特開 2024-153567 トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024153567

(43)【公開日】2024-10-29

(54)【発明の名称】トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20241022BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 9/50 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 15/57 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241022BHJP

   C12N 15/48 20060101ALI20241022BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54

C12N9/10 ZNA

C12N9/50

C12N15/57

C12N15/63 Z

C12N15/48

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024060519

(22)【出願日】2024-04-04

(31)【優先権主張番号】P 2023066894

(32)【優先日】2023-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(72)【発明者】

【氏名】近藤 宏紀

(72)【発明者】

【氏名】田島（大熊） 里佳

(72)【発明者】

【氏名】野口 惇

(72)【発明者】

【氏名】寺尾 陽介

(57)【要約】

【課題】トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を用いたＡＭＶ逆転写酵素の製造において、ＡＭＶ逆転写酵素を効率的に生産可能な方法を提供すること。
【解決手段】ＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子に加えて、プロテアーゼをコードする遺伝子を共発現させることで、前記課題を解決する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を培養することで前記ＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、
得られた培養物から前記ＡＭＶ逆転写酵素を回収する工程とを含むＡＭＶ逆転写酵素の製造方法であって、
前記遺伝子組換え大腸菌がＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子とプロテアーゼをコードする遺伝子との共発現が可能である、前記製造方法。

【請求項2】

前記プロテアーゼの発現量が前記ＡＭＶ逆転写酵素の発現量よりも低い、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記遺伝子組換え大腸菌が前記ＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子を発現可能な第一の発現ベクターと、前記プロテアーゼをコードする遺伝子を発現可能な第二の発現ベクターとを含み、かつ
第二のベクターのプロモーター強度および／またはコピー数が、第一のベクターのプロモーター強度および／またはコピー数よりも低い、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記プロテアーゼがＡＭＶ由来のプロテアーゼである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

前記プロテアーゼがＡＭＶ由来のプロテアーゼである、請求項３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の製造方法に関する。特に本発明は、ＡＭＶ逆転写酵素およびプロテアーゼを共発現可能な遺伝子組換え大腸菌を培養し、前記ＡＭＶ逆転写酵素を効率的に製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

逆転写酵素の一つであるトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、ｃＤＮＡ合成等に必要な遺伝子工学試薬や遺伝子診断用酵素などに利用されている。

【0003】

ＡＭＶ逆転写酵素には、分子量約９５ｋＤａのβ鎖と、分子量約６３ｋＤａのα鎖（天然ではβ鎖の断片化によって生成）の２種類のサブユニットが存在し、β鎖のモノマーやホモダイマー、α鎖のモノマーやホモダイマー、ならびにα鎖とβ鎖とのヘテロダイマー（以下、「αβ体」とも表記する）などを構成することが知られている。このうち、αβ体は酵素活性が高く、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの遺伝子増幅反応へ特に有用であることから（特許文献１）、ＡＭＶ逆転写酵素αβ体の効率的な製造方法が求められていた。

【0004】

ＡＭＶ逆転写酵素αβ体の製造方法として、タンパク質を安定的に大量生産可能な遺伝子組換え大腸菌を用いた製造方法が知られている。一例として、特許文献２には、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖およびβ鎖をコードする遺伝子をそれぞれ導入した遺伝子組換え大腸菌を用いて、前記遺伝子組換え大腸菌体内でα鎖およびβ鎖遺伝子を共発現させることで、ＡＭＶ逆転写酵素αβ体を生産する方法が記載されている。しかしながら、前記方法ではＡＭＶ逆転写酵素の可溶性発現量が少なく、可溶化促進のためにＡＭＶ逆転写酵素との分離精製が難しいシャペロンタンパク質との更なる共発現を必要とすることから、精製純度の点で懸念があった。また、前記方法では、α鎖およびβ鎖が別々の遺伝子にコードされているため遺伝子工学的に複雑な発現系となっており、例えば進化分子工学的手法によるＡＭＶ逆転写酵素の改良などを行う上で、より簡便なＡＭＶ逆転写酵素の発現系が求められていた。

【0005】

シャペロンタンパク質との共発現を必要としないＡＭＶ逆転写酵素αβ体の製造方法として、特許文献３には、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖をコードする遺伝子のみを導入した遺伝子組換え大腸菌を用いて、前記遺伝子組換え大腸菌体内で発現させたβ鎖からα鎖を分解生成し、ＡＭＶ逆転写酵素αβ体を生産する方法が記載されている。しかしながら、前記方法では前記遺伝子組換え大腸菌体内におけるＡＭＶ逆転写酵素β鎖の存在量に対して、α鎖の存在量が相対的に低く、さらに効率的なＡＭＶ逆転写酵素αβ体の製造方法が求められていた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００３－３３４０９５号公報

【特許文献2】特開２００２－３１５５８４号公報

【特許文献3】特開２０１３－１２６４０２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を用いたＡＭＶ逆転写酵素の製造において、ＡＭＶ逆転写酵素を効率的に生産可能な方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、前記遺伝子組換え大腸菌において、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードする遺伝子に加えて、プロテアーゼをコードする遺伝子を共発現させることで、前記ＡＭＶ逆転写酵素を効率的に生産できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0009】

すなわち本発明は、以下の＜１＞から＜８＞に記載の態様を包含する。

【0010】

＜１＞ＡＭＶ逆転写酵素を発現可能な遺伝子組換え大腸菌を培養することでＡＭＶ逆転写酵素を発現させる工程と、
得られた培養物から前記ＡＭＶ逆転写酵素を回収する工程とを含むＡＭＶ逆転写酵素の製造方法であって、
前記遺伝子組換え大腸菌がＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子とプロテアーゼをコードする遺伝子との共発現が可能である、前記製造方法。

【0011】

＜２＞前記プロテアーゼの発現量が前記ＡＭＶ逆転写酵素の発現量よりも低い、＜１＞に記載の方法。

【0012】

＜３＞前記遺伝子組換え大腸菌が前記ＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子を発現可能な第一の発現ベクターと、前記プロテアーゼをコードする遺伝子を発現可能な第二の発現ベクターとを含み、かつ
第二のベクターのプロモーター強度および／またはコピー数が、第一のベクターのプロモーター強度および／またはコピー数よりも低い、前記＜１＞または＜２＞に記載の方法。

【0013】

＜４＞前記プロテアーゼがＡＭＶ由来のプロテアーゼである、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の方法。

【0014】

＜５＞前記遺伝子組換え大腸菌がＡＭＶ逆転写酵素β鎖をコードする遺伝子とプロテアーゼをコードする遺伝子との共発現が可能な大腸菌である、＜１＞に記載の方法。

【0015】

＜６＞前記プロテアーゼの発現量がＡＭＶ逆転写酵素β鎖の発現量よりも低い、＜５＞に記載の方法。

【0016】

＜７＞前記遺伝子組換え大腸菌がＡＭＶ逆転写酵素β鎖をコードする遺伝子を発現可能な第一の発現ベクターと、前記プロテアーゼをコードする遺伝子を発現可能な第二の発現ベクターとを含み、かつ
第二のベクターのプロモーター強度および／またはコピー数が、第一のベクターのプロモーター強度および／またはコピー数よりも低い、前記＜５＞または＜６＞に記載の方法。

【0017】

＜８＞前記プロテアーゼがＡＭＶ由来のプロテアーゼである、前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の方法。

【発明の効果】

【0018】

本発明の遺伝子組換え大腸菌を用いたトリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素の製造方法は、ＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子とプロテアーゼをコードする遺伝子とを前記大腸菌体内で共発現させることを特徴としている。本発明の製造方法では、前記ＡＭＶ逆転写酵素β鎖からα鎖への分解が促進され、ＡＭＶ逆転写酵素αβ体の生産量が大幅に増大している。したがって本発明は、ＡＭＶ逆転写酵素αβ体の工業的製造に有用といえる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ＡＭＶ逆転写酵素α体およびβ体の総量に占めるα体の割合（モル比）の経時変化を、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で解析した結果を示す図である。

【図2】プラスミドベクターｐＴｒｃ＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂの構造を示す図である。

【図3】プラスミドベクターｐＳＴＶ＿ｐ１５の構造を示す図である。

【図4】プラスミドベクターｐＴｒｃ＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂ＿ｐ１５の構造を示す図である。

【図5】プラスミドベクターｐＴｒｃ＿ｐ１５＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂの構造を示す図である。

【図6】培養液当たりのＡＭＶ逆転写酵素発現量を、ウェスタンブロッティング法で解析した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0021】

本発明においてＡＭＶ逆転写酵素とは、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ、トリ骨髄芽球症ウイルス等とも呼称される）が有する逆転写酵素のことである。ＡＭＶ逆転写酵素の一例として、
（Ｉ）配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＢ３１９２９）に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドや、
（ＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性の少なくとも1つ以上の活性を有するポリペプチドや、
（ＩＩＩ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の同一性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性の少なくとも1つ以上の活性を有するポリペプチド、があげられる。

【0022】

前記（ＩＩ）の一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドがあげられる。配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドはＡＭＶ逆転写酵素の天然型バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）であり、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから８６５番目のアラニンまでのアミノ酸残基からなり、ただし当該アミノ酸残基において、以下に示す３箇所のアミノ酸残基の置換が生じたポリペプチドである；
配列番号１の２８０番目（配列番号２では２７３番目）のアルギニンのメチオニンへの置換、
配列番号１の３１１番目（配列番号２では３０４番目）のアルギニンのグルタミンへの置換、
配列番号１の４０２番目（配列番号２では３９５番目）のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換。

【0023】

なお、前記（ＩＩ）の「１もしくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～８０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、または１～５個であってよい。

【0024】

前記（ＩＩＩ）において同一性とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等のアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）プログラムを用いて決定できる。例えば、「アミノ酸残基の同一性」とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。同一性は７０％以上であればよく、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上の同一性を有していてもよい。

【0025】

なお前述したＡＭＶ逆転写酵素はβ鎖と呼ばれるポリペプチドであってよい。一方、ＡＭＶ逆転写酵素にはβ鎖よりも低分子のポリペプチドであるα鎖も存在してよい。ＡＭＶ逆転写酵素α鎖の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基からなるポリペプチドや、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性の少なくとも1つ以上の活性を有するポリペプチドや、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち８番目のスレオニンから５７９番目のチロシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の同一性を有し、かつ逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性の少なくとも1つ以上の活性を有するポリペプチド、があげられる。

【0026】

前記（ｉｉ）の一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうちＮ末端側５７２残基からなるポリペプチドである、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。

【0027】

なお、前記（ｉｉ）の「１もしくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、または１～５個であってよい。

【0028】

前記（ｉｉｉ）において同一性は、７０％以上であればよく、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上の同一性を有していてもよい。

【0029】

ＡＭＶ逆転写酵素は、前述したβ鎖のモノマーやホモダイマー、前述したα鎖のモノマーやホモダイマー、ならびにα鎖とβ鎖とのヘテロダイマー（以下、「αβ体」とも表記する）などを構成することが知られているが、本発明では、活性が高く遺伝子増幅試薬などの原材料として有用なαβ体を、効率的に製造することが可能である。

【0030】

また、本発明におけるＡＭＶ逆転写酵素は、そのＮ末端側および／またはＣ末端側に、分析・精製を容易にするためのタグペプチドや、大腸菌での分泌発現を促すためのシグナルペプチド、ベクターの開始コドンやマルチクローニングサイト由来のペプチドなどが付加されていてもよい。一例として、前述したＡＭＶ逆転写酵素のＮ末端側に、開始コドン由来のメチオニン、精製を容易にするための６×Ｈｉｓタグ（６残基のヒスチジン）およびそれらのリンカー配列から成る配列を付加したポリペプチド（配列番号５）があげられる。

【0031】

本発明においてＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子（以下、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子とも表記する）とは、ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一なタンパク質が発現可能な範囲で、当該遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に相同的な配列を含む遺伝子であってもよいし、当該遺伝子のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む遺伝子であってもよい。

【0032】

ここで「ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一なタンパク質」とは、具体的には、ＡＭＶ逆転写酵素が有する３つの酵素活性（逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅ Ｈ活性）のうち少なくとも１つ以上が、天然型ＡＭＶ逆転写酵素と同等以上の活性を有するタンパク質のことをいう。例えば、ＡＭＶが本来有するＡＭＶ逆転写酵素遺伝子のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％以上（好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上）の同一性を有したヌクレオチド配列を含む遺伝子から翻訳されたタンパク質であってよい。

【0033】

またここで「ストリンジェントな条件」とは、通常の状態と比較してＤＮＡ同士が二重鎖を形成し難い条件をいい、具体的には、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｗ／ｖ） Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）、０．１％（ｗ／ｖ） フィコール（商品名）、０．１％（ｗ／ｖ） ポリビニルピロリドン、５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム、または７５ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸ナトリウムが共存する条件が例示できる。

【0034】

本発明におけるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の一例として、
ＡＭＶ逆転写酵素（β鎖）である、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ宿主である大腸菌におけるコドン使用頻度に最適化されたポリヌクレオチド（配列番号４）があげられる。

【0035】

本発明のＡＭＶ逆転写酵素の製造方法では、ＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子とプロテアーゼをコードする遺伝子とを遺伝子組換え大腸菌体内で共発現させることで、前記ＡＭＶ逆転写酵素β鎖からα鎖への分解を前記プロテアーゼによって促進し、ＡＭＶ逆転写酵素αβ体を効率的に高生産させる。

【0036】

本発明におけるプロテアーゼは、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖と実質的に同等な機能を有するポリペプチドを生成可能なプロテアーゼであれば特に限定はなく、大腸菌由来のプロテアーゼやＡＭＶ由来のプロテアーゼが例示できる。天然（ＡＭＶの宿主であるトリ細胞内）におけるβ鎖からα鎖への分解をより再現できるという点で、ＡＭＶ由来のプロテアーゼ（以下、ＡＭＶｐ１５プロテアーゼとも表記する）が好ましい。ＡＭＶｐ１５プロテアーゼの一例として、
（Ａ）配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＡＢ２１２６２．１）に記載のアミノ酸配列のうち７４番目のロイシンから２０４番目のロイシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドや、
（Ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち７４番目のロイシンから２０４番目のロイシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基中の１もしくは数個の位置での、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつプロテアーゼ活性の少なくとも1つ以上の活性を有するポリペプチドや、
（Ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち７４番目のロイシンから２０４番目のロイシンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基に対して７０％以上の同一性を有し、かつプロテアーゼ活性の少なくとも1つ以上の活性を有するポリペプチド、があげられる。

【0037】

本発明においてＡＭＶｐ１５プロテアーゼをコードする遺伝子（以下、ＡＭＶｐ１５プロテアーゼ遺伝子とも表記する）とは、ＡＭＶｐ１５プロテアーゼと実質的に同一なタンパク質が発現可能な範囲で、当該遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に相同的な配列を含む遺伝子であってもよいし、当該遺伝子のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む遺伝子であってもよい。ここで「ＡＭＶｐ１５プロテアーゼと実質的に同一なタンパク質」とは、具体的には、プロテアーゼ活性が天然型ＡＭＶｐ１５プロテアーゼと同等以上の活性を有するタンパク質のことをいう。

【0038】

本発明におけるＡＭＶｐ１５プロテアーゼ遺伝子の一例として、ＡＭＶｐ１５プロテアーゼである配列番号６の７４番目のロイシンから２０４番目のロイシンまでのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ宿主である大腸菌におけるコドン使用頻度に最適化されたポリヌクレオチド（配列番号７）があげられる。

【0039】

本発明における、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖をコードする遺伝子とプロテアーゼをコードする遺伝子との共発現とは、前記２種類の遺伝子を人為的な制御下において同一宿主大腸菌体内で発現させることである。発現させる遺伝子は、ＡＭＶｐ１５プロテアーゼのような異種タンパク質をコードする遺伝子であっても良いし、発現量を調節する目的で、大腸菌プロテアーゼ遺伝子のような宿主大腸菌がもともと有している遺伝子であってもよい。発現方法には特に限定はなく、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子とプロテアーゼ遺伝子をそれぞれ別々のベクターに挿入して発現させても良く、単一ベクター上で同一または別々のプロモーターで制御して発現させても良く、染色体ＤＮＡ上に組み込んで発現させても良い。前述した宿主大腸菌がもともと有している遺伝子を共発現させる場合には、前記遺伝子を宿主大腸菌へ新たに導入して発現させる代わりに、もともと宿主大腸菌が有していた前記遺伝子のプロモーター等を置換して人為的に制御可能な状態にすることで共発現させても良い。組換えプラスミドの構築や、それぞれの遺伝子の発現量の制御が容易という点で、別々のベクターに挿入して発現させる方法が好ましい。ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子およびプロテアーゼ遺伝子を発現させる時期については特に限定はなく、同時に発現を誘導しても良いし、それぞれ別々の時期に発現を誘導しても良い。操作の簡便性の点で、同時に発現を誘導する方法が好ましい。

【0040】

本発明において、プロテアーゼの発現量をＡＭＶ逆転写酵素の発現量よりも低く抑え、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖からα鎖への分解量を調整すると、ＡＭＶ逆転写酵素αβ体を効率的に生産し、かつ可溶性発現量を向上できる点で好ましい。

【0041】

発現量の調整方法は特に限定はなく、それぞれの遺伝子発現を制御するプロモーターの強度によって調整する方法や、宿主大腸菌体内における各遺伝子のコピー数によって調整する方法（それぞれの遺伝子をコピー数の異なる別々のプラスミドに挿入して調整する方法、プラスミドや染色体ＤＮＡ上に同一遺伝子を複数コピー挿入する方法）、これらを組み合わせた方法などが例示できる。これらの方法で使用するプロモーターやプラスミドベクターには特に限定はなく、プロモーターは例えばｌａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどの大腸菌で機能するプロモーターから必要に応じて転写強度を考慮して適宜選択すればよく、プラスミドベクターはｐＴｒｃ系、ｐＳＴＶ系、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＥＴ系、広宿主域（Ｂｒｏａｄ－Ｈｏｓｔ－Ｒａｎｇｅ）プラスミドベクター系などの、形質転換する大腸菌内で安定に存在、複製できるプラスミドベクターから、必要に応じてプラスミド同士の不和合性やコピー数を考慮して適宜選択すればよい。一例として、２種類のプラスミドベクターを単一宿主大腸菌体内で安定的に保持可能であり、かつ発現量の調整が容易という点で、比較的コピー数が多いＣｏｌＥ１複製起点（約４０コピー／菌体）と強力なｔｒｃプロモーターを有するｐＴｒｃ系プラスミドベクター（ｐＴｒｃ９９Ａなど）へＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を挿入し、比較的コピー数が少ないｐ１５Ａ複製起点（約２０コピー／菌体）と温和なプロモーター（ｌａｃプロモーター）を有するｐＳＴＶ系プラスミドベクター（ｐＳＴＶ２８など）へプロテアーゼ遺伝子を挿入する方法が、好適な事例として例示できる。

【0042】

前述したＡＭＶ逆転写酵素遺伝子およびプロテアーゼ遺伝子の発現ベクターへの挿入は、挿入するベクターの適切な位置に遺伝子工学的に挿入すればよい。ここでいう適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、または伝達性に関わる領域を破壊しない範囲で自由に決定してよい。

【0043】

形質転換に用いる大腸菌の好ましい態様として、大腸菌ＭＶ１１８４株、大腸菌ＧＭ３１株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＪＭ１０１株、大腸菌Ｗ３１１０株、大腸菌ＪＭ１０９株があげられる。中でも、より好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株である。なお前述した大腸菌に対し、ニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチル等の化学物質、紫外線、放射線等の公知の方法により変異処理した大腸菌変異株を使用してもよい。

【0044】

本発明のベクターを用いて大腸菌を形質転換するには、公知の方法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，４６９－６３１，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓやＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４，３０５－６３６，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載の方法）で行なえばよい。

【0045】

前述した方法で得られた本発明の形質転換体の培養は、公知の方法を利用すればよく、例えばＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地や２×ＹＴ培地を用いる方法があげられる。なお本発明のベクターに薬剤耐性遺伝子を有している場合、当該遺伝子に対応した薬剤を選抜剤として培地に添加すると、本発明の形質転換体を選択して培養できる点で好ましい。例えば、本発明のベクター２種がアンピシリン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を有している場合、培地にアンピシリンまたはカルベニシリンおよびクロラムフェニコールを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素、無機塩や、適当な栄養源を添加してもよい。培養温度は、例えば１０℃以上４０℃以下の範囲であればよく、好ましくは２５℃以上３７℃以下の範囲、より好ましくは３０℃以上３７℃以下の範囲である。ｐＨは例えば５．９以上８．１以下の範囲であればよく、好ましくはｐＨ６．５以上７．５以下の範囲である。

【0046】

本発明のプロモーターとしてｔｒｃプロモーターやｌａｃプロモーターなどの誘導性プロモーターを用いる場合、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）などの誘導剤を培地に添加し、ＡＭＶ逆転写酵素やプロテアーゼの発現を誘導してもよい。この場合、培養開始時に誘導剤を添加して前記酵素の発現を誘導させてもよいし、良好なＡＭＶ逆転写酵素の生産性が得られる程度まで菌体を増殖させた後に誘導剤を添加し、ＡＭＶ逆転写酵素および／またはプロテアーゼの発現を誘導させてもよい。ＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子、およびプロテアーゼをコードする遺伝子を、それぞれ別々の誘導剤によって誘導されるプロモーターの制御下に挿入し、それぞれの誘導剤を各々適切な時期に培地に添加することで、前記ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子および前記プロテアーゼ遺伝子の発現を異なる時期に誘導してもよい。菌体の増殖を阻害せず、かつ操作が簡便という点で、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が概ね０．１以上２０．０以下を示す期間、あるいは培養開始から１時間以上２４時間以内の期間に、誘導剤を添加してＡＭＶ逆転写酵素およびプロテアーゼの発現を誘導する誘導操作を行ない、引き続き培養する方法が、好適な事例として例示できる。ＩＰＴＧの添加濃度は、一例として終濃度で概ね０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲の中から適宜選択すればよいが、好ましくは１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲、より好ましくは２．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上７．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下の範囲である。なお、誘導操作後（誘導剤添加後）の培養温度を大腸菌の至適培養温度よりも低い温度まで下げると好ましく、具体的には１０℃以上３０℃以下の範囲、より好ましくは１５℃以上２５℃以下の範囲、さらに好ましくは２０℃以上２５℃以下の範囲である。誘導操作後の培養時間は、例えば３時間以上であればよく、好ましくは１日以上、より好ましくは２日以上、さらに好ましくは２日以上７日以下である。

【0047】

本発明の製造方法のうち回収工程は、ＡＭＶ逆転写酵素の発現形態に応じて、公知の方法から適宜選択し、実施すればよい。例えば、発現したＡＭＶ逆転写酵素が大腸菌内に蓄積する場合は、遠心分離操作等により菌体を集めた後、酵素処理剤や超音波破砕等により菌体を破砕して抽出し、共沈殿法やクロマトグラフィー法を用いて適宜精製すればよい。共沈殿法としてはストレプトマイシン塩酸塩やポリエチレンイミン（商品名：Ｐｏｌｙｍｉｎ Ｐ）などを添加してＡＭＶ逆転写酵素を沈殿回収する方法が、クロマトグラフィー法としてはイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといった種々のクロマトグラフィーを用いる方法が例示でき、これらを単独または組み合わせて適用することにより、ＡＭＶ逆転写酵素を高純度に精製できる。前述した分析・精製を容易にするためのタグペプチドとして６×Ｈｉｓタグを付加したＡＭＶ逆転写酵素を回収する場合、コバルトやニッケルを用いた固定化金属アフィニティクロマトグラフィーを用いて精製することで、ＡＭＶ逆転写酵素を簡便に回収することができる。

【実施例0048】

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

【0049】

実施例１ プロテアーゼ共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌の作製（その１）
（１）配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子の５’末端側に、開始コドン、６×Ｈｉｓタグをコードする塩基配列、およびそれらのリンカーをコードする塩基配列（配列番号８）を、３’末端側に終止コドン（ＴＡＡ）を、それぞれ付加したポリヌクレオチド（配列番号９）を合成した。

【0050】

（２）ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクターのｔｒｃプロモーター下流に、（１）で合成したポリヌクレオチドをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（タカラバイオ）を用いて挿入後、当該ベクターで大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ）を形質転換した。

【0051】

（３）（２）で得られた形質転換体から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて組換えプラスミドを抽出し、ＡＭＶ逆転写酵素発現用プラスミドｐＴｒｃ＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂを調製した。

【0052】

（４）配列番号７に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶｐ１５プロテアーゼ遺伝子の５’末端側に開始コドン（ＡＴＧ）を、３’末端側に終止コドン（ＴＡＡ）を、それぞれ付加したポリヌクレオチドを合成した。

【0053】

（５）ｐＳＴＶ２８プラスミドベクターのｌａｃプロモーター下流に、（４）で合成したポリヌクレオチドを挿入後、当該ベクターで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。

【0054】

（６）（５）で得られた形質転換体から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて組換えプラスミドを抽出し、プロテアーゼ発現用プラスミドｐＳＴＶ＿ｐ１５を調製した。

【0055】

（７）（６）で得られたプロテアーゼ発現用プラスミドｐＳＴＶ＿ｐ１５を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した後、次いで（３）で得られたＡＭＶ逆転写酵素発現用プラスミドｐＴｒｃ＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂを用いて前記形質転換体を形質転換することで、プロテアーゼ共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌を作製した。

【0056】

実施例２ ＡＭＶ逆転写酵素の発現
（１）実施例１で作製したプロテアーゼ共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌、および実施例１（３）で調製したＡＭＶ逆転写酵素発現用プラスミドｐＴｒｃ＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂのみで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した形質転換体（プロテアーゼ非共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌）を、２×ＹＴ培地（トリプトン １６ｇ／Ｌ、酵母エキス １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ５ｇ／Ｌ）３ｍＬに植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで一晩前培養した。

【0057】

（２）（１）の前培養液２ｍＬを、２×ＹＴ培地２００ｍＬに植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで１６時間培養した。

【0058】

（３）ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、２５℃でさらに最長で７日間培養した。

【0059】

（４）培養液を遠心分離し、ＡＭＶ逆転写酵素を発現した大腸菌を回収した。

【0060】

実施例３ ＡＭＶ逆転写酵素発現量の評価（その１）
（１）実施例２で回収した各大腸菌を、破砕バッファー（ｘＴｒａｃｔｏｒ Ｂｕｆｆｅｒ （タカラバイオ）、１／８× Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、２５Ｕ／μＬ ＤＮａｓｅ、０．２５ｍｇ／ｍＬ リゾチーム）に懸濁し、氷上でインキュベートすることで、菌体抽出液を調製した。

【0061】

（２）（１）で得られた菌体抽出液を遠心分離し、不溶性沈殿物を除去した後、含まれるＡＭＶ逆転写酵素をＴＡＬＯＮコバルトレジン（タカラバイオ）に吸着させた。

【0062】

（３）１０ｍＭ イミダゾールを含むｐＨ７．５の洗浄液で洗浄した後、２００ｍＭイミダゾールを含むｐＨ７．５の溶出液を用いてレジンからＡＭＶ逆転写酵素を溶出させ、溶出液を回収した。

【0063】

（４）（３）で回収した溶出液を、アミコンウルトラ限外濾過フィルター（メルク）で濃縮した。

【0064】

（５）（４）で得られた濃縮液を、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、泳動後のゲル中のバンド輝度を画像解析ソフトＩｍａｇｅＪで解析することでＡＭＶ逆転写酵素量を定量した。

【0065】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法におけるＡＭＶ逆転写酵素α体およびβ体のバンド輝度をそれぞれの分子量で除した。その値をそれぞれ＜α＞、＜β＞とすると、＜α＞を＜α＞および＜β＞の合計で除した値に１００を乗じた数値を、α体の割合とした。当該数値はα体とβ体の総量に占めるα体のモル比に近似できる。誘導後の培養日数ごとのα体の割合の経時変化を、図１に示す。

【0066】

プロテアーゼ共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌では、プロテアーゼ非共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌に比べてＡＭＶ逆転写酵素α体の割合が誘導後１日目において１．４１倍、誘導後２日目において１．２８倍、誘導後３日目において１．２３倍に向上した。また、その割合は誘導剤であるＩＰＴＧの添加から２日後に最大に達し、以後７日目までα体：β体のモル比が１：１の水準を維持した。なお、誘導後７日目のプロテアーゼ非共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌での培養結果は、α体のＳＤＳ－ＰＡＧＥのバンドが検出限界となってしまった。本結果から、ＡＭＶ逆転写酵素β体遺伝子に加えて、プロテアーゼ遺伝子を共発現させることで、ＡＭＶ逆転写酵素β体からα体への分解が促進され、α体の生産量が向上することが分かる。したがって、本発明の製造方法により、ＡＭＶ逆転写酵素αβ体を効率的に大量生産可能であるといえる。

【0067】

実施例４ プロテアーゼ共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌の作製（その２）
ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子およびＡＭＶｐ１５プロテアーゼ遺伝子を、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクターのｔｒｃプロモーターの下流へ挿入し、当該ベクターで大腸菌を形質転換することで、ＡＭＶ逆転写酵素とプロテアーゼを等量発現するプロテアーゼ共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌を作製した。

【0068】

（１）実施例１（４）で合成した開始コドンおよび終止コドンが付加されたＡＭＶｐ１５プロテアーゼ遺伝子を、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクターのｔｒｃプロモーター下流に挿入後、当該ベクターで大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ）を形質転換した。

【0069】

（２）（１）で得られた形質転換体から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて組換えプラスミドを抽出し、クローニング用プラスミドｐＴｒｃ＿ｐ１５を調製した。

【0070】

（３－１）（２）で調製したクローニング用プラスミドｐＴｒｃ＿ｐ１５を鋳型としたＰＣＲにより、ＡＭＶｐ１５プロテアーゼ遺伝子とその周辺領域を含むポリヌクレオチドを合成し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（タカラバイオ）を用いて実施例１（３）で調製したＡＭＶ逆転写酵素発現用プラスミドｐＴｒｃ＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂのＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子の下流に挿入後、当該ベクター（以下、等量共発現プラスミドｐＴｒｃ＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂ＿ｐ１５と表記）で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換することで、等量共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌Ａを作製した。等量共発現プラスミドｐＴｒｃ＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂ＿ｐ１５における、ｔｒｃプロモーター配列からＡＭＶｐ１５プロテアーゼ遺伝子までの塩基配列を配列番号１０に示す。

【0071】

（３－２）実施例１（３）で調製したＡＭＶ逆転写酵素発現用プラスミドｐＴｒｃ＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂを鋳型としたＰＣＲにより、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子とその周辺領域を含むポリヌクレオチドを合成し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキットを用いて（２）で調製したクローニング用プラスミドｐＴｒｃ＿ｐ１５のＡＭＶｐ１５プロテアーゼ遺伝子の下流に挿入後、当該ベクター（以下、等量共発現プラスミドｐＴｒｃ＿ｐ１５＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂと表記）で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換することで、等量共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌Ｂを作製した。等量共発現プラスミドｐＴｒｃ＿ｐ１５＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂにおける、ｔｒｃプロモーター配列からＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子までの塩基配列を配列番号１１に示す。

【0072】

また、各プラスミドベクターの構造を図２～５に示す。

【0073】

実施例５ ＡＭＶ逆転写酵素発現量の評価（その２）
（１）実施例４（３－１）で作製した等量共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌Ａ、および（３－２）で作製した等量共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌Ｂを、実施例２に記載と同様の方法で培養し、ＡＭＶ逆転写酵素を発現した大腸菌を回収した。なお、誘導後の培養日数は２日間とした。

【0074】

（２）（１）および実施例２で回収した共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌を、実施例３（１）に記載と同様の方法で処理し、菌体抽出液を調製した。

【0075】

（３）（２）で得られた菌体抽出液を遠心分離して不溶性沈殿物を除去した後、３－メルカプト－１，２－プロパンジオールを含むＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプル緩衝液に添加し、９８℃で５分間熱処理後、５％（ｗ／ｖ）から２０％（ｗ／ｖ）濃度勾配ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。

【0076】

（４）電気泳動後、トランスブロットＴｕｒｂｏ転写システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写した。

【0077】

（５）（４）のメンブレンに対して、１次抗体として抗ＡＭＶ逆転写酵素ラビットポリクローナル抗体を、２次抗体として抗ラビットＩｇＧ抗体－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）を、発色試薬としてＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ（サーモフィッシャー）を用いて染色し、ウェスタンブロッティング解析を実施した。

【0078】

（６）（５）で染色したメンブレンを、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ８００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて撮影し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて各バンドの輝度を定量解析した。

【0079】

等量共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌Ａ、Ｂによる、ＡＭＶ逆転写酵素の発現量（培養液当たりのα体およびβ体の総量）を、共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌（ＡＭＶ逆転写酵素発現用プラスミドｐＴｒｃ＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂおよびプロテアーゼ発現用プラスミドｐＳＴＶ＿ｐ１５で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した形質転換体）での発現量（バンドの輝度に相当）を１とした相対値で表した。その結果を図６に示す。

【0080】

ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクターのｔｒｃプロモーターの下流に挿入した、ＡＭＶ逆転写酵素発現用プラスミドｐＴｒｃ＿Ｎ－Ｈｉｓ－ＡＭＶｂと、ＡＭＶｐ１５プロテアーゼ遺伝子をｐＳＴＶ２８プラスミドベクターのｌａｃプロモーター下流に挿入したプロテアーゼ発現用プラスミドｐＳＴＶ＿ｐ１５の、それぞれで形質転換したプロテアーゼ共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌は、等量共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌Ａ、Ｂに比べて、ＡＭＶ逆転写酵素の発現量が向上していることが分かる（等量共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌Ａの１．６６倍、等量共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌Ｂの１．７６倍）。

【0081】

ｐＳＴＶ２８プラスミドベクター（ｐ１５Ａ型複製起点）はｐＴｒｃ９９Ａプラスミドベクター（ＣｏｌＥ１型複製起点）と比べて同等から同等以下のコピー数であることが（Ｑｕｅｓｔ ｍａｐ Ｖｏｌ．１、Ｍｅｒｃｋ社）、ｌａｃプロモーターはｔｒｃプロモーターと比べて転写強度が低いことが（生物工学会誌、９１、９６－１００、２０１３）報告されている。このことから前記２種類のプラスミドベクターを用いて形質転換したプロテアーゼ共発現型ＡＭＶ逆転写酵素生産大腸菌では、ＡＭＶｐ１５プロテアーゼの発現量がＡＭＶ逆転写酵素の発現量よりも低くなると考えられる。よって、前記プロテアーゼの発現量をＡＭＶ逆転写酵素の発現量よりも低く調整することで、ＡＭＶ逆転写酵素を効率的に製造できる。

【産業上の利用可能性】

【0082】

本発明の製造方法により、遺伝子組換え大腸菌を用いたＡＭＶ逆転写酵素αβ体の大量生産が可能となるため、工業規模でのＡＭＶ逆転写酵素の製造を効率的に行なえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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