特開 2024-140805 自己免疫性脳弓下器官疾患を判定するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024140805

(43)【公開日】2024-10-10

(54)【発明の名称】自己免疫性脳弓下器官疾患を判定するための方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20241003BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 N ZNA

【審査請求】未請求

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023052145

(22)【出願日】2023-03-28

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(71)【出願人】

【識別番号】518150688

【氏名又は名称】プロテオブリッジ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】宇都宮 朱里

(72)【発明者】

【氏名】五島 直樹

(72)【発明者】

【氏名】山口 圭

(57)【要約】

【課題】本開示の目的の１つは、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するための方法を提供することである。
【解決手段】対象から採取された試料における抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルをカットオフ値と比較することを含む、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するための方法が提供される。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象から採取された試料における抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルをカットオフ値と比較することを含む、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するための方法。

【請求項2】

自己免疫性脳弓下器官疾患が本態性高ナトリウム血症またはＲＯＨＨＡＤ症候群である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

対象の血中ナトリウム濃度が標準値と比較して高い、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

対象が神経芽腫群腫瘍に罹患していない、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

対象から採取された試料における抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルを測定することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定される、請求項１～５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

対象から採取された試料における抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルをカットオフ値と比較することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

対象から採取された試料における抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルを測定することを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定される、請求項７または８に記載の方法。

【請求項10】

対象から採取された試料が、血液試料である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

血液試料が、血漿試料または血清試料である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

ＺＳＣＡＮ１またはその断片を含む、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するためのキット。

【請求項13】

ＳＣＮ７Ａまたはその断片をさらに含む、請求項１２に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するための方法およびキットに関する。

【背景技術】

【0002】

本態性高ナトリウム血症は、口渇中枢障害を伴う高ナトリウム血症とも呼ばれる。本症は不均一な臨床像を示すが、その特徴的な症状は、高ナトリウム血症、抗利尿ホルモンの低下を伴う低張尿および口渇感欠如である。一部の症例では、生来の構造的な病変（中隔視神経形成異常症など）、視床下部－下垂体領域の腫瘍、炎症（例えば、ＣＭＶ、ＨＨＶ６、ＣＯＶＩＤ－１９による脳炎）などにより、視床下部や下垂体に損傷がある。視床下部や下垂体に構造的な病変を持たない本態性高ナトリウム血症患者において、脳弓下器官に対する特異的な抗体応答が報告されている（非特許文献１）。脳弓下器官に対する自己抗体として抗Ｎａ_ｘ抗体が報告されているが、その他に標的となる抗原分子は同定されていない（非特許文献２、３）。

【0003】

ＲＯＨＨＡＤ（低換気、視床下部機能不全および自律神経調節不全を伴う急速発症肥満）症候群は、２００７年に提唱された比較的新しい疾患概念であり、非常に稀な小児科疾患である。神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）を伴う場合、ＲＯＨＨＡＤ－ＮＥＴ症候群とも呼ばれる（非特許文献４）。典型的には平均で３歳頃から発症する急激な肥満と中枢性低換気を特徴とし、成長ホルモン欠乏とナトリウムレベル異常を高頻度で合併する。より頻度の低い合併症として、高プロラクチン血症、中枢性甲状腺機能低下症、心呼吸停止が挙げられる。病因としては、遺伝やエピゲノムに加え、自己免疫が推測されており、脳弓下器官および視床下部に対する抗体が検出されている（非特許文献５）。最近、神経芽腫群腫瘍を伴うＲＯＨＨＡＤ患者の主に脳脊髄液にＺＳＣＡＮ１に対する自己抗体が検出され、腫瘍組織にＺＳＣＡＮ１の発現が見られたことから、ＲＯＨＨＡＤが傍腫瘍性神経症候群である可能性が示唆された（非特許文献６）。ＺＳＣＡＮ１は卵巣癌の予後予測マーカーとして知られている（非特許文献７）。

【0004】

本態性高ナトリウム血症とＲＯＨＨＡＤ症候群の臨床的特徴を比較すると、ナトリウムレベルの異常に加えて、類似の視床下部－下垂体機能障害があり、一部の症例では脳弓下器官に対する自己抗体の関与が推測される（非特許文献８）。脳弓下器官は、口渇および塩欲求制御の中枢であり、血中ナトリウムセンサーとして主要な役割を担い、抗利尿ホルモン分泌にも関与する。脳血管関門を免れている血管豊富な部位であり、脳脊髄液に直接接触し、抗体が侵入することも知られている。しかしながら、本態性高ナトリウム血症とＲＯＨＨＡＤ症候群に共通する抗原は同定されていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Hiyama T.Y., et al. Adipsic hypernatremia without hypothalamic lesions accompanied by autoantibodies to subfornical organ. Brain Pathol. 2017;27:323-331. doi: 10.1111/bpa.12409.

【非特許文献2】Hiyama T.Y., et al., Autoimmunity to the sodium-level sensor in the brain causes essential hypernatremia. Neuron. 2010;27:508-522. doi: 10.1016/j.neuron.2010.04.017.

【非特許文献3】宇都宮朱里, 小児内科, vol. 53, 増刊号2021, 362-365

【非特許文献4】Lee J.M., et al. Rapid-Onset Obesity with Hypoventilation, Hypothalamic, Autonomic Dysregulation, and Neuroendocrine Tumors (ROHHADNET) Syndrome: A Systematic Review. Biomed. Res. Int. 2018;21:1250721. doi: 10.1155/2018/1250721.

【非特許文献5】Nakamura-Utsunomiya A., et al. Identification of clinical factors related to antibody-mediated immune response to the subfornical organ. Clin. Endocrinol. 2022;97:72-80. doi: 10.1111/cen.14737.

【非特許文献6】Mandel-Brehm C., et al. ZSCAN1 Autoantibodies Are Associated with Pediatric Paraneoplastic ROHHAD. Ann. Neurol. 2022 doi: 10.1002/ana.26380

【非特許文献7】Li N, et al. DNA methylation markers as triage test for the early identification of cervical lesions in a Chinese population. Int. J. Cancer. 2021; 148:1768-1777. https://doi.org/10.1002/ijc.33430

【非特許文献8】Nakamura-Utsunomiya, A. Autoimmunity Related to Adipsic Hypernatremia and ROHHAD Syndrome. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 6899. https://doi.org/10.3390/ijms23136899

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本開示の目的の１つは、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するための方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、自己免疫性脳弓下器官疾患の患者の血中では、抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルが高いことを見出した。従って、抗ＺＳＣＡＮ１抗体を自己免疫性脳弓下器官疾患のマーカーとして使用し得る。

【0008】

ある態様では、本開示は、対象から採取された試料における抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルをカットオフ値と比較することを含む、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するための方法を提供する。

【0009】

ある態様では、本開示は、ＺＳＣＡＮ１またはその断片を含む、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するためのキットを提供する。

【発明の効果】

【0010】

本開示により、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているかを判定するための方法およびキットが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】マウス脳弓下器官を含む切片を患者の血清試料および抗ＺＳＣＡＮ１抗体で免疫染色した結果を示す。

【図2】患者の血清試料に含まれる抗Ｎａ_ｘ抗体および抗ＺＳＣＡＮ１抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。

【図3】脳弓下器官（ＳＦＯ）への抗体反応陽性者の血清試料に含まれる抗Ｎａ_ｘ抗体および抗ＺＳＣＡＮ１抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。

【図4】患者の血清試料にＺＳＣＡＮ１タンパク質を添加した後に、抗ＺＳＣＡＮ１抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。

【0013】

本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間のすべての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。

【0014】

ある態様では、対象から採取された試料における抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルをカットオフ値と比較することを含む、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するための方法が提供される。本方法により、自己免疫性脳弓下器官疾患の診断を補助すること、または、自己免疫性脳弓下器官疾患の診断のための情報を提供することができる。

【0015】

本開示において、自己免疫性脳弓下器官疾患は、脳弓下器官に発現する抗原に対する自己免疫が関与する疾患を意味し、本態性高ナトリウム血症およびＲＯＨＨＡＤ症候群が含まれる。脳弓下器官は、脳内のナトリウムセンサー（Ｎａ_ｘチャネル）と浸透圧センサー（ＴＰＰＶ４チャネル）機能を有する脳室周囲器官の一部であり、ナトリウムセンサーとして主要な役割を担っている。

【0016】

本態性高ナトリウム血症は、口渇中枢障害を伴う高ナトリウム血症とも呼ばれる。血清ナトリウム値の恒常性は生命維持に必須であり、ヒトの体液のナトリウムレベルは通常１３５～１４５ｍＥｑ／Ｌで維持されている。血中ナトリウム濃度が上昇すれば口渇中枢が働き、ナトリウム濃度を低下させるために飲水行動が起こるが、口渇中枢に障害があると飲水行動が起こらず、高ナトリウム血症を発症する。本態性高ナトリウム血症の主な診断基準は次の通りである：（１）血清または血漿中ナトリウムが、標準値（約１４５ｍＥｑ／Ｌ）より持続して高値である、（２）高ナトリウム血症が存在するにもかかわらず、口渇感がない、（３）他に高ナトリウム血症を来す明らかな器質的原因がない。後述する実施例により、本態性高ナトリウム血症において、脳弓下器官に発現するＺＳＣＡＮ１に対する抗体の血中レベルが高い症例が見出された。

【0017】

ＲＯＨＨＡＤ症候群は、急激な肥満、中枢性低換気、視床下部機能不全および自律神経調節不全を伴う症候群の略称であり、２００７年にIze-Ludlowらによって定義された比較的新しい疾患概念である（Ize-Ludlow D, et al., Rapid-onset obesity with hypothalamic dysfunction, hypoventilation, and autonomic dysregulation presenting in childhood. Pediatrics. 2007 Jul;120(1):e179-88. doi: 10.1542/peds.2006-3324）。全例で急激な肥満および中枢性低換気が認められ、高頻度の合併症として、成長ホルモン欠乏およびナトリウムレベル異常、半数で認められる合併症として、高プロラクチン血症、中枢性甲状腺機能低下症、心呼吸停止が挙げられる。神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）を合併する場合があり、ＲＯＨＨＡＤ－ＮＥＴ症候群とも呼ばれる。後述する実施例により、神経芽腫群腫瘍を合併しないＲＯＨＨＡＤ症候群において、脳弓下器官に発現するＺＳＣＡＮ１に対する抗体の血中レベルが高い症例が見出された。

【0018】

本開示において、対象はヒトである。対象は、自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していることが疑われる対象であってもよい。例えば、血中ナトリウム濃度が標準値（例えば、１４５ｍＥｑ／Ｌ）と比較して高い対象が挙げられる。あるいは、対象は、急激な肥満など、ＲＯＨＨＡＤ症候群の徴候または症状が見られる対象であってもよい。ある実施態様では、対象は腫瘍、好ましくは神経内分泌腫瘍、より好ましくは神経芽腫群腫瘍に罹患していない。神経芽腫群腫瘍には、神経芽腫、神経節芽腫および神経節腫が含まれる。

【0019】

試料は、対象から採取された生体試料であり、採取後にさらに調製したものであってもよい。例えば、試料は血漿試料または血清試料などの血液試料であり得る。血液試料は、通常の方法で、例えば静脈または動脈から採取された血液を、当業者に周知の方法により適宜処理することにより調製し得る。この処理は、特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理でもあってもよい。例えば、抗凝固剤の添加、遠心分離などが行われる。試料は使用に先立ち低温下で保存してもよく、例えば、冷凍保存し得る。また、試料は必要に応じて適宜濃縮または希釈して使用し得る。ある実施態様では、本開示の方法は、対象から試料を採取することを含む。

【0020】

抗ＺＳＣＡＮ１抗体は、ＺＳＣＡＮ１に結合できる抗体である。ＺＳＣＡＮ１は、転写因子の１つであるジンクフィンガーおよびＳＣＡＮドメイン含有タンパク質１の略称である。脳および精巣にＺＳＣＡＮ１タンパク質の発現が見られ、下垂体、視床下部および精巣にＲＮＡの発現が見られる。種々の生物種に由来するＺＳＣＡＮ１のアミノ酸配列は、公知のデータベースを利用して、容易に入手できる。ヒトＺＳＣＡＮ１の代表的なアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号ＮＰ＿８７２３７８．３（配列番号１）として登録されている。本開示において、ＺＳＣＡＮ１は、その天然に存在する対立遺伝子の産物を含む。

【0021】

本開示において、抗体のアイソタイプは限定されない。アイソタイプの例には、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが含まれ、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ、より好ましくはＩｇＧである。

【0022】

抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルを測定する方法は、限定されない。例えば、抗ＺＳＣＡＮ１抗体は、免疫学的手法により測定し得る。免疫学的手法としては、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ法、例えば、直接法、間接法、サンドイッチ法または競合法）、イムノクロマト法、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）などを例示できる。

【0023】

ある実施態様では、抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルは、（１）対象から採取された試料を、ＺＳＣＡＮ１またはその断片と接触させる工程、および、（２）ＺＳＣＡＮ１またはその断片に結合した抗体の量を測定する工程、を含む方法により測定される。

【0024】

本開示に関して、対象から採取された試料と接触させるＺＳＣＡＮ１は、生体試料中の抗ＺＳＣＡＮ１抗体を検出できる限り、本来のアミノ酸配列（例えば配列番号１のアミノ酸配列）において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加した配列を含んでもよい。なお、「数個」とは、好ましくは２～７個、より好ましくは２～５個、最も好ましくは２～３個のアミノ酸を意味する。アミノ酸置換は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。

【0025】

また、対象から採取された試料と接触させるＺＳＣＡＮ１は、生体試料中の抗ＺＳＣＡＮ１抗体を検出できる限り、本来のアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ等を用いて計算したときに（例えば、ＢＬＡＳＴのデフォルト、即ち初期条件のパラメーターを用いた場合に）、少なくとも約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９７％、約９８％もしくは約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

【0026】

ＺＳＣＡＮ１の断片は、ＺＳＣＡＮ１の一部のアミノ酸配列を含み、生体試料中の抗ＺＳＣＡＮ１抗体を検出できるものであれば、特に限定されない。ＺＳＣＡＮ１の断片のアミノ酸残基の数は、例えば６以上、８以上、１２以上、２０以上、４０以上、１００以上、２００以上、３００以上または４００以上、かつ、１０未満、５０未満、１００未満、２００未満または４０８未満であり得る。

【0027】

ＺＳＣＡＮ１またはその断片は、生体試料中の抗ＺＳＣＡＮ１抗体を検出できる限り、化学修飾されていてもよい。リンカー、エピトープタグ、蛍光タンパク質、精製を容易にするペプチドなどが付加されていてもよい。

【0028】

ＺＳＣＡＮ１またはその断片は、遺伝子工学的手法により、例えば、これをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製して細胞で発現させる方法など、公知の方法により製造できる。具体的には、ＺＳＣＡＮ１またはその断片をコードするポリヌクレオチドがエンハンサーやプロモーターなどの発現制御領域のもとで発現するよう発現ベクターを構築し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換して、ＺＳＣＡＮ１またはその断片を発現させ、回収する。あるいは、無細胞タンパク質合成系により、即ち、細胞を直接使用せず、コムギ胚芽、大腸菌、ウサギ網状赤血球、昆虫細胞などの細胞に由来する酵素などを利用してＺＳＣＡＮ１またはその断片を合成してもよく、例えば、Goshima, N. et al.: Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome, Nat Methods. 2008 Dec;5(12):1011-7 に記載のコムギ無細胞タンパク質合成系により、合成し得る。

【0029】

工程（１）では、抗ＺＳＣＡＮ１抗体の測定方法（各種イムノアッセイなど）に応じて、対象から採取された試料とＺＳＣＡＮ１またはその断片をどのような方法で接触させてもよい。例えば、試料中の抗体、または、抗原（ＺＳＣＡＮ１またはその断片）を固相に固定して接触させもよく、抗体と抗原の両方とも固相に固定しない状態で接触させてもよい。好ましくは、抗原を固相に固定した状態で接触させる。固相は、抗体または抗原を固定できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であっても良い。例えば、ナイロン膜などのメンブレン、ビーズ、ガラス、プラスチック、および金属などを例示できる。

【0030】

工程（２）では、どのような方法でＺＳＣＡＮ１またはその断片に結合した抗体の量を測定してもよい。例えば、抗原に結合した抗体に対して直接または間接的に標識抗体を接触させ、結合した標識抗体の標識に由来するシグナルを定量することによって、抗ＺＳＣＡＮ１抗体の量を測定できる。標識抗体は、特に制限されず、例えば抗体定常領域に対する抗体または抗イディオタイプ抗体であり得る。標識は検出可能な物質であればよく、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、酵素標識およびビオチンが挙げられる。

【0031】

本開示の方法では、対象から採取された試料における抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定し得る。抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルがカットオフ値と同等である場合、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定するか、罹患していないと判定するか、判定の目的などに応じて任意に設定できる。従って、ある実施態様では、抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルがカットオフ値以上である場合に対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定する。別の実施態様では、抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルがカットオフ値より高い場合に対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定する。

【0032】

カットオフ値は、自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患している対象群と罹患していない対象群を、統計的に有意差をもって分けることができる値である。カットオフ値の設定は、種々の統計解析手法を用いて、公知の方法により実施できる。例えば、自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患している対象群から取得された試料における抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルと、罹患していない対象群から取得された試料における抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルを統計解析的に処理することにより、カットオフ値を設定できる。統計的有意差は、カイ二乗検定、一般化Wilcoxon検定、Wilcoxonの符号順位検定、Mann-Whitney検定、ログランク検定、Cox比例ハザードなどの公知の検定方法により解析され得る。カットオフ値の設定には、例えば、SPSS、JMP、Prism等の統計解析用ソフトウェアを使用し得る。

【0033】

カットオフ値は、感度および／または特異度に基づいて設定し得る。好ましくは、カットオフ値は、高い感度および高い特異度の両方を示す。ここで、感度とは、真の陽性率を意味する。また、特異度とは真の陰性率を意味する。例えば、自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患している対象群で高い陽性率を示し、かつ、自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していない対象群で高い陰性率を示す抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルを、カットオフ値として設定し得る。

【0034】

例えば、診断検査の有用性を検討する手法として一般的に用いられているＲＯＣ解析（receiver operating characteristic analysis）により、カットオフ値を設定することができる。ＲＯＣ解析では、各カットオフ値における感度を縦軸に、偽陽性率（１－特異度）を横軸にプロットしたＲＯＣ曲線が作成される。ＲＯＣ曲線は、診断能のない検査では対角線上の直線となるが、診断能が向上するほど、左上方に弧を描く曲線となる。左上隅との距離が最小となるＲＯＣ曲線上の点を与えるカットオフ値は、感度と特異度に優れると言える。また、ヨーデン指標（Youden index）に基づいてカットオフ値を設定することもできる。具体的には、自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患している対象群および罹患していない対象群の抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルから感度および特異度を求め、これらの値に基づき、市販の解析ソフトを使用してＲＯＣ曲線を作成する。そして、感度と特異度が可能な限り１００％に近いときの値を求めて、その値をカットオフ値とし得る。

【0035】

また、例えば、診断効率（即ち、自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患している対象を「罹患している」と正しく診断した症例と、自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していない対象を「罹患していない」と正しく診断した症例との合計数の全症例数に対する割合）を求め、最も高い診断効率が算出される抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルをカットオフ値とし得る。

【0036】

特徴に応じてサブグループ化された患者群についてカットオフ値を設定することもできる。例えば、性別、年齢層または人種に応じてそれぞれカットオフ値が設定されてよい。

【0037】

ある実施態様では、本開示の方法は、対象から採取された試料における抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルをカットオフ値と比較することをさらに含む。Ｎａ_ｘは脳室周囲器官に発現するナトリウム濃度依存性ナトリウムチャネルである。神経節腫を合併した本態性高ナトリウム血症において、抗Ｎａ_ｘ抗体陽性の症例が報告されている（非特許文献２、３）。後述する実施例により、神経芽腫群腫瘍を合併しない本態性高ナトリウム血症およびＲＯＨＨＡＤ症候群において、抗Ｎａ_ｘ抗体の血中レベルが高い症例が見出された。

【0038】

抗Ｎａ_ｘ抗体は、ナトリウムチャネルタンパク質７型サブユニットα（ＳＣＮ７Ａ）に結合できる抗体である。ＳＣＮ７Ａは、脳室周囲器官等に発現するナトリウムチャネルのイオン透過性ポアを形成するサブユニットである。種々の生物種に由来するＳＣＮ７Ａのアミノ酸配列は、公知のデータベースを利用して、容易に入手できる。ヒトＳＣＮ７Ａの代表的なアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号ＮＰ＿００２９６７．２（配列番号２）として登録されている。本開示において、ＳＣＮ７Ａは、その天然に存在する対立遺伝子の産物を含む。

【0039】

抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルは、上述の抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルと同様に測定できる。例えば、（１）対象から採取された試料を、ＳＣＮ７Ａまたはその断片を試料と接触させる工程、および、（２）ＳＣＮ７Ａまたはその断片に結合した抗体の量を測定する工程、を含む方法により測定し得る。これらの工程は、上述の抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルを測定する方法において、抗原としてＺＳＣＡＮ１またはその断片の代わりにＳＣＮ７Ａまたはその断片を使用することにより、実施できる。

【0040】

本開示に関して、ＳＣＮ７Ａは、生体試料中の抗Ｎａ_ｘ抗体を検出できる限り、本来のアミノ酸配列（例えば配列番号２のアミノ酸配列）において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加した配列を含んでもよい。なお、「数個」とは、好ましくは２～７個、より好ましくは２～５個、最も好ましくは２～３個のアミノ酸を意味する。アミノ酸置換は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。

【0041】

また、ＳＣＮ７Ａは、生体試料中の抗Ｎａ_ｘ抗体を検出できる限り、本来のアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ等を用いて計算したときに（例えば、ＢＬＡＳＴのデフォルト、即ち初期条件のパラメーターを用いた場合に）、少なくとも約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９７％、約９８％もしくは約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。

【0042】

ＳＣＮ７Ａの断片は、ＳＣＮ７Ａ１の一部のアミノ酸配列を含み、生体試料中の抗Ｎａ_ｘ抗体を検出できるものであれば、特に限定されない。これらの断片のアミノ酸残基の数は、例えば６以上、８以上、１２以上、２５以上、５０以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上または１５００以上、かつ、１０未満、２５未満、５０未満、５２未満、１００未満、５００未満、１０００未満または１６８２未満である。ある実施態様では、ＳＣＮ７Ａの断片は既報（非特許文献２）の抗Ｎａ_ｘ抗体のエピトープを含む。例えば、ＳＣＮ７Ａの断片はＳＣＮ７Ａの１１番目の細胞外領域の５１アミノ酸（Ｄ１０７８～Ｖ１１２８、配列番号３）、好ましくは、６アミノ酸（Ｃ１１０７～Ｆ１１１２、配列番号４）を含む。

【0043】

ＳＣＮ７Ａまたはその断片は、生体試料中の抗Ｎａ_ｘ抗体を検出できる限り、化学修飾されていてもよい。リンカー、エピトープタグ、蛍光タンパク質、精製を容易にするペプチドなどが付加されていてもよい。

【0044】

ＳＣＮ７Ａまたはその断片は、上述のＺＳＣＡＮ１またはその断片と同様の方法で製造できる。

【0045】

この実施態様では、対象から採取された試料における抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定される。抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルがカットオフ値と同等である場合、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定するか、罹患していないと判定するか、判定の目的などに応じて任意に設定できる。従って、ある実施態様では、抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルがカットオフ値以上である場合に対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定する。別の実施態様では、抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルがカットオフ値より高い場合に対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定する。抗Ｎａ_ｘ抗体のカットオフ値は、上述の抗ＺＳＣＡＮ１抗体のカットオフ値と同様に設定できる。

【0046】

この実施態様では、抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルに拘わらず、対象から採取された試料における抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定される。従って、対象から採取された試料における抗ＺＳＣＡＮ１抗体および抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルを測定し、抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルがカットオフ値と比較して高い場合、および／または、抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定し得る。

【0047】

ある実施態様では、本方法により自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定された対象において、自己免疫性脳弓下器官疾患の治療が実施される。例えば、本方法により自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定された対象に、自己免疫性脳弓下器官疾患の治療薬を投与し得る。

【0048】

本方法により自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定された対象をさらに臨床的に診断し、治療を実施してもよい。例えば、本方法により自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定され、臨床的に本態性高ナトリウム血症と診断された対象に、本態性高ナトリウム血症の治療を実施する。例えば、本方法により自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定され、臨床的にＲＯＨＨＡＤ症候群と診断された対象に、ＲＯＨＨＡＤ症候群の治療を実施する。

【0049】

本態性高ナトリウム血症の治療の例には、デスモプレシン製剤の投与などが含まれる。ＲＯＨＨＡＤ症候群の治療の例には、低下している各ホルモンの補充、免疫グロブリン製剤投与、ステロイドパルス療法、シクロフォスファミド製剤、リツキシマブ製剤、血漿交換等による免疫抑制治療などが含まれる。

【0050】

別の態様では、ＺＳＣＡＮ１またはその断片を含む、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するためのキットが提供される。ＺＳＣＡＮ１は抗ＺＳＣＡＮ１抗体の抗原であり、当該キットにより試料中の抗ＺＳＣＡＮ１抗体を検出または測定できる。ＺＳＣＡＮ１またはその断片は、水または適当な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容されて、あるいは固相に結合した状態で、提供され得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、シリンジ、試験管、プレート、メンブレン等が含まれる。容器は、ガラス、プラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。キットは、ＺＳＣＡＮ１またはその断片の検出に必要な他の成分や試薬をさらに含んでもよい。例えば、キットは、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液などをさらに含み得る。キットは、さらに、使用のための説明を含む添付文書等の、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の材料をさらに含み得る。

【0051】

ある実施態様では、キットはＳＣＮ７Ａまたはその断片をさらに含んでもよい。ＳＣＮ７Ａは抗Ｎａ_ｘ抗体の抗原であり、当該キットにより、試料中の抗ＺＳＣＡＮ１抗体に加えて、抗Ｎａ_ｘ抗体も検出または測定できる。一度の操作で試料中の抗ＺＳＣＡＮ１抗体と抗Ｎａｘ抗体を同時に検出または測定できるキットが好ましい。

【0052】

ある態様では、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するための、ＺＳＣＡＮ１またはその断片が提供される。
ある態様では、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するためのキットを製造するための、ＺＳＣＡＮ１またはその断片の使用が提供される。

【0053】

例えば、下記の実施態様が提供される。
［１］対象から採取された試料における抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルをカットオフ値と比較することを含む、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するための方法。
［２］自己免疫性脳弓下器官疾患が本態性高ナトリウム血症またはＲＯＨＨＡＤ症候群である、第１項に記載の方法。
［３］対象の血中ナトリウム濃度が標準値と比較して高い、第１項または第２項に記載の方法。
［４］対象が神経芽腫群腫瘍に罹患していない、第１項～第３項のいずれかに記載の方法。
［５］対象から採取された試料における抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルを測定することを含む、第１項～第４項のいずれかに記載の方法。
［６］抗ＺＳＣＡＮ１抗体のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定される、第１項～第５項のいずれかに記載の方法。
［７］対象から採取された試料における抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルをカットオフ値と比較することをさらに含む、第１項～第６項のいずれかに記載の方法。
［８］対象から採取された試料における抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルを測定することを含む、第７項に記載の方法。
［９］抗Ｎａ_ｘ抗体のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患していると判定される、第７項または第８項に記載の方法。
［１０］対象から採取された試料が、血液試料である、第１項～第９項のいずれかに記載の方法。
［１１］血液試料が、血漿試料または血清試料である、第１０項に記載の方法。
［１２］ＺＳＣＡＮ１またはその断片を含む、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定するためのキット。
［１３］ＳＣＮ７Ａまたはその断片をさらに含む、第１２項に記載のキット。

【0054】

本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、本発明は添付の特許請求の範囲において定義され、その技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。以下、実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

【実施例0055】

方法
網羅的タンパク質アレイ解析
ＨｕＰＥＸ（商標）網羅タンパク質アレイ（プロテオブリッジ社）Ｎｏ．１およびＮｏ．２を使用して自己抗体を検出した。血清試料（３検体ミクスチャー、各４５μＬ）、希釈液（２０ｍＬ）、ブロッキング剤としてのコムギ胚芽抽出液（４０μＬ）を３０分間混合し、血清反応液を調製した。血清反応液をアレイにアプライし、室温で１時間反応させた。ＴＢＳＴでアレイを３回洗浄後、１：１０００希釈（２０μＬ：２０ｍＬ）のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）AlexaFlour（登録商標）６４７コンジュゲート二次抗体（A21445_ThermoFisher）をアプライし、室温で１時間反応させた。Typhoon FRA 9500（GE Healthcare）を使用して蛍光を検出した。

【0056】

カスタムタンパク質アレイ解析
網羅的タンパク質アレイ解析で同定された３３個の抗原、ポジティブコントロール（ＬＩＭＳ１、ヒトＩｇＧ）およびネガティブコントロール（ｍＲＮＡを含まないタンパク質合成溶液（Ｍｏｃｋ））を搭載したカスタムタンパク質アレイを作製した。血清試料（１０．５μＬ）、希釈液（３．５ｍＬ）、ブロッキング剤としてのコムギ胚芽抽出液（３～９μＬ）を３０分間混合し、血清反応液を調製した。血清反応液をカスタムタンパク質アレイにアプライし、室温で１時間反応させた。ＴＢＳＴでアレイを３回洗浄後、１：１０００希釈（５μＬ:５ｍＬ）のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）AlexaFlour（登録商標）６４７コンジュゲート二次抗体（A21445_ThermoFisher）をアプライし、室温で１時間反応させた。Typhoon FRA 9500（GE Healthcare）を使用して蛍光を検出した。

【0057】

免疫染色
深麻酔下の８～１６週齢のオスの野生型マウス（C57Bl/6J; CLEA Japan）をリン酸緩衝食塩水で経心的に灌流し、続いて２０％中和ホルマリンで灌流した。脳を冠状に切開し、４℃で一晩固定し、段階的な濃度のスクロース溶液に浸漬して凍結保護した。次いで、脳をＯＣＴ化合物（Sakura）に包埋し、クライオスタット（CM3050S; Leica Microsystems）で２０μｍの切片にした。切片を２５ｍＭグリシン（リン酸緩衝食塩水中）で３０分間インキュベートし、ブロッキング液（５％ＦＢＳ、０．１％ＴＸ１００を含む）により４℃で一晩処理した。次いで、ＳＦＯを含む切片を患者または対照の血清試料（１：２５０希釈）および抗ＺＳＣＡＮ１抗体（１：２５０希釈の抗ＺＳＣＡＮ１抗体ウサギ宿主抗体（Prestage Antibodies（登録商標）HPA007938_Sigma-Aldrich））と４８時間反応させた。１：５００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）, AlexaFlour（登録商標）６４７コンジュゲート（A21445_ThermoFisher）二次抗体およびヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）, Alexa Fluor（登録商標）５５５コンジュゲート（A 21428_ThermoFisher）二次抗体と２４時間反応させた。切片を共焦点蛍光顕微鏡（FV‐1000D; Olympus）で撮影した（露光時間：３０秒間）。

【0058】

ＥＬＩＳＡ法抗体測定
抗原タンパク質として、ＳＣＮ７Ａ（Ｑ０１１１８）の１１番目の細胞外領域（５１アミノ酸、Ｄ１０７８～Ｖ１１２８（配列番号３）、既報の抗Ｎａ_ｘ抗体のエピトープを含む）およびＺＳＣＡＮ１（Ｑ８ＮＢＢ４－１）全長（４０８アミノ酸、配列番号１）をコムギ無細胞タンパク質合成系によって合成した（Goshima, N. et al.: Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome, Nat Methods. 2008 Dec;5(12):1011-7）。抗原タンパク質は、Ｎ末端にＦＬＡＧ－ＧＳＴタグを有する融合タンパク質であり、タグと抗原タンパク質の間に２５アミノ酸のリンカーを有した。ＳＣＮ７Ａ、ＺＳＣＡＮ１、ヒトＩｇＧおよびＭｏｃｋを搭載したＥＬＩＳＡプレートを作製した。血清試料（１．０μＬ）、希釈液（１００．０μＬ）、ブロッキング剤としてのコムギ胚芽抽出液（０．５μＬ）を３０分間混合し、血清反応液（１ウェル分）を調製した。血清反応液をＥＬＩＳＡプレートのウェルにアプライし、１時間反応させた後、ＴＢＳＴでプレートを３回洗浄した。次に１：１００００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）HRPコンジュゲート酵素標識抗体溶液（A18811_ThermoFisher）を１００．０μＬ／１ウェルにてアプライし、室温で１時間反応させた後、ＴＢＳＴでプレートを３回洗浄した。呈色反応には、１００．０μＬ/１ウェルのＴＭＢ基質溶液（34021_ThermoFisher）を２５分間反応させた後、２Ｍ硫酸（１００．０μＬ／１ウェル）を加えて反応を停止させた。DTX880 Multimode Detector（Beckman）を使用して吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。インデックス値を下式により算出した。

【数1】

【0059】

患者血清とリコンビナントＺＳＣＡＮ１反応後のＥＬＩＳＡ抗体測定
患者の血清１０μｌに対してＺＳＣＡＮ１タンパク質をそれぞれ０、１０μｇ、５０μｇを添加し、４℃で２４時間反応させた。その後、１４０００回転で３分間遠心分離させた上清血清を用いて、抗ＺＳＣＡＮ１抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した。

【0060】

結果
プロテインアレイ解析
下表に示す小児患者５名（女児４名、男児１名）の血清試料をプロテインアレイ解析に付した。症例４は後腹膜腫瘍を合併した。いずれの症例もＳＦＯへの特異的抗体反応を示したが、抗Ｎａ_ｘ抗体陰性であった。

【0061】

【表1】

【0062】

網羅的プロテインアレイ解析により、症例１～３の血清試料の混合物および症例２～４の血清試料の混合物を分析した。検出されたタンパク質のうち、健常者でも検出されるものを除外し、３３種類のタンパク質を候補抗原として同定した。これらの３３種類のタンパク質を搭載したカスタムプロテインアレイを作製し、症例１～５の血清試料を分析した。結果を下表に示す。表中、＊は弱陽性（１０＜インデックス値＜２０）を、＊＊は強陽性（２０≦インデックス値）を示す。腫瘍合併を認めない症例４例において、共通する抗原としてＺＳＣＡＮ１を認めた。

【0063】

【表2】

【0064】

脳弓下器官の免疫染色
症例１の血清試料および抗ＺＳＣＡＮ１抗体を用いて、マウスの脳弓下器官を含む切片を免疫染色した。結果を図１に示す。患者のＩｇＧと抗ＺＳＣＡＮ１抗体は、脳弓下器官の同一の部位に結合することが観察された。

【0065】

ＥＬＩＳＡ法による抗体測定
症例１～５、傍腫瘍性神経疾患、膠原病（抗ＳＳ－Ｂ抗体陽性）および膠原病（抗Ｊｏ－１抗体陽性）の血清試料に含まれる抗Ｎａ_ｘ抗体および抗ＺＳＣＡＮ１抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡプレートの構造と測定された吸光度を図２に示す。算出されたインデックス値を下表に示す。インデックス値＞１０を陽性カットオフレベルと設定した。

【0066】

【表3】

【0067】

多数症例の抗体測定
ＳＦＯへの抗体反応陽性者（Akari Nakamura‐Utsunomiya, et al., Clinical Endocrinology. 2022;97:72-80）および正常対照者の血清試料に含まれる抗Ｎａ_ｘ抗体および抗ＺＳＣＡＮ１抗体を上記と同様のＥＬＩＳＡ法により測定し、インデックス値を算出した。
●ＳＦＯへの抗体反応陽性者：２５名
年齢：中央値９歳（２歳～６６歳）
性別：男性１０名、女性１５名
血清Ｎａ値（ｍＥｑ／ｌ）：１５６．４±１４．５ｍＥｑ／Ｌ
Ｎａ_ｘ抗体陽性数（％）：１０名（４０％）
●正常対照者：２５名（ＳＦＯへの抗体反応陰性者を含む）
年齢：中央値１０歳（２歳～３８歳）
性別：男性１０名、女性１５名
血清Ｎａ（ｍＥｑ／ｌ）：１４２．８±４．１ｍＥｑ／Ｌ
腫瘍合併例はなし。
Ｎａ_ｘ抗体陽性数（％）：０名（０％）

【0068】

ＳＦＯへの抗体反応陽性者の詳細を表４および５に示す。これらの患者は解析時にＲＯＨＨＡＤ症候群（ＲＯ）または本態性高ナトリウム血症（ＡＨ）と診断されていた。

【表4】

【0069】

【表5】

【0070】

表中の略語
Ｐｔ：患者
Ｍ：男性
Ｆ：女性
ｙ：歳
Ｎ／Ａ：数値なし
ＮＤ：解析施行なし
ＰＰ：中枢性思春期早発症
ＣＡＨ：中枢性副腎皮質機能低下症
ＣＨ：中枢性甲状腺機能低下症
ＨＨ：中枢性性腺機能低下症
ＬＨ：性線刺激ホルモン
ＡＤＨＤ：注意欠陥・多動性障害
ＳＡＳ：睡眠時無呼吸症候群
ＪＩＡ：若年生関節リウマチ
ＡＳＤ：自閉症スペクトラム障害
ＡＨ：本態性高ナトリウム血症
ＲＯ：ＲＯＨＨＡＤ症候群
＊Ｎａについて、括弧内は初診時の値を示す。
＊ｆＴ４について、＊＊は内服治療開始後の数値を示す。

【0071】

結果を図３に示す。ＳＦＯへの抗体反応陽性者では、２５例中８０％で抗ＺＳＣＡＮ１抗体陽性であった（抗ＺＳＣＡＮ１抗体陽性かつ抗Ｎａ_ｘ抗体陽性：２４％、抗ＺＳＣＡＮ１抗体陰性かつ抗Ｎａ_ｘ抗体陽性：１２％、抗ＺＳＣＡＮ１抗体陽性かつ抗Ｎａ_ｘ抗体陰性：６０％、抗ＺＳＣＡＮ１抗体陰性かつ抗Ｎａ_ｘ抗体陰性：４％）。正常対照群は、全例で抗ＺＳＣＡＮ１抗体陰性であった。

【0072】

患者血清とリコンビナントＺＳＣＡＮ１反応後のＥＬＩＳＡ抗体測定
表１の症例１の血清１０μＬに対してＺＳＣＡＮ１タンパク質を各（１）０μｇ、（２）１０μｇ、（３）５０μｇを添加し４℃で２４時間反応させた後に、１４０００回転で３分間遠心分離させた上清血清を採取した。血清中の抗ＺＳＣＡＮ１抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した。血清中抗体値は（１）８６±４、（２）５８±２、（３）４０．７±１．５であった。結果を図４に示す。抗ＺＳＣＡＮ１抗体値は用量依存的に低下した。

【0073】

考察
本実施例において、腫瘍合併の有無に関わらず、多数の自己免疫性本態性高ナトリウム血症およびＲＯＨＨＡＤ症候群患者の血清中に抗ＺＳＣＡＮ１抗体が同定され、これらの疾患と抗ＺＳＣＡＮ１抗体との関連が示唆された。従って、抗ＺＳＣＡＮ１抗体は診断バイオマーカーとして早期診断に有用である。

【産業上の利用可能性】

【0074】

本開示に従って、対象が自己免疫性脳弓下器官疾患に罹患しているか否かを判定することができ、医療分野で有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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