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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024014070
(43)【公開日】2024-02-01
(54)【発明の名称】膵島細胞又は膵島様細胞の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240125BHJP
C12M 1/00 20060101ALN20240125BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240125BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071 ZNA
C12M1/00 A
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022116640
(22)【出願日】2022-07-21
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 公開日（発行日） 令和３年（２０２１年）８月７日 刊行物 オープンアクセスジャーナル 「Ｃｅｌｌｓ ２０２１」（Ｃｅｌｌｓ ２０２１，１０，２０１７．） 研究論文 『Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｔｏ Ｉｓｌｅｔ－ｌｉｋｅ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ』 ＭＤＰＩ（Ｍｕｌｔｉｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ） 発行 ＜オープンアクセス・掲載ＵＲＬ ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｃｅｌｌｓ１００８２０１７＞ ＜資 料＞ Ｃｅｌｌｓ ２０２１ 掲載研究論文
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000000941
【氏名又は名称】株式会社カネカ
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100141139
【弁理士】
【氏名又は名称】及川 周
(74)【代理人】
【識別番号】100134359
【弁理士】
【氏名又は名称】勝俣 智夫
(74)【代理人】
【識別番号】100162868
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 英輔
(74)【代理人】
【識別番号】100178847
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 映美
(72)【発明者】
【氏名】酒井 康行
(72)【発明者】
【氏名】西川 昌輝
(72)【発明者】
【氏名】チェ ヒュンジン
(72)【発明者】
【氏名】神林 昌
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029BB11
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BB15
4B065BC12
4B065BD39
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】分化誘導効率が高く、且つ、優れた機能性を有する膵島細胞又は膵島様細胞の製造方法を提供する。
【解決手段】培地と分化誘導因子とを含む第一領域と、培地成分の少なくとも一部を含む第二領域とを有し、前記第一領域と前記第二領域とが膜で隔離されている培養装置を用いて前記第一領域において内分泌前駆細胞を培養することを含み、前記膜の分画分子量が５００～１７，０００である、膵島細胞又は膵島様細胞の製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】培地と分化誘導因子とを含む第一領域と、培地成分の少なくとも一部を含む第二領域とを有し、前記第一領域と前記第二領域とが膜で隔離されている培養装置を用いて前記第一領域において内分泌前駆細胞を培養することを含み、前記膜の分画分子量が５００～１７，０００である、膵島細胞又は膵島様細胞の製造方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
培地と分化誘導因子とを含む第一領域と、培地成分の少なくとも一部を含む第二領域とを有し、前記第一領域と前記第二領域とが膜で隔離されている培養装置を用いて前記第一領域において内分泌前駆細胞を培養することを含み、前記膜の分画分子量が５００～１７，０００である、膵島細胞又は膵島様細胞の製造方法。
【請求項2】
第一領域の培養において、第一領域の培地の培地交換が２回未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第二領域の培地成分の少なくとも一部が、グルコースである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記第一領域と前記第二領域とが膜を隣接して配置され、前記膜を介して前記第一領域と前記第二領域との間で物質交換がなされる、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
第一領域の培地におけるグルコース濃度が培養中において５ｍＭ以上に維持される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
第一領域の培地における乳酸濃度が培養中において０．３ｍＭ以上になる、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記分化誘導因子が、少なくともＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤が、アクチビンＡ及びＢＭＰ４からなる群から選択される少なくとも１種類である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
さらに、前記分化誘導因子が、インスリン様増殖因子、ＧＬＰ－１受容体シグナル活性化剤及びアデニレートシクラーゼ活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種類を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記第一領域と前記第二領域が培地を含み、第一領域の培地量と第二領域の培地量の体積比が、１：１０，０００から１：１である、請求項６に記載の方法。
【請求項11】
前記第一領域における細胞の密度が、１×１０４～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、膵島細胞又は膵島様細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
再生医療は、ドナー不足を課題とする臓器移植の代替法や難病の新たな治療法開発などにおいて大きな期待が寄せられている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は多能性及び無限増殖性を有しているため、再生医療に必要とされる細胞を調製するための細胞ソースとして期待されている。これらの多能性幹細胞を用いた再生医療の実用化に際しては、多能性幹細胞を効率よく目的の体細胞に分化誘導させる技術の確立が必要であり、多様な分化誘導方法について報告されている。
【0003】
一般的には、各種の分化誘導因子（サイトカイン、成長因子、液性因子又は増殖因子と言う場合もある）を添加した液体培地中において多能性幹細胞を培養することによって、多能性幹細胞の分化誘導が行われている。例えば、特許文献１には、多能性幹細胞を内胚葉系細胞へ分化させるためにアクチビンＡを含む分化培地において多能性幹細胞を培養するステップと、前記内胚葉系細胞にｐｄｘ－１ ｍＲＮＡをトランスフェクトして、さらに分化した細胞を生じさせるステップと、ニコチンアミド、エキセンディン４、及びＧＬＰ－１からなる群から選択される成熟因子を含む培地においてさらに分化した細胞を培養し、それにより、多能性幹細胞から膵島細胞を作製するステップとを含む、多能性幹細胞から膵島細胞を作製する方法が記載されている。
【0004】
膵島（ランゲルハンス島）は、膵臓の内部に存在する内分泌組織であり、インスリンやグルカゴンを分泌し、主に血糖調整を行っている。膵島は種々の細胞で構成されており、α細胞、β細胞、δ細胞等が存在する。特許文献２には、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞から膵臓β細胞を製造する方法が記載されている。特許文献３には、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞から膵臓α細胞を製造する方法が記載されている。しかしながら、従来の方法では、分化誘導の効率やグルコース応答性等の機能性が不十分である。また、膵島移植は、多数の細胞が必要であることから、膵島細胞の製造には浮遊培養方式が向いており、浮遊培養方式にすることで、前述の機能性が改善傾向となるという報告があるが、未だ不十分なレベルである。
【0005】
また、多能性幹細胞から膵島細胞を得るためには、高価な分化誘導因子を使用することから、生産コストが高いという問題がある。特許文献４では、分化誘導のごく初期にあたる内胚葉分化において、高分子系の添加剤を効率的に使用するために透析膜を使用しているが、それ以降の膵島細胞を得るまでの長い工程においては、低分子系の添加剤を比較的多く使用することから、透析膜使用によるコストダウンの効果が見込みにくいと考えられており、透析膜を使用することについて全く報告がなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２０１５－１６５７８３号公報
【特許文献2】国際公開第２０１９／２０８７８８号
【特許文献3】国際公開第２０２１／１９３３６０号
【特許文献4】特許第６９５０８８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、内分泌前駆細胞を培養することを含む膵島細胞又は膵島様細胞の製造方法であって、分化誘導効率が高く、且つ、優れた機能性を有する膵島細胞又は膵島様細胞の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、内分泌前駆細胞を、透析膜を使用して培養することにより、分化誘導効率が高く、且つ、優れた機能性を有する膵島細胞又は膵島様細胞が得られることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【0009】
すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
［１］培地と分化誘導因子とを含む第一領域と、培地成分の少なくとも一部を含む第二領域とを有し、前記第一領域と前記第二領域とが膜で隔離されている培養装置を用いて前記第一領域において内分泌前駆細胞を培養することを含み、前記膜の分画分子量が５００～１７，０００である、膵島細胞又は膵島様細胞の製造方法。
［２］第一領域の培養において、第一領域の培地の培地交換が２回未満である、［１］に記載の方法。
［３］前記培地成分の少なくとも一部が、グルコースである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記第一領域と前記第二領域とが膜を隣接して配置され、前記膜を介して前記第一領域と前記第二領域との間で物質交換がなされる、［１］～［３］の何れか一項に記載の方法。
［５］第一領域の培地におけるグルコース濃度が培養中において５ｍＭ以上に維持される、［１］～［４］の何れか一項に記載の方法。
［６］第一領域の培地における乳酸濃度が培養中において０．３ｍＭ以上になる、［１］～［５］の何れか一項に記載の方法。
［７］前記分化誘導因子が、少なくともＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む、［１］～［６］の何れか一項に記載の方法。
［８］前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤が、アクチビンＡ及びＢＭＰ４からなる群から選択される少なくとも１種類である、［７］に記載の方法。
［９］さらに、前記分化誘導因子が、インスリン様増殖因子、ＧＬＰ－１受容体シグナル活性化剤及びアデニレートシクラーゼ活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種類を含む、［１］～［８］の何れか一項に記載の方法。
［１０］前記第一領域と前記第二領域が培地を含み、第一領域の培地量と第二領域の培地量の体積比が、１：１０，０００から１：１である、［１］～［９］の何れか一項に記載の方法。
［１１］前記第一領域における細胞の密度が、１×１０４～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである、［１］～［１０］の何れか一項に記載の方法。
［１］培地と分化誘導因子とを含む第一領域と、培地成分の少なくとも一部を含む第二領域とを有し、前記第一領域と前記第二領域とが膜で隔離されている培養装置を用いて前記第一領域において内分泌前駆細胞を培養することを含み、前記膜の分画分子量が５００～１７，０００である、膵島細胞又は膵島様細胞の製造方法。
［２］第一領域の培養において、第一領域の培地の培地交換が２回未満である、［１］に記載の方法。
［３］前記培地成分の少なくとも一部が、グルコースである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記第一領域と前記第二領域とが膜を隣接して配置され、前記膜を介して前記第一領域と前記第二領域との間で物質交換がなされる、［１］～［３］の何れか一項に記載の方法。
［５］第一領域の培地におけるグルコース濃度が培養中において５ｍＭ以上に維持される、［１］～［４］の何れか一項に記載の方法。
［６］第一領域の培地における乳酸濃度が培養中において０．３ｍＭ以上になる、［１］～［５］の何れか一項に記載の方法。
［７］前記分化誘導因子が、少なくともＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤を含む、［１］～［６］の何れか一項に記載の方法。
［８］前記ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤が、アクチビンＡ及びＢＭＰ４からなる群から選択される少なくとも１種類である、［７］に記載の方法。
［９］さらに、前記分化誘導因子が、インスリン様増殖因子、ＧＬＰ－１受容体シグナル活性化剤及びアデニレートシクラーゼ活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種類を含む、［１］～［８］の何れか一項に記載の方法。
［１０］前記第一領域と前記第二領域が培地を含み、第一領域の培地量と第二領域の培地量の体積比が、１：１０，０００から１：１である、［１］～［９］の何れか一項に記載の方法。
［１１］前記第一領域における細胞の密度が、１×１０４～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである、［１］～［１０］の何れか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明の製造方法によれば、分化誘導効率が高く、且つ、優れた機能性を有する膵島細胞又は膵島様細胞の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本発明で用いる培養装置の一例を示す。
【図2】対照、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）、ＤＣ（０）の各培養条件における、分化誘導培地および透析培地中のグルコースおよび乳酸濃度を、分化誘導中の培地交換ごとに測定した結果を示す。（ａ）は分化誘導培地中のグルコース濃度、（ｂ）は分化誘導培地中の乳酸濃度、（ｃ）は透析培地中のグルコース濃度、（ｄ）は透析培地中の乳酸濃度をそれぞれ示す。
【図3】対照、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）、ＤＣ（０）の各培養条件における、膵島様細胞の最終細胞密度を示す。
【図4】対照、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）、ＤＣ（０）の各培養条件における、内分泌前駆細胞及び膵島様細胞におけるＮＧＮ３、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＣＫ及びＰＣＳＫ１の相対的遺伝子発現レベルをＲＴ‐ｑＰＣＲにより測定した結果を示す。
【図5】対照、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）、ＤＣ（０）の各培養条件における、分化後の膵島様細胞の免疫染色の結果を示す。（ａ）はインスリンの免疫染色、（ｂ）はグルカゴンの免疫染色の結果をそれぞれ示す。
【図6】対照、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）、ＤＣ（０）の各培養条件における、インスリン陽性細胞面積及びグルカゴン陽性細胞面積の測定結果を示す。（ａ）はインスリン陽性細胞面積の割合、（ｂ）はグルカゴン陽性細胞面積の割合をそれぞれ示す。
【図7】対照、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）、ＤＣ（０）の各培養条件における、第１相での低濃度又は高濃度グルコース刺激によるＣ－ペプチドの分泌を示したグラフである。
【図8】対照、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）、ＤＣ（０）の各培養条件における、第２相での低濃度又は高濃度グルコース刺激によるＣ－ペプチドの分泌を示したグラフである。
【図9】対照、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）、ＤＣ（０）の各培養条件における、高濃度グルコース刺激と低濃度グルコース刺激におけるＣ‐ペプチド分泌の比（高濃度グルコース刺激によるＣ－ペプチドの分泌量／低濃度グルコース刺激におけるＣ－ペプチドの分泌量）を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、下記の説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が下記の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も本発明の範囲に含まれる。
【0013】
［１］内分泌前駆細胞（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ；ＥＰ）
本発明の方法においては、内分泌前駆細胞を培養することによって、膵島細胞又は膵島様細胞の細胞集団を製造する。
内分泌前駆細胞は、膵臓前駆細胞から分化した細胞であり、膵臓の内分泌系細胞（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）へと分化することができる細胞である。内分泌前駆細胞への分化は、内分泌前駆細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内分泌前駆細胞に特異的な遺伝子としてはＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＧ３、ＮｅｕｒｏＤ１などを挙げることができる。
本発明の方法においては、内分泌前駆細胞を培養することによって、膵島細胞又は膵島様細胞の細胞集団を製造する。
内分泌前駆細胞は、膵臓前駆細胞から分化した細胞であり、膵臓の内分泌系細胞（α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）へと分化することができる細胞である。内分泌前駆細胞への分化は、内分泌前駆細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内分泌前駆細胞に特異的な遺伝子としてはＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＧ３、ＮｅｕｒｏＤ１などを挙げることができる。
【0014】
内分泌前駆細胞は、多能性幹細胞から分化誘導された内胚葉系細胞から分化誘導することによって製造することができる。
内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する能力を有し、一般的に、胚体内胚葉（DE）と言われることがある。多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。なお、本明細書中において、内胚葉系細胞を胚体内胚葉と言い換えて使用することがある。
内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する能力を有し、一般的に、胚体内胚葉（DE）と言われることがある。多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。なお、本明細書中において、内胚葉系細胞を胚体内胚葉と言い換えて使用することがある。
【0015】
多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する際には、分化誘導化培地を使用して多能性幹細胞の培養を行う。
多能性幹細胞とは、生体を構成する全てまたは複数の種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有する細胞であって、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９８，９５：１３７２６－３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４－９）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、体性幹細胞（組織幹細胞）などが挙げられる。多能性幹細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。なお、「胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、配偶子融合によって導出された胚に加えて、体細胞核移植によって、導出された胚も指す。
多能性幹細胞とは、生体を構成する全てまたは複数の種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有する細胞であって、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９８，９５：１３７２６－３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４－９）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、体性幹細胞（組織幹細胞）などが挙げられる。多能性幹細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。なお、「胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ）」とは、配偶子融合によって導出された胚に加えて、体細胞核移植によって、導出された胚も指す。
【0016】
ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、又はヒトが挙げられる。好ましくはヒトに由来する細胞を使用できる。
【0017】
ＥＳ細胞の具体例としては、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。各ＥＳ細胞は当分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。 マウスのＥＳ細胞は、１９８１年にエバンスら（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４－６）や、マーチンら（Ｍａｒｔｉｎ ＧＲ．ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７８：７６３４－８）によって樹立されている。 ヒトのＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５－７）によって樹立されており、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、京都大学、国立成育医療研究センターなどから入手可能であり、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ社（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ／、スウェーデン）から購入可能である。
【0018】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。ｉＰＳ細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ(Ｒｕｄｏｌｆ Ｊａｅｎｉｓｃｈ)らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（Ｊａｍｅｓ Ｔｈｏｍｓｏｎ）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Ｋｏｎｒａｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。
【0019】
ｉＰＳ細胞の製造に用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、又はヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。体細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、膵臓細胞、白血球細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞等）、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。
【0020】
ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉系細胞、中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞への何れにも多分化能を有する幹細胞である。また、ｉＰＳ細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
【0021】
体細胞からｉＰＳ細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせをあげることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
【0022】
上記以外にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Ｎａｔｕｒｅ．２００８ Ｊｕｌ ３１；４５４（７２０４）：６４６－５０）、低分子化合物を利用した方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｊａｎ ９；４（１）：１６－９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｎｏｖ ６；５（５）：４９１－５０３）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｍａｙ ８；４（５）：３８１－４）などが報告されており、いずれの方法で製造されたｉＰＳ細胞でもよい。
【0023】
初期化因子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入、タンパク質として直接導入などが挙げられる。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡやＲＮＡ、低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を始めとする多能性幹細胞は、市販品又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製したものを用いてもよい。
【0024】
ｉＰＳ細胞として、例えば２５３Ｇ１株、２５３Ｇ４株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、１２０１Ｃ１株、１２０５Ｄ１株、１２１０Ｂ２株、１２３１Ａ３株、１３８３Ｄ２株、１３８３Ｄ６株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－３ｆ７株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－４ｆ１株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１１４－４ｆ１株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株、１５Ｍ６３株、１５Ｍ６６株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、ＴｋＤＮ４－Ｍ株、ＴｋＤＡ３－１株、ＴｋＤＡ３－２株、ＴｋＤＡ３－４株、ＴｋＤＡ３－５株、ＴｋＤＡ３－９株、ＴｋＤＡ３－２０株、ｈｉＰＳＣ ３８－２株、ＭＳＣ－ｉＰＳＣ１株、ＢＪ－ｉＰＳＣ１株等を使用することができる。
【0025】
ＥＳ細胞として、例えばＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ―３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＥＥＳ１株、ＳＥＥＳ２株、ＳＥＥＳ３株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ－１８１株等を使用することができる。新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を用いてもよい。
【0026】
内胚葉系細胞への分化誘導を行う前の多能性幹細胞は、未分化維持培地を用いて未分化性を維持したものとすることが好ましい。未分化維持培地を用いて多能性幹細胞の未分化性を維持する培養のことを、多能性幹細胞の維持培養ともいう。
【0027】
未分化維持培地は、多能性幹細胞の未分化性を維持できる培地であれば特に限定されないが、例えば、マウス胚性幹細胞及びマウス人工多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒを含む培地や、ヒトｉＰＳの未分化性を維持する性質を有していることが知られているｂａｓｉｃ ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を含む培地等が挙げられる。例えば、ヒトｉＰＳ細胞培地（２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１×ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）、５５μｍｏｌ／Ｌ ２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、７．５ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ２（ＦＧＦ２；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、０．５ｘＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＰＳ；Ｗａｋｏ社）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｗａｋｏ社）、又はＥｓｓｅｎｔａｉｌ８培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標） ｈＥＳＣ ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）等を使用することができるが、特に限定されない。
【0028】
多能性幹細胞の維持培養は、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン又はマトリゲル等の細胞接着タンパク質や細胞外マトリックスをコートした細胞培養用ディッシュ上においても、つまり接着培養でも、上記した未分化維持培地を用いて行うことができる。
【0029】
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【0030】
多能性幹細胞の維持培養は継代しながら所望の期間行うことができ、例えば、維持培養後の継代数１から１００、好ましくは継代数１０から５０、より好ましくは継代数１２から２５の多能性幹細胞を用いて、凝集体の形成や分化誘導を行うことが好ましい。
【0031】
多能性幹細胞の凝集体を形成するための実施形態の一つとしては、未分化で、接着培養で維持培養されている細胞を、ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等の公知の剥離剤により接着基材から剥がすことができる。次いで、ピペッティングにより小さな細胞塊又はシングルセルに砕き、それら細胞を培地中に懸濁した後に、懸濁液中の多能性幹細胞が凝集体を形成するまでの期間にわたって攪拌又は旋回させながら浮遊培養する。
【0032】
浮遊培養は、培地の粘性等や凹凸を有するマイクロウェル等を用いた静置培養であってもよいし、スピナー等を利用して液体培地が流動する条件での培養であってもよいが、好ましくは液体培地が流動する条件での培養である。液体培地が流動する条件での培養は、細胞の凝集を促進できることから好ましい。細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養としては、例えば、旋回流、揺動流等の流れによる応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように液体培地が流動する条件での培養や、直線的な往復運動により液体培地が流動する条件、攪拌翼を用いて液体培地を流動させる条件での培養等が挙げられる。さらに、予めマイクロキャリア等に接着させて浮遊培養しても良いし、細胞のみで構成された細胞凝集塊の状態で浮遊培養しても良いし、細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子が混在していても良く、形態は特に限定しない。
【0033】
浮遊培養に用いる培養容器は、好ましくは容器内面への細胞の接着性が低い容器が好ましい。このような容器内面への細胞の接着性が低い容器としては、例えば生体適合性がある物質で親水性表面処理されているようなプレートが挙げられる。例えば、ＮｕｎｃｌｏｎＴＭＳｐｈｅｒａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用できるが特に限定はされない。また、培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。
【0034】
凝集体を形成させる期間としては、６時間を超える期間であれば特に限定されないが、具体的には、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間の期間において凝集体を形成させることが好ましい。
【0035】
浮遊培養培地としては、多能性幹細胞を増殖可能な成分が含まれるのであれば特に限定されないが、１～１００μＭのＹ－２７６３２（Ｃａｙｍａｎ社）を含むｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）培地、又は１～１００μＭのＹ－２７６３２（Ｃａｙｍａｎ社）、１～１００ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ８ＴＭ、１～１００μＭのＹ－２７６３２（Ｃａｙｍａｎ社）を含むＳｔｅｍＦｉｔなどを使用することができる。
【0036】
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃から４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１から１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１から１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【0037】
上記多能性幹細胞の凝集体又は多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導する前に、２－メルカプトエタノールを含む培地を用いて浮遊培養し、細胞集団を調製することができる。
前培養に用いる培地は、細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６ＴＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。
前培養に用いる培地は、細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６ＴＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。
【0038】
前培養用の培地には、アミノ酸、抗生物質、抗酸化剤、その他の添加物を加えてもよい。例えば０．１から２％（体積／体積）のＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、０．１から２％（体積／体積）のペニシリン／ストレプトマイシン、０．１から２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ又は１から２５％（体積／体積）（好ましくは１から２０％（体積／体積））のＫｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （ＫＳＲ）などを添加してもよい。
【0039】
培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃から４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１から１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１から１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【0040】
多能性幹細胞の前培養の培養期間は、多分化能が向上するまで培養する日数であれば特に限定されないが、例えば１週間を超えない期間であれば良い。より具体的には、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、又は、６時間から４８時間であり、１２時間から３６時間程度であり、１８時間から２４時間である。
【0041】
多能性幹細胞から内分泌前駆細胞への分化誘導は、多能性幹細胞を、ＴＧＦβ(Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β)スーパーファミリーシグナル活性化剤を含む培地で培養した後、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）を添加していない培地で培養することにより行うことができる。
【0042】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤としては、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）経路、ＴＧＦβ／アクチビン経路、及び／又はＮＯＤＡＬ／アクチビン経路のシグナルを活性化する物質であれば特に限定されないが、例えば、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ１３、ＧＤＦ２、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＡＭＨ、ＰＩＴＸ２、及び／又はＮＯＤＡＬなどを用いることができる。特に、ＴＧＦβ／アクチビン経路のシグナルを活性化する物質を好適に用いることができ、具体的には、アクチビンＡ及びＢＭＰ４からなる群から選択される少なくとも１種類を使用することが好ましく、アクチビンＡ及びＢＭＰ４の全てを使用することが特に好ましい。
【0043】
内胚葉系細胞から内分泌前駆細胞への分化誘導は、一般的に内胚葉系細胞（胚体内胚葉：Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ：ＤＥ）→原始腸管細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｇｕｔ Ｔｕｂｅ：ＰＧＴ）→後前腸細胞（Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｆｏｒｅｇｕｔ：ＰＦＧ）→膵臓前駆細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ：ＰＰ）→内分泌前駆細胞（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ：ＥＰ）という順番で行うことができる。
【0044】
内胚葉系細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ）への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地等）に、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン等）、ＮＥＡＡ（例えば、１×ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社）等）、Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、レチノイン酸又はレチノイン酸のアナログ（ＥＣ２３等）、ピルビン酸ナトリウム、ＢＳＡ、ＦＧＦ受容体シグナル活性化剤（ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－２等）を添加した培地を用いることができる。
【0045】
内胚葉系細胞から原始腸管細胞への分化誘導における培養温度は、使用する多能性幹細胞の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃から４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１から１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
ＣＯ２インキュベーターなどを利用して、約１から１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【0046】
内胚葉系細胞から原始腸管細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には２４時間から１２０時間であり、好ましく４８時間から９６時間程度である。例えば、７２時間である。
【0047】
次に、原始腸管細胞から後前腸細胞に分化誘導する。原始腸管細胞から後前腸細胞への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ培地など）に、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＥＣ２３、及びＳＡＮＴ１を添加した培地を用いることができる。
【0048】
原始腸管細胞から後前腸細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には４８時間から１４４時間であり、好ましく７２時間から１２０時間程度である。
【0049】
次に、後前腸細胞から膵臓前駆細胞に分化誘導する。後前腸細胞から膵臓前駆細胞への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ培地など）に、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、ＦＧＦ－１０、Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＥＣ２３、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、及びインドラクタムＶを添加した培地を用いることができる。
【0050】
後前腸細胞から膵臓前駆細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には２４時間から１２０時間であり、好ましく４８時間から９６時間程度である。
【0051】
次に、膵臓前記細胞から内分泌前駆細胞に分化誘導する。膵臓前駆細胞から内分泌前駆細胞への分化誘導に用いる培地としては、基礎培地（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ－ＤＭＥＭ培地など）に、抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）、Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＥＣ２３、ＳＡＮＴ１、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、及びＥｘｃｅｄｉｎ－４を添加した培地を用いることができる。
【0052】
膵臓前駆細胞から内分泌前駆細胞への分化誘導の培養期間は、一般的には２４時間から１２０時間であり、好ましく４８時間から９６時間程度である。
【0053】
［２］膵島細胞、膵島様細胞
本発明の方法によれば、内分泌前駆細胞から膵島細胞又は膵島様細胞を製造できる。
膵臓は、アミラーゼやリパーゼなどの消化酵素を分泌して消化吸収を助ける外分泌細胞と、インスリンやグルカゴンを分泌して血糖調節を行う内分泌細胞との２種類の、全く働きの異なる細胞より構成されている。外分泌細胞は膵臓の９９％を占めており、これら細胞で作られる消化酵素は、導管を通って十二指腸に放出される。内分泌細胞は、膵外分泌組織の中に点々と散らばっており、膵島を形成している。
膵島を形成している、内分泌細胞は、主にα細胞、β細胞、δ細胞に分類される。α細胞は血糖を高める作用のあるグルカゴンを分泌する。β細胞は細胞数がもっとも多く、この細胞からはインスリンが分泌される。δ細胞はインスリンやグルカゴンの分泌を抑制するソマトスタチンというホルモンを分泌する。
本発明の方法によれば、内分泌前駆細胞から膵島細胞又は膵島様細胞を製造できる。
膵臓は、アミラーゼやリパーゼなどの消化酵素を分泌して消化吸収を助ける外分泌細胞と、インスリンやグルカゴンを分泌して血糖調節を行う内分泌細胞との２種類の、全く働きの異なる細胞より構成されている。外分泌細胞は膵臓の９９％を占めており、これら細胞で作られる消化酵素は、導管を通って十二指腸に放出される。内分泌細胞は、膵外分泌組織の中に点々と散らばっており、膵島を形成している。
膵島を形成している、内分泌細胞は、主にα細胞、β細胞、δ細胞に分類される。α細胞は血糖を高める作用のあるグルカゴンを分泌する。β細胞は細胞数がもっとも多く、この細胞からはインスリンが分泌される。δ細胞はインスリンやグルカゴンの分泌を抑制するソマトスタチンというホルモンを分泌する。
【0054】
本発明において、膵島様細胞とは、膵島のようなインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン等のホルモンを産生・分泌することが可能な細胞を意味し、前記ホルモンを産生・分泌することが可能な膵α細胞様細胞、膵β細胞様細胞、膵δ細胞様細胞の総称である。また、膵島様細胞は、様々な種類の細胞が凝集した細胞塊で作製されるため，Ｉｓｌｅｔ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｉｓｌｅｔ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｓｐｈｅｒｏｉｄ、Ｉｓｌｅｔ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ等とも称される。
内分泌前駆細胞から膵島細胞又は膵島様細胞への分化は、膵島細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。膵島細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＬＵＴ２、ＰＣＳＫ１等を挙げることができる。
内分泌前駆細胞から膵島細胞又は膵島様細胞への分化は、膵島細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。膵島細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＬＵＴ２、ＰＣＳＫ１等を挙げることができる。
【0055】
上記の方法により製造される膵島細胞又膵島様細胞を用いて、例えば、膵臓の治療用の細胞を得ることができる。例えば、膵島細胞又は膵島様細胞は、インスリン分泌能を有するため、糖尿病に対して高い治療効果を発揮できる。即ち、本発明の方法を利用して得られた膵島細胞又は膵島様細胞をカテーテルなどであるいは免疫隔離デバイス等に封入して移植することにより、糖尿病の治療へ利用できる。また、膵臓細胞又は膵島様細胞が産生したインスリンを直接注射することにより、Ｉ型糖尿病の治療に用いることもできる。
【0056】
［３］培養装置
本発明においては、培地と分化誘導因子とを含む第一領域と、培地成分の少なくとも一部を含む第二領域とを有し、前記第一領域と前記第二領域とが膜で隔離されている培養装置を用いて前記第一領域において、上記で製造された内分泌前駆細胞を培養する。
本発明においては、培地と分化誘導因子とを含む第一領域と、培地成分の少なくとも一部を含む第二領域とを有し、前記第一領域と前記第二領域とが膜で隔離されている培養装置を用いて前記第一領域において、上記で製造された内分泌前駆細胞を培養する。
【0057】
第一領域は、培地と分化誘導因子とを含む領域であり、内分泌前駆細胞が培養される領域である。第二領域は、培地成分の少なくとも一部を含む領域である。第一領域と前記第二領域とは膜で隔離されており、膜を介して、第一領域と第二領域との間では物質交換が行われる。
【0058】
好ましくは、第一領域と第二領域とは膜を隣接して配置され、膜を介して第一領域と第二領域との間で物質交換がなされる。上記の態様の一例として、本発明で用いることができる培養装置の構成の一例の模式図を図１に示す。図１において、第一領域１には培地２が含まれており、培地２には、分化誘導因子が添加されている。第二領域３には、培地成分の少なくとも一部４が含まれている。そして、第一領域１と第二領域３とは、膜５で隔離されている。
【0059】
本発明においては、第二領域に含まれている培地成分の少なくとも一部が、グルコースであることが好ましい。図１では、培地成分の少なくとも一部４としてグルコースが第二領域に含まれている場合を示す。第一領域１において、内分泌前駆細胞を培養すると、内分泌前駆細胞の代謝により、第一領域の培地に含まれる乳酸濃度は増大するが、乳酸濃度の増大に伴って、第一領域１の培地に含まれる乳酸は膜５を介して第二領域３に移動し、第一領域の培地に含まれる乳酸濃度の増大は抑制される。また、内分泌前駆細胞を培養すると、内分泌前駆細胞の代謝により、第一領域の培地に含まれるグルコース濃度は減少するが、グルコース濃度の減少に伴って、第二領域３の培地に含まれるグルコースは膜５を介して第一領域１に移動し、第一領域の培地に含まれるグルコース濃度の減少は抑制される。
上記したメカニズムにより、第一領域１において内分泌前駆細胞の分化誘導を効率的に行うことが可能になる。
上記したメカニズムにより、第一領域１において内分泌前駆細胞の分化誘導を効率的に行うことが可能になる。
【0060】
なお、図１に示した培養装置の構成は、培養装置の一例を示したものであり、上記以外の構成の培養装置を使用することも可能である。例えば、国際公開第２０１３／１６１８８５号公報に記載されている細胞培養システムに準じた構成を採用することも可能である。国際公開第２０１３／１６１８８５号公報に記載されている細胞培養システムは、細胞を培養するための細胞培養槽と、成分調整液貯留槽と、細胞培養液及び／又は成分調整液の入口と出口とを有し、半透膜を備える培養液成分調整手段と、前記細胞培養槽及び／又は前記成分調整液貯留槽から前記培養液成分調整手段の入口に接続された入口接続送液回路と、前記細胞培養槽及び／又は前記成分調整液貯留槽から前記培養液成分調整手段の出口に接続された出口接続送液回路と、前記入口接続送液回路から前記培養液成分調整手段を経て前記出口接続送液回路に前記細胞培養液及び／又は前記成分調整液を灌流する手段と、前記細胞培養槽の液量を調整する手段とを備える細胞培養システムである。本発明においては、上記のように、細胞培養槽（本発明で言う第一領域）と成分調整液貯留槽（本発明で言う第二領域）とを送液回路で連結し、送液回路中に設けた送液手段により細胞培養槽中の培養液を循環させ、その循環の途中において培養液成分調整手段（本発明で言う膜）を介して、培養液と成分調整液貯留槽中の液体との間で物質交換を行うというシステムを採用することも可能である。
【0061】
本発明においては、グルコース及び乳酸は膜を介して第一領域と第二領域との間を移動できることが好ましい。また、本発明においては、第一領域に含まれる分化誘導因子は、膜を通過して第二領域に移動しないことが好ましい。
【0062】
本発明で用いる膜としては、例えば、透析膜を使用することができる。透析膜とは、分子量に応じて分画できる半透膜であり、好ましくは、膜中に実質的に同一形状の連通孔を多数有し、膜の両側の濃度差によって分子を分離できるものである。
【0063】
透析膜等の膜の分画分子量は目的に応じて適宜変更可能であるが、下限は５００以上であり、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、１０００以上、１２００以上、１４００以上、１６００以上、１６００以上、２０００以上、２２００以上、２４００以上、２６００以上、２８００以上、３０００以上、又は３２００以上であってもよい。膜の分画分子量の上限は、１７，０００以下であり、１６，０００以下、１５，０００以下、１４，０００以下、１３，０００以下、１２，０００以下、１１，０００以下、１０，０００以下、９，０００以下、８，０００以下、７，０００以下、６，０００以下、又は５，０００以下が好ましい。膜の分画分子量は、例えば、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００又は５０，０００であってもよい。
【0064】
膜の材料は特に限定されず、例えば、再生セルロース、アセチルセルロース、ポリアク
リロニトリル、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール、テフロン（登録商標）、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリスルホン、ポリアミドなどを挙げることができる。
リロニトリル、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール、テフロン（登録商標）、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリスルホン、ポリアミドなどを挙げることができる。
【0065】
［４］透析培養による膵島細胞又は膵島様細胞への分化誘導
本発明において、膜を用いた培養によって内分泌前駆細胞を膵島細胞又は膵島様細胞に分化誘導する際には、分化誘導培地を使用して内分泌前駆細胞の培養を行う。分化誘導培地としては、内分泌前駆細胞を分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、例えば、血清含有培地や、血清代替成分を含有した無血清培地等が挙げられる。
本発明において、膜を用いた培養によって内分泌前駆細胞を膵島細胞又は膵島様細胞に分化誘導する際には、分化誘導培地を使用して内分泌前駆細胞の培養を行う。分化誘導培地としては、内分泌前駆細胞を分化誘導させる培地であれば特に限定されるものではないが、例えば、血清含有培地や、血清代替成分を含有した無血清培地等が挙げられる。
【0066】
用いる細胞の種類に応じて、霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（リプロセル培地）、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの培地から任意に選択した２種以上の培地を混合した培地などが使用できる。なお、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
【0067】
分化誘導培地は、血清成分又は血清代替成分を含んでいてもよい。血清成分又は血清代替成分としては、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ－２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎ２サプリメント、Ｎ２１サプリメント（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ－２１サプリメント（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ社）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、２－メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、並びにこれらの均等物が挙げられる。
【0068】
分化誘導培地には、さらに各種の添加物、抗生物質、抗酸化剤などを加えてもよい。例えば、０．１ｍＭ～５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１～２％（体積／体積）の非必須アミノ酸、０．１～２％（体積／体積）のペニシリン、０．１～２％（体積／体積）のストレプトマイシン、０．１～２％（体積／体積）のアンフォテリシンＢ、カタラーゼ、グルタチオン、ガラクトース、レチノイン酸（ビタミンＡ）、スーパーオキシドディスムターゼ、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、Ｄ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、ニコチンアミドなどを添加してもよい。
分化誘導培地にはさらに分化誘導因子を添加する。分化誘導因子については後記する。
分化誘導培地にはさらに分化誘導因子を添加する。分化誘導因子については後記する。
【0069】
本発明においては、培養装置の第一領域において、分化誘導因子を含む分化誘導培地中において内分泌前駆細胞を培養することにより、内分泌前駆細胞から膵島細胞又は膵島様細胞を製造する。その際、膜を介して、培養装置の第一領域と第二領域との間で物質交換を行う。
【0070】
本発明においては、第一領域と第二領域が培地を含む。第一領域の培地量と第二領域の培地量との体積比は、特に限定しないが、例えば１：１０，０００から１：１とすることができる。
【0071】
第一領域における細胞の密度は、特に限定されないが、１×１０４～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましい。第一領域における細胞の密度は、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、又は８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上が好ましく、５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、又は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下が好ましい。
【0072】
培養温度は、使用する内分泌前駆の培養に適した培養温度であれば、特に限定されないが、一般的には３０℃～４０℃であり、好ましくは約３７℃である。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
ＣＯ2インキュベーターなどを利用して、約１～１０％、好ましくは５％のＣＯ2濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【0073】
内分泌前駆細胞の膜を使用した培養の培養期間は、好ましくは１日以上、より好ましくは２日以上、さらに好ましくは３日以上であり、特に好ましくは４日以上であり、上限は特に限定されないが、一般的には２０日以下である。
【0074】
好ましい態様においては、第一領域の培地におけるグルコース濃度は培養中において５ｍＭ以上に維持され、より好ましくは１０ｍＭ以上に維持され、さらに好ましくは２０ｍＭ以上に維持され、さらに一層好ましくは２２ｍＭ以上に維持され、特に好ましくは２３ｍＭ以上に維持される。好ましい態様においては、第二領域の培地におけるグルコース濃度は培養中において１０ｍＭ以上に維持され、より好ましくは１５ｍＭ以上に維持され、さらに好ましくは２０ｍＭ以上に維持され、さらに一層好ましくは２２ｍＭ以上に維持され、特に好ましくは２３ｍＭ以上に維持される。
【0075】
グルコース濃度の測定は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、バイオアナライザー（王子計測機器株式会社BF-5iD）等の市販の分析装置を用いて測定することができる。
【0076】
培養系内の乳酸濃度が高いと、細胞が障害を受けることがよく知られている。よって、第一領域の培地における乳酸濃度が低い方が、膵島細胞又は膵島様細胞のグルコース応答性等の膵島機能がより向上すると本発明者らは考えていたが、驚くべきことに、鋭意検討の結果、第一領域の培地における乳酸濃度が一定程度高い方が、同機能がより向上する場合があることを発見した。すなわち、当該乳酸濃度は、好ましくは０．３ｍＭ以上になることであり、より好ましくは０．５ｍＭ以上、より好ましくは１ｍＭ以上になることである。ただし、前述の通り乳酸濃度が高いと細胞が障害を受けるため、乳酸濃度が低すぎず高すぎない適切な濃度範囲で培養することが重要であり、つまり、細胞からの乳酸の排出と、透析による乳酸の排出のバランスが重要であり、そのような乳酸濃度の適切な環境の維持が本発明の方法により可能となる。さらに、本発明者らは、第一領域の培地における乳酸濃度の推移が、連続的であることが好ましいことを見出した。当該乳酸濃度推移が連続的ではない例としては、培地交換による極端な濃度変化が挙げられる。また、好ましい態様においては、第一領域の培地における乳酸濃度の上限は、培養中において１５ｍＭ以下に維持されることであり、より好ましくは１０ｍＭ以下に維持され、より好ましくは５ｍＭ以下に維持され、より好ましくは３ｍＭ以下に維持され、より好ましくは２ｍＭ以下に維持される。第二領域の培地の乳酸濃度は第一領域と同等あるいはそれ以下であることが好ましい。
【0077】
乳酸濃度の測定は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、バイオアナライザー（王子計測機器株式会社BF-5iD）等の市販の分析装置を用いて測定することができる。
【0078】
第一領域の培地において内分泌前駆細胞を培養する際、培地交換は２回未満であることが好ましく、例えば、培地交換を１回行うか、又は培地交換を行わずに培養してもよい。培地交換を２回未満とすることで、膵島細胞又は膵島様細胞のグルコース応答性等の膵島機能がより向上する。なお、培地交換は培養期間中に行うため、例えば、培養期間が２～８日間であれば、培養期間２～８日間中に行う培地交換が２回未満であることが好ましい。
【0079】
［５］分化誘導因子
第一領域の培地に添加する分化誘導因子は、分化誘導の目的に応じて、当業者であれば
適宜選択することができる。即ち、内分泌前駆細胞から膵島細胞又は膵島様細胞への分化を誘導する分化誘導因子を添加すればよい。
第一領域の培地に添加する分化誘導因子は、分化誘導の目的に応じて、当業者であれば
適宜選択することができる。即ち、内分泌前駆細胞から膵島細胞又は膵島様細胞への分化を誘導する分化誘導因子を添加すればよい。
【0080】
分化誘導因子としては、ＴＧＦβ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）スーパーファミリーシグナル活性化剤、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ１等）、ＧＬＰ－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－１）受容体シグナル活性化剤（Ｅｘｅｎｄｉｎ４等）、アデニレートシクラーゼ（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ）活性化剤等を使用することが好ましい。
【0081】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤としては、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）経路、ＴＧＦβ／アクチビン経路、及び／又はＮＯＤＡＬ／アクチビン経路のシグナルを活性化する物質であれば特に限定されないが、例えば、アクチビンＡ、ＦＧＦ２、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ１３、ＧＤＦ２、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＡＭＨ、ＰＩＴＸ２、及び／又はＮＯＤＡＬなどを用いることができる。特に、ＴＧＦβ／アクチビン経路のシグナルを活性化する物質を好適に用いることができ、具体的には、アクチビンＡ、及びＢＭＰ４からなる群から選択される少なくとも１種類を使用することが好ましく、アクチビンＡ、及びＢＭＰ４を使用することが特に好ましい。
【0082】
第一領域におけるＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤（ＢＭＰ４等）の添加初期濃度の下限は、好ましくは０．２ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるＴＧＦβスーパーファミリーシグナル活性化剤（ＢＭＰ４等）の添加量の上限は、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬである。
【0083】
第一領域における肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の添加初期濃度の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地における肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
【0084】
インスリン様増殖因子は、プロインスリンに似た構造を持つポリペプチドであり、細胞増殖や生存、遊走やコラーゲンを含む細胞外マトリクスの産生に関与することが知られている。インスリン様増殖因子は、腫瘍細胞を含む種々の細胞型に対して、インスリン様増殖因子受容体－１（ＩＧＦＲ１）と称される共通の受容体に結合することにより細胞分裂促進活性を示す。インスリン様増殖因子としては、インスリン様増殖因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）およびインスリン様増殖因子－ＩＩ（ＩＧＦ－ＩＩ）が挙げられる。
【0085】
第一領域におけるインスリン様増殖因子の添加初期濃度の下限は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。培地におけるインスリン様増殖因子（ＩＧＦ１等）の添加量の上限は、好ましくは５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは４００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬである。
【0086】
アデニレートシクラーゼは、ＡＴＰを３’，５’－環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）とピロリン酸への変換を触媒する酵素であり、アデニレートシクラーゼ（Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ）活性化剤は、細胞内のｃＡＭＰ濃度を向上させる物質である。ｃＡＭＰはセカンドメッセンジャーと呼ばれる、真核生物のシグナル伝達に重要な分子である。Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤としては、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、ＮＫＨ４７７などが挙げられる。
【0087】
第一領域におけるＡｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ等）の添加初期濃度の下限は、好ましくは０．１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは０．７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌである。培地におけるＡｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ活性化剤（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ等）の含有量の上限は、好ましくは１００μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは８０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは４０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは３０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは２０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１５μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは１０μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは７μｍｏＬ／Ｌ、より好ましくは５μｍｏＬ／Ｌである。
【0088】
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例0089】
実施例１：透析培養を用いた膵島様細胞の分化誘導
（１）透析膜を底面にもつ透析培養容器の作製
透析培養容器は、６ウェル培養インサート（コーニング社製）の元の膜を、３ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＣＷＯ）を有する再生セルロース透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ社製）に置き換えた。インサートカップに結合した透析膜を深底ウェルプレート（コーニング社製）に挿入した。分化誘導の間、２．５ｍＬの分化誘導培地を培養インサートに添加し、ウェルに１４．５ｍＬの透析培地を添加した。３ｋＤａより大きい分子は、振盪機培養中、培養インサート中に残存した。透析培養を、透析培養を行わない従来の懸濁培養と比較するために、培養インサートの透析膜をポリエチレンフィルム（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）でシールし、透析による物質移動をブロックした。
（１）透析膜を底面にもつ透析培養容器の作製
透析培養容器は、６ウェル培養インサート（コーニング社製）の元の膜を、３ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＣＷＯ）を有する再生セルロース透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ社製）に置き換えた。インサートカップに結合した透析膜を深底ウェルプレート（コーニング社製）に挿入した。分化誘導の間、２．５ｍＬの分化誘導培地を培養インサートに添加し、ウェルに１４．５ｍＬの透析培地を添加した。３ｋＤａより大きい分子は、振盪機培養中、培養インサート中に残存した。透析培養を、透析培養を行わない従来の懸濁培養と比較するために、培養インサートの透析膜をポリエチレンフィルム（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）でシールし、透析による物質移動をブロックした。
【0090】
（２）ヒト多能性幹細胞の培養およびヒト多能性幹細胞凝集体の形成
ヒト多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株ＴｋＤＮ４－Ｍを用いた。ヒトｉＰＳ細胞株ＴｋＤＮ４－Ｍは、東京大学医学研究所のＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋによって提供されたものを用いた。ヒト多能性幹細胞をビトロネクチン断片（ＶＴＮ－Ｎ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でコーティングした６ウェル組織培養用プレート（Ｗａｋｏ社製）上で、ペニシリンストレプトマイシンアムホテリシンＢ懸濁液（ＰＳＡ；Ｗａｋｏ社製）を１％添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）中で培養した。継代培養のために、培養したヒト多能性幹細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によって分離させ、単一細胞を１％ ＰＳＡ、１０ｍＭ Ｒｈｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ－２７６３２；Ｗａｋｏ社製）を含有するＥ８培地中で１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で培養した。培地は、１％ＰＳＡを含むＥ８培地で毎日交換した。
ヒト多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞株ＴｋＤＮ４－Ｍを用いた。ヒトｉＰＳ細胞株ＴｋＤＮ４－Ｍは、東京大学医学研究所のＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋによって提供されたものを用いた。ヒト多能性幹細胞をビトロネクチン断片（ＶＴＮ－Ｎ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でコーティングした６ウェル組織培養用プレート（Ｗａｋｏ社製）上で、ペニシリンストレプトマイシンアムホテリシンＢ懸濁液（ＰＳＡ；Ｗａｋｏ社製）を１％添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）中で培養した。継代培養のために、培養したヒト多能性幹細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によって分離させ、単一細胞を１％ ＰＳＡ、１０ｍＭ Ｒｈｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ－２７６３２；Ｗａｋｏ社製）を含有するＥ８培地中で１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種した。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で培養した。培地は、１％ＰＳＡを含むＥ８培地で毎日交換した。
【0091】
細胞凝集体形成のために、分離した多能性幹細胞を、１％ ＰＳＡ、５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ； Ｐｒｏｌｉａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）、および１０μＭ Ｙ－２７６３２を含有するＥ８培地を用いて、エルレンマイヤーフラスコ（コーニング社製）に７．×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した。エルレンマイヤーフラスコを、９０ｒｐｍで振とうさせた。細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で培養した。培地は、１％ ＰＳＡおよび５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＥ８培地で毎日交換した。培養３～５日後、凝集体が形成された。
【0092】
（３）内分泌前駆細胞の調製
ヒト多能性幹細胞の内分泌前駆細胞への分化誘導のために、（２）で得られたヒト多能性幹細胞凝集体を、１％ ＰＳＡ、５μＭ Ｙ－２７６３２、２０％ノックアウトＴＭ血清リプレイスメント（ＫＳＲ；Ｗａｋｏ社製）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社製）、および５５μＭ ２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ‐１２培地（Ｗａｋｏ社製）で１日間前培養した。内分泌前駆細胞の分化は、下記の５段階で行った。
ヒト多能性幹細胞の内分泌前駆細胞への分化誘導のために、（２）で得られたヒト多能性幹細胞凝集体を、１％ ＰＳＡ、５μＭ Ｙ－２７６３２、２０％ノックアウトＴＭ血清リプレイスメント（ＫＳＲ；Ｗａｋｏ社製）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；Ｗａｋｏ社製）、および５５μＭ ２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ‐１２培地（Ｗａｋｏ社製）で１日間前培養した。内分泌前駆細胞の分化は、下記の５段階で行った。
【0093】
＜第１段階：ヒト多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化誘導＞
ヒト多能性幹細胞を内胚葉系細胞（ＤＥ）に分化させるために、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ ＮＥＡＡ、０．４％ ＰＳＡ、８０ｎｇ／ｍＬ 組換えヒトアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）、５５μＭ ２－ＭＥ、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２；リプロセル社製）、および２０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を含むＲＰＭＩ－１６４０（Ｗａｋｏ社製）の培地で、ヒト多能性幹細胞凝集体を、毎日培地交換を行いながら４日間培養した。３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社製）を１日目に添加し、１％ ＫＳＲを４日目に添加した。
ヒト多能性幹細胞を内胚葉系細胞（ＤＥ）に分化させるために、５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ ＮＥＡＡ、０．４％ ＰＳＡ、８０ｎｇ／ｍＬ 組換えヒトアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）、５５μＭ ２－ＭＥ、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２；リプロセル社製）、および２０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を含むＲＰＭＩ－１６４０（Ｗａｋｏ社製）の培地で、ヒト多能性幹細胞凝集体を、毎日培地交換を行いながら４日間培養した。３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗａｋｏ社製）を１日目に添加し、１％ ＫＳＲを４日目に添加した。
【0094】
＜第２段階：内胚葉系細胞から原始腸管細胞への分化誘導＞
内胚葉系細胞（ＤＥ）から原始腸管細胞（ＰＧＴ）に分化させるために、上記で得られた内胚葉系細胞凝集体を５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ ＮＥＡＡ、０．４％ ＰＳＡ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬ 組換えヒトＦＧＦ７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、および２％ Ｂ－２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を含むＲＰＭＩ－１６４０中で２日間培養した。
内胚葉系細胞（ＤＥ）から原始腸管細胞（ＰＧＴ）に分化させるために、上記で得られた内胚葉系細胞凝集体を５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ ＮＥＡＡ、０．４％ ＰＳＡ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬ 組換えヒトＦＧＦ７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、および２％ Ｂ－２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を含むＲＰＭＩ－１６４０中で２日間培養した。
【0095】
＜第３段階：原始腸管細胞（ＰＴＧ）か後前腸細胞（ＰＦＧ）への分化誘導＞
原始腸管細胞（ＰＴＧ）から後前腸細胞（ＰＦＧ）に分化させるために、上記で得られたＰＧＴ細胞凝集体を４日間培養し、培地を２日目に交換した。得られた細胞凝集体を、１％ ＮＥＡＡ、０．４％ ＰＳＡ、２％ Ｂ－２７サプリメント、０．６７μＭ ＥＣ２３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、１μＭ Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（Ｗａｋｏ社製）、１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｗａｋｏ社製）、および０．２５μＭ ＳＡＮＴ１（Ｗａｋｏ社製）を添加したＤＭＥＭ－高グルコース培地（Ｗａｋｏ社製）で培養した。
原始腸管細胞（ＰＴＧ）から後前腸細胞（ＰＦＧ）に分化させるために、上記で得られたＰＧＴ細胞凝集体を４日間培養し、培地を２日目に交換した。得られた細胞凝集体を、１％ ＮＥＡＡ、０．４％ ＰＳＡ、２％ Ｂ－２７サプリメント、０．６７μＭ ＥＣ２３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、１μＭ Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（Ｗａｋｏ社製）、１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｗａｋｏ社製）、および０．２５μＭ ＳＡＮＴ１（Ｗａｋｏ社製）を添加したＤＭＥＭ－高グルコース培地（Ｗａｋｏ社製）で培養した。
【0096】
＜第４段階：後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（ＰＰ）への分化誘導＞
後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（ＰＰ）に分化させるために、後前腸細胞凝集体を３日間培養し、培地を２日目に交換した。後前腸細胞凝集体を、１％ ＮＥＡＡ、０．４％ ＰＳＡ、２％ Ｂ－２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍＬ 組換えヒトＦＧＦ１０（Ｗａｋｏ社製）、０．５μＭ ＥＣＭ２３、１μＭ Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、５μＭ Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（Ｒｅｐ Ｓｏｘ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、０．２５μＭ ＳＮＡＴ１、および３００ｎＭ ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ（ＩＬＶ；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を添加したＤＭＥＭ－高グルコース培地で培養した。
後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（ＰＰ）に分化させるために、後前腸細胞凝集体を３日間培養し、培地を２日目に交換した。後前腸細胞凝集体を、１％ ＮＥＡＡ、０．４％ ＰＳＡ、２％ Ｂ－２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍＬ 組換えヒトＦＧＦ１０（Ｗａｋｏ社製）、０．５μＭ ＥＣＭ２３、１μＭ Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、５μＭ Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（Ｒｅｐ Ｓｏｘ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、０．２５μＭ ＳＮＡＴ１、および３００ｎＭ ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ（ＩＬＶ；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を添加したＤＭＥＭ－高グルコース培地で培養した。
【0097】
＜第５段階：膵臓前駆細胞（ＰＰ）から内分泌前駆細胞（ＥＰ）への分化誘導＞
膵臓前駆細胞（ＰＰ）から内分泌前駆細胞（ＥＰ）に分化させるために、膵臓前駆細胞凝集体を３日間培養し、培地を２日目に交換した。得られた膵臓前駆細胞凝集体を、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｗａｋｏ社製）、０．４％ ＰＳＡ、２％ Ｂ－２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍＬ ｅｘｅｎｄｉｎ４（ＥＸ４；Ｗａｋｏ社製）、０．２μＭ ＥＣ２３及び１μＭ ＲｅｐＳｏｘ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ１を添加したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で培養した。
膵臓前駆細胞（ＰＰ）から内分泌前駆細胞（ＥＰ）に分化させるために、膵臓前駆細胞凝集体を３日間培養し、培地を２日目に交換した。得られた膵臓前駆細胞凝集体を、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｗａｋｏ社製）、０．４％ ＰＳＡ、２％ Ｂ－２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍＬ ｅｘｅｎｄｉｎ４（ＥＸ４；Ｗａｋｏ社製）、０．２μＭ ＥＣ２３及び１μＭ ＲｅｐＳｏｘ、０．２５μＭ ＳＡＮＴ１を添加したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で培養した。
【0098】
（４）透析培養による膵島様細胞の分化誘導
上記（３）で得られた内分泌前駆細胞凝集体を収集し、第５段階の最終日に２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬを、上記（１）の透析培養容器に移し、１４．５ｍＬの透析培地を培養インサートの下部のウェルに充填した。透析培地は、成長因子を含まない２ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．４％ ＰＳＡ、２％ Ｂ－２７サプリメントおよび低分子化合物（５μＭ ＲｅｐＳｏｘ、１０μＭ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ及び５ｍＭ ニコチンアミド）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地を用いた。
上記（３）で得られた内分泌前駆細胞凝集体を収集し、第５段階の最終日に２．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬを、上記（１）の透析培養容器に移し、１４．５ｍＬの透析培地を培養インサートの下部のウェルに充填した。透析培地は、成長因子を含まない２ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．４％ ＰＳＡ、２％ Ｂ－２７サプリメントおよび低分子化合物（５μＭ ＲｅｐＳｏｘ、１０μＭ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ及び５ｍＭ ニコチンアミド）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地を用いた。
【0099】
次に、内分泌前駆細胞凝集体を、２．５ｍＬの分化誘導培地を用いて、培養インサート中で６日間培養した。分化誘導培地としては、透析膜のＭＷＣＯより大きい分子量（３ｋＤａ）の高分子（１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４（３４ｋＤａ）、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（１７ｋＤａ）、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）（７０ｋＤａ）及び５０ｎｇ／ｍＬのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）（７．７ｋＤａ）、５０ｎｇ／ｍＬのＥＸ４（４ｋＤａ））、サプリメント（２ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．４％ ＰＳＡ、２％ Ｂ－２７サプリメント及び低分子化合物（５μＭ ＲｅｐＳｏｘ、１０μＭ Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（富士フイルム和光純薬社製）及び５ｍＭ ニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製））を含む高ＤＭＥＭ培地を用いた。
【0100】
透析培養の効果を評価するために、内分泌前駆細胞凝集体を、対照、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）及びＤＣ（０）という４つの異なる培養条件で培養した。
対照では、透析培養インサートを密封し、培地が分化培地と透析培地との間で混合されないようにした。分化誘導培地は隔日に培地交換し、透析培地は変更しなかった。
ＤＣ（２）、ＤＣ（１）及びＤＣ（０）では、分化誘導培地および透析培地は透析膜を介して相互作用することができた。分化誘導培地および透析培地は、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）において、それぞれ、２回、１回培地交換し、ＤＣ（０）では培地交換を行わなかった。
なお、以下の各測定において、データは、２つの独立した実験から取得し、ｍｅａｎｓ±ＳＤで表した。統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて差を評価した。２群以上の比較のために、ｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｔｕｋｅｙ ＨＳＤ検定を用いたＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを実施した。ｐ＜０．０５の値を有意とした。
対照では、透析培養インサートを密封し、培地が分化培地と透析培地との間で混合されないようにした。分化誘導培地は隔日に培地交換し、透析培地は変更しなかった。
ＤＣ（２）、ＤＣ（１）及びＤＣ（０）では、分化誘導培地および透析培地は透析膜を介して相互作用することができた。分化誘導培地および透析培地は、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）において、それぞれ、２回、１回培地交換し、ＤＣ（０）では培地交換を行わなかった。
なお、以下の各測定において、データは、２つの独立した実験から取得し、ｍｅａｎｓ±ＳＤで表した。統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて差を評価した。２群以上の比較のために、ｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｔｕｋｅｙ ＨＳＤ検定を用いたＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを実施した。ｐ＜０．０５の値を有意とした。
【0101】
（５）グルコース及び乳酸の測定
培養中の透析培養の詳細な効果を評価するために、分化誘導培地と透析培地とを培地交換ごとに採取した。各培地のグルコースおよび乳酸レベルをバイオアナライザー（王子科学機器社製）で測定した。その結果を図２に示す。
図２に示したように、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）、ＤＣ（０）の各透析培養条件において、透析なしの対照培養よりもグルコース濃度が高く、乳酸濃度は低く、良好な培養環境を示した（図２（ａ）、（ｂ））。さらに、透析培養条件下で透析培地中の乳酸の蓄積が観察され、透析により連続的な乳酸除去が生じたことが示された（図２（ｄ））。透析培養条件下では、両培地中の乳酸濃度は、低い方から順にＤＣ（２）、ＤＣ（１）、ＤＣ（０）となることが分かった。また、透析培養においては、分化誘導培地及び透析培地のグルコース濃度は新鮮培地と近く、透析培養ではグルコース供給が豊富であることが示唆された（図２（ａ）、（ｃ））。
培養中の透析培養の詳細な効果を評価するために、分化誘導培地と透析培地とを培地交換ごとに採取した。各培地のグルコースおよび乳酸レベルをバイオアナライザー（王子科学機器社製）で測定した。その結果を図２に示す。
図２に示したように、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）、ＤＣ（０）の各透析培養条件において、透析なしの対照培養よりもグルコース濃度が高く、乳酸濃度は低く、良好な培養環境を示した（図２（ａ）、（ｂ））。さらに、透析培養条件下で透析培地中の乳酸の蓄積が観察され、透析により連続的な乳酸除去が生じたことが示された（図２（ｄ））。透析培養条件下では、両培地中の乳酸濃度は、低い方から順にＤＣ（２）、ＤＣ（１）、ＤＣ（０）となることが分かった。また、透析培養においては、分化誘導培地及び透析培地のグルコース濃度は新鮮培地と近く、透析培養ではグルコース供給が豊富であることが示唆された（図２（ａ）、（ｃ））。
【0102】
分化した細胞凝集体を集め、細胞数を計測するため分離した。各培養条件における最終細胞密度の測定結果を図３に示す。データは、２つの独立した実験よりｎ＝５－６、ｍｅａｎｓ±ＳＤで示す。図３に示したように、対照、ＤＣ（２）、ＤＣ（１）及び（０）の各培養条件間で膵島様細胞の最終細胞密度に有意差はなかった。
【0103】
（６）ＲＴ－ｑＰＣＲ分析
膵島様細胞への分化の０日目および６日目に、細胞凝集体をＴＲＩＺｏｌ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて採取した。クロロホルム（Ｗａｋｏ社製）を添加して１５，０００ｇで１５分間遠心分離することにより、全ＲＮＡを単離した。次に、２－プロパノール（Ｗａｋｏ社製）を、採取した上清に添加し、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離して、精製されたＲＮＡペレットを調製した。ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅ非含有水に溶解した。ＲＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（島津製作所社製）で測定し、各試料からのＲＮＡ １００ｎｇをＰｒｉｍｅ ＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（タカラバイオ社製）で逆転写した。逆転写後、転写された相補的ＤＮＡ試料をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ遺伝子発現アッセイにより定量し、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により検出した。標的遺伝子としては、ＮＧＮ３、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＣＫ及びハウスキーピング遺伝子としてβアクチンを用いた。ＮＧＮ３、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＣＫ、βアクチンのフォワードプライマー配列及びリバースプライマー配列を表１に示す。
膵島様細胞への分化の０日目および６日目に、細胞凝集体をＴＲＩＺｏｌ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて採取した。クロロホルム（Ｗａｋｏ社製）を添加して１５，０００ｇで１５分間遠心分離することにより、全ＲＮＡを単離した。次に、２－プロパノール（Ｗａｋｏ社製）を、採取した上清に添加し、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離して、精製されたＲＮＡペレットを調製した。ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、ＲＮａｓｅ非含有水に溶解した。ＲＮＡ濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（島津製作所社製）で測定し、各試料からのＲＮＡ １００ｎｇをＰｒｉｍｅ ＳｃｒｉｐｔＴＭ逆転写酵素（タカラバイオ社製）で逆転写した。逆転写後、転写された相補的ＤＮＡ試料をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ遺伝子発現アッセイにより定量し、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により検出した。標的遺伝子としては、ＮＧＮ３、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＣＫ及びハウスキーピング遺伝子としてβアクチンを用いた。ＮＧＮ３、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＣＫ、βアクチンのフォワードプライマー配列及びリバースプライマー配列を表１に示す。
【0104】
【表1】
【0105】
ＲＴ－ｑＰＣＲ分析の結果を図４に示す。データは、２つの独立した実験より、ｎ＝５－６、ｍｅａｎｓ±ＳＤを表す。統計解析は、Ｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｔｕｋｅｙ ＨＳＤ ｔｅｓｔを用いたｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）を用いて行った。
図４に示したように、ＮＧＮ３のｍＲＮＡ発現は、内分泌前駆細胞と比較して６日目に全ての培養条件で減少した。ＮＧＮ３は初期の内分泌前駆細胞から発現を開始し、膵島様細胞の成熟とともに減少した。ＮＧＮ３とは、対照的に、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＬＵＴ２及びＰＣＳＫ１のような膵臓遺伝子の発現レベルは、内分泌前駆細胞と比較して全ての培養条件において培養６日目に上昇制御された。これらの結果は、内分泌前駆細胞が膵島様細胞に分化誘導されたことを示唆する。
培地交換頻度の少ないＤＣ（１）及びＤＣ（０）の培養条件では、通常の培地交換の頻度である、対照およびＤＣ（２）よりも膵臓内分泌ホルモンであるＩＮＳ（インシュリン遺伝子）およびＧＣＧ（グルカゴン遺伝子）の発現レベルが有意に高かった。さらに、ＤＣ（０）の培養条件では、ＧＬＵＴ（グルコース輸送体遺伝子）１、ＧＬＵＴ２、およびＧＣＫ（グルコキナーゼ遺伝子）のようなグルコース感知遺伝子およびグルコース代謝関連遺伝子の発現レベルが対照よりも高い傾向にあった。特にＧＬＵＴ２の発現レベルは対照よりもＤＣ（１）とＤＣ（０）の培養条件で有意に高かったが、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ及びＰＣＳＫ１では発現レベルに有意差はなかった。
図４に示したように、ＮＧＮ３のｍＲＮＡ発現は、内分泌前駆細胞と比較して６日目に全ての培養条件で減少した。ＮＧＮ３は初期の内分泌前駆細胞から発現を開始し、膵島様細胞の成熟とともに減少した。ＮＧＮ３とは、対照的に、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＧＬＵＴ２及びＰＣＳＫ１のような膵臓遺伝子の発現レベルは、内分泌前駆細胞と比較して全ての培養条件において培養６日目に上昇制御された。これらの結果は、内分泌前駆細胞が膵島様細胞に分化誘導されたことを示唆する。
培地交換頻度の少ないＤＣ（１）及びＤＣ（０）の培養条件では、通常の培地交換の頻度である、対照およびＤＣ（２）よりも膵臓内分泌ホルモンであるＩＮＳ（インシュリン遺伝子）およびＧＣＧ（グルカゴン遺伝子）の発現レベルが有意に高かった。さらに、ＤＣ（０）の培養条件では、ＧＬＵＴ（グルコース輸送体遺伝子）１、ＧＬＵＴ２、およびＧＣＫ（グルコキナーゼ遺伝子）のようなグルコース感知遺伝子およびグルコース代謝関連遺伝子の発現レベルが対照よりも高い傾向にあった。特にＧＬＵＴ２の発現レベルは対照よりもＤＣ（１）とＤＣ（０）の培養条件で有意に高かったが、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ及びＰＣＳＫ１では発現レベルに有意差はなかった。
【0106】
（７）免疫染色
分化した膵島様細胞を集め、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞凝集体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１５分間３回洗浄し、室温で１時間、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含むＰＢＳ中で透過処理した。透過処理した細胞凝集体をＰＢＳで１５分間３回洗浄し、６％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中で、４℃で一晩ブロックした。免疫染色は、マウス抗インスリン抗体（１：５００；Ａｂｃａｍ社製）およびマウス抗グルカゴン抗体（１：５００；Ａｂｃａｍ社製）を一次抗体として用い、３％ ＢＳＡ（ＰＢＳＢ）を含有するＰＢＳ中で希釈し、４℃で４８時間インキュベートすることにより行った。細胞を０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで３０分間３回洗浄した後、ＰＢＳＢで希釈した二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７結合ロバ抗マウスＩｇＧ）（１：５００；Ａｂｃａｍ社製）と、暗所で４℃、一晩インキュベートした。免疫染色後、核を４’，６’－ジアミジノ－２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ；１：１０００；同仁化学社製）で染色した。次に、組織除去試薬（Ｖｉｓｉｋｏｌ社製）により細胞凝集体を除去し、密な細胞凝集体の断面を観察した。蛍光画像は、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＩＸ－８１、オリンパス社製）を用いて取得し、膵島様細胞の断面積に対する陽性細胞面積の割合を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（米国国立精神衛生研究所）を用いて、各画像において計測した。結果を図５に示す。
分化した膵島様細胞を集め、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞凝集体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１５分間３回洗浄し、室温で１時間、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含むＰＢＳ中で透過処理した。透過処理した細胞凝集体をＰＢＳで１５分間３回洗浄し、６％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中で、４℃で一晩ブロックした。免疫染色は、マウス抗インスリン抗体（１：５００；Ａｂｃａｍ社製）およびマウス抗グルカゴン抗体（１：５００；Ａｂｃａｍ社製）を一次抗体として用い、３％ ＢＳＡ（ＰＢＳＢ）を含有するＰＢＳ中で希釈し、４℃で４８時間インキュベートすることにより行った。細胞を０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで３０分間３回洗浄した後、ＰＢＳＢで希釈した二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７結合ロバ抗マウスＩｇＧ）（１：５００；Ａｂｃａｍ社製）と、暗所で４℃、一晩インキュベートした。免疫染色後、核を４’，６’－ジアミジノ－２‐フェニルインドール（ＤＡＰＩ；１：１０００；同仁化学社製）で染色した。次に、組織除去試薬（Ｖｉｓｉｋｏｌ社製）により細胞凝集体を除去し、密な細胞凝集体の断面を観察した。蛍光画像は、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＩＸ－８１、オリンパス社製）を用いて取得し、膵島様細胞の断面積に対する陽性細胞面積の割合を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（米国国立精神衛生研究所）を用いて、各画像において計測した。結果を図５に示す。
【0107】
図５に示したように、全ての培養条件下で膵島様細胞のインシュリン陽性細胞及びグルカゴン陽性細胞を観察した。また、ＤＣ（１）及びＤＣ（０）の培養条件で、インシュリン陽性細胞及びグルカゴン陽性細胞面積が増加していた。図６に、インスリン陽性細胞及びグルカゴン陽性細胞面積の測定結果を示す。図６に示したように、インスリン陽性細胞面積の割合は、ＤＣ（１）で、２０．６±５．８％、ＤＣ（０）で、２４．１±７．９％であり、対照（８．６±４．４％）と比較して有意に増加していた（図６（ａ））。さらに、ＤＣ（０）のグルカゴン陽性細胞面積の割合は、１．７８±１．０２％であり、対照（０．５２±０．３６％）よりも有意に大きかった（図６（ｂ））。これらの結果は、ＤＣ（０）の培養条件では、インシュリン及びグルカゴンのｍＲＮＡ発現レベルの増加に応じて、より多くの細胞がインシュリンまたはグルカゴンを産生することを示している。
【0108】
（８）グルコース刺激Ｃ－ペプチド分泌試験
膵島様細胞へ分化後、各培養条件下の膵島様細胞を採取し、グルコース刺激を行った。その後、Ｃ－ペプチド分泌アッセイを行い、グルコース刺激インスリン分泌（Ｇｌｕｃｏｓｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ；ＧＳＩＳ）を測定した。グルコース刺激は、２相で行い、各相、低濃度グルコース刺激と高濃度グルコース刺激を行った。具体的には下記の操作を２回繰り返した。
細胞凝集体を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ（グルコースなし）で２回洗浄し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ（２ｍＭグルコース）中、３７℃で３０分間プレインキュベートした。細胞凝集体を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ（グルコースなし）で２回洗浄し、次いで、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡを含有する１ｍＬのＤＭＥＭ（２ｍＭグルコース）中で、３７℃で１時間インキュベートした。培地の上清を穏やかに混合した後に集め、Ｃ－ペプチド濃度を均一にした。細胞凝集体を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ（グルコースなし）で２回洗浄し、次いで、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡを含有する１ｍＬ ＤＭＥＭ（２０ｍＭグルコース）中で、３７℃で１時間インキュベートし、上清を採取した。各相におけるサンプリングされた上清のＣ－ペプチド濃度を、ヒトＣ－ペプチドＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｗｉｎｓｔｏｎ Ｓａｌｅｍ社製）を用い、製品のプロトコールに従って測定した。
膵島様細胞へ分化後、各培養条件下の膵島様細胞を採取し、グルコース刺激を行った。その後、Ｃ－ペプチド分泌アッセイを行い、グルコース刺激インスリン分泌（Ｇｌｕｃｏｓｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ；ＧＳＩＳ）を測定した。グルコース刺激は、２相で行い、各相、低濃度グルコース刺激と高濃度グルコース刺激を行った。具体的には下記の操作を２回繰り返した。
細胞凝集体を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ（グルコースなし）で２回洗浄し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ（２ｍＭグルコース）中、３７℃で３０分間プレインキュベートした。細胞凝集体を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ（グルコースなし）で２回洗浄し、次いで、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡを含有する１ｍＬのＤＭＥＭ（２ｍＭグルコース）中で、３７℃で１時間インキュベートした。培地の上清を穏やかに混合した後に集め、Ｃ－ペプチド濃度を均一にした。細胞凝集体を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ（グルコースなし）で２回洗浄し、次いで、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ ＢＳＡを含有する１ｍＬ ＤＭＥＭ（２０ｍＭグルコース）中で、３７℃で１時間インキュベートし、上清を採取した。各相におけるサンプリングされた上清のＣ－ペプチド濃度を、ヒトＣ－ペプチドＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｗｉｎｓｔｏｎ Ｓａｌｅｍ社製）を用い、製品のプロトコールに従って測定した。
【0109】
結果を図７及び図８に示す。図７に示したように、ＧＳＩＳの最初のグルコース刺激では、すべての培養条件下で高濃度グルコース刺激によるＣペプチド分泌の有意な増加は観察できなかった（図７）。これは、膵島様細胞の未熟性によると推定される。ＧＳＩＳの２回目のグルコース刺激において、高濃度グルコース刺激に対するＣ－ペプチド分泌応答の倍増を観察し、ＤＣ（０）の培養条件のみがＣ－ペプチド分泌の有意な増加を示した（図８）。さらに、ＤＣ（１）およびＤＣ（０）の培養条件では、ＤＣ（２）および対照の培養条件よりも低濃度グルコース刺激および高濃度グルコース刺激の各々においてＣ－ペプチドの分泌が高い傾向を示した。
次に、高濃度グルコース刺激と低濃度グルコース刺激とにおけるＣ‐ペプチド分泌の比を計算した。その結果を図９に示す。図９に示したように、対照は、１．２６±０．７６、ＤＣ（２）は１．３５±０．６４、ＤＣ（１）は、１．１８±０．３５、ＤＣ（０）は、１．５７±０．５７であった。
次に、高濃度グルコース刺激と低濃度グルコース刺激とにおけるＣ‐ペプチド分泌の比を計算した。その結果を図９に示す。図９に示したように、対照は、１．２６±０．７６、ＤＣ（２）は１．３５±０．６４、ＤＣ（１）は、１．１８±０．３５、ＤＣ（０）は、１．５７±０．５７であった。
【0110】
上述したように、ＤＣ（０）の培養条件では、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、およびＧＣＫの遺伝子の発現が増加していたことから、この結果は、グルコース感知遺伝子及びグルコース代謝関連遺伝子発現の増加制御に起因するものと推定される。なお、β細胞の生育に関与するＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＡ、及びインシュリン分泌プロセスに関与するＰＣＳＫ１の発現レベルに有意な変化はなかったことから、ＤＣ（０）の培養条件におけるＧＳＩＳの改善は、主にβ細胞のグルコース感知およびグルコース代謝の成熟に起因するものと推定される。
【符号の説明】
【0111】
１ 第一領域
２ 培地
３ 第二領域
４ 培地成分の少なくとも一部
５ 膜
２ 培地
３ 第二領域
４ 培地成分の少なくとも一部
５ 膜
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】