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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024136632
(43)【公開日】2024-10-04
(54)【発明の名称】脱分化脂肪細胞を製造する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20240927BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023047791
(22)【出願日】2023-03-24
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000003193
【氏名又は名称】ＴＯＰＰＡＮホールディングス株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100113435
【弁理士】
【氏名又は名称】黒木 義樹
(74)【代理人】
【識別番号】100169063
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100211100
【弁理士】
【氏名又は名称】福島 直樹
(72)【発明者】
【氏名】北野 史朗
(72)【発明者】
【氏名】松▲崎▼ 典弥
(72)【発明者】
【氏名】ルイス フィオナ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA87X
4B065BC41
4B065BC50
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】成熟脂肪細胞から脱分化脂肪細胞がより効率的に得られる新規な方法を提供すること。
【解決手段】天井面を備える培養容器内で成熟脂肪細胞を天井培養して脱分化脂肪細胞を得る工程を含み、前記天井面の少なくとも一部が細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の被覆材料によって被覆されている、脱分化脂肪細胞を製造する方法。
【選択図】なし
【解決手段】天井面を備える培養容器内で成熟脂肪細胞を天井培養して脱分化脂肪細胞を得る工程を含み、前記天井面の少なくとも一部が細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の被覆材料によって被覆されている、脱分化脂肪細胞を製造する方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
天井面を備える培養容器内で成熟脂肪細胞を天井培養して脱分化脂肪細胞を得る工程を含み、
前記天井面の少なくとも一部が細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の被覆材料によって被覆されている、脱分化脂肪細胞を製造する方法。
前記天井面の少なくとも一部が細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の被覆材料によって被覆されている、脱分化脂肪細胞を製造する方法。
【請求項2】
前記被覆材料がフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ポリリシン及びその塩並びにポリジアリルジメチルアンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記天井培養が血清を含む培地中で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脱分化脂肪細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
脱分化脂肪細胞は成熟脂肪細胞を天井培養することによって得られ（特許文献１）、間葉系幹細胞に類似した多分化能を有することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開第２００４／１１１２１１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、成熟脂肪細胞から脱分化脂肪細胞がより効率的に得られる新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、以下の各発明を包含する。
［１］
天井面を備える培養容器内で成熟脂肪細胞を天井培養して脱分化脂肪細胞を得る工程を含み、前記天井面の少なくとも一部が細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の被覆材料によって被覆されている、脱分化脂肪細胞を製造する方法。
［２］
前記被覆材料がフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ポリリシン及びその塩並びにポリジアリルジメチルアンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である、［１］に記載の方法。
［３］
前記天井培養が血清を含む培地中で行われる、［１］又は［２］に記載の方法。
［１］
天井面を備える培養容器内で成熟脂肪細胞を天井培養して脱分化脂肪細胞を得る工程を含み、前記天井面の少なくとも一部が細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の被覆材料によって被覆されている、脱分化脂肪細胞を製造する方法。
［２］
前記被覆材料がフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ポリリシン及びその塩並びにポリジアリルジメチルアンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である、［１］に記載の方法。
［３］
前記天井培養が血清を含む培地中で行われる、［１］又は［２］に記載の方法。
【発明の効果】
【0006】
本発明によれば、成熟脂肪細胞から脱分化脂肪細胞がより効率的に得られる新規な方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】図１は脱分化プロセスの観察結果を示し、（Ａ）は天井面が被覆されていない培養容器を用い、天井培養開始から０日、３日又は７日時点における脱分化プロセスの顕微鏡観察結果を示し、（Ｂ）は当該天井培養開始から７日時点における、ＣＤ９０及びＹＡＰにより脱分化脂肪細胞を免疫蛍光染色した画像、Ｈｏｅｃｈｓｔ対比染色により核（Ｎｕｃｌｅｉ）を可視化した画像、並びに、脱分化脂肪細胞のＣＤ９０、ＹＡＰ及び核の共局在を示すマージ画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【0008】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値又は下限値は、他の段階の数値範囲の上限値又は下限値と任意に組み合わせることができる。本明細書に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
【0009】
本実施形態に係る脱分化脂肪細胞を製造する方法は、天井面を備える培養容器内で成熟脂肪細胞を天井培養して脱分化脂肪細胞を得る工程（天井培養工程）を含む。当該方法において、天井面の少なくとも一部は細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の被覆材料によって被覆されている。
【0010】
＜成熟脂肪細胞＞
成熟脂肪細胞は脂肪組織を構成する細胞であり、脂肪滴を含み培地中で浮遊する性質を有する細胞である。脂肪細胞の成熟度を示す指標として、脂肪滴の大きさを用いることができる。脂肪滴とは、トリグリセリド（中性脂肪）、コレストロール等の脂質を貯蔵する細胞内小器官であり、上記脂質類がリン脂質の１重膜で覆われることで液滴様の形状を有している。また上記リン脂質の表面には脂肪組織特有のタンパク質（ペリリピン等）の発現が見られる。成熟した脂肪細胞の脂肪滴の大きさにはばらつきがあるが、例えば、脂肪滴の大きさの平均値が２０μｍ以上である場合には、脂肪細胞がある程度成熟している、すなわち、成熟脂肪細胞であるとすることができる。
成熟脂肪細胞は脂肪組織を構成する細胞であり、脂肪滴を含み培地中で浮遊する性質を有する細胞である。脂肪細胞の成熟度を示す指標として、脂肪滴の大きさを用いることができる。脂肪滴とは、トリグリセリド（中性脂肪）、コレストロール等の脂質を貯蔵する細胞内小器官であり、上記脂質類がリン脂質の１重膜で覆われることで液滴様の形状を有している。また上記リン脂質の表面には脂肪組織特有のタンパク質（ペリリピン等）の発現が見られる。成熟した脂肪細胞の脂肪滴の大きさにはばらつきがあるが、例えば、脂肪滴の大きさの平均値が２０μｍ以上である場合には、脂肪細胞がある程度成熟している、すなわち、成熟脂肪細胞であるとすることができる。
【0011】
成熟脂肪細胞は脂肪組織から分離することによって得ることができる。脂肪組織から成熟脂肪細胞を分離する方法は、特に制限されず、公知の分離方法を用いることができる。成熟脂肪細胞は、例えば、脂肪組織を用意すること、当該脂肪組織を切断して脂肪組織片を作製すること、コラゲナーゼを含む溶液中で脂肪組織片をコラゲナーゼ処理すること、コラゲナーゼ処理後の溶液を必要に応じてインキュベート及び濾過した後に遠心分離すること、遠心分離後の溶液において浮遊している成熟脂肪細胞を回収すること等を含む方法によって得ることができる。
【0012】
成熟脂肪細胞の由来は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の哺乳類動物であってよい。
【0013】
＜脱分化脂肪細胞＞
脱分化脂肪細胞（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｆａｔ（ＤＦＡＴ） ｃｅｌｌｓ）は間葉系幹細胞に似た形質を示し、種々の組織に分化する能力を有する。
脱分化脂肪細胞（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｆａｔ（ＤＦＡＴ） ｃｅｌｌｓ）は間葉系幹細胞に似た形質を示し、種々の組織に分化する能力を有する。
【0014】
脱分化脂肪細胞は天井培養の過程で天井面に付着した成熟脂肪細胞中の脂肪滴が失われること等によって形成される。脱分化脂肪細胞であることは線維芽細胞の形態、及び、ＣＤ９０表面マーカー及びＹＡＰの発現等の幹細胞特性を得ていること等によって確認することができる。
【0015】
＜天井培養＞
天井培養は培地で満たされた培養容器中で細胞が培養容器の内側上面（天井面）に接着した状態又は浮遊した状態で培養する方法である。
天井培養は培地で満たされた培養容器中で細胞が培養容器の内側上面（天井面）に接着した状態又は浮遊した状態で培養する方法である。
【0016】
培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等の液体培地が挙げられる。液体培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。
【0017】
培地は、血清を添加した培地であってよく、無血清培地であってもよい。血清としては、例えば、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ））が挙げられる。培地中の血清の濃度は、例えば、培地の全量を基準として、脱分化脂肪細胞がより効率よく得られる観点から、１ｖ／ｖ％以上、３ｖ／ｖ％以上、５ｖ／ｖ％以上、８ｖ／ｖ％以上、１０ｖ／ｖ％以上、１２ｖ／ｖ％以上、１５ｖ／ｖ％以上、又は１８ｖ／ｖ％以上であってよく、３０ｖ／ｖ％以下、２５ｖ／ｖ％以下、２０ｖ／ｖ％以下、１５ｖ／ｖ％以下、１０ｖ／ｖ％以下、又は５ｖ／ｖ％以下であってよい。
【0018】
培養温度は、例えば、２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６．０～８．０、７．０～８．０、又は、７．２～７．６であってもよい。培養時間は、１日以上、３日以上、５日以上又は７日以上であってよく、１４日以下、１２日以下、又は１０日以下であってよい。
【0019】
＜培養容器＞
培養容器は、培養面を備える本体を含む。当該培養面は液体を満たした状態で天井培養を行う際に内側上面（天井面）に位置する面である。当該培養面の一部又は全部は被覆材料によって被覆されている。培養容器は、培養面（天井面）及び培養面と対向する面（底面）以外の面に開口を有し、培養時の液体の漏出を抑制する観点から当該開口を閉じる蓋を備えていてよい。
培養容器は、培養面を備える本体を含む。当該培養面は液体を満たした状態で天井培養を行う際に内側上面（天井面）に位置する面である。当該培養面の一部又は全部は被覆材料によって被覆されている。培養容器は、培養面（天井面）及び培養面と対向する面（底面）以外の面に開口を有し、培養時の液体の漏出を抑制する観点から当該開口を閉じる蓋を備えていてよい。
【0020】
培養容器の材質は、特に制限されないが、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）であってよい。培養容器の材質はポリスチレンであることが好ましい。
【0021】
培養容器の培養面積は、特に制限されないが、例えば、１０．０～１５．０ｃｍ２であってよい。
【0022】
本実施形態に係る方法において用いられる培養容器は、例えば、市販のセルカルチャーフラスコの培養面の少なくとも一部を被覆材料で被覆することを含む方法によって製造することができる。
【0023】
＜被覆材料＞
被覆材料は細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種である。細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種によって天井面が被覆された培養容器を用いて天井培養を行うことによって成熟脂肪細胞から脱分化脂肪細胞をより効率的に製造することが可能になる。具体的には、本実施形態に係る方法を用いる場合、被覆材料によって天井面が被覆されていないこと以外同じ条件（成熟脂肪細胞の播種密度、培養条件等）で培養する方法を用いる場合と比べて、培養後に得られる脱分化脂肪細胞数が増加する。
被覆材料は細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種である。細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種によって天井面が被覆された培養容器を用いて天井培養を行うことによって成熟脂肪細胞から脱分化脂肪細胞をより効率的に製造することが可能になる。具体的には、本実施形態に係る方法を用いる場合、被覆材料によって天井面が被覆されていないこと以外同じ条件（成熟脂肪細胞の播種密度、培養条件等）で培養する方法を用いる場合と比べて、培養後に得られる脱分化脂肪細胞数が増加する。
【0024】
細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種で天井面を被覆した場合、成熟脂肪細胞が天井面により付着しやすくなる傾向がある。成熟脂肪細胞が天井面に付着しやすい条件下で天井培養が行われる結果として脱分化脂肪細胞がより効率的に得られることになると推察されるが、メカニズムはこれに限定されない。
【0025】
（細胞外マトリックス）
細胞外マトリックスは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックスとしては、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン及びカドヘリン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックスは、これらのうち１種を単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
細胞外マトリックスは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックスとしては、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン及びカドヘリン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックスは、これらのうち１種を単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
【0026】
細胞外マトリックスは、上述の細胞外マトリックスの改変体及びバリアントであってもよく、化学合成ペプチド等のポリペプチドであってもよい。細胞外マトリックスは、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列の繰り返しを有するものであってよい。ここで、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表す。複数のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有する細胞外マトリックスにおいて、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の割合は、全アミノ酸配列のうち、８０％以上であってよく、好ましくは９５％以上である。また、細胞外マトリックスは、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドであってもよい。ＲＧＤ配列とは、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（アルギニン残基－グリシン残基－アスパラギン酸残基）で表される配列をいう。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列と、ＲＧＤ配列とを含む細胞外マトリックスとしては、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン等が挙げられる。
【0027】
ラミニンとして、ラミニンとエンタクチンとの複合体（ラミニン／エンタクチン複合体）が使用されてよい。ラミニン／エンタクチン複合体は市販品を使用してもよい。ラミニン／エンタクチン複合体の市販品としては、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）高濃度ラミニン／エンタクチン複合体（製品番号：３５４２５９）が挙げられる。
【0028】
コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン及び非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。コラーゲンはテロペプチドが除去されたコラーゲンであるアテロコラーゲンであってもよい。アテロコラーゲンは例えば、トロポコラーゲンをペプシン処理することにより得ることができる。コラーゲンは、市販されているコラーゲンを使用してよい。Ｉ型コラーゲンの市販品としては、コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＰＣ（５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ３．０、無菌、アテロコラーゲン酸性溶液、製品番号ＩＰＣ－５０）が挙げられる。ＩＶ型コラーゲンの市販品としては、コラーゲンヒト胎盤由来（カタログ番号Ｃ７５２１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられる。コラーゲンは脱分化脂肪細胞がより効率的に得られる観点から、Ｉ型コラーゲン又はＩＶ型コラーゲンであることが好ましい。
【0029】
フィブロネクチンとしては、例えば、血漿フィブロネクチンが挙げられる。フィブロネクチンは市販品を使用してもよい。フィブロネクチンの市販品としては、例えば、ヒト血漿フィブロネクチン（ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号：Ｆ２００６）が挙げられる。
【0030】
細胞外マトリックスは、脱分化脂肪細胞がより効率的に得られる観点から、ラミニン、コラーゲン、及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。
【0031】
細胞外マトリックスは、動物由来の細胞外マトリックスであってよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種として、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、マウス等の哺乳類動物が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックスは、一種類の動物に由来する成分を用いてもよいし、複数種の動物に由来する成分を併用して用いてもよい。
【0032】
細胞外マトリックスは、負のゼータ電位を有していてよい。細胞外マトリックス成分のゼータ電位は例えば０ｍＶ未満又は－１ｍＶ以下であってよく、例えば、－８ｍＶ以上０ｍＶ未満であってよい。本明細書におけるゼータ電位は後述する実施例に記載の方法によって測定される。
【0033】
（カチオン性ポリマー）
カチオン性ポリマーはカチオン性官能基を含む重合性化合物を単量体単位として含むポリマーである。カチオン性官能基としてはアミノ基（－ＮＨ２）、置換アミノ基、アンモニウム基等が挙げられる。カチオン性官能基を含む重合性化合物としては、例えば、リシン（Ｌ－リシン、Ｄ－リシン）、アリルアミン及びこれらの塩、並びにジアリルメチルアンモニウム塩が挙げられる。カチオン性ポリマーには、細胞外マトリックスに該当する物質は含まれない。
カチオン性ポリマーはカチオン性官能基を含む重合性化合物を単量体単位として含むポリマーである。カチオン性官能基としてはアミノ基（－ＮＨ２）、置換アミノ基、アンモニウム基等が挙げられる。カチオン性官能基を含む重合性化合物としては、例えば、リシン（Ｌ－リシン、Ｄ－リシン）、アリルアミン及びこれらの塩、並びにジアリルメチルアンモニウム塩が挙げられる。カチオン性ポリマーには、細胞外マトリックスに該当する物質は含まれない。
【0034】
カチオン性ポリマーとしては、例えば、ポリリシン、ポリアリルアミン、及びこれらの塩、並びにポリジアリルジメチルアンモニウム塩が挙げられる。カチオン性ポリマーは、これらのうち１種を単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
【0035】
ポリリシンの塩及びポリアリルアミンの塩としては、例えば、塩酸塩が挙げられる。ポリジアリルジメチルアンモニウム塩としては、例えば、塩化ポリジアリルジメチルアンモニウムが挙げられる。
【0036】
カチオン性ポリマーは、脱分化脂肪細胞がより効率的に得られる観点から、ポリリシン及びその塩並びにポリジアリルジメチルアンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。
【0037】
カチオン性ポリマーのゼータ電位は０ｍＶ超＋２０ｍＶ以下、又は＋３ｍＶ以上＋１５ｍＶ以下であってよい。ゼータ電位は後述する実施例に記載の方法によって測定することができる。
【0038】
被覆材料と水との接触角は３０°以上、４０°以上、５０°以上、６０°以上、７０°以上、又は８０°以上であってよく、１００°以下、９５°以下、９０°以下、８５°以下、８０°以下、又は７５°以下であってもよい。被覆材料が細胞外マトリックスである場合、細胞外マトリックスと水との接触角は例えば３０～８０°であってよい。被覆材料がカチオン性ポリマーである場合、カチオン性ポリマーと水との接触角は例えば７０～９５°又は８０～９５°であってよい。被覆材料と水との接触角は後述する実施例に記載の方法によって測定される。
【0039】
＜被覆方法＞
培養容器の天井面を被覆する方法は、例えば、被覆材料を含む溶液で天井面の少なくとも一部を被覆すること、被覆された天井面を乾燥させることと、を含む方法を用いることができる。被覆材料を含む溶液は、被覆材料を含む水溶液、又は被覆材料を含むＰＢＳ溶液であってよい。当該方法は、被覆された天井面をＰＢＳ等で洗浄することを含んでいてもよい。
培養容器の天井面を被覆する方法は、例えば、被覆材料を含む溶液で天井面の少なくとも一部を被覆すること、被覆された天井面を乾燥させることと、を含む方法を用いることができる。被覆材料を含む溶液は、被覆材料を含む水溶液、又は被覆材料を含むＰＢＳ溶液であってよい。当該方法は、被覆された天井面をＰＢＳ等で洗浄することを含んでいてもよい。
【0040】
＜被覆量＞
被覆材料による被覆量は、被覆材料の種類に応じて適宜設定してよい。例えば、被覆材料による被覆量は、天井面の全面積を基準として、０．５μｇ／ｃｍ２以上、０．８μｇ／ｃｍ２以上、１．０μｇ／ｃｍ２以上、１．５μｇ／ｃｍ２以上、２．０μｇ／ｃｍ２以上、３．０μｇ／ｃｍ２以上、４．０μｇ／ｃｍ２以上、５．０μｇ／ｃｍ２以上、６．０μｇ／ｃｍ２以上、７．０μｇ／ｃｍ２以上、８．０μｇ／ｃｍ２以上、９．０μｇ／ｃｍ２以上又は９．５μｇ／ｃｍ２以上であってよく、１５．０μｇ／ｃｍ２以下、又は１２．０μｇ／ｃｍ２以下であってよい。
被覆材料による被覆量は、被覆材料の種類に応じて適宜設定してよい。例えば、被覆材料による被覆量は、天井面の全面積を基準として、０．５μｇ／ｃｍ２以上、０．８μｇ／ｃｍ２以上、１．０μｇ／ｃｍ２以上、１．５μｇ／ｃｍ２以上、２．０μｇ／ｃｍ２以上、３．０μｇ／ｃｍ２以上、４．０μｇ／ｃｍ２以上、５．０μｇ／ｃｍ２以上、６．０μｇ／ｃｍ２以上、７．０μｇ／ｃｍ２以上、８．０μｇ／ｃｍ２以上、９．０μｇ／ｃｍ２以上又は９．５μｇ／ｃｍ２以上であってよく、１５．０μｇ／ｃｍ２以下、又は１２．０μｇ／ｃｍ２以下であってよい。
【0041】
コラーゲンによる被覆量は天井面の全面積を基準として５．０～１５．０μｇ／ｃｍ２、又は８．０～１２．０μｇ／ｃｍ２であってよい。ラミニンによる被覆量は天井面の全面積を基準として０．５～１．５μｇ／ｃｍ２、又は０．８～１．２μｇ／ｃｍ２であってよい。フィブロネクチンによる被覆量は天井面の全面積を基準として１．０～１０．０μｇ／ｃｍ２又は４．０～６．０μｇ／ｃｍ２であってよい。カチオン性ポリマーによる被覆量は天井面の全面積を基準として５．０～１５．０μｇ／ｃｍ２、又は６～１０μｇ／ｃｍ２であってよい。
【0042】
＜成熟脂肪細胞の播種密度＞
成熟脂肪細胞の播種密度は天井面の全面積を基準として１．０×１０４／ｃｍ２～１０．０×１０４／ｃｍ２又は２．０×１０４／ｃｍ２～８．０×１０４／ｃｍ２であってよい。ここで播種密度は培養容器に添加される時点の天井面（培養面）の単位面積当たりの細胞数を示す。
成熟脂肪細胞の播種密度は天井面の全面積を基準として１．０×１０４／ｃｍ２～１０．０×１０４／ｃｍ２又は２．０×１０４／ｃｍ２～８．０×１０４／ｃｍ２であってよい。ここで播種密度は培養容器に添加される時点の天井面（培養面）の単位面積当たりの細胞数を示す。
【0043】
＜脱分化脂肪細胞の用途＞
脱分化脂肪細胞は、例えば、移植用生体材料等の用途に用いることができる。
脱分化脂肪細胞は、例えば、移植用生体材料等の用途に用いることができる。
【実施例0044】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0045】
〔実験手順〕
＜１．細胞外マトリックス又はポリマーによる培養容器天井面の被覆（コーティング）＞
Ｉ型コラーゲン溶液（ＡｔｅｌｏＣｅｌｌ（登録商標）ＩＰＣ５０、製品濃度：５ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳ（ｐＨ：７．４）で１２５μｇ／ｍＬに希釈した。ＩＶ型コラーゲン（Ｃ７５２１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びフィブロネクチン（Ｆ２００６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ：７．４、１４２４９－２４、ナカライテスク）で希釈してそれぞれ１２５μｇ／ｍＬ及び６２．５μｇ／ｍＬとした。得られたＩＶ型コラーゲン溶液は、ＩＶ型コラーゲンが溶解するまで冷蔵庫内で４℃の条件でインキュベートした。
＜１．細胞外マトリックス又はポリマーによる培養容器天井面の被覆（コーティング）＞
Ｉ型コラーゲン溶液（ＡｔｅｌｏＣｅｌｌ（登録商標）ＩＰＣ５０、製品濃度：５ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳ（ｐＨ：７．４）で１２５μｇ／ｍＬに希釈した。ＩＶ型コラーゲン（Ｃ７５２１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びフィブロネクチン（Ｆ２００６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ：７．４、１４２４９－２４、ナカライテスク）で希釈してそれぞれ１２５μｇ／ｍＬ及び６２．５μｇ／ｍＬとした。得られたＩＶ型コラーゲン溶液は、ＩＶ型コラーゲンが溶解するまで冷蔵庫内で４℃の条件でインキュベートした。
【0046】
ポリスチレン（ＰＳ）セルカルチャーフラスコ（３５３０１８、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の内側上部表面（内側上部の表面積（培養面積）：１２．５ｃｍ２）をＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン及びフィブロネクチンによってそれぞれの量が１０μｇ／ｃｍ２、１０μｇ／ｃｍ２及び５μｇ／ｃｍ２となるように室温、１時間の条件でコーティングを行った。具体的なコーティング手順は、これらのタンパク質に推奨されるコーティングプロトコル（下記Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（１）及びＲｅｆｅｒｅｎｃｅ（２）参照）に基づいて実施した。
【0047】
ラミニン溶液（３５４２５９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）をＰＢＳ（ｐＨ：７．４）で希釈して１２５μｇ／ｍｌのラミニン溶液を調製した。当該ラミニン溶液の調製は氷上で実施した。１２５μｇ／ｍｌのラミニン溶液を用い、１μｇ／ｃｍ２となるようにＰＳフラスコの内側上部表面を、４℃、一晩の条件でコーティングした。
【0048】
カチオン性ポリマーとして、ポリ－Ｌ－リシン（ＰＬＬ）（Ｐ４７０７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ＰＤＤＡ）（２６０６２－７９－３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びポリアリルアミン（ＰＡＨ）（４７９１３６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、アニオンポリマーとしてゼラチン（０７７－０３１５５、Ｗａｋｏ）及びジェランガム（８Ｈ１１２１Ａ、Ｓａｎｓｈｏ）を用い、次に示す手順でコーティングを実施した。
【0049】
ＰＬＬ溶液の無菌水溶液を用い、８．３３μｇ／ｃｍ２となるようにＰＳフラスコの内側上部表面を室温、５分間の条件でコーティングした。コーティングの具体的手順は、入手元のプロトコル（下記Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（３）参照）に従った。ＰＡＨ、ＰＤＤＡ、ゼラチン及びジェランガムそれぞれのＰＢＳ（ｐＨ：７．４）溶液を調製し、ＰＳフラスコの内側上部表面をＰＬＬと同じコーティング手順及び同じ濃度で室温、５分間の条件でコーティングした。
【0050】
コーティング後のフラスコは、インキュベーション後にＰＢＳ（ｐＨ：７．４）で３回洗浄した。全てのコーティング手順は、汚染を最小限にするためにラミナーフローフード内で実施した。
【0051】
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：
（１）https://www.sigmaaldrich.com/JP/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/mammalian-cell-culture/collagen-product-protocols［検索日：２０２３年２月２８日］
（２）https://www.sigmaaldrich.com/JP/en/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-growth-and-maintenance/fibronectin-product-protocols［検索日：２０２３年２月２８日］
（３）https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/244/731/p4707pis［検索日：２０２３年２月２８日］
（１）https://www.sigmaaldrich.com/JP/en/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/mammalian-cell-culture/collagen-product-protocols［検索日：２０２３年２月２８日］
（２）https://www.sigmaaldrich.com/JP/en/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-growth-and-maintenance/fibronectin-product-protocols［検索日：２０２３年２月２８日］
（３）https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/244/731/p4707pis［検索日：２０２３年２月２８日］
【0052】
＜２．水接触角の測定＞
細胞外マトリックス、カチオン性ポリマー又はアニオン性ポリマーで被覆したＰＳ表面の接触角を静滴法により測定した（ｎ＝３）。ＰＳ顕微鏡スライド（２．５×７．５ｃｍ２）を濡れ性測定用の基材として使用し、上述した条件と同じコーティング条件でコーティングを実施した。１９Ｇマイクロシリンジを用いて、５μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑの液滴が表面に接したときの写真を撮影した。次に接触角の測定には協和接触角計を使用し、画像処理にはＦＡＭＡＳソフトウェアを用いた。
細胞外マトリックス、カチオン性ポリマー又はアニオン性ポリマーで被覆したＰＳ表面の接触角を静滴法により測定した（ｎ＝３）。ＰＳ顕微鏡スライド（２．５×７．５ｃｍ２）を濡れ性測定用の基材として使用し、上述した条件と同じコーティング条件でコーティングを実施した。１９Ｇマイクロシリンジを用いて、５μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑの液滴が表面に接したときの写真を撮影した。次に接触角の測定には協和接触角計を使用し、画像処理にはＦＡＭＡＳソフトウェアを用いた。
【0053】
＜３．ゼータ電位測定＞
細胞外マトリックス、カチオン性ポリマー又はアニオン性ポリマーを含む溶液（コーティング溶液）のゼータ電位をＭａｌｖｅｒｎ ＺｅＴａＳｉｚｅｒで測定した。測定用のセル（Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｆｏｌｄｅｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｃｅｌｌ）にＰＢＳ（ｐＨ：７．４）を用いて調製したコーティング溶液８００μＬを入れ、２５℃で動的光散乱を測定した（ｎ＝３）。コーティング溶液の調製手順は＜１＞で述べた手順と同様である。
細胞外マトリックス、カチオン性ポリマー又はアニオン性ポリマーを含む溶液（コーティング溶液）のゼータ電位をＭａｌｖｅｒｎ ＺｅＴａＳｉｚｅｒで測定した。測定用のセル（Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｆｏｌｄｅｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｃｅｌｌ）にＰＢＳ（ｐＨ：７．４）を用いて調製したコーティング溶液８００μＬを入れ、２５℃で動的光散乱を測定した（ｎ＝３）。コーティング溶液の調製手順は＜１＞で述べた手順と同様である。
【0054】
＜４．カチオン性ポリマーで被覆したＰＳ表面上の吸着タンパク質の評価＞
カチオン性ポリマーにより被覆したＰＳ表面の血清タンパク質の量を次に示す方法で評価した。ＰＬＬ，ＰＤＤＡ及びＰＡＨそれぞれを用い、濃度８．３３μｇ／ｃｍ２となるように９６ウェルプレートを室温、５分間の条件でコーティングした。２０％ＦＢＳ（１０２７０１０６、Ｇｉｂｃｏ）及び１％抗生物質を含むＤＭＥＭ高グルコース培地２５μＬを、各ポリマーでコーティングされたウェル上に添加した。次いで、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベーター内で０．５時間、１時間、３時間又は１６時間インキュベートした。各ウェルに吸着したタンパク質の総量をＢＣＡアッセイ（ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ， ２３２２５）により評価した。各時点の最後に、培地を吸引し、２００μＬのＢＣＡワーキング溶液を各ウェルに挿入し、３７℃にてインキュベーター中で３０分間インキュベートした。光学密度はマイクロプレートリーダーで波長５６２ｎｍを測定し、標準タンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた検量線と比較することで求めた。
カチオン性ポリマーにより被覆したＰＳ表面の血清タンパク質の量を次に示す方法で評価した。ＰＬＬ，ＰＤＤＡ及びＰＡＨそれぞれを用い、濃度８．３３μｇ／ｃｍ２となるように９６ウェルプレートを室温、５分間の条件でコーティングした。２０％ＦＢＳ（１０２７０１０６、Ｇｉｂｃｏ）及び１％抗生物質を含むＤＭＥＭ高グルコース培地２５μＬを、各ポリマーでコーティングされたウェル上に添加した。次いで、９６ウェルプレートを３７℃のインキュベーター内で０．５時間、１時間、３時間又は１６時間インキュベートした。各ウェルに吸着したタンパク質の総量をＢＣＡアッセイ（ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ， ２３２２５）により評価した。各時点の最後に、培地を吸引し、２００μＬのＢＣＡワーキング溶液を各ウェルに挿入し、３７℃にてインキュベーター中で３０分間インキュベートした。光学密度はマイクロプレートリーダーで波長５６２ｎｍを測定し、標準タンパク質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた検量線と比較することで求めた。
【0055】
＜５．成熟脂肪細胞の分離＞
患者由来のヒト脂肪組織を京都大学医学部附属病院で分離した。成熟脂肪細胞を分離する前に、５％の抗生物質を含有するＰＢＳでヒト脂肪組織を洗浄した。次いで、６ウェルプレートの各ウェルに２～３ｇのヒト脂肪組織を入れ、オートクレーブ処理したピンセット及びハサミを用いて１ｍｍ３程度になるように細かく刻んだ。ＤＭＥＭ、０％ＦＢＳ、５％ＢＳＡ及び１％抗生物質を含む２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ溶液２ｍＬ（濾過により滅菌）を各ウェルに直接添加し、３７℃で１時間、回転数２５０ｒｐｍの条件でインキュベートした。１時間のインキュベーション後、ライセートを孔径５００μｍのフィルターで濾過し、８０ｇの条件で３分間遠心分離した。遠心分離後、成熟脂肪細胞はチューブの最上層に浮遊し、間質血管細胞群（Ｓｔｒｏｍａｌ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＳＶＦ）はチューブの底にあった。最上層とペレットとの間の液体を１０ｍＬピペットで捨て、その後、５％のＢＳＡを含むＰＢＳ及び１％の抗菌薬で洗浄を２回繰り返し、最後にＤＭＥＭで洗浄した。すべての天井培養実験には、新たに単離した成熟脂肪細胞を用いた。
倫理規定：脂肪組織は、年齢が４１歳、４５歳及び５３歳であり、ＢＭＩ（Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅｘ）がそれぞれ２２．４、２５．７８及び２０．４６である３人の異なるヒトドナーの腹部脂肪組織、胸部脂肪組織又は脂肪吸引分離後に京都大学医学部附属病院（京都府、日本）から収集したものである。全ての使用は大阪大学研究倫理審査委員会により承認された（承認番号：Ｌ０２６）。
患者由来のヒト脂肪組織を京都大学医学部附属病院で分離した。成熟脂肪細胞を分離する前に、５％の抗生物質を含有するＰＢＳでヒト脂肪組織を洗浄した。次いで、６ウェルプレートの各ウェルに２～３ｇのヒト脂肪組織を入れ、オートクレーブ処理したピンセット及びハサミを用いて１ｍｍ３程度になるように細かく刻んだ。ＤＭＥＭ、０％ＦＢＳ、５％ＢＳＡ及び１％抗生物質を含む２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ溶液２ｍＬ（濾過により滅菌）を各ウェルに直接添加し、３７℃で１時間、回転数２５０ｒｐｍの条件でインキュベートした。１時間のインキュベーション後、ライセートを孔径５００μｍのフィルターで濾過し、８０ｇの条件で３分間遠心分離した。遠心分離後、成熟脂肪細胞はチューブの最上層に浮遊し、間質血管細胞群（Ｓｔｒｏｍａｌ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＳＶＦ）はチューブの底にあった。最上層とペレットとの間の液体を１０ｍＬピペットで捨て、その後、５％のＢＳＡを含むＰＢＳ及び１％の抗菌薬で洗浄を２回繰り返し、最後にＤＭＥＭで洗浄した。すべての天井培養実験には、新たに単離した成熟脂肪細胞を用いた。
倫理規定：脂肪組織は、年齢が４１歳、４５歳及び５３歳であり、ＢＭＩ（Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅｘ）がそれぞれ２２．４、２５．７８及び２０．４６である３人の異なるヒトドナーの腹部脂肪組織、胸部脂肪組織又は脂肪吸引分離後に京都大学医学部附属病院（京都府、日本）から収集したものである。全ての使用は大阪大学研究倫理審査委員会により承認された（承認番号：Ｌ０２６）。
【0056】
＜６．脱分化脂肪細胞比（ＤＦＡＴ ｒａｔｉｏ）に与える血清タンパク質量の影響＞
上記＜５＞の手順で得た成熟脂肪細胞を、５．０×１０４／ｃｍ２の播種密度で、ＦＢＳ濃度が２０ｖ／ｖ％、１０ｖ／ｖ％又は０ｖ／ｖ％であり、１％の抗菌薬を含むＤＭＥＭで満たした非被覆ＰＳフラスコに播種した。培地漏出を防ぐために各フラスコは蓋をして密閉し、３７℃のインキュベーター中で１週間インキュベートした。１週間のインキュベーション後、培地を吸引し、得られたＤＦＡＴをトリプシン処理によって分離し、細胞をトリパンブルーを用いて自動細胞カウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で計数した。０ｖ／ｖ％のＦＢＳを含むＤＭＥＭによって得たＤＦＡＴ数を対照として用い、他の条件のＤＦＡＴ数と比較することで、データを正規化した。
上記＜５＞の手順で得た成熟脂肪細胞を、５．０×１０４／ｃｍ２の播種密度で、ＦＢＳ濃度が２０ｖ／ｖ％、１０ｖ／ｖ％又は０ｖ／ｖ％であり、１％の抗菌薬を含むＤＭＥＭで満たした非被覆ＰＳフラスコに播種した。培地漏出を防ぐために各フラスコは蓋をして密閉し、３７℃のインキュベーター中で１週間インキュベートした。１週間のインキュベーション後、培地を吸引し、得られたＤＦＡＴをトリプシン処理によって分離し、細胞をトリパンブルーを用いて自動細胞カウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で計数した。０ｖ／ｖ％のＦＢＳを含むＤＭＥＭによって得たＤＦＡＴ数を対照として用い、他の条件のＤＦＡＴ数と比較することで、データを正規化した。
【0057】
＜７．細胞生存率アッセイ＞
ＦＢＳ濃度が２０ｖ／ｖ％、１０ｖ／ｖ％又は０ｖ／ｖ％であるＤＭＥＭで１週間天井培養を行って得た細胞の生存率を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）生存率アッセイキットを用いて評価した。細胞の核をＨｏｅｃｈｓｔで対比染色した。３回のＰＢＳ洗浄の後、暗所で３７℃、３０分間表面上の細胞を染色し、ＦＶ３０００共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で画像化した。各試料に対して同じレーザー露光時間及び励起パワーの条件で蛍光強度測定を行った。
ＦＢＳ濃度が２０ｖ／ｖ％、１０ｖ／ｖ％又は０ｖ／ｖ％であるＤＭＥＭで１週間天井培養を行って得た細胞の生存率を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）生存率アッセイキットを用いて評価した。細胞の核をＨｏｅｃｈｓｔで対比染色した。３回のＰＢＳ洗浄の後、暗所で３７℃、３０分間表面上の細胞を染色し、ＦＶ３０００共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で画像化した。各試料に対して同じレーザー露光時間及び励起パワーの条件で蛍光強度測定を行った。
【0058】
＜８．天井面が被覆された培養容器内での天井培養＞
１％の抗生物質、及び２０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭで満たし、天井面が細胞外マトリックス又はポリマーで被覆されたＰＳフラスコに、上記＜５＞の手順で得た成熟脂肪細胞を５．０×１０４／ｃｍ２の播種密度で播種した。培地の漏出を防ぐために各フラスコに蓋をし、インキュベーター内で、３７℃、１週間の条件でインキュベートした。１週間のインキュベーション後、培地を吸引し、得られたＤＦＡＴをトリプシン処理によって分離し、細胞をトリパンブルーを用いて自動細胞カウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で計数した。被覆されていない表面によって得られたＤＦＡＴ数を対照として使用して、他の条件のＤＦＡＴ数と比較することでデータを正規化した。
１％の抗生物質、及び２０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭで満たし、天井面が細胞外マトリックス又はポリマーで被覆されたＰＳフラスコに、上記＜５＞の手順で得た成熟脂肪細胞を５．０×１０４／ｃｍ２の播種密度で播種した。培地の漏出を防ぐために各フラスコに蓋をし、インキュベーター内で、３７℃、１週間の条件でインキュベートした。１週間のインキュベーション後、培地を吸引し、得られたＤＦＡＴをトリプシン処理によって分離し、細胞をトリパンブルーを用いて自動細胞カウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で計数した。被覆されていない表面によって得られたＤＦＡＴ数を対照として使用して、他の条件のＤＦＡＴ数と比較することでデータを正規化した。
【0059】
＜９．脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）の免疫蛍光イメージング＞
天井面が被覆されていないＰＳフラスコでの１週間の天井培養後、ＤＦＡＴを分離し、１０ｃｍペトリ皿上に播種し、８０％コンフルエントに達するまで培養皿上でＤＦＡＴを培養した。次いで、細胞を再び分離し、播種密度１．２×１０４で９６ウェルプレート上に播種した。細胞がコンフルエントに達した後、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液を用いて、４℃、一晩の条件で固定した。得られたサンプルを０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００のＰＢＳ溶液で１５分間透過処理し、非特異的染色を最小限にするために１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液中で室温、１時間の条件でインキュベートした。インキュベート後の液に抗ＣＤ９０抗体及び抗ＹＡＰ抗体をＢＳＡ １％に添加し、４℃で一晩インキュベートした。次に、得られたサンプルを二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（登録商標）６４７及びＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（登録商標）４８８と共に、暗所にて室温、２時間の条件でインキュベートした。核はＨｏｅｃｈｓｔで対比染色した。細胞をＰＢＳでリンスし、落射蛍光顕微鏡（共焦点定量的画像サイトメーターＣＱ１、Ｔｏｋｙｏ、Ｙｏｋｏｇａｗａ）を用いて観察した。
天井面が被覆されていないＰＳフラスコでの１週間の天井培養後、ＤＦＡＴを分離し、１０ｃｍペトリ皿上に播種し、８０％コンフルエントに達するまで培養皿上でＤＦＡＴを培養した。次いで、細胞を再び分離し、播種密度１．２×１０４で９６ウェルプレート上に播種した。細胞がコンフルエントに達した後、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液を用いて、４℃、一晩の条件で固定した。得られたサンプルを０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００のＰＢＳ溶液で１５分間透過処理し、非特異的染色を最小限にするために１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液中で室温、１時間の条件でインキュベートした。インキュベート後の液に抗ＣＤ９０抗体及び抗ＹＡＰ抗体をＢＳＡ １％に添加し、４℃で一晩インキュベートした。次に、得られたサンプルを二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（登録商標）６４７及びＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（登録商標）４８８と共に、暗所にて室温、２時間の条件でインキュベートした。核はＨｏｅｃｈｓｔで対比染色した。細胞をＰＢＳでリンスし、落射蛍光顕微鏡（共焦点定量的画像サイトメーターＣＱ１、Ｔｏｋｙｏ、Ｙｏｋｏｇａｗａ）を用いて観察した。
【0060】
＜１０．蛍光標識化したカチオン性ポリマー及び細胞外マトリックスによる細胞培養皿表面の被覆（コーティング）＞
蛍光標識化した細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーそれぞれのＰＢＳ（ｐＨ：７．４）溶液を調製し、ＰＳセルカルチャーフラスコの天井面を被覆したときと同じ条件で、コーティングを実施した。ＦＩＴＣ結合Ｉ型コラーゲン、ＦＡＭ結合ＩＶ型コラーゲン、ローダミンラミニン、ローダミンフィブロネクチン及びＦＩＴＣ結合ＰＬＬが、それぞれ１０μｇ／ｃｍ２，１０μｇ／ｃｍ２，１μｇ／ｃｍ２，５μｇ／ｃｍ２及び８．３３μｇ／ｃｍ２となるように９６ウェルプレートにおける各ウェルを被覆した。コーティングされたウェルをＰＢＳ（ｐＨ：７．４）で３回洗浄し、ＦＶ３０００共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって画像化した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（Ｆｉｊｉ，Ｍａｃ ＯＳ Ｘ版）を用いて各被覆表面の蛍光強度を分析した。
蛍光標識化した細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーそれぞれのＰＢＳ（ｐＨ：７．４）溶液を調製し、ＰＳセルカルチャーフラスコの天井面を被覆したときと同じ条件で、コーティングを実施した。ＦＩＴＣ結合Ｉ型コラーゲン、ＦＡＭ結合ＩＶ型コラーゲン、ローダミンラミニン、ローダミンフィブロネクチン及びＦＩＴＣ結合ＰＬＬが、それぞれ１０μｇ／ｃｍ２，１０μｇ／ｃｍ２，１μｇ／ｃｍ２，５μｇ／ｃｍ２及び８．３３μｇ／ｃｍ２となるように９６ウェルプレートにおける各ウェルを被覆した。コーティングされたウェルをＰＢＳ（ｐＨ：７．４）で３回洗浄し、ＦＶ３０００共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって画像化した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（Ｆｉｊｉ，Ｍａｃ ＯＳ Ｘ版）を用いて各被覆表面の蛍光強度を分析した。
【0061】
＜１１．統計解析＞
データセット間の有意差を判定する場合には、両側ｔ検定を用いた統計解析を実施した。エラーバーは標準偏差を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示し、Ｎ．Ｓ．は有意差が確認されなかったことを示す。ｐ値が少なくともｐ＜０．０５であるときに有意差ありと判断される。
データセット間の有意差を判定する場合には、両側ｔ検定を用いた統計解析を実施した。エラーバーは標準偏差を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示し、Ｎ．Ｓ．は有意差が確認されなかったことを示す。ｐ値が少なくともｐ＜０．０５であるときに有意差ありと判断される。
【0062】
〔結果〕
図１は上記＜９＞で示す手順で実施された実験の結果を示す。図１（Ａ）は、天井面が被覆されていない培養容器を用い、天井培養開始から０日、３日又は７日時点における脱分化プロセスの顕微鏡観察結果を示す。０日時点の結果（左の写真）における矢印は成熟脂肪細胞を示し、３日時点の結果（中央の写真）及び７日時点の結果（右の写真）における矢印は脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を示す。図１（Ａ）中のスケールバーは１００μｍを示す。
図１は上記＜９＞で示す手順で実施された実験の結果を示す。図１（Ａ）は、天井面が被覆されていない培養容器を用い、天井培養開始から０日、３日又は７日時点における脱分化プロセスの顕微鏡観察結果を示す。０日時点の結果（左の写真）における矢印は成熟脂肪細胞を示し、３日時点の結果（中央の写真）及び７日時点の結果（右の写真）における矢印は脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を示す。図１（Ａ）中のスケールバーは１００μｍを示す。
【0063】
図１（Ｂ）は、天井培養開始から７日時点における、ＣＤ９０及びＹＡＰにより脱分化脂肪細胞を免疫蛍光染色した画像、Ｈｏｅｃｈｓｔ対比染色により核（Ｎｕｃｌｅｉ）を可視化した画像、並びに、脱分化脂肪細胞のＣＤ９０、ＹＡＰ及び核の共局在を示すマージ画像である。図１（Ｂ）中のスケールバーは５０μｍを示す。
【0064】
図２は上記＜６＞及び＜７＞で示す手順で実施された実験の結果を示す。図２（Ａ）は、ＦＢＳ濃度が０ｖ／ｖ％、１０ｖ／ｖ％又は２０ｖ／ｖ％であるＤＭＥＭ高グルコース培地を用いた条件で１週間天井培養した際のＤＦＡＴ比の結果を示す。データを正規化するために、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭによって得られたＤＦＡＴ細胞数を対照として用い、他の条件の得られたＤＦＡＴ細胞数と比較した。図２（Ａ）には０ｖ／ｖ％，１０ｖ／ｖ％又は２０ｖ／ｖ％のＦＢＳ含有ＤＭＥＭ高グルコース培地を用いて１６時間インキュベートした後の非被覆ＰＳ表面上に吸着したタンパク質の量も示す。
【0065】
【0066】
図２（Ｃ）は、０ｖ／ｖ％、１０ｖ／ｖ％又は２０ｖ／ｖ％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース培地を用いた７日目のＤＦＡＴｓの生死イメージングの結果、及びＨｏｅｃｈｓｔ対比染色を用いたＤＦＡＴｓの核の染色結果を示す。図２（Ｃ）中のスケールバーは１００μｍを示す。
【0067】
表１、表２及び表３は、上記＜１＞及び＜８＞の手順で実施され、細胞外マトリックス又は各種ポリマーで天井面を被覆した状態で天井培養を実施した場合の結果を示す。ＤＦＡＴ比は、天井面が被覆されていない培養容器で天井培養して得たＤＦＡＴ数に対するＤＦＡＴ数の比である。ＤＦＡＴ比は並列して実施したｎ＝６の結果の平均値である。表１、表２及び表３には上記＜２＞及び＜３＞に示す手順で実施された接触角及びゼータ電位の測定結果も示す。
【0068】
【表1】
【表2】
【表3】
【0069】
天井面を細胞外マトリックス又はカチオン性ポリマーで被覆した状態で天井培養を実施した場合にはＤＦＡＴ比が１．０を超えるものとなった。一方、天井面をアニオン性ポリマーで被覆した状態で天井培養を実施した場合にはＤＦＡＴ比は１．０未満となった。これらの結果から天井面を細胞外マトリックス又はカチオン性ポリマーで被覆した場合にはより効率的にＤＦＡＴが製造可能になることがわかる。
【0070】
天井面をフィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、ラミニン、ＰＬＬ、又はＰＤＤＡで被覆した場合、特に効率的にＤＦＡＴが製造可能であった。天井面の被覆なしの結果をコントロールとすると、フィブロネクチン及びＰＤＤＡではｐ＜０．０５、ＩＶ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、ラミニン及びＰＬＬではｐ＜０．０１であった。
【0071】
図３は上記＜４＞に示す手順で実施され、２０ｖ／ｖ％のＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いてインキュベーションしたときのカチオン性ポリマーで天井面を被覆した被覆面上で吸着タンパク質の量を示す（ｎ＝３）。
【0072】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】