知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特開2024-139770遺伝子改変イネ植物、イネ植物の作出方法、判定方法、成長促進剤、遺伝子及びタンパク質
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024139770
(43)【公開日】2024-10-09
(54)【発明の名称】遺伝子改変イネ植物、イネ植物の作出方法、判定方法、成長促進剤、遺伝子及びタンパク質
(51)【国際特許分類】
A01H 6/46 20180101AFI20241002BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20241002BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20241002BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20241002BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241002BHJP
C07K 14/415 20060101ALI20241002BHJP
【ＦＩ】
A01H6/46 ZNA
C12N15/09 100
C12N15/29
A01H1/00 A
C12N15/11 Z
C07K14/415
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024049959
(22)【出願日】2024-03-26
(31)【優先権主張番号】63/454722
(32)【優先日】2023-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】504202472
【氏名又は名称】大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 豊
(72)【発明者】
【氏名】タ キム ニュン
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA31
4H045EA05
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】イネ穀粒サイズを大きくし、収量の向上を可能とする技術を提供する。
【解決手段】野生イネの遺伝的背景を有する遺伝子改変イネ植物であって、ＦＬＴ９遺伝子の機能が、欠損しており、又は抑制されており、その穀粒サイズは、前記遺伝子の機能が正常な対応する野生イネの穀粒サイズより大きい、遺伝子改変イネ植物。
【選択図】なし
【解決手段】野生イネの遺伝的背景を有する遺伝子改変イネ植物であって、ＦＬＴ９遺伝子の機能が、欠損しており、又は抑制されており、その穀粒サイズは、前記遺伝子の機能が正常な対応する野生イネの穀粒サイズより大きい、遺伝子改変イネ植物。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
野生イネの遺伝的背景を有する遺伝子改変イネ植物であって、
ＦＬＴ９遺伝子の機能が、欠損しており、又は抑制されており、その穀粒サイズは、前記遺伝子の機能が正常な対応する野生イネの穀粒サイズより大きい、遺伝子改変イネ植物。
ＦＬＴ９遺伝子の機能が、欠損しており、又は抑制されており、その穀粒サイズは、前記遺伝子の機能が正常な対応する野生イネの穀粒サイズより大きい、遺伝子改変イネ植物。
【請求項2】
前記野生イネは、インディカ品種である、請求項１に記載の遺伝子改変イネ植物。
【請求項3】
穀粒サイズを肥大化する、イネ植物の作出方法であって、前記イネ植物内において、ＦＬＴ９遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、イネ植物の作出方法。
【請求項4】
穀粒サイズの大きいイネ植物の判定方法であって、葉中のＦＬＴ９遺伝子又はＦＬＴ９タンパク質の発現量を測定する、判定方法。
【請求項5】
穀粒サイズを肥大化するイネ植物の成長促進剤であって、ＦＬＴ９遺伝子を破壊するゲノム編集組成物を含有する、成長促進剤。
【請求項6】
以下の（Ａ）～（Ｄ）のいずれか一つの塩基配列からなり、穀粒サイズの大きさを規定する遺伝子。
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されている塩基配列、
（Ｃ）配列番号１で表される塩基配列において、同一性が８０％以上である塩基配列、
（Ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
（Ｅ）前記（Ａ）～（Ｄ）の塩基配列の縮重異性体
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されている塩基配列、
（Ｃ）配列番号１で表される塩基配列において、同一性が８０％以上である塩基配列、
（Ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
（Ｅ）前記（Ａ）～（Ｄ）の塩基配列の縮重異性体
【請求項7】
以下の（Ｆ）～（Ｈ）のいずれか一つのタンパク質。
（Ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（Ｇ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質；
（Ｈ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質
（Ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（Ｇ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質；
（Ｈ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子改変イネ植物、イネ植物の作出方法、判定方法、成長促進剤、遺伝子及びタンパク質に関する。
【背景技術】
【0002】
イネ育種において収量の増加は、優先度の高い育種目標である。収量増加には、穀粒のサイズを大きくする方法が、有力な方法の一つになっている。イネ穀粒のサイズを制御する遺伝子座は多数見出されており、実際に有用な対立遺伝子の多くは、栽培品種に搭載されている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Molecular Networks of Seed Size Control in Plants. Na Li, Ran Xu, and Yunhai Li. Annual Review of Plant Biology Volume 70, 435-463(2019) .
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかし、これらの遺伝子の多くは、既に育種利用されており、現在の栽培品種の穀粒を更に増大させることは容易ではない。
【0005】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、イネの穀粒サイズを大きくし、収量の向上を可能とする技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］野生イネの遺伝的背景を有する遺伝子改変イネ植物であって、ＦＬＴ９遺伝子の機能が、欠損しており、又は抑制されており、その穀粒サイズは、前記遺伝子の機能が正常な対応する野生イネの穀粒サイズより大きい、遺伝子改変イネ植物。
［２］前記野生イネは、インディカ品種である、［１］に記載の遺伝子改変イネ植物
［３］穀粒サイズを肥大化する、イネ植物の作出方法であって、前記イネ植物内において、ＦＬＴ９遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、イネ植物の作出方法。
［４］穀粒サイズの大きいイネ植物の判定方法であって、葉中のＦＬＴ９遺伝子又はＦＬＴ９タンパク質の発現量を測定する、判定方法。
［５］穀粒サイズを肥大化するイネ植物の成長促進剤であって、ＦＬＴ９遺伝子を破壊するゲノム編集組成物を含有する、成長促進剤。
［６］以下の（Ａ）～（Ｄ）のいずれか一つの塩基配列からなり、穀粒サイズの大きさを規定する遺伝子。
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されている塩基配列、
（Ｃ）配列番号１で表される塩基配列において、同一性が８０％以上である塩基配列、
（Ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
（Ｅ）前記（Ａ）～（Ｄ）の塩基配列の縮重異性体
［７］以下の（Ｆ）～（Ｈ）のいずれか一つのタンパク質。
（Ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（Ｇ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質；
（Ｈ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質
［１］野生イネの遺伝的背景を有する遺伝子改変イネ植物であって、ＦＬＴ９遺伝子の機能が、欠損しており、又は抑制されており、その穀粒サイズは、前記遺伝子の機能が正常な対応する野生イネの穀粒サイズより大きい、遺伝子改変イネ植物。
［２］前記野生イネは、インディカ品種である、［１］に記載の遺伝子改変イネ植物
［３］穀粒サイズを肥大化する、イネ植物の作出方法であって、前記イネ植物内において、ＦＬＴ９遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、イネ植物の作出方法。
［４］穀粒サイズの大きいイネ植物の判定方法であって、葉中のＦＬＴ９遺伝子又はＦＬＴ９タンパク質の発現量を測定する、判定方法。
［５］穀粒サイズを肥大化するイネ植物の成長促進剤であって、ＦＬＴ９遺伝子を破壊するゲノム編集組成物を含有する、成長促進剤。
［６］以下の（Ａ）～（Ｄ）のいずれか一つの塩基配列からなり、穀粒サイズの大きさを規定する遺伝子。
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されている塩基配列、
（Ｃ）配列番号１で表される塩基配列において、同一性が８０％以上である塩基配列、
（Ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
（Ｅ）前記（Ａ）～（Ｄ）の塩基配列の縮重異性体
［７］以下の（Ｆ）～（Ｈ）のいずれか一つのタンパク質。
（Ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（Ｇ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質；
（Ｈ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、イネの穀粒サイズを大きくし、収量の向上を可能とする技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ個体群における穀粒の多様性を示す写真である。
【図2】ＦＴＬ９（Ｏｓ０１ｇ０７４８８００）の遺伝子構造を示す図である。上向きの小さい矢印は、ＧＷＡＳにおけるＳＮＰに有意に関連する位置を示す。下向きの大きい矢印はｆｔｌ９＊のナンセンス変異の位置を示す。アスタリスクは終止コドンを示す。
【図3】ｆｔｌ９＊とＦＴＬ９Ｗをそれぞれ保有する２つのハプロタイプ間の穀粒幅の比較を示したグラフである。ボックス内の数字は、種の計数に使用された系統の数を示す。
【図4】ｆｔｌ９＊とＦＴＬ９Ｗをそれぞれ保有する２つのハプロタイプ間の穀粒の厚みの比較を示したグラフである。ボックス内の数字は、種の計数に使用された系統の数を示す。
【図5】ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９由来ＦＴＬ９ノックアウト株、Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１、及びその親株Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗの穀粒と穂の形態を示す写真である。
【図6】ＦＴＬ９のプロモーター（ＦＴＬ９ｐ）及び構成的ユビキチンプロモーター（Ｕｂｉ）によって駆動されるＦＴＬ９Ｗを発現するトランスジェニック植物の穀粒及び穂の形態を示す写真である。Ｔ６５Ｕｂｉ：：ＧＦＰは対照トランスジェニック植物である。
【図7】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のノックアウト株間（Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１対Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ）の穀粒の幅の比較結果である。ボックス内の数字は、測定に使用した種子の数を示す。
【図8】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のノックアウト株間（Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１対Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ）の穀粒の厚みの比較結果である。ボックス内の数字は、測定に使用した種子の数を示す。
【図9】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のノックアウト株間（Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１対Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ）の一穂当たりの小穂数の比較結果である。ボックス内の数字は、計数に使用した穂の数を示す。
【図10】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のノックアウト株間（Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１対Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ）の一穂当たりの一次枝数の比較結果である。ボックス内の数字は、計数に使用した穂の数を示す。
【図11】ＦＴＬ９のプロモーターと構成的プロモーターによって駆動されるＦＴＬ９Ｗを発現するトランスジェニック植物間の穀粒の幅の比較結果である。Ｔ６５Ｕｂｉ：：ＧＦＰは対照トランスジェニック植物である。ボックス内の数字は、測定に使用した種子の数を示す。
【図12】ＦＴＬ９のプロモーターと構成的プロモーターによって駆動されるＦＴＬ９Ｗを発現するトランスジェニック植物間の穀粒の厚みの比較結果である。Ｔ６５Ｕｂｉ：：ＧＦＰは対照トランスジェニック植物である。ボックス内の数字は、測定に使用した種子の数を示す。
【図13】ＦＴＬ９のプロモーターと構成的プロモーターによって駆動されるＦＴＬ９Ｗを発現するトランスジェニック植物間の穀粒の幅の比較結果である。Ｔ６５Ｕｂｉ：：ＧＦＰは対照トランスジェニック植物である。ボックス内の数字は、測定に使用した種子の数を示す。
【図14】ＦＴＬ９のプロモーターと構成的プロモーターによって駆動されるＦＴＬ９Ｗを発現するトランスジェニック植物間の一穂当たりの一次枝数の比較結果である。Ｔ６５Ｕｂｉ：：ＧＦＰは対照トランスジェニック植物である。ボックス内の数字は、測定に使用した種子の数を示す。
【図15】成熟した穎の内側 (向軸) 表面の細胞の写真である。
【図17】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のノックアウト株間（Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１対Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ）の細胞サイズの比較結果である。ボックス内の数字は、５つの独立した株から計数された細胞の数を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１;０．００１≦＊＊Ｐ＜０．０１；０．０１≦＊Ｐ＜ ０．０５ (スチューデントの t 検定);ｎｓ、有意差が無い。
【図18】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のノックアウト株間（Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１対Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ）の細胞幅の比較結果である。ボックス内の数字は、５つの独立した株から計数された細胞の数を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１;０．００１≦＊＊Ｐ＜０．０１；０．０１≦＊Ｐ＜ ０．０５ (スチューデントの t 検定);ｎｓ、有意差が無い。
【図19】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のノックアウト株間（Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１対Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ）の細胞の長さの比較結果である。ボックス内の数字は、５つの独立した株から計数された細胞の数を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１;０．００１≦＊＊Ｐ＜０．０１；０．０１≦＊Ｐ＜ ０．０５ (スチューデントの t 検定);ｎｓ、有意差が無い。
【図20】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のノックアウト株（Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１）とその親野生株（Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ）の若い小穂の形態（左パネル）、若い小穂の穎の断面図(中央のパネル)、及びその拡大図 (右パネル)である。ｌｅ, 外穎;ｐａ, 内穎;ａｂ, 背軸性;ａｄ, 向軸性
【図21】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のノックアウト株（Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１）とその親野生株（Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ）の若い穎の内側（向軸）表面の細胞数の測定結果である。ボックス内の数字は、５つの独立した株からの穎の数を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１;０．００１≦＊＊Ｐ＜０．０１；０．０１≦＊Ｐ＜ ０．０５ (スチューデントの t 検定);ｎｓ、有意差が無い。
【図22】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９由来のノックアウト株（Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１）とその親野生株（Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ）の若い穎の内側（向軸）表面の細胞幅の測定結果である。＊＊＊Ｐ＜０．００１;０．００１≦＊＊Ｐ＜０．０１；０．０１≦＊Ｐ＜ ０．０５ (スチューデントの t 検定);ｎｓ、有意差が無い。
【図23】栄養段階及び生殖段階の葉、花序分裂組織、及び若い小穂におけるＦＴＬ９発現の定量的ＰＣＲ分析の結果である。
【図24】（Ｂ－Ｆ）ＧＵＳでアッセイされたトランスジェニック植物であって、ＧＵＳレポーター遺伝子をＦＴＬ９プロモーターによって駆動されるＦＴＬ９Ｗゲノム断片（ＦＴＬ９ｐ：：ＦＴＬ９Ｗ：：ＧＵＳ）につなぐことによりデザインされたＦＴＬ９Ｗ：：ＧＵＳ融合遺伝子を発現するトランスジェニック植物の画像である。（Ｇ－Ｋ）自身のプロモーターによって駆動されるＦＴＬ９Ｗ：：ＧＦＰ融合体遺伝子（ＦＴＬ９ｐ：：ＦＴＬ９Ｗ：：ＧＦＰ）を発現するトランスジェニック植物の微分干渉コントラスト画像である。（Ｌ－Ｐ）自身のプロモーターによって駆動されるＦＴＬ９Ｗ：：ＧＦＰ融合体遺伝子（ＦＴＬ９ｐ：：ＦＴＬ９Ｗ：：ＧＦＰ）を発現するトランスジェニック植物の共焦点レーザースキャン顕微鏡画像である。（Ｑ－Ｕ）葉維管束組織に特異的なｒｏｌＣプロモーターによって駆動されるＦＴＬ９Ｗ：：ＧＦＰ融合遺伝子（ｒｏｌＣ：：ＦＴＬ９Ｗ：：ＧＦＰ）を発現するトランスジェニック植物の微分干渉コントラスト画像である。（Ｖ－Ｚ）ｒｏｌＣプロモーターによって駆動されるＦＴＬ９Ｗ：：ＧＦＰ融合遺伝子（ｒｏｌＣ：：ＦＴＬ９Ｗ：：ＧＦＰ）を発現するトランスジェニック植物の共焦点レーザースキャン顕微鏡画像である。白い矢印は、師部の ＧＦＰシグナルを示す。すべての共焦点画像はスペクトル分離後に取得された。スケールバー：５０μｍ。Ｋの挿入図は、Ｋ、Ｐ、Ｕ、及びＺの穎のおおよその観測位置を示す。Ｂ、Ｇ、Ｌ、Ｑ、及びＶは、維管束周囲の葉身の断面図である。Ｂの矢印は師部と木部のおおよその位置を示す。ＳＡＭ、茎頂成長点; ｐｂ、一次分裂組織。ｌｅ, 外穎;ｐａ, 内穎;ｆｍ,小花分裂組織。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図25】Ｔ６５におけるＯ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ由来のＦＴＬ９Ｗを持つ染色体セグメント置換系統のバックグラウンドでｒｏｌＣプロモーターによって駆動されるＨｄ３ａを発現する植物（ＣＳＳＬ＿Ｌ４ｒｏｌＣ：：Ｈｄ３ａ）及びその親コントロール（ＣＳＳＬ＿Ｌ４ＷＴ）の形態を示す写真である。
【図26】ＣＳＳＬ＿Ｌ４ ＷＴの栄養段階および生殖段階、並びにＣＳＳＬ＿Ｌ４ｒｏｌＣ：：Ｈｄ３ａの生殖段階における葉におけるＦＴＬ９の発現レベルを示すｑＰＣＲ分析の結果である。
【図27】日本晴のＦＴＬ９のプロモーターによって駆動されるＦＴＬ９Ｗを発現するトランスジェニック植物（ＮＢＦＴＬ９ｐ：：ＦＴＬ９ｇ）における、日長を長日（ＬＤ）から短日（ＳＤ）に変更する前後のＦＴＬ９及びＨｄ３ａの発現レベルを示すｑＰＣＲ分析の結果である。ＬＤ状態を示すバー及びＳＤ 状態を示すバーは、上図及び下図において対応している。破線は出穂日を示す。
【図28】砂糖処理（６％）有無におけるＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ Ｗ０６２９の実生におけるＦＴＬ９を示すｑＰＣＲ分析の結果である。＊＊＊Ｐ＜０．００１ (スチューデントの t 検定);ｎｓ、有意差が無い。
【図29】砂糖処理（６％）有無におけるＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＮＢＦＴＬ９ｐ：：ＦＴＬ９Ｗの実生におけるＦＴＬ９を示すｑＰＣＲ分析の結果である。＊＊＊Ｐ＜０．００１ (スチューデントの t 検定);ｎｓ、有意差が無い。
【図30】栽培米のコアコレクション、即ち農研機構が開発した世界の米コレクション（ＷＲＣ）と日本米コレクション（ＪＲＣ）におけるＦＴＬ９Ｗとｆｔｌ９＊の分布を示すグラフである。バー内の数字は、各対立遺伝子を含む系統の数を示す。
【図31】Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ集団のサブグループ、即ちＯｒ－Ｉ、Ｏｒ－ＩＩ、及びＯｒ－ＩＩＩにおけるＦＴＬ９Ｗ及びｆｔｌ９＊の分布を示すグラフである。バー内の数字は、各対立遺伝子を含む系統の数を示す。
【図32】Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ及びＯ. ｓａｔｉｖａ(ＮＡＲＯ ＷＲＣ)のＦＴＬ９遺伝子領域のＳＮＰを使用したハプロタイプネットワーク解析の結果である。矢印は、ｆｔｌ９＊変異イベントの位置を示す。
【図33】拡張ハプロタイプホモ接合性分析（ＥＨＨ）によるＯｒ－ＩＩＩのＦＴＬ９ゲノム領域周辺のポジティブ選択の検出結果である。ｉＨＳ、統合ハプロタイプ スコア。
【図34】進化と栽培化における野生イネ個体群と栽培イネ個体群におけるＦＴＬ９の機能喪失対立遺伝子の出現と固定を説明するモデルである。
【図35】イネにおけるＦＴＬ９による粒サイズと粒数の調整を示すモデルである。ＦＴＬ９の発現は、葉の糖などの母系資源を感知することによって誘導される。次に、ＦＴＬ９タンパク質は葉から花序分裂組織に移動して、穀粒のサイズと数を調節する。
【図36】イネにおけるＦＴＬ９による粒サイズと粒数の調整を示すモデルである。ＦＴＬ９は、母系資源の利用可能性に応答し、種子の数とサイズを調節するシグナルとして機能する。母植物が、光合成が活発で適切な状態にある場合、ＦＴＬ９の発現が誘導される。その結果、穀粒の数が増えて生息域が広がる。一方、粒サイズは限られる。この母親による子の数と大きさの規制は、親と子の対立の理論を裏付けており、子に割り当てられる母親のリソースの最適なレベルが親と子の間で異なる。
【図37】イネにおけるＦＴＬ９による粒サイズと粒数の調整を示すモデルである。ＦＴＬ９が存在しない場合 (ｆｔｌ９＊)、おそらく人間の選択により、穀粒数が損なわれることにより穀粒サイズが増加する。この数の減少は、栽培化中に他の遺伝子によって補われる可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【0009】
実施例で後述するように、発明者は、アジアで栽培されるイネの祖先である野生イネＯｒｙｚａ ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ集団から、穀粒の厚みと幅を制御する遺伝子ＦＬＴ９（ＦＴ－ｌｉｋｅ９）を同定した。ＦＬＴ９遺伝子の塩基配列は、配列番号１（ATGTCTGATGTGCCAACTGTGGAGCCCTTGGTTCTGGCTCATGTCATACATGACGTGTTAGATCCATTTAGACCAACTATGCCCCTTAAAATAACATACAACGATAGGTTACTTCTGGCAGGTGTTGAGCTGAAACCATCTGCAACTGTGCATAAACCAAGAGTAGATATTGGTGGCACCGACCTTAGGGTGTTCTACACATTGGTACTGGTGGATCCAGATGCTCCAAGCCCAAGCAACCCATCACTAGGGGAGTATTTGCACTGGATGGTGATAGATATCCCAGGAACAACTGGAGTCAACTTCGGTCAAGACCTCATGCTTTATGAAAGACCGGAACTGAGATATGGTATCCACCGGATGGTATTTGTGTTATTCCGACAACTTGGCAGGGGAACCCTTTTTGCACCAGAGATGCGACACAACTTCCATTGTAGAAGCTTTGCGCAACAATACCATCTGGACATTGTGGCCGCTACATATTTCAACTGCCAAAGGGAAGCCGGCTCTGGTGGAAGAAGGTTCAGGCCCGAGAGTTCTTAA）で表される。ＦＬＴ９タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２（MSDVPTVEPLVLAHVIHDVLDPFRPTMPLKITYNDRLLLAGVELKPSATVHKPRVDIGGTDLRVFYTLVLVDPDAPSPSNPSLGEYLHWMVIDIPGTTGVNFGQDLMLYERPELRYGIHRMVFVLFRQLGRGTLFAPEMRHNFHCRSFAQQYHLDIVAATYFNCQREAGSGGRRFRPESS）で表される。発明者は、ＦＬＴ９遺伝子において、機能型が穀粒の厚みと幅を小さくする一方で、機能喪失型は、穀粒の厚みと幅を大きくすることを明らかにした。
【0010】
≪遺伝子≫
一実施形態において、本発明は、以下の（Ａ）～（Ｄ）のいずれか一つの塩基配列からなり、穀粒サイズの大きさを規定する遺伝子を提供する。
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されている塩基配列、
（Ｃ）配列番号１で表される塩基配列において、同一性が８０％以上である塩基配列、
（Ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
（Ｅ）前記（Ａ）～（Ｄ）の塩基配列の縮重異性体
一実施形態において、本発明は、以下の（Ａ）～（Ｄ）のいずれか一つの塩基配列からなり、穀粒サイズの大きさを規定する遺伝子を提供する。
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されている塩基配列、
（Ｃ）配列番号１で表される塩基配列において、同一性が８０％以上である塩基配列、
（Ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
（Ｅ）前記（Ａ）～（Ｄ）の塩基配列の縮重異性体
【0011】
（Ｂ）において、欠失、置換、挿入、又は付加されてもよい塩基の数としては、１ ～１００個が好ましく、１～８０個がより好ましく、１～５０個が更に好ましく、１～２５個が最も好ましい。
【0012】
（Ｃ）において、同一性は８０％であり、８５％以上が好ましく、特に好ましくは、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましい。
【0013】
（Ｄ）において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５～７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【0014】
メチオニンとトリプトファン以外のアミノ酸は、１つのアミノ酸に対して複数のコドンが対応する。このことを遺伝暗号の縮重という。（Ｅ）において、塩基配列の縮重異性体とは、ある塩基配列がコードするアミノ酸に対応する他の塩基配列を意味する。
【0015】
ＦＬＴ９遺伝子において、機能喪失型は、穀粒の厚みと幅を大きくすることから、本発明の遺伝子は、機能喪失型変異を有していてもよい。
【0016】
≪タンパク質≫
一実施形態において、本発明は、以下の（Ｆ）～（Ｈ）のいずれか一つのタンパク質を提供する。
（Ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｇ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質；
（Ｈ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質
一実施形態において、本発明は、以下の（Ｆ）～（Ｈ）のいずれか一つのタンパク質を提供する。
（Ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｇ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質；
（Ｈ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質
【0017】
（Ｇ）において、係る同一性としては、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が最も好ましい。
【0018】
（Ｈ）において欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸の数としては、１ ～１３５個が好ましく、１～２５個がより好ましく、１～２０個が更に好ましく、１～１５個が特に好ましく、１～５個が最も好ましい。
【0019】
≪遺伝子改変イネ植物≫
一実施形態において、本発明は、野生イネの遺伝的背景を有する遺伝子改変イネ植物であって、ＦＬＴ９遺伝子の機能が、欠損しており、又は抑制されており、その穀粒サイズは、前記遺伝子の機能が正常な対応する野生イネの穀粒サイズより大きい、遺伝子改変イネ植物を提供する。
一実施形態において、本発明は、野生イネの遺伝的背景を有する遺伝子改変イネ植物であって、ＦＬＴ９遺伝子の機能が、欠損しており、又は抑制されており、その穀粒サイズは、前記遺伝子の機能が正常な対応する野生イネの穀粒サイズより大きい、遺伝子改変イネ植物を提供する。
【0020】
本実施形態の遺伝子改変イネ植物において、ＦＬＴ９遺伝子の機能が欠損している又は抑制されている。ＦＬＴ９遺伝子の機能が欠損しているとは、本実施形態の遺伝子改変イネ植物において、ＦＬＴ９遺伝子産物の発現が喪失していることをいう。
ＦＬＴ９遺伝子産物の発現の喪失は、例えばＦＬＴ９遺伝子に変異を導入し、ＦＬＴ９遺伝子を破壊することにより生じさせることができる。
変異は、ＦＬＴ９遺伝子、或いは、この遺伝子の発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じさせることができる。これらの変異の導入は、例えば、変異原性物質による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子ノックアウト、Ｃｒｅ-ｌｏｘＰ系等による条件的ノックアウト等の手法を用いて行うことができる。
遺伝子ターゲティング、遺伝子ノックアウトについては、ゲノム編集技術を用いてもよい。
ＦＬＴ９遺伝子産物の発現の喪失は、例えばＦＬＴ９遺伝子に変異を導入し、ＦＬＴ９遺伝子を破壊することにより生じさせることができる。
変異は、ＦＬＴ９遺伝子、或いは、この遺伝子の発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じさせることができる。これらの変異の導入は、例えば、変異原性物質による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子ノックアウト、Ｃｒｅ-ｌｏｘＰ系等による条件的ノックアウト等の手法を用いて行うことができる。
遺伝子ターゲティング、遺伝子ノックアウトについては、ゲノム編集技術を用いてもよい。
【0021】
ＦＬＴ９遺伝子の機能が抑制されているとは、本実施形態の遺伝子改変イネ植物において、コントロールとなる野生型の植物と比較して、ＦＬＴ９遺伝子産物の量が抑制されていることをいう。
ＦＬＴ９遺伝子の発現の抑制は、ＦＬＴ９遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの発現を生じさせる核酸配列を、細胞又は動物に導入し、遺伝子ノックダウン等により生じさせることができる。
ＦＬＴ９遺伝子の発現の抑制は、ＦＬＴ９遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの発現を生じさせる核酸配列を、細胞又は動物に導入し、遺伝子ノックダウン等により生じさせることができる。
【0022】
本実施形態の遺伝子改変イネ植物は、野生イネの遺伝的背景を有する。野生イネの遺伝的背景を有する品種としては、インディカ品種、ジャバニカ品種が挙げられ、インディカ品種が好ましい。
【0023】
即ち、本実施形態の遺伝子改変イネ植物は、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの遺伝子の機能が欠損している又は抑制されていることが好ましい。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）前記（ａ）で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）前記（ａ）で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質をコードする遺伝子
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｂ）前記（ａ）で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質をコードする遺伝子
（ｃ）前記（ａ）で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ穀粒サイズの大きさを規定するタンパク質をコードする遺伝子
【0024】
（ｂ）において、欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸の数としては、１ ～１３５個が好ましく、１～２５個がより好ましく、１～２０個が更に好ましく、１～１５個が特に好ましく、１～５個が最も好ましい。
【0025】
（ｃ）において、同一性としては、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が最も好ましい
【0026】
本発明において、「穀粒サイズの大きさを規定する」とは、穀粒の厚みと幅を規定することを意味する。
【0027】
≪植物の作出方法≫
一実施形態において、本発明は、穀粒サイズを肥大化する、イネ植物の作出方法であって、前記イネ植物内において、ＦＬＴ９遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、イネ植物の作出方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、穀粒サイズを肥大化する、イネ植物の作出方法であって、前記イネ植物内において、ＦＬＴ９遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、イネ植物の作出方法を提供する。
【0028】
遺伝子の機能を欠損又は抑制させる方法としては、例えば、ＦＬＴ９遺伝子のゲノムに人為的に改変又は変異を加えることにより、機能的な遺伝子産物の生成が欠損又は抑制された植物を得る方法が挙げられる。
例えば、突然変異誘発剤の処理により、ＦＬＴ９遺伝子の機能が欠損又は抑制された植物をスクリーニングする方法が挙げられる。
また例えば、遺伝子ターゲッティング法や、ゲノム編集技術、トランスジェニック等によって、ＦＬＴ９遺伝子のゲノムに人為的に改変又は変異を加えることにより、機能的な遺伝子産物の生成が欠損又は抑制された植物を得てもよい。
または、ＦＬＴ９遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸を植物に導入することによって、遺伝子産物の生成が欠損又は抑制された植物を得てもよい。
例えば、突然変異誘発剤の処理により、ＦＬＴ９遺伝子の機能が欠損又は抑制された植物をスクリーニングする方法が挙げられる。
また例えば、遺伝子ターゲッティング法や、ゲノム編集技術、トランスジェニック等によって、ＦＬＴ９遺伝子のゲノムに人為的に改変又は変異を加えることにより、機能的な遺伝子産物の生成が欠損又は抑制された植物を得てもよい。
または、ＦＬＴ９遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸を植物に導入することによって、遺伝子産物の生成が欠損又は抑制された植物を得てもよい。
【0029】
本実施形態の植物の作出方法は、ＦＬＴ９遺伝子の機能を、そのプロモーターを改変することによって、欠損又は抑制する方法でもよい。
【0030】
ＦＬＴ９遺伝子及び/又はそのプロモーターを改変する方法としては、効率の観点からゲノム編集技術を用いることが好ましい。
改変する方法としては、標的ゲノムＤＮＡの二重鎖切断後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による挿入欠損（ＩｎＤｅｌ）変異を生じさせる方法が挙げられる。ＩｎＤｅｌ変異により、フレームシフトや未成熟終始コドンが誘発される。
また、標的ゲノムＤＮＡの二重鎖切断後、相同組換え型修復により、変異を導入した外来ＤＮＡを標的ゲノム中に挿入する方法も挙げられる。
改変する方法としては、標的ゲノムＤＮＡの二重鎖切断後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による挿入欠損（ＩｎＤｅｌ）変異を生じさせる方法が挙げられる。ＩｎＤｅｌ変異により、フレームシフトや未成熟終始コドンが誘発される。
また、標的ゲノムＤＮＡの二重鎖切断後、相同組換え型修復により、変異を導入した外来ＤＮＡを標的ゲノム中に挿入する方法も挙げられる。
【0031】
標的ゲノムＤＮＡの二重鎖切断に用いるシステムとしては、特に限定されず、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム等が挙げられる。これらのシステムの細胞への導入方法としては、特に限定されず、標的ゲノムＤＮＡ切断酵素自体を細胞に導入してもよく、標的ゲノムＤＮＡ切断酵素発現ベクターを細胞に導入してもよい。標的ゲノムＤＮＡの二重鎖切断に用いるシステムは、外来ＤＮＡと同時又は外来ＤＮＡの前若しくは後に細胞に導入される。
【0032】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいては、Ｃａｓ９発現ベクターと、切断したい箇所にＣａｓ９を誘導するガイドＲＮＡをコードする発現ベクターと、を細胞に導入する方法や、発現精製した組み換えＣａｓ９タンパク質と、ガイドＲＮＡと、を細胞に導入する方法等が挙げられる。
本実施形態において、標的ゲノムＤＮＡの二重鎖切断に用いるシステムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが好ましい。
本実施形態において、標的ゲノムＤＮＡの二重鎖切断に用いるシステムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが好ましい。
【0033】
本実施形態において、ゲノム編集は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系で行われても、ｉｎ ｐｌａｎｔａで行われてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系でのゲノム編集方法においては、外来遺伝子、核酸及びタンパク質の細胞への導入は、カルス又は組織片に対して、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びウィスカー法等の公知の方法を用いて行われる。ｉｎ ｐｌａｎｔａにおけるゲノム編集方法においては、外来遺伝子、核酸及びタンパク質の細胞への導入は、露出させた未熟胚や完熟胚のシュート頂に対して、公知の方法を用いて行われる。
【0034】
≪成長促進剤≫
一実施形態において、本発明は、穀粒サイズを肥大化するイネ植物の成長促進剤であって、ＦＬＴ９遺伝子を破壊するゲノム編集組成物を含有する、成長促進剤を提供する。
一実施形態において、本発明は、穀粒サイズを肥大化するイネ植物の成長促進剤であって、ＦＬＴ９遺伝子を破壊するゲノム編集組成物を含有する、成長促進剤を提供する。
【0035】
ゲノム編集組成物は、標的ゲノムＤＮＡ切断酵素又は前記酵素をコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡを含む。標的ゲノムＤＮＡ切断酵素としては、Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ等が挙げられる。また、前記酵素をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡとしては、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡが挙げられる。
【0036】
標的ゲノムＤＮＡ切断酵素として、Ｃａｓ９を用いる場合には、ゲノム編集組成物は、Ｃａｓ９を誘導するガイドＲＮＡを含有することが好ましい。また、組成物は、ガイドＲＮＡをコードする発現ベクターを含有してもよい。ガイドＲＮＡとしては、例えば、配列番号３（GCAAATACTCCCCTAGTGAT）で表される標的配列を有するものが挙げられる。
【0037】
相同組換により、ＦＬＴ９遺伝子を破壊する場合には、ゲノム編集組成物は、相同性アームを両端に備えた所定の変異を有する外来ＤＮＡを含むことが好ましい。
【0038】
本実施形態の成長促進剤によれば、ＦＬＴ９遺伝子を破壊することにより、穀粒の厚みと幅を大きくする
【0039】
≪判定方法≫
一実施形態において、本発明は、穀粒サイズの大きいイネ植物の判定方法であって、葉中のＦＬＴ９遺伝子又はＦＬＴ９タンパク質の発現量を測定する、判定方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、穀粒サイズの大きいイネ植物の判定方法であって、葉中のＦＬＴ９遺伝子又はＦＬＴ９タンパク質の発現量を測定する、判定方法を提供する。
【0040】
葉中のＦＬＴ９遺伝子発現量の測定方法としては、葉から核酸を抽出し、プライマーを用いたＰＣＲにより、ＦＬＴ９遺伝子断片を増幅し、その増幅産物を解析する方法や、ＦＬＴ９遺伝子に相補的なプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを用いて解析する方法が挙げられる。
【0041】
葉から核酸（例えば、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を抽出する方法としては、酸性フェノールを含むＲＮＡ抽出用試薬を用いた方法等が挙げられ、定法に従う。
【0042】
遺伝子発現量を定量する観点から、ＰＣＲによりＦＬＴ９遺伝子断片を増幅し、その増幅産物を解析することが好ましい。具体的な定量方法としては、次世代シークエンサー（ＮＧＳ）法やリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法が挙げられる。
【0043】
また、葉からタンパク質を抽出し、ＥＬＩＳＡ等を用いてＦＬＴ９タンパク質の発現量を解析してもよい。葉からタンパク質を抽出する方法についても、定法に従う。
【0044】
葉中のＦＬＴ９遺伝子又はＦＬＴ９タンパク質の発現が確認された場合には、イネ植物の穀粒サイズは小さいものと判定でき、葉中のＦＬＴ９遺伝子又はＦＬＴ９タンパク質の発現が確認されなかった場合には、イネ植物の穀粒サイズは大きいものと判定できる。
【実施例0045】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0046】
［ｑＧＷＴ１：Ｏｒｙｚａ ｒｕｆｉｐｏｇｏｎにおける穀粒のサイズと数を制御するＱＴＬ］
Ｏ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ系統の穀粒は、サイズや形状など多くの点で異なる (図１参照。)。発明者らは、全集団（３３８ａｃｃ.）又は部分集団、すなわちＯｒ－Ｉ（１５４ａｃｃ.）、Ｏｒ－ＩＩ（１０４ａｃｃ.）、及びＯｒ－ＩＩＩ（８０ａｃｃ.）を使用して、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を実施し、Ｏ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ穀粒の表現型の多様性に寄与する４１の量的形質遺伝子座 （ＱＴＬ） を同定した。このうち、１番染色体上のｑＧＷＴ１に注目した。ｑＧＷＴ１は、パネル全体とＯｒ－ＩＩＩサブパネルを穀粒の厚みと幅に有意に関連しているＳＮＰのクラスターとして使用した分析で検出された。ｑＧＷＴ１の候補領域では、重要なＳＮＰは、Ｏｒ－ＩＩＩにおいて、２つのハプロタイプ(Ｈａｐ１及びＨａｐ２)のみを構成していた。そして、これらのＳＮＰをカバーする連鎖不平衡は、単一の遺伝子Ｏｓ０１ｇ０７４８８００ （ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ５４４９０）を含んでいた。この遺伝子は、ＦＴ－ｌｉｋｅ９ （ＦＴＬ９）をコードする遺伝子である。ＦＴＬ９は、ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｔ （ＦＴ） タンパク質ファミリーのメンバーであり、ＦＴ－ＩＩサブファミリーのイネ科草本特異的系統群に属する(図２参照。)。これは、この遺伝子がＯ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎの穀粒多様性の原因遺伝子であることを示唆する。
Ｏ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ系統の穀粒は、サイズや形状など多くの点で異なる (図１参照。)。発明者らは、全集団（３３８ａｃｃ.）又は部分集団、すなわちＯｒ－Ｉ（１５４ａｃｃ.）、Ｏｒ－ＩＩ（１０４ａｃｃ.）、及びＯｒ－ＩＩＩ（８０ａｃｃ.）を使用して、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を実施し、Ｏ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ穀粒の表現型の多様性に寄与する４１の量的形質遺伝子座 （ＱＴＬ） を同定した。このうち、１番染色体上のｑＧＷＴ１に注目した。ｑＧＷＴ１は、パネル全体とＯｒ－ＩＩＩサブパネルを穀粒の厚みと幅に有意に関連しているＳＮＰのクラスターとして使用した分析で検出された。ｑＧＷＴ１の候補領域では、重要なＳＮＰは、Ｏｒ－ＩＩＩにおいて、２つのハプロタイプ(Ｈａｐ１及びＨａｐ２)のみを構成していた。そして、これらのＳＮＰをカバーする連鎖不平衡は、単一の遺伝子Ｏｓ０１ｇ０７４８８００ （ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ５４４９０）を含んでいた。この遺伝子は、ＦＴ－ｌｉｋｅ９ （ＦＴＬ９）をコードする遺伝子である。ＦＴＬ９は、ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｔ （ＦＴ） タンパク質ファミリーのメンバーであり、ＦＴ－ＩＩサブファミリーのイネ科草本特異的系統群に属する(図２参照。)。これは、この遺伝子がＯ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎの穀粒多様性の原因遺伝子であることを示唆する。
【0047】
Ｏ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ系統の中で、ＦＴＬ９の２つのハプロタイプを特定した。１つは遺伝子の２番目のエクソンにナンセンス変異があり、ＦＴＬ９が機能しなくなる可能性がある。以下、この変異を有するものと有しないＦＴＬ９をそれぞれ、ｆｔｌ９＊（Ｈａｐ１）及びＦＴＬ９Ｗ（Ｈａｐ２） と呼ぶ(図２参照。)。ＧＷＡＳで使用されるＯｒ－ＩＩＩサブパネルにおける８０個のＯ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ系統のうち、Ｈａｐ１を持つものは、Ｈａｐ２を持つものよりも幅が広く、厚い穀粒を規定する(図３及び図４参照。)。さらに、後述するように、ほとんどのジャポニカ米品種はｆｔｌ９＊を保有する。
したがって、発明者は、ＦＴＬ９のナンセンス変異が、穀粒の厚みと幅に影響を与えるという仮説を立て、Ｏ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのＦＴＬ９Ｗをノックアウトすること、及び、ジャポニカ米品種のｆｔｌ９＊バックグラウンドにＦＴＬ９Ｗを導入することにより、この仮説を検証した。
したがって、発明者は、ＦＴＬ９のナンセンス変異が、穀粒の厚みと幅に影響を与えるという仮説を立て、Ｏ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのＦＴＬ９Ｗをノックアウトすること、及び、ジャポニカ米品種のｆｔｌ９＊バックグラウンドにＦＴＬ９Ｗを導入することにより、この仮説を検証した。
【0048】
ＦＴＬ１０は、ＦＴＬ９に最も近いパラログであり、開花に関与することが知られている。また、ヤマカモジグサ（ＢｄＦＴＬ９）及びトウモロコシ（ＺｍＦＴＬ９）におけるＦＴＬ９オルソログの機能としては、開花に関与することがよく知られている。そのため、発明者らは、イネの開花におけるＦＴＬ９の関与をテストした。開花時期の変化は、穂の形状に影響を与える可能性があり、結果として、Ｈｄ３ａ過剰発現の場合と同様に粒径に影響を与える可能性がある。したがって、ＢｄＦＴＬ９とＺｍＦＴＬ９が穀粒のサイズと数に及ぼす影響を議論するのは困難だが、イネにおけるＦＴＬ９は開花に影響を及ぼさないため、穀粒のサイズと数にＦＴＬ９がより直接的に関与していると議論できる。
【0049】
［ｑＧＷＴ１は、葉由来のシグナルとして機能するＦＴＬ９をコードし、穀粒のサイズと数を制御する］
発明者らは、ＦＴＬ９Ｗ（Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ）を保有するＯ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ系統Ｗ０６２９において、ＦＴＬ９ＷのＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９媒介ノックアウトを実施した。ガイドＲＮＡとして、配列番号３（GCAAATACTCCCCTAGTGAT）で表される標的配列を有するものを用いた。予想どおり、種子の幅と厚みは、ノックアウト変異（Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１）のホモ接合性植物の方が、コントロールＷ０６２９ＦＴＬ９Ｗ植物よりも大きかった(図５～図８参照。)。驚くべきことに、両者間で開花時期に差は無かった。更に、ノックアウト系統では、一次枝数（ＰＢＮ）と二次枝数（ＳＢＮ）の両方を含む花序の枝分かれが減少すると共に、花軸長（ＲＬ）が減少し、その結果として花数も減少していた (図９及び図１０参照。)。逆に、ＦＴＬ９Ｗ遺伝子をジャポニカ品種（ｆｔｌ９＊）に導入すると、種子の幅と厚みが減少した（図６、図１１、及び図１２参照。）。特に、強力な構成的プロモーターを使用したＦＴＬ９Ｗの発現により、花序が著しく増加し、その結果、小穂数が増加した。両方のプロモーターからの発現が、種子の幅と厚みに同じように影響を及ぼしたが、この効果は、ネイティブＦＴＬ９Ｗプロモーターを用いた場合より顕著であった(図１３及び図１４参照。)。これは、花序の分枝とは異なり、ＦＴＬ９Ｗによる穀粒サイズの制御が、ＦＴＬ９Ｗの発現レベルに依存していないことを示唆する。また、上記すべての植物の開花時期及び全体的な形態は、親株やコントロールのトランスジェニック植物と区別できなかった。
したがって、ヤマカモジグサやトウモロコシのオーソログＦＴＬ９とは異なり、機能的なＦＴＬ９（つまりＦＴＬ９Ｗ）の存在が、開花時期を変えずに、穀粒サイズの減少と小穂の数の増加につながるものと結論付けられた。
発明者らは、ＦＴＬ９Ｗ（Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ）を保有するＯ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ系統Ｗ０６２９において、ＦＴＬ９ＷのＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９媒介ノックアウトを実施した。ガイドＲＮＡとして、配列番号３（GCAAATACTCCCCTAGTGAT）で表される標的配列を有するものを用いた。予想どおり、種子の幅と厚みは、ノックアウト変異（Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿ｃ１）のホモ接合性植物の方が、コントロールＷ０６２９ＦＴＬ９Ｗ植物よりも大きかった(図５～図８参照。)。驚くべきことに、両者間で開花時期に差は無かった。更に、ノックアウト系統では、一次枝数（ＰＢＮ）と二次枝数（ＳＢＮ）の両方を含む花序の枝分かれが減少すると共に、花軸長（ＲＬ）が減少し、その結果として花数も減少していた (図９及び図１０参照。)。逆に、ＦＴＬ９Ｗ遺伝子をジャポニカ品種（ｆｔｌ９＊）に導入すると、種子の幅と厚みが減少した（図６、図１１、及び図１２参照。）。特に、強力な構成的プロモーターを使用したＦＴＬ９Ｗの発現により、花序が著しく増加し、その結果、小穂数が増加した。両方のプロモーターからの発現が、種子の幅と厚みに同じように影響を及ぼしたが、この効果は、ネイティブＦＴＬ９Ｗプロモーターを用いた場合より顕著であった(図１３及び図１４参照。)。これは、花序の分枝とは異なり、ＦＴＬ９Ｗによる穀粒サイズの制御が、ＦＴＬ９Ｗの発現レベルに依存していないことを示唆する。また、上記すべての植物の開花時期及び全体的な形態は、親株やコントロールのトランスジェニック植物と区別できなかった。
したがって、ヤマカモジグサやトウモロコシのオーソログＦＴＬ９とは異なり、機能的なＦＴＬ９（つまりＦＴＬ９Ｗ）の存在が、開花時期を変えずに、穀粒サイズの減少と小穂の数の増加につながるものと結論付けられた。
【0050】
穀粒のサイズは、穀粒を取り囲む母系組織である穎のサイズに関連する。ＦＴＬ９Ｗが穀粒のサイズをどのように制御するかを理解するために、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ノックアウト株とその野生株バックグランドの間の成熟した穎花の穎における細胞サイズを比較した(図１５～図１９参照。)。Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿Ｃ１の穎の細胞は、Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗの穎の細胞よりも幅が広いことを示した（図１７～図１９参照。）。これは、Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿Ｃ１の幅の広い穀粒が、穎内の細胞幅の増加によって引き起こされる可能性があることを示唆する。穎の細胞サイズが、肥大した穀粒の二次的効果の影響を受ける（減少した粒数により許容される個々の種子への母系資源のより多くの配分におそらく起因する）か、又はＦＴＬ９により直接的に影響を受けるかどうかを判断するために、受精前、つまり母系資源の種子への割り当て前に、穎内の細胞サイズを測定した(図２０～図２２参照。)。登熟前の穎発達期に、Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿Ｃ１の穎の細胞は、Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗの穎の細胞よりも幅が広かった。したがって、穀粒のサイズは、（減少した穀粒数によって引き起こされる）母系資源の過剰な割り当てによる二次効果ではなく、穎細胞サイズを制御するＦＴＬ９Ｗの影響を受ける。したがって、ＦＴＬ９Ｗは、穀粒のサイズと数を別個に制御する。シロイヌナズナのＴＦＬ１は、胚乳の細胞膜形成のタイミングを調節することにより、種子のサイズを制御する。ＦＴＬ９が、ＦＴ遺伝子ファミリーのイネ科草本特異的系統群に属し、ＦＴＬ９が穎の細胞サイズに影響を与えることを考慮すると、子孫の胚乳の細胞膜形成に影響を与えるＴＦＬ１とは異なり、ＦＴＬ９とＴＦＬ１による穀粒と種子のサイズを制御するメカニズムは異なるようである。
【0051】
ＦＴＬ９による穀粒サイズと数の制御の分子基盤を明らかにするために、小穂が発達している花序分裂組織を使用してｍＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した。花の分裂組織には、Ｗ０６２９ＦＴＬ９ＷとＷ０６２９ｆｔｌ９＿Ｃ１の初発及び成長中の内穎と外穎（穎）の両方が含まれている。Ｗ０６２９ｆｔｌ９＿Ｃ１と比較して、Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗでは５４７個の差次的に発現する遺伝子（１１３個が上方制御され、４３４個が下方制御されている）を見出した。遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント分析により、花の発達と転写因子に関連する用語が頻出した。転写因子ファミリー間では、ＦＴＬ９ＷバックグラウンドにおけるＭＡＤＳボックス転写因子をコードする遺伝子発現の低下が最も顕著であった。ＯｓＭＡＤＳ１は最も急激な発現減少を示し、ＳＥＰ系統群ＭＡＤＳボックス遺伝子の他のメンバーがそれに続いた。ＯｓＭＡＤＳ１は、枝分裂組織から小穂分裂組織への移行を促進し、花の発達を制御する分裂組織の運命に関係することが知られている。Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗにおけるより低いＯｓＭＡＤＳ１発現は、枝分裂組織から小穂分裂組織への移行を遅らせ、穂の発達中の分岐段階を長引かせる可能性がある。
したがって、穂はより多くの分枝（ＰＢＮ，ＳＢＮ）を有し、より長い穂軸の長さを有し、より多い小穂を有する。ＯｓＭＡＤＳ１発現は穀粒サイズに影響を与える可能性がある。したがって、活性化ＦＴＬ９Ｗが、ＯｓＭＡＤＳ１発現の抑制を介して、穀粒サイズと数に影響を与える可能性がある。確かに、ＦＴＬ９Ｗの発現が、生殖時のトランスジェニック日本晴の葉におけるＯｓＭＡＤＳ１発現を大幅に減少させた。これは、葉におけるＦＴＬ９によるＯｓＭＡＤＳ１の抑制が、花序または小穂で特異的に発現し、枝分かれや粒の大きさを制御する追加の因子を必要としないことを示す。ＦＴＬ９によるＯｓＭＡＤＳ１の制御が直接的であるか間接的であるかは依然として不明であった。穂の分岐や穀粒サイズを調節することが知られているいくつかの遺伝子の発現レベルも、Ｗ０６２９ＦＴＬ９ＷとＷ０６２９ｆｔｌ９＿Ｃ１の間で変動しているため、ＯｓＭＡＤＳ１以外の因子がＦＴＬ９の下流を作用し、穂の構造と穀粒サイズを調節する可能性を否定できない。
したがって、穂はより多くの分枝（ＰＢＮ，ＳＢＮ）を有し、より長い穂軸の長さを有し、より多い小穂を有する。ＯｓＭＡＤＳ１発現は穀粒サイズに影響を与える可能性がある。したがって、活性化ＦＴＬ９Ｗが、ＯｓＭＡＤＳ１発現の抑制を介して、穀粒サイズと数に影響を与える可能性がある。確かに、ＦＴＬ９Ｗの発現が、生殖時のトランスジェニック日本晴の葉におけるＯｓＭＡＤＳ１発現を大幅に減少させた。これは、葉におけるＦＴＬ９によるＯｓＭＡＤＳ１の抑制が、花序または小穂で特異的に発現し、枝分かれや粒の大きさを制御する追加の因子を必要としないことを示す。ＦＴＬ９によるＯｓＭＡＤＳ１の制御が直接的であるか間接的であるかは依然として不明であった。穂の分岐や穀粒サイズを調節することが知られているいくつかの遺伝子の発現レベルも、Ｗ０６２９ＦＴＬ９ＷとＷ０６２９ｆｔｌ９＿Ｃ１の間で変動しているため、ＯｓＭＡＤＳ１以外の因子がＦＴＬ９の下流を作用し、穂の構造と穀粒サイズを調節する可能性を否定できない。
【0052】
１４－３－３、ＦＴ/Ｈｄ３ａ、及びＦＤから構成されるタンパク質複合体の形成は、下流の遺伝子を制御するために不可欠である。ＦＴＬ９は、Ｈｄ３ａ：１４－３－３ タンパク質相互作用に必要とされる保存されたアミノ酸を共有するため、おそらく、分裂組織におけるＦＴＬ９の作用機序もＨｄ３ａの場合と同様に１４－３－３を含むタンパク質複合体の形成を含む。ただし、ＦＴＬ９は、機能喪失実験及び機能獲得実験の両方で開花に影響を及ぼさないことを考慮すると、分裂組織でＦＴＬ９活性を媒介する分子機構と相互作用は、Ｈｄ３ａのものとは異なると考えられる。
ＦＴファミリーの中には、下流遺伝子の制御において、活性化と抑制の相反する方向があることが知られている。ＦＴ/Ｈｄ３ａはアクティベーターとして機能し、ＴＦＬ/ＲＣＮはリプレッサーとして機能する。ＦＴＬ９はリプレッサーとして機能すると推測される。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析における差次的に発現される遺伝子解析において、Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ内の下方制御された遺伝子の数は、上方制御された遺伝子の数の約４倍であった(下方制御された遺伝子数４３４個対上方制御された遺伝子数１１３個)。
ＦＴファミリータンパク質の反対の活性を決定するセグメントＢのＣ末端領域の主要なアミノ酸残基/モチーフもこれを裏付けている。アクティベーター型ＦＴは、この領域の高く保存された残基を共有する。この領域のアミノ酸配列のわずかな変化で、アクチベーターをリプレッサーに変換する。リプレッサータイプ（ＴＦＬ/ＲＣＮ）では、この領域のアミノ酸配列は分岐している。ＦＴＬ９は、ＴＦＬ/ＲＣＮ系統群に属さないが、系統発生解析ではイネ科草本特異的な系統群に属する。しかしながら、ＦＴＬ９もＦＴ/Ｈｄ３ａアクチベーターメンバーと保存された残基を共有していないため、ＦＴＬ９はＦＴファミリーのアクチベータータイプではなくリプレッサータイプであることが強く示唆される。
ＦＴＬ９は、ＦＴ遺伝子ファミリーに属しているため、ＦＴＬ９は花序の分岐と穀粒サイズを調節する非細胞自律性シグナルとして機能する可能性がある。つまり、花序分裂組織に輸送され、小穂が発達する前に、タンパク質が葉の中で合成される可能性がある。イネ発育中のＦＴＬ９ ＲＮＡの発現解析により、ＦＴＬ９Ｗ ＲＮＡが生殖段階で葉で優先的に発現され、花序分裂組織と若い小穂では検出されないことが明らかとなった (図２３参照。)。これによると、天然のＦＴＬ９Ｗプロモーターから発現したＦＴＬ９Ｗ：：ＧＵＳ及びＦＴＬ９Ｗ：：ＧＦＰ融合タンパク質を用いて、ＦＴＬ９Ｗプロモーター活性が大小の葉脈を含む葉身の維管束組織周囲で検出され(図２４参照。)、細胞間の移動に欠陥のあるＦＴＬ９Ｗ：：ＧＵＳ融合タンパク質の蓄積は、花序分裂組織（ＩＦＭｓ）又は発達中の小穂では検出されなかった (図２４参照。)。さらに、細胞間の移動を可能にすると推定されるＦＴＬ９Ｗ：：ＧＦＰ融合タンパク質は、天然のＦＴＬ９Ｗプロモーター又は師部特異的なｒｏｌＣプロモーターによって駆動され、花序に蓄積する。ＦＴＬ９Ｗ抗体を使用したイムノブロット分析で、ＦＴＬ９Ｗタンパク質がＩＦＭｓ及び発達中の小穂に蓄積することも確認した。これらの発見は、ＦＴＬ９Ｗタンパク質が葉で合成され、穎細胞に作用して種子のサイズを制御するという考えを裏付ける。また、ＦＴＬ９Ｗタンパク質は、ＩＦＭｓ内で機能して小穂の数を制御する。
ＦＴファミリーの中には、下流遺伝子の制御において、活性化と抑制の相反する方向があることが知られている。ＦＴ/Ｈｄ３ａはアクティベーターとして機能し、ＴＦＬ/ＲＣＮはリプレッサーとして機能する。ＦＴＬ９はリプレッサーとして機能すると推測される。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析における差次的に発現される遺伝子解析において、Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ内の下方制御された遺伝子の数は、上方制御された遺伝子の数の約４倍であった(下方制御された遺伝子数４３４個対上方制御された遺伝子数１１３個)。
ＦＴファミリータンパク質の反対の活性を決定するセグメントＢのＣ末端領域の主要なアミノ酸残基/モチーフもこれを裏付けている。アクティベーター型ＦＴは、この領域の高く保存された残基を共有する。この領域のアミノ酸配列のわずかな変化で、アクチベーターをリプレッサーに変換する。リプレッサータイプ（ＴＦＬ/ＲＣＮ）では、この領域のアミノ酸配列は分岐している。ＦＴＬ９は、ＴＦＬ/ＲＣＮ系統群に属さないが、系統発生解析ではイネ科草本特異的な系統群に属する。しかしながら、ＦＴＬ９もＦＴ/Ｈｄ３ａアクチベーターメンバーと保存された残基を共有していないため、ＦＴＬ９はＦＴファミリーのアクチベータータイプではなくリプレッサータイプであることが強く示唆される。
ＦＴＬ９は、ＦＴ遺伝子ファミリーに属しているため、ＦＴＬ９は花序の分岐と穀粒サイズを調節する非細胞自律性シグナルとして機能する可能性がある。つまり、花序分裂組織に輸送され、小穂が発達する前に、タンパク質が葉の中で合成される可能性がある。イネ発育中のＦＴＬ９ ＲＮＡの発現解析により、ＦＴＬ９Ｗ ＲＮＡが生殖段階で葉で優先的に発現され、花序分裂組織と若い小穂では検出されないことが明らかとなった (図２３参照。)。これによると、天然のＦＴＬ９Ｗプロモーターから発現したＦＴＬ９Ｗ：：ＧＵＳ及びＦＴＬ９Ｗ：：ＧＦＰ融合タンパク質を用いて、ＦＴＬ９Ｗプロモーター活性が大小の葉脈を含む葉身の維管束組織周囲で検出され(図２４参照。)、細胞間の移動に欠陥のあるＦＴＬ９Ｗ：：ＧＵＳ融合タンパク質の蓄積は、花序分裂組織（ＩＦＭｓ）又は発達中の小穂では検出されなかった (図２４参照。)。さらに、細胞間の移動を可能にすると推定されるＦＴＬ９Ｗ：：ＧＦＰ融合タンパク質は、天然のＦＴＬ９Ｗプロモーター又は師部特異的なｒｏｌＣプロモーターによって駆動され、花序に蓄積する。ＦＴＬ９Ｗ抗体を使用したイムノブロット分析で、ＦＴＬ９Ｗタンパク質がＩＦＭｓ及び発達中の小穂に蓄積することも確認した。これらの発見は、ＦＴＬ９Ｗタンパク質が葉で合成され、穎細胞に作用して種子のサイズを制御するという考えを裏付ける。また、ＦＴＬ９Ｗタンパク質は、ＩＦＭｓ内で機能して小穂の数を制御する。
【0053】
［ＦＴＬ９は母系資源の利用可能性を仲介するシグナルとして機能する］
ＦＴＬ９Ｗが穀粒の数とサイズを調節する非細胞自律性シグナルとして機能する場合、シグナル合成に影響を与える情報は、このプロセスにとって不可欠である。生殖段階におけるＦＴＬ９Ｗ ＲＮＡの発現が一時的に制限されることの潜在的なシナリオの １つは、栄養段階から生殖段階への移行が、ＦＴＬ９Ｗ ＲＮＡの発現を引き起こすことである。この仮説を検証するために、イネのフロリゲン遺伝子であるＨｄ３ａの過剰発現による生殖期への移行と開花を早熟誘導するトランスジェニック植物におけるＦＴＬ９Ｗの発現を分析した。ＦＴＬ９Ｗの発現は検出されなかったが、生殖段階のマーカーＲＦＴ１は、高度に発現していた(図２５及び図２６参照。)。これは、栄養段階から生殖段階への移行は、ＦＴＬ９Ｗ発現に影響を与えないことを示す。
ＦＴＬ９Ｗが穀粒の数とサイズを調節する非細胞自律性シグナルとして機能する場合、シグナル合成に影響を与える情報は、このプロセスにとって不可欠である。生殖段階におけるＦＴＬ９Ｗ ＲＮＡの発現が一時的に制限されることの潜在的なシナリオの １つは、栄養段階から生殖段階への移行が、ＦＴＬ９Ｗ ＲＮＡの発現を引き起こすことである。この仮説を検証するために、イネのフロリゲン遺伝子であるＨｄ３ａの過剰発現による生殖期への移行と開花を早熟誘導するトランスジェニック植物におけるＦＴＬ９Ｗの発現を分析した。ＦＴＬ９Ｗの発現は検出されなかったが、生殖段階のマーカーＲＦＴ１は、高度に発現していた(図２５及び図２６参照。)。これは、栄養段階から生殖段階への移行は、ＦＴＬ９Ｗ発現に影響を与えないことを示す。
【0054】
別のシナリオは、葉でのＦＴＬ９発現は、Ｈｄ３ａやＢｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎのＦＴＬ９のオルソログＢｄＦＴＬ９などの他のＦＴ遺伝子と同様に短日長に応答するということである。この仮説を検証するためにするために、内因性ｆｔｌ９＊を有するジャポニカバックグラウンドにおけるＦＴＬ９Ｗゲノム断片を保有するトランスジェニック植物において、異なる日長下条件でのＦＴＬ９ＷとＨｄ３ａの発現を分析した。
Ｈｄ３ａ発現は短日条件下では直ちに誘導されたのに対し、ＦＴＬ９Ｗ発現は長日から短日へ日長が変化する前に始まった(図２７参照。)。これは、トウモロコシやヤマカモジグサのＦＴＬ９ファミリーのメンバーは、日長の変化により誘導され、開花時期に影響するが、ＦＴＬ９Ｗが日長によって誘導されないことを示唆する。
このことは、パラログであるＦＴＬ１０、またはトウモロコシやヤマカモジグサのオルソログとは異なり、イネのＦＴＬ９が開花時期に影響を及ぼさないという事実と一致する。
栄養期から生殖期への発達移行はＦＴＬ９Ｗを誘発しないととすれば、ＦＴＬ９Ｗの発現は、子孫に割り当てられる母系資源のソースの強さに関する情報によって制御されるのではないかと考えられる。母系資源に関する情報を提供するのに適した候補は、糖類などの光合成同化である。糖が、登熟前の母系葉においてＦＴＬ９を誘導するために、登熟時に子孫に割り当てられる母系資源としての役割に加えてシグナルとしても機能すると仮説を立てた。したがって、糖がＦＴＬ９の発現を誘導できるかどうかを検証した。生理学的に適切なレベルの糖で処理したＯ.ｒｕｆｉｐｏｇｏｎの幼苗 (Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ) 及びトランスジェニック系統 (ＮＢＦＴＬ９ｐ：：ＦＴＬ９Ｗ)は、内因性ＦＴＬ９Ｗと導入遺伝子由来ＦＴＬ９Ｗ両方の発現が、スクロース、フルクトース、グルコースによって誘導されたが、浸透圧ストレスをシミュレートするためによく使用される糖アルコールであるマンニトールによっては誘導されなかった（図２８及び図２９参照。）。
したがって、葉の炭水化物又はエネルギー代謝の変化は、葉のＦＴＬ９Ｗ発現を調節する可能性がある。さらに、糖によるＦＴＬ９Ｗ誘導の程度は、用量依存的であった。試験したスクロース濃度の範囲は、生理学的に関連しており、光合成中の葉の内因性スクロース含有量と同様であった。この結果は、ＦＴＬ９が母系資源レベルに応じて、子孫の数とサイズを制御するシグナルとして機能している可能性を示唆する。
Ｈｄ３ａ発現は短日条件下では直ちに誘導されたのに対し、ＦＴＬ９Ｗ発現は長日から短日へ日長が変化する前に始まった(図２７参照。)。これは、トウモロコシやヤマカモジグサのＦＴＬ９ファミリーのメンバーは、日長の変化により誘導され、開花時期に影響するが、ＦＴＬ９Ｗが日長によって誘導されないことを示唆する。
このことは、パラログであるＦＴＬ１０、またはトウモロコシやヤマカモジグサのオルソログとは異なり、イネのＦＴＬ９が開花時期に影響を及ぼさないという事実と一致する。
栄養期から生殖期への発達移行はＦＴＬ９Ｗを誘発しないととすれば、ＦＴＬ９Ｗの発現は、子孫に割り当てられる母系資源のソースの強さに関する情報によって制御されるのではないかと考えられる。母系資源に関する情報を提供するのに適した候補は、糖類などの光合成同化である。糖が、登熟前の母系葉においてＦＴＬ９を誘導するために、登熟時に子孫に割り当てられる母系資源としての役割に加えてシグナルとしても機能すると仮説を立てた。したがって、糖がＦＴＬ９の発現を誘導できるかどうかを検証した。生理学的に適切なレベルの糖で処理したＯ.ｒｕｆｉｐｏｇｏｎの幼苗 (Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗ) 及びトランスジェニック系統 (ＮＢＦＴＬ９ｐ：：ＦＴＬ９Ｗ)は、内因性ＦＴＬ９Ｗと導入遺伝子由来ＦＴＬ９Ｗ両方の発現が、スクロース、フルクトース、グルコースによって誘導されたが、浸透圧ストレスをシミュレートするためによく使用される糖アルコールであるマンニトールによっては誘導されなかった（図２８及び図２９参照。）。
したがって、葉の炭水化物又はエネルギー代謝の変化は、葉のＦＴＬ９Ｗ発現を調節する可能性がある。さらに、糖によるＦＴＬ９Ｗ誘導の程度は、用量依存的であった。試験したスクロース濃度の範囲は、生理学的に関連しており、光合成中の葉の内因性スクロース含有量と同様であった。この結果は、ＦＴＬ９が母系資源レベルに応じて、子孫の数とサイズを制御するシグナルとして機能している可能性を示唆する。
【0055】
［Ｏ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎにおけるｆｔｌ９＊の進化と栽培化への関与］
この可能性は、種子生産が、干ばつや気温などの非生物的ストレスに特に敏感で、環境によって変動する母系光合成に強く依存していることと一致する。したがって、ＦＴＬ９Ｗによる穀粒のサイズと数の編成は、数の増加とサイズの減少が連動しており、野生植物にとって変動する環境に適応するために重要なメカニズムである可能性がある。個々のＷ０６２９ＦＴＬ９Ｗ及びＷ０６２９ｆｔｌ９＿Ｃ１植物間の穀粒のサイズと数の変動の分析により、Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗでのサイズと数の間の負の相関が明らかになった。ただし、この相関関係はＷ０６２９ｆｔｌ９＿Ｃ１ではあまり明らかではなかった。
したがって、ＦＴＬ９Ｗは、十分な母系リソースが利用可能な場合、サイズと数を微調整して前者を減らし、後者を増やすことができる。適切な状態にあるとき、母系親は各子孫に過剰なリソースを割り当ててリソースを無駄にする必要がなくなるため、野生植物はこの恩恵を受けると考えられる。これは母親が子供のサイズを最小限に抑えようとする親子の対立理論に従ったものである。
ただし、サイズと数の増加はどちらもヒトに好まれるため、繁殖プログラムでは、この特性が悪影響を与える可能性がある。ｆｔｌ９＊を搭載する日本晴やＴａｉｃｈｕｎｇ ６５（Ｔ６５）を含むジャポニカ米の代表的な品種を考慮すると、この遺伝子の機能の欠損が、イネの栽培化プロセスに貢献するのではないかと推測される。そこで、栽培イネコレクション間のｆｔｌ９＊変異の分布を分析した。この変異はジャポニカ系統のほとんどに存在するが、インディカ系統とａｕｓ系統にはまれであることが判明した（図３０参照。）。これは、特にジャポニカ米の栽培化において、ｆｔｌ９＊が穀粒の幅と厚みの増大に寄与した可能性があることを示唆する。Ｏ.ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ系統のうち、Ｏｒ－ＩＩＩ [ジャポニカが起源とするＯ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのサブグループ] における系統の４３％はｆｔｌ９＊を保有しているのに対し、Ｏｒ－Ｉではわずか１．９％であり、Ｏｒ－ＩＩでは７．４％であった(図３１参照。)。野生集団の間で、非機能的なｆｔｌ９＊の高い対立遺伝子頻度は、祖先Ｏｒ－ＩＩＩの変異した対立遺伝子の（自然または人工の）ポジティブセレクションが示唆される。
栽培化の間に古代Ｏｒ－ＩＩＩのｆｔｌ９＊変異が、Ｏ. ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐジャポニカに導入されたというシナリオが考えられる。このシナリオは、栽培イネでは、多くのＯ.ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ系統が共有するハプロタイプと一致する、唯一のｆｔｌ９＊対立遺伝子を示したハプロタイプネットワーク分析と一致する(図３２参照。)。Ｏ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのｆｔｌ９＊を有するいくつかのハプロタイプの存在は、ｆｔｌ９＊変異がジャポニカ品種の確立よりも前に存在したことを示唆する。さらに、ジャポニカｆｔｌ９＊対立遺伝子が、Ｏｒ－ＩＩＩ間での分岐に続いて、最近の異系交雑を介してＯｒ－ＩＩＩ個体群に戻る可能性は低い。これは、ジャポニカ品種のｆｔｌ９＊対立遺伝子がＯ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ系統に由来するという考えを裏付ける。さらに、拡張ハプロタイプホモ接合性（ＥＨＨ）分析は、Ｏ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのｆｔｌ９＊対立遺伝子を有するハプロタイプ(Ｈａｐ１)の長さは、Ｏｒ－ＩＩＩ のＦＴＬ９Ｗ対立遺伝子を有するハプロタイプ(Ｈａｐ２)の長さよりも有意に大きく、統計的に有意な統合ハプロタイプスコアを有する（ｉＨＳ） (Ｐ＝０．００４７)ことを示した。これは、Ｏｒ－ＩＩＩサブグループの進化におけるｆｔｌ９＊対立遺伝子のポジティブ選択を裏付ける (図３３参照。）。これらの結果は、野生集団におけるｆｔｌ９＊の選択を示唆する(図３４参照。）。作物の野生祖先の可食部分のサイズの増加が、作物の栽培化における初期段階の１つであること、及びＯ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのいくつかの集団の実験栽培により数世代以内に穀粒のサイズが増加したことを考慮すると、米の農業システムが確立される前に、古代の人類集団は、食糧生産と収量促進のため、Ｏ.ｒｕｆｉｐｏｇｏｎの(ｆｔｌ９＊親からの)より大きな種子を収集して散布した可能性があることが推測される。
この可能性は、種子生産が、干ばつや気温などの非生物的ストレスに特に敏感で、環境によって変動する母系光合成に強く依存していることと一致する。したがって、ＦＴＬ９Ｗによる穀粒のサイズと数の編成は、数の増加とサイズの減少が連動しており、野生植物にとって変動する環境に適応するために重要なメカニズムである可能性がある。個々のＷ０６２９ＦＴＬ９Ｗ及びＷ０６２９ｆｔｌ９＿Ｃ１植物間の穀粒のサイズと数の変動の分析により、Ｗ０６２９ＦＴＬ９Ｗでのサイズと数の間の負の相関が明らかになった。ただし、この相関関係はＷ０６２９ｆｔｌ９＿Ｃ１ではあまり明らかではなかった。
したがって、ＦＴＬ９Ｗは、十分な母系リソースが利用可能な場合、サイズと数を微調整して前者を減らし、後者を増やすことができる。適切な状態にあるとき、母系親は各子孫に過剰なリソースを割り当ててリソースを無駄にする必要がなくなるため、野生植物はこの恩恵を受けると考えられる。これは母親が子供のサイズを最小限に抑えようとする親子の対立理論に従ったものである。
ただし、サイズと数の増加はどちらもヒトに好まれるため、繁殖プログラムでは、この特性が悪影響を与える可能性がある。ｆｔｌ９＊を搭載する日本晴やＴａｉｃｈｕｎｇ ６５（Ｔ６５）を含むジャポニカ米の代表的な品種を考慮すると、この遺伝子の機能の欠損が、イネの栽培化プロセスに貢献するのではないかと推測される。そこで、栽培イネコレクション間のｆｔｌ９＊変異の分布を分析した。この変異はジャポニカ系統のほとんどに存在するが、インディカ系統とａｕｓ系統にはまれであることが判明した（図３０参照。）。これは、特にジャポニカ米の栽培化において、ｆｔｌ９＊が穀粒の幅と厚みの増大に寄与した可能性があることを示唆する。Ｏ.ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ系統のうち、Ｏｒ－ＩＩＩ [ジャポニカが起源とするＯ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのサブグループ] における系統の４３％はｆｔｌ９＊を保有しているのに対し、Ｏｒ－Ｉではわずか１．９％であり、Ｏｒ－ＩＩでは７．４％であった(図３１参照。)。野生集団の間で、非機能的なｆｔｌ９＊の高い対立遺伝子頻度は、祖先Ｏｒ－ＩＩＩの変異した対立遺伝子の（自然または人工の）ポジティブセレクションが示唆される。
栽培化の間に古代Ｏｒ－ＩＩＩのｆｔｌ９＊変異が、Ｏ. ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐジャポニカに導入されたというシナリオが考えられる。このシナリオは、栽培イネでは、多くのＯ.ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ系統が共有するハプロタイプと一致する、唯一のｆｔｌ９＊対立遺伝子を示したハプロタイプネットワーク分析と一致する(図３２参照。)。Ｏ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのｆｔｌ９＊を有するいくつかのハプロタイプの存在は、ｆｔｌ９＊変異がジャポニカ品種の確立よりも前に存在したことを示唆する。さらに、ジャポニカｆｔｌ９＊対立遺伝子が、Ｏｒ－ＩＩＩ間での分岐に続いて、最近の異系交雑を介してＯｒ－ＩＩＩ個体群に戻る可能性は低い。これは、ジャポニカ品種のｆｔｌ９＊対立遺伝子がＯ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ系統に由来するという考えを裏付ける。さらに、拡張ハプロタイプホモ接合性（ＥＨＨ）分析は、Ｏ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのｆｔｌ９＊対立遺伝子を有するハプロタイプ(Ｈａｐ１)の長さは、Ｏｒ－ＩＩＩ のＦＴＬ９Ｗ対立遺伝子を有するハプロタイプ(Ｈａｐ２)の長さよりも有意に大きく、統計的に有意な統合ハプロタイプスコアを有する（ｉＨＳ） (Ｐ＝０．００４７)ことを示した。これは、Ｏｒ－ＩＩＩサブグループの進化におけるｆｔｌ９＊対立遺伝子のポジティブ選択を裏付ける (図３３参照。）。これらの結果は、野生集団におけるｆｔｌ９＊の選択を示唆する(図３４参照。）。作物の野生祖先の可食部分のサイズの増加が、作物の栽培化における初期段階の１つであること、及びＯ. ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのいくつかの集団の実験栽培により数世代以内に穀粒のサイズが増加したことを考慮すると、米の農業システムが確立される前に、古代の人類集団は、食糧生産と収量促進のため、Ｏ.ｒｕｆｉｐｏｇｏｎの(ｆｔｌ９＊親からの)より大きな種子を収集して散布した可能性があることが推測される。
【産業上の利用可能性】
【0056】
本発明によれば、イネの穀粒サイズを大きくし、収量の向上を可能とする技術を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【配列表】