特開 2024-143539 サツマイモ種植物の品種の判別方法、品種特異的なＤＮＡマーカー、および判別用キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024143539

(43)【公開日】2024-10-11

(54)【発明の名称】サツマイモ種植物の品種の判別方法、品種特異的なＤＮＡマーカー、および判別用キット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6895 20180101AFI20241003BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALN20241003BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6895 Z ZNA

C12Q1/6844 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023056269

(22)【出願日】2023-03-30

(71)【出願人】

【識別番号】501203344

【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】田中 勝

(72)【発明者】

【氏名】小林 晃

(72)【発明者】

【氏名】川田 ゆかり

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA18

4B063QQ04

4B063QQ09

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR62

4B063QS24

(57)【要約】      （修正有）

【課題】新たなサツマイモ種植物の品種判別方法を実現する。
【解決手段】判別方法は下記ＤＮＡマーカー、すなわち（ａ）特定の配列からなる塩基配列における、１３３番目から１６６番目の塩基の、ＴＡで示される塩基配列への置換、および（ｂ）特定の配列からなる塩基配列における、１３２番目の塩基から１３７番目の塩基の、特定の配列からなる塩基配列への置換、の少なくとも一方を検出することを含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

サツマイモ種植物の品種の判別方法であって、
下記（ａ）で示される第１のＤＮＡマーカー、および下記（ｂ）で示される第２のＤＮＡマーカーの少なくとも一方のＤＮＡマーカーを検出することを含む、判別方法：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列における、１３３番目から１６６番目の塩基配列の、ＴＡへの置換、
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列における、１３２番目から１３７番目の塩基配列の、ＴＴＧＴＧＡＣＴＴＧＴＧＡ（配列番号３）への置換。

【請求項2】

前記第１のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号４に示される塩基配列の中の連続する２０以上の塩基からなり、１３２番目から１３７番目の塩基配列またはその相補配列を含むプライマーを用いて、核酸断片を増幅することを含む、請求項１に記載の判別方法。

【請求項3】

前記第１のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号４に示される塩基配列の中の連続する２０以上の塩基からなる塩基配列またはその相補配列を含むプライマーであって、１３２番目から１３７番目の塩基配列および１３８番目以降の塩基配列部分の１塩基以上１２塩基未満、または１３２番目から１３７番目の塩基配列および１３１番目以前の塩基配列部分の１塩基以上１２塩基未満の相補配列、を３’末端に含むプライマーを用いて、核酸断片を増幅することを含む、請求項１に記載の判別方法。

【請求項4】

前記第２のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号５に示される塩基配列の中の連続する２０以上の塩基からなり、１３２番目から１４４番目の塩基配列を８塩基以上含む塩基配列またはその相補配列を含むプライマーを用いて、核酸断片を増幅することを含む、請求項１に記載の判別方法。

【請求項5】

前記第２のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号５に示される塩基配列の中の連続する２０以上の塩基からなる塩基配列またはその相補配列を含むプライマーであって、１３２番目から１４４番目の塩基配列の８塩基以上またはその相補配列を３’末端に含むプライマーを用いて、核酸断片を増幅することを含む、請求項１に記載の判別方法。

【請求項6】

前記第１のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号６に示される塩基配列からなるプライマー、および配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーの組を用いて、核酸断片を増幅することを含む、請求項１に記載の判別方法。

【請求項7】

前記第２のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマー、および配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーの組を用いて、核酸断片を増幅することを含む、請求項１に記載の判別方法。

【請求項8】

品種べにはるかに由来するＤＮＡマーカーを検出することをさらに含む、請求項１に記載の判別方法。

【請求項9】

加工食品から、該加工食品に含まれる原料植物のＤＮＡを抽出することを含み、
抽出したＤＮＡを用いて前記ＤＮＡマーカーを検出することを含む、請求項１～６の何れか１項に記載の判別方法。

【請求項10】

サツマイモ種植物における、品種特異的なＤＮＡマーカーであって、
下記（ａ）または（ｂ）を含む連続したポリヌクレオチド；
（ａ）配列番号１に示される塩基配列における、１３３番目から１６６番目の塩基配列の、ＴＡへの置換；
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列における、１３２番目から１３７番目の塩基配列の、ＴＴＧＴＧＡＣＴＴＧＴＧＡ（配列番号３）への置換；
である、ＤＮＡマーカー。

【請求項11】

下記（ａ）で示される第１のＤＮＡマーカー、または下記（ｂ）で示される第２のＤＮＡマーカーを検出するプライマーの組；
（ａ）配列番号１に示される塩基配列における、１３３番目から１６６番目の塩基配列の、ＴＡへの置換；
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列における、１３２番目から１３７番目の塩基配列の、ＴＴＧＴＧＡＣＴＴＧＴＧＡ（配列番号３）への置換；
を含む、サツマイモ種植物の品種の判別に用いられる判別用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はサツマイモ種植物の品種の判別方法、品種特異的なＤＮＡマーカー、および判別用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

植物種の優良品種が無断で国外に流出し、またその生産物および加工品が違法に国内に逆輸入される例が近年頻発している。特にサツマイモ種植物は栄養繁殖植物であり、その生産物である塊根を基に苗を作製して増殖させることが容易であるため、品種の海外流出が起こりやすい。用途が同じサツマイモ品種は塊根の外観が類似しているため、目視による品種の識別は困難である。また輸入される場合は加工品として輸入されることが多く、当該加工品の外観から特定品種の使用の有無は容易に判断できない。これらのことから、遺伝情報に基づいた品種の識別に関する技術の開発が進められている。

【0003】

植物品種の識別方法の例として、例えば非特許文献１には、増幅断片制限断片長多型（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence；ＣＡＰＳ）を利用したＤＮＡ多型分析が報告されている。また非特許文献２には、べにはるかとサツマイモの主要品種との判別に利用可能なＤＮＡマーカーとして、レトロトランスポゾンＲｔｓｐ－１の挿入多型由来のマーカーが３種報告されている。また特許文献１では、サツマイモ加工食品からレトロトランスポゾンＲｔｓｐ－１由来のＤＮＡマーカーを検出することを含む、サツマイモ加工食品に使用されている品種の判別方法が報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００６－０４２８０８号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】「サツマイモの品種識別に利用可能なＤＮＡマーカー」、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 九州沖縄農業研究センター ２００６年研究成果情報［online］、インターネット＜URL：https://www.naro.go.jp/project/results/laboratory/karc/2006/konarc06-17.html＞

【非特許文献2】田中 勝、他５名、「日作九支報」、２０１５年、８１巻、p.４３－４５，２０１５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

近年、既存の優良品種を親とする後代品種が開発されており、その判別に利用可能な技術が求められている。その例として、例えば非特許文献１に記載のＣＡＰＳを応用する方法が挙げられるが、この方法においては多数のマーカーを組み合わせて利用する必要が考えられること、および品種によってＣＡＰＳマーカーのシグナルが不明瞭になる可能性があること等の問題がある。また、開発された後代品種が品種べにはるかを親とする場合、例えば非特許文献２に記載の、べにはるかの判別に利用されるレトロトランスポゾン由来のマーカーは利用できない等の問題がある。

【0007】

本発明は、上記課題に鑑み、新たなサツマイモ種植物の品種判別方法を実現することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記の課題を解決するために、本発明の第一の態様に係る判別方法は、サツマイモ種植物の品種の判別方法であって、下記（ａ）で示される第１のＤＮＡマーカー、および下記（ｂ）で示される第２のＤＮＡマーカーの少なくとも一方のＤＮＡマーカーを検出することを含む、判別方法である：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列における、１３３番目から１６６番目の塩基配列の、ＴＡへの置換、
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列における、１３２番目から１３７番目の塩基配列の、ＴＴＧＴＧＡＣＴＴＧＴＧＡ（配列番号３）への置換。

【0009】

上記第一の態様に係る判別方法では、前記第１のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号４に示される塩基配列の中の連続する２０以上の塩基からなり、１３２番目から１３７番目の塩基配列またはその相補配列を含むプライマーを用いて、核酸断片を増幅することを含むことが好ましい。

【0010】

上記第一の態様に係る判別方法では、前記第１のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号４に示される塩基配列の中の連続する２０以上の塩基からなる塩基配列またはその相補配列を含むプライマーであって、１３２番目から１３７番目の塩基配列および１３８番目以降の塩基配列部分の１塩基以上１２塩基未満、または１３２番目から１３７番目の塩基配列および１３１番目以前の塩基配列部分の１塩基以上１２塩基未満の相補配列、を３’末端に含むプライマーを用いて、核酸断片を増幅することを含むことが好ましい。

【0011】

上記第一の態様に係る判別方法では、前記第２のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号５に示される塩基配列の中の連続する２０以上の塩基からなり、１３２番目から１４４番目の塩基配列を８塩基以上含む塩基配列またはその相補配列を含むプライマーを用いて、核酸断片を増幅することを含むことが好ましい。

【0012】

上記第一の態様に係る判別方法では、前記第２のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号５に示される塩基配列の中の連続する２０以上の塩基からなる塩基配列またはその相補配列を含むプライマーであって、１３２番目から１４４番目の塩基配列の８塩基以上またはその相補配列を３’末端に含むプライマーを用いて、核酸断片を増幅することを含むことが好ましい。

【0013】

上記第一の態様に係る判別方法では、前記第１のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号６に示される塩基配列からなるプライマー、および配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーの組を用いて、核酸断片を増幅することを含むことが好ましい。

【0014】

上記第一の態様に係る判別方法では、前記第２のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマー、および配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーの組を用いて、核酸断片を増幅することを含むことが好ましい。

【0015】

上記第一の態様に係る判別方法では、品種べにはるかに由来するＤＮＡマーカーを検出することをさらに含むことが好ましい。

【0016】

上記第一の態様に係る判別方法では、加工食品から、該加工食品に含まれる原料植物のＤＮＡを抽出することを含み、抽出したＤＮＡを用いて前記ＤＮＡマーカーを検出することを含むことが好ましい。

【0017】

上記の課題を解決するために、本発明の第二の態様に係るＤＮＡマーカーは、サツマイモ種植物における、品種特異的なＤＮＡマーカーであって、下記（ａ）または（ｂ）を含む連続したポリヌクレオチドである；
（ａ）配列番号１に示される塩基配列における、１３３番目から１６６番目の塩基配列の、ＴＡへの置換；
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列における、１３２番目から１３７番目の塩基配列の、ＴＴＧＴＧＡＣＴＴＧＴＧＡ（配列番号３）への置換。

【0018】

上記の課題を解決するために、本発明の第三の態様に係る判別用キットは、下記（ａ）で示される第１のＤＮＡマーカー、または下記（ｂ）で示される第２のＤＮＡマーカーを検出するプライマーの組を含む、サツマイモ種植物の品種の判別に用いられる判別用キットである；
（ａ）配列番号１に示される塩基配列における、１３３番目から１６６番目の塩基配列の、ＴＡへの置換；
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列における、１３２番目から１３７番目の塩基配列の、ＴＴＧＴＧＡＣＴＴＧＴＧＡ（配列番号３）への置換。

【発明の効果】

【0019】

本発明の一態様によれば、新たなサツマイモ種植物の品種判別方法を実現できる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】本発明の実施例に係る、第１のＤＮＡマーカーを検出した図である。

【図2】本発明の実施例に係る、第２のＤＮＡマーカーを検出した図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

【0022】

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書において使用される場合、塩基の表記は、適宜ＩＵＰＡＣ及びＩＵＢの定める１文字表記を使用する。

【0023】

本発明の一態様において、サツマイモ種植物とは、サツマイモ（Ipomoea batatas）を指す。

【0024】

本発明の一態様に係るＤＮＡマーカーの検出方法としては、当該マーカーのＤＮＡ配列をＰＣＲ等の核酸増幅技術によって増幅後に、（ｉ）市販のシーケンサー等を利用して、ＤＮＡ塩基配列を直接解読する方法、または（ｉｉ）挿入または欠失を含む産物と含まない産物を、電気泳動の移動度の差から識別する方法、等が好ましい方法として挙げられるが、これに限定されない。

【0025】

本実施形態に係るサツマイモ品種の判別方法の一態様として、植物体としてのサツマイモまたは加工食品に含まれる原料植物としてのサツマイモの品種を判別する方法であり得る。本実施形態における判別方法では、品種特異的なＤＮＡマーカーの検出を行うことにより、当該サツマイモ品種であるか否かを精度よく判別する。

【0026】

（ＤＮＡマーカー）
本実施形態におけるサツマイモ品種の判別方法では、第１のＤＮＡマーカーおよび第２のＤＮＡマーカーの少なくとも一方を検出することを含む。

【0027】

ここで、第１のＤＮＡマーカーおよび第２のＤＮＡマーカーは、本発明者らが作出した「九系０９１７８－１」と名付けた系統、およびその育種後代系統にのみ検出されるＤＮＡマーカーである。なお、「九系０９１７８－１」は市場に流通していない非公開の系統である。より具体的には、第１のＤＮＡマーカーおよび第２のＤＮＡマーカーは、「九系０９１７８－１」系統の作出に使用した２つの親系統のいずれにも検出されないＤＮＡマーカーであり、「九系０９１７８－１」作出時に、「九系０９１７８－１」のゲノムの塩基配列に新たに生じたと推定される変異に基づくＤＮＡマーカーである。

【0028】

本実施形態において、第１のＤＮＡマーカーおよび第２のＤＮＡマーカーは、具体的にはそれぞれ以下の（ａ）および（ｂ）を含む連続したポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列における、１３３番目から１６６番目の塩基配列の、ＴＡへの置換、
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列における、１３２番目から１３７番目の塩基配列の、ＴＴＧＴＧＡＣＴＴＧＴＧＡ（配列番号３）への置換。

【0029】

ここで、配列番号１および２に示される塩基配列は、いずれもサツマイモのゲノム上に存在する配列である。なお、（ａ）で示す置換は、配列番号１に示される塩基配列の、（ａ－１）１３３番目から１６４番目の間の塩基配列の欠失、（ａ－２）１３４番目から１６５番目の間の塩基配列の欠失、または（ａ－３）１３５番目から１６６番目の間の塩基配列の欠失、とも表現され得る。同様に、（ｂ）で示す置換は、配列番号２に示される塩基配列における、１３１番目と１３２番目の塩基の間への、ＴＴＧＴＧＡＣで示される塩基配列の挿入、とも表現され得る。

【0030】

本発明者らは、先述した系統「九系０９１７８－１」、および「九系０９１７８－１」と品種べにはるかとをかけ合わせて作出した育種後代系統である「九州２０１号」と名付けた系統について全ゲノム情報を取得するとともに、品種べにはるか、および「九系０９１７８－１」の２つの親系統の全ゲノム情報を取得した。そして、これら合計５つの品種および系統の全ゲノム配列を比較することで、「九系０９１７８－１」で新たに生じ、「九州２０１号」に遺伝したと考えられる挿入欠失変異候補を抽出した。次いで、他のサツマイモ種植物の主要な流通品種を含む品種および系統も含めて、ＰＣＲによりその特異性を確認した。その結果、調査したサツマイモ種植物の主要な流通品種を含む品種および系統の中で、「九系０９１７８－１」およびその育種後代系統である「九州２０１号」にのみ、上記（ａ）および（ｂ）の変異が検出されることが確認された。また、ゲノム中の同一箇所に独立に同じ変異が生じることは極めて考えにくいため、同結果から、上記（ａ）および（ｂ）の変異は、他の品種および系統には存在しない変異であるとの結論を導くにいたった。すなわち（ａ）および（ｂ）を指標としたＤＮＡマーカーは、市場に流通する主要なサツマイモ品種には存在しない変異に基づくものであり、品種特異的なＤＮＡマーカーである。発明者らのこれまでの研究の結果、「九州２０１号」は、サツマイモ基腐病に抵抗性を有する有望系統であり、今後品種として流通することが見込まれる。また、「九系０９１７８－１」の別の育種後代系統が品種として流通する可能性も考えられる。当該ＤＮＡマーカーのいずれかの検出は、「九州２０１号」を含む「九系０９１７８－１」の育種後代系統の判別の根拠として非常に有用であり、また「九系０９１７８－１」の別の育種後代系統が品種として流通していない場合においては、当該ＤＮＡマーカーのいずれかの検出のみによって、「九州２０１号」を判別することができる。

【0031】

〔ＤＮＡマーカーの検出〕
ＤＮＡマーカーを検出する方法としては特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いればよい。中でも、核酸増幅反応を用いることが好ましい。

【0032】

核酸増幅反応を用いる方法の例として、当該ＤＮＡマーカーを含む配列を増幅しシーケンス反応を用いて配列を直接解読する方法、当該ＤＮＡマーカーを含む配列を増幅し、増幅産物が挿入または欠失を含むか否かを、電気泳動の移動度の差から識別する方法などがある。より好適な方法として、目的とする欠失変異を含む塩基配列に基づいて設計されるプライマー、または目的とする挿入変異を部分的に含む塩基配列に基づいて設計されるプライマーを含むプライマーセットを用いて、検査対象から調製したＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行い、増幅産物の有無を確認する方法を挙げることができる。

【0033】

また、増幅産物の有無を確認する方法としては、電気泳動による確認、クロマトＰＡＳ法による確認、およびリアルタイムＰＣＲ等が挙げられる。

【0034】

核酸増幅反応は、公知の核酸増幅手段を適宜選択して用いればよく、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、プライマーエクステンション法等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

【0035】

ＤＮＡマーカーを検出する方法は、増幅反応の手段に依らず、第１のＤＮＡマーカーおよび第２のＤＮＡマーカーのいずれか少なくとも１つの検出を行えばよく、あるいは判別の精度をより高めるため、第１のＤＮＡマーカーおよび第２のＤＮＡマーカー両方の検出を行ってもよい。「九系０９１７８－１」の育種後代で、品種として流通している系統が「九州２０１号」のみであれば、第１のＤＮＡマーカーおよび第２のＤＮＡマーカーのいずれか少なくとも１つの検出をおこなうことにより、「九州２０１号」であると判定することができる。

【0036】

また、ＤＮＡマーカーを検出する方法は、さらに、品種べにはるかに由来するＤＮＡマーカーを検出することをさらに含んでもよい。この場合においては、例えばＰＣＲによる増幅を行う場合、いわゆるマルチプレックスＰＣＲにより、複数の断片の増幅を同一反応で行い、複数のＤＮＡマーカーを一つの反応で検出するものであってもよい。すなわち、１つのＰＣＲ反応液中に、第１のＤＮＡマーカーの検出を行うためのプライマーセットまたは第２のＤＮＡマーカーの検出を行うためのプライマーセットと、品種べにはるかに由来するＤＮＡマーカーの検出を行うためのプライマーセットと、の両方を含ませ、ＰＣＲを行ってもよい。

【0037】

第１のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号４に示される塩基配列の中の連続する２０以上の塩基からなり、１３２番目から１３７番目の塩基配列またはその相補配列を含むプライマーを用いて、核酸断片を増幅することを含むことが好ましい。

【0038】

ここで配列番号４に示される塩基配列は、配列番号１に示される塩基配列において、１３３番目から１６６番目の塩基配列がＴＡに置換した塩基配列である。したがって、１３２番目から１３７番目の塩基配列は、「九州２０１号」の有する欠失変異に係る領域である。

【0039】

プライマーの長さは目的の核酸断片を増幅可能であれば上限は特に制限されないが、プライマーダイマーの形成を抑える観点から、例えば、５０塩基以下、４５塩基以下、４０塩基以下、３５塩基以下または３０塩基以下が好ましい。また、精度よくアニーリングさせるために、２０塩基以上、２１塩基以上、２２塩基以上、２３塩基以上または２４塩基以上が好ましい。

【0040】

第１のＤＮＡマーカーの検出にあたり、より好適なプライマーとして、配列番号４に示される塩基配列の中の連続する２０以上の塩基からなる塩基配列またはその相補配列を含むプライマーであって、１３２番目から１３７番目の塩基配列および１３８番目以降の塩基配列部分の１塩基以上１２塩基未満、または１３２番目から１３７番目の塩基配列および１３１番目以前の塩基配列部分の１塩基以上１２塩基未満の相補配列を３’末端に含むプライマーが挙げられる。

【0041】

第１のＤＮＡマーカーの検出にあたり、さらに好適なプライマーとして、配列番号６に示される塩基配列からなるプライマー、および配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーの組が挙げられる。

【0042】

第２のＤＮＡマーカーの検出は、配列番号５に示される塩基配列の中の連続する２０以上の塩基からなり、１３２番目から１４４番目の塩基配列を８塩基以上含む塩基配列またはその相補配列を含むプライマーを用いて、核酸断片を増幅することを含む。

【0043】

ここで配列番号５に示される塩基配列は、配列番号２に示される塩基配列において、１１３２番目から１３７番目の塩基配列が、ＴＴＧＴＧＡＣＴＴＧＴＧＡ（配列番号３）に置換した塩基配列である。したがって、１３２番目から１４４番目の塩基配列は、「九州２０１号」の有する挿入変異に係る領域である。

【0044】

第２のＤＮＡマーカーの検出にあたり、より好適なプライマーとして、配列番号５に示される塩基配列の中の連続する２０以上の塩基からなる塩基配列またはその相補配列を含むプライマーであって、１３２番目から１４４番目の塩基配列の８塩基以上またはその相補配列を３’末端に含むプライマーが挙げられる。

【0045】

第２のＤＮＡマーカーの検出にあたり、さらに好適なプライマーとして、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマー、および配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーの組が挙げられる。

【0046】

（判別方法）
本実施形態に係る判別方法は、植物体からＤＮＡを抽出して実施することにより、植物体の品種を判別する方法、または加工食品など、原料としてサツマイモが使用されている加工品からＤＮＡを抽出し、当該加工品に使用されているサツマイモの品種を判別する方法であり得る。

【0047】

加工食品の対象としては、原料植物にサツマイモが含まれるものであって、当該加工食品から原料植物のＤＮＡを抽出可能なものであれば特に限定されるものではない。また、加工食品に含まれる原料植物は、植物体の一部であり得、例えば、塊根、根、葉、茎、花および種子等が挙げられる。また、加工食品とは、原料植物に対して、加熱、乾燥、冷凍等の加工処理を施して製造されたものである。本明細書においては、最終製品のみではなく、中間加工品も含む意味で使用される。また、加工食品は、単一の品種の原料植物を含む加工食品に限定されるものではなく、複数の品種の原料植物を含む加工食品であってもよい。

【0048】

植物体からのＤＮＡの抽出および加工食品からのＤＮＡの抽出は、従来知られた方法により行えばよい。

【0049】

（判別用キット）
本発明の一実施形態に係る判別用キットは、サツマイモ種植物の品種の判別に用いられる判別用キットであり、下記（ａ）で示される第１のＤＮＡマーカー、または下記（ｂ）で示される第２のＤＮＡマーカーを検出するプライマーの組を含んでいる：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列における、１３３番目から１６６番目の塩基配列の、ＴＡへの置換；
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列における、１３２番目から１３７番目の塩基配列の、ＴＴＧＴＧＡＣＴＴＧＴＧＡ（配列番号３）への置換。

【0050】

判別用キットに含まれるプライマーの好適な例は、上述のプライマーの説明に示した例と同じである。

【0051】

各プライマーは常法の核酸合成法に従って合成することができる。

【0052】

各判別用キットは、必要に応じて、ＰＣＲに用いる各種試薬、例えば、ポリメラーゼ、ＰＣＲバッファーおよび各ｄＮＴＰ等；ＰＣＲに供するＤＮＡを含有する試料を調製するための各種試薬、例えば、バッファー等；ＰＣＲ増幅断片を解析するための各種試薬、例えば、電気泳動ゲル材料等；ならびに判別用キットの使用説明書等の少なくとも１つを備えていてもよい。

【0053】

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

【実施例0054】

＜１．植物材料＞
ＤＮＡマーカーの開発および検出に用いた品種および系統を表１に示す。ＤＮＡ抽出用の葉は育苗用のビニールハウスまたは温室内で育成した植物から採取した。また、塊根は農業・食品産業技術総合研究機構九州沖縄農業研究センターの試験圃場で栽培した植物から得られた塊根を用いた。

【表1】

【0055】

＜２．ＤＮＡマーカーの検出＞
サツマイモの未展開葉から、ＱＩＡＧＥＮ社のＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔまたはニッポンジーン社のＩＳＯＳＰＩＮ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。または塊根の内部組織からＩＳＯＳＰＩＮ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出操作はキットに付属のマニュアルに従って行った。ＤＮＡ濃度の測定はＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＱｕｂｉｔ２．０フルオロメーターを用いて行うか、または分光光度計を用いて２６０ｎｍの吸光度を測定することによって行った。

【0056】

表２に示す組成の反応液を調製し、９４℃２分間の変性、９４℃１５秒間－６０℃３０秒間－７２℃３０秒間を３０サイクル、７２℃５分間の最終伸長反応のサイクリング条件でＰＣＲを行った。反応後は４℃に冷却した。置換部位に特異的なプライマーは、表３に示すプライマーにおいて当該部位に対応する組合せを使用した。すなわち、Ｃｈｒ２＿６０８０５７９＿Ｆ（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）とＣｈｒ２＿６０８０５７９＿Ｒ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）とのプライマーセットを用いたＰＣＲ、およびＣｈｒ３＿２８７２３４７６＿Ｆ（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）とＣｈｒ３＿２８７２３４７６＿Ｒ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）とのプライマーセットを用いたＰＣＲ、のいずれかまたは両方を実施した。

【表2】

【表3】

【0057】

ＰＣＲ産物の検出は、マイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）またはアガロースゲルを用いた電気泳動により行った。

【0058】

結果を図１および図２に示す。図１は、第１のマーカーに関する欠失変異を検出する特異的プライマー（表３中のＣｈｒ２＿６０８０５７９＿Ｆ、およびＣｈｒ２＿６０８０５７９＿Ｒの組）を用いて、マイクロチップ電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した結果を示している。一方、図２は、第２のマーカーに関する挿入変異を検出する特異的プライマー（表３中のＣｈｒ３＿２８７２３４７６＿Ｆ、およびＣｈｒ３＿２８７２３４７６＿Ｒ）を用いて、マイクロチップ電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した結果を示している。図中、星印で示すバンドが、増幅されたマーカー断片である。

【0059】

なお、図示しないが、ＤＮＡの品質確認のためのコントロールとして、上記の挿入変異または欠失変異に特異的プライマーに代えて、ＩＩ型デンプン合成酵素（ＳＳ２）遺伝子を増幅させるためのプライマー（表３中のＳＳ２＿ＦおよびＳＳ２＿Ｒ）を用いたＰＣＲも実施し、マイクロチップ電気泳動によりＰＣＲ産物を問題なく検出できることを確認した。

【産業上の利用可能性】

【0060】

本発明は、品種育成権保護のために利用できる。すなわち、当該品種の輸出入時の水際における、マーカーを用いた迅速な品種判別への利用が期待される。

【図1】

【図2】

【配列表】

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