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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024146430
(43)【公開日】2024-10-15
(54)【発明の名称】細胞外小胞分離用粉体
(51)【国際特許分類】
C12M 1/26 20060101AFI20241004BHJP
B01J 20/08 20060101ALI20241004BHJP
B01J 20/28 20060101ALI20241004BHJP
【ＦＩ】
C12M1/26
B01J20/08 B
B01J20/08 A
B01J20/28 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023059321
(22)【出願日】2023-03-31
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000002093
【氏名又は名称】住友化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】原 瑶佑
(72)【発明者】
【氏名】外崎 究
(72)【発明者】
【氏名】齊藤 浩史
【テーマコード（参考）】
4B029
4G066
【Ｆターム（参考）】
4B029AA09
4B029BB11
4B029CC01
4B029DG08
4B029HA05
4G066AA20B
4G066BA09
4G066BA20
4G066BA26
4G066BA36
4G066CA20
4G066CA54
4G066CA56
4G066DA07
4G066FA37
(57)【要約】
【課題】細胞外小胞であるエクソソームを含む液体から、エクソソームを選択的かつ効率的に分離回収できる細胞外小胞分離用粉体の提供。
【解決手段】複数の無機粒子を含む細胞外小胞分離用粉体であって、
上記無機粒子は、一次粒子の凝集体である二次粒子であり、上記一次粒子の平均粒径が１０ｎｍ以上７００ｎｍ以下の範囲である細胞外小胞分離用粉体。
【選択図】なし
【解決手段】複数の無機粒子を含む細胞外小胞分離用粉体であって、
上記無機粒子は、一次粒子の凝集体である二次粒子であり、上記一次粒子の平均粒径が１０ｎｍ以上７００ｎｍ以下の範囲である細胞外小胞分離用粉体。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の無機粒子を含む細胞外小胞分離用粉体であって、
前記無機粒子は、一次粒子の凝集体である二次粒子であり、前記一次粒子の平均粒径が１０ｎｍ以上７００ｎｍ以下の範囲である、細胞外小胞分離用粉体。
前記無機粒子は、一次粒子の凝集体である二次粒子であり、前記一次粒子の平均粒径が１０ｎｍ以上７００ｎｍ以下の範囲である、細胞外小胞分離用粉体。
【請求項2】
前記二次粒子の平均粒径が０．５μｍ以上３０μｍ以下の範囲である、請求項１に記載の細胞外小胞分離用粉体。
【請求項3】
前記二次粒子のＢＥＴ比表面積が１ｍ２／ｇ以上３００ｍ２／ｇ以下の範囲である、請求項１又は請求項２に記載の細胞外小胞分離用粉体。
【請求項4】
前記無機粒子は、酸化アルミニウム、酸化水酸化アルミニウム及び水酸化アルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種のアルミニウム化合物を含み、かつ、前記アルミニウム化合物の合計割合が前記無機粒子の全質量に対して５０質量％以上である、請求項１又は請求項２に記載の細胞外小胞分離用粉体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、細胞外小胞分離用粉体に関する。
【背景技術】
【0002】
エクソソームと呼ばれる細胞外小胞は、タンパク質、脂質、核酸等の生理活性分子の細胞間輸送及び生物学的障壁を越えた輸送を行うなど、細胞間コミュニケーション及びシグナル伝達を効率的に行う機能を有することで知られている。
エクソソームは、劣化し難く、また、希釈せずに長距離シグナル伝達が可能であることから、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）及び治療薬として有望視されている。エクソソームを上記のような医療用途に用いるためには、目的外のエクソソーム及び不純物の混入を低減できるような分離方法が必要となる。細胞外小胞の分離回収方法については、これまで種々の報告がなされている。
エクソソームは、劣化し難く、また、希釈せずに長距離シグナル伝達が可能であることから、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）及び治療薬として有望視されている。エクソソームを上記のような医療用途に用いるためには、目的外のエクソソーム及び不純物の混入を低減できるような分離方法が必要となる。細胞外小胞の分離回収方法については、これまで種々の報告がなされている。
【0003】
例えば、特許文献１には、平均粒子径１０ｎｍ～７００ｎｍの細胞外小胞を含む分散液を、多孔質体からなる孔空き基板に接触させることで、上記分散液から上記細胞外小胞を上記孔空き基板に捕捉して分離した後、上記捕捉された細胞外小胞を上記孔空き基板から回収することを特徴とする細胞外小胞の回収方法が開示されている。
また、特許文献２には、液体サンプルから生体粒子を単離する方法であって、下記工程を含むことを特徴とする生体粒子の単離方法が開示されている。ａ）被験者又は細胞培養物から液体サンプルを取得する；ｂ）結晶形成及び／又は沈殿を可能にするのに適した条件下で、上記液体サンプルを結晶／沈殿誘発剤と接触させ、それにより混合物を作成する；ｃ）結晶形成及び／又は沈殿を可能にするのに十分な時間、上記混合物をインキュベートすること；並びに；ｄ）上記混合物を分離して、生体粒子を含む粒子画分を得て、それにより上記液体試料から生体粒子を単離する。
また、特許文献２には、液体サンプルから生体粒子を単離する方法であって、下記工程を含むことを特徴とする生体粒子の単離方法が開示されている。ａ）被験者又は細胞培養物から液体サンプルを取得する；ｂ）結晶形成及び／又は沈殿を可能にするのに適した条件下で、上記液体サンプルを結晶／沈殿誘発剤と接触させ、それにより混合物を作成する；ｃ）結晶形成及び／又は沈殿を可能にするのに十分な時間、上記混合物をインキュベートすること；並びに；ｄ）上記混合物を分離して、生体粒子を含む粒子画分を得て、それにより上記液体試料から生体粒子を単離する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】国際公開第２０１７／１５４９５１号
【特許文献2】米国特許出願公開第２０１７／０２５２６７０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
エクソソームを医療用途に用いるためには、エクソソームをより選択的に分離回収できる方法を確立する必要がある。また、市販製剤では、多数の患者に投与されることが想定されることから、商用製剤に適用できるようなスケールでエクソソームを効率的に分離回収できる方法が求められる。
これらの点に関し、特許文献１に記載の回収方法では、孔空き基板を用いており、分離デバイスのスケールが制限されるため、商用製剤への適用を考えた場合に、効率的な方法とは言い難い。また、特許文献１及び特許文献２に記載の方法は、いずれもエクソソームの選択的かつ効率的な分離回収という点について、未だ課題が残されている。
これらの点に関し、特許文献１に記載の回収方法では、孔空き基板を用いており、分離デバイスのスケールが制限されるため、商用製剤への適用を考えた場合に、効率的な方法とは言い難い。また、特許文献１及び特許文献２に記載の方法は、いずれもエクソソームの選択的かつ効率的な分離回収という点について、未だ課題が残されている。
【0006】
本開示は、上記事情に鑑みてなされたものである。
本開示の一実施形態が解決しようとする課題は、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体から、エクソソームを選択的かつ効率的に分離回収できる細胞外小胞分離用粉体を提供することにある。
本開示の一実施形態が解決しようとする課題は、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体から、エクソソームを選択的かつ効率的に分離回収できる細胞外小胞分離用粉体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
［１］ 複数の無機粒子を含む細胞外小胞分離用粉体であって、
上記無機粒子は、一次粒子の凝集体である二次粒子であり、上記一次粒子の平均粒径が１０ｎｍ以上７００ｎｍ以下の範囲である、細胞外小胞分離用粉体。
［２］ 上記二次粒子の平均粒径が０．５μｍ以上３０μｍ以下の範囲である、［１］に記載の細胞外小胞分離用粉体。
［３］ 上記二次粒子のＢＥＴ比表面積が１ｍ２／ｇ以上３００ｍ２／ｇ以下の範囲である、［１］又は［２］に記載の細胞外小胞分離用粉体。
［４］ 上記無機粒子は、酸化アルミニウム、酸化水酸化アルミニウム及び水酸化アルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種のアルミニウム化合物を含み、上記アルミニウム化合物の合計割合が上記無機粒子の全質量に対して５０質量％以上である、［１］～［３］のいずれか１つに記載の細胞外小胞分離用粉体。
［１］ 複数の無機粒子を含む細胞外小胞分離用粉体であって、
上記無機粒子は、一次粒子の凝集体である二次粒子であり、上記一次粒子の平均粒径が１０ｎｍ以上７００ｎｍ以下の範囲である、細胞外小胞分離用粉体。
［２］ 上記二次粒子の平均粒径が０．５μｍ以上３０μｍ以下の範囲である、［１］に記載の細胞外小胞分離用粉体。
［３］ 上記二次粒子のＢＥＴ比表面積が１ｍ２／ｇ以上３００ｍ２／ｇ以下の範囲である、［１］又は［２］に記載の細胞外小胞分離用粉体。
［４］ 上記無機粒子は、酸化アルミニウム、酸化水酸化アルミニウム及び水酸化アルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種のアルミニウム化合物を含み、上記アルミニウム化合物の合計割合が上記無機粒子の全質量に対して５０質量％以上である、［１］～［３］のいずれか１つに記載の細胞外小胞分離用粉体。
【発明の効果】
【0008】
本開示の一実施形態によれば、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体から、エクソソームを選択的かつ効率的に分離回収できる細胞外小胞分離用粉体が提供される。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体について、詳細に説明する。以下に記載する要件の説明は、本開示の代表的な実施態様に基づいてなされることがあるが、本開示はそのような実施態様に限定されるものではなく、本開示の目的の範囲内において、適宜、変更を加えて実施することができる。
【0010】
本開示において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
本開示に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
【0011】
本開示において、２つ以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。
【0012】
本開示において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても、その工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
【0013】
細胞外小胞は、細胞に由来する細胞外に存在する小胞であって、その大きさからエクソソーム、マイクロベシクル及びアポトーシス小体に分類される。エクソソーム及びマイクロベシクルには、タンパク質、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の核酸が含まれ、アポトーシス小体には、断片化された核及び細胞小器官が含まれている。エクソソームとマイクロベシクルとの違いは明確ではなく、本開示に記載のエクソソームは、マイクロベシクルを含んでいてもよい。
【0014】
［細胞外小胞分離用粉体］
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体は、複数の無機粒子を含む細胞外小胞分離用粉体であって、上記無機粒子は、一次粒子の凝集体である二次粒子であり、上記一次粒子の平均粒径が１０ｎｍ以上７００ｎｍ以下の範囲である。なお、以下では、細胞外小胞分離用粉体が含む上記の特定の構成を有する無機粒子を、単に「無機粒子」とも称する。
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体は、複数の無機粒子を含む細胞外小胞分離用粉体であって、上記無機粒子は、一次粒子の凝集体である二次粒子であり、上記一次粒子の平均粒径が１０ｎｍ以上７００ｎｍ以下の範囲である。なお、以下では、細胞外小胞分離用粉体が含む上記の特定の構成を有する無機粒子を、単に「無機粒子」とも称する。
【0015】
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体によれば、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体から、エクソソームを選択的かつ効率的に分離回収できる。本開示に係る細胞外小胞分離用粉体がこのような効果を奏し得る理由は明らかではないが、本発明者らは、以下のように推測している。但し、以下の推測は、本開示の細胞外小胞分離用粉体を限定的に解釈するものではなく、一例として説明するものである。
【0016】
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体は、特定の平均粒径を有する一次粒子が凝集した二次粒子である無機粒子が、細胞外小胞であるエクソソームの高い選択的吸着性及び選択的脱離性を有することを見出し、なされたものである。
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体は、複数の無機粒子を含み、無機粒子が一次粒子の凝集体である二次粒子であり、一次粒子の平均粒径が特定範囲である。すなわち、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体は、複数の無機粒子を含み、無機粒子が特定の平均粒径を有する一次粒子が凝集した二次粒子であるため、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体を接触させたときに、一次粒子の凝集により形成された二次粒子の内部にエクソソームが選択的かつ効率的に捕捉されると考えられる。また、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体は、無機粒子が特定の平均粒径を有する一次粒子が凝集した二次粒子であるため、捕捉されたエクソソームを無機粒子から効率的に脱離できると考えられる。
以上のことから、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体によれば、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体から、エクソソームの選択的かつ効率的な分離回収が可能となる。
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体は、複数の無機粒子を含み、無機粒子が一次粒子の凝集体である二次粒子であり、一次粒子の平均粒径が特定範囲である。すなわち、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体は、複数の無機粒子を含み、無機粒子が特定の平均粒径を有する一次粒子が凝集した二次粒子であるため、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体を接触させたときに、一次粒子の凝集により形成された二次粒子の内部にエクソソームが選択的かつ効率的に捕捉されると考えられる。また、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体は、無機粒子が特定の平均粒径を有する一次粒子が凝集した二次粒子であるため、捕捉されたエクソソームを無機粒子から効率的に脱離できると考えられる。
以上のことから、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体によれば、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体から、エクソソームの選択的かつ効率的な分離回収が可能となる。
【0017】
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体は、複数の無機粒子を含み、無機粒子は、一次粒子の凝集体である二次粒子の状態で存在している。すなわち、無機粒子は、一次粒子が凝集した二次粒子であり、一次粒子が互いに連結して形成されている。
一次粒子が互いに連結していることは、例えば、電子顕微鏡観察から測定される一次粒子径と、超音波処理を行った試料の粒度分布測定による粒子径との対比によって確認できる。すなわち、超音波処理を行った試料の粒度分布測定による粒子径が、電子顕微鏡観察から測定される一次粒子径よりも大きければ、一次粒子は、互いに連結している。
一次粒子が互いに連結していることは、例えば、電子顕微鏡観察から測定される一次粒子径と、超音波処理を行った試料の粒度分布測定による粒子径との対比によって確認できる。すなわち、超音波処理を行った試料の粒度分布測定による粒子径が、電子顕微鏡観察から測定される一次粒子径よりも大きければ、一次粒子は、互いに連結している。
【0018】
無機粒子の組成は、特に限定されない。
無機粒子は、水に難溶又は不溶であることが好ましい。
本開示において、「水に難溶」とは、２５℃の水に対する溶解度が０．０１質量％～１質量％であることを意味し、「水に不溶」とは、２５℃の水に対する溶解度が０．０１質量％未満であることを意味する。
無機粒子は、水に難溶又は不溶であることが好ましい。
本開示において、「水に難溶」とは、２５℃の水に対する溶解度が０．０１質量％～１質量％であることを意味し、「水に不溶」とは、２５℃の水に対する溶解度が０．０１質量％未満であることを意味する。
【0019】
無機粒子の組成としては、例えば、酸化物、水酸化物、酸化水酸化物、炭化物、窒化物、及び、金属が挙げられる。
【0020】
酸化物の具体例としては、二酸化ケイ素（シリカ）、酸化アルミニウム（アルミナ）、ゼオライト、酸化チタン（ＩＶ）（チタニア）、二酸化ジルコニウム（ジルコニア）等の金属酸化物が挙げられる。
水酸化物の具体例としては、水酸化アルミニウム等の金属水酸化物が挙げられる。
酸化水酸化物の具体例としては、酸化水酸化アルミニウム、酸化水酸化鉄（ＩＩＩ）等の金属酸化水酸化物が挙げられる。
炭化物の具体例としては、炭化ケイ素（シリコンカーバイド）、炭化ホウ素（ボロンカーバイド）、炭化タングステン（タングステンカーバイド）等の金属炭化物が挙げられる。
窒化物の具体例としては、窒化アルミニウム（アルミナイトライド）、窒化ケイ素（シリコンナイトライド）、窒化ホウ素（ボロンナイトライド）等の金属窒化物が挙げられる。
水酸化物の具体例としては、水酸化アルミニウム等の金属水酸化物が挙げられる。
酸化水酸化物の具体例としては、酸化水酸化アルミニウム、酸化水酸化鉄（ＩＩＩ）等の金属酸化水酸化物が挙げられる。
炭化物の具体例としては、炭化ケイ素（シリコンカーバイド）、炭化ホウ素（ボロンカーバイド）、炭化タングステン（タングステンカーバイド）等の金属炭化物が挙げられる。
窒化物の具体例としては、窒化アルミニウム（アルミナイトライド）、窒化ケイ素（シリコンナイトライド）、窒化ホウ素（ボロンナイトライド）等の金属窒化物が挙げられる。
【0021】
金属は、金属単体であってもよく、金属合金であってもよい。
金属の具体例としては、アルミニウム、チタン、ニッケル等が挙げられる。
金属の具体例としては、アルミニウム、チタン、ニッケル等が挙げられる。
【0022】
無機粒子は、アルミニウム化合物を含むことが好ましく、酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム及び酸化水酸化アルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種のアルミニウム化合物を含むことがより好ましく、酸化アルミニウムを含むことが更に好ましい。
【0023】
無機粒子は、タンパク質と強く相互作用しない化合物であることが好ましく、酸化アルミニウム、酸化水酸化アルミニウム及び水酸化アルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種のアルミニウム化合物を含み、上記アルミニウム化合物の合計割合が無機粒子の全質量に対して５０質量％以上であることがより好ましい。
無機粒子における上記アルミニウム化合物の合計割合は、無機粒子の全質量に対して、７０質量％以上であることがより好ましく、８０質量％以上であることが更に好ましく、９０質量％以上であることが特に好ましく、例えば、１００質量％であってもよい。
無機粒子における上記アルミニウム化合物の合計割合は、無機粒子の全質量に対して、７０質量％以上であることがより好ましく、８０質量％以上であることが更に好ましく、９０質量％以上であることが特に好ましく、例えば、１００質量％であってもよい。
【0024】
二次粒子を形成する一次粒子の形状は、特に限定されない。
一次粒子の形状としては、例えば、球形、楕円形、不定形等の形状が挙げられる。
一次粒子の形状としては、例えば、球形、楕円形、不定形等の形状が挙げられる。
【0025】
二次粒子を形成する一次粒子の平均粒径は、１０ｎｍ以上７００ｎｍ以下の範囲である。一次粒子の平均粒径が上記範囲内であると、エクソソームを分離する際には、一次粒子の連結により形成された二次粒子の内部にエクソソームを効率的に捕捉でき、エクソソームを回収する際には、一次粒子の連結により形成された二次粒子の内部からエクソソームを効率的に脱離させることができる傾向がある。
このような観点から、一次粒子の平均粒径は、１２ｎｍ以上であることが好ましく、１５ｎｍ以上であることがより好ましい。また、一次粒子の平均粒径は、６００ｎｍ以下であることが好ましく、５００ｎｍ以下であることがより好ましい。
一次粒子の平均粒径は、１０ｎｍ以上６００ｎｍ以下の範囲であってもよく、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲であってもよく、１２ｎｍ以上６００ｎｍ以下の範囲であってもよく、１５ｎｍ以上６００ｎｍ以下の範囲であってもよく、１５ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲であってもよい。
このような観点から、一次粒子の平均粒径は、１２ｎｍ以上であることが好ましく、１５ｎｍ以上であることがより好ましい。また、一次粒子の平均粒径は、６００ｎｍ以下であることが好ましく、５００ｎｍ以下であることがより好ましい。
一次粒子の平均粒径は、１０ｎｍ以上６００ｎｍ以下の範囲であってもよく、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲であってもよく、１２ｎｍ以上６００ｎｍ以下の範囲であってもよく、１５ｎｍ以上６００ｎｍ以下の範囲であってもよく、１５ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲であってもよい。
【0026】
一次粒子の平均粒径は、電子顕微鏡観察より得られる一次粒子の外観について、Ｉｍａｇｅ－Ｊを用いた画像解析を行うことにより求める。
画像解析方法については、電子顕微鏡観察によって得られる一次粒子の外観について、２５０個から５００個の一次粒子の輪郭をマーキングして、Ｉｍａｇｅ－Ｊを用いて粒径を検出する。得られる粒径分布から、平均粒径を求める。
電子顕微鏡としては、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いることができる。ＳＥＭとしては、例えば、日立ハイテクノロジーズ社製のＳ－４８００を用いることができる。ＴＥＭとしては、例えば、日本電子（株）社製ＪＥＭ－２１００Ｆを用いることができる。但し、電子顕微鏡は、これに限定されない。
画像解析方法については、電子顕微鏡観察によって得られる一次粒子の外観について、２５０個から５００個の一次粒子の輪郭をマーキングして、Ｉｍａｇｅ－Ｊを用いて粒径を検出する。得られる粒径分布から、平均粒径を求める。
電子顕微鏡としては、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いることができる。ＳＥＭとしては、例えば、日立ハイテクノロジーズ社製のＳ－４８００を用いることができる。ＴＥＭとしては、例えば、日本電子（株）社製ＪＥＭ－２１００Ｆを用いることができる。但し、電子顕微鏡は、これに限定されない。
【0027】
二次粒子の平均粒径は、特に限定されないが、例えば、試料液等の液体に含まれる細胞外小胞であるエクソソームを、一次粒子の連結により形成された二次粒子の内部に効率的に捕捉し、かつ、効率的に脱離させる観点からは、より小さいことが好ましい。
このような観点から、二次粒子の平均粒径は、０．５μｍ以上２００μｍ以下の範囲であることが好ましく、０．５μｍ以上１５０μｍ以下の範囲であることがより好ましく、０．５μｍ以上１００μｍ以下の範囲であることが更に好ましく、０．５μｍ以上５０μｍ以下の範囲であることが特に好ましく、０．５μｍ以上３０μｍ以下の範囲であることが最も好ましい。
このような観点から、二次粒子の平均粒径は、０．５μｍ以上２００μｍ以下の範囲であることが好ましく、０．５μｍ以上１５０μｍ以下の範囲であることがより好ましく、０．５μｍ以上１００μｍ以下の範囲であることが更に好ましく、０．５μｍ以上５０μｍ以下の範囲であることが特に好ましく、０．５μｍ以上３０μｍ以下の範囲であることが最も好ましい。
【0028】
本開示において、二次粒子の平均粒径は、体積平均二次粒径を意味する。
二次粒子の平均粒径は、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置により測定された体積基準の粒度分布において、小径側からの累積が５０％となるときの粒子径（Ｄ５０）として求める。
レーザー回折散乱式粒度分布測定装置としては、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製のＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００を好適に用いることができる。但し、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置は、これに限定されない。
二次粒子の平均粒径は、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置により測定された体積基準の粒度分布において、小径側からの累積が５０％となるときの粒子径（Ｄ５０）として求める。
レーザー回折散乱式粒度分布測定装置としては、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製のＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００を好適に用いることができる。但し、レーザー回折散乱式粒度分布測定装置は、これに限定されない。
【0029】
二次粒子の粒径は、例えば、粉砕機による粉砕プロセス等によって制御できる。例えば、破砕機による粉砕プロセスでより粉砕されない条件を選択すると、二次粒子の粒径は大きくなり、破砕機による粉砕プロセスでより粉砕される条件を選択すると、二次粒子の粒径は小さくなる。
【0030】
二次粒子のＢＥＴ比表面積は、特に限定されないが、例えば、試料液等の液体に含まれる細胞外小胞であるエクソソームを、一次粒子の連結により形成された二次粒子の内部に十分量吸着させる観点からは、二次粒子の力学強度を確保できる範囲で、より大きいことが好ましい。
このような観点から、二次粒子のＢＥＴ比表面積は、０．１ｍ２／ｇ以上５００ｍ２／ｇ以下の範囲であることが好ましく、１ｍ２／ｇ以上５００ｍ２／ｇ以下の範囲であることがより好ましく、１ｍ２／ｇ以上３００ｍ２／ｇ以下の範囲であることが更に好ましい。
このような観点から、二次粒子のＢＥＴ比表面積は、０．１ｍ２／ｇ以上５００ｍ２／ｇ以下の範囲であることが好ましく、１ｍ２／ｇ以上５００ｍ２／ｇ以下の範囲であることがより好ましく、１ｍ２／ｇ以上３００ｍ２／ｇ以下の範囲であることが更に好ましい。
【0031】
二次粒子のＢＥＴ比表面積は、ＪＩＳ Ｚ ８８３０：２０１３に規定された方法に従って、窒素ガスを用いたガス吸着法により求める。
比表面積測定装置としては、例えば、（株）マウンテック製の全自動比表面積測定装置であるＭａｃｓｏｒｂ（登録商標） ＨＭ－１２０１を好適に用いることができる。但し、比表面積測定装置は、これに限定されない。
比表面積測定装置としては、例えば、（株）マウンテック製の全自動比表面積測定装置であるＭａｃｓｏｒｂ（登録商標） ＨＭ－１２０１を好適に用いることができる。但し、比表面積測定装置は、これに限定されない。
【0032】
エクソソームは、細胞が放出する小胞であり、放出細胞（所謂、ドナー細胞）の性質を継承し、受け手細胞（所謂、レシピエント細胞）に適用することで、ドナー細胞由来の性質をレシピエント細胞に付与できることから、ドラックデリバリーシステム、治療薬等の素材として有用である。本開示に係る細胞外小胞分離用粉体によれば、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体から、エクソソームを選択的かつ効率的に分離回収できることから、純度及び量の確保が求められるドラックデリバリーシステム及び治療薬の素材としてのエクソソームの分離回収に好ましく使用できる。
【0033】
［細胞外小胞分離用粉体の製造方法］
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の製造方法は、特に限定されない。
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の製造方法としては、例えば、アルコキシドを出発原料としたゾル－ゲル法による酸化物、水酸化物、酸化水酸化物等の形成を経由する方法が挙げられる。また、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の製造方法としては、例えば、一次粒子同士を、バインダーを用いて固着させる方法も挙げられる。
以下、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の製造方法の好適な例の１つとして、アルミニウムアルコキシドを出発原料としたゾル－ゲル法による水酸化物アルミニウムの形成を経由する方法を説明する。
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の製造方法は、特に限定されない。
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の製造方法としては、例えば、アルコキシドを出発原料としたゾル－ゲル法による酸化物、水酸化物、酸化水酸化物等の形成を経由する方法が挙げられる。また、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の製造方法としては、例えば、一次粒子同士を、バインダーを用いて固着させる方法も挙げられる。
以下、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の製造方法の好適な例の１つとして、アルミニウムアルコキシドを出発原料としたゾル－ゲル法による水酸化物アルミニウムの形成を経由する方法を説明する。
【0034】
アルミニウムアルコキシドを出発原料としたゾル－ゲル法による水酸化物アルミニウムの形成を経由する本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の製造方法は、アルミニウムアルコキシドの一部を加水分解する工程Ａと、工程Ａにて得られた液からアルコールを分離回収した後、水を添加して、残りのアルミニウムアルコキシドを加水分解する工程Ｂと、水酸化アルミニウムを焼成し、アルミナ焼成体を生成する工程Ｃと、アルミナ焼成体を、粉砕機を用いて粉砕する工程Ｄとを含む。
工程Ａ、工程Ｂ、工程Ｃ、及び、工程Ｄの詳細については、特許第５７５９０６５号公報に記載がある。これらの記載は、参照により本明細書に取り込まれる。
工程Ａ、工程Ｂ、工程Ｃ、及び、工程Ｄの詳細については、特許第５７５９０６５号公報に記載がある。これらの記載は、参照により本明細書に取り込まれる。
【0035】
工程Ａは、アルミニウムアルコキシドの一部を加水分解する工程である。
工程Ａによれば、一部が加水分解されたアルミニウムアルコキシド溶液を得ることができる。
アルミニウムアルコキシドの一部を加水分解する方法としては、局所的な加水分解反応と、局所的な加水分解反応に伴う局所的な水酸化アルミニウムの生成と、を抑えることができる条件であれば、特に限定されない。
アルミニウムアルコキシドの一部を加水分解する方法としては、例えば、アルミニウムアルコキシドに、水を含むアルコール溶液を添加する方法が挙げられる。
工程Ａによれば、一部が加水分解されたアルミニウムアルコキシド溶液を得ることができる。
アルミニウムアルコキシドの一部を加水分解する方法としては、局所的な加水分解反応と、局所的な加水分解反応に伴う局所的な水酸化アルミニウムの生成と、を抑えることができる条件であれば、特に限定されない。
アルミニウムアルコキシドの一部を加水分解する方法としては、例えば、アルミニウムアルコキシドに、水を含むアルコール溶液を添加する方法が挙げられる。
【0036】
工程Ｂは、工程Ａにて得られた液からアルコールを分離回収した後、水を添加して、残りのアルミニウムアルコキシドを加水分解する工程である。
工程Ｂによれば、水酸化アルミニウムを得ることができる。
工程Ｂによれば、水酸化アルミニウムを得ることができる。
【0037】
工程Ｃは、水酸化アルミニウムを焼成し、アルミナ焼成体を生成する工程である。
水酸化アルミニウムの焼成では、水酸化アルミニウムをアルミナに相転移させるために必要な熱エネルギーを加える。
工程Ｃにおいて、水酸化アルミニウムに対して加える熱エネルギーが大きくなる焼成温度及び焼成時間を選択すると、一次粒子の成長が促進され、一次粒子の粒径が大きくなる傾向がある。また、一次粒子の粒径が大きくなるほど、二次粒子の比表面積が小さくなる傾向がある。
水酸化アルミニウムの焼成では、水酸化アルミニウムをアルミナに相転移させるために必要な熱エネルギーを加える。
工程Ｃにおいて、水酸化アルミニウムに対して加える熱エネルギーが大きくなる焼成温度及び焼成時間を選択すると、一次粒子の成長が促進され、一次粒子の粒径が大きくなる傾向がある。また、一次粒子の粒径が大きくなるほど、二次粒子の比表面積が小さくなる傾向がある。
【0038】
工程Ｄは、アルミナ焼成体を、粉砕機を用いて粉砕する工程である。
工程Ｄにおいて、破砕機による粉砕プロセスでより粉砕されない条件を選択すると、二次粒子の粒径は大きくなり、破砕機による粉砕プロセスでより粉砕される条件を選択すると、二次粒子の粒径は小さくなる傾向がある。
工程Ｄにおいて、破砕機による粉砕プロセスでより粉砕されない条件を選択すると、二次粒子の粒径は大きくなり、破砕機による粉砕プロセスでより粉砕される条件を選択すると、二次粒子の粒径は小さくなる傾向がある。
【0039】
［細胞外小胞分離用粉体の使用方法］
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の使用方法は、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体と細胞外小胞分離用粉体とを接触させることにより、細胞外小胞分離用粉体にエクソソームを吸着させる工程ａと、細胞外小胞分離用粉体に吸着したエクソソームを脱離させる工程ｂと、を含む。
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の使用方法によれば、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体から、エクソソームを選択的かつ効率的に分離回収できる。
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の使用方法は、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体と細胞外小胞分離用粉体とを接触させることにより、細胞外小胞分離用粉体にエクソソームを吸着させる工程ａと、細胞外小胞分離用粉体に吸着したエクソソームを脱離させる工程ｂと、を含む。
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の使用方法によれば、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体から、エクソソームを選択的かつ効率的に分離回収できる。
【0040】
工程ａは、細胞外小胞であるエクソソームを含む液体と細胞外小胞分離用粉体とを接触させることにより、細胞外小胞分離用粉体にエクソソームを吸着させる工程である。
工程ａによれば、例えば、エクソソーム及び夾雑物を含む液体から、エクソソームを選択的に分離できる。
エクソソームを含む液体は、液状媒体中に細胞外小胞であるエクソソームが分散して含まれる分散液であれば、特に限定されない。
エクソソームを含む液体は、夾雑物を含むものであってもよい。
夾雑物としては、例えば、タンパク質（所謂、夾雑タンパク質）が挙げられる。
液状媒体としては、例えば、血清及び培地上清が挙げられる。
工程ａによれば、例えば、エクソソーム及び夾雑物を含む液体から、エクソソームを選択的に分離できる。
エクソソームを含む液体は、液状媒体中に細胞外小胞であるエクソソームが分散して含まれる分散液であれば、特に限定されない。
エクソソームを含む液体は、夾雑物を含むものであってもよい。
夾雑物としては、例えば、タンパク質（所謂、夾雑タンパク質）が挙げられる。
液状媒体としては、例えば、血清及び培地上清が挙げられる。
【0041】
エクソソームを含む液体と細胞外小胞分離用粉体とを接触させる方法は、特に限定されない。
エクソソームを含む液体と細胞外小胞分離用粉体とを接触させる方法としては、例えば、液体中のエクソソームと細胞外小胞分離用粉体とを効果的に接触させることができる点において、エクソソームを含む液体と細胞外小胞分離用粉体とを撹拌により混合する方法が好ましい。
また、エクソソームを含む液体と細胞外小胞分離用粉体とを接触させる方法としては、例えば、細胞外小胞分離用粉体を担体とするカラムに、エクソソームを含む液体を流す方法も好ましい。
エクソソームを含む液体と細胞外小胞分離用粉体とを接触させる方法としては、例えば、液体中のエクソソームと細胞外小胞分離用粉体とを効果的に接触させることができる点において、エクソソームを含む液体と細胞外小胞分離用粉体とを撹拌により混合する方法が好ましい。
また、エクソソームを含む液体と細胞外小胞分離用粉体とを接触させる方法としては、例えば、細胞外小胞分離用粉体を担体とするカラムに、エクソソームを含む液体を流す方法も好ましい。
【0042】
工程ｂは、細胞外小胞分離用粉体に吸着したエクソソームを脱離させる工程である。
工程ｂによれば、細胞外小胞分離用粉体によって分離したエクソソームの回収が可能となる。
工程ｂによれば、細胞外小胞分離用粉体によって分離したエクソソームの回収が可能となる。
【0043】
細胞外小胞分離用粉体に吸着したエクソソームを脱離させる方法としては、特に限定されず、例えば、脱離液とエクソソームが吸着した細胞外小胞分離用粉体とを撹拌により混合する方法が挙げられる。
脱離液は、細胞外小胞分離用粉体からエクソソームを脱離させることができれば、特に限定されない。
脱離液としては、炭酸水素ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム等の無機塩の水溶液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等の有機塩の水溶液などが好ましい。
無機塩の水溶液は、ｐＨ５～ｐＨ１１であることが好ましく、ｐＨ７～ｐＨ１０であることがより好ましい。
脱離液は、細胞外小胞分離用粉体からエクソソームを脱離させることができれば、特に限定されない。
脱離液としては、炭酸水素ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム等の無機塩の水溶液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等の有機塩の水溶液などが好ましい。
無機塩の水溶液は、ｐＨ５～ｐＨ１１であることが好ましく、ｐＨ７～ｐＨ１０であることがより好ましい。
【0044】
本開示に係る細胞外小胞分離用粉体の使用方法は、工程ａ及び工程ｂ以外の工程（所謂、他の工程）を含んでいてもよい。
他の工程としては、例えば、脱離したエクソソームを回収する工程が挙げられる。
例えば、脱離液を用いてエクソソームを脱離させた場合、脱離したエクソソームは脱離液に含まれる。エクソソームを含む脱離液の回収方法としては、例えば、遠心分離が好ましい。
他の工程としては、例えば、脱離したエクソソームを回収する工程が挙げられる。
例えば、脱離液を用いてエクソソームを脱離させた場合、脱離したエクソソームは脱離液に含まれる。エクソソームを含む脱離液の回収方法としては、例えば、遠心分離が好ましい。
【実施例0045】
以下に実施例を挙げて、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体を更に具体的に説明する。本開示に係る細胞外小胞分離用粉体は、その主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【0046】
［細胞外小胞分離用粉体の準備］
＜細胞外小胞分離用粉体Ａ－１＞
細胞外小胞分離用粉体Ａ－１として、住友化学（株）製のＡＫＰ－１５（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
＜細胞外小胞分離用粉体Ａ－１＞
細胞外小胞分離用粉体Ａ－１として、住友化学（株）製のＡＫＰ－１５（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
【0047】
＜細胞外小胞分離用粉体Ａ－２＞
細胞外小胞分離用粉体Ａ－２として、住友化学（株）製のＡＫＰ－２０（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
細胞外小胞分離用粉体Ａ－２として、住友化学（株）製のＡＫＰ－２０（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
【0048】
＜細胞外小胞分離用粉体Ａ－３＞
細胞外小胞分離用粉体Ａ－３として、住友化学（株）製のＡＫＰ－３０（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
細胞外小胞分離用粉体Ａ－３として、住友化学（株）製のＡＫＰ－３０（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
【0049】
＜細胞外小胞分離用粉体Ａ－４＞
細胞外小胞分離用粉体Ａ－４として、住友化学（株）製のＡＫＰ－Ｇ０７（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
細胞外小胞分離用粉体Ａ－４として、住友化学（株）製のＡＫＰ－Ｇ０７（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
【0050】
＜細胞外小胞分離用粉体Ａ－５＞
細胞外小胞分離用粉体Ａ－５として、住友化学（株）製のＡＫＰ－Ｇ１５（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
細胞外小胞分離用粉体Ａ－５として、住友化学（株）製のＡＫＰ－Ｇ１５（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
【0051】
＜細胞外小胞分離用粉体Ａ－６＞
細胞外小胞分離用粉体Ａ－６として、住友化学（株）製のＡＡ－１８（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
細胞外小胞分離用粉体Ａ－６として、住友化学（株）製のＡＡ－１８（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
【0052】
＜細胞外小胞分離用粉体Ａ－７＞
細胞外小胞分離用粉体Ａ－７として、珪藻土〔富士フイルム和光純薬（株）製〕を準備した。上記珪藻土は、複数の多孔質シリカ粒子を含む粉体である。
細胞外小胞分離用粉体Ａ－７として、珪藻土〔富士フイルム和光純薬（株）製〕を準備した。上記珪藻土は、複数の多孔質シリカ粒子を含む粉体である。
【0053】
＜細胞外小胞分離用粉体Ａ－８＞
細胞外小胞分離用粉体Ａ－８として、住友化学（株）製のＡ－２１（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
細胞外小胞分離用粉体Ａ－８として、住友化学（株）製のＡ－２１（商品名、組成：アルミナ）を準備した。
【0054】
細胞外小胞分離用粉体Ａ－１～Ａ－８について、二次粒子の有無及び一次粒子の平均粒径を表１に示す。また、細胞外小胞分離用粉体Ａ－１～Ａ－８のうち、二次粒子を有するものについては、二次粒子の平均粒径及びＢＥＴ比表面積を表１に示す。
【0055】
細胞外小胞分離用粉体Ａ－１～Ａ－８における二次粒子の有無は、電子顕微鏡観察により確認した。
細胞外小胞分離用粉体Ａ－１～Ａ－８における一次粒子の平均粒径は、電子顕微鏡観察より得られた一次粒子の外観について、Ｉｍａｇｅ－Ｊを用いた画像解析を行うことにより求めた。具体的には、電子顕微鏡観察によって得られた一次粒子の外観について、２５０個から５００個の一次粒子の輪郭をマーキングして、Ｉｍａｇｅ－Ｊを用いて粒径を検出した。得られた粒径分布から、平均粒径を求めた。
細胞外小胞分離用粉体Ａ－１～Ａ－８における一次粒子の平均粒径は、電子顕微鏡観察より得られた一次粒子の外観について、Ｉｍａｇｅ－Ｊを用いた画像解析を行うことにより求めた。具体的には、電子顕微鏡観察によって得られた一次粒子の外観について、２５０個から５００個の一次粒子の輪郭をマーキングして、Ｉｍａｇｅ－Ｊを用いて粒径を検出した。得られた粒径分布から、平均粒径を求めた。
【0056】
細胞外小胞分離用粉体Ａ－１～Ａ－５及びＡ－８に含まれる二次粒子の平均粒径は、測定装置として、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製のレーザー回折散乱式粒度分布測定装置であるＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００を用いて測定した。
細胞外小胞分離用粉体Ａ－１～Ａ－５及びＡ－８に含まれる二次粒子のＢＥＴ比表面積は、ＪＩＳ Ｚ ８８３０：２０１３に規定された方法に従って、窒素ガスを用いたガス吸着法により求めた。測定装置には、（株）島津製作所製のマイクロメリティックス流動式比表面積自動測定装置であるフローソーブＩＩ ２３００を用いた。
細胞外小胞分離用粉体Ａ－１～Ａ－５及びＡ－８に含まれる二次粒子のＢＥＴ比表面積は、ＪＩＳ Ｚ ８８３０：２０１３に規定された方法に従って、窒素ガスを用いたガス吸着法により求めた。測定装置には、（株）島津製作所製のマイクロメリティックス流動式比表面積自動測定装置であるフローソーブＩＩ ２３００を用いた。
【0057】
【表1】
【0058】
表１中、「－」は、該当するものがないことを意味する。
【0059】
表１に示す結果から、細胞外小胞分離用粉体Ａ－１～Ａ－８中、細胞外小胞分離用粉体Ａ－１～Ａ－５は、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体に相当することが確認された。
【0060】
［検量線の作成］
粉体によるエクソソーム及び牛血清アルブミンの吸着率、吸着したエクソソーム及び牛血清アルブミンの粉体からの脱離率、並びに、エクソソーム及び牛血清アルブミンの回収率を算出するため、エクソソーム濃度とタンパク質濃度の標準直線を作成した。
標準となるエクソソームは、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ－３細胞〔細胞登録番号：ＪＣＲＢ１４４８、ＪＣＲＢ細胞バンク〕の培養上清から分離した。具体的には、以下のようにして調製した。ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ－３細胞を牛血清不含ＲＰＭＩ－１６４０培地〔カタログ番号：１８９－０２０２５、富士フイルム和光純薬（株）製〕中で３日間培養した。次いで、得られた培養液を遠心分離〔遠心力：３００×ｇ)、回転時間：５分、温度：４℃〕し、培養上清Ｘを回収した。回収した培養上清Ｘを再度遠心分離〔遠心力：１，２００×g、回転時間：２０分、温度：４℃〕し、培養上清Ｙを回収した。回収した培養上清Ｙを再度遠心分離〔遠心力：１０，０００×ｇ、回転時間：３０分、温度：４℃〕し、培養上清Ｚを回収した。回収した培養上清Ｚには、エクソソームが含まれる。回収した培養上清Ｚを超遠心分離〔遠心力：１００，０００×ｇ、回転時間：１時間、温度：４℃〕し、得られたペレットを１ｍＬのＰＢＳ（－）溶液（リン酸緩衝生理食塩水）で縣濁した。得られた懸濁液を再度超遠心分離〔遠心力：１００，０００×ｇ、回転時間：１時間、温度：４℃〕し、得られたペレットを１ｍＬのＰＢＳ（－）溶液で再懸濁し、エクソソームを回収した。エクソソームを含む試料液中のタンパク質濃度は、牛血清アルブミン〔カタログ番号：Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製〕を標準として、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ〔カタログ番号：２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕を用いて測定した。
次に、上記にて得られたエクソソームを標準として、試料液中のエクソソーム濃度を算出するための検量線をｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法により作成した。具体的には、以下のようにして作成した。ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ ウエルプレート〔カタログ番号：４３９４５４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕の各ウエルに１μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ９抗体〔カタログ番号：３Ｃ９－Ｅ１２、（株）細胞工学研究所製〕ＰＢＳ（－）溶液を１００μＬ加え、室温にて１時間静置した。次いで、各ウエルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液〔５０ｍＭのＴｒｉｓ及び０．１４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８〕（以下、「洗浄液Ｔ」という。）２００μＬで３回洗浄した後、０．０１ｇ／ｍＬの牛血清アルブミンを含む洗浄液Ｔを２００μＬ加えて、室温にて１時間静置した。次いで、各ウエルから０．０１ｇ／ｍＬの牛血清アルブミンを含む洗浄液Ｔを除去した後、各濃度のエクソソーム標準液を１００μＬ加えて、室温で２時間振とうした。次いで、各ウエルを２００μＬの洗浄液Ｔで５回洗浄した後、ＨＲＰ標識ラット抗ヒトＣＤ６３抗体〔カタログ番号：１Ｃ８－２Ｂ１１、（株）細胞工学研究所製〕を１００μＬ添加し、室温にて１時間静置した。次いで、各ウエルを２００μＬの洗浄液Ｔで５回洗浄した後、ＨＲＰ基質液〔カタログ番号：５１２０－００５３、ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製〕を１００μＬ添加し、室温で２０分間振とうした。その後、２％硫酸水溶液を５０μＬ添加して反応を停止させ、各ウエルの波長４５０ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。その結果、エクソソーム標準液の濃度と波長４５０ｎｍにおける吸光度との間に高い直線性が示された（Ｒ２＝１．０００）。
また、試料液中のタンパク質濃度を算出するための検量線を、牛血清アルブミンをタンパク質の標準として、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ〔カタログ番号：２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕を用いて作成した。その結果、タンパク質標準液の濃度と波長５７０ｎｍにおける吸光度との間に高い直線性が示された（Ｒ２＝０．９７０）。
粉体によるエクソソーム及び牛血清アルブミンの吸着率、吸着したエクソソーム及び牛血清アルブミンの粉体からの脱離率、並びに、エクソソーム及び牛血清アルブミンの回収率を算出するため、エクソソーム濃度とタンパク質濃度の標準直線を作成した。
標準となるエクソソームは、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ－３細胞〔細胞登録番号：ＪＣＲＢ１４４８、ＪＣＲＢ細胞バンク〕の培養上清から分離した。具体的には、以下のようにして調製した。ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ－３細胞を牛血清不含ＲＰＭＩ－１６４０培地〔カタログ番号：１８９－０２０２５、富士フイルム和光純薬（株）製〕中で３日間培養した。次いで、得られた培養液を遠心分離〔遠心力：３００×ｇ)、回転時間：５分、温度：４℃〕し、培養上清Ｘを回収した。回収した培養上清Ｘを再度遠心分離〔遠心力：１，２００×g、回転時間：２０分、温度：４℃〕し、培養上清Ｙを回収した。回収した培養上清Ｙを再度遠心分離〔遠心力：１０，０００×ｇ、回転時間：３０分、温度：４℃〕し、培養上清Ｚを回収した。回収した培養上清Ｚには、エクソソームが含まれる。回収した培養上清Ｚを超遠心分離〔遠心力：１００，０００×ｇ、回転時間：１時間、温度：４℃〕し、得られたペレットを１ｍＬのＰＢＳ（－）溶液（リン酸緩衝生理食塩水）で縣濁した。得られた懸濁液を再度超遠心分離〔遠心力：１００，０００×ｇ、回転時間：１時間、温度：４℃〕し、得られたペレットを１ｍＬのＰＢＳ（－）溶液で再懸濁し、エクソソームを回収した。エクソソームを含む試料液中のタンパク質濃度は、牛血清アルブミン〔カタログ番号：Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製〕を標準として、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ〔カタログ番号：２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕を用いて測定した。
次に、上記にて得られたエクソソームを標準として、試料液中のエクソソーム濃度を算出するための検量線をｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ法により作成した。具体的には、以下のようにして作成した。ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ ウエルプレート〔カタログ番号：４３９４５４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕の各ウエルに１μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトＣＤ９抗体〔カタログ番号：３Ｃ９－Ｅ１２、（株）細胞工学研究所製〕ＰＢＳ（－）溶液を１００μＬ加え、室温にて１時間静置した。次いで、各ウエルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ溶液〔５０ｍＭのＴｒｉｓ及び０．１４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８〕（以下、「洗浄液Ｔ」という。）２００μＬで３回洗浄した後、０．０１ｇ／ｍＬの牛血清アルブミンを含む洗浄液Ｔを２００μＬ加えて、室温にて１時間静置した。次いで、各ウエルから０．０１ｇ／ｍＬの牛血清アルブミンを含む洗浄液Ｔを除去した後、各濃度のエクソソーム標準液を１００μＬ加えて、室温で２時間振とうした。次いで、各ウエルを２００μＬの洗浄液Ｔで５回洗浄した後、ＨＲＰ標識ラット抗ヒトＣＤ６３抗体〔カタログ番号：１Ｃ８－２Ｂ１１、（株）細胞工学研究所製〕を１００μＬ添加し、室温にて１時間静置した。次いで、各ウエルを２００μＬの洗浄液Ｔで５回洗浄した後、ＨＲＰ基質液〔カタログ番号：５１２０－００５３、ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製〕を１００μＬ添加し、室温で２０分間振とうした。その後、２％硫酸水溶液を５０μＬ添加して反応を停止させ、各ウエルの波長４５０ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。その結果、エクソソーム標準液の濃度と波長４５０ｎｍにおける吸光度との間に高い直線性が示された（Ｒ２＝１．０００）。
また、試料液中のタンパク質濃度を算出するための検量線を、牛血清アルブミンをタンパク質の標準として、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ〔カタログ番号：２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕を用いて作成した。その結果、タンパク質標準液の濃度と波長５７０ｎｍにおける吸光度との間に高い直線性が示された（Ｒ２＝０．９７０）。
【0061】
［試料液の調製］
細胞外小胞であるエクソソームと、牛血清アルブミン〔カタログ番号：Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製〕とを混合し、試料液を調製した。
エクソソームには、検量線を作成する際に使用したエクソソーム、すなわち、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ－３細胞〔細胞登録番号：ＪＣＲＢ１４４８、ＪＣＲＢ細胞バンク〕の培養上清から分離したエクソソームを用いた。
調製した試料液は、エクソソームの濃度が１．２μｇ／ｍＬであり、牛血清アルブミンの濃度が３．０ｍｇ／ｍＬであり、エクソソーム及び牛血清アルブミンがＰＢＳ（－）溶液に分散された分散液である。
細胞外小胞であるエクソソームと、牛血清アルブミン〔カタログ番号：Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製〕とを混合し、試料液を調製した。
エクソソームには、検量線を作成する際に使用したエクソソーム、すなわち、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ－３細胞〔細胞登録番号：ＪＣＲＢ１４４８、ＪＣＲＢ細胞バンク〕の培養上清から分離したエクソソームを用いた。
調製した試料液は、エクソソームの濃度が１．２μｇ／ｍＬであり、牛血清アルブミンの濃度が３．０ｍｇ／ｍＬであり、エクソソーム及び牛血清アルブミンがＰＢＳ（－）溶液に分散された分散液である。
【0062】
［評価］
細胞外小胞分離用粉体Ａ－１～Ａ－８を用いて、下記の試験を行い、細胞外小胞分離用粉体によるエクソソームの分離及び回収の効率についての評価を行った。
細胞外小胞分離用粉体Ａ－１～Ａ－８を用いて、下記の試験を行い、細胞外小胞分離用粉体によるエクソソームの分離及び回収の効率についての評価を行った。
【0063】
１．分離試験
上記にて調製した試料液５００μＬと、上記にて製造した細胞外小胞分離用粉体１０ｍｇ又は３０ｍｇと、をマイクロチューブ〔プロテオセーブ（登録商標）ＳＳ １．５ｍＬマイクロチューブ、住友ベークライト（株）製〕中で混合した後、室温で２時間回転させて撹拌した。次に、マイクロチューブを回転数８，０００ｒｐｍ（revolution per minute；以下、同じ。）及び回転時間５秒の条件で遠心分離機にかけ、細胞外小胞分離用粉体と上澄み液とに分離し、上澄み液を回収した。回収した上澄み液の分画を「Ｓ分画」とした。
次に、上澄み液を回収した後のマイクロチューブに、洗浄液としてのＰＢＳ（－）溶液５００μＬを加え、細胞外小胞分離用粉体とＰＢＳ（－）溶液とを混合した後、室温で１０分間回転させて撹拌することにより、細胞外小胞分離用粉体の洗浄処理を行った。その後、マイクロチューブを回転数８，０００ｒｐｍ及び回転時間５秒の条件で遠心分離機にかけ、細胞外小胞分離用粉体とＰＢＳ（－）溶液とに分離し、ＰＢＳ（－）溶液を回収した。上記の洗浄処理及び回収の操作を３回連続して行い、回収したＰＢＳ（－）溶液の分画をそれぞれ「Ｗ１分画」、「Ｗ２分画」及び「Ｗ３分画」とした。
上記にて調製した試料液５００μＬと、上記にて製造した細胞外小胞分離用粉体１０ｍｇ又は３０ｍｇと、をマイクロチューブ〔プロテオセーブ（登録商標）ＳＳ １．５ｍＬマイクロチューブ、住友ベークライト（株）製〕中で混合した後、室温で２時間回転させて撹拌した。次に、マイクロチューブを回転数８，０００ｒｐｍ（revolution per minute；以下、同じ。）及び回転時間５秒の条件で遠心分離機にかけ、細胞外小胞分離用粉体と上澄み液とに分離し、上澄み液を回収した。回収した上澄み液の分画を「Ｓ分画」とした。
次に、上澄み液を回収した後のマイクロチューブに、洗浄液としてのＰＢＳ（－）溶液５００μＬを加え、細胞外小胞分離用粉体とＰＢＳ（－）溶液とを混合した後、室温で１０分間回転させて撹拌することにより、細胞外小胞分離用粉体の洗浄処理を行った。その後、マイクロチューブを回転数８，０００ｒｐｍ及び回転時間５秒の条件で遠心分離機にかけ、細胞外小胞分離用粉体とＰＢＳ（－）溶液とに分離し、ＰＢＳ（－）溶液を回収した。上記の洗浄処理及び回収の操作を３回連続して行い、回収したＰＢＳ（－）溶液の分画をそれぞれ「Ｗ１分画」、「Ｗ２分画」及び「Ｗ３分画」とした。
【0064】
細胞外小胞分離用粉体へのエクソソームの吸着率（単位：％）は、下記の計算式により算出した。
エクソソームの吸着率（単位：％）
＝１００×｛〔試料液に含まれるエクソソームの量（単位：μｇ）〕－〔Ｓ分画、Ｗ１分画、Ｗ２分画及びＷ３分画に含まれるエクソソームの合計量（単位：μｇ）〕｝／〔試料液に含まれるエクソソームの量（単位：μｇ）〕
エクソソームの吸着率（単位：％）
＝１００×｛〔試料液に含まれるエクソソームの量（単位：μｇ）〕－〔Ｓ分画、Ｗ１分画、Ｗ２分画及びＷ３分画に含まれるエクソソームの合計量（単位：μｇ）〕｝／〔試料液に含まれるエクソソームの量（単位：μｇ）〕
【0065】
細胞外小胞分離用粉体への牛血清アルブミンの吸着率（単位：％）は、下記の計算式により算出した。
牛血清アルブミンの吸着率（単位：％）
＝１００×｛〔試料液に含まれる牛血清アルブミンの量（単位：ｍｇ）〕－〔Ｓ分画、Ｗ１分画、Ｗ２分画及びＷ３分画に含まれる牛血清アルブミンの合計量（単位：ｍｇ）〕｝／〔試料液に含まれる牛血清アルブミンの量（単位：ｍｇ）〕
牛血清アルブミンの吸着率（単位：％）
＝１００×｛〔試料液に含まれる牛血清アルブミンの量（単位：ｍｇ）〕－〔Ｓ分画、Ｗ１分画、Ｗ２分画及びＷ３分画に含まれる牛血清アルブミンの合計量（単位：ｍｇ）〕｝／〔試料液に含まれる牛血清アルブミンの量（単位：ｍｇ）〕
【0066】
２．回収試験
上記「１．分離試験」を行った後の細胞外小胞分離用粉体と、脱離液としての２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液（ｐＨ１０）５００μＬと、をマイクロチューブ中で混合した後、室温で３０分間回転させて撹拌することにより、細胞外小胞分離用粉体に吸着したエクソソームを細胞外小胞分離用粉体から脱離させた。次に、マイクロチューブを回転数８，０００ｒｐｍ及び回転時間５秒の条件で遠心分離機にかけ、細胞外小胞分離用粉体と脱離液とに分離し、脱離液を回収した。上記の脱離処理及び回収の操作を３回連続して行い、回収した脱離液の分画をそれぞれ「Ｅ１分画」、「Ｅ２分画」及び「Ｅ３分画」とした。
上記「１．分離試験」を行った後の細胞外小胞分離用粉体と、脱離液としての２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ水溶液（ｐＨ１０）５００μＬと、をマイクロチューブ中で混合した後、室温で３０分間回転させて撹拌することにより、細胞外小胞分離用粉体に吸着したエクソソームを細胞外小胞分離用粉体から脱離させた。次に、マイクロチューブを回転数８，０００ｒｐｍ及び回転時間５秒の条件で遠心分離機にかけ、細胞外小胞分離用粉体と脱離液とに分離し、脱離液を回収した。上記の脱離処理及び回収の操作を３回連続して行い、回収した脱離液の分画をそれぞれ「Ｅ１分画」、「Ｅ２分画」及び「Ｅ３分画」とした。
【0067】
細胞外小胞分離用粉体からのエクソソームの脱離率（単位：％）は、下記の計算式により算出した。
エクソソームの脱離率（単位：％）
＝１００×〔Ｅ１分画、Ｅ２分画及びＥ３分画に含まれるエクソソームの合計量（単位：μｇ）〕／｛〔エクソソームの吸着率（単位：％）〕×〔試料液に含まれるエクソソームの量（単位：μｇ）〕／１００｝
エクソソームの脱離率（単位：％）
＝１００×〔Ｅ１分画、Ｅ２分画及びＥ３分画に含まれるエクソソームの合計量（単位：μｇ）〕／｛〔エクソソームの吸着率（単位：％）〕×〔試料液に含まれるエクソソームの量（単位：μｇ）〕／１００｝
【0068】
細胞外小胞分離用粉体からの牛血清アルブミンの脱離率（単位：％）は、下記の計算式により算出した。
牛血清アルブミンの脱離率（単位：％）
＝１００×〔Ｅ１分画、Ｅ２分画及びＥ３分画に含まれる牛血清アルブミンの合計量（単位：ｍｇ）〕／｛〔牛血清アルブミンの吸着率（単位：％）〕×〔試料液に含まれる牛血清アルブミンの量（単位：ｍｇ）〕／１００｝
牛血清アルブミンの脱離率（単位：％）
＝１００×〔Ｅ１分画、Ｅ２分画及びＥ３分画に含まれる牛血清アルブミンの合計量（単位：ｍｇ）〕／｛〔牛血清アルブミンの吸着率（単位：％）〕×〔試料液に含まれる牛血清アルブミンの量（単位：ｍｇ）〕／１００｝
【0069】
エクソソームの回収率（単位：％）は、下記の計算式により算出した。
エクソソームの回収率（単位：％）
＝〔エクソソームの吸着率（単位：％）×エクソソームの脱離率（単位：％）〕／１００
エクソソームの回収率（単位：％）
＝〔エクソソームの吸着率（単位：％）×エクソソームの脱離率（単位：％）〕／１００
【0070】
牛血清アルブミンの回収率（単位：％）は、下記の計算式により算出した。
牛血清アルブミンの回収率（単位：％）
＝〔牛血清アルブミンの吸着率（単位：％）×牛血清アルブミンの脱離率（単位：％）〕／１００
牛血清アルブミンの回収率（単位：％）
＝〔牛血清アルブミンの吸着率（単位：％）×牛血清アルブミンの脱離率（単位：％）〕／１００
【0071】
【表2】
【0072】
表２に示すように、本開示に係る細胞外小胞分離用粉体によれば、細胞外小胞であるエクソソーム及び夾雑タンパク質である牛血清アルブミンを含む試料液から、エクソソームを選択的に吸着して分離できること、及び、吸着して分離したエクソソームを選択的かつ効率的に脱離して回収できることが明らかとなった。