特開2024-153168熱安定性が向上したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024153168
(43)【公開日】2024-10-29
(54)【発明の名称】熱安定性が向上したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20241022BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20241022BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241022BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241022BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54
C12N9/10 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/21
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023066893
(22)【出願日】2023-04-17
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】野口 惇
(72)【発明者】
【氏名】田島（大熊） 里佳
(72)【発明者】
【氏名】市川 智之
(72)【発明者】
【氏名】寺尾 陽介
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA26X
4B065AA97Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA29
(57)【要約】
【課題】 熱安定性が向上したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素、当該逆転写酵素の製造方法、および当該逆転写酵素を含む核酸増幅試薬を提供すること。
【解決の手段】 ＡＭＶ逆転写酵素を構成するアミノ酸のうち、特定の位置にあるアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、熱安定性が向上したＡＭＶ逆転写酵素を得ることができた。また前記逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで、前記逆転写酵素を製造することができた。
【選択図】 図１
【解決の手段】 ＡＭＶ逆転写酵素を構成するアミノ酸のうち、特定の位置にあるアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、熱安定性が向上したＡＭＶ逆転写酵素を得ることができた。また前記逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで、前記逆転写酵素を製造することができた。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択される、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、以下に示すアミノ酸置換が少なくとも生じている、ＡＭＶ逆転写酵素；
配列番号１の７５１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が少なくとも生じており、さらに前記置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ酵素活性を有するＡＭＶ逆転写酵素；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が少なくとも生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記置換が残存したアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を含み、かつ酵素活性を有するＡＭＶ逆転写酵素。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、以下に示すアミノ酸置換が少なくとも生じている、ＡＭＶ逆転写酵素；
配列番号１の７５１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が少なくとも生じており、さらに前記置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ酵素活性を有するＡＭＶ逆転写酵素；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が少なくとも生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記置換が残存したアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を含み、かつ酵素活性を有するＡＭＶ逆転写酵素。
【請求項2】
請求項１に記載のＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項3】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項4】
請求項３に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項5】
宿主が大腸菌である、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項6】
請求項４に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記逆転写酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。
【請求項7】
請求項１に記載のＡＭＶ逆転写酵素を含む、標的核酸の増幅試薬
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、熱に対する安定性を向上したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素に関する。
【背景技術】
【0002】
逆転写酵素の一つであるトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有しているため、ｃＤＮＡ合成等に必要な遺伝子工学試薬や遺伝子診断試薬などに利用されている。ＡＭＶ逆転写酵素には、分子量約６３ｋＤａのα鎖および分子量約９５ｋＤａのβ鎖の２種類のサブユニットが知られているが、α鎖とβ鎖のヘテロ二量体（αβ体）は、α鎖のみの場合（α体）またはβ鎖のみの場合（β体）と比較して酵素活性が高く、これら試薬の成分として特に有用である（特許文献１）。
【0003】
ＡＭＶ逆転写酵素の反応効率に影響を及ぼす要因のひとつに、ＲＮＡの二次構造があげられる。例えば、ＲＮＡ分子の塩基配列が分子内でハイブリダイズするのに十分な相補性を有し、二本鎖ＲＮＡを形成する場合に、このような二次構造が形成されることがある。一般的に、ＲＮＡ分子を含む反応液の反応温度を上げることによって、ＲＮＡの二次構造の形成を減らし、反応効率を向上させることができる。反応温度の上昇はまた、プライマーのミスアニーリングやプライマーダイマー形成などに起因する非特異的な反応の進行の抑制にも効果的である。そのため、多くの場合、十分に高い温度（一例として、３７℃を超える温度）で反応を行なうことが望ましい。しかしながら、野生型ＡＭＶ逆転写酵素（例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド）は熱に対する安定性が低く、ＲＮＡの二次構造形成や非特異的反応の進行が抑制されるような温度では、酵素活性を失うことがあった。
【0004】
前記課題を解決すべく、α鎖にある特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで熱安定性が向上したＡＭＶ逆転写酵素が知られている（特許文献２）。しかしながら、特許文献２で開示のＡＭＶ逆転写酵素におけるアミノ酸置換は、α体より酵素活性の高いαβ体では熱安定性向上の効果が報告されていない。またα鎖および／またはβ鎖にある特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで熱安定性が向上したαβ体またはβ体のＡＭＶ逆転写酵素も知られている（特許文献３）が、当該逆転写酵素におけるアミノ酸置換でも熱安定性の向上が不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２００３－３３４０９５号公報
【特許文献2】特開２０１３－１６５６６９号公報
【特許文献3】特開２０１４－２０９８９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、熱安定性が向上したトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素、当該逆転写酵素の製造方法、および当該逆転写酵素を含む核酸増幅試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、前記課題を解決するため、鋭意検討した結果、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を構成するアミノ酸残基のうち、特定位置にあるアミノ酸残基を他の特定アミノ酸残基に置換することにより、熱に対する安定性が向上することを見出し、本願発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本願は以下の＜１＞から＜７＞に記載の態様を包含する：
＜１＞以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択される、ＡＭＶ逆転写酵素：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、以下に示すアミノ酸置換が少なくとも生じている、ＡＭＶ逆転写酵素；
配列番号１の７５１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が少なくとも生じており、さらに前記置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ酵素活性を有するＡＭＶ逆転写酵素；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が少なくとも生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記置換が残存したアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を含み、かつ酵素活性を有するＡＭＶ逆転写酵素。
＜１＞以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択される、ＡＭＶ逆転写酵素：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、以下に示すアミノ酸置換が少なくとも生じている、ＡＭＶ逆転写酵素；
配列番号１の７５１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が少なくとも生じており、さらに前記置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつ酵素活性を有するＡＭＶ逆転写酵素；
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が少なくとも生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記置換が残存したアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を含み、かつ酵素活性を有するＡＭＶ逆転写酵素。
【0009】
＜２＞＜１＞に記載のＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド。
【0010】
＜３＞＜２＞に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【0011】
＜４＞＜３＞に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【0012】
＜５＞宿主が大腸菌である、＜４＞に記載の形質転換体。
【0013】
＜６＞＜４＞または＜５＞に記載の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記逆転写酵素を回収する工程とを含む、ＡＭＶ逆転写酵素の製造方法。
【0014】
＜７＞熱安定性が向上した、＜１＞に記載のＡＭＶ逆転写酵素を含む、標的核酸の増幅試薬
【発明の効果】
【0015】
本発明のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、野生型のＡＭＶ逆転写酵素と比較して、残存酵素活性がより高いことを示しており、すなわち野生型のＡＭＶ逆転写酵素と比較して熱安定性が向上していることを特徴としている。このため、遺伝子工学試薬や遺伝子診断試薬で用いる酵素として有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】本発明のＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ、配列番号７）、野生型ＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ ｗｉｌｄ、配列番号１）、および特開２０１４－２０９８９８号公報に記載の耐熱性ＡＭＶ逆転写酵素（四重変異体、ＡＭＶ－ＲＴ＿ｍ４－２、配列番号５）とで、耐熱性を比較した結果を示す図である。なお本図は、熱処理した抽出液中のＡＭＶ逆転写酵素残存量（ＥＬＩＳＡ測定における４５０ｎｍの吸光度）を、それぞれ対応する熱処理なしの抽出液中のＡＭＶ逆転写酵素量を１００％とした相対値で示している。
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0018】
本明細書において、野生型トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ、ＡＭＶ）逆転写酵素とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖、または配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＡＭＶ逆転写酵素α鎖のことをいう。α鎖（配列番号３）は、β鎖（配列番号１）の１番目のスレオニン（Ｔ）から５７２番目のチロシン（Ｙ）までの配列に相当し、天然ではβ鎖のタンパク質分解性プロセシングにより形成される。なお、野生型ＡＭＶ逆転写酵素は、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖単独でもよく、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖単独でもよく、さらには両者からなる任意の複合体やそれらの混合物であってもよい。
【0019】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において、少なくとも配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換が生じていることを特徴としている。
【0020】
本発明において言及されるＡＭＶ逆転写酵素のアミノ酸置換は、野生型ＡＭＶ逆転写酵素β鎖のアミノ酸配列を表す配列番号１を基準として表されるが、配列番号１のアミノ酸配列における所定のアミノ酸置換（配列番号１の７５１番目のアルギニンのヒスチジンへの置換）のみを意図するものではなく、酵素活性を有している限り、前記所定のアミノ酸置換以外に、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加（以下まとめて、「変異」とも表記する）のうち、いずれか１つ以上をさらに有しても良い。本態様の一例として、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＢ３１９２９）に記載のアミノ酸配列のうち、８番目のスレオニン（Ｔ）から８６５番目のアラニン（Ａ）までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドがあげられる。当該ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、以下に示す３箇所のアミノ酸残基の置換が生じたポリペプチド（天然型バリアント（ｖａｒｉａｎｔ））である；
配列番号１の２７３番目（配列番号２では２８０番目）のメチオニン（Ｍ）のアルギニン（Ｒ）への置換、
配列番号１の３０４番目（配列番号２では３１１番目）のグルタミン（Ｑ）のアルギニン（Ｒ）への置換、
配列番号１の３９５番目（配列番号２では４０２番目）のグルタミン酸（Ｅ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換。
配列番号１の２７３番目（配列番号２では２８０番目）のメチオニン（Ｍ）のアルギニン（Ｒ）への置換、
配列番号１の３０４番目（配列番号２では３１１番目）のグルタミン（Ｑ）のアルギニン（Ｒ）への置換、
配列番号１の３９５番目（配列番号２では４０２番目）のグルタミン酸（Ｅ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換。
【0021】
前記変異が生じたＡＭＶ逆転写酵素は、前記所定のアミノ酸置換を含み、かつ酵素活性を有している限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、前記所定のアミノ酸置換が少なくとも生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性があればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。本明細書において相同性とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味し、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等のアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）プログラムを用いて決定できる。例えば、「アミノ酸残基の同一性」とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。
【0022】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素は、その機能を損ねない範囲で、当該酵素のＮ末端および／またはＣ末端にタグペプチドがさらに付加されていてもよい。前記タグペプチドの一例として、分析・精製を容易にするためのタグペプチド（ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグなど）、宿主での分泌発現を促すためのシグナルペプチド（宿主が大腸菌の場合、ＯｍｐＡシグナルペプチド、ＰｅｌＢシグナルペプチドなど）、ベクターの開始コドン（メチオニン）やマルチクローニングサイト（メチオニン－グルタミン酸－フェニルアラニン）由来のペプチドがあげられる。タグペプチドを付加した本発明のＡＭＶ逆転写酵素の一態様として、
配列番号７に記載の配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖のＮ末端にマルチクローニングサイト（メチオニン－グルタミン酸－フェニルアラニン）および開始コドン（メチオニン）を付加したポリペプチドである、配列番号９に記載の配列からなるポリペプチドや、
配列番号７に記載の配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖のＮ末端にヒスチジン６残基を含むヒスチジンタグを付加したポリペプチドである、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。
配列番号７に記載の配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖のＮ末端にマルチクローニングサイト（メチオニン－グルタミン酸－フェニルアラニン）および開始コドン（メチオニン）を付加したポリペプチドである、配列番号９に記載の配列からなるポリペプチドや、
配列番号７に記載の配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖のＮ末端にヒスチジン６残基を含むヒスチジンタグを付加したポリペプチドである、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。
【0023】
ＡＭＶ逆転写酵素は、前述したβ鎖のモノマーやホモダイマー、前述したα鎖のモノマーやホモダイマー、ならびにα鎖とβ鎖とのヘテロダイマー（αβ体）などを構成することが知られているが、本発明のＡＭＶ逆転写酵素はβ鎖を含むものであれば、これらのいずれの形態を有していてもよい。
【0024】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素は、野生型ＡＭＶ逆転写酵素と比較して、「耐熱性である」または「熱安定性が向上している」であることを特徴としているが、すなわち
（ａ）３７℃より高い温度で、酵素活性の半減期がより長い、および／または、
（ｂ）３７℃より高い温度で保持した場合に、残存酵素活性がより高い、
ということである。
（ａ）３７℃より高い温度で、酵素活性の半減期がより長い、および／または、
（ｂ）３７℃より高い温度で保持した場合に、残存酵素活性がより高い、
ということである。
【0025】
本明細書において、酵素活性とは、ＡＭＶ逆転写酵素が有する酵素活性のことを指し、すなわちＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性のことである。
従って、本発明のＡＭＶ逆転写酵素が有する酵素活性は、
ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性のみであってもよく、
ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性であってもよく、
ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性であってもよく、
ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性であってもよい。
中でも本発明のＡＭＶ逆転写酵素が、野生型ＡＭＶ逆転写酵素が有する酵素活性と同じ酵素活性、すなわち、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を全て有していると好ましい。
従って、本発明のＡＭＶ逆転写酵素が有する酵素活性は、
ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性のみであってもよく、
ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性であってもよく、
ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性であってもよく、
ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性であってもよい。
中でも本発明のＡＭＶ逆転写酵素が、野生型ＡＭＶ逆転写酵素が有する酵素活性と同じ酵素活性、すなわち、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性を全て有していると好ましい。
【0026】
前記（ａ）は、例えば、ある態様において、所定の温度、例えば３７℃、好ましくは４５℃、より好ましくは５０℃、より好ましくは５５℃において、野生型ＡＭＶ逆転写酵素よりも酵素活性の半減期がより長いことを指す。
【0027】
前記（ｂ）は、例えば、ある態様において、所定の温度、例えば３７℃、好ましくは４５℃、より好ましくは５０℃、より好ましくは５５℃で一定時間、例えば１分以上、５分以上、１０分以上、２０分以上、３０分以上保持した場合に、野生型ＡＭＶ逆転写酵素よりも残存酵素活性が高いことを指す。
【0028】
本発明において、ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド（以下、単に「本発明のポリヌクレオチド」とも表記）とは、ｍＲＮＡへの転写と転写されたｍＲＮＡの翻訳によって、本発明のＡＭＶ逆転写酵素を製造し得るポリヌクレオチドのことをいう。本発明のポリヌクレオチドは、例えば前述した所定のアミノ酸置換が生じるよう、野生型ＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号４に記載の配列からなるポリヌクレオチド）を改変または変異を導入することで作製できる。ポリヌクレオチドへの変異導入は、例えば当業者に公知の方法である、エラープローンＰＣＲ法、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤または放射線への露出などを適宜使用することで実施できる。本発明のポリヌクレオチドの一例として、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる本発明のＡＭＶ逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの３’末端に終止コドン（ＴＡＡ）を付加した、配列番号８に記載の配列からなるポリヌクレオチドや、当該ポリヌクレオチドに、アミノ酸残基の変化をもたらさないサイレント変異が導入されたポリヌクレオチドがあげられる。
【0029】
本発明のポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入することで本発明の発現ベクターを作製できる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するベクターは、形質転換する宿主内で充分な期間安定に存在し、複製することができるものであれば特に制限はなく、ＡＭＶ逆転写酵素を発現させる宿主を基にして適宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌の場合、ｐＵＣベクター、ｐＥＴベクター、ｐＴｒｃ９９Ａベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＢＢＲベクター、ｐＢＲ３２２ベクターを例示できる。中でもｔｒｃプロモータを有する点で、ｐＴｒｃ９９Ａベクターが大腸菌用のベクターとして好ましい。本発明のポリヌクレオチドのベクターへの挿入は、挿入するベクターの適切な位置に遺伝子工学的に挿入すればよい。ここでいう適切な位置とは、ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、または伝達性に関わる領域を破壊しない範囲で自由に決定してよい。またベクターに挿入する場合、例えばプロモータ機能を有するオリゴヌクレオチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合、前記プロモータとして、ｌａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータまたはＴ７プロモータが例示できる。中でもｔｒｃプロモータは、転写活性の調節が容易な点で、大腸菌用のプロモータとして好ましい。
【0030】
本発明において、宿主とは、ＡＭＶ逆転写酵素を発現できる細胞であればよく、原核細胞においては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する菌などがあげられ、真核細胞としては酵母のサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する菌、キャンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する菌、ポンベ（Ｐｏｍｂｅ）属に属する菌、糸状菌のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する菌などをあげられる。さらには、昆虫細胞や動物細胞を宿主として用いてもよい。中でも好ましい宿主の一例として、培養や取り扱いが容易な大腸菌があげられる。さらに大腸菌の中でも、大腸菌ＭＶ１１８４株、大腸菌ＧＭ３１株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＪＭ１０１株、大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌Ｗ３１１０株が好ましい。なお前述した大腸菌に対し、ニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチル等の化学物質、紫外線、放射線等の従来公知の手段により変異処理した大腸菌変異株を使用してもよい。
【0031】
本発明の発現ベクターを用いて宿主を形質転換し、本発明の形質転換体を得る方法については、本技術分野に知られている任意の方法が使用できる。例えば、宿主が大腸菌の場合、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，ｐ．４６９－６３１，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓやＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４，ｐ．３０５－６３６，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載された方法により行なえばよい。
【0032】
前述した方法で得られた本発明の形質転換体を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、得られた培養物から発現された前記逆転写酵素を回収する工程とを含む工法で、本発明のＡＭＶ逆転写酵素を製造できる。
【0033】
本発明の形質転換体の培養は、公知の方法を利用すればよく、例えば宿主が大腸菌の場合、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地や２ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）を用いる方法があげられる。なお本発明の発現ベクターが薬剤耐性遺伝子を有している場合、当該遺伝子に対応した薬剤を選抜剤として培地に添加すると、本発明の形質転換体を選択して培養できる点で好ましい。例えば、本発明の発現ベクターがアンピシリン耐性遺伝子を有している場合、培地にアンピシリンやカルベニシリンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素、無機塩や、適当な栄養源を添加してもよい。培養温度は、例えば宿主が大腸菌の場合、１０℃以上４０℃以下の範囲であればよく、好ましくは２５℃以上３７℃以下の範囲である。ｐＨは例えば宿主が大腸菌の場合、ｐＨ５．９以上ｐＨ８．１以下の範囲であればよく、好ましくはｐＨ６．０以上ｐＨ７．０以下の範囲である。培養時間は、例えば３時間以上であればよく、好ましくは１６時間以上、より好ましくは５０時間以上、さらに好ましくは７２時間以上である。
【0034】
本発明の発現ベクターがｔｒｃプロモーターなど誘導性のプロモーターを有している場合、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）などの誘導剤を培地に添加し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導してもよい。この場合、培養開始時に誘導剤を添加してＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導させてもよいし、良好なＡＭＶ逆転写酵素の生産性が得られる程度まで菌体を増殖させた後に誘導剤を添加し、ＡＭＶ逆転写酵素の発現を誘導させてもよい。好ましくは宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が概ね０．１以上２０．０以下を示す増殖期間、より好ましくは濁度が０．５以上１０．０以下を示す増殖期間に、誘導剤を添加する誘導操作を行ない、引き続き培養する方法が例示できる。ＩＰＴＧの添加濃度は宿主が大腸菌の場合、一例として終濃度で概ね０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲の中から適宜選択すればよいが、好ましくは１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲、より好ましくは５．０ｍｍｏｌ／Ｌ付近である。なお、誘導操作後（誘導剤添加後）の培養温度を宿主の至適培養温度よりも低い温度まで下げると好ましく、具体的には宿主が大腸菌の場合、１０℃以上３０℃以下の範囲、より好ましくは１５℃以上２５℃以下の範囲である。具体的には宿主が大腸菌の場合、特開２０１４－１１３１０６号公報に記載の方法を用いると、ＡＭＶ逆転写酵素を効率的に生産できる点で好ましい。
【0035】
前述した方法で得られた本発明の形質転換体の培養物からＡＭＶ逆転写酵素を回収するには、当該形質転換体による発現の形態によって、適宜回収方法を選択すればよい。例えば、発現したＡＭＶ逆転写酵素が宿主内に蓄積する場合は遠心分離操作等により菌体を集めた後、酵素処理剤や超音波破砕等により菌体を破砕して回収すればよい。なお前記抽出段階では核酸など種々の夾雑物が混在しているが、ストレプトマイシン塩酸塩やポリエチレンイミン（商品名：ポリミンＰ）などの除核酸剤を添加し、前記核酸と共沈させることで、効率的にＡＭＶ逆転写酵素を沈澱回収できる。さらに、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといったクロマトグラフィーを単独または組み合わせて適用することにより、回収したＡＭＶ逆転写酵素を高純度に精製できる。クロマトグラフィーを用いたＡＭＶ逆転写酵素精製の一例として、ポリプロピレングリコール基を導入した疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いてＡＭＶ逆転写酵素を精製後、ホスホセルロース担体を用いたイオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製することで、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖と、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖と、αβ体のＡＭＶ逆転写酵素とを、分離精製できる。
【0036】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素は、例えば遺伝子工学試薬や遺伝子診断試薬で用いる、標的核酸の増幅試薬に利用できる。標的核酸の増幅試薬には、前記逆転写酵素以外にも逆転写反応に必要な構成成分、例えば、増幅を望む標的核酸の特定塩基配列の一部に特異的に結合するプライマーセット、ｄＮＴＰ、反応緩衝液、選択的にはＤＮＡ重合酵素などをさらに含むことができる。当該試薬に野生型ＡＭＶ逆転写酵素よりも耐熱性の高い、本発明のＡＭＶ逆転写酵素を用いることで、標的核酸の増幅反応をより高い温度で実施できるため、増幅反応効率の向上や、標的核酸の二次構造形成の抑制や、非特異的な核酸増幅反応の抑制が見込まれる。
【0037】
また、当該標的核酸の増幅試薬には、標的核酸の特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のオリゴヌクレオチドおよび前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット（ただし、少なくとも前記第一および第二のオリゴヌクレオチドのいずれか一方の５’末端にＲＮＡポリメラーゼの転写が開始可能なプロモータ配列が付加されている）と、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼとを含む、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法を利用した標的核酸の増幅試薬も包含される。
【実施例0038】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【0039】
実施例１ トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素遺伝子の変異導入
（１）配列番号４に記載の核酸配列からなるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断サイト（ＧＡＡＴＴＣ）および開始コドン（ＡＴＧ）を、３’末端側に終止コドン（ＴＡＡ）および制限酵素ＫｐｎＩ切断サイト（ＧＧＴＡＣＣ）を、それぞれ付加したポリヌクレオチドを合成した。
（１）配列番号４に記載の核酸配列からなるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断サイト（ＧＡＡＴＴＣ）および開始コドン（ＡＴＧ）を、３’末端側に終止コドン（ＴＡＡ）および制限酵素ＫｐｎＩ切断サイト（ＧＧＴＡＣＣ）を、それぞれ付加したポリヌクレオチドを合成した。
【0040】
（２）予めＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクターに、（１）で合成したポリヌクレオチド（予めＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化済）を挿入後、当該ベクターで大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
【0041】
（３）（２）で得られた形質転換体から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドを抽出し、野生型ＡＭＶ逆転写酵素発現ベクターｐＴｒｃＡ－ＡＭＶＥｂを調製した。
【0042】
（４）（３）で得られたｐＴｒｃＡ－ＡＭＶＥｂの塩基配列に基づき、所定の位置に遺伝子変異を導入した。具体的には、配列番号１のうち７５１番目のアルギニン（Ｒ）をヒスチジン（Ｈ）への変異を導入した。（以降、当該変異を導入したＡＭＶ逆転写酵素を、耐熱性ＡＭＶ逆転写酵素またはＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈと命名する）。ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈのアミノ酸配列を配列番号７に、塩基配列を配列番号８に、それぞれ示す。
【0043】
（５）ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈの発現ベクターｐＴｒｃＡ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈを作製し、キャピラリーシーケンサーにより、耐熱性ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の塩基配列確認を行なった。
【0044】
比較例１ 既知の耐熱性ＡＭＶ逆転写酵素（四重変異体）の形質転換体の作製
（１）特開２０１４－２０９８９８号公報に記載した方法で、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる、耐熱性ＡＭＶ逆転写酵素（四重変異体、ＡＭＶ－ＲＴ＿ｍ４－２と命名）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。なお、ＡＭＶ－ＲＴ＿ｍ４－２は、配列番号１に示す野生型ＡＭＶ逆転写酵素において、６５番目のセリン（Ｓ）がグリシン（Ｇ）に、５８３番目のアラニン（Ａ）がスレオニン（Ｔ）に、６２６番目のグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に、６８９番目のアラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）に、それぞれ置換されたポリペプチドである。
（１）特開２０１４－２０９８９８号公報に記載した方法で、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる、耐熱性ＡＭＶ逆転写酵素（四重変異体、ＡＭＶ－ＲＴ＿ｍ４－２と命名）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。なお、ＡＭＶ－ＲＴ＿ｍ４－２は、配列番号１に示す野生型ＡＭＶ逆転写酵素において、６５番目のセリン（Ｓ）がグリシン（Ｇ）に、５８３番目のアラニン（Ａ）がスレオニン（Ｔ）に、６２６番目のグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）に、６８９番目のアラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）に、それぞれ置換されたポリペプチドである。
【0045】
（２）実施例１（２）と同様の方法で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、ＡＭＶ－ＲＴ＿ｍ４－２発現株（形質転換体）を作製した。
【0046】
実施例２ ＡＭＶ逆転写酵素の耐熱性評価
（１）実施例１（２）で得られた、ｐＴｒｃＡ－ＡＭＶＥｂの形質転換体、
実施例１（５）で得られた、ｐＴｒｃＡ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈの形質転換体、
比較例１（２）で得られたＡＭＶ－ＲＴ＿ｍ４－２発現株（形質転換体）を、
９６穴ディープウェルプレートに分注した２×ＹＴ／Ｃａｒ培地（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍＬカルベニシリンナトリウム）２００μＬへそれぞれ植菌し、３７℃・１０００ｒｐｍで一晩振とう培養することで、前培養を行なった。
（１）実施例１（２）で得られた、ｐＴｒｃＡ－ＡＭＶＥｂの形質転換体、
実施例１（５）で得られた、ｐＴｒｃＡ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈの形質転換体、
比較例１（２）で得られたＡＭＶ－ＲＴ＿ｍ４－２発現株（形質転換体）を、
９６穴ディープウェルプレートに分注した２×ＹＴ／Ｃａｒ培地（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍＬカルベニシリンナトリウム）２００μＬへそれぞれ植菌し、３７℃・１０００ｒｐｍで一晩振とう培養することで、前培養を行なった。
【0047】
（２）（１）の前培養液の一部を、４℃で３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行ない、上清を除去することで菌体を回収し、－３０℃で保存した。
【0048】
（３）（１）の前培養液を、９６穴ディープウェルプレートに分注した２×ＰＮａ／Ｃａｒ培地（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１４．５ｇ／Ｌ第一リン酸ナトリウム・二水和物、２．５ｇ／Ｌ第二リン酸二ナトリウム・十二水和物、０．１ｍｇ／ｍＬカルベニシリンナトリウム（ｐＨ６．０））５００μＬへ、１０μＬ／ｗｅｌｌずつ植菌し、３７℃・１０００ｒｐｍで４．５時間振とう培養を行なった。
【0049】
（４）ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう、各ウェルに添加し、２５℃・１５０ｒｐｍでさらに３日間培養した。
【0050】
（５）（４）の培養液を４℃・３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行ない、上清を除去することで菌体を回収し、－３０℃で保存した。
【0051】
（６）（５）で回収した菌体に、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（商品名）（メルク社製）を含む抽出用緩衝液を１００μＬずつ加え、２５℃・１０００ｒｐｍで１時間振とうした後、４℃・３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清を回収することで、抽出液を調製した。
【0052】
（７）ＴＢＳ緩衝液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を用いて１００倍希釈した（６）の抽出液を、９６穴ＰＣＲプレートへ１２０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて５５℃で１０分間加熱した後、４℃で保持した。
【0053】
（８）（６）の抽出液中のＡＭＶ逆転写酵素量（熱処理なし）、および（７）で熱処理した抽出液中のＡＭＶ逆転写酵素量（熱処理あり）を、以下に示すＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法で評価した。
（８－１）９６穴マイクロプレートに抽出液（熱処理なし、および熱処理あり）を分注し、３０℃で１時間インキュベートすることで抽出液中のタンパク質をマイクロプレートに固定化した。
（８－２）固定化終了後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（商品名）を含むＴＢＳ緩衝液）で洗浄し、１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）溶液（メルク社製）を加えて３０℃で１時間インキュベートすることで、ブロッキングを行なった。
（８－３）ブロッキング終了後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液で洗浄し、マウス由来の抗ＡＭＶ逆転写酵素モノクローナル抗体を加えて３０℃で１時間インキュベートすることで、１次抗体反応を行なった。
（８－４）１次抗体反応終了後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液で洗浄し、Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）で標識された抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｉｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を加え、３０℃で１時間インキュベートすることで、２次抗体反応を行なった。
（８－５）２次抗体反応終了後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を加えて、室温で５分間インキュベートした。
（８－６）等量の１ｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液を加えて反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定することでＡＭＶ逆転写酵素量を評価した。
（８－１）９６穴マイクロプレートに抽出液（熱処理なし、および熱処理あり）を分注し、３０℃で１時間インキュベートすることで抽出液中のタンパク質をマイクロプレートに固定化した。
（８－２）固定化終了後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（商品名）を含むＴＢＳ緩衝液）で洗浄し、１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）溶液（メルク社製）を加えて３０℃で１時間インキュベートすることで、ブロッキングを行なった。
（８－３）ブロッキング終了後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液で洗浄し、マウス由来の抗ＡＭＶ逆転写酵素モノクローナル抗体を加えて３０℃で１時間インキュベートすることで、１次抗体反応を行なった。
（８－４）１次抗体反応終了後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液で洗浄し、Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）で標識された抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｉｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を加え、３０℃で１時間インキュベートすることで、２次抗体反応を行なった。
（８－５）２次抗体反応終了後、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を加えて、室温で５分間インキュベートした。
（８－６）等量の１ｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液を加えて反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定することでＡＭＶ逆転写酵素量を評価した。
【0054】
（９）熱処理した抽出液中のＡＭＶ逆転写酵素量（４５０ｎｍの吸光度）を、それぞれ対応する熱処理なしの抽出液中のＡＭＶ逆転写酵素量を１００％とした相対値（残存酵素量）で比較した。
【0055】
耐熱性ＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ）、野生型ＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ ｗｉｌｄ）、および特開２０１４－２０９８９８号公報で既知の耐熱性ＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ＿ｍ４－２）とで、残存酵素量を比較した結果を図１に示す。ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ（配列番号７）は、親株であるＡＭＶ－ＲＴ ｗｉｌｄ（配列番号１）だけでなく、既知のＡＭＶ－ＲＴ＿ｍ４－２（配列番号５）よりも残存酵素量が多くなっている。耐熱性の低い酵素は、加熱により凝集や分解を引き起こされやすくなり、酵素量が少なく定量されると考えられることから、ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ（配列番号７）は、熱に対する安定性がさらに向上していることが分かる。
【0056】
実施例３ ヒスチジンタグを付加した耐熱性ＡＭＶ逆転写酵素発現株の作製
（１）ｐＴｒｃＡ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈを鋳型プラスミドとして、表１に示す組成からなる試薬を調製後、サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用い、９４℃で２分加熱後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１分の温度サイクルを３０回繰り返す、インバースＰＣＲを行なった。
（１）ｐＴｒｃＡ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈを鋳型プラスミドとして、表１に示す組成からなる試薬を調製後、サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用い、９４℃で２分加熱後、９８℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１分の温度サイクルを３０回繰り返す、インバースＰＣＲを行なった。
【0057】
【表1】
【0058】
（２）得られたＰＣＲ産物を０．７％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動で泳動後、ゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
【0059】
（３）（２）で精製したＰＣＲ産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ社製）を用いて環状化させ、Ｎ末端にヒスチジンタグを付加したＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ（６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈと命名）発現ベクターを作製した。
【0060】
（４）（３）で作製した発現ベクターを用いて、ＡＭＶ由来ｐ１５プロテアーゼ（配列番号１４）を共発現する大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ（配列番号１０）を発現可能な組換え大腸菌株（形質転換体）を作製した。
【0061】
比較例２ ヒスチジンタグを付加した野生型ＡＭＶ逆転写酵素発現株の作製
ｐＴｒｃＡ－ＡＭＶＥｂを鋳型プラスミドとした他は、実施例３と同様の方法で、Ｎ末端にヒスチジンタグを付加したＡＭＶ－ＲＴ ｗｉｌｄ（配列番号１３、６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ ｗｉｌｄと命名）を発現可能な組換え大腸菌株（形質転換体）を作製した。
ｐＴｒｃＡ－ＡＭＶＥｂを鋳型プラスミドとした他は、実施例３と同様の方法で、Ｎ末端にヒスチジンタグを付加したＡＭＶ－ＲＴ ｗｉｌｄ（配列番号１３、６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ ｗｉｌｄと命名）を発現可能な組換え大腸菌株（形質転換体）を作製した。
【0062】
実施例４ ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌のフラスコ培養
（１）実施例３で作製した６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ（配列番号１０）を発現可能な形質転換体、または比較例２で作製した６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ ｗｉｌｄ（配列番号１３）を発現可能な形質転換体を、バッフル付き１００ｍＬフラスコに分注した２×ＹＴ／Ｃａｒ培地２０ｍＬに植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍで一晩振とう培養することで、前培養を行なった。
（１）実施例３で作製した６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ（配列番号１０）を発現可能な形質転換体、または比較例２で作製した６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ ｗｉｌｄ（配列番号１３）を発現可能な形質転換体を、バッフル付き１００ｍＬフラスコに分注した２×ＹＴ／Ｃａｒ培地２０ｍＬに植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍで一晩振とう培養することで、前培養を行なった。
【0063】
（２）（１）の前培養液を、バッフル付き５Ｌフラスコに分注した２×ＹＴ／Ｃａｒ培地１Ｌに植菌し、３７℃・１００ｒｐｍで８時間振とう培養を行なった。
【0064】
（３）ＩＰＴＧを終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう添加し、２５℃・１００ｒｐｍでさらに３日間培養した。
【0065】
（４）（３）の培養液を４℃・８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行ない、上清を除去することで菌体を回収し、－３０℃で保存した。
【0066】
実施例５ ＡＭＶ逆転写酵素の精製および耐熱性評価
（１）実施例４で回収した湿菌体１ｇあたり、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（商品名）（メルク社製）を含む抽出用緩衝液５ｍＬ加え、氷冷しながら１０分間撹拌することで、抽出液を調製した。
（１）実施例４で回収した湿菌体１ｇあたり、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（商品名）（メルク社製）を含む抽出用緩衝液５ｍＬ加え、氷冷しながら１０分間撹拌することで、抽出液を調製した。
【0067】
（２）（１）で調製した抽出液を、ＴＡＬＯＮ（Ｃｏｂａｌｔ）レジン（タカラバイオ社製）１ｍＬに添加し、１０ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾールを含む緩衝液２５ｍＬで洗浄した後、２００ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾールを含む緩衝液３ｍＬで溶出した。
【0068】
（３）アミコンウルトラ限外濾過フィルター（メルク社製）を用いて、（２）の溶出液の脱塩および濃縮を行ない、濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈調整することで、ヒスチジンタグを付加したＡＭＶ逆転写酵素（６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ、または６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ ｗｉｌｄ）を取得した。
【0069】
（４）（３）で取得した精製ＡＭＶ逆転写酵素を、サーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて５５℃で２分間加熱した後、４℃で保持した。
【0070】
（５）ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法による結核菌群ｒＲＮＡ検出試薬ＴＲＣＲｅａｄｙ ＭＴＢ（東ソー社製）の構成成分のうち、ＡＭＶ逆転写酵素のみを、（３）で調製したＡＭＶ逆転写酵素（熱処理なし）または（４）で熱処理したＡＭＶ逆転写酵素（熱処理あり）に置き換え、陽性標準ＲＮＡ（濃度既知の検出対象ＲＮＡ）を測定した。測定は、自動遺伝子検査装置ＴＲＣＲｅａｄｙ－８０（東ソー社製）を用いて蛍光強度の変化をモニタリングすることで行ない、蛍光測定値が初期蛍光値の１．２倍になった時間を検出時間とした。当該検出時間が短いほど、ＡＭＶ逆転写酵素の酵素活性が残存していることが言える。
【0071】
ＡＭＶ逆転写酵素として、６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ（配列番号１０）、および６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ ｗｉｌｄ（配列番号１３）をそれぞれ用いた場合の検出時間を、表２に示す。熱処理ありＡＭＶ逆転写酵素での検出時間を比較すると、６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ（配列番号１０）のほうが、６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ ｗｉｌｄ（配列番号１３）よりも顕著に検出時間が短くなっており、６Ｈ－ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ（配列番号１０）の熱安定性が向上していることがわかる。
【0072】
以上の結果から、ＴＲＣ法による標的核酸増幅試薬の構成成分であるＡＭＶ逆転写酵素として、本発明の熱安定性が向上したＡＭＶ逆転写酵素ＡＭＶ－ＲＴ＿Ｒ７５１Ｈ（配列番号７）を含むポリペプチドを用いることで、ＴＲＣ法による標的核酸の増幅をより高い温度で実施できることができ、当該増幅をより迅速に、および／または、より正確に行なえることが示唆される。
【0073】
【表2】
【産業上の利用可能性】
【0074】
本発明のトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、野生型ＡＭＶ逆転写酵素や既知の熱安定性ＡＭＶ逆転写酵素と比較し、熱安定性がさらに向上した酵素であり、例えば、当該酵素を標的核酸の増幅試薬やｃＤＮＡ合成試薬などの構成成分とすることで、遺伝子工学試薬や遺伝子診断試薬の性能を向上させることができる。
【図1】
【配列表】