭に供し、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを活性炭に吸着させる工程（Ａ）、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを吸着させた活性炭を酸性水溶液で洗浄する工程（Ｂ）、及び、洗浄後の活性炭からβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを脱着及び溶出させ、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液を回収する工程（Ｃ）を含むβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製工程を含む、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】酸性条件下、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液を活性炭に供し、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを活性炭に吸着させる工程（Ａ）、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを吸着させた活性炭を酸性水溶液で洗浄する工程（Ｂ）、及び、洗浄後の活性炭からβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを脱着及び溶出させ、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液を回収する工程（Ｃ）を含むβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製工程を含む、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程（Ａ）～（Ｃ）を含むβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製工程を含む、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。
工程（Ａ）：酸性条件下、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液を活性炭に供し、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを活性炭に吸着させる。
工程（Ｂ）：β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを吸着させた活性炭を酸性水溶液で洗浄する。
工程（Ｃ）：洗浄後の活性炭からβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを脱着及び溶出させ、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液を回収する。
工程（Ａ）：酸性条件下、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液を活性炭に供し、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを活性炭に吸着させる。
工程（Ｂ）：β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを吸着させた活性炭を酸性水溶液で洗浄する。
工程（Ｃ）：洗浄後の活性炭からβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを脱着及び溶出させ、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液を回収する。
【請求項2】
前記工程（Ａ）～（Ｃ）を、活性炭を担体とするカラムクロマトグラフィーで実施する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記工程（Ｃ）において、水及びエタノールからなる２成分系の水溶液を用いてβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを活性炭から脱着及び溶出させる、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項4】
前記精製工程が更に以下の工程（Ｄ）を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
工程（Ｄ）：前記工程（Ｃ）後のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液を濃縮する。
工程（Ｄ）：前記工程（Ｃ）後のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液を濃縮する。
【請求項5】
前記精製工程が更に以下の工程（Ｅ）を含む、請求項１に記載の製造方法。
工程（Ｅ）：前記工程（Ｃ）後のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液について水及びエタノールの２成分系で晶析を行う。
工程（Ｅ）：前記工程（Ｃ）後のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液について水及びエタノールの２成分系で晶析を行う。
【請求項6】
前記精製工程が更に以下の工程（Ｆ）を含む、請求項５に記載の製造方法。
工程（Ｆ）：前記工程（Ｅ）で得られた結晶について１回以上再結晶を行う。
工程（Ｆ）：前記工程（Ｅ）で得られた結晶について１回以上再結晶を行う。
【請求項7】
前記精製工程が更に以下の工程（Ｇ）を含む、請求項５又は６に記載の製造方法。
工程（Ｇ）：得られたβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの湿結晶を乾燥する。
工程（Ｇ）：得られたβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの湿結晶を乾燥する。
【請求項8】
前記精製工程が、前記工程（Ａ）の前に、以下の工程（Ｘ）～（Ｚ）の少なくとも１つを更に含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
工程（Ｘ）：β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中の不溶物を除去する。
工程（Ｙ）：β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液に塩酸を添加して酸性化する。
工程（Ｚ）：酸性化によってβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に生じた不溶物を除去する。
工程（Ｘ）：β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中の不溶物を除去する。
工程（Ｙ）：β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液に塩酸を添加して酸性化する。
工程（Ｚ）：酸性化によってβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に生じた不溶物を除去する。
【請求項9】
前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液が、リン酸塩、ニコチンアミド、Ｄ－リボース、アデニンリボヌクレオチド類及びマグネシウム塩から選ばれる少なくとも２種を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項10】
前記精製工程に供するβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドが、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）を触媒として製造されたものである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項11】
前記精製工程に供するβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドが、ＡＴＰの再生反応と共役させて製造されたものである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項12】
前記のＡＴＰの再生反応が、ポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の作用によるものである、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項13】
前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドに対する割合が１０質量％以上のニコチンアミドが含まれている、請求項９に記載の製造方法。
【請求項14】
前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドに対する割合がリン酸イオン（ＰＯ４
３－）として１００質量％以上のリン酸塩が含まれている、請求項９に記載の製造方法。
【請求項15】
前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドに対する割合がマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）として２０質量％以上のマグネシウム塩が含まれている、請求項９に記載の製造方法。
【請求項16】
前記工程（Ｂ）の後、かつ前記工程（Ｃ）の前に下記工程（Ｈ）を含む、請求項１３に記載の製造方法。
工程（Ｈ）：活性炭を酸と有機溶媒と水の混合液で洗浄する。
工程（Ｈ）：活性炭を酸と有機溶媒と水の混合液で洗浄する。
【請求項17】
前記精製工程において使用する活性炭が、細孔分布の２～４ｎｍ付近に微分細孔容積のピークを持つ、請求項１６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法に関し、より詳しくは、不純物を含有するβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液から、活性炭を用いた簡便な精製手段により該不純物を除去し、高純度のＮＭＮを製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
β－ニコチンアミドモノヌクレオチド（以下、「ＮＭＮ」ともいう。）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の合成中間体である。近年、ＮＭＮはＮＡＤ＋への変換を通じて長寿遺伝子「サーチュイン」の活性をコントロールすること、ＮＭＮをマウスに投与すると抗老化作用が示されることが明らかにされた。さらに、ＮＭＮは糖尿病、アルツハイマー病、心不全等の疾患の予防や症状の改善に効果があることも報告されている。このようなＮＭＮには、機能性食品、医薬品、化粧品等の成分としての用途が期待されており、生産性の向上を目指して、効率的な製造方法の研究開発が進められている。
【0003】
特許文献１には、酵素反応によりＮＭＮを製造し、一般的な手法で回収精製できることが記載されている。具体的な精製方法としては、イオン交換樹脂を用いる方法（特許文献２～４）、膜濃縮（精密濾過及びナノ濾過）及び逆相高速液体クロマトグラフを組み合わせる方法（特許文献５）、シリカゲルカラムを用いる方法（特許文献６）、合成樹脂を用いる方法（特許文献７）等が知られている。また、ＮＭＮはアルコール系溶媒を中心に各種（混合）溶媒系で晶析できることが知られている（特許文献８～１０）。
【0004】
特許文献１１には、活性炭でＮＭＮ中の疎水性の不純物を除去する方法、及び炭素数１～６のアルコールを用いて晶析する方法が記載されている。そのほか、活性炭を使用した精製方法として、特許文献１２には、活性炭で不純物を除去した後、膜濾過、イオン交換樹脂処理等を経て、エタノールで晶析する方法が記載されている。
非特許文献１には、弱酸性条件でＮＭＮを活性炭に吸着させ、蒸留水で洗浄後、イソアミルアルコール水溶液で溶出させ、それをさらにイオン交換カラムで精製し、アセトン沈殿物として回収する方法が記載されている。非特許文献２には、ｐＨ２の条件でＮＭＮを活性炭に吸着させ、イソアミルアルコール水溶液で溶出させることが記載されている。
非特許文献１には、弱酸性条件でＮＭＮを活性炭に吸着させ、蒸留水で洗浄後、イソアミルアルコール水溶液で溶出させ、それをさらにイオン交換カラムで精製し、アセトン沈殿物として回収する方法が記載されている。非特許文献２には、ｐＨ２の条件でＮＭＮを活性炭に吸着させ、イソアミルアルコール水溶液で溶出させることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１９／０６５８７６号
【特許文献2】特公昭４１－１２７３７公報
【特許文献3】特公昭４３－２５４９５公報
【特許文献4】国際公開第２０１８／０２３２０５号
【特許文献5】国際公開第２０１６／０８６８６０号
【特許文献6】中国特許出願公開第１１２１５９４４５号明細書
【特許文献7】中国特許出願公開第１１０１９５０８９号明細書
【特許文献8】国際公開第２０１７／０５９２４９号
【特許文献9】国際公開第２０１８／０８９８３０号
【特許文献10】国際公開第２０２２／０３３５８９号
【特許文献11】国際公開第２０１８／０４７７１５号
【特許文献12】国際公開第２０２０－１２９９９７号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Archives of Biochemistry and Biophysics Volume 48, Issue 1, January 1954, Pages 189-192
【非特許文献2】Journal of Biological Chemistry Volume 176, Issue 2, 1 November 1948, Pages 665-677
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
以上のように、ＮＭＮの単離精製には多種の手段が適用されているが、簡便かつ効果的な単離精製手法を用いた製造は未だ発展途上にある。機能性食品あるいは医薬品の有効成分となり得るＮＭＮは、当然に高純度であることが望ましい。
【0008】
本発明の課題は、不純物を含有するＮＭＮから、より高純度のＮＭＮを得ることができるβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究をした結果、活性炭の吸脱着を利用した精製、もしくは更に晶析精製を一定条件下で組み合わせることにより、ＮＭＮの効果的な単離精製が可能なことを見出し、本発明を完成させた。
【0010】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］以下の工程（Ａ）～（Ｃ）を含むβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製工程を含む、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。
工程（Ａ）：酸性条件下、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液を活性炭に供し、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを活性炭に吸着させる。
工程（Ｂ）：β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを吸着させた活性炭を酸性水溶液で洗浄する。
工程（Ｃ）：洗浄後の活性炭からβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを脱着及び溶出させ、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液を回収する。
［２］前記工程（Ａ）～（Ｃ）を、活性炭を担体とするカラムクロマトグラフィーで実施する、［１］に記載の製造方法。
［３］前記工程（Ｃ）において、水及びエタノールからなる２成分系の水溶液を用いてβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを活性炭から脱着及び溶出させる、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記精製工程が更に以下の工程（Ｄ）を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｄ）：前記工程（Ｃ）後のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液を濃縮する。
［５］前記精製工程が更に以下の工程（Ｅ）を含む、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｅ）：前記工程（Ｃ）後のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液について水及びエタノールの２成分系で晶析を行う。
［６］前記精製工程が更に以下の工程（Ｆ）を含む、［５］に記載の製造方法。
工程（Ｆ）：前記工程（Ｅ）で得られた結晶について１回以上再結晶を行う。
［７］前記精製工程が更に以下の工程（Ｇ）を含む、［５］又は［６］に記載の製造方法。
工程（Ｇ）：得られたβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの湿結晶を乾燥する。
［８］前記精製工程が、前記工程（Ａ）の前に、以下の工程（Ｘ）～（Ｚ）の少なくとも１つを更に含む、［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｘ）：β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中の不溶物を除去する。
工程（Ｙ）：β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液に塩酸を添加して酸性化する。
工程（Ｚ）：酸性化によってβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に生じた不溶物を除去する。
［９］前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液が、リン酸塩、ニコチンアミド、Ｄ－リボース、アデニンリボヌクレオチド類及びマグネシウム塩から選ばれる少なくとも２種を含む、［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］前記精製工程に供するβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドが、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）を触媒として製造されたものである、［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］前記精製工程に供するβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドが、ＡＴＰの再生反応と共役させて製造されたものである、［１］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］前記のＡＴＰの再生反応が、ポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の作用によるものである、［１１］に記載の製造方法。
［１３］前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドに対する割合が１０質量％以上のニコチンアミドが含まれている、［９］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドに対する割合がリン酸イオン（ＰＯ４ ３－）として１００質量％以上のリン酸塩が含まれている、［９］～［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドに対する割合がマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）として２０質量％以上のマグネシウム塩が含まれている、［９］～［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］工程（Ｂ）の後、かつ前記工程（Ｃ）の前に下記工程（Ｈ）を含む［１３］～［１５］のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｈ）：活性炭を酸と有機溶媒と水の混合液で洗浄する。
［１７］ 前記精製工程において使用する活性炭が、細孔分布の２～４ｎｍ付近に微分細孔容積のピークを持つ、［１６］に記載の製造方法。
［１］以下の工程（Ａ）～（Ｃ）を含むβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの精製工程を含む、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。
工程（Ａ）：酸性条件下、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液を活性炭に供し、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを活性炭に吸着させる。
工程（Ｂ）：β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを吸着させた活性炭を酸性水溶液で洗浄する。
工程（Ｃ）：洗浄後の活性炭からβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを脱着及び溶出させ、β－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液を回収する。
［２］前記工程（Ａ）～（Ｃ）を、活性炭を担体とするカラムクロマトグラフィーで実施する、［１］に記載の製造方法。
［３］前記工程（Ｃ）において、水及びエタノールからなる２成分系の水溶液を用いてβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドを活性炭から脱着及び溶出させる、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記精製工程が更に以下の工程（Ｄ）を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｄ）：前記工程（Ｃ）後のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液を濃縮する。
［５］前記精製工程が更に以下の工程（Ｅ）を含む、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｅ）：前記工程（Ｃ）後のβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド溶液について水及びエタノールの２成分系で晶析を行う。
［６］前記精製工程が更に以下の工程（Ｆ）を含む、［５］に記載の製造方法。
工程（Ｆ）：前記工程（Ｅ）で得られた結晶について１回以上再結晶を行う。
［７］前記精製工程が更に以下の工程（Ｇ）を含む、［５］又は［６］に記載の製造方法。
工程（Ｇ）：得られたβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドの湿結晶を乾燥する。
［８］前記精製工程が、前記工程（Ａ）の前に、以下の工程（Ｘ）～（Ｚ）の少なくとも１つを更に含む、［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｘ）：β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中の不溶物を除去する。
工程（Ｙ）：β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液に塩酸を添加して酸性化する。
工程（Ｚ）：酸性化によってβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に生じた不溶物を除去する。
［９］前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液が、リン酸塩、ニコチンアミド、Ｄ－リボース、アデニンリボヌクレオチド類及びマグネシウム塩から選ばれる少なくとも２種を含む、［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］前記精製工程に供するβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドが、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）を触媒として製造されたものである、［１］～［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］前記精製工程に供するβ－ニコチンアミドモノヌクレオチドが、ＡＴＰの再生反応と共役させて製造されたものである、［１］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］前記のＡＴＰの再生反応が、ポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の作用によるものである、［１１］に記載の製造方法。
［１３］前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドに対する割合が１０質量％以上のニコチンアミドが含まれている、［９］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドに対する割合がリン酸イオン（ＰＯ４ ３－）として１００質量％以上のリン酸塩が含まれている、［９］～［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］前記β－ニコチンアミドモノヌクレオチド水溶液中に、β－ニコチンアミドモノヌクレオチドに対する割合がマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）として２０質量％以上のマグネシウム塩が含まれている、［９］～［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］工程（Ｂ）の後、かつ前記工程（Ｃ）の前に下記工程（Ｈ）を含む［１３］～［１５］のいずれかに記載の製造方法。
工程（Ｈ）：活性炭を酸と有機溶媒と水の混合液で洗浄する。
［１７］ 前記精製工程において使用する活性炭が、細孔分布の２～４ｎｍ付近に微分細孔容積のピークを持つ、［１６］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、簡便な精製手段で純度の高いＮＭＮを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図2】実施例１におけるＨＰＬＣ分析による活性炭カラムからの溶出パターンを洗浄液と溶出液の量に対するＵＶ強度で示した図である。
【図3】実施例１で晶析により得られた結晶及び母液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図4】実施例１で再結晶により得られた結晶及び母液のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図6】参考例におけるＮＭＮ晶析時の塩酸（ＮＭＮクロライドの）含量と母液中のＮＭＮ濃度（溶解度）の関係を示す図である。
【図7】実施例２におけるＨＰＬＣ分析による活性炭カラムからの溶出パターンを洗浄液と溶出液の量に対するＵＶ強度で示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【0014】
実施形態に係るβ－ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法は、以下の工程（Ａ）～（Ｃ）を含むＮＭＮの精製工程を含む。
工程（Ａ）：酸性条件下、ＮＭＮ水溶液を活性炭に供し、ＮＭＮを活性炭に吸着させる。
工程（Ｂ）：ＮＭＮを吸着させた活性炭を酸性水溶液で洗浄する。
工程（Ｃ）：洗浄後の活性炭からＮＭＮを脱着及び溶出させ、ＮＭＮ溶液を回収する。
工程（Ａ）：酸性条件下、ＮＭＮ水溶液を活性炭に供し、ＮＭＮを活性炭に吸着させる。
工程（Ｂ）：ＮＭＮを吸着させた活性炭を酸性水溶液で洗浄する。
工程（Ｃ）：洗浄後の活性炭からＮＭＮを脱着及び溶出させ、ＮＭＮ溶液を回収する。
【0015】
精製工程は工程（Ｂ）の後、かつ前記工程（Ｃ）の前に下記工程（Ｈ）を含んでもよい、
工程（Ｈ）：活性炭を酸と有機溶媒と水の混合液で洗浄する。
工程（Ｈ）：活性炭を酸と有機溶媒と水の混合液で洗浄する。
【0016】
精製工程は、工程（Ｃ）の後に、以下の工程（Ｄ）～（Ｇ）の少なくとも１つを更に含んでいてもよい。
工程（Ｄ）：前記工程（Ｃ）後のＮＭＮ溶液を濃縮する。
工程（Ｅ）：前記工程（Ｃ）後のＮＭＮ溶液について水及びエタノールの２成分系で晶析を行う。
工程（Ｆ）：前記工程（Ｅ）で得られた結晶について１回以上再結晶を行う。
工程（Ｇ）：得られたＮＭＮの湿結晶を乾燥する。
工程（Ｄ）：前記工程（Ｃ）後のＮＭＮ溶液を濃縮する。
工程（Ｅ）：前記工程（Ｃ）後のＮＭＮ溶液について水及びエタノールの２成分系で晶析を行う。
工程（Ｆ）：前記工程（Ｅ）で得られた結晶について１回以上再結晶を行う。
工程（Ｇ）：得られたＮＭＮの湿結晶を乾燥する。
【0017】
精製工程は、工程（Ａ）の前に、以下の工程（Ｘ）～（Ｚ）の少なくとも１つを更に含んでもよい。
工程（Ｘ）：ＮＭＮ水溶液中の不溶物を除去する。
工程（Ｙ）：ＮＭＮ水溶液に塩酸を添加して酸性化する。
工程（Ｚ）：酸性化によってＮＭＮ水溶液中に生じた不溶物を除去する。
工程（Ｘ）：ＮＭＮ水溶液中の不溶物を除去する。
工程（Ｙ）：ＮＭＮ水溶液に塩酸を添加して酸性化する。
工程（Ｚ）：酸性化によってＮＭＮ水溶液中に生じた不溶物を除去する。
【0018】
＜ＮＭＮの調製と不純物＞
以下、精製工程に供するＮＭＮ、及びそれに含まれ得る不純物について説明する。
精製工程に供するＮＭＮは、特に限定されず、天然物から抽出したＮＭＮ、化学合成したＮＭＮ、生体反応を応用して製造したＮＭＮのいずれであっても構わない。「製造」という目的から見れば、収率良く、不純物が少ないＮＭＮであることが望ましいが、本発明の効果を最大限享受できる点では、不純物を多く含有するＮＭＮを精製工程に供することが好ましい。生体反応を応用すれば、温和な条件、かつ高い選択性でＮＭＮが得られるため、本発明の効果と相俟って更に純度の高いＮＭＮを製造することができる。
以下、精製工程に供するＮＭＮ、及びそれに含まれ得る不純物について説明する。
精製工程に供するＮＭＮは、特に限定されず、天然物から抽出したＮＭＮ、化学合成したＮＭＮ、生体反応を応用して製造したＮＭＮのいずれであっても構わない。「製造」という目的から見れば、収率良く、不純物が少ないＮＭＮであることが望ましいが、本発明の効果を最大限享受できる点では、不純物を多く含有するＮＭＮを精製工程に供することが好ましい。生体反応を応用すれば、温和な条件、かつ高い選択性でＮＭＮが得られるため、本発明の効果と相俟って更に純度の高いＮＭＮを製造することができる。
【0019】
生体反応を応用して製造したＮＭＮを精製工程に供する場合、ＮＭＮの具体例としては、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）を触媒として製造されたものが挙げられる。Ｎａｍｐｔは、ＡＴＰの存在下あるいは非存在下において、ホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）とニコチンアミドからのＮＭＮ合成を触媒できる。Ｎａｍｐｔは一般的にはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のサルベージ経路に関与することが知られており、哺乳類等の高等生物からバクテリアである原核生物まで広くその存在が知られている。本発明においては、限定されるものではないが、ＮＭＮを高効率に製造できる点から、バクテリア由来のＮａｍｐｔを用いることが好ましい。
Ｎａｍｐｔとしては、野生株のみならず、例えば、遺伝子の転写及び翻訳活性、あるいは酵素活性を改変又は改良した変異体や組換え体を使用することもできる。
Ｎａｍｐｔとしては、野生株のみならず、例えば、遺伝子の転写及び翻訳活性、あるいは酵素活性を改変又は改良した変異体や組換え体を使用することもできる。
【0020】
Ｎａｍｐｔを用いた反応は選択率良くＮＭＮを製造できるが、転化率に課題がある場合もあり、反応が完結しなければ未反応（過剰）原料や前駆体が残り、不純物となり得る。具体的にはニコチンアミド、ホスホリボシルピロリン酸、さらにはその前駆体であるＤ－リボース、Ｄ－リボース５－リン酸等が不純物して含まれる場合がある。本発明は、これらの不純物が存在してもＮＭＮを効率的に分離することができ、純度の高いＮＭＮを製造することができる。
【0021】
生体反応を応用したＮＭＮの合成には、補酵素（ＡＴＰ他）及びそれらの活性化物質を必要する場合が多い。反応終了後には、これらの補酵素等は夾雑不純物として精製除去対象となる。具体的には、例えば、アデニンリボヌクレオチド類（ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ）、マグネシウム塩が挙げられる。本発明は、これらの不純物が含まれる場合でもＮＭＮを効率的に分離し、純度の高いＮＭＮを製造することができる。
【0022】
より効率良くＮＭＮを合成できる点では、ＡＴＰの再生系と共役したシステムでＮＭＮを製造することが好ましい。ＡＴＰの再生系と組み合わせることで、高価なＡＴＰの使用量を大幅に削減でき、より安価にＮＭＮを製造できる。
ＡＴＰの再生系としては、グルコースをエネルギー供給基質とする系、クレアチンリン酸をリン酸基供与体とするクレアチンキナーゼを用いる系、アセチルリン酸を供与体とする酢酸キナーゼを用いる系、ポリリン酸を供与体とするポリリン酸キナーゼを用いる系等が知られている。本発明においては、いずれの再生系との組み合わせでもよく、リン酸供与体の入手及び系の構築の難易度等の実用性の観点から、ポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）を用いる再生系が適している。同再生系では、副生物として多量のリン酸（塩）が生じるが、本発明ではリン酸（塩）とＮＭＮを効率的に分離し、純度の高いＮＭＮを製造することができる。
ＡＴＰの再生系としては、グルコースをエネルギー供給基質とする系、クレアチンリン酸をリン酸基供与体とするクレアチンキナーゼを用いる系、アセチルリン酸を供与体とする酢酸キナーゼを用いる系、ポリリン酸を供与体とするポリリン酸キナーゼを用いる系等が知られている。本発明においては、いずれの再生系との組み合わせでもよく、リン酸供与体の入手及び系の構築の難易度等の実用性の観点から、ポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）を用いる再生系が適している。同再生系では、副生物として多量のリン酸（塩）が生じるが、本発明ではリン酸（塩）とＮＭＮを効率的に分離し、純度の高いＮＭＮを製造することができる。
【0023】
Ｐｐｋとしては、特に限定されるものでないが、ＮＭＮを効率良く製造できる点から、ポリリン酸キナーゼ２型ファミリーが好ましく、ポリリン酸キナーゼ２型ファミリーのクラス３サブファミリー（Ｐｐｋ２クラス３）がより好ましい。Ｐｐｋとしては、野生株のみならず、例えば、遺伝子の転写及び翻訳活性、あるいは酵素活性を改変又は改良した変異体や組換え体を使用することもできる。
【0024】
本発明において分離除去対象となり得るリン酸（塩）は、特に限定されず、オルトリン酸又はピロリン酸であってもよく、それらが中和されたアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であってもよい。
【0025】
ＡＴＰ再生反応と共役したＮＭＮの合成反応においては、マグネシウム化合物を使用して反応中のｐＨを６．５～８．５に維持することが好ましい。これにより、ＮＭＮをより効率良く製造できる。
マグネシウム化合物としては、例えば、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム等が挙げられる。
マグネシウム化合物としては、例えば、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム等が挙げられる。
【0026】
ＡＴＰ再生反応と共役したＮＭＮ合成に、マグネシウム化合物を使用したｐＨ維持を適用すると、多量のマグネシウム塩が生じて不純物となり得る。しかし、本発明では、このような場合でもマグネシウム塩とＮＭＮを効率的に分離し、純度の高いＮＭＮを製造することができる。
不純物となり得るマグネシウム塩としては、特に限定されず、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。また、マグネシウム化合物を用いたＮＭＮ合成では多量のリン酸マグネシウムが副生するが、リン酸マグネシウムとＮＭＮも効率的に分離できる。
不純物となり得るマグネシウム塩としては、特に限定されず、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等が挙げられる。また、マグネシウム化合物を用いたＮＭＮ合成では多量のリン酸マグネシウムが副生するが、リン酸マグネシウムとＮＭＮも効率的に分離できる。
【0027】
以上、精製工程に供するＮＭＮの合成方法の例、及びそれに依存して含有され得る不純物の例について説明した。一般に、調製したＮＭＮ水溶液にはその製造方法特有の不純物が含まれることも多い。
ＮＭＮの製法や、各不純物の種類及び含有量は特に制限されないが、本発明では、ＮＭＮ水溶液中のリン酸塩、ニコチンアミド、Ｄ－リボース、アデニンリボヌクレオチド類（ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ）、マグネシウム塩等を効果的に除去することが可能である。ＮＭＮ水溶液に含まれる不純物は、１種のみであってもよく、２種以上であってもよい。前述の不純物が２種以上含まれている場合であっても効果的に除去できる。
ＮＭＮの製法や、各不純物の種類及び含有量は特に制限されないが、本発明では、ＮＭＮ水溶液中のリン酸塩、ニコチンアミド、Ｄ－リボース、アデニンリボヌクレオチド類（ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ）、マグネシウム塩等を効果的に除去することが可能である。ＮＭＮ水溶液に含まれる不純物は、１種のみであってもよく、２種以上であってもよい。前述の不純物が２種以上含まれている場合であっても効果的に除去できる。
【0028】
精製工程に供するＮＭＮ水溶液に含まれる各不純物の濃度は、特に制限されないが、ＮＭＮに対して１０００質量ｐｐｍ～１０質量％程度である場合が多い。
製造プロセス特有の不純物を多量に含むケースとしては、例えば、ＮＭＮに対して１０質量％以上のニコチンアミドが含まれているＮＭＮ水溶液、ＮＭＮに対してリン酸イオン（ＰＯ４ ３－）として１００質量％以上のリン酸塩が含まれているＮＭＮ水溶液、ＮＭＮに対してマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）として２０質量％以上のマグネシウム塩が含まれているＮＭＮ水溶液が挙げられる。これら不純物の含有量の上限は、実質的にＮＭＮの精製が可能な範囲であればよく、例えば１００００質量％（＝ＮＭＮに対して１００倍）であり得る。
なお、ＮＭＮあるいは不純物の含有量は、公知な方法により、測定することができる。例えば、後述する実施例に記載のＨＰＬＣを用いる方法で測定することができる。
製造プロセス特有の不純物を多量に含むケースとしては、例えば、ＮＭＮに対して１０質量％以上のニコチンアミドが含まれているＮＭＮ水溶液、ＮＭＮに対してリン酸イオン（ＰＯ４ ３－）として１００質量％以上のリン酸塩が含まれているＮＭＮ水溶液、ＮＭＮに対してマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）として２０質量％以上のマグネシウム塩が含まれているＮＭＮ水溶液が挙げられる。これら不純物の含有量の上限は、実質的にＮＭＮの精製が可能な範囲であればよく、例えば１００００質量％（＝ＮＭＮに対して１００倍）であり得る。
なお、ＮＭＮあるいは不純物の含有量は、公知な方法により、測定することができる。例えば、後述する実施例に記載のＨＰＬＣを用いる方法で測定することができる。
【0029】
＜精製工程＞
以下、本発明の精製工程における各工程について詳細に説明する。
以下、本発明の精製工程における各工程について詳細に説明する。
【0030】
（工程（Ａ））
工程（Ａ）は、酸性条件下、ＮＭＮ水溶液を活性炭に供し、ＮＭＮを活性炭に吸着させる工程である。
「酸性条件」とは、活性炭にＮＭＮを接触させる際の水溶液のｐＨが酸性であることを意味し、具体的にはｐＨ＝４以下を示し、好ましくはｐＨ＝３以下、より好ましくはｐＨ＝１～３である。ｐＨをこの範囲とすることにより、ＮＭＮの分解等が抑えられ、溶解度も適切であるとともに、ＮＭＮを活性炭に効率的に吸着させることができる。
ＮＭＮ水溶液の酸性化に用いる酸としては、特に限定されず、例えば、塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸が挙げられる。なかでも、効果的に酸性化できる点、また残存した場合、ＮａＯＨで中和することで、人体への悪影響が小さいＮａＣｌに変換することができることから、塩酸が好ましい。
工程（Ａ）は、酸性条件下、ＮＭＮ水溶液を活性炭に供し、ＮＭＮを活性炭に吸着させる工程である。
「酸性条件」とは、活性炭にＮＭＮを接触させる際の水溶液のｐＨが酸性であることを意味し、具体的にはｐＨ＝４以下を示し、好ましくはｐＨ＝３以下、より好ましくはｐＨ＝１～３である。ｐＨをこの範囲とすることにより、ＮＭＮの分解等が抑えられ、溶解度も適切であるとともに、ＮＭＮを活性炭に効率的に吸着させることができる。
ＮＭＮ水溶液の酸性化に用いる酸としては、特に限定されず、例えば、塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸が挙げられる。なかでも、効果的に酸性化できる点、また残存した場合、ＮａＯＨで中和することで、人体への悪影響が小さいＮａＣｌに変換することができることから、塩酸が好ましい。
【0031】
工程（Ａ）に用いる活性炭は、ＮＭＮを吸着できるものであればよく、例えば、石炭や木質材料（オガ屑、ヤシ殻、木材チップ等）を原料に薬品賦活あるいはガス賦活法で製造された活性炭を使用することができる。
活性炭の形状は、粉末状、粒状（破砕及び造粒）、シート状、繊維状等のいずれでも構わない。使用する活性炭はあらかじめ、精製工程に供するＮＭＮ水溶液と同程度の酸性の水溶液で洗浄、平衡化しておくことが望ましい。
活性炭の形状は、粉末状、粒状（破砕及び造粒）、シート状、繊維状等のいずれでも構わない。使用する活性炭はあらかじめ、精製工程に供するＮＭＮ水溶液と同程度の酸性の水溶液で洗浄、平衡化しておくことが望ましい。
【0032】
吸着の方法としては、回分式、半回分式、連続式、流動床式、固定床式のいずれの方法でも行うことができる。例えば、活性炭を、不純物を含んだＮＭＮ水溶液に添加して撹拌することで接触させる方法、あるいは活性炭を筒状のカラムに充填し、不純物を含んだＮＭＮ水溶液を該カラムに通液して連続的に接触させる方法等により、ＮＭＮを活性炭に吸着させることができる。効率的な操作及び精製が可能な点では、工程（Ａ）から工程（Ｃ）まで、活性炭を担体とするカラムクロマトグラフィーで実施することが好ましい。
【0033】
ＮＭＮ水溶液と活性炭の接触時間は、ＮＭＮ水溶液のＮＭＮ濃度及び不純物濃度を勘案して設定すればよく、通常１分以上、好ましくは５分以上、より好ましくは１０分以上である。前記接触時間の上限については、特に限定されず、例えば２時間もあれば十分である。接触時間は、例えば５分から１時間程度の範囲で適宜決めることができる。
【0034】
活性炭の使用量は、吸着させようとするＮＭＮの容量、使用する活性炭の表面積、孔の大きさ等の吸脱着性能に応じて設定することができ、例えば、ＮＭＮに対する質量比で１０～２００倍の範囲で適宜決めることができる。
【0035】
（工程（Ｂ））
工程（Ｂ）は、ＮＭＮを吸着した活性炭を酸性水溶液で洗浄する工程である。
ＮＭＮ水溶液との接触後の活性炭においては、活性炭粒の空隙等に残留した溶液が存在する。その部分を酸性水溶液で洗浄することにより、活性炭表面に付着したＮＭＮ水溶液の残液を除去する。また、酸性水溶液によって充分に洗浄することにより、未吸着あるいは吸着親和性の弱い化合物（リン酸塩、マグネシウム塩、Ｄ－リボース等）を除去することができる。
工程（Ｂ）は、ＮＭＮを吸着した活性炭を酸性水溶液で洗浄する工程である。
ＮＭＮ水溶液との接触後の活性炭においては、活性炭粒の空隙等に残留した溶液が存在する。その部分を酸性水溶液で洗浄することにより、活性炭表面に付着したＮＭＮ水溶液の残液を除去する。また、酸性水溶液によって充分に洗浄することにより、未吸着あるいは吸着親和性の弱い化合物（リン酸塩、マグネシウム塩、Ｄ－リボース等）を除去することができる。
【0036】
工程（Ｂ）では、洗浄液として酸性水溶液を用いる。
酸性水溶液に用いる酸としては、特に限定されず、塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸が挙げられる。
酸性水溶液としては、例えば、好ましくは工程（Ａ）で活性炭に接触させるＮＭＮ水溶液と同程度のｐＨの水溶液、あるいは０．０００１～０．２Ｎの塩酸等が挙げられる。
工程（Ｂ）における酸性水溶液の使用量は、特に限定されないが、例えば、使用する活性炭の体積比で２～２０倍量とすることができる。
酸性水溶液に用いる酸としては、特に限定されず、塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸が挙げられる。
酸性水溶液としては、例えば、好ましくは工程（Ａ）で活性炭に接触させるＮＭＮ水溶液と同程度のｐＨの水溶液、あるいは０．０００１～０．２Ｎの塩酸等が挙げられる。
工程（Ｂ）における酸性水溶液の使用量は、特に限定されないが、例えば、使用する活性炭の体積比で２～２０倍量とすることができる。
【0037】
（工程（Ｃ））
工程（Ｃ）は、洗浄後の活性炭からＮＭＮを脱着及び溶出させ、ＮＭＮ溶液を回収する工程である。
活性炭からのＮＭＮの脱着は、活性炭に溶出液を接触させることにより行うことができる。例えば、一回あるいは複数回に分けて、活性炭に対して体積比で１～３０倍量の溶出液を活性炭に接触させる。
工程（Ｃ）は、洗浄後の活性炭からＮＭＮを脱着及び溶出させ、ＮＭＮ溶液を回収する工程である。
活性炭からのＮＭＮの脱着は、活性炭に溶出液を接触させることにより行うことができる。例えば、一回あるいは複数回に分けて、活性炭に対して体積比で１～３０倍量の溶出液を活性炭に接触させる。
【0038】
溶出液としては、極性を有する有機溶媒の水溶液を用いることができ、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール等の炭素数１～３のアルコール水溶液が好ましく、人体への悪影響が小さいという観点から、エタノール及び水からなる２成分系の水溶液がより好ましい。より具体的には、濃度１～７０質量％のエタノール水溶液が更に好ましく、濃度３～５０質量％のエタノール水溶液が特に好ましい。
溶出液に用いる有機溶媒は、１種でもよく、２種以上でもよい。
溶出液に用いる有機溶媒は、１種でもよく、２種以上でもよい。
【0039】
溶出液としてアルコール水溶液を用いて複数回の脱着操作を行う場合は、各回の溶出液のアルコール含量を変化させてもよい。例えば、溶出液のアルコール含量を段階的に増加させることにより、活性炭からＮＭＮを段階的に溶出させることができる。
【0040】
溶出液と活性炭の接触時間は、溶出液の組成及びＮＭＮ中の不純物組成を勘案して設定すればよく、通常５分以上、好ましくは１０分以上、より好ましくは３０分以上である。前記接触時間の上限については、特に限定されず、例えば５時間もあれば十分である。接触時間は、例えば１０分から３時間程度の範囲で適宜決めることができる。
【0041】
工程（Ａ）～（Ｃ）の処理時の温度は、特に制限されないが、通常２～４０℃であり、より好ましくは５～３０℃である。
【0042】
工程（Ａ）～（Ｃ）の処理（以下、まとめて「活性炭処理」ともいう。）は、バッチ式で行ってもよいが、活性炭を筒状のカラムに充填した活性炭カラムの形で実施する方法もある。活性炭カラムに連続的に通液して接触させる方法は、その後の活性炭との分離が容易な点や、活性炭の使用量を少なくできる点から好ましい。
【0043】
カラムに充填される活性炭の種類は、特に限定されず、例えば、粉末、顆粒、破砕状態のものである。また、カラムに活性炭を充填する方法は、特に限定されず、例えば、活性炭に水を添加してスラリーとしたものをカラムに充填し、静置する方法を例示できる。
使用するカラムの材質は、特に限定されるものではなく、例えば金属製、ガラス製、樹脂製等のカラムを用いることができる。カラムの直径や高さも特に限定されるものではなく、カラム分離の特性を考慮して最適化されたサイズ、あるいは任意のサイズのカラムを用いることができる。活性炭へのＮＭＮの吸着、洗浄、及びＮＭＮの溶出は、前述の各溶液をカラムに通液することで効率良く実施できる。
使用するカラムの材質は、特に限定されるものではなく、例えば金属製、ガラス製、樹脂製等のカラムを用いることができる。カラムの直径や高さも特に限定されるものではなく、カラム分離の特性を考慮して最適化されたサイズ、あるいは任意のサイズのカラムを用いることができる。活性炭へのＮＭＮの吸着、洗浄、及びＮＭＮの溶出は、前述の各溶液をカラムに通液することで効率良く実施できる。
【0044】
活性炭カラムへの通液速度は、空間速度（ＳＶ）として、好ましくは０．０１～３０Ｈｒ－１、より好ましくは０．０２～１０Ｈｒ－１、さらに好ましくは０．０３～３Ｈｒ－１である。活性炭からＮＭＮを脱着させるに際しては、アイソクラティック溶出、前述の段階的溶出、クラジェント溶出、及びそれらを組み合わせる方法のいずれを採用してもよい。
【0045】
活性炭は、処理ごとに破棄してもよいし、吸脱着能力が残っている間は再度利用してもよい。例えばカラムに充填して使用する場合は、不純物の除去効果が得られる限り、連続して使用することもできる。使用済活性炭に対して再生処理を行うことにより、活性炭を繰り返し再使用することもできる。使用済活性炭を再生する方法としては、活性炭をアルカリ水溶液、酸水溶液あるいは溶剤並びにそれらの混合液等で処理し、水洗する方法、又は、高温下、不活性ガス又は水蒸気で処理する方法等が挙げられる。
【0046】
工程（Ａ）～（Ｃ）において、活性炭カラムを使用する場合には、ＮＭＮの溶出後に特段分離除去操作を行うことなく、カラムから流出したＮＭＮ溶液（ＮＭＮ画分）をそのまま次の工程に使用することもできる。
工程（Ａ）～（Ｃ）においてカラムを使用しない場合、活性炭と各溶液（ＮＭＮ水溶液、洗浄液及び溶出液）との分離方法は、特に限定されず、例えば、遠心分離、自然濾過、減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過が挙げられる。
工程（Ａ）～（Ｃ）においてカラムを使用しない場合、活性炭と各溶液（ＮＭＮ水溶液、洗浄液及び溶出液）との分離方法は、特に限定されず、例えば、遠心分離、自然濾過、減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過が挙げられる。
【0047】
工程（Ｈ）では、工程（Ａ）でＮＭＮと共に活性炭に吸着した不純物の一部を溶出させる。例えば、ＮＭＮに対して１０質量％以上のニコチンアミドが含まれているＮＭＮ水溶液を工程（Ａ）～（Ｃ）に供する場合、工程（Ｈ）を追加することでより効果的にニコチンアミドを除去できる。その結果、吸脱着処理後の活性炭の吸脱着能力が維持されやすくなることで、複数回再利用ができる。また、酸性条件下では有機溶媒共存下でもＮＭＮが活性炭から脱着されづらくなることから、工程（Ｈ）によってニコチンアミドとＮＭＮの分離がより効果的に行われる。
【0048】
工程（Ｈ）では、洗浄液として、酸と有機溶媒と水の混合液を用いる。
用いる酸としては、特に限定されず、例えば、塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸が挙げられる。混合液に使用する酸は１種でもよく、２種以上でもよい。
混合液中の酸の濃度としては、好ましくは工程（Ｂ）における酸と同程度であり、例えば０．０００１～０．２Ｎの塩酸を含む混合液とすることができる。
用いる酸としては、特に限定されず、例えば、塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸が挙げられる。混合液に使用する酸は１種でもよく、２種以上でもよい。
混合液中の酸の濃度としては、好ましくは工程（Ｂ）における酸と同程度であり、例えば０．０００１～０．２Ｎの塩酸を含む混合液とすることができる。
【0049】
有機溶媒としては極性を有する有機溶媒を用いることができ、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール等の炭素数１～３のアルコールが好ましく、人体への悪影響が小さいという観点から、エタノールが特に好ましい。
混合液中のエタノールの濃度としては１～３０質量％が好ましく、３～２０質量％が特に好ましい。
混合液に使用する有機溶媒は１種でもよく、２種以上でもよい。
混合液中のエタノールの濃度としては１～３０質量％が好ましく、３～２０質量％が特に好ましい。
混合液に使用する有機溶媒は１種でもよく、２種以上でもよい。
【0050】
工程（Ｈ）における混合液の使用量は、特に限定されないが、例えば、使用する活性炭の体積比で２～２０倍量とすることができる。
工程（Ｈ）を追加する場合に使用する活性炭としては、細孔分布の２～４ｎｍ付近に微分細孔容積のピークを持つ活性炭が好ましく、具体的には木質材料（オガ屑、ヤシ殻、木材チップ等）を原料に薬品賦活で製造された活性炭が挙げられる。
工程（Ｈ）を追加する場合に使用する活性炭としては、細孔分布の２～４ｎｍ付近に微分細孔容積のピークを持つ活性炭が好ましく、具体的には木質材料（オガ屑、ヤシ殻、木材チップ等）を原料に薬品賦活で製造された活性炭が挙げられる。
【0051】
（工程（Ｄ））
工程（Ｄ）は、工程（Ｃ）で回収したＮＭＮ溶液を濃縮する工程である。
例えば単蒸留、薄膜蒸留、精密蒸留等の蒸留により、ＮＭＮ溶液からアルコール及び水を留去し、活性炭処理前のＮＭＮより純度の向上したＮＭＮの濃縮物を得る。留出液は回収して再利用できる。必要に応じて、溶媒をほぼ完全に留去させ、乾固物となるまで濃縮すること、又は、一部のみを留去してＮＭＮ濃縮溶液とすることもできる。
工程（Ｄ）は、工程（Ｃ）で回収したＮＭＮ溶液を濃縮する工程である。
例えば単蒸留、薄膜蒸留、精密蒸留等の蒸留により、ＮＭＮ溶液からアルコール及び水を留去し、活性炭処理前のＮＭＮより純度の向上したＮＭＮの濃縮物を得る。留出液は回収して再利用できる。必要に応じて、溶媒をほぼ完全に留去させ、乾固物となるまで濃縮すること、又は、一部のみを留去してＮＭＮ濃縮溶液とすることもできる。
【0052】
濃縮は、ＮＭＮの安定性等を考慮して、減圧下、なるべく熱をかけずに短時間で実施することが好ましい。具体的には濃縮時の内温が６０℃以下、より好ましくは５～５０℃になるように、真空度及び留出速度を適宜設定することが好ましい。真空度は、内温が前述の条件になるように任意に調整すればよい。
工程（Ｄ）後の濃縮溶液のＮＭＮ濃度は、５～９０質量％が好ましく、１０～５０質量％がより好ましい。
工程（Ｄ）後の濃縮溶液のＮＭＮ濃度は、５～９０質量％が好ましく、１０～５０質量％がより好ましい。
【0053】
（工程（Ｅ））
工程（Ｅ）は、工程（Ｃ）後のＮＭＮ溶液について水及びエタノールの２成分系で晶析を行う工程である。活性炭処理後のＮＭＮは、使用目的によっては十分な純度を有しているが、晶析により、更に純度を高めることができる。
工程（Ｅ）は、工程（Ｃ）後のＮＭＮ溶液について水及びエタノールの２成分系で晶析を行う工程である。活性炭処理後のＮＭＮは、使用目的によっては十分な純度を有しているが、晶析により、更に純度を高めることができる。
【0054】
晶析方法は、特に限定されず、冷却（晶析）法、溶媒の除去による濃縮（晶析）法、貧溶媒添加法のいずれであってもよい。
使用する溶媒にも特段の制限はないが、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール等の炭素数１～３のアルコール水溶液が好ましく、人体への悪影響が小さいことから、エタノール及び水からなる２成分系の水溶液がより好ましい。
使用する溶媒にも特段の制限はないが、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール等の炭素数１～３のアルコール水溶液が好ましく、人体への悪影響が小さいことから、エタノール及び水からなる２成分系の水溶液がより好ましい。
【0055】
水はＮＭＮに対して良溶媒として利用でき、炭素数１～３のアルコールは貧溶媒として作用する。両者を組み合わせることによって任意の溶解性の溶媒が調製可能であり、それを用いた任意の方法で晶析が可能である。
晶析方法としては、貧溶媒添加法が好ましく、水を主成分とする溶媒にＮＭＮを溶解させ、貧溶媒としてエタノールを加える方法がより好ましい。より具体的には、例えば、５～５０質量％のＮＭＮ及び０～１０質量％のエタノールを含む水溶液に、終濃度が５０～８０質量％になるようにエタノールを加え、静置又は撹拌等を行う方法が挙げられる。
また、晶析方法として、水を主成分とする溶媒にＮＭＮを溶解させ、貧溶媒に対して添加する逆添加晶析も用いることができる。より具体的には、例えば、エタノールの終濃度が５０～９０質量％になるように、ＮＭＮ及び０～１０質量％のエタノールを含む水溶液を加え、静置又は撹拌等を行う方法が挙げられる。
晶析方法としては、貧溶媒添加法が好ましく、水を主成分とする溶媒にＮＭＮを溶解させ、貧溶媒としてエタノールを加える方法がより好ましい。より具体的には、例えば、５～５０質量％のＮＭＮ及び０～１０質量％のエタノールを含む水溶液に、終濃度が５０～８０質量％になるようにエタノールを加え、静置又は撹拌等を行う方法が挙げられる。
また、晶析方法として、水を主成分とする溶媒にＮＭＮを溶解させ、貧溶媒に対して添加する逆添加晶析も用いることができる。より具体的には、例えば、エタノールの終濃度が５０～９０質量％になるように、ＮＭＮ及び０～１０質量％のエタノールを含む水溶液を加え、静置又は撹拌等を行う方法が挙げられる。
【0056】
晶析に用いる溶媒（例えば、貧溶媒等）は、工程（Ｄ）のＮＭＮ濃縮溶液に加えてもよいし、工程（Ｃ）で回収したＮＭＮ溶液に、必要に応じて部分濃縮あるいは溶媒置換等の処理をしてから加えてもよい。すなわち、工程（Ｃ）で回収したＮＭＮ溶液に対して工程（Ｄ）を行わずに工程（Ｅ）を行ってもよく、工程（Ｄ）後のＮＭＮ濃縮溶液に対して工程（Ｅ）を行ってもよい。
【0057】
晶析の際には種晶を加えてもよい。
晶析の温度は、特に限定されず、晶析に用いる溶媒へのＮＭＮあるいは不純物の溶解度等の情報、目標とする析出量と結晶の品質（化学純度、含量）に応じて設定すればよく、例えば０～６０℃の範囲で実施することができる。冷却（晶析）法を採用する場合は、晶析時にこの範囲で連続的あるいは段階的に温度を下げながら行うこともできる。
晶析の時間は、結晶の成長速度等を考慮して適宜決定すればよく、通常１０分～２日、好ましくは３０分～２４時間、さらに好ましくは１時間～１２時間である。析出した結晶をさらに熟成させることもできる。
晶析の温度は、特に限定されず、晶析に用いる溶媒へのＮＭＮあるいは不純物の溶解度等の情報、目標とする析出量と結晶の品質（化学純度、含量）に応じて設定すればよく、例えば０～６０℃の範囲で実施することができる。冷却（晶析）法を採用する場合は、晶析時にこの範囲で連続的あるいは段階的に温度を下げながら行うこともできる。
晶析の時間は、結晶の成長速度等を考慮して適宜決定すればよく、通常１０分～２日、好ましくは３０分～２４時間、さらに好ましくは１時間～１２時間である。析出した結晶をさらに熟成させることもできる。
【0058】
晶析前のＮＭＮが良溶媒に溶解した水溶液に不溶物が存在する場合は、晶析操作に入る前に遠心分離又は濾過により不溶物を除去することが好ましい。
ＮＭＮの結晶は、例えば固液分離によって回収することができる。固液分離の方法としては、例えば、遠心濾過、加圧濾過、吸引濾過等が挙げられる。結晶への母液の付着を少なくする観点から、遠心濾過が好ましい。
ＮＭＮの結晶は、例えば固液分離によって回収することができる。固液分離の方法としては、例えば、遠心濾過、加圧濾過、吸引濾過等が挙げられる。結晶への母液の付着を少なくする観点から、遠心濾過が好ましい。
【0059】
晶析で得られたＮＭＮは、ＮＭＮの晶析における貧溶媒で洗浄することもできる。好ましくは晶析に用いた溶媒組成と同組成の溶媒で洗浄する。これにより、結晶に付着した母液を洗い流し、より高純度のＮＭＮを得ることができる。
【0060】
工程（Ａ）及び工程（Ｂ）の影響で晶析前のＮＭＮ水溶液には酸性成分が混入する場合がある。酸性成分の混入の程度によっては、両性物質であるＮＭＮは、下記式１に示すように、例えばＮＭＮクロライド等の、本来の解離状態（分子内塩）と異なる状態になることが予想される。
【0061】
【化1】
【0062】
後述の参考例に示すように、過剰な酸成分が存在すると母液へのＮＭＮの溶解度が上昇し、母液中のＮＭＮ及びＮＭＮクロライドの合計量が増え、安定した晶析の妨げになる場合がある。貧溶媒の量によって晶析収率等の調整は可能であるが、本発明の効果を十分に発揮させるには、混入した酸成分を中和することが好ましい。すなわち、工程（Ｅ）は、ＮＭＮがＮＭＮクロライド等になった状態で実施しても構わないが、分子内塩の状態で実施することが好ましい。
【0063】
中和に用いる塩基としては、特に制限はないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等が挙げられる。
【0064】
（工程（Ｆ））
工程（Ｆ）は、工程（Ｅ）で得られた結晶について１回以上再結晶を行う工程である。
工程（Ｅ）で得られたＮＭＮの結晶を溶解させ、再び晶析を行うことにより、不純物をより低減させたＮＭＮを得ることができる。再結晶における晶析操作は、前述の工程（Ｅ）と同様に行うことができ、水とエタノールの２成分系で実施することが好ましい。
工程（Ｆ）は、工程（Ｅ）で得られた結晶について１回以上再結晶を行う工程である。
工程（Ｅ）で得られたＮＭＮの結晶を溶解させ、再び晶析を行うことにより、不純物をより低減させたＮＭＮを得ることができる。再結晶における晶析操作は、前述の工程（Ｅ）と同様に行うことができ、水とエタノールの２成分系で実施することが好ましい。
【0065】
工程（Ｅ）及び工程（Ｆ）の晶析において生じる母液に含まれるＮＭＮは廃棄してもよいが、回収することもできる。例えば固液分離後の母液を工程（Ｄ）と同様に濃縮し、その濃縮物を工程（Ａ）あるいは後述の工程（Ｘ）～（Ｚ）のいずれかに供してＮＭＮを回収してもよい。工程（Ｆ）の母液については、貧溶媒であるエタノールを加え、もう一度結晶を析出（二次晶析）させ、その結晶（二次晶）を回収してもよい。また、母液のＮＭＮ濃度が低い場合には、濃縮して工程（Ｅ）の晶析に供することもできる。母液からＮＭＮを回収することにより、極力ロスを抑えて収率良くＮＭＮを製造することができる。
【0066】
（工程（Ｇ））
工程（Ｇ）は、工程（Ｅ）もしくは工程（Ｆ）で得られたＮＭＮの湿結晶を乾燥する工程である。
乾燥方法としては、特に制限されず、減圧（真空）乾燥、通風乾燥、流動層乾燥等が挙げられる。なかでも、熱分解や溶融を避けて６０℃以下で減圧乾燥することが好ましい。
乾燥時間としては、用いる装置の特性によって支配される部分が大きいが、通常１～４８時間、好ましくは２～２４時間である。
工程（Ｇ）は、工程（Ｅ）もしくは工程（Ｆ）で得られたＮＭＮの湿結晶を乾燥する工程である。
乾燥方法としては、特に制限されず、減圧（真空）乾燥、通風乾燥、流動層乾燥等が挙げられる。なかでも、熱分解や溶融を避けて６０℃以下で減圧乾燥することが好ましい。
乾燥時間としては、用いる装置の特性によって支配される部分が大きいが、通常１～４８時間、好ましくは２～２４時間である。
【0067】
（工程（Ｘ））
工程（Ｘ）は、工程（Ａ）に供する前のＮＭＮ水溶液中の不溶物を除去する工程である。前述のようなＮＭＮの合成反応では、反応の進行に伴って不溶物が生じることがある。このような不溶物が存在する場合は、工程（Ａ）～（Ｃ）に先立ってそれを除くことが好ましい。
除去方法としては、特に制限はないが、例えば遠心分離、濾過が挙げられる。不溶物が存在しない場合は、工程（Ｘ）を実施せずに工程（Ｙ）を実施することができる。
工程（Ｘ）は、工程（Ａ）に供する前のＮＭＮ水溶液中の不溶物を除去する工程である。前述のようなＮＭＮの合成反応では、反応の進行に伴って不溶物が生じることがある。このような不溶物が存在する場合は、工程（Ａ）～（Ｃ）に先立ってそれを除くことが好ましい。
除去方法としては、特に制限はないが、例えば遠心分離、濾過が挙げられる。不溶物が存在しない場合は、工程（Ｘ）を実施せずに工程（Ｙ）を実施することができる。
【0068】
工程（Ｙ）は、ＮＭＮ水溶液に塩酸を添加して酸性化する工程である。
活性炭処理は酸性条件下で実施することが好ましいため、活性炭処理に供するＮＭＮ水溶液が酸性でない場合は、工程（Ａ）の前に工程（Ｙ）を行うことが好ましい。
工程（Ｙ）の酸性化に用いる酸は、特に限定されず、例えば２～１２Ｎの塩酸を使用できる。活性炭処理に供するＮＭＮ水溶液が既に酸性である場合は、工程（Ｙ）を行わなくてもよい。
活性炭処理は酸性条件下で実施することが好ましいため、活性炭処理に供するＮＭＮ水溶液が酸性でない場合は、工程（Ａ）の前に工程（Ｙ）を行うことが好ましい。
工程（Ｙ）の酸性化に用いる酸は、特に限定されず、例えば２～１２Ｎの塩酸を使用できる。活性炭処理に供するＮＭＮ水溶液が既に酸性である場合は、工程（Ｙ）を行わなくてもよい。
【0069】
（工程（Ｚ））
工程（Ｚ）は、工程（Ｙ）の酸性化によってＮＭＮ水溶液に生じた不溶物を除去する工程である。除去方法としては、特に制限はないが、例えば遠心分離、濾過が挙げられる。
工程（Ｙ）を実施した場合には、酸性化によってＮＭＮ水溶液に不溶物が生じることがある。例えば生体触媒によりＮＭＮ合成した場合は、触媒あるいは生体由来成分等が酸性条件で変性したり、不溶な塩を形成したりすることがある。このような場合には、工程（Ｚ）を実施することが好ましい。
工程（Ｚ）は、工程（Ｙ）の酸性化によってＮＭＮ水溶液に生じた不溶物を除去する工程である。除去方法としては、特に制限はないが、例えば遠心分離、濾過が挙げられる。
工程（Ｙ）を実施した場合には、酸性化によってＮＭＮ水溶液に不溶物が生じることがある。例えば生体触媒によりＮＭＮ合成した場合は、触媒あるいは生体由来成分等が酸性条件で変性したり、不溶な塩を形成したりすることがある。このような場合には、工程（Ｚ）を実施することが好ましい。
【0070】
工程（Ｘ）～（Ｚ）を実施することは、生体由来成分の一部を簡便に除去できる点で好ましい。本発明においては、活性炭処理に供するＮＭＮ水溶液中に生体由来成分（核酸、脂質、タンパク質、残存生菌）等が含まれていても構わないが、それら成分を除去あるいは不活性化したＮＭＮ水溶液の方が、活性炭処理の効率が向上し、また活性炭への負荷低減が期待される。
【0071】
工程（Ｘ）及び工程（Ｚ）において、濾過操作を行う場合、必要に応じて、濾過助剤を使用することができる。濾過助剤は、プリコート法、ボディフィード法、あるいはそれらの併用においても用いられる。
濾過助剤としては、例えば、珪藻土とパーライト、セルロース、酸性白土、ベントナイト、粉末活性炭等を使用できる。
濾過助剤としては、例えば、珪藻土とパーライト、セルロース、酸性白土、ベントナイト、粉末活性炭等を使用できる。
【0072】
以上説明したように、本発明では、精製工程において、工程（Ａ）～（Ｃ）の活性炭の吸脱着を利用した精製を実施することにより、不純物を効果的に取り除き、純度の高いＮＭＮの製造することができる。
また、本発明における精製工程は、条件を選べば、水以外に使用する溶媒は人体への悪影響が比較的小さく、易分解性であるエタノールのみに限定することができる。このため、溶剤タンク、回収リサイクル等の設備あるいは操作が簡便となり、さらに排水処理の観点からも優れた製造プロセスとなり得る。
また、本発明における精製工程は、条件を選べば、水以外に使用する溶媒は人体への悪影響が比較的小さく、易分解性であるエタノールのみに限定することができる。このため、溶剤タンク、回収リサイクル等の設備あるいは操作が簡便となり、さらに排水処理の観点からも優れた製造プロセスとなり得る。
【実施例0073】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
【0074】
［実施例１］
精製工程に供するＮＭＮ水溶液として、生体反応を応用したＮＭＮ合成の反応終了液を用いた。組成は以下のとおりである。
（反応終了液の組成）
・ＮＭＮ：１．０質量％
・ニコチンアミド：ＮＭＮに対する割合が３３質量％
・リン酸塩：ＮＭＮに対する割合がリン酸（ＰＯ４ ３－）として２３４質量％
・マグネシウム塩：ＮＭＮに対する割合がマグネシウム（Ｍｇ２＋）として３５質量％
精製工程に供するＮＭＮ水溶液として、生体反応を応用したＮＭＮ合成の反応終了液を用いた。組成は以下のとおりである。
（反応終了液の組成）
・ＮＭＮ：１．０質量％
・ニコチンアミド：ＮＭＮに対する割合が３３質量％
・リン酸塩：ＮＭＮに対する割合がリン酸（ＰＯ４ ３－）として２３４質量％
・マグネシウム塩：ＮＭＮに対する割合がマグネシウム（Ｍｇ２＋）として３５質量％
【0075】
前記反応終了液（ＮＭＮ水溶液）を０．４５μｍフィルターで濾過し、前記反応終了液中の不溶物を除去した（工程（Ｘ））。次いで、濾液１５３ｇに６Ｎ塩酸（富士フィルム和光純薬）を１０．０６ｇ添加してｐＨ１．５とし（工程（Ｙ））、酸性化に伴って生じた白濁を０．４５μｍフィルターで除去した（工程（Ｚ））。
富士フィルム和光純薬社製の活性炭（粉末）約４５ｇを０．０６Ｎ塩酸約４００ｍＬに一晩懸濁した後、２００ｍＬ容の加圧濾過器（アドバンテック東洋社製、型番ＫＳＴ－４７）に詰め、活性炭カラムを作製した。前記活性炭カラムは、０．０３Ｎ塩酸で洗浄し、平衡化した後に使用した。
工程（Ｚ）後の濾液１５９ｇを前記活性炭カラムに供し、ＮＭＮを活性炭に吸着させた（工程（Ａ））。ＮＭＮを吸着させた後、０．０３Ｎ塩酸１４７３ｇでカラム内の活性炭を洗浄した（工程（Ｂ））。続いて、２０質量％（Ｗ／Ｗ）エタノール水溶液７５０ｇでＮＭＮを溶出させた（工程（Ｃ））。洗浄液及び溶出液は５０ｇ程度ずつフラクション分けして回収した。
富士フィルム和光純薬社製の活性炭（粉末）約４５ｇを０．０６Ｎ塩酸約４００ｍＬに一晩懸濁した後、２００ｍＬ容の加圧濾過器（アドバンテック東洋社製、型番ＫＳＴ－４７）に詰め、活性炭カラムを作製した。前記活性炭カラムは、０．０３Ｎ塩酸で洗浄し、平衡化した後に使用した。
工程（Ｚ）後の濾液１５９ｇを前記活性炭カラムに供し、ＮＭＮを活性炭に吸着させた（工程（Ａ））。ＮＭＮを吸着させた後、０．０３Ｎ塩酸１４７３ｇでカラム内の活性炭を洗浄した（工程（Ｂ））。続いて、２０質量％（Ｗ／Ｗ）エタノール水溶液７５０ｇでＮＭＮを溶出させた（工程（Ｃ））。洗浄液及び溶出液は５０ｇ程度ずつフラクション分けして回収した。
【0076】
活性炭処理前のＮＭＮ水溶液と活性炭カラムからの溶出液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析結果を図１に示す。なお、ＨＰＬＣ分析条件は以下のとおりである。
（ＨＰＬＣ分析条件）
・カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３ ４．６ｍｍ×２５ｃｍ
・移動層：０．２％Ｈ３ＰＯ４
・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度：４０℃
・検出：ＵＶ（２６１ｎｍ）検出及びＲＩ検出
（ＨＰＬＣ分析条件）
・カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３ ４．６ｍｍ×２５ｃｍ
・移動層：０．２％Ｈ３ＰＯ４
・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度：４０℃
・検出：ＵＶ（２６１ｎｍ）検出及びＲＩ検出
【0077】
図１に示すように、活性炭処理（精製）前後で、ニコチンアミド、リン酸塩及びマグネシウム塩等が効率的に除去されたことが分かる。
洗浄液及び溶出液の各フラクションをＨＰＬＣで分析し、ＮＭＮとニコチンアミドの相対量を測定した。その結果（溶出パターン）を図２に示す。図２から、活性炭カラムへのＮＭＮ等の吸脱着の様子が分かる。
洗浄液及び溶出液の各フラクションをＨＰＬＣで分析し、ＮＭＮとニコチンアミドの相対量を測定した。その結果（溶出パターン）を図２に示す。図２から、活性炭カラムへのＮＭＮ等の吸脱着の様子が分かる。
【0078】
溶出されたＮＭＮ画分（図２中「⇔」部分）を回収し、エバポレーターで４．３０ｇまで濃縮（バス温４０℃、～１４ｔｏｒｒ）した（工程（Ｄ））。得られた濃縮物に、貧溶媒として９９．５質量％エタノール（富士フィルム和光純薬社製、特級）１．５１ｇを加え、５℃で静置した。次いで、エタノール４．５２ｇを加え、数時間の間隔をあけて更にエタノール１．５４ｇを加えて放置した。その後、桐山ロートを使用して、析出した結晶を回収した（工程（Ｅ））。結晶を少量のエタノールで洗浄（リンス）し、未乾燥状態のＮＭＮ結晶を１．６８ｇ得た。得られたＮＭＮ結晶及び母液のＨＰＬＣ分析結果を図３に示す。
図３に示すように、晶析によってニコチンアミドが母液側に効果的に移行していることを確認できた。
図３に示すように、晶析によってニコチンアミドが母液側に効果的に移行していることを確認できた。
【0079】
得られたＮＭＮ結晶に、ＮＭＮが２５質量％前後になるように水４．６０ｇを加え、加熱溶解させた。貧溶媒として９９．５質量％エタノール（富士フィルム和光純薬社製、特級）２．４４ｇを加え、５℃で一晩放置した。次いで、エタノールの２．２８ｇ、２．２６ｇ及び２．２３ｇを順次加え（最終的なエタノール合計量は９．２１ｇ）、翌日まで５℃で放置した。桐山ロートを使用して、析出した結晶を回収した（工程（Ｆ））。結晶を少量のエタノールで洗浄（リンス）し、未乾燥状態のＮＭＮの結晶を１．３８ｇ得た。得られた湿結晶を常温、真空ポンプ減圧下、質量変化がなくなるまで乾燥し、乾燥状態の結晶を１．３１ｇ得た（工程（Ｇ））。
【0080】
再結晶で得られたＮＭＮの結晶及び母液のＨＰＬＣ分析結果を図４に示す。図４に示すように、再結晶によって更にニコチンアミドが母液側に除かれ、純度の向上したＮＭＮが回収されたことを確認できた。
また、これらの精製工程を経て得られたＮＭＮについて、不純物に注目した分析を行うために、サンプル注入量を増やしてＨＰＬＣ分析した結果を図５に示す。図５に示すように、工程（Ａ）～（Ｃ）を含む精製工程により、多くの不純物が効果的に除かれたことを確認できた。
また、これらの精製工程を経て得られたＮＭＮについて、不純物に注目した分析を行うために、サンプル注入量を増やしてＨＰＬＣ分析した結果を図５に示す。図５に示すように、工程（Ａ）～（Ｃ）を含む精製工程により、多くの不純物が効果的に除かれたことを確認できた。
【0081】
［参考例］
ＮＭＮ（分子内塩）及びＮＭＮクロライドの晶析時における挙動の相違について調べた。
ＮＭＮ０．５０ｇに表１に示す量の１Ｎ塩酸及び水を加え、２５質量％のＮＭＮを含有する塩酸水溶液を４種類調製した。なお、１Ｎ塩酸の比重（文献値１．０２）は１とした。
各溶液について、９９．５質量％エタノール（富士フィルム和光純薬特級）１．０ｇを加え、５℃で静置し、結晶を析出させた。間隔をあけてエタノール１．０ｇを２回添加し、合計３．０ｇのエタノール加えた状態で晶析を行った。晶析後の上澄みを０．２２μｍのフィルターで濾過し、その濾液を晶析母液としてＮＭＮ含量をＨＰＬＣで分析した。結果を図６に示す。
ＮＭＮ（分子内塩）及びＮＭＮクロライドの晶析時における挙動の相違について調べた。
ＮＭＮ０．５０ｇに表１に示す量の１Ｎ塩酸及び水を加え、２５質量％のＮＭＮを含有する塩酸水溶液を４種類調製した。なお、１Ｎ塩酸の比重（文献値１．０２）は１とした。
各溶液について、９９．５質量％エタノール（富士フィルム和光純薬特級）１．０ｇを加え、５℃で静置し、結晶を析出させた。間隔をあけてエタノール１．０ｇを２回添加し、合計３．０ｇのエタノール加えた状態で晶析を行った。晶析後の上澄みを０．２２μｍのフィルターで濾過し、その濾液を晶析母液としてＮＭＮ含量をＨＰＬＣで分析した。結果を図６に示す。
【0082】
【表1】
【0083】
図６に示すように、塩酸を加えてＮＭＮクロライドの量が増加すると、母液中のＮＭＮ（又はＮＭＮクロライド）の含量が上昇し、晶析収率に影響を与えることが分かる。
【0084】
［実施例２］
精製工程に供するＮＭＮ水溶液として、生体反応を応用したＮＭＮ合成の反応終了液を用いた。組成は以下のとおりである。
（反応終了液の組成）
・ＮＭＮ：１．４質量％
・ニコチンアミド：ＮＭＮに対する割合が２７質量％
精製工程に供するＮＭＮ水溶液として、生体反応を応用したＮＭＮ合成の反応終了液を用いた。組成は以下のとおりである。
（反応終了液の組成）
・ＮＭＮ：１．４質量％
・ニコチンアミド：ＮＭＮに対する割合が２７質量％
【0085】
前記反応終了液（ＮＭＮ水溶液）を０．４５μｍフィルターで濾過し、前記反応終了液中の不溶物を除去した（工程（Ｘ））。次いで、濾液１９３２１ｇに６Ｎ塩酸（富士フィルム和光純薬）を５００ｇ添加してｐＨ１．５とし（工程（Ｙ））、酸性化に伴って生じた白濁を０．４５μｍフィルターで除去した（工程（Ｚ））。
大阪ガスケミカル社製の活性炭（ＫＬ）約６２ｇを蒸留水約１Ｌに一晩懸濁した後、４００ｍＬ容のガラスカラム（柴田科学社製、型番Ａ６２５８０－ＧＣ－０３）に詰め、活性炭カラムを作製した。前記活性炭カラムは、０．０３Ｎ塩酸で洗浄し、平衡化した後に使用した。
工程（Ｚ）後の濾液２３４．５ｇを前記活性炭カラムに供し、ＮＭＮを活性炭に吸着させた（工程（Ａ））。ＮＭＮを吸着させた後、０．０３Ｎ塩酸１８００．０ｇでカラム内の活性炭を洗浄した（工程（Ｂ））。続いて、１０質量％（Ｗ／Ｗ）エタノール及び０．１質量％（Ｗ／Ｗ）塩酸を含有する水溶液１３５０．０ｇでさらに活性炭を洗浄した（工程（Ｈ））。続いて、４０質量％（Ｗ／Ｗ）エタノール水溶液１２００ｇでＮＭＮを溶出させた（工程（Ｃ））。洗浄液及び溶出液は１５０ｇ程度ずつフラクション分けして回収した。
大阪ガスケミカル社製の活性炭（ＫＬ）約６２ｇを蒸留水約１Ｌに一晩懸濁した後、４００ｍＬ容のガラスカラム（柴田科学社製、型番Ａ６２５８０－ＧＣ－０３）に詰め、活性炭カラムを作製した。前記活性炭カラムは、０．０３Ｎ塩酸で洗浄し、平衡化した後に使用した。
工程（Ｚ）後の濾液２３４．５ｇを前記活性炭カラムに供し、ＮＭＮを活性炭に吸着させた（工程（Ａ））。ＮＭＮを吸着させた後、０．０３Ｎ塩酸１８００．０ｇでカラム内の活性炭を洗浄した（工程（Ｂ））。続いて、１０質量％（Ｗ／Ｗ）エタノール及び０．１質量％（Ｗ／Ｗ）塩酸を含有する水溶液１３５０．０ｇでさらに活性炭を洗浄した（工程（Ｈ））。続いて、４０質量％（Ｗ／Ｗ）エタノール水溶液１２００ｇでＮＭＮを溶出させた（工程（Ｃ））。洗浄液及び溶出液は１５０ｇ程度ずつフラクション分けして回収した。
【0086】
洗浄液及び溶出液の各フラクションをＨＰＬＣで分析し、ＮＭＮとニコチンアミドの相対量を測定した。その結果（溶出パターン）を図７に示す。図７から、活性炭カラムへのＮＭＮ等の吸脱着の様子が分かる。なお、ＨＰＬＣ分析条件は以下のとおりである。
（ＨＰＬＣ分析条件）
・カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３ ４．６ｍｍ×１５ｃｍ
・移動層：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
・流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度：４０℃
・検出：ＵＶ（２６０ｎｍ）検出
（ＨＰＬＣ分析条件）
・カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３ ４．６ｍｍ×１５ｃｍ
・移動層：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
・流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム温度：４０℃
・検出：ＵＶ（２６０ｎｍ）検出
【0087】
続いて前記平衡化、工程Ａ、工程Ｂ、工程Ｈ、工程Ｃを連続して９回実施したが、いずれも図７と同様の吸脱着の挙動を示した。
【0088】
溶出されたＮＭＮ画分（図７中「⇔」部分）を回収し、計１０回分の吸脱着で約６０００ｇの脱着液を得た。この脱着液をエバポレーターで１９８．５ｇまで濃縮（バス温４０℃、１０ｋＰａ）した（工程（Ｄ））。濃縮液のＮＭＮ濃度をＨＰＬＣ分析で作成した検量線を用いて測定したところ、１５％であった（ＮＭＮの標品としてＣｏｍｂｉ－ｂｌｏｃｋｓ社製のＮＭＮを用いて）。貧溶媒として９５ｖｏｌ％エタノール（宝酒造社製、食品グレード）３３３．５ｇを５００ｍｌセパラブルフラスコに加え、撹拌しながら上記濃縮液１．９４ｇを加え、２時間の間隔をあけて更に濃縮液２．０４ｇを加え、その後、１時間おきに約２．０ｇずつ計９５ｇの濃縮液を加えた。ブフナーロートを使用して、析出した結晶を回収した（工程（Ｅ））。結晶を少量のエタノールで洗浄（リンス）し、未乾燥状態のＮＭＮ結晶を２３．３ｇ得た。得られた湿結晶を常温、真空ポンプ減圧下、質量変化がなくなるまで乾燥し、乾燥状態の結晶を１３．５１ｇ得た（工程（Ｇ））。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】