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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024147691
(43)【公開日】2024-10-16
(54)【発明の名称】静止期肝星細胞の調製方法と活性化評価モデル
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20241008BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20241008BHJP
C12Q 1/6897 20180101ALI20241008BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20241008BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20241008BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20241008BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077 ZNA
C12Q1/02
C12Q1/6897 Z
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C12N5/077
C12N5/10
【審査請求】有
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024113467
(22)【出願日】2024-07-16
(62)【分割の表示】P 2020572358の分割
【原出願日】2020-02-17
(31)【優先権主張番号】P 2019025802
(32)【優先日】2019-02-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構 再生医療 実現拠点ネットワークプログラム 幹細胞・再生医学イノベーション創出プログラム 研究開発課題名「ヒトｉＰＳ細胞由来肝構成細胞による肝線維化モデルの樹立と応用」、産業技術力強化法第１７条の適用を受けるもの
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(72)【発明者】
【氏名】宮島 篤
(72)【発明者】
【氏名】木戸 丈友
(72)【発明者】
【氏名】厚井 悠太
(57)【要約】
【課題】本発明は、多能性幹細胞を分化誘導して静止期肝星細胞を調製する方法、及び静止期肝星細胞の活性化に関与する薬剤のスクリーニング法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明によれば、ｉＰＳ細胞を分化誘導して、ＮＧＦＲ陽性の表現型を指標として静止期肝星細胞を分取する工程を含む、静止期肝星細胞を調製する方法が提供される。また、該静止期肝星細胞にレポーター遺伝子を導入することにより、活性化された肝星細胞において特異的に発現する遺伝子マーカーの発現量に基づく、線維化を伴う肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法が提供される。
【選択図】図１
【解決手段】本発明によれば、ｉＰＳ細胞を分化誘導して、ＮＧＦＲ陽性の表現型を指標として静止期肝星細胞を分取する工程を含む、静止期肝星細胞を調製する方法が提供される。また、該静止期肝星細胞にレポーター遺伝子を導入することにより、活性化された肝星細胞において特異的に発現する遺伝子マーカーの発現量に基づく、線維化を伴う肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法が提供される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多能性幹細胞を分化誘導して静止期肝星細胞を調製する方法であって、
（ａ）多能性幹細胞にレポーター遺伝子を組み込む工程；ならびに
（ｂ）該レポーター遺伝子が組み込まれた多能性幹細胞を下記の各誘導期間に対応する培地：
（ｉ）０～１日目：ＢＭＰ４及びＲｏｃｋ阻害剤を添加した培地、
（ｉｉ）１～４日目：ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ｂＦＧＦ、及びＢＭＰ４を添加した培地、及び
（ｉｉｉ）４～８日目：ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＲｏｃｋ阻害剤を添加した培地
において三次元培養する工程
を含み、
ここで、上記期間のうち０～６日目では約４％Ｏ２の存在下で多能性幹細胞を培養し、続いて６～８日目では２０％酸素濃度環境下で多能性幹細胞を培養して、ＮＧＦＲを発現する静止期肝星細胞を得ることによって特徴付けられる、上記調製方法。
（ａ）多能性幹細胞にレポーター遺伝子を組み込む工程；ならびに
（ｂ）該レポーター遺伝子が組み込まれた多能性幹細胞を下記の各誘導期間に対応する培地：
（ｉ）０～１日目：ＢＭＰ４及びＲｏｃｋ阻害剤を添加した培地、
（ｉｉ）１～４日目：ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ｂＦＧＦ、及びＢＭＰ４を添加した培地、及び
（ｉｉｉ）４～８日目：ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＲｏｃｋ阻害剤を添加した培地
において三次元培養する工程
を含み、
ここで、上記期間のうち０～６日目では約４％Ｏ２の存在下で多能性幹細胞を培養し、続いて６～８日目では２０％酸素濃度環境下で多能性幹細胞を培養して、ＮＧＦＲを発現する静止期肝星細胞を得ることによって特徴付けられる、上記調製方法。
【請求項2】
多能性幹細胞を分化誘導して静止期肝星細胞を調製する方法であって、
（ａ）多能性幹細胞を下記の各誘導期間に対応する培地：
（ｉ）０～１日目：ＢＭＰ４及びＲｏｃｋ阻害剤を添加した培地、
（ｉｉ）１～４日目：ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ｂＦＧＦ、及びＢＭＰ４を添加した培地、及び
（ｉｉｉ）４～８日目：ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＲｏｃｋ阻害剤を添加した培地
において三次元培養する工程；ならびに
（ｂ）（ａ）の工程中又はその後にレポーター遺伝子を前記多能性幹細胞に組み込む工程
を含み、
ここで、上記期間のうち０～６日目では約４％Ｏ２の存在下で多能性幹細胞を培養し、続いて６～８日目では２０％酸素濃度環境下で多能性幹細胞を培養して、ＮＧＦＲを発現する静止期肝星細胞を得ることによって特徴付けられる、上記調製方法。
（ａ）多能性幹細胞を下記の各誘導期間に対応する培地：
（ｉ）０～１日目：ＢＭＰ４及びＲｏｃｋ阻害剤を添加した培地、
（ｉｉ）１～４日目：ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ｂＦＧＦ、及びＢＭＰ４を添加した培地、及び
（ｉｉｉ）４～８日目：ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＲｏｃｋ阻害剤を添加した培地
において三次元培養する工程；ならびに
（ｂ）（ａ）の工程中又はその後にレポーター遺伝子を前記多能性幹細胞に組み込む工程
を含み、
ここで、上記期間のうち０～６日目では約４％Ｏ２の存在下で多能性幹細胞を培養し、続いて６～８日目では２０％酸素濃度環境下で多能性幹細胞を培養して、ＮＧＦＲを発現する静止期肝星細胞を得ることによって特徴付けられる、上記調製方法。
【請求項3】
Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、ＴＧＦ－β阻害剤がＳＢ４３１５４２であり、及び／又はＢＭＰ阻害剤がＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎである、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項4】
三次元培養が、スフェロイド培養、浮遊培養又はゲル培養である、請求項１～３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載の方法で調製された静止期肝星細胞。
【請求項6】
請求項５に記載の静止期肝星細胞を含む細胞懸濁液。
【請求項7】
肝星細胞の活性化を抑制する被験物質を、線維化を伴う肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法であって、
（ａ）請求項１～４のいずれか１項に記載の方法で調製された、レポーター遺伝子が導入された静止期肝星細胞を培養し；
（ｂ）前記静止期肝星細胞の培養系に静止期肝星細胞を活性化する薬物を添加するか、又は前記静止期肝星細胞を回収及び再播種して二次元培養することによって、静止期肝星細胞を活性化して、活性化肝星細胞を得て；
（ｃ）活性化肝星細胞の培養系に被験物質を添加し；
（ｄ）レポーター遺伝子の発現量を被験物質の添加前後で比較し；及び
（ｅ）被験物質の添加後にレポーター遺伝子の発現量が減少している場合に、肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法。
（ａ）請求項１～４のいずれか１項に記載の方法で調製された、レポーター遺伝子が導入された静止期肝星細胞を培養し；
（ｂ）前記静止期肝星細胞の培養系に静止期肝星細胞を活性化する薬物を添加するか、又は前記静止期肝星細胞を回収及び再播種して二次元培養することによって、静止期肝星細胞を活性化して、活性化肝星細胞を得て；
（ｃ）活性化肝星細胞の培養系に被験物質を添加し；
（ｄ）レポーター遺伝子の発現量を被験物質の添加前後で比較し；及び
（ｅ）被験物質の添加後にレポーター遺伝子の発現量が減少している場合に、肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法。
【請求項8】
請求項７に記載のスクリーニング法に使用するためのキットであって、請求項５に記載の静止期肝星細胞又は請求項６に記載の細胞懸濁液を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多能性幹細胞を分化誘導して静止期肝星細胞を調製する方法、該調製方法によって得られた静止期肝星細胞及びそれを含む細胞懸濁液、ならびに静止期肝星細胞の活性化に関与する薬剤のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【0002】
肝臓の結合組織の増生及び蓄積は、肝臓の循環傷害を引き起こし、さらに肝実質細胞障害の原因となり、さらなる結合組織の増生及び蓄積がおこり、肝硬変や肝線維化を伴う肝疾患症の原因になると考えられている。肝臓は、肝実質細胞と非実質細胞（肝星細胞、クッパー細胞、類洞内皮細胞、Ｐｉｔ細胞）からなり、肝臓の結合組織は細胞外基質（コラーゲンなど）とそこに局在する細胞から構成されている。結合組織中の基質産生担当細胞である肝星細胞（Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ：ＨＳＣ）が活性化され、形質転換することにより、結合組織の増生及び蓄積が促進される。正常肝臓の肝星細胞（以下、「静止期肝星細胞」と呼ぶ）は、細胞外基質の生産量が少なく、活性化に伴い筋線維芽様細胞に形態を変化させ、細胞の増加とともに多量の細胞外基質を合成することが知られている。
【0003】
したがって、肝硬変などの肝線維化を伴う肝疾患患者の肝星細胞の活性化を抑制し、結合組織の増生及び蓄積を軽減する治療法及び予防法が必要とされ、肝星細胞の活性化を抑制させる薬剤のスクリーニングは重要であると言える。このような必要性があるにも関わらず、肝星細胞の活性化を抑制する薬物の効率的なスクリーニング法は知られていない。
【0004】
本発明者らは、これまでに多能性幹細胞から肝星細胞への分化誘導系の樹立に成功している（特許文献１；非特許文献１）。しかしながら、誘導した肝星細胞は、現在市販され、入手可能な初代培養肝星細胞と同様に、すでに活性化しているか又は培養直後から活性化してしまうことが明らかとなっているため、線維症治療薬などの創薬の研究及び開発の有用ツールにはなっていない。そこで、肝星細胞の活性化過程を培養系で反映する創薬スクリーニング系の開発が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１６／１４８２１６号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Koui, Y., et al., Stem. Cell. Rep., 2017, 9, 490-498
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記の通り、市販の初代培養星細胞は既に活性化しており、そもそもヒト生体から創薬スクリーニング系の構築に十分な静止期肝星細胞を多量に得ることは不可能である。したがって、本発明は、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）から静止期肝星細胞への分化誘導系の樹立と、その活性化制御系の開発を目的する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、従来のｉＰＳ細胞を分化誘導して肝星細胞を得る方法を改良することにより、ｉＰＳ細胞から静止期を安定に保持した肝星細胞を得ることに成功し、本発明を完成することに成功した。
【0009】
すなわち本発明は、以下の態様を有する。
［１］多能性幹細胞を分化誘導して静止期肝星細胞を調製する方法であって、多能性幹細胞を三次元培養する工程、及び／又は低酸素濃度で培養する工程を含む調製方法。
［２］
培養０～６日目まで約４％Ｏ２の存在下で多能性幹細胞を培養する、上記［１］に記載の調製方法。
［３］
培養６日目以降、Ｏ２濃度を大気中と同一にして培養を行う、上記［２］に記載の調製方法。
［４］
三次元培養が、スフェロイド培養、浮遊培養又はゲル培養である、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の調製方法。
［５］
Ｒｏｃｋ阻害剤を添加する工程を含む、上記［１］～［４］のいずれか１つに記載の調製方法。
［６］
分化誘導前に多能性幹細胞にレポーター遺伝子を組み込む工程をさらに含む、上記［１］～［５］のいずれか１つに記載の調製方法。
［７］
分化誘導過程又は分化誘導後にレポーター遺伝子を静止期肝星細胞に組み込む工程をさらに含む、上記［１］～［５］のいずれか１つに記載の調製方法。
［８］
上記［１］～［７］のいずれか１つに記載の方法で調製された静止期肝星細胞。
［９］
上記［８］に記載の静止期肝星細胞を含む細胞懸濁液。
［１０］
肝星細胞の活性化を抑制する被験物質を、線維化を伴う肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法であって、
（ａ）上記［６］又は［７］に記載の方法で調製された、レポーター遺伝子が導入された静止期肝星細胞を培養し；
（ｂ）上記静止期肝星細胞の培養系に静止期肝星細胞を活性化する薬物を添加するか、又は上記静止期肝星細胞を回収及び再播種して二次元培養することによって、静止期肝星細胞を活性化して、活性化肝星細胞を得て；
（ｃ）活性化肝星細胞の培養系に被験物質を添加し；
（ｄ）レポーター遺伝子の発現量を被験物質の添加前後で比較し；及び
（ｅ）被験物質の添加後にレポーター遺伝子の発現量が減少している場合に、肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法。
［１１］
上記［１０］に記載のスクリーニング法に使用するためのキットであって、上記［８］に記載の静止期肝星細胞又は上記［９］に記載の細胞懸濁液を含むキット。
［１］多能性幹細胞を分化誘導して静止期肝星細胞を調製する方法であって、多能性幹細胞を三次元培養する工程、及び／又は低酸素濃度で培養する工程を含む調製方法。
［２］
培養０～６日目まで約４％Ｏ２の存在下で多能性幹細胞を培養する、上記［１］に記載の調製方法。
［３］
培養６日目以降、Ｏ２濃度を大気中と同一にして培養を行う、上記［２］に記載の調製方法。
［４］
三次元培養が、スフェロイド培養、浮遊培養又はゲル培養である、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載の調製方法。
［５］
Ｒｏｃｋ阻害剤を添加する工程を含む、上記［１］～［４］のいずれか１つに記載の調製方法。
［６］
分化誘導前に多能性幹細胞にレポーター遺伝子を組み込む工程をさらに含む、上記［１］～［５］のいずれか１つに記載の調製方法。
［７］
分化誘導過程又は分化誘導後にレポーター遺伝子を静止期肝星細胞に組み込む工程をさらに含む、上記［１］～［５］のいずれか１つに記載の調製方法。
［８］
上記［１］～［７］のいずれか１つに記載の方法で調製された静止期肝星細胞。
［９］
上記［８］に記載の静止期肝星細胞を含む細胞懸濁液。
［１０］
肝星細胞の活性化を抑制する被験物質を、線維化を伴う肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法であって、
（ａ）上記［６］又は［７］に記載の方法で調製された、レポーター遺伝子が導入された静止期肝星細胞を培養し；
（ｂ）上記静止期肝星細胞の培養系に静止期肝星細胞を活性化する薬物を添加するか、又は上記静止期肝星細胞を回収及び再播種して二次元培養することによって、静止期肝星細胞を活性化して、活性化肝星細胞を得て；
（ｃ）活性化肝星細胞の培養系に被験物質を添加し；
（ｄ）レポーター遺伝子の発現量を被験物質の添加前後で比較し；及び
（ｅ）被験物質の添加後にレポーター遺伝子の発現量が減少している場合に、肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法。
［１１］
上記［１０］に記載のスクリーニング法に使用するためのキットであって、上記［８］に記載の静止期肝星細胞又は上記［９］に記載の細胞懸濁液を含むキット。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、ｉＰＳ細胞から、活性化されていない静止期にある肝星細胞を調製することが可能である。得られた肝硬変などの肝線維化を伴う肝疾患治療用の創薬をスクリーニングし、治療薬を評価する系に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図2】図２は、ヒトｉＰＳ細胞からの静止期肝星細胞への分化過程において、未分化マーカー遺伝子（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ）、中胚葉マーカー遺伝子（ＭＥＳＰ１、Ｔ）、及び横中隔間充織／肝星細胞マーカー遺伝子（ＨＬＸ、ＬＨＸ２、ＦＯＸＦ１）の経時的な発現を解析した結果を示す。
【図3】図３は、Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）の培養系への添加の有無による、ヒトｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞への分化誘導効果を示す図である。図中、ＮＧＦＲ及びＬＲＡＴは、静止期肝星細胞のマーカー遺伝子であり、ＡＣＴＡ２及びＣＯＬ１Ａ１は、活性化された肝星細胞のマーカー遺伝子である。
【図4】図４は、ヒトｉＰＳ細胞の静止期肝星細胞の分化誘導における培養中の酸素濃度を検討した実験方法とその結果を示す。分化誘導開始後の１～６日目まで酸素濃度を４％とし、６日目以降は、酸素濃度を４％に維持した場合と２０％（大気中の酸素濃度に対応する）に変更した場合で比較した。比較検討は、活性化された肝星細胞のマーカー遺伝子である、ＡＣＴＡ２及びＣＯＬ１Ａ１の相対的発現について行った。
【図5】図５は、分化誘導開始後の８日目に、ＮＧＦＲ＋細胞（「ｐｏｓｉ」）及びＮＧＦＲ－細胞（「ｎｅｇａ」）をそれぞれＭｏＦＬｏ ＸＤＰ セルソーターにより分離し、各群の遺伝子発現を検討した結果を示す。図中、「ｂｕｌｋ」は、セルソーターによる分離前の細胞群を指す。
【図7】図７は、従来法により調製したｉＰＳ細胞由来の肝星細胞（「Ｖｅｒ．１」）と本発明の方法により調製したｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞（「Ｖｅｒ．２」）における各遺伝子発現を比較検討した結果を示す。
【図11】図１１は、ｉＰＳ細胞から静止期肝星細胞を分化誘導し、活性化能を評価した結果を示す。左下図は、培養系における活性化星細胞マーカーの遺伝子発現を示し、中央図は、活性化５日後にａＳＷＡ染色した画像を示し、右下図は、培地上清中に分泌されるプロコラーゲン１ａを定量した結果を示す。
【図12】図１２は、ｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞の活性化に伴い、活性化肝星細胞マーカー遺伝子（ＡＣＴＡ２）の活性化を可視化するための手法を示す。図中、「ＲＦＰ」は、赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を示し、「２Ａ」は、ウイルス由来の２０アミノ酸残基前後のペプチド配列をコードする介在配列を示す。
【図15】図１５は、図１４で示した評価法を用いて、肝星細胞の活性化を増強する薬剤（ＴＧＦｂ）及び活性化を抑制する薬剤（Ａ８３－０１、ＩＣＧ－００１）による活性化マーカー遺伝子の発現を検討した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、多能性幹細胞を分化誘導して、ＮＧＦＲ陽性の表現型を指標として静止期肝星細胞を分取する工程を含む、静止期肝星細胞の調製方法に関する。また、得られた静止期肝星細胞にレポーター遺伝子を導入し、肝硬変などの肝線維化を伴う肝疾患を治療するための薬剤をスクリーニングするための方法に関する。本発明を以下に詳細に説明する。
【0013】
１．多能性幹細胞由来の静止期肝星細胞の作製
（１）多能性幹細胞
本明細書において「多能性幹細胞」とは、自己複製能と多分化能を有する細胞であり、生体を構成するあらゆる細胞を形成する能力を備える細胞をいう。「自己複製能」とは、１つの細胞から自分と同じ未分化な細胞を作る能力のことをいう。「分化能」とは、細胞が分化する能力をいう。多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ）、精子幹細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）などが含まれるが、これらに限定されない。本発明に用いる多能性幹細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞である。なお、多能性幹細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類及び両生類のいずれでもよく、特に限定されない。哺乳動物は、霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレットなどを含む。より好ましくはヒトである。
（１）多能性幹細胞
本明細書において「多能性幹細胞」とは、自己複製能と多分化能を有する細胞であり、生体を構成するあらゆる細胞を形成する能力を備える細胞をいう。「自己複製能」とは、１つの細胞から自分と同じ未分化な細胞を作る能力のことをいう。「分化能」とは、細胞が分化する能力をいう。多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ）、精子幹細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）などが含まれるが、これらに限定されない。本発明に用いる多能性幹細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞である。なお、多能性幹細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類及び両生類のいずれでもよく、特に限定されない。哺乳動物は、霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレットなどを含む。より好ましくはヒトである。
【0014】
本発明において「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞に初期化因子を導入することにより体細胞を未分化状態へと初期化し、多能性を付与した培養細胞をいう。初期化因子としては、例えば、ＯＣＴ３／４及びＫＬＦ４及びＳＯＸ２及びｃ－Ｍｙｃを用いることができ（Ｙｕ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７；３１８：１９１７－２０）、上記４遺伝子からｃ－Ｍｙｃを除く３遺伝子（後述するＴｋＤＮ４－Ｍ、２５３Ｇ１）、また、ＯＣＴ３／４及びＳＯＸ２及びＬＩＮ２８及びＮａｎｏｇを用いることができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００７；１３１：８６１－７２）。これらの因子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入、タンパク質として直接導入などが挙げられる。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡやＲＮＡ、低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。また、拒絶反応が起きにくいとされるＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）型の組み合わせ（ＨＬＡホモ接合体）を持つ健常人ボランティア由来の細胞から作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。ｉＰＳ細胞を始めとする多能性幹細胞は、市販品又は分譲を受けた細胞を用いてもよく、新たに作製したものを用いてもよい。ｉＰＳ細胞として、例えば、２５３Ｇ１株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、ＴｋＤＮ４－Ｍ株、ＴｋＤＡ３－１株、ＴｋＤＡ３－２株、ＴｋＤＡ３－４株、ＴｋＤＡ３－５株、ＴｋＤＡ３－９株、ＴｋＤＡ３－２０株、ｈｉＰＳＣ ３８－２株、ＭＳＣ－ｉＰＳＣ１株、ＢＪ－ｉＰＳＣ１株等を使用することができる。新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞を用いてもよい。ｉＰＳ細胞を作製する際の細胞の由来は特に限定されないが、例えば、繊維芽細胞又はリンパ球等を用いることができる。
【0015】
（２）肝星細胞
本発明において「肝星細胞」とは、典型的には、肝臓に存在する、ビタミンＡ貯蔵能を有する星状の線維芽細胞様細胞を指し、休眠状態（静止期）又は活性化状態であってもよい。本明細書では、休眠状態（静止期）にある肝星細胞を特に「静止期肝星細胞」と記載し、活性化状態にある肝星細胞と区別する。通常、休眠状態の肝星細胞であっても、臓器の構造の正常な組織化に重要な結合組織を形成するためにコラーゲンなどの細胞外基質を産生する。一方、肝星細胞が活性化されると、肝星細胞は、大量で過剰のコラーゲンや炎症性分子を産生するようになる。
本発明において「肝星細胞」とは、典型的には、肝臓に存在する、ビタミンＡ貯蔵能を有する星状の線維芽細胞様細胞を指し、休眠状態（静止期）又は活性化状態であってもよい。本明細書では、休眠状態（静止期）にある肝星細胞を特に「静止期肝星細胞」と記載し、活性化状態にある肝星細胞と区別する。通常、休眠状態の肝星細胞であっても、臓器の構造の正常な組織化に重要な結合組織を形成するためにコラーゲンなどの細胞外基質を産生する。一方、肝星細胞が活性化されると、肝星細胞は、大量で過剰のコラーゲンや炎症性分子を産生するようになる。
【0016】
静止期肝星細胞と活性化された肝星細胞の区別は、各肝星細胞に主に発現するタンパク質産生や遺伝子発現を測定することにより可能である。各肝星細胞の遺伝子発現の有無や比較検討する場合、それぞれの遺伝子に固有のマーカー遺伝子を用いて、そのｍＲＮＡ発現を測定する方法が使用され得る。遺伝子発現量を定量及び分析には、限定されないが、定量ＲＴ－ＰＣＲが簡便な方法である。
【0017】
本発明によれば、ｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞の遺伝子発現の指標として、限定されないが、ＮＧＦＲ、及び／又はＮＧＦＲと同時期に発現する遺伝子の機能（例えば、ＬＲＡＴ、ＮＥＳ、ＨＧＦ、及びＣＹＧＢなど）を使用することにより静止期肝星細胞を分取することができる。本明細書において、上記のタンパク質又は遺伝子を「静止期マーカー」と称することがある。「ＮＧＦＲ」は、Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（神経栄養因子受容体）の略であり、「ＬＲＡＴ」は、レチノールエステル化酵素であるＬｅｃｉｔｈｉｎ Ｒｅｔｉｎｏｌ Ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（レシチン－レチノールアシルトランスフェラーゼ）の略であり、「ＮＥＳ」は、Ｎｅｓｔｉｎ（ネスチン）であり、「ＨＧＦ」は、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（肝細胞増殖因子）の略であり、「ＣＹＧＢ」は、Ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ（サイトグロビン）の略である。一方、上記静止期肝星細胞が活性化された場合に細胞に発現する線維化関連遺伝子マーカーとして、限定されないが、ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１など（本明細書において、「活性化マーカー」と称することがある）を使用することができる。「ＡＣＴＡ２」は、α－平滑筋アクチン２であり、「ＣＯＬ１Ａ１」は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｔｙｐｅ Ｉ，Ａｌｐｈａ １（Ｉ型コラーゲンα１）の略である。また、多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞を使用する場合、分化の過程は、各段階に特異的に発現する遺伝子を指標として観察することができる。例えば、未分化マーカー遺伝子として、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧが挙げられ、中胚葉マーカー遺伝子として、ＭＥＳＰ１及びＴが挙げられ、横中隔間充織／肝星細胞マーカー遺伝子として、ＨＬＸ、ＬＨＸ２、ＦＯＸＦ１が挙げられる。なお、静止期肝星細胞と活性化された肝星細胞のそれぞれのマーカー遺伝子の発現量を比較した場合、静止期肝星細胞における「活性化マーカー」の発現は、活性化された肝星細胞の同マーカーの発現量と比較して低く、例えば、９９％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、０％であることが好ましい。一方、活性化された肝星細胞における「静止期マーカー」の発現は、静止期肝星細胞の同マーカーの発現量と比較して低く、例えば、９９％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、０％であることが好ましい。また、活性化された後の肝星細胞の活性化マーカーの発現量は、活性化前の同細胞のマーカーの発現量と比較して高いことが好ましく、限定されないが、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、５００倍、１０００倍などであってもよい。
【0018】
定量ＲＴ－ＰＣＲで使用され得るプライマーは、以下の通りである。
【表1】
【0019】
（３）多能性幹細胞から静止期肝星細胞への分化誘導法
本発明は、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）を分化誘導して静止期肝星細胞を調製する方法であって、多能性幹細胞を三次元培養する工程、及び／又は低酸素濃度で培養する工程を含む調製方法を提供する。本発明は、多能性幹細胞を三次元培養することによって静止期肝星細胞を分化誘導することができる。ここで、「三次元培養」とは、当業者が一般的に使用される意味を有するが、例えば、スフェロイド培養、浮遊培養、又はゲル培養などの培養形態を含むことができる。また、「ゲル培養」とは、ゲル状基質中で細胞を培養する方法であって、ゲル状基質自体は、細胞に親和性のあるものであってもよく、又は親和性がないものであってもよい。また、上記の三次元培養とともに又は独立して、多能性幹細胞を低酸素濃度で培養することによっても静止期肝星細胞を分化誘導することができる。低酸素の濃度及び培養時期などについては、後述する。
本発明は、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）を分化誘導して静止期肝星細胞を調製する方法であって、多能性幹細胞を三次元培養する工程、及び／又は低酸素濃度で培養する工程を含む調製方法を提供する。本発明は、多能性幹細胞を三次元培養することによって静止期肝星細胞を分化誘導することができる。ここで、「三次元培養」とは、当業者が一般的に使用される意味を有するが、例えば、スフェロイド培養、浮遊培養、又はゲル培養などの培養形態を含むことができる。また、「ゲル培養」とは、ゲル状基質中で細胞を培養する方法であって、ゲル状基質自体は、細胞に親和性のあるものであってもよく、又は親和性がないものであってもよい。また、上記の三次元培養とともに又は独立して、多能性幹細胞を低酸素濃度で培養することによっても静止期肝星細胞を分化誘導することができる。低酸素の濃度及び培養時期などについては、後述する。
【0020】
別の態様によれば、これまでに本発明者らは、Ｒｏｃｋ阻害剤を用いてｉＰＳ細胞から肝星細胞を分化誘導する方法を報告している（国際公開第２０１６／１４８２１６号；Ｋｏｕｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｐ．，２０１７，９，４９０－４９８を参照されたい）。本発明によれば、従前の方法と同様にＲｏｃｋ阻害剤を使用するが、培養系に添加する時期を変更することにより、これまで得ることができなかったｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞を得ることに成功した。
【0021】
本発明は、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）を分化誘導して、ＮＧＦＲ陽性の表現型を指標として静止期肝星細胞を分取する工程を含む、静止期肝星細胞を調製する方法を提供する。本発明によれば、多能性幹細胞を分化誘導開始後の４日目からＲｏｃｋ阻害剤を添加することにより、所望の静止期肝星細胞を得ることができる。公知のｉＰＳ細胞から肝星細胞を分化誘導は、分化誘導開始後の６日目からＲｏｃｋ阻害剤を添加するものであるが、そこで得られる肝星細胞は、マーカー遺伝子の発現を検討すると、活性化された肝星細胞であった。後述する実施例２において、本発明により得られた肝星細胞は、従来の方法によって得られた肝星細胞と比較して、静止期肝星細胞に見られる遺伝子発現が顕著であり、さらに、活性化された肝星細胞に見られる遺伝子発現が観察することができない。また、初代培養肝星細胞との比較によっても同様の結果が得られた（実施例３）。このように、Ｒｏｃｋ阻害剤を添加する開始時期としては、分化誘導開始から６日目になる以前の４～５日目が好ましい。
【0022】
多能性幹細胞から肝星細胞を分化誘導するために使用される上記のＲｏｃｋ阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：Ｒｏｃｋ）を阻害する薬剤を指す。「Ｒｈｏキナーゼ」は、低分子量ＧＴＰ結合蛋白Ｒｈｏの標的蛋白質として同定されたセリン－スレオニン蛋白リン酸化酵素であり、平滑筋収縮や細胞の形態変化など様々な生理機能に関与していることが知られている。ここで、使用可能なＲｏｃｋ阻害剤としては、特に限定されず、低分子化合物、抗体、またはアンチセンス化合物などの形態のものであってもよい。例えば、Ｙ２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド）、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）（ヘキサヒドロ－１－（５－イソキノリンスルホニル）－１Ｈ－１，４－ジアゼピン）、Ｈ－１１５２（（Ｓ）－（＋）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スフホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン）などが挙げられる。好ましくは、Ｙ２７６３２である。また、Ｒｏｃｋ阻害剤を培地に添加する際の濃度は、当業者であれば適宜、選択可能である。例えば、Ｙ２７６３２を使用する場合、培地への添加濃度は、０．１～５０μＭ、好ましくは１～３０μＭ、より好ましくは５～２０μＭ、さらにより好ましくは１０μＭである。
【0023】
上記の通り、Ｒｏｃｋ阻害剤の添加を開始する時期は、誘導開始後の４日目が好ましいが、それに先行して、誘導開始の直後（０日目）～１日目にもＲｏｃｋ阻害剤を適宜添加することができる。この点においては、従来の誘導化法と相違しない。本発明によれば、多能性幹細胞から分化誘導して所望の静止期肝星細胞を得ることできる限りにおいて、培養系に添加されるＲｏｃｋ阻害剤以外の各種添加剤の種類、濃度、添加時期、及び添加剤の組み合わせは限定されない。このような添加剤としては、限定されないが、ＢＭＰ４（多能性幹細胞を中胚葉に分化誘導させる因子）、ＡｃｔＡ（アクチビンＡ）、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ－β阻害剤）、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）（ＢＭＰ阻害剤）などが挙げられる。ＢＭＰ４について、培地への添加時期は、誘導開始の直後（０日目）～４日目が好ましく、添加濃度は、限定されないが、０．５～５０ｎｇ／ｍｌ、１～４０ｎｇ／ｍｌ、２～３０ｎｇ／ｍｌなどが例示され、添加時期により、添加濃度を変更してもよい。例えば、１～４日目のＢＭＰ４の添加濃度は、０～１日目までの添加濃度と比べて高くてもよい。ＡｃｔＡについて、培地への添加時期は、誘導開始の１～４日目が好ましく、添加濃度は、限定されないが、１～２０ｎｇ／ｍｌ、２～１０ｎｇ／ｍｌ、３～５ｎｇ／ｍｌなどが例示される。ＡｃｔＡについて、培地への添加時期は、誘導開始の１～４日目が好ましく、添加濃度は、限定されないが、１～２０ｎｇ／ｍｌ、２～１０ｎｇ／ｍｌ、３～５ｎｇ／ｍｌなどが例示される。ｂＦＧＦについて、培地への添加時期は、誘導開始の１～４日目が好ましく、添加濃度は、限定されないが、１～２０ｎｇ／ｍｌ、２～１０ｎｇ／ｍｌ、３～５ｎｇ／ｍｌなどが例示される。ＶＥＧＦについて、培地への添加時期は、誘導開始の４～６日目が好ましく、添加濃度は、限定されないが、１～３０ｎｇ／ｍｌ、３～２０ｎｇ／ｍｌ、５～１５ｎｇ／ｍｌなどが例示される。ＳＢ４３１５４２について、培地への添加時期は、誘導開始の４日目以降が好ましく、添加濃度は、限定されないが、１～１５μＭ、２～１０μＭ、３～７μＭなどが例示される。ドルソモルフィンについて、培地への添加時期は、誘導開始の４日目以降が好ましく、添加濃度は、限定されないが、０．０５～５μＭ、０．１～３μＭ、０．３～１μＭなどが例示される。上記の添加剤の添加濃度は、列挙した数値の範囲内に含まれる任意の数値であってもよく、例えば、「１～２０ｎｇ／ｍｌ」では、１、２、３、４、５、１．５、３．５などが含まれる。また、多能性幹細胞から分化誘導して所望の静止期肝星細胞を得る過程において、細胞を培養する細胞培養液は、当業者であれば適宜、選択可能である。例示的な態様において、ｉＰＳ細胞を分化誘導して静止期肝星細胞を作製する方法は、典型的には、図１に示される通りである。具体的には、Ｓｔｅｍｐｒｏ－３４ ＳＦＭを基本培地として、誘導開始０日から１日に１０μＭのＹ２７６３２、２ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を添加し、誘導開始１日～４日に５ｎｇ／ｍｌのＡｃｔＡ（アクチビンＡ）、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を加え、誘導開始４日から６日に１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、５．４μＭのＳＢ４３１５４２、０．５μＭのドルソモルフィン、及び１０μＭのＹ２７６３２を加えることで行う。この条件で８日目まで培養し、ＮＧＦＲ陽性細胞を分取して静止期肝星細胞を得ることができる。
【0024】
一般的に、細胞を培養する酸素（Ｏ２）濃度は、大気中のＯ２濃度（約２０％）と同程度であるが、本発明の誘導化方法では、誘導開始（０日目）～６日目までＯ２濃度を４％とすることを特徴とする。人為的な培養操作などにより、インキュベーター内のＯ２濃度を厳密に４％に一定に維持することは困難な場合もあるため、ごく限定された時間、Ｏ２濃度が上昇し得ることもある。後述する実施例１に記載されるように、６日目以降にＯ２濃度を４％に維持して培養を持続した場合と、６日目以降にＯ２濃度を２０％にして培養した場合では、高Ｏ２濃度の環境下での培養により、肝星細胞の活性化が抑制されることも見出された。したがって、本発明において、静止期肝星細胞への分化誘導化では、上述してＲｏｃｋ阻害剤の添加時期のみならず、培養中のＯ２濃度を上昇させることも重要な要素であると言える。
【0025】
多能性幹細胞のうち、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、体性幹細胞などは浮遊培養に適しており、培養経過とともに細胞塊を形成する。したがって、このような細胞の培養では、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）、ハイドロゲル、ＭＰＣ（２－Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｅｔｈｙｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｃｈｏｌｉｎｅ）ポリマーなどで表面がコーティングされた低接着性の培養器や、コラーゲンなどの細胞接着分子でコーティングされていない非接着性の培養器上で細胞を浮遊培養（スフェロイド形成）することにより行うことができる。上記低接着性の培養器や非接着性の培養器は、市販のものであってもよく、又は研究室において調製したものであってもよい。さらには、市販の低接着性の培養器としては、例えば、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（スフェロイド形成培養用容器）（ＩＷＡＫＩ社）、ＶＥＣＥＬＬ（登録商標）プレート（ベセル株式会社）、ＮＣＰ（ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ）（ＳＣＩＶＡＸ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＵＬＡ（超低接着表面）培養容器（ＣＯＲＮＩＮＧ社）を挙げることができ、市販の非接着性の培養器としては、例えば、浮遊培養用ペトリディッシュ（Ｎｕｎｃ社製）、浮遊細胞培養用シャーレ（住友ベークライト社）、ノントリートメントプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社）の市販品を挙げることができる。なお、各種培養器への細胞の播種濃度は、適宜調整可能であり、例えば、９６ウェルタイプの培養用容器を使用する場合、例えば、１×１０３～１×１０６細胞／ウェル、好ましくは５×１０３～５×１０５細胞／ウェル、より好ましくは１×１０４～１×１０５細胞／ウェルで播種され得る。
【0026】
本発明によれば、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）を分化誘導して静止期肝星細胞を作製する場合、分化誘導の最終段階（例えば、誘導開始から８日目）でＮＧＦＲ陽性の表現型を指標として静止期肝星細胞を分取することができる。ＮＧＦＲ陽性の表現型を指標として静止期肝星細胞を分取する工程は、特に限定されないが、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ；ＦＡＣＳ）又は磁気細胞ソーティング（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）により行うことができる。また、本発明によれば、静止期肝星細胞の分取には、上記のソーティングに限定されず、細胞の自家蛍光に基づいて、又は遠心分離によっても可能である。例えば、ＬＲＡＴ陽性期では、ビタミンの取り込みに起因して、細胞が自家蛍光を発することから蛍光を検出する手段を用いて分取し、指標とすることもできる。
【0027】
上記の通り、本発明の静止期肝星細胞は、ＮＧＦＲ陽性の表現型を指標として分取されるものであるが、静止期肝星細胞の使用では、該静止期肝星細胞を含む細胞画分であってもよく、例えば、該細胞画分は、全細胞に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の静止期肝星細胞を含む。また、別の態様では、上記の分取後に得られた細胞画分中の静止期肝星細胞と活性化された肝星細胞との存在比は、活性化された肝星細胞よりも静止期肝星細胞が多く存在すれば特に限定されないが、例えば、５１：４９、５５：４５、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９７：３、９８：２、９９：１、１００：０などであり得る。
【0028】
なお、本発明の方法によって得られた静止期肝星細胞は、適切な容器中で、細胞培養液、細胞懸濁液、細胞保存液、ハイドロゲルに含有させて提供され得る。さらに、該静止期肝星細胞は、凍結保存され得、例えば、－８０℃で、３か月以上、６か月以上、９か月以上、又は１２か月以上凍結保存することが可能である。凍結後、解凍した後における本発明の静止期肝星細胞は、活性化されておらず、静止期を維持し得る。
【0029】
２．レポーター遺伝子を導入した静止期肝星細胞の作製
肝星細胞の活性化が一因となって生じる肝硬変や肝線維化を伴う肝疾患症を治療及び予防するための薬剤をスクリーニングする方法が提供される。本発明によれば、上述したように、活性化された肝星細胞は、ＡＣＴＡ２及びＣＯＬ１Ａ１が遺伝子マーカーとして検出され得るため、これらの遺伝子の発現量を決定してもよく、又はこれらの遺伝子自体の発現量を決定する代わりに、導入したレポーター遺伝子の発現量を測定し、若しくはその発現を可視化してもよい。後述するスクリーニング法に使用される肝星細胞は、上記遺伝子マーカーの発現に付随して機能発現するレポーター遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞であり得る。
肝星細胞の活性化が一因となって生じる肝硬変や肝線維化を伴う肝疾患症を治療及び予防するための薬剤をスクリーニングする方法が提供される。本発明によれば、上述したように、活性化された肝星細胞は、ＡＣＴＡ２及びＣＯＬ１Ａ１が遺伝子マーカーとして検出され得るため、これらの遺伝子の発現量を決定してもよく、又はこれらの遺伝子自体の発現量を決定する代わりに、導入したレポーター遺伝子の発現量を測定し、若しくはその発現を可視化してもよい。後述するスクリーニング法に使用される肝星細胞は、上記遺伝子マーカーの発現に付随して機能発現するレポーター遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞であり得る。
【0030】
導入可能なレポーター遺伝子としては、限定されないが、蛍光タンパク質遺伝子（赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質など）、ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）、ベータ－ガラクトシダーゼ遺伝子（ｂｅｔａ－ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ遺伝子（ＡＰ）、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）、ベータグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）などが挙げられる。
【0031】
細胞へのレポーター遺伝子の導入法は、ゲノム編集技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（Ｃｏｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９，８１９－８２３）、ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）（Ｃｅｒｍａｋ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１１，３９：ｅ８２）、ＺＦＮ（Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）（Ｋｉｍ，Ｙ．－Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３：１１５６－１１６０）などの当業者にとって公知の遺伝子改変技術を用いて行うことができる。また、より一般的な遺伝子導入法として、レポーター遺伝子を組み込んだベクターを導入する方法を用いてもよく、ベクターを用いた遺伝子導入としては、限定されないが、ウイルス性又は非ウイルス性遺伝子導入（例えば、プラスミド導入、ファージインテグラーゼ、トランスポゾン、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びレンチウイスルなど）が挙げられる。
【0032】
遺伝子マーカーとレポーター遺伝子の遺伝子の組み合わせは、特に限定されず、例えば、ＡＣＴＡ２－ＲＦＰ、ＡＣＴＡ２－ｌｕｓ、ＣＯＬ１Ａ１－ＬａｃＺなどであってもよい。また、遺伝子マーカーとレポーター遺伝子の間に適宜、介在配列（例えば、２Ａペプチド配列をコードする遺伝子）を導入してもよい。介在配列を導入する目的は様々である。例えば、２Ａペプチドは、ウイルス由来の２０アミノ酸残基前後のペプチド配列であり、細胞に内在するプロテアーゼ（２Ａペプチダーゼ）により認識され、Ｃ末端から１残基の位置で切断される。２Ａペプチドにより１つのユニットに連結された複数遺伝子（例えば、ＡＣＴＡ２－ＲＦＰ）は、１つのユニットとして転写翻訳された後、２Ａペプチダーゼで切断され得る。
【0033】
本発明の方法によって得られるレポーター遺伝子が導入された肝星細胞が静止期肝星細胞であるかどうかは、各遺伝子マーカーの発現を調べることによって確認することができる。また、本発明のレポーター遺伝子が導入された静止期肝星細胞は、レポーター遺伝子が導入されていない静止期肝星細胞と同様に、細胞画分として提供され得る。
【0034】
なお、本発明の方法によって得られたレポーター遺伝子が導入された静止期肝星細胞は、適切な容器中で、細胞培養液、細胞懸濁液、細胞保存液、ハイドロゲルに含有させて提供され得る。さらに、該レポーター遺伝子が導入された静止期肝星細胞は、凍結保存され得、例えば、－８０℃で、３か月以上、６か月以上、９か月以上、又は１２か月以上凍結保存することが可能である。凍結後、解凍した後における本発明のレポーター遺伝子が導入された静止期肝星細胞は、活性化されておらず、静止期を維持し得る。
【0035】
３．評価モデル及び有効な治療薬のスクリーニング法
本発明の多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来の静止期肝星細胞の培養系は、肝星細胞に起因した肝硬変や肝線維化を伴う肝疾患症を治療及び予防する薬剤（被験物質）の評価モデルとなる。より具体的には、本発明によれば、肝星細胞の活性化を抑制する被験物質を、線維化を伴う肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法が提供され、該スクリーニング法は、
（ａ）レポーター遺伝子が導入された多能性幹細胞由来の静止期肝星細胞を培養し；
（ｂ）上記静止期肝星細胞の培養系に静止期肝星細胞を活性化する薬物を添加するか、又は上記静止期肝星細胞を回収及び再播種して二次元培養することによって、静止期肝星細胞を活性化して、活性化肝星細胞を得て；
（ｃ）活性化肝星細胞の培養系に被験物質を添加し；
（ｄ）レポーター遺伝子の発現量を被験物質の添加前後で比較し；及び
（ｅ）被験物質の添加後にレポーター遺伝子の発現量が減少している場合に、肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含み得る。
本発明の多能性幹細胞（特にｉＰＳ細胞）由来の静止期肝星細胞の培養系は、肝星細胞に起因した肝硬変や肝線維化を伴う肝疾患症を治療及び予防する薬剤（被験物質）の評価モデルとなる。より具体的には、本発明によれば、肝星細胞の活性化を抑制する被験物質を、線維化を伴う肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法が提供され、該スクリーニング法は、
（ａ）レポーター遺伝子が導入された多能性幹細胞由来の静止期肝星細胞を培養し；
（ｂ）上記静止期肝星細胞の培養系に静止期肝星細胞を活性化する薬物を添加するか、又は上記静止期肝星細胞を回収及び再播種して二次元培養することによって、静止期肝星細胞を活性化して、活性化肝星細胞を得て；
（ｃ）活性化肝星細胞の培養系に被験物質を添加し；
（ｄ）レポーター遺伝子の発現量を被験物質の添加前後で比較し；及び
（ｅ）被験物質の添加後にレポーター遺伝子の発現量が減少している場合に、肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含み得る。
【0036】
本発明では、レポーター遺伝子の発現量の比較は、使用されるレポーター遺伝子のタイプに依存するため、定量的に測定された数値の比較であってもよく、また観察された画像の定性的な比較であってもよい。本発明によれば、レポーター遺伝子の発現量が減少した場合に、肝疾患症を治療又は予防するための薬剤に使用される被験物質として選択することを特徴とするが、被験物質を添加後の発現量が、肝星細胞を活性化したときの発現量から少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０、９０％、又は１００％減少していることが好ましい。
【0037】
本明細書で使用するとき、被験物質によって肝疾患症を「治療する」又は「予防する」とは、これらの一般的な用語の意味と同等に使用され得て、例えば、疾患の影響を低減する、無効にする、抑制する、和らげる、疾患の重症度を軽減する、疾患を発症する可能性を減らす、疾患の進行を鈍化させる及び／または疾患を治癒させる、など意味を有する。
【0038】
本発明のスクリーニング法において肝星細胞を活性化し得る薬物としては、限定されないが、ＴＧＦ－β、ＰＤＧＦ、ケモカインなどが挙げられる。後述する実施例６に記載されるように、ｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞をＴＧＦ－βにより活性化した培養系に、被験物質の例として、Ａ８３－０１（ＴＧＦ－β阻害剤）やＩＣＧ－００１（ＷＮＴ阻害剤）を添加することにより、肝星細胞の活性化を抑制することができる。なお、上記の薬物を添加する培養系は、三次元培養系又はゲル培養系であってもよく、又は二次元培養系であってもよい。また、「三次元培養」及び「ゲル培養」なる用語は、上記で定義した通りであり、一方、「二次元培養」なる用語は、当業者が通常、用いる用語と同じ意味を有する。
【0039】
別の態様において、静止期肝星細胞の活性化は、上述の活性化し得る薬物の培養系への添加のみならず、静止期肝星細胞を二次元培養系に播種し、培養することによっても可能である。二次元培養によって活性化された後の肝星細胞の活性化マーカーの発現量は、活性化前の同細胞のマーカーの発現量と比較して高いことが好ましく、限定されないが、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、５００倍、１０００倍などであってもよい。なお、二次元培養に使用する細胞培養基材は、活性化肝星細胞を得ることができる細胞培養基材であれば限定されない。このような細胞培養基材には、細胞に対して硬い底面を有する、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック製やガラス製のプレートやディッシュであってもよい。また、上記の細胞培養基材の培養面（底面）は、コラーゲンなどの細胞接着分子でコーティングされていてもよい。また、二次元培養における細胞の播種濃度は、適宜調整し得る。
【0040】
４．キット
本発明は、肝硬変や肝線維化を伴う肝疾患症を治療及び予防するための薬剤（被験物質）をスクリーニングするのに適したキットが提供される。一態様では、本発明のキットには、本発明のレポーター遺伝子が導入された静止期肝星細胞（又は該細胞を含む細胞培養液など）、静止期肝星細胞を活性化するための薬物（上述）、培養容器、細胞培養培地、キットの使用説明書などが含まれる。
本発明は、肝硬変や肝線維化を伴う肝疾患症を治療及び予防するための薬剤（被験物質）をスクリーニングするのに適したキットが提供される。一態様では、本発明のキットには、本発明のレポーター遺伝子が導入された静止期肝星細胞（又は該細胞を含む細胞培養液など）、静止期肝星細胞を活性化するための薬物（上述）、培養容器、細胞培養培地、キットの使用説明書などが含まれる。
【実施例0041】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【0042】
定量ＲＴ－ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）若しくはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＸＳ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＡＬ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＲＮＡを抽出した。残存しているゲノムＤＮＡを、ＤＮａｓｅＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ１ｏｇｉｅｓ）を用いて消化後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ ｂｉｏ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。定量ＲＴ－ＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ ｂｉｏ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて行い、データはβ－アクチンを標準化コントロールとしてｄｄＣｔ法に従って算出した。
ＴＲＩｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）若しくはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＸＳ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＡＬ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＲＮＡを抽出した。残存しているゲノムＤＮＡを、ＤＮａｓｅＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ１ｏｇｉｅｓ）を用いて消化後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ ｂｉｏ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。定量ＲＴ－ＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ ｂｉｏ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて行い、データはβ－アクチンを標準化コントロールとしてｄｄＣｔ法に従って算出した。
【0043】
実施例１：ｉＰＳ細胞から静止期肝星細胞への分化誘導
（１）静止期肝星細胞の作製
ヒトｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４－Ｍ）（東京大学、Ｔａｋａｙａｍａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０１０，２０７，２８１７－２８３０）をビトロネクチンコート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）したディッシュで培養した。ｉＰＳ細胞をＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてディッシュから剥離し、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でＵｌｔｒａ－ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅへ播種し、胚様体形成培養を行なった。Ｓｔｅｍｐｒｏ－３４ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基本培地として、誘導開始０～１日に２ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、１０μＭ Ｙ２７６３２を添加し、誘導開始１～４日に５ｎｇ／ｍｌ ＡｃｔｉｖｉｎＡ、５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、３０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４を添加した。その後、誘導開始４～８日に１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、５．４μＭ ＳＢ４３１５４２、０．５μＭ Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、１０μＭ Ｙ２７６３２を添加した。なお、誘導開始０～６日は４％酸素濃度環境下で培養し、誘導開始６～８日は２０％酸素濃度環境下で培養した。８日間誘導後、ＭｏＦＬｏ ＸＤＰ セルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ）を用いてＮＧＦＲを発現する静止期肝星細胞を分取した（図１）。また、図１に示した細胞形態の画像から、胚様体が形成されている過程が観察できた。
（１）静止期肝星細胞の作製
ヒトｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４－Ｍ）（東京大学、Ｔａｋａｙａｍａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０１０，２０７，２８１７－２８３０）をビトロネクチンコート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）したディッシュで培養した。ｉＰＳ細胞をＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてディッシュから剥離し、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でＵｌｔｒａ－ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅへ播種し、胚様体形成培養を行なった。Ｓｔｅｍｐｒｏ－３４ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基本培地として、誘導開始０～１日に２ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、１０μＭ Ｙ２７６３２を添加し、誘導開始１～４日に５ｎｇ／ｍｌ ＡｃｔｉｖｉｎＡ、５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、３０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４を添加した。その後、誘導開始４～８日に１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、５．４μＭ ＳＢ４３１５４２、０．５μＭ Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、１０μＭ Ｙ２７６３２を添加した。なお、誘導開始０～６日は４％酸素濃度環境下で培養し、誘導開始６～８日は２０％酸素濃度環境下で培養した。８日間誘導後、ＭｏＦＬｏ ＸＤＰ セルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ）を用いてＮＧＦＲを発現する静止期肝星細胞を分取した（図１）。また、図１に示した細胞形態の画像から、胚様体が形成されている過程が観察できた。
【0044】
（２）静止期肝星細胞分化過程における遺伝子発現解析
ｉＰＳ細胞から分化誘導開始後の０日、１日、４日、６日、８日における未分化マーカー（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ）、中胚葉マーカー（ＭＥＳＰ１、Ｔ）、横中隔間充織／星細胞マーカー（ＨＬＸ、ＬＨＸ２、ＦＯＸＦ１）の遺伝子発現を定量ＲＴ－ＰＣＲによって解析した。未分化マーカーは分化誘導の進行に伴って減少し、中胚葉マーカーは分化誘導中期で高発現し、その後、横中隔間充織／星細胞マーカーは分化誘導後期で高発現した（図２）。この結果から、ｉＰＳ細胞から静止期肝星細胞を分化誘導する本発明の方法が適切なものであることが判明した。
ｉＰＳ細胞から分化誘導開始後の０日、１日、４日、６日、８日における未分化マーカー（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ）、中胚葉マーカー（ＭＥＳＰ１、Ｔ）、横中隔間充織／星細胞マーカー（ＨＬＸ、ＬＨＸ２、ＦＯＸＦ１）の遺伝子発現を定量ＲＴ－ＰＣＲによって解析した。未分化マーカーは分化誘導の進行に伴って減少し、中胚葉マーカーは分化誘導中期で高発現し、その後、横中隔間充織／星細胞マーカーは分化誘導後期で高発現した（図２）。この結果から、ｉＰＳ細胞から静止期肝星細胞を分化誘導する本発明の方法が適切なものであることが判明した。
【0045】
（３）Ｙ２７６３２の効果
誘導開始後の４日目に１０μＭ Ｙ２７６３２を培養系に添加し、Ｙ２７６３２による静止期肝星細胞への分化誘導効果を定量ＲＴ－ＰＣＲによって解析した。肝星細胞マーカー（ＮＧＦＲ、ＬＲＡＴ）は、Ｙ２７６３２の添加によって各マーカー遺伝子の発現が誘導された。一方、活性化肝星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）は、Ｙ２７６３２添加によって発現が抑制された（図３）。この結果から、誘導開始後の４日目にＹ２７６３２を添加することにより、静止期肝星細胞を誘導することができることが分かった。
誘導開始後の４日目に１０μＭ Ｙ２７６３２を培養系に添加し、Ｙ２７６３２による静止期肝星細胞への分化誘導効果を定量ＲＴ－ＰＣＲによって解析した。肝星細胞マーカー（ＮＧＦＲ、ＬＲＡＴ）は、Ｙ２７６３２の添加によって各マーカー遺伝子の発現が誘導された。一方、活性化肝星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）は、Ｙ２７６３２添加によって発現が抑制された（図３）。この結果から、誘導開始後の４日目にＹ２７６３２を添加することにより、静止期肝星細胞を誘導することができることが分かった。
【0046】
（４）酸素濃度の検討
誘導開始後の０～６日における４％の酸素濃度を６日から２０％に変化させる条件によって、活性化肝星細胞マーカー遺伝子の発現に変化が観察されるのかを定量ＲＴ－ＰＣＲにより解析した。図４に示されるように、活性化星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）の発現は、２０％酸素濃度環境下で抑制された。
誘導開始後の０～６日における４％の酸素濃度を６日から２０％に変化させる条件によって、活性化肝星細胞マーカー遺伝子の発現に変化が観察されるのかを定量ＲＴ－ＰＣＲにより解析した。図４に示されるように、活性化星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）の発現は、２０％酸素濃度環境下で抑制された。
【0047】
（５）ＮＧＦＲ陽性細胞のセルソートの効果
８日間の分化誘導後、ＭｏＦＬｏ ＸＤＰ セルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ）を用いてＮＧＦＲを発現する細胞（ｐｏｓｉ）と発現しない細胞（ｎｅｇａ）を回収し、分離前の細胞（ｂｕｌｋ）との遺伝子発現を定量ＲＴ－ＰＣＲで比較した。結果を図５に示す。ＮＧＦＲ陽性細胞（ｐｏｓｉ）では、肝星細胞マーカー（ＮＧＦＲ、ＬＲＡＴ、ＮＥＳ）は高発現したが、活性化肝星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）の発現は極めて低かった。一方、ＮＧＦＲ陰性細胞（ｎｅｇａ）は、活性化肝星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）の発現が高かった。この結果から、ＮＧＦＲの発現の有無により静止期肝星細胞と活性化肝星細胞を区別することができ、ＮＧＦＲが両者の細胞を区別する指標となり得ることが判明した。
８日間の分化誘導後、ＭｏＦＬｏ ＸＤＰ セルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ）を用いてＮＧＦＲを発現する細胞（ｐｏｓｉ）と発現しない細胞（ｎｅｇａ）を回収し、分離前の細胞（ｂｕｌｋ）との遺伝子発現を定量ＲＴ－ＰＣＲで比較した。結果を図５に示す。ＮＧＦＲ陽性細胞（ｐｏｓｉ）では、肝星細胞マーカー（ＮＧＦＲ、ＬＲＡＴ、ＮＥＳ）は高発現したが、活性化肝星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）の発現は極めて低かった。一方、ＮＧＦＲ陰性細胞（ｎｅｇａ）は、活性化肝星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）の発現が高かった。この結果から、ＮＧＦＲの発現の有無により静止期肝星細胞と活性化肝星細胞を区別することができ、ＮＧＦＲが両者の細胞を区別する指標となり得ることが判明した。
【0048】
（６）ｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞の細胞形態
誘導開始から８日目のｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞の形態観察を行った結果を図６に示す。画像からも明らかなように得られた細胞は、通常の肝星細胞と同様に星状の線維芽細胞様形態を示した。
誘導開始から８日目のｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞の形態観察を行った結果を図６に示す。画像からも明らかなように得られた細胞は、通常の肝星細胞と同様に星状の線維芽細胞様形態を示した。
【0049】
実施例２：公知の誘導化法により得たｉＰＳ細胞由来の肝星細胞との比較
従来のｉＰＳ細胞由来の肝星細胞（「Ｖｅｒ．１」）（国際公開第２０１６／１４８２１６号；Ｋｏｕｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｐ．，２０１７，９，４９０－４９８参照）と、実施例１において作製したｉＰＳ細胞由来の肝星細胞（「Ｖｅｒ．２」）における遺伝子発現を定量ＲＴ－ＰＣＲによって解析し、比較検討した。肝星細胞マーカー（ＮＧＦＲ、ＬＲＡＴ、ＮＥＳ）は、実施例１で作製した肝星細胞において高発現し、活性化肝星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）の発現は極めて低かった。一方、従来法により作製した肝星細胞は、活性化肝星細胞マーカーの発現が極めて高かった（図７）。このことから、従来法で作製した肝星細胞は活性化状態であり、実施例１で作製した肝星細胞は静止期にあることが判明した。
従来のｉＰＳ細胞由来の肝星細胞（「Ｖｅｒ．１」）（国際公開第２０１６／１４８２１６号；Ｋｏｕｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｐ．，２０１７，９，４９０－４９８参照）と、実施例１において作製したｉＰＳ細胞由来の肝星細胞（「Ｖｅｒ．２」）における遺伝子発現を定量ＲＴ－ＰＣＲによって解析し、比較検討した。肝星細胞マーカー（ＮＧＦＲ、ＬＲＡＴ、ＮＥＳ）は、実施例１で作製した肝星細胞において高発現し、活性化肝星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）の発現は極めて低かった。一方、従来法により作製した肝星細胞は、活性化肝星細胞マーカーの発現が極めて高かった（図７）。このことから、従来法で作製した肝星細胞は活性化状態であり、実施例１で作製した肝星細胞は静止期にあることが判明した。
【0050】
実施例３：初代培養肝星細胞との比較
実施例１で作製したｉＰＳ細胞由来の肝星細胞（「ｖｅｒ２」）における遺伝子発現と、初代培養肝星細胞の遺伝子発現を定量ＲＴ－ＰＣＲによって比較検討した。初代培養肝星細胞は、Ｌｏｎｚａ社から入手した。実施例２と同様の結果であるが、肝星細胞マーカー（ＮＧＦＲ、ＬＲＡＴ、ＮＥＳ）は、実施例１で作製した肝星細胞で高発現し、活性化肝星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）は極めて低い発現だった（図８）。一方、初代培養肝星細胞では、肝星細胞マーカーは極めて低い発現であり、活性化肝星細胞マーカーの発現は顕著に高かった（図８）。これは、実施例２の結果と同様に、実施例１で作製した肝星細胞は静止期にあり、初代培養肝星細胞は活性化した状態にあることが判明した。
実施例１で作製したｉＰＳ細胞由来の肝星細胞（「ｖｅｒ２」）における遺伝子発現と、初代培養肝星細胞の遺伝子発現を定量ＲＴ－ＰＣＲによって比較検討した。初代培養肝星細胞は、Ｌｏｎｚａ社から入手した。実施例２と同様の結果であるが、肝星細胞マーカー（ＮＧＦＲ、ＬＲＡＴ、ＮＥＳ）は、実施例１で作製した肝星細胞で高発現し、活性化肝星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）は極めて低い発現だった（図８）。一方、初代培養肝星細胞では、肝星細胞マーカーは極めて低い発現であり、活性化肝星細胞マーカーの発現は顕著に高かった（図８）。これは、実施例２の結果と同様に、実施例１で作製した肝星細胞は静止期にあり、初代培養肝星細胞は活性化した状態にあることが判明した。
【0051】
実施例４：ビタミンＡ貯蔵能
実施例１で作製した静止期肝星細胞を培養し、培地に１０μＭ レチノールを添加し、４日間培養した。０．０５％トリプシン／０．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離後、ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーによって細胞内のビタミンＡの自家蛍光を検出した。ＬＸ２（ヒト星細胞株）、初代培養肝星細胞（２ロット（＃１、＃２））、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を比較対照のために、同様の解析を行なった。結果を図９に示す。ＬＸ２及び初代培養肝星細胞と同様に、実施例１で作製した静止期肝星細胞は細胞内にビタミンＡを貯蔵していることから、肝星細胞として機能していることが分かった。
実施例１で作製した静止期肝星細胞を培養し、培地に１０μＭ レチノールを添加し、４日間培養した。０．０５％トリプシン／０．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離後、ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーによって細胞内のビタミンＡの自家蛍光を検出した。ＬＸ２（ヒト星細胞株）、初代培養肝星細胞（２ロット（＃１、＃２））、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を比較対照のために、同様の解析を行なった。結果を図９に示す。ＬＸ２及び初代培養肝星細胞と同様に、実施例１で作製した静止期肝星細胞は細胞内にビタミンＡを貯蔵していることから、肝星細胞として機能していることが分かった。
【0052】
実施例５：静止期肝星細胞の活性化誘導
実施例１で作製した静止期肝星細胞をコラーゲンコートしたプラスチックプレートに播種し、培養した。培養前と５日間の培養後における遺伝子発現を定量ＲＴ－ＰＣＲによって解析した。活性化星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）は培養前と比較して、培養後で顕著に発現が亢進した（図１０）。実施例１で作製した静止期肝星細胞は、生体の静止期肝星細胞と同様に、培養系で活性化を誘導できることが分かった。
実施例１で作製した静止期肝星細胞をコラーゲンコートしたプラスチックプレートに播種し、培養した。培養前と５日間の培養後における遺伝子発現を定量ＲＴ－ＰＣＲによって解析した。活性化星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）は培養前と比較して、培養後で顕著に発現が亢進した（図１０）。実施例１で作製した静止期肝星細胞は、生体の静止期肝星細胞と同様に、培養系で活性化を誘導できることが分かった。
【0053】
追加的に、実施例１で作製した静止期肝星細胞を二次元培養系で活性化を誘導した（図１１）。図１１の左下図は、作製した直後（０日目）、活性化誘導後（１日目、３日目、及び５日目）における肝星細胞の活性化星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、及びＣＯＬ３Ａ１）の遺伝子発現解析の結果を示す。経時的に活性化星細胞マーカーの上昇が確認できた。中央図は、活性化星細胞マーカーであるａＳＭＡ（ＡＣＴＡ２）の発現を免疫染色で確認した画像を示す。右下図は、培養上清中に分泌されるプロコラーゲンα１（Ｐｒｏ－Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ１）をＥＬＩＳＡによって測定した結果である。上記の結果から、遺伝子レベル及びタンパク質レベルで静止期肝星細胞の活性化を証明することができた。
【0054】
実施例６：静止期肝星細胞の活性化に基づく評価系の検証
（１）レポーターｉＰＳ細胞の作製
ヒトｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４－Ｍ）にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いて遺伝子改変を行った。活性化肝星細胞マーカー遺伝子であるＡＣＴＡ２の終止コドンを削り、２Ａペプチドを挟んでＲＦＰを挿入した（図１２及び図１３参照）。これにより、ＡＣＴＡ２－ＲＦＰレポーター遺伝子を有する静止期肝星細胞を得た。
（１）レポーターｉＰＳ細胞の作製
ヒトｉＰＳ細胞（ＴｋＤＮ４－Ｍ）にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いて遺伝子改変を行った。活性化肝星細胞マーカー遺伝子であるＡＣＴＡ２の終止コドンを削り、２Ａペプチドを挟んでＲＦＰを挿入した（図１２及び図１３参照）。これにより、ＡＣＴＡ２－ＲＦＰレポーター遺伝子を有する静止期肝星細胞を得た。
【0055】
（２）レポーターｉＰＳ細胞を用いた肝星細胞活性化評価
ＡＣＴＡ２－ＲＦＰレポーター遺伝子を有するｉＰＳ細胞から静止期肝星細胞を分化誘導した。コラーゲンコートディッシュに播種し、播種翌日に細胞の接着を確認後、培地を交換した。その際、培地に肝星細胞の活性化を増強する薬剤（ＴＧＦｂ）、活性化を抑制する薬剤（Ａ８３－０１、ＩＣＧ－００１）を添加した（図１４参照）。培養前と５日間の培養後における遺伝子発現を定量ＲＴ－ＰＣＲによって解析した（図１５）。活性化星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）は培養前と比較して、培養後で顕著に発現が亢進した。また、ＴＧＦｂの添加によってこれらマーカー遺伝子の発現が増強され、Ａ８３－０１、ＩＣＧ－００１添加によってその発現は抑制された。培養５日後の細胞におけるレポータータンパク質であるＲＦＰの蛍光をＦＶ３０００共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ）で観察した（図１６Ａ）。同時に、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて細胞の核を染色した（図１６Ｂ）。遺伝子発現と相関してＡ８３－０１およびＩＣＧ－００１添加条件ではＲＦＰの蛍光が抑制された。
ＡＣＴＡ２－ＲＦＰレポーター遺伝子を有するｉＰＳ細胞から静止期肝星細胞を分化誘導した。コラーゲンコートディッシュに播種し、播種翌日に細胞の接着を確認後、培地を交換した。その際、培地に肝星細胞の活性化を増強する薬剤（ＴＧＦｂ）、活性化を抑制する薬剤（Ａ８３－０１、ＩＣＧ－００１）を添加した（図１４参照）。培養前と５日間の培養後における遺伝子発現を定量ＲＴ－ＰＣＲによって解析した（図１５）。活性化星細胞マーカー（ＡＣＴＡ２、ＣＯＬ１Ａ１）は培養前と比較して、培養後で顕著に発現が亢進した。また、ＴＧＦｂの添加によってこれらマーカー遺伝子の発現が増強され、Ａ８３－０１、ＩＣＧ－００１添加によってその発現は抑制された。培養５日後の細胞におけるレポータータンパク質であるＲＦＰの蛍光をＦＶ３０００共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ）で観察した（図１６Ａ）。同時に、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて細胞の核を染色した（図１６Ｂ）。遺伝子発現と相関してＡ８３－０１およびＩＣＧ－００１添加条件ではＲＦＰの蛍光が抑制された。
【0056】
追加的に、ＡＣＴＡ２－ＲＦＰレポーター遺伝子を有するｉＰＳ細胞から静止期肝星細胞を作製し、その後、二次元培養系でＲＦＰの発現をＦＶ３０００共焦点レーザー顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ）で経時的に観察した（図１３中、左下図）。未分化なｉＰＳ細胞や活性化誘導直後（１日目）の肝星細胞では、ＲＦＰの発現を認めなかった。さらに、３日目から５日目まで活性化を誘導すると、徐々にＲＦＰの蛍光が強く観察されるようになった。
【0057】
また、５日目まで活性化を誘導した後、フローサイトメトリー解析によりＲＦＰの蛍光発現細胞を解析した。作製した直後の静止期星細胞（０日目）ではＲＦＰを発現する細胞は認められないが、活性化誘導後（５日目）の肝星細胞はほぼ全ての細胞がＲＦＰを発現することが分かった（図１３中、右下図）。これにより、未分化なｉＰＳ細胞や静止期肝星細胞ではＲＦＰを発現せず、活性化することによって徐々にＲＦＰを発現することがわかり、このＡＣＴＡ２－ＲＦＰレポーターｉＰＳ細胞に由来する静止期星細胞の活性化状態をＲＦＰの発現を指標に定量的に評価できることが示された。
【0058】
実施例７：レポーターｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞の活性化評価系を用いた治療薬のスクリーニング系の開発
本実施例では、治療薬のスクリーニング系の妥当性を検証した実験である（以下、「バリデーション」と呼ぶ）。ＡＣＴＡ２－ＲＦＰレポーターｉＰＳ細胞から静止期肝星細胞を作製し、その後、３８４ウェルプレートに播種した。続いて、培養５日後にＨｏｅｃｈｓｔ（核染色液）を添加した。ＦＶ３０００共焦点レーザー顕微鏡を使用して、各ウェルごとにＲＦＰの蛍光とヘキストの蛍光を撮像した（図１７中、左下）。次に、得られた画像に基づいて、画像解析ソフト「ｃｅｌｌＳｅｎｓ」（ＯＬＹＭＰＵＳ）を使用して、ＲＦＰ陽性エリアの面積（肝星細胞の活性化度合い）とＨｏｅｃｈｓｔのドットの数（細胞数）を各ウェルごとに算出した（図１７中、右下）。右下のグラフにおける緑色のドットは、各ウェルにおけるＲＦＰ陽性エリアの面積を示す。ピンク色のドットは、正常のｉＰＳ細胞に由来する肝星細胞を同様な方法で培養した際のＲＦＰ陽性エリアの面積である（したがって、面積はほぼゼロになっている）。グラフに記載されているＣＶ値は、緑色のドットのばらつき度合いを示し、値が小さいほどばらつきが少なく、良いスクリーニング系と言える。Ｚ’－ｆａｃｔｏｒは、スクリーニング系の質を評価する指標の１つであり、データのばらつきや測定値の強度から算出される値である。一般的に、Ｚ’－ｆａｃｔｏｒが０．５以上ならスクリーニング系として妥当であると言える。
本実施例では、治療薬のスクリーニング系の妥当性を検証した実験である（以下、「バリデーション」と呼ぶ）。ＡＣＴＡ２－ＲＦＰレポーターｉＰＳ細胞から静止期肝星細胞を作製し、その後、３８４ウェルプレートに播種した。続いて、培養５日後にＨｏｅｃｈｓｔ（核染色液）を添加した。ＦＶ３０００共焦点レーザー顕微鏡を使用して、各ウェルごとにＲＦＰの蛍光とヘキストの蛍光を撮像した（図１７中、左下）。次に、得られた画像に基づいて、画像解析ソフト「ｃｅｌｌＳｅｎｓ」（ＯＬＹＭＰＵＳ）を使用して、ＲＦＰ陽性エリアの面積（肝星細胞の活性化度合い）とＨｏｅｃｈｓｔのドットの数（細胞数）を各ウェルごとに算出した（図１７中、右下）。右下のグラフにおける緑色のドットは、各ウェルにおけるＲＦＰ陽性エリアの面積を示す。ピンク色のドットは、正常のｉＰＳ細胞に由来する肝星細胞を同様な方法で培養した際のＲＦＰ陽性エリアの面積である（したがって、面積はほぼゼロになっている）。グラフに記載されているＣＶ値は、緑色のドットのばらつき度合いを示し、値が小さいほどばらつきが少なく、良いスクリーニング系と言える。Ｚ’－ｆａｃｔｏｒは、スクリーニング系の質を評価する指標の１つであり、データのばらつきや測定値の強度から算出される値である。一般的に、Ｚ’－ｆａｃｔｏｒが０．５以上ならスクリーニング系として妥当であると言える。
【産業上の利用可能性】
【0059】
本発明によって作製したｉＰＳ細胞由来の静止期肝星細胞を用いた評価系は、線維症治療薬などの創薬の研究及び開発の有用ツールになり得る。
【0060】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】