特開 2024-153657 エンドソームのＧタンパク質共役受容体を標的とするナノ粒子のカプセル化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024153657

(43)【公開日】2024-10-29

(54)【発明の名称】エンドソームのＧタンパク質共役受容体を標的とするナノ粒子のカプセル化

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/08 20060101AFI20241022BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20241022BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 31/454 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 31/451 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 31/551 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 31/438 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 31/4545 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 31/426 20060101ALI20241022BHJP

   A61K 31/55 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 1/08 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 25/22 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 39/02 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 19/04 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 13/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 29/02 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241022BHJP

   A61P 25/06 20060101ALI20241022BHJP

【ＦＩ】

A61K9/08

A61K45/00

A61K47/32

A61K47/34

A61K31/5377

A61K31/454

A61K31/451

A61P43/00 111

A61K9/14

A61K31/551

A61K31/506

A61K31/438

A61K31/4545

A61K31/426

A61K31/55

A61P1/08

A61P25/24

A61P25/22

A61P39/02

A61P1/04

A61P1/00

A61P19/04

A61P11/00

A61P11/06

A61P13/00

A61P15/00

A61P25/04

A61P29/02

A61P17/04

A61P31/12

A61P31/04

A61P35/00

A61P43/00 121

A61P25/06

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024108154

(22)【出願日】2024-07-04

(62)【分割の表示】P 2021521808の分割

【原出願日】2019-10-22

(31)【優先権主張番号】2018903997

(32)【優先日】2018-10-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】000002934

【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(72)【発明者】

【氏名】バネット、ナイジェル

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィス、トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ウィテカー、マイケル

(72)【発明者】

【氏名】フェルトハイス、ニコラス

(57)【要約】      （修正有）

【課題】エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法を提供する。
【解決手段】（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有し、ここで、該ナノ粒子は、そのコア内に、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含み、該酸応答性ポリマーブロックは、エンドソーム内腔の酸性環境において遷移を受け、これにより、集合したコポリマー鎖が解体し、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩がエンドソームに放出される、方法である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コア／シェル構造を形成するように集合したコポリマー鎖のポリマーナノ粒子を含む水性液体であって、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有し、
ここで、該ナノ粒子は、そのコア内に、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含む、
水性液体。

【請求項2】

酸応答性疎水性ポリマーブロックが酸性環境においてプロトン化される第三級アミン官能基を含み、任意に該第三級アミン官能基が約ｐＨ＝６．１でプロトン化される、請求項１に記載の水性液体。

【請求項3】

酸応答性疎水性ポリマーブロックが２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤｉＰＡＥＭＡ）のホモポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１または２に記載の水性液体。

【請求項4】

酸応答性疎水性ポリマーブロックが２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤｉＰＡＥＭＡ）およびポリアルキレンオキシドメタクリレートのコポリマーを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項5】

酸応答性疎水性ポリマーブロックが２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤｉＰＡＥＭＡ）およびジエチレングリコールメタクリレート（ＤＥＧＭＡ）のコポリマーを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項6】

親水性ポリマーブロックがポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）および２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）のコポリマーを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項7】

ナノ粒子の直径が１５から１２０ｎｍ、任意に１５から１００ｎｍまたは２５から５０ｎｍである、請求項１から６のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項8】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がエンドソームＧＰＣＲの阻害剤である、請求項１から７のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項9】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がエンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達の阻害剤、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１から８のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項10】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がアプレピタント、フォサプレピタント、トラディピタント、マロピタント、ＨＴＸ－０１９、ネツピタント、セルロピタント、オルベピタント、ＮＡＳ－９１１Ｂ、ＺＤ－６０２１、ＫＤ－０１８、ＤＮＫ－３３３、ＮＴ－４３２、ＮＫ－９４９、ＮＴ－８１４、ＥＵ－Ｃ－００１、ベスチピタント、１１４４８１４、ＳＣＨ－９００９７８、ＡＺＤ－２７３８、ＢＬ－１８３３、カソピタント、ＡＶ－８１０、ＫＲＰ－１０３、４２４８８７、シゾリルチン、ボフォピタント、Ｌ－７４２６９４、カプサゼピン、ＧＲ－８２３３４、ＭＥＮ－１１１４９、Ｌ－７３２１３８、ＮｉＫ－００４、ＴＡ－５５３８、Ｃ
Ｐ－９６３４５、ラネピタント、ＬＹ－２５９０４４３、ダピタント、ブラピタント、ベフェツピタント、ＣＪ－１７４９３、ＡＶＥ－５８８３、ＣＧＰ－４９８２３、ＣＰ－１２２７２１、ＣＰ－９９９９４、ＳＬＶ－３１７、ＴＡＫ－６３７、Ｌ－７３３０６０、Ｌ－７０３６０６、ジロペチン、ＭＰＣ－４５０５、Ｌ－７４２３１１、ＦＫ－８８８、ＷＩＮ－６４８２１、ＮＩＰ－５３０、ＳＬＶ－３３６、エズロピタント、ＴＫＡ－４５７、フィゴピタント、ＺＤ－４７９４、ＣＰ－１００２６３、ＧＲ－２０３０４０、Ｌ－７０９２１０、ＭＥＮ－１０９３０、ＭＥＮ－１１４６７、ＬＹ－３０６７４０、ＦＫ－３５５、ＷＩＮ－６７６８９、ＷＩＮ－５１７０８、ＦＫ－２２４、ＢＬ－１８３２、ＣＡＭ－６１０８、ＣＰ－９８９８４、ＷＳ－９３２６Ａ、Ｌ－７４１６７１、Ｌ－７３７４８８、Ｌ－７４０１４１、Ｌ－７６０７３５、Ｌ－１６１６６４、ＹＭ－４９２４４、Ｓｃｈ－６００５９、ＳＤＺ－ＮＫＴ－３４３、Ｓ－１８５２３、ＲＰＲ－１１１９０５、Ｓ－１９７５２、Ｌ－１６１６４４、ＬＹ－２９７９１１、ＲＰＲ－１０７８８０、Ｌ－７３６２８１、アントロテニン、ＲＰ－７３４６７、ＷＩＮ－６４７４５、ＷＩＮ－６８５７７、ＷＩＮ－６２５７７ ＷＩＮ－６６３０６、ＲＰ－６７５８０、ＣＰ－０３６４、Ｌ－７４３９８６、Ｓ－１６４７４、ＣＧＰ－４７８９９、ＦＲ－１１３６８０、ＹＭ－４４７７８、ＧＲ－１３８６７６、ＣＧＰ－７３４００、ＣＡＭ－２４４５、ＭＤＬ－１０５１７２Ａ、Ｌ－７５６８６７、イスブフィリン、Ｒ－６７３、ＳＲ－４８９６８およびＳＲ－１４０３３、ＧＷ６７９７６９、ＣＰ－０５７８、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項11】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がアプレピタント、ボフォピタント、Ｌ－７３３０６０、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項12】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がエンドソームＣＧＲＰおよび／若しくはＣＬＲシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩である、請求項１から８のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項13】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がＢＩ４４３７０、ＭＫ－３２０７、オルセゲパント、ウブロゲパント、リメゲパント、ＳＢ－２６８２６２、テルカゲパント、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１から８および１２のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項14】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がオルセゲパント、ＭＫ－３２０７、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１から８および１２から１３のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項15】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩をさらに含み、該エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩が、ポリマーナノ粒子のコア内に含まれている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項16】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲシグナル伝達の阻害剤である、請求項１５に記載の水性液体。

【請求項17】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に
許容される塩がＢＩ４４３７０、ＭＫ－３２０７、オルセゲパント、ウブロゲパント、リメゲパント、ＳＢ－２６８２６２、テルカゲパント、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１５から１６のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項18】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がオルセゲパント、ＭＫ－３２０７、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項19】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とのモル比が１：１０から１０：１である、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項20】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とのモル比が１：４から４：１、任意に１：２から２：１、任意に１：１である、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項21】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がエンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩であり、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がエンドソームＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩である、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項22】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がアプレピタント、ボフォピタント、Ｌ－７３３０６０、またはそれらの薬学的に許容される塩であり；エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がオルセゲパント、ＭＫ－３２０７、またはそれらの薬学的に許容される塩である請求項２１に記載の水性液体。

【請求項23】

コア／シェル構造を形成するように集合したコポリマー鎖のポリマーナノ粒子を含む水性液体であって、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有し、
ここで、該ナノ粒子はそのコア内に、
ｃ）エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩；および
ｄ）エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含む、
水性液体。

【請求項24】

酸応答性疎水性ポリマーブロックが酸性環境においてプロトン化される第三級アミン官能基を含み、任意に該第三級アミン官能基が約ｐＨ＝６．１でプロトン化される、請求項２３に記載の水性液体。

【請求項25】

酸応答性疎水性ポリマーブロックが２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤｉＰＡＥＭＡ）のホモポリマーまたはコポリマーを含む、請求項２３または２４に記載の水性液体。

【請求項26】

酸応答性疎水性ポリマーブロックが２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤｉＰＡＥＭＡ）およびポリアルキレンオキシドメタクリレートのコポリマーを含む、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項27】

酸応答性疎水性ポリマーブロックが２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤｉＰＡＥＭＡ）およびジエチレングリコールメタクリレート（ＤＥＧＭＡ）のコポリマーを含む、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項28】

親水性ポリマーブロックがポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）および２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）のコポリマーを含む、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項29】

ナノ粒子の直径が１５から１２０ｎｍ、任意に１５から１００ｎｍまたは２５から５０ｎｍである、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項30】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がエンドソームＧＰＣＲの阻害剤である、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項31】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がエンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩である、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項32】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩が、アプレピタント、フォサプレピタント、トラディピタント、マロピタント、ＨＴＸ－０１９、ネツピタント、セルロピタント、オルベピタント、ＮＡＳ－９１１Ｂ、ＺＤ－６０２１、ＫＤ－０１８、ＤＮＫ－３３３、ＮＴ－４３２、ＮＫ－９４９、ＮＴ－８１４、ＥＵ－Ｃ－００１、ベスチピタント、１１４４８１４、ＳＣＨ－９００９７８、ＡＺＤ－２７３８、ＢＬ－１８３３、カソピタント、ＡＶ－８１０、ＫＲＰ－１０３、４２４８８７、シゾリルチン、ボフォピタント、Ｌ－７４２６９４、カプサゼピン、ＧＲ－８２３３４、ＭＥＮ－１１１４９、Ｌ－７３２１３８、ＮｉＫ－００４、ＴＡ－５５３８、ＣＰ－９６３４５、ラネピタント、ＬＹ－２５９０４４３、ダピタント、ブラピタント、ベフェツピタント、ＣＪ－１７４９３、ＡＶＥ－５８８３、ＣＧＰ－４９８２３、ＣＰ－１２２７２１、ＣＰ－９９９９４、ＳＬＶ－３１７、ＴＡＫ－６３７、Ｌ－７３３０６０、Ｌ－７０３，６０６、ジロペチン、ＭＰＣ－４５０５、Ｌ－７４２３１１、ＦＫ－８８８、ＷＩＮ－６４８２１、ＮＩＰ－５３０、ＳＬＶ－３３６、エズロピタント、ＴＫＡ－４５７、フィゴピタント、ＺＤ－４７９４、ＣＰ－１００２６３、ＧＲ－２０３０４０、Ｌ－７０９２１０、ＭＥＮ－１０９３０、ＭＥＮ－１１４６７、ＬＹ－３０６７４０、ＦＫ－３５５、ＷＩＮ－６７６８９、ＷＩＮ－５１７０８、ＦＫ－２２４、ＢＬ－１８３２、ＣＡＭ－６１０８、ＣＰ－９８９８４、ＷＳ－９３２６Ａ、Ｌ－７４１６７１、Ｌ－７３７４８８、Ｌ－７４０１４１、Ｌ－７６０７３５、Ｌ－１６１６６４、ＹＭ－４９２４４、Ｓｃｈ－６００５９、ＳＤＺ－ＮＫＴ－３４３、Ｓ－１８５２３、ＲＰＲ－１１１９０５、Ｓ－１９７５２、Ｌ－１６１６４４、ＬＹ－２９７９１１、ＲＰＲ－１０７８８０、Ｌ－７３６２８１、アントロテニン、ＲＰ－７３４６７、ＷＩＮ－６４７４５、ＷＩＮ－６８５７７、ＷＩＮ－６２５７７ ＷＩＮ－６６３０６、ＲＰ－６７５８０、ＣＰ－０３６４、Ｌ－７４３９８６、Ｓ－１６４７４、ＣＧＰ－４７８９９、ＦＲ－１１３６８０、ＹＭ－４４７７８、ＧＲ－１３８６７６、ＣＧＰ－７３４００、ＣＡＭ－２４４５、ＭＤＬ－１０５１７２Ａ、Ｌ－７５６８６７、イスブフィリン、Ｒ－６７３、ＳＲ－４８９６８およびＳＲ－１４０３３、ＧＷ６７９７６９、ＣＰ－０５７８、およびそれら
の薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項２３から３１のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項33】

第１の疎水性モジュレーターエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達またはその薬学的に許容される塩がアプレピタント、ボフォピタント、Ｌ－７３３０６０、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項34】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲシグナル伝達の阻害剤である、請求項２３から３３のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項35】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がＢＩ４４３７０、ＭＫ－３２０７、オルセゲパント、ウブロゲパント、リメゲパント、ＳＢ－２６８２６２、テルカゲパント、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項２３から３４のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項36】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がオルセゲパント、ＭＫ－３２０７、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項２３から３５のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項37】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とのモル比が１：１０から１０：１である、請求項２３から３６のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項38】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とのモル比が１：４から４：１、任意に１：２から２：１または１：１である、請求項２３から３７のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項39】

請求項１から２２のいずれか一項または請求項２３から３８のいずれか一項に記載の水性液体、および任意に、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項40】

有効量の請求項１から１１のいずれか一項に記載の水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法。

【請求項41】

有効量のエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することをさらに含む、請求項４０の方法。

【請求項42】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がエンドソームＣＧＲＰおよび／またはＣＬＲシグナル伝達の阻害剤、任意にＭＫ－３２０７、オルセゲパント、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項４１の方法。

【請求項43】

有効量の請求項１から８および１２－１４のいずれか一項に記載の水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法。

【請求項44】

有効量のエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することをさらに含む、請求項４３の方法。

【請求項45】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がエンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩、任意にアプレピタント、ボフォピタント、Ｌ－７３３０６０、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項４４の方法。

【請求項46】

有効量の
１）第１の水性液体またはその医薬組成物（ここで、該第１の水性液体は、請求項９から１１のいずれか一項に従って定義されているとおりである）；および
２）第２の水性液体またはその医薬組成物（ここで、該第２の水性液体は、請求項１２から１４のいずれか一項に従って定義されているとおりである）
をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法。

【請求項47】

有効量の請求項１５から２２および２３から３８のいずれか一項に記載の水性液体、またはその医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法。

【請求項48】

コア／シェル構造を形成するように集合したコポリマー鎖のポリマーナノ粒子を含む水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法であって、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有し、
ここで、該ナノ粒子は、そのコア内に、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含み；
およびここで、該酸応答性ポリマーブロックは、エンドソーム内腔の酸性環境において遷移を受け、これにより、集合したコポリマー鎖が解体し、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩がエンドソームに放出される、
方法。

【請求項49】

コア／シェル構造を形成するように集合したコポリマー鎖のポリマーナノ粒子を含む水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法であって、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有し、
ここで、該ナノ粒子は、そのコア内に、
ａ）エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩；および
ｂ）エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含み；
およびここで、該酸応答性ポリマーブロックは、エンドソーム内腔の酸性環境において遷移を受け、これにより、集合したコポリマー鎖が解体し、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩がエンドソームに放出される、
方法。

【請求項50】

有効量の請求項９から１１のいずれか一項に記載の水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療方法。

【請求項51】

エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害が化学療法誘発性の吐き気および嘔吐（ＣＩＮＶ）、周期的嘔吐症候群、術後の吐き気および嘔吐、鬱病および不安を含む情動性および中毒性の障害、全般性不安障害（ＧＡＤ）、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、胃麻痺および機能性消化不良を含む胃腸障害、関節炎を含む慢性炎症性障害、ＣＯＰＤおよび喘息を含む呼吸器障害、泌尿生殖器障害、感覚障害並びに体性痛および内臓痛を含む疼痛、掻痒、ウイルス性および細菌性感染症並びに増殖性疾患（癌）、並びにそれらの組合せから選択される、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害が体性痛または内臓痛である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害が慢性疾患または障害である、請求項５０から５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

有効量のエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することをさらに含む、請求項５０から５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がエンドソームＣＧＲＰおよび／またはＣＬＲシグナル伝達の阻害剤、任意にＭＫ－３２０７、オルセゲパント、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項５４の方法。

【請求項56】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がコポリマー鎖のポリマーナノ粒子のコア内に含まれる、請求項５５の方法であって、
ここで、該コポリマー鎖は、コア／シェル構造を形成するように集合し、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有する、
方法。

【請求項57】

有効量の請求項１２から１４のいずれか一項に記載の水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、エンドソームＣＧＲＰおよび／またはＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療方法。

【請求項58】

エンドソームＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害が片頭痛並びに疼痛、光恐怖症、音声恐怖症、悪心および嘔吐を含む片頭痛に関連する症状、感覚障害、体性痛および内臓痛を含む疼痛、クラスターおよび慢性の毎日の頭痛に関連する疼痛、ＣＯＰＤおよび喘息を含む呼吸器障害、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、胃麻痺および機能性消化不良を含む胃腸障害、並びに変形性関節症および関節リウマチを含む慢性炎症性障害からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

エンドソームＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患ま
たは障害が体性痛または内臓痛である、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

エンドソームＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害が慢性疾患または障害である、請求項５７から５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

有効量のエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することをさらに含む、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がエンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達の阻害剤、任意にアプレピタント、ボフォピタント、Ｌ－７３３０６０、またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項６１の方法。

【請求項63】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩がコポリマー鎖のポリマーナノ粒子のコア内に含まれる、請求項６１から６２のいずれか一項に記載の方法であって、
ここで、該コポリマー鎖は、コア／シェル構造を形成するように集合し、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを含む、
方法。

【請求項64】

有効量の請求項１５から２２のいずれか一項または請求項２３－３８のいずれか一項に記載の水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療方法であって、ここで、該疾患または障害は、ＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲ、および／またはＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される、方法。

【請求項65】

疾患または障害が、エンドソームＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害、任意に片頭痛並びに疼痛、光恐怖症、音声恐怖症、悪心および嘔吐を含む片頭痛に関連する症状、感覚障害、体性痛および内臓痛を含む疼痛、クラスターおよび慢性の毎日の頭痛に関連する疼痛、ＣＯＰＤおよび喘息を含む呼吸器障害、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、胃麻痺および機能性消化不良を含む胃腸障害、または変形性関節症および関節リウマチを含む慢性炎症性障害である、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

疾患または障害が、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害、任意に化学療法誘発性の吐き気および嘔吐（ＣＩＮＶ）、周期的嘔吐症候群、術後の吐き気および嘔吐、鬱病および不安を含む情動性および中毒性の障害、全般性不安障害（ＧＡＤ）、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、胃麻痺および機能性消化不良を含む胃腸障害、関節炎を含む慢性炎症性障害、ＣＯＰＤおよび喘息を含む呼吸器障害、泌尿生殖器障害、感覚障害並びに体性痛および内臓痛を含む疼痛、掻痒、ウイルス性および細菌性感染症並びに増殖性疾患（癌）、並びにそれらの組合せである、請求項６４に記載の方法。

【請求項67】

疾患または障害が体性痛または内臓痛である、請求項６４から６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

疾患または障害が慢性疾患または障害である、請求項６４から６７のいずれか一項に記
載の方法。

【請求項69】

エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療における使用のための、請求項９から２２および３１から３８のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項70】

エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療のための薬剤の製造における、請求項９から２２および３１から３８のいずれか一項に記載の水性液体の使用。

【請求項71】

エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害が、化学療法誘発性の吐き気および嘔吐（ＣＩＮＶ）、周期的嘔吐症候群、術後の吐き気および嘔吐、鬱病および不安を含む情動性および中毒性の障害、全般性不安障害（ＧＡＤ）、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、胃麻痺および機能性消化不良を含む胃腸障害、関節炎を含む慢性炎症性障害、ＣＯＰＤおよび喘息を含む呼吸器障害、泌尿生殖器障害、感覚障害並びに体性痛および内臓痛を含む疼痛、掻痒、ウイルス性および細菌性感染症並びに増殖性疾患（癌）、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６９に記載の使用または請求項７０の使用のための水性液体。

【請求項72】

エンドソームＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療における使用のための、請求項１２から１４、１６から２２、および３４から３８のいずれか一項に記載の水性液体。

【請求項73】

エンドソームＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療のための薬剤の製造における、請求項１２から１４、１６から２２、および３４から３８のいずれか一項に記載の水性液体の使用。

【請求項74】

エンドソームＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害が、片頭痛並びに疼痛、光恐怖症、音声恐怖症、悪心および嘔吐を含む片頭痛に関連する症状、感覚障害、体性痛および内臓痛を含む疼痛、クラスターおよび慢性の毎日の頭痛に関連する疼痛、ＣＯＰＤおよび喘息を含む呼吸器障害、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、胃麻痺および機能性消化不良を含む胃腸障害、または変形性関節症および関節リウマチを含む慢性炎症性障害からなる群から選択される、請求項７２に記載の使用または請求項７３の使用のための水性液体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年１０月２２日付で出願されたオーストラリア仮出願番号２０１８９０３９９７号の優先権を主張し、かかる仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法に関する。特に、本発明は、エンドソームＧＰＣＲの疎水性モジュレーターの標的化送達のためのポリマーナノ粒子の使用、並びに関連する疾患および障害の治療におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
細胞の細胞外環境に応答する能力は、細胞内シグナル伝達経路を迅速に開始する細胞外リガンドに結合するための、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）および受容体型チロシンキナーゼ（ＥＧＦまたはインスリン受容体などのＲＴＫ）などの細胞表面シグナル伝達タンパク質を必要とする。いったん細胞応答が達成されると、これらのシグナルは、β－アレスチン１／２アダプタータンパク質への結合、およびエンドソーム膜ネットワークへのリクルートメントのためのクラスリン／ダイナミン媒介経路を介したインターナリゼーションによって終結され得る。古典的な受容体シグナル伝達パラダイムは、インターナリゼーションが初期エンドソームにおける受容体結合リガンド複合体を解体し、受容体をリサイクルエンドソーム中にまたは分解性リソソーム経路に向けて分別することによってシグナル終結を促進すると仮定する。この仮説は、持続的なエンドソーム由来シグナル伝達プロセスを開始できる同族のＧタンパク質に結合したままのインターナライズされた受容体の証拠によって異議を唱えられている。

【0004】

細胞表面受容体の最大ファミリーであるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、大多数の病態生理学的プロセスに関与し、約３０％の治療薬の標的である（Ａｕｄｅｔ，Ｍ．＆Ｂｏｕｖｉｅｒ，Ｍ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００８、４、３９７－４０３）。細胞表面ＧＰＣＲは、細胞外リガンドと相互作用してヘテロ三量体Ｇタンパク質に結合し、これにより、原形質膜に限界を定められたシグナル（セカンドメッセンジャーの形成、成長因子受容体のトランス活性化、イオンチャネルの調節）が引き起こされる。リガンドの除去およびβ－アレスチン（βａｒｒ）との受容体の共役は、原形質膜シグナルを終結させる。

【0005】

最近まで、ＧＰＣＲの活性化、引き続く下流シグナル伝達およびシグナル終結は、もっぱら原形質膜で起こると広く考えられていた。原形質膜シグナル伝達は、活性リガンド結合受容体コンフォメーションに選択的なＧＰＣＲキナーゼ（ＧＲＫ）による受容体のリン酸化を介した活性化から数分以内に終結する。ＧＲＫはＧＰＣＲのＣ末端Ｓ／Ｔリッチドメインをリン酸化する（Ｓａｔｏ，Ｐ．Ｙ．ら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１５、９５、３７７－４０４）。次いで、リン酸化された受容体は、βａｒｒに結合し、これが受容体とＧタンパク質との間の結合を立体的に防ぎ、アゴニストを介したＧタンパク質の活性化を終結させる。βａｒｒは、ダイナミンおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスを介して、細胞表面から初期エンドソームへのリガンド結合受容体の移動をさらに促進する。いったんエンドサイトーシスが行われると、リガンドおよびリン酸基がＧＰＣＲから除去され、受容体は、細胞膜に迅速に再分配されるか、または分解
のためにリソソームに輸送される。

【0006】

しかしながら、最近、多様な範囲のＧＰＣＲが従来のパラダイムに常に従うわけではないことが発見されている。研究により、リガンドの結合および受容体の活性化に続いて、一部の細胞表面ＧＰＣＲは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のシグナル伝達が長期にわたって維持される初期エンドソームにインターナライズし再分布することが見い出されている。従って、エンドソームは、単にリサイクルまたは分解経路へのＧＰＣＲ輸送の導管として機能するというよりむしろ、シグナル伝達の重要な部位であり得る（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００９、１０６、１７６１５－１７６２２）。ＧＰＣＲおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼをエンドソームにリクルートすることにより、βａｒｒは、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を媒介することができる（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ ２００９、１０６、１７６１５－１７６２２；ＤｅＦｅａ，Ｋ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００、９７、１１０８６－１１０９１；ＤｅＦｅａ，Ｋ．Ａ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０００、１４８、１２６７－１２８１）。

【0007】

βａｒｒは、原形質膜およびエンドソーム膜の活性化受容体に多様なシグナル伝達タンパク質をリクルートし、シグナル伝達の重要なメディエーターである。ＭＡＰＫカスケード［ＥＲＫ、ｃ－Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ３８］は、最も完全に特徴付けられたβａｒｒ依存性シグナル伝達経路である。βａｒｒがシグナル伝達に積極的に関与するものであるという最初の証拠は、βａｒｒのドミナントネガティブ変異体がβ_２ＡＲによって誘導されるＥＲＫ１／２の活性化を阻害したという観察であった（Ｄａａｋａ
Ｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８、２７３，６８５－６８８）。引き続いて、βａｒｒは、β_２ＡＲをｃ－Ｓｒｃに共役させてＥＲＫ１／２の活性化を媒介することが見い出された（Ｌｕｔｔｅｒａｌｌ Ｌ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９、２８３、６５５－６６１）。βａｒｒは、ニューロキニン－１受容体（ＮＫ_１Ｒ）、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ_２）、アンジオテンシンＩＩ型１Ａ受容体（ＡＴ_１ＡＲ）、およびバソプレシンＶ２受容体（Ｖ_２Ｒ）を含む他のＧＰＣＲによるＥＲＫ１／２シグナル伝達にも同様に関与する。これらの観察は、βａｒｒが活性化されたＧＰＣＲをＭＡＰＫシグナル伝達複合体と共役させる足場であるという見解につながった。βａｒｒは、それによって原形質膜でのＧタンパク質依存性シグナル伝達とは異なるＧＰＣＲシグナル伝達の第２波を媒介する。

【0008】

従って、エンドサイトーシスされたＧＰＣＲを調節することは、この大きな受容体ファミリーに関連する膨大な数の疾患および障害を治療する新規な方法を有利に提供し得る。

【発明の概要】

【0009】

ＧＰＣＲのモジュレーターがエンドサイトーシスされた受容体と相互作用することができる、該モジュレーターをエンドソーム内腔に送達するための新しい方法が提供される。

【0010】

従って、一面においては、本発明は、コア／シェル構造を形成するように集合したコポリマー鎖のポリマーナノ粒子を含む水性液体を提供し、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有し、
ここで、該ナノ粒子は、そのコア内に、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含む。

【0011】

一つの実施態様においては、本明細書で開示されるポリマーナノ粒子は、ミセルである
。

【0012】

別の面においては、本発明は、コア／シェル構造を形成するように集合したコポリマー鎖のポリマーナノ粒子を含む水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法を提供し、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有し、
ここで、該ナノ粒子は、そのコア内に、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含み、
およびここで、該酸応答性ポリマーブロックは、エンドソーム内腔の酸性環境において遷移を受け、これにより、集合したコポリマー鎖が解体し、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩がエンドソームに放出される。

【0013】

一つの実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩である。

【0014】

一面においては、本発明は、有効量の本発明による水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法を提供する。

【0015】

別の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩である。

【0016】

従って、本発明のさらなる面においては、有効量の本発明による水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療方法が提供される。

【0017】

別の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、エンドソームＣＧＲＰおよび／若しくはＣＬＲシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩である。

【0018】

従って、本開示のさらなる面においては、有効量の本開示による水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、エンドソームＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療方法が提供される。

【0019】

いくつかの実施態様においては、本明細書で開示される水性液体は、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩をさらに含み、該エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、ポリマーナノ粒子のコア内に含まれる。

【0020】

従って、別の面においては、本明細書で提供されるのは、コア／シェル構造を形成するように集合したコポリマー鎖のポリマーナノ粒子を含む水性液体であり、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロ
ックを有し、
ここで、該ナノ粒子はそのコア内に、
ａ）エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩；および
ｂ）エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含む。

【0021】

さらなる面においては、本明細書で提供されるのは、コア／シェル構造を形成するように集合したコポリマー鎖のポリマーナノ粒子を含む水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法であり、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有し、
ここで、該ナノ粒子は、そのコア内に、
ａ）エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩；および
ｂ）エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含み、
およびここで、該酸応答性ポリマーブロックは、エンドソーム内腔の酸性環境において遷移を受け、これにより、集合したコポリマー鎖が解体し、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩がエンドソームに放出される。

【0022】

いくつかの実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩である。

【0023】

いくつかの実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、ＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達の阻害剤、またはその薬学的に許容される塩である。

【0024】

従って、別の実施態様においては、本明細書で提供されるのは、有効量の本開示による水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療方法であり、ここで該疾患または障害は、ＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲ、および／またはＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患／障害である。

【0025】

別の態様においては、本明細書で提供されるのは、有効量の
１）第１の水性液体またはその医薬組成物（ここで、該第１の水性液体は、本明細書のどこにでも記載されているようにポリマーナノ粒子のコア内にＮＫ_１Ｒ阻害剤を含む）；および
２）第２の水性液体またはその医薬組成物（ここで、該第２の水性液体は、本明細書のどこにでも記載されているようにポリマーナノ粒子のコア内にＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲの阻害剤を含む）
をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法である。

【0026】

カルシトニン遺伝子関連ペプチド（「ＣＧＲＰ」）は、神経系全体で発現することが知られている。ＣＧＲＰ受容体は、カルシトニン受容体様受容体（「ＣＬＲ」）、ＧＰＣＲ
、およびリガンド特異性を付与し、細胞表面へのＣＬＲ標的化を確実にする単一の膜貫通タンパク質である受容体活性修飾タンパク質１（ＲＡＭＰ１）を含む。有害な刺激は、脊髄の後角および末梢組織の一次感覚ニューロンの末端からのＣＧＲＰ放出を引き起こす。ＣＧＲＰは、ＣＬＲ／ＲＡＭＰ１を活性化して脊髄ニューロンで痛覚を誘発し、末梢細動脈で神経原性炎症を引き起こす。Ｙａｒｗｏｏｄら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １１４（４６）：１２３０９－１２３１４。）を参照されたい。

【0027】

本発明のさらに別の面においては、本発明による水性液体を含む医薬組成物が提供される。

【0028】

本発明のこれらおよび他の面は、付随する実施例および特許請求の範囲に関連して以下の詳細な説明を読むと、当業者により明らかになるであろう。
本発明は、以下の非限定的な図は参照のみとして、例によって本明細書に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、ＤＩＰＭＡおよびＢＭＡナノ粒子の概略図を示す。Ａ）ＤＩＰＭＡナノ粒子は、Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）の疎水性コアおよびＰ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）の親水性シェルで構成されている。一方、Ｂ）ＢＭＡナノ粒子は、同じ親水性シェルによって形成されるが、疎水性コアをＢＭＡに置き換える。Ｃ）は、ＤＩＰＭＡナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。上の画像はＤＩＰＭＡ－Ａｐがロードされたナノ粒子を示し、下の画像はＤＩＰＭＡ－空ナノ粒子を示す。Ｄ）は、ＤＩＰＭＡおよびＢＭＡナノ粒子のｐＨ解体を示すグラフ表示を示す。ナイルレッドをロードした２００μｇのＤＩＰＭＡおよびＢＭＡナノ粒子を、７．４から５．０の範囲の異なるｐＨのＰＢＳ溶液に添加した。ＤＩＰＭＡ－Ｎｒナノ粒子の５０％の解体が、ｐＨ６．０８±０．０６４で観察されるが、ＢＭＡ－Ｎｒは、ｐＨの変化に伴う解体特性を示さなかった。平均値±ＳＥＭ。ｎ＝３。

【図2】図２は、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルのグラフ表示を示す。Ａ）Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）を形成するための、カチオン性モノマーＤＭＡＥＭＡおよび親水性モノマーＰＥＧＭＡの重合。Ｂ）Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）を形成するための、ｐＨ応答性モノマーＤＩＰＭＡおよび電荷スクリーニングモノマーＤＥＧＭＡの添加によるＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）の鎖延長。Ｃ）非ｐＨ応答性コポリマーＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－（ＢＭＡ）を形成するための、ＢＭＡによる、Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）の鎖延長。

【図3】図３は、Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）および結果として得られるジブロックコポリマーＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）およびＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＢＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）のＧＰＣトレースのグラフ表示を示す。Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）を形成するためのモノマーＤＩＰＭＡおよびＤＥＧＭＡによる鎖延長およびＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＢＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）を形成するためのＢＭＡによる鎖延長後に、高分子量へのシフト（すなわち、より短い保持時間）が観察された。

【図4】図４は、ＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰでトランスフェクトされ、１０ｎＭのＳＰで刺激されたＨＥＫ－２９３細胞でのＣｙ５で標識されたＤＩＰＭＡナノ粒子の取り込みを示す画像を示す。ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子を、１０ｎＭ ＳＰ添加の４０分前にインキュベートした。画像を、ＳＰ添加のＡ）３０分後およびＢ）６０分後に撮った。原形質膜並びにエンドソームに局在するＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰが、観察される。ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子のＮＫ_１ＲＧＦＰ陽性エンドソームとの共分布は、選択された全ての時点で観察される。スケールバー＝１μｍ

【図5】図５は、ＳＰによって刺激され、Ａｐによって阻害された核ＥＲＫの濃度用量応答曲線のグラフ表示を示す。Ａ）異なる濃度のＳＰを使用した経時的な核ＥＲＫ応答。Ｂ）異なる濃度のＡｐとプレインキュベートした後、５ｎＭ ＳＰで刺激。Ｃ）ＳＰおよびＡｐ核の核ＥＲＫ応答の６５分の時間トレースのＡＵＣ。結果を、ＰＤＢｕ１μＭに対する最大核ＥＲＫ応答によって正規化された値として表す。平均値±ＳＥＭ。ｎ＝６。

【図6】図６は、空のナノ粒子で刺激されたＨＥＫ－２９３およびＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞の細胞内カルシウム測定値のグラフ表示を示す。ベースラインを、１０、３．１６および１μｇのナノ粒子を添加する前に５分間測定した Ａ）およびＢ）は、ＤＩＰＭＡおよびＢＭＡナノ粒子で刺激されたＨＥＫ－２９３およびＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞におけるｉ［Ｃａ＋２］測定にそれぞれ対応する。Ｃ）およびＤ）は、Ａ）およびＢ）のＡＵＣを示す。データを平均値±ＳＥＭとして示す。ｎ＝４。

【図7】図７は、ＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞に対する核ＥＲＫシグナル伝達および細胞生存率の空のナノ粒子の効果を示す。Ａ）ナノ粒子を、核ＥＲＫの活性化がないことを示す空のナノ粒子によって引き起こされる核ＥＲＫ活性化の測定の前に３０分間インキュベートした。Ｂ）核ＥＲＫ時間トレースのＡＵＣ（ｎ＝６）。ＣおよびＤ）ａｌａｍａｒＢｌｕｅ細胞生存率試薬を使用して評価した細胞の還元力に対するナノ粒子の効果（ｎ＝４）。データを平均値±ＳＥＭとして示す。

【図8】図８は、１０μｇの空のＤＩＰＭＡおよびＢＭＡナノ粒子で刺激されたＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞における核ＥＲＫ測定値のグラフ表示を示す。ナノ粒子を、ベースライン読み取りの３０分前に添加した。Ａ）ベースラインを５分間測定した後、５ｎＭのＳＰを添加した。Ｂ）Ａに示す時間トレースの曲線下の面積。データを平均値±ＳＥＭとして示す。ｎ＝２

【図9】図９は、ＤＩＰＭＡナノ粒子の投与後の自発運動パターンの評価のグラフ表示を示す。動物をＤＩＰＭＡ－Ａｐおよび対照ナノ粒子で処置し、落下までの潜時を処置後３０～２４０分記録した。ナノ粒子は、ビヒクルと比較したとき、落下までの潜時に差を生じさせなかった。平均値±ＳＥＭ。ｎ＝３。

【図10】図１０は、髄腔内投与後のＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子の分布を示す。Ａ）ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５投与は、注射部位（Ｌ３－Ｌ４）内に投与後２時間で減少し始め、２４時間後に完全に失われる局在した蛍光を示した。Ｂ）Ａに示す画像の放射効率の定量化。平均値±ＳＥＭ。ｎ＝３。Ｃ）ロータロッドを使用して評価したナノ粒子で処置した動物の自発運動（ｎ＝３）。

【図11】図１１は、カプサイシン誘発性の急性疼痛モデルにおけるＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子の鎮痛能力の評価を示す。ナノ粒子を、ｉ．ｐｌカプサイシン注射の３０分前にｉ．ｔ投与し、機械的痛覚過敏を、Ａ）カプサイシン刺激足（同側）およびＢ）非刺激足（対側）でフォンフレイ（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ）フィラメントを使用して評価した。値データを、基底フォンフレイ反応のパーセンテージとして示す。平均値±ＳＥＭ。ｎ＝６

【図12】図１２は、Ａ）１００、３００ｎＭおよび１μＭのアプレピタント（濃度あたりｎ＝４）、Ｂ）１００、３００若しくは５００ｎＭのアプレピタントをロードした１０、３０若しくは５０μｇのＢＭＡナノ粒子（各濃度あたりｎ＝６）、またはＣ）１００、３００若しくは５００ｎＭのアプレピタントをロードした１０、３０若しくは５０μｇの酸応答性ＤＩＰＭＡナノ粒子（各濃度あたりｎ＝６）の投与後にランダルセリット（Ｒａｎｄａｌｌ－Ｓｅｌｉｔｔｏ）電子痛覚計を使用して評価した慢性疼痛モデルにおけるＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子の鎮痛能力の評価を示す。

【図13】図１３は、ＤＥＡＥＭＡおよびＤＩＰＭＡ粒子で処置した細胞における細胞生存率の指標としてのミトコンドリア機能のグラフ表示を示す。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを使用してミトコンドリア活性を測定することにより、細胞生存率を決定した。細胞を、漸増で０％、５％、１０％、２０％および５０％のＤＥＧＭＡを含むＤＥＡＥＭＡ（Ａ～Ｄ）またはＤＩＰＭＡ（Ｅ～Ｈ）ナノ粒子で２４時間まで処置した。細胞生存率を、ビヒクル対照のパーセンテージとして表した。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ；ｎ＝４～５の個別実験。

【図14】図１４は、ＤＥＡＥＭＡおよびＤＩＰＭＡ粒子で処置した細胞における細胞死の指標としての核膜透過性のグラフ表示を示す。細胞死を、ヨウ化プロピジウムを使用して核膜透過性を測定することによって決定した。細胞を、漸増で０％、５％、１０％、２０％および５０％のＤＥＧＭＡを含むＤＥＡＥＭＡ（Ａ～Ｄ）またはＤＩＰＭＡ（Ｅ～Ｈ）ナノ粒子で２４時間まで処置した。細胞死を、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（最大細胞死）のパーセンテージとして表した。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ；ｎ＝４～５の個別実験。

【図15】図１５は、１２時間、２４時間、４８時間、および７２時間の曝露後の異なる濃度でのＤＥＡＭＡおよびＤＩＰＭＡナノ粒子の細胞生存率アッセイの結果を示す。

【図16】図１６は、ＨＥＫ－２９３細胞におけるＤＩＰＭＡナノ粒子の取り込みおよび解体を示す。Ａ）は、Ｒａｂ５－ＧＦＰを発現する細胞へのＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子の取り込みを示す。Ｂ）は、３０分後のＲａｂ５－ＧＦＰ初期エンドソームおよびＲａｂ７－ＧＦＰ後期エンドソームにおけるＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子の共局在を示す。Ｃ）は、ＮＫ_１Ｒエンドサイトーシスを誘導するためのＳＰでの刺激および添加の３０分後のＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰを含むエンドソームにおけるＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子の共局在を示す。Ｄ）～Ｆ）は、ハイコンテントイメージング（Ｄ、Ｅ）および共焦点顕微鏡（Ｆ）によって決定したＤＩＰＭＡ－ＣＯナノ粒子の取り込みを示す。Ｄ）は、クマリン１５３細胞蛍光の時間経過を示し；Ｅ）は、３０分にわたる積分応答を示す。ＰｉｔＳｔｏｐ２（ＰＳ２）、Ｄｙｎｇｏ４ａ（Ｄｙ４）およびバフィロマイシンＡ（ＢＦＡ）は、クマリン１５３細胞蛍光の蓄積を阻害した。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、代表的な結果、ｎ＝４～５の実験；Ｄ、Ｅ、ｎ＝４～５の実験。

【図17】図１７は、ＨＥＫ－２９３細胞におけるＤＩＰＭＡナノ粒子の取り込みおよび解体を示す。Ａ）６０分後のＲａｂ５－ＧＦＰ初期エンドソームおよびＲａｂ７－ＧＦＰ後期エンドソームにおけるＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子の共局在を示す。Ｂ）は、ＮＫ_１Ｒエンドサイトーシスを誘導するためのＳＰでの刺激の６０分後のＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰを含むエンドソームにおけるＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子の共局在を示す。添加。代表的な結果、ｎ＝４～５の実験。

【図18】図１８は、急性炎症性および神経因性疼痛に対するＤＩＰＭＡ－ＡＰおよびＢＭＡ－ＡＰナノ粒子の効果を示す。Ａ）マウスにおける急性痛覚のカプサイシン（ＣＡＰ）誘発性モデルにおいて、ビヒクル（Ｖｅｈ）、ＡＰまたはナノ粒子を、カプサイシンの足底内（ｉ．ｐｌ．）注射の３０分前に髄腔内（ｉ．ｔ．）注射によって投与した。マウスにおける持続性炎症性疼痛のＣＦＡ誘発性モデルにおいては、ＣＦＡを足底内注射によって投与し；４８時間後、ビヒクル、ＡＰまたはナノ粒子が髄腔内注射によって投与した。慢性神経因性疼痛のＳＮＳモデルを、ラットで研究した。ビヒクル、ＡＰまたはナノ粒子を、ＳＮＳの１０日後に髄腔内注射によって投与した。足引っ込め反応を、マウスではフォンフレイフィラメント（ＶＦＦ）を使用し、ラットではランダルセリット試験を使用して評価した。Ｂ）およびＣ）は、マウスにおけるカプサイシン誘発機械的アロディニアを示す。Ｄ）～Ｆ）は、マウスにおけるＣＦＡ誘発性の機械的痛覚過敏を示す。Ｇ）～Ｉ）は、ラットにおけるＳＮＳ誘発性の機械的痛覚過敏を示す。（ｎ）は、動物数を示す。ｎ＝６。＃＃＃＝^＊＊＊＊、＃＝＊＊＊。Ｐ＜０．００５。

【図19】図１９は、ＳＮＳモデルにおける神経因性疼痛に対するＤＩＰＭＡ－ＡＰおよびＢＭＡ－ＡＰナノ粒子の効果を示す。慢性神経因性疼痛のＳＮＳモデルを、ラットで研究した。ビヒクル、ＡＰ、ＤＩＰＭＡ－ＡＰ、またはＢＭＡ－ＡＰを、ＳＮＳの１０日後に髄腔内注射によって投与した。足引っ込め反応を、ランダルセリット試験を使用して評価した。Ａ）は、時間経過に伴う引っ込め閾値の変動を示す。Ｂ）は、０～７時間の曲線下面積（ＡＵＣ）プロットである。（ｎ）は、動物数を示す。ｎ＝６。＃＃＝^＊＊＊＊、＃＝^＊＊＊。Ｐ＜０．００５。

【図20】図２０は、ＤＩＰＭＡ－ＡＰおよびＢＭＡ－ＡＰナノ粒子による疼痛の伝達の感作および活性化を示す。Ａ）～Ｆ）は、ＳＮＳラットにおけるＣ線維反射およびワインドアップ（ｗｉｎｄ－ｕｐ）を示す。Ｃ線維反射（Ａ～Ｃ）およびワインドアップ（Ｄ～Ｆ）を、ＳＮＳの１０日後に測定した。ビヒクル（Ｖｅｈ）、ＡＰまたはＤＩＰＭＡ－ＡＰを、髄腔内注射によって投与した。Ａ）およびＤ）は、ＡＰおよびＤＩＰＭＡ－ＡＰを比較する代表的な記録を示す。Ｂ）およびＥ）は、効果の時間経過を示す。Ｃ）およびＦ）は、積分応答を示す。（ｎ）動物数。ｎ＝５。＃＃＝^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０５。Ｇ）～Ｉ）は、ラット脊髄のスライスにおけるニューロンのＳＰ誘発興奮の細胞付着パッチクランプ記録を示す。Ｇ）は、代表的なトレース、ｎ＝６－８回の実験を示す。Ｈ）は、正規化された発火率を比較する。Ｉ）は、発火時間を比較する。ｎ＝６～８。^＊＊Ｐ＜０．０５。

【図21】図２１は、ＤＩＰＭＡ－ＡＰおよびＢＭＡ－ＡＰナノ粒子によるＨＥＫ２９３細胞のエンドソームにおけるＮＫ_１Ｒシグナル伝達の拮抗作用を示す。Ａ）～Ｃ）は、ダイナミン野生型（Ｄｙｎ ＷＴ、Ａ）またはダイナミンＫ４４Ｅ（Ｄｙｎ Ｋ４４Ｅ、Ｂ）を発現するＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞における核ＥＲＫのＳＰ誘発活性化を示す。Ｃ）は、ＳＰ濃度－応答曲線を示す（ｎ＝６）。Ｄ）およびＥ）は、３０分にわたるＨＥＫ２９３細胞における核ＥＲＫ活性に対するＢＭＡ－空およびＤＩＰＭＡ－空の効果の欠如を示す（ｎ＝６～７）。Ｆ）は、２４時間および４８時間にわたるＨＥＫ２９３細胞の生存率に対するＢＭＡ－空およびＤＩＰＭＡ－空の効果の欠如を示す（ｎ＝４）。Ｇ）～Ｉ）は、ＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞における核ＥＲＫのＳＰ誘発活性化に対する遊離ＡＰ、ＢＭＡ－ＡＰおよびＤＩＰＭＡ－ＡＰの効果を示す。細胞をＡＰまたはナノ粒子とともに３０分間インキュベートし；それらを、ＳＰでチャレンジした（洗浄なし、Ｇ）か、または洗浄し、アンタゴニストを含まない培地中に回収し、次いでＳＰでチャレンジした（洗浄後、Ｈ）。Ｉ）は、３０分のＥＲＫアッセイのＡＵＣである。結果を、ＰＤＢｕ１μＭに対する最大核ＥＲＫ応答によって正規化された値として表す。（ｎ＝６）。Ｐ＜０．０５。

【図22】図２２は、ＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞における核ＥＲＫのＳＰ誘発活性化を示す。Ａ）は、核ＥＲＫ活性に対する段階的濃度のＳＰの効果を示す。Ｂ）は、ＳＰ濃度－応答曲線を示す。Ｃ）は、ＳＰ（５ｎＭ）に対する核ＥＲＫ応答に対する段階的濃度のＡＰの効果を示す。Ｄ）は、ＡＰ濃度－応答曲線を示す。（ｎ＝７～８の実験）。

【図23】図２３は、Ａ）３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、および１０００ｎＭのＭＫ－３２０７（濃度あたりｎ＝４）、およびＢ）３０ｎＭ、５０ｎＭ、および１００ｎＭのＭＫ－３２０７（各濃度あたりｎ＝４）をロードした酸応答性ＤＩＰＭＡナノ粒子の投与後にフォンフレイヘアによって評価した機械的アロディニアを伴うＣＦＡモデルにおける酸応答性ＤＩＰＭＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子の鎮痛能力の評価を示す。

【図24】図２４は、アプレピタント／ＭＫ－３２０７の初期ロード比（ＬＣ－ＭＳ評価）に対する１ｍｇ／ｍＬ ＤＩＰＭＡポリマー組成物中のロードされたアプレピタントおよびＭＫ－３２０７（μＭ）の濃度を示す。平均値－／＋ ＳＤ、ｎ＝４

【図25】図２５は、１２０ｎＭのアプレピタント＋１２０ｎＭのＭＫ－３２０７（ｎ＝４）；および（８２ｎＭのアプレピタント＋１２ｎＭのＭＫ－３２０７）、（８１ｎＭのアプレピタント＋２５ｎＭのＭＫ－３２０７）、および（８０ｎＭのアプレピタント＋８１ｎＭのＭＫ－３２０７）をロードした酸応答性ＤＩＰＭＡナノ粒子の投与後にフォンフレイヘアによって評価した機械的アロディニアを伴うＣＦＡモデルにおける二重ロードＤＩＰＭＡ－（Ａｐ＋ＭＫ－３２０７）ナノ粒子の鎮痛能力の評価を示す（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．００１；２元配置分散分析、ダネットの事後検定）。

【図26】図２６は、１２０ｎＭのアプレピタント＋１２０ｎＭのＭＫ－３２０７（ｎ＝４）；並びにＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子（Ａｐで３０ｎＭ）＋ＤＩＰＭＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子（ＭＫ－３２０７で３０ｎＭ）、ＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子（Ａｐで６０ｎＭ）＋ＤＩＰＭＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子（ＭＫ－３２０７で６０ｎＭ）、およびＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子（Ａｐで１２０ｎＭ）＋ＤＩＰＭＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子（ＭＫ－３２０７で１２０ｎＭ）の投与後にフォンフレイヘアによって評価した機械的アロディニアを伴うＣＦＡモデルにおけるＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子およびＤＩＰＭＡ－（ＭＫ３２０７）ナノ粒子の同時投与の鎮痛能力の評価を示す。（^＊Ｐ＜０．０５、＃Ｐ＜０．００１；２元配置分散分析、ダネットの事後検定）。

【発明を実施するための形態】

【0030】

発明の詳細な説明
この明細書では、当業者によく知られている多くの用語が使用されている。それにもかかわらず、明確化のために、多くの用語が定義される。

【0031】

用語「ハロ」は、フルオロ（Ｆ）、クロロ（Ｃｌ）、ブロモ（Ｂｒ）、またはヨード（Ｉ）を指す。
用語「アシル」は、式－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒのラジカルを指し、ここで、Ｒは、化学置換基である。非限定的な例として、Ｒは、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクリルから独立して選択することができ、ここで、各Ｒは、本明細書の他の場所で定義されるように任意に置換されている。アシルの非限定的な例は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｍｅおよび－Ｃ（＝Ｏ）Ｐｈを含む。

【0032】

用語「アシルオキシ」は、式－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲのラジカルを指し、ここで、Ｒは、化学置換基である。Ｒは、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクリルから独立して選択することができ、ここで、各Ｒは、本明細書の他の場所で定義されるように任意に置換されている。アシルオキシの非限定的な例は、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＭｅおよび－Ｃ（＝Ｏ）ＯＰｈを含む。

【0033】

用語「アミノ」は、式－ＮＲ_２の窒素中心ラジカルを指し、ここで、各Ｒは、独立して置換基である。非限定的な例として、各Ｒは、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクリルから独立して選択することができ、ここで、各Ｒは、本明細書の他の場所で定義されるように任意に置換されている。アミノの非限定的な例は、Ｎ（アルキル）_２（例えば、ＮＭｅ_２、ＮｉＰｒ_２）、ＮＨ_２、ＮＨ（アルキル）、およびＮ（Ｐｈ）_２を含む。

【0034】

用語「アルキル」は、示された数の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖であってもよい炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ_１－１０は、該基が１から１０個（両端を含む）の炭素原子をその中に有してもよいことを示す。非限定的な例は、メチル、エチル、ｉｓｏ－プロピル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルを含む。

【0035】

用語「ハロアルキル」は、１つ以上の水素原子が独立して選択されたハロで置き換えられているアルキルを指す。

【0036】

用語「アルコキシ」は、－Ｏ－アルキルラジカル（例えば、－ＯＣＨ_３）を指す。

【0037】

用語「ハロアルコキシ」は、－Ｏ－ハロアルキルラジカル（例えば、－ＯＣＨ_３）を指す。

【0038】

用語「アルキレン」は、分枝状または非分枝状の二価アルキル（例えば、－ＣＨ_２－）を指す。

【0039】

用語「アリーレン」などは、環系の二価形態、ここでは二価アリールを指す。

【0040】

用語「アルケニル」は、１つ以上の炭素－炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖であってもよい炭化水素鎖を指す。アルケニル部分は、示された数の炭素原子を含む。例えば、Ｃ_２－６は、該基が２から６個（両端を含む）の炭素原子をその中に有してもよいことを示す。

【0041】

用語「アルキニル」は、１つ以上の炭素－炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖であってもよい炭化水素鎖を指す。アルキニル部分は、示された数の炭素原子を含む。例えば、Ｃ_２－６は、該基が２から６個（両端を含む）の炭素原子をその中に有してもよいことを示す。

【0042】

用語「アリール」は、各環の０、１、２、３、または４個の原子が置換基で置換されていてもよい、６炭素単環式、１０炭素二環式、または１４炭素三環式芳香環系を指し、ここで、単環式ラジカルを含む環は、芳香族であり、二環式または三環式ラジカルを含む縮合環の少なくとも１つは、芳香族であり、例えばテトラヒドロナフチルである。アリール基の例は、フェニル、ナフチルなども含む。

【0043】

本明細書で使用される用語「シクロアルキル」または「カルボシクリル」は、３から１０個の炭素、好ましくは３から８個の炭素、より好ましくは３から６個の炭素を有する飽和環状炭化水素基を含み、ここで、シクロアルキル基は、任意に置換されていてもよい。好ましいシクロアルキル基は、限定されることなく、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルを含む。

【0044】

用語「ヘテロアリール」は、単環式の場合は１－３個のヘテロ原子、二環式の場合は１－６個のヘテロ原子、または三環式の場合は１－９個のヘテロ原子を有する芳香族５－８員単環式、８－１２員二環式、または１１－１４員三環式環系を指し、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子、および単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ１－３、１－６、または１－９個のＮ、Ｏ、若しくはＳのヘテロ原子）、ここで、各環の０、１、２、３、または４個の原子は、置換基で置換されていてもよく、およびここで、単環式ラジカルを含む環は、芳香族であり、二環式または三環式ラジカルを含む縮合環の少なくとも１つは、芳香族である（しかし、ヘテロ原子を含む環である必要はなく、例えばテトラヒドロイソキノリニル。例示的なヘテロアリール系は、以下の環系に由来するが、これらに限定されない：ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール（＝［１，３］オキサゾール）、イソオキサゾール（＝［１，２］オキサゾール）、チアゾール（＝［１，３］チアゾール）、イソチアゾール（＝［１，２］チアゾール）、［１，２，３］トリアゾール、［１，２，４］トリアゾール、［１，２，４］オキサジアゾール、［１，３，４］オキサジアゾール、［１，２，４］チアジアゾール、［１，３，４］チアジアゾール、テトラゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、［１，２，３］トリアジン、［１，２，４］トリアジン、［１，３，５］トリアジン、インドール、イソインドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン ［１，３］ベンゾオキサゾール、［１，３］ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、インダゾール、キノリン、イソキノリン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン、フタラジン、さまざまなナフチリジン、例えば［１，８］ナフチリジン、さまざまなチエノピリジン、例えばチエノ［２，３－ｂ］ピリジンおよびプリン。

【0045】

用語「ヘテロシクリル」は、単環式の場合は１－３個のヘテロ原子、二環式の場合は１－６個のヘテロ原子、または三環式の場合は１－９個のヘテロ原子を有する非芳香族５－８員単環式、８－１２員二環式、または１１－１４員三環式環系を指し、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子、および単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ１－３、１－６、または１－９個のＮ、Ｏ、若しくはＳのヘテロ原子）、ここで、各環の０、１、２または３個の原子は、置換基で置換されていてもよい。ヘテロシクリル基の例は、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、テトラヒドロフランイルなどを含む。

【0046】

用語「置換された」は、分子の１つ以上の非水素原子上の水素を置換する置換基を有する部分を指す。「置換」または「で置換された」は、そのような置換が置換される原子および置換基の許容される原子価に従うという暗黙のただし書きを含み、置換は、例えば、転位、環化、脱離などによるものなどの変換を自発的に受けない安定な化合物に至ることが理解されるであろう。置換基は、例えば、任意に１つ以上のヒドロキシル、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｃ_１－３アルキル）、および－Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２で置換された－（Ｃ_１－９アルキル）；－（Ｃ_１－９ハロアルキル）；ハライド；ヒドロキシル；カルボニル［－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｃ（Ｏ）Ｒなどの］；チオカルボニル［－Ｃ（Ｓ）ＯＲ、－Ｃ（Ｏ）ＳＲ、および－Ｃ（Ｓ）Ｒなどの］；任意に１つ以上のハライド、ヒドロキシル、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｃ_１－３アルキル）、および-Ｎ（Ｃ_１－３アルキル）_２で置換された－（
Ｃ_１－９アルコキシ）；－ＯＰＯ（ＯＨ）_２；ホスホネート［－ＰＯ（ＯＨ）_２および－ＰＯ（ＯＲ’）_２などの］；－ＯＰＯ（ＯＲ’）Ｒ’’；－ＮＲＲ’；－Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’；－Ｃ（ＮＲ）ＮＲ’Ｒ’’；－Ｃ（ＮＲ’）Ｒ’’；シアノ；ニトロ；アジド；－ＳＨ；－Ｓ－Ｒ；－ＯＳＯ_２（ＯＲ）；スルホネート［－ＳＯ_２（ＯＨ）および－ＳＯ_２（ＯＲ）などの］；－ＳＯ_２ＮＲ’Ｒ’’；および－ＳＯ_２Ｒを含み；ここで、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’の各発生は、Ｈ；－（Ｃ_１－９アルキル）；任意に１－３個のＲ’’’で置換されたＣ_６－１０アリール；Ｎ、Ｏ、およびＳから独立して選択される１－４個のヘテロ原子を有し任意に１－３個のＲ’’’で置換された５－１０員のヘテロアリール；任意に１－３個のＲ’’’で置換されたＣ_３－７カルボシクリル；並びにＮ、Ｏ、およびＳから独立して選択される１－４個のヘテロ原子を有し任意に１－３個のＲ’’’で置換された３－８員のヘテロシクリルから独立して選択され；ここで、各Ｒ’’’は、－（Ｃ_１－６アルキル）、－（Ｃ_１－６ハロアルキル）、ハライド（例えば、Ｆ）、ヒドロキシル、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、－（Ｃ_１－６アルコキシル）、－ＮＲＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’、およびシアノから独立して選択され、ここで、ＲおよびＲ’の各発生は、Ｈおよび－（Ｃ_１－６アルキル）から独立して選択される。いくつかの実施態様においては、置換基は、－（Ｃ_１－６アルキル）、－（Ｃ_１－６ハロアルキル）、ハライド（例えば、Ｆ）、ヒドロキシル、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｃ（Ｏ）Ｒ、－（Ｃ_１－６アルコキシル）、－ＮＲＲ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’、およびシアノから選択され、ここで、ＲおよびＲ’の各発生は、Ｈおよび－（Ｃ_１－６アルキル）から独立して選択される。

【0047】

用語「アプレピタント」、「ボフォピタント」、「Ｌ－７３３０６０」、「ＭＫ－３２０７」、および「オルセゲパント」は、以下の表の構造、化学名、およびＣＡＳ番号を有する化学物質を指す。

【0048】

【0049】

【0050】

本明細書で使用される場合、用語「ＤＩＰＭＡナノ粒子」または「酸応答性ＤＩＰＭＡナノ粒子」は、Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）ジブロックコポリマーから形成されるナノ粒子を意味する。図１に示すように、ＤＩＰＭＡナノ粒子は、Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）の疎水性コアおよびＰ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）の親水性シェルで構成されている。

【0051】

本明細書で使用される場合、用語「ＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子」（または「ＤＩＰＭＡ－ＡＰナノ粒子」）は、アプレピタントをロードした（すなわち、アプレピタントは、ナノ粒子のコア内に含まれている）Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）ジブロックコポリマーから形成されたナノ粒子を意味する。従って、用語「ＤＩＰＭＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子」は、ＭＫ－３２０７をロードしたＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）ジブロックコポリマーから形成されたナノ粒子を意味し；用語「ＤＩＰＭＡ－（Ａｐ＋ＭＫ－３２０７）ナノ粒子」は、アプレピタントおよびＭＫ－３２０７を二重にロードした（すなわち、アプレピタントおよびＭＫ－３２０７の両方が、ナノ粒子のコア内に含まれている）Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂＰ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）ジブロックコポリマーから形成されたナノ粒子を意味する。

【0052】

本明細書で使用される場合、用語「ＢＭＡ－Ａｐナノ粒子」は、アプレピタントがロードされた（すなわち、アプレピタントは、ナノ粒子のコア内に含まれている）Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＢＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）ジブロックコポリマーから形成されたナノ粒子を意味する。

【0053】

サブスタンスＰ（ＳＰ）ニューロキニン１受容体（ＮＫ_１Ｒ）を、活性化時にエンドソームに盛んに輸送するプロトタイプのＧＰＣＲとして研究することにより、エンドソームＧＰＣＲが脊髄ニューロンにおける興奮および痛覚伝達の根底にある持続的なシグナルを伝達することが今や示された。ＳＰは、細胞表面で迅速な一過性のシグナル伝達を開始し、その後、エンドソーム中へのアレスチン媒介インターナリゼーションおよび持続的なシグナル伝達を促進するためのシグナル伝達複合体のリクルートメントが続くことが見い出された。これは最終的に、持続的な脊髄ニューロンの興奮性および中枢性疼痛の伝達などの生理学的結果を伴う、ＭＡＰキナーゼＥＲＫ１／２の長期活性および核移行を含む明確な細胞性の結果をもたらす。

【0054】

これらの知見は、エンドソームにおけるＧＰＣＲの標的化が最適な薬理学的介入に必要であることを示唆する。エンドソームが病態生理学的に重要なプロセスの根底にある区画化されたＧＰＣＲシグナル伝達のプラットフォームであるという概念は、受容体シグナル特異性および治療標的化にとって意味を有する。エンドソーム輸送により、ＧＰＣＲは細胞内区画においてシグナルを生成し、これは同じＧタンパク質およびβａｒｒを活性化するさまざまな受容体がどのように応答を特異的に調節できるかを説明し得る。エンドソームへのＧＰＣＲモジュレーターの送達により、有効性および選択性が強化された、疾患関連プロセスの根底にあるシグナルの標的化が可能になり得る。

【0055】

驚くべきことに、本発明によるポリマーナノ粒子を利用して、ＧＰＣＲの疎水性モジュレーターを有効にエンドソーム内腔にインタクトに送達できることができ、そこでそれらはエンドサイトーシスされた受容体と効率的に相互作用することができることが今や見い出された。

【0056】

本発明のポリマーナノ粒子のインビトロ評価は、空のナノ粒子の投与がｉ［Ｃａ^＋２］流入を妨害も誘発もせず、対照ナノ粒子のみが核ＥＲＫを増加させたことを示す。逆に、ＮＫ_１Ｒアンタゴニストアプレピタント（Ａｐ）をロードしたポリマーナノ粒子は、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達を媒介するとしてＪｅｎｓｅｎらによって以前に記載されたＳＰにトリガーされる核ＥＲＫを減少させることができた（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｄ．Ｄ．ら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ． ２０１７、３１（９） ３９２）。ロータロッドを使用した評価では、ナノ粒子の髄腔内投与がマウスの自発運動パターンを変更しないことも見い出された。本発明のポリマーナノ粒子を、主にＴＲＰＶ１受容体の活性化を介して引き起こされる（Ｓｔｏｒｙ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ． ２００３、１１２（６）、８１
９－２９）カプサイシン急性疼痛モデル（Ｓａｋｕｒａｄａ，Ｔ．ら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９９２、３１（１２）、１２７９－８５）で試験したとき、４時間のカプサイシン効果を通して、ＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子で持続的かつ有意な鎮痛が観察された。カプサイシンは、ラミナＩ／ＩＩにおけるＮＫ_１Ｒ発現後角ニューロン上でＮＫ_１Ｒ（Ｓａｋｕｒａｄａ，Ｔ．ら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９９２、３１（１２）、１２７９－８５）およびホスホノＥＲＫタンパク質（ｐＥＲＫ）（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｄ．Ｄ．ら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ． ２０１７、３１（９） ３９２）の発現を増加させることも知られており、これは、ナノ粒子の鎮痛効果がＮＫ_１Ｒのエンドソームシグナル伝達のダウンレギュレーションに起因し得ることを示す。これらの知見は、ポリマーナノ粒子を介した疎水性ＧＰＣＲモジュレーターの送達が、ＧＰＣＲのエンドソームシグナル伝達を選択的に阻害するための適切かつ効率的な選択肢であり得ることを示唆する。

【0057】

一面においては、本発明は、コア／シェル構造を形成するように集合したコポリマー鎖のポリマーナノ粒子を含む水性液体を提供し、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有し、
ここで、該ナノ粒子は、そのコア内に、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩を含む。

【0058】

一つの実施態様においては、本明細書で開示されるポリマーナノ粒子は、ミセルである。

【0059】

別の面においては、本発明は、コア／シェル構造を形成するように集合したコポリマー鎖のポリマーナノ粒子を含む水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法を提供し、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有し、
ここで、該ナノ粒子は、そのコア内に、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含み、
およびここで、該酸応答性疎水性ポリマーブロックは、エンドソーム内腔の酸性環境において遷移を受け、これにより、集合したコポリマー鎖が解体し、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩がエンドソームに放出される。

【0060】

いくつかの実施態様においては、方法は、有効量のエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することをさらに含む。エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターは、本明細書のどこにでも記載されているとおりであり得る。

【0061】

「水性液体」または「水性環境」への言及は、少なくとも５０重量％の水を含む液体媒体を意味すると理解されるであろう。従って、水性液体媒体は、１つ以上の他の混和性共溶媒を含んでもよい。いくつかの実施態様においては、液体媒体は、主に水、例えば、少なくとも約７０重量％、または少なくとも約８０重量％、または少なくとも約９０重量％、または少なくとも約９５重量％の水を含むであろう。本発明のいくつかの実施態様においては、液体媒体が実質的に水および／または重水からなることが望ましいこともある。「水性液体」または「水性環境」は、例えば、本明細書で定義される医薬組成物、並びに
細胞外および細胞内環境並びにエンドソーム内腔内の環境を含むがこれらに限定されない生理学的環境を含む。

【0062】

誤解を避けるために、本明細書での水性液体または水性環境への言及は、その媒体中の他の成分の存在を排除することを意図するものではない。水性液体は、ポリマーナノ粒子（例えば、ポリマーミセルナノ粒子）を含み、また、例えば、ｐＨを調節し得る１つ以上の添加剤を含んでもよい。従って、実質的に水からなる液体媒体は、１つ以上の可溶性または不溶性の非液体添加剤を含んでもよい。

【0063】

本明細書で開示されるポリマーナノ粒子は、クラシン（ｃｌａｔｈｉｎ）依存性および非依存性エンドサイトーシスを介して迅速に細胞にインターナライズし得ることが今や示された。エンドソーム内の細胞小器官のｐＨは厳密に制御されており、初期エンドソームにおける弱酸性から後期エンドソーム／リソソームにおける強酸性まで及ぶ。ｐＨ制御は、プロトンリーク、ＣＩＣクロライドチャネルまたはＮａ，Ｋ－ＡＴＰａｓｅなどの多くの因子によって調節され得る。しかしながら、それは、主に液胞ＡＴＰａｓｅの活性によって決定され、その機能は、プロトンを細胞質からエンドソームの内腔に汲み出すことである（Ｋａｎｅ，Ｐ．Ｍ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ． ２００６、７０、１７７－９１）。

【0064】

従来のナノ粒子とは異なり、本発明に従って使用されるポリマーナノ粒子は、コポリマー鎖の集合で形成されており、該コポリマー鎖は、生理学的または塩基性ｐＨで疎水性であり、ナノ粒子のコアを形成する酸応答性ポリマーブロック、および水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有する。当業者は、（ａ）液体媒体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックがナノ粒子の「シェル」または「コロナ」を表し、（ｂ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロックが生理学的または塩基性ｐＨの水性液体では不十分にしか溶媒和されないことを理解するであろう。当業者はまた、酸応答性ポリマーが酸性環境において物理的変化または遷移を受けるポリマーであることを理解するであろう。

【0065】

以下でより詳細に論じられるように、コポリマー鎖の酸応答性疎水性ポリマーブロックは、ナノ粒子のコアを形成するのみならず、ナノ粒子の解体を促進する手段も提供する。酸応答性疎水性ポリマーブロックは、酸性環境にさらされると遷移を受けることにより、解体のためのこの手段を提供する。

【0066】

エンドソーム内腔の酸性環境において「遷移を受ける」酸応答性疎水性ポリマーブロックへの言及は、エンドソーム内腔の酸性環境において、ポリマーコアの溶媒和、コポリマー鎖の解離およびエンドソームＧＰＣＲの疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩のエンドソームへの放出につながる親水性遷移を受ける酸応答性疎水性ポリマーブロックを指すことが理解されるであろう。

【0067】

一例として、本発明のナノ粒子の疎水性コア内に含まれる酸応答性官能基は、エンドソーム内腔の酸性環境においてプロトン化され、酸応答性ポリマーブロックの親水性遷移をもたらし、コアの溶媒和およびコポリマー鎖の解離につながり、これにより、次いでエンドソームＧＰＣＲの疎水性モジュレーターがエンドソーム内腔に放出されると考えられている。

【0068】

本明細書に記載の「酸性環境」は、生理学的ｐＨすなわちｐＨ７．４未満のｐＨを有する水性環境を指すことが理解されるであろう。従って、用語「酸性環境」は、強酸性環境並びに弱酸性環境を示すことが理解されるであろう。適切なｐＨ範囲は、約ｐＨ１からｐＨ７．３の範囲にあるであろう。一つの実施態様においては、ｐＨ範囲は、約ｐＨ２から
約ｐＨ７の範囲にあるであろう。別の実施態様においては、ｐＨは、約ｐＨ３から約ｐＨ７、約ｐＨ４から約ｐＨ７、または約ｐＨ５から約ｐＨ７の範囲内であろう。好ましくは、ｐＨは、約ｐＨ５．５から約ｐＨ７の範囲内であろう。より好ましくは、ｐＨは、約ｐＨ５．９および約ｐＨ６．５の範囲内（例えば、約ｐＨ６．１）であろう。

【0069】

一つの実施態様においては、本明細書で開示されるポリマーナノ粒子は、ミセルである。用語「ミセル」は、液体媒体内に分散された両親媒性分子の集合または凝集体を定義するものとして当技術分野でよく知られている。水性液体媒体中の従来のミセルは、親水性を示し、周囲の水性液体媒体によって溶媒和される、またミセルの中心またはコアを形成するように分子の疎水性セクションまたは領域を隔離するセクションまたは領域を有する集合分子からなる。このタイプのミセルは、一般的に「順相ミセル」または「水中油ミセル」として呼ばれる。

【0070】

ミセルは、典型的には球形または回転楕円体の形状であるが、円筒形および二重層の形状も含み得る。与えられたミセルの形状およびサイズは、典型的にはそれが形成される両親媒性分子の性質並びに両親媒性分子の濃度、温度、ｐＨおよびイオン強度などの液体媒体の特性によって決定される。ミセルを形成するプロセスは、一般的にミセル化と呼ばれる。集合した両親媒性分子はまた、「ミセル状の」集合した両親媒性分子として呼ばれることもある。

【0071】

いくつかの実施態様においては、本発明に従って使用されるナノ粒子は、１ｎｍ－１０００ｎｍの直径を有する。一つの実施態様においては、本発明に従って使用されるナノ粒子は、５ｎｍ－２００ｎｍの直径を有する。一つの実施形態においては、本発明に従って使用されるナノ粒子は、５ｎｍ－１５０ｎｍの直径を有する。一つの実施態様においては、本発明に従って使用されるナノ粒子は、１５－１２０ｎｍ（例えば、１５－１００ｎｍ、２０－９０ｎｍ、２５－８０ｎｍ、２５－７０ｎｍ、２５－６０ｎｍ、２５－５０ｎｍ、または２５－４５ｎｍ）の直径を有する。

【0072】

本発明に従って使用されるナノ粒子は、集合したコポリマー鎖のナノ粒子である。換言すると、ナノ粒子はコポリマー鎖から形成されるか、またはコポリマー鎖で形成される。コポリマー鎖は、ナノ粒子のコアを形成する酸応答性ポリマーブロック、および液体媒体によって溶媒和されているポリマーブロックを含む。従って、当業者は、コポリマー鎖が両親媒性を示すことを理解するであろう。本発明に従って使用されるナノ粒子は、図１Ａを参照してさらに説明されてもよい。すなわち、コポリマー鎖は、一方のブロックが酸応答性疎水性ポリマーブロックによって表され、他方のブロックが水性液体によって溶媒和され得る親水性ポリマーによって表されるＡ－Ｂジブロックコポリマーとして説明されてもよい。コポリマー鎖の集合は、酸応答性疎水性ポリマーブロックがナノ粒子のコアを形成し、液体媒体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックがシェルまたはコロナを形成するナノ粒子を生じさせる。

【0073】

図１Ａに示され、本明細書で記載されるコポリマー鎖は、Ａ－Ｂジブロックコポリマーであるが、本発明に従って使用されるコポリマー鎖は、そのような構造に限定されない。特に、コポリマー鎖がポリマーナノ粒子を形成することができ、（ａ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック、および（ｂ）生理学的または塩基性ｐＨで液体媒体によって溶媒和されている親水性ポリマーブロックを含む限り、コポリマーの組成または構造に関しては何の特別な制限もない。

【0074】

一例として、コポリマー鎖は、Ａ－Ｂ－Ａトリブロックコポリマー構造を有してもよく、ここで、Ａブロックは、同一であっても異なっていてもよい液体媒体によって溶媒和されることができる親水性ポリマーを表し、Ｂブロックは、ナノ粒子のコアを形成する疎水
性酸応答性ポリマーを表す。

【0075】

コポリマー鎖は、線状または分枝状であってもよい。

【0076】

コポリマー鎖は、１つ以上の酸応答性疎水性ポリマーブロック、および生理学的または塩基性ｐＨで液体媒体によって溶媒和される１つ以上の親水性ポリマーブロックを含んでもよい。各ポリマーブロックは、独立して線状または分枝状であってもよい。各ポリマーブロックは、独立してホモ－またはコポリマーであってもよい。

【0077】

本発明に従って使用されるコポリマー鎖は、一般に約６００から約１３０，０００の範囲の総数平均分子量を有するであろう。いくつかの実施態様においては、本発明に従って使用されるコポリマー鎖は、約１，０００から約１００，０００の範囲の総数平均分子量を有する。特定の実施態様においては、本発明に従って使用されるコポリマー鎖は、約５，０００から約７５，０００の範囲の総数平均分子量を有する。特定の実施態様においては、本発明に従って使用されるコポリマー鎖は、約１０，０００から約５０，０００の範囲の総数平均分子量を有する。

【0078】

これに関連して、液体媒体によって溶媒和されるポリマーブロックの数平均分子量は、一般に約１００から約５０，０００（例えば、５００から約５０，０００、１，０００から約４０，０００、２０００から約３０，０００、５，０００から約３０，０００）の範囲であり、ナノ粒子のコアを形成する刺激応答性ポリマーブロックの数平均分子量は、一般に約５００から約８０，０００（例えば、１，０００から約７０，０００、２，０００から約６０，０００、３，０００から約５０，０００、５，０００から約４０，０００、５，０００から約３０，０００、１０，０００から約３０，０００）の範囲であろう。

【0079】

本明細書における数平均分子量への言及は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって決定されるものを意味することが意図される。

【0080】

酸応答性ポリマーブロック（例えば、酸応答性疎水性ポリマーブロック）は、第一級、第二級、および第三級アルキルアミンを含むアミン基、窒素含有ヘテロシクリル（例えば、モルホリニル、ピロリジニル、ピペラジニル、およびピペリジニル）、ピリジン、およびエンドソーム内腔の酸性環境においてプロトン化される他の窒素含有ヘテロアリール（例えば、イミダゾール）などの官能基を含むエチレン性不飽和モノマーに由来してもよい。酸応答性ポリマーブロックは、Ｎ－ビニルホルムアミド、Ｎ－ビニルアセトアミド、アクリルアミドおよびメタクリルアミド、Ｎ－メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、ジメチルアミノエチルまたはアミノエチルなどのエチレン性不飽和モノマーから調製されてもよい。酸応答性ポリマーはまた、アミノ酸（例えばポリリジン）からの若しくはタンパク質（例えばリゾザイム、アルブミン、カゼイン）などの天然に存在するポリマー由来のポリペプチド、またはＤＮＡなどの核酸として調製されてもよい。

【0081】

一つの実施態様においては、酸応答性ポリマーブロックは、以下から選択されるエチレン性不飽和モノマー由来であってもよい。

【0082】

【化1】

【0083】

一つの実施態様においては、酸応答性ポリマーブロックは、以下から選択されるエチレン性不飽和モノマー由来であってもよい。

【0084】

【化2】

【0085】

一つの実施態様においては、酸応答性ポリマーブロックは、以下から選択されるエチレン性不飽和モノマー由来であってもよい。

【0086】

【化3】

【0087】

一つの実施態様においては、酸応答性ポリマーブロックは、ポリアルキレンオキシドメタクリレートモノマーと共重合されるアミン基などの官能基を含むエチレン性不飽和モノマー由来であってもよい。理論に拘束されることを望まないが、官能基を含むモノマーとポリアルキレンオキシドメタクリレートモノマーとの共重合は、いったんポリマーナノ粒子の解離が起こったときに、プロトン化ポリマーに関連するいかなる細胞毒性をも低減するのに役立ち得ると考えられている。

【0088】

コポリマー鎖が水性液体中でナノ粒子を形成するように集合するという条件で、生理学的または塩基性ｐＨで水性液体によって溶媒和されるポリマーブロックの性質または組成
に関して特に何の制限もない。このポリマーブロックは、通常は酸応答性ポリマーブロックではないであろう。

【0089】

ブロックは、ブロックに親水性を付与し、水性液体において溶媒和される能力を集合的に促進する十分に重合されたモノマー残基を含まなければならない。当業者は、ポリマー鎖に親水性を提供することができるエチレン性不飽和モノマーを知っているであろう。そのようなエチレン性不飽和モノマーは、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、またはそれらのコポリマーを含むが、これらに限定されない。

【0090】

コポリマー鎖が本明細書に記載のように機能するナノ粒子を形成できるという条件で、コポリマー鎖の各ブロックは、さまざまなエチレン性不飽和モノマーに由来する重合されたモノマー残基を含んでもよい。

【0091】

ポリマー鎖の形成に使用される一般的なエチレン性不飽和モノマーは、ラジカル重合プロセスによって重合できるものを含む。モノマーは、他のモノマーと重合できるべきである。さまざまなモノマーの共重合性を決定する要因は、当技術分野で十分に文書化されており、例えば、Ｇｒｅｅｎｌｅｅ，Ｒ．Ｚ．、ポリマーハンドブック第３版（Ｂｒａｎｄｕｐ，Ｊ．およびＩｍｍｅｒｇｕｔ，Ｅ．Ｈ．編） Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９ ｐ ＩＩ／５３を参照されたい。

【0092】

そのようなエチレン性不飽和モノマーの例は、式（Ｉ）：

【0093】

【化4】

【0094】

（式中、ＵおよびＷは、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ^１、－ＣＯＲ^１、－ＣＳＲ^１、－ＣＳＯＲ^１、－ＣＯＳＲ^１、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＲ^１、－ＣＯＮＲ^１ _２、水素、ハロゲンおよび任意に置換されたＣ_１－Ｃ_４アルキルから独立して選択されるかまたはＵおよびＷが一緒になってそれ自体任意に置換されていてもよいラクトン、無水物またはイミド環を形成し、ここで、任意の置換基は、ヒドロキシ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ^１、－ＣＯＲ^１、－ＣＳＲ^１、－ＣＳＯＲ^１、－ＣＯＳＲ^１、－ＣＮ、－ＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＲ^１、－ＣＯＮＲ^１ _２、－ＯＲ^１、－ＳＲ^１、－Ｏ_２ＣＲ^１、－ＳＣＯＲ^１、および－ＯＣＳＲ^１から独立して選択され；

【0095】

Ｖは、水素、Ｒ^１、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ^１、－ＣＯＲ^１、－ＣＳＲ^１、－ＣＳＯＲ^１、－ＣＯＳＲ^１、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＲ^１、－ＣＯＮＲ^１ _２、－ＯＲ^１、－ＳＲ^１、－Ｏ_２ＣＲ^１、－ＳＣＯＲ^１、および－ＯＣＳＲ^１から選択され；

【0096】

ＵおよびＶは、それぞれが結合している炭素と一緒になって、５－８個の環原子を含む複素環を形成し、ここで、１－３個の環原子は、それぞれＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｏ、およびＳから独立して選択されるヘテロ原子であり、ここで、該複素環は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、オキソ、およびＣ_１－Ｃ_６アルコキシから選択される１つ以上の置換基で任意に置換され；

【0097】

各Ｒ^１は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたヘテロアリールアルキル、任意に置換されたアルキルアリール、任意に置換されたアルキルヘテロアリール、および任意に置換されたポリマー鎖から独立して選択される）のものを含む。

【0098】

各Ｒ^１はまた、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキル（例えば、１つ以上のＣ_１－_１０ジアルキルアミノで任意に置換されたアルキル；１つ以上のヘテロシクリルで任意に置換されたアルキル；１つ以上のカルボシクリルで任意に置換されたアルキル；１つ以上のアリールで任意に置換されたアルキル；または１つ以上のヘテロアリールで任意に置換されたアルキル、ここで、ヘテロシクリル、カルボシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、本明細書の他の場所で定義されるようにそれぞれさらに任意に置換される）、任意に置換されたＣ_２－Ｃ_２２アルケニル、任意に置換されたＣ_２－Ｃ_２２アルキニル、任意に置換されたＣ_６－Ｃ_１８アリール、任意に置換されたＣ_３－Ｃ_１８ヘテロアリール、任意に置換されたＣ_３－Ｃ_１８カルボシクリル、任意に置換されたＣ_２－Ｃ_１８ヘテロシクリル、任意に置換されたＣ_７－Ｃ_２４アリールアルキル、任意に置換されたＣ_４－Ｃ_１８ヘテロアリールアルキル、任意に置換されたＣ_７－Ｃ_２４アルキルアリール、任意に置換されたＣ_４－Ｃ_１８アルキルヘテロアリール、および任意に置換されたポリマー鎖から独立して選択されてもよい。

【0099】

Ｒ^１はまた、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_１８アルキル、任意に置換されたＣ_２－Ｃ_１８アルケニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアラルキル、任意に置換されたヘテロアリールアルキル、任意に置換されたアルカリール、任意に置換されたからアルキルヘテロアリールおよびポリマー鎖から選択されてもよい。

【0100】

一つの実施態様においては、Ｒ^１は、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキルから独立して選択されてもよい。

【0101】

いくつかの実施態様においては、Ｒ^１の任意の置換基の例は、それらの塩および誘導体を含む、アルキレンオキシジル（エポキシ）、ヒドロキシ、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、ホルミル、アルキルカルボニル、カルボキシ、スルホン酸、アルコキシ－またはアリールオキシ－カルボニル、イソシアナート、シアノ、シリル、ハロ、アミノ（例えば、ジアルキルアミノ）、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、およびヘテロシクリルから選択されるものを含み、ここで、Ｒ^１の各任意の置換基は、Ｃ_１－Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１－Ｃ_１８アルケニル、Ｃ_１－Ｃ_１８アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ_１－Ｃ_１８アルコキシ、アシル、およびアシルオキシから選択される１つ以上の置換基でさらに任意に置換される。

【0102】

ポリマー鎖の例は、ポリアルキレンオキシド、ポリアリーレンエーテルおよびポリアルキレンエーテルから選択されるものを含む。

【0103】

式（Ｉ）のモノマーの例は、無水マレイン酸、Ｎ－アルキルマレイミド、Ｎ－アリールマレイミド、フマル酸ジアルキルおよび環化重合可能なモノマー、アクリレートおよびメタクリレートエステル、アクリルおよびメタクリル酸、スチレン、アクリルアミド、メタクリルアミド、およびメタクリロニトリル、これらのモノマーの混合物、並びにこれらのモノマーと他のモノマーとの混合物を含む。

【0104】

式（Ｉ）のモノマーの他の例は、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、プロ
ピルメタクリレート（全ての異性体）、ブチルメタクリレート（全ての異性体）、２－エチルヘキシルメタクリレート、イソボルニルメタクリレート、ベンジルメタクリレート、フェニルメタクリレート、メタクリロニトリル、アルファ－メチルスチレン、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート（全ての異性体）、ブチルアクリレート（全ての異性体）、２－エチルヘキシルアクリレート、イソボルニルアクリレート、ベンジルアクリレート、フェニルアクリレート、アクリロニトリル、スチレン、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート（全ての異性体）、ヒドロキシブチルメタクリレート（全ての異性体）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、無水イタコン酸、グリシジルアクリレート、２－ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート（全ての異性体）、ヒドロキシブチルアクリレート（全ての異性体）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルアクリレート、トリエチレングリコールアクリレート、メタクリルアミド、Ｎ－メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチルメタクリルアミド、Ｎ－ｎ－ブチルメタクリルアミド、Ｎ－メチロールメタクリルアミド、Ｎ－エチロールメタクリルアミド、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチルアクリルアミド、Ｎ－Ｎ－ブチルアクリルアミド、Ｎ－メチロールアクリルアミド、Ｎ－エチロールアクリルアミド、ジエチルアミノスチレン（全ての異性体）、ジエチルアミノα－メチルスチレン（全ての異性体）、ｐ－ビニルベンゼンスルホン酸、ｐ－ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩、トリメトキシシリルプロピルメタクリレート、トリエトキシシリルプロピルメタクリレート、トリブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルメタクリレート、ジメトキシシリルプロピルメタクリレート、ジエトキシシリルプロピルメタクリレート、ジブトキシシリルプロピルメタクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルメタクリレート、トリメトキシシリルプロピルアクリレート、トリエトキシシリルプロピルアクリレート、トリブトキシシリルプロピルアクリレート、ジメトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジエトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジブトキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシメチルシリルプロピルアクリレート、ジメトキシシリルプロピルアクリレート、ジエトキシシリルプロピルアクリレート、ジブトキシシリルプロピルアクリレート、ジイソプロポキシシリルプロピルアクリレートから選択される官能性メタクリレート、アクリレートおよびスチレン、酢酸ビニル、酪酸ビニル、安息香酸ビニル、塩化ビニル、フッ化ビニル、臭化ビニル、無水マレイン酸、Ｎ－フェニルマレイミド、Ｎ－ブチルマレイミド、Ｎ－ビニルピロリドン、Ｎ－ビニルカルバゾール、ブタジエン、エチレンおよびクロロプレンを含む。このリストは網羅的ではない。

【0105】

いくつかの実施態様においては、コポリマー鎖の各ブロックは、式（Ｉ－ａ）：

【0106】

【化5】

【0107】

（式中、Ｕ^ａは、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕ、－ＣＯＲ^１Ｕ、－ＣＳＲ^１Ｕ、－ＣＳＯＲ^１Ｕ、－ＣＯＳＲ^１Ｕ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＮ、－ＣＯＮＨＲ^１Ｕ、－ＣＯＮＲ^１Ｕ _２、水素、ハロゲンおよび任意に置換されたＣ_１－Ｃ_４アルキル、－ＯＲ^１Ｕ、－ＳＲ^１Ｕ
、－Ｏ_２ＣＲ^１Ｕ、－ＳＣＯＲ^１Ｕ、および-ＯＣＳＲ^１Ｕから選択され；

【0108】

Ｖ^ａは、水素、Ｒ^１Ｖ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｖ、－ＣＯＲ^１Ｖ、－ＣＳＲ^１Ｖ、－ＣＳＯＲ^１Ｖ、－ＣＯＳＲ^１Ｖ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＲ^１Ｖ、－ＣＯＮＲ^１Ｖ _２、－ＯＲ^１Ｖ、－ＳＲ^１Ｖ、－Ｏ_２ＣＲ^１Ｖ、－ＳＣＯＲ^１Ｖ、および－ＯＣＳＲ^１Ｖから選択されるか；または

【0109】

Ｕ^ａおよびＶ^ａは、それぞれが結合している炭素と一緒になって、５－８個の環原子を含む複素環を形成し、ここで、１－３個の環原子は、それぞれＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｏ、およびＳから独立して選択されるヘテロ原子であり、該複素環は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、オキソ、およびＣ_１－Ｃ_６アルコキシから選択される１つ以上の置換基で任意に置換され；

【0110】

Ｒ^１ＵおよびＲ^１Ｖのそれぞれは、独立して選択されるＲ^１であり、ここで、Ｒ^１は、上記で式（Ｉ）について定義されたとおりである）のエチレン性不飽和モノマー由来の重合されたモノマー残基を含んでもよい。

【0111】

式（Ｉ－ａ）の特定の実施態様においては、Ｕ^ａは、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕ、－ＣＯＲ^１Ｕ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＲ^１Ｕ、および－ＣＯＮＲ^１Ｕ _２から選択される。
上述の特定の実施態様においては、Ｕ^ａは、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕから選択される。
上述の特定の実施態様においては（Ｕ^ａが－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕ、－ＣＯＲ^１Ｕ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＲ^１Ｕ、および－ＣＯＮＲ^１Ｕ _２から選択されるとき）、各Ｒ^１Ｕは、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキル［例えば、アミノ、例えば、ジアルキルアミノで置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキル；またはアルコキシで置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキル（ここで、アルコキシは、任意に置換され、例えば、Ｒ^１Ｕは、

【0112】

【化6】

【0113】

である）］および任意に置換されたポリマー鎖（例えば、ポリエチレンオキシドなどのポリアルキレンオキシド）から選択される。

【0114】

式（Ｉ－ａ）の特定の実施態様においては、Ｖ^ａは、水素およびＲ^１Ｖから選択される。
上述の特定の実施態様においては（Ｖ^ａが水素およびＲ^１Ｖから選択されるとき）、Ｒ^１Ｖは、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキル（例えば、非置換のＣ_１－Ｃ_６アルキル、例えば、メチル）から独立して選択される。

【0115】

いくつかの実施態様においては、式（Ｉ－ａ）のエチレン性不飽和モノマーは、式（Ｉ－ａ０）：

【0116】

【化7】

【0117】

［式中、Ｕ^ａは、水素、－ＣＯＲ^１Ｕ、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕ、または－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１Ｕであり；
Ｖ^ａは、ＨまたはＲ^１Ｖであり；
Ｒ^１Ｕは、
（ｉ）１つ以上のＮ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）_２またはＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）で置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキル；
（ｉｉ）４－１０個の環原子を含むヘテロシクリルで置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキル（ここで、１－３個の環原子は、ヘテロ原子であり、それぞれがＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｎ（Ｃ_１－１０アルキル）、およびＯからなる群から独立して選択され、ただし、該ヘテロシクリルは、１つ以上の環窒素原子を含み、およびここで、該１つ以上のヘテロシクリル環炭素原子は、任意に置換されている）；

【0118】

（ｉｉｉ）５－１０個の環原子を含むヘテロアリールで置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキル（ここで、１－４個の環原子は、ヘテロ原子であり、それぞれがＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｎ（Ｃ_１－１０アルキル）、Ｏ、およびＳからなる群から独立して選択され、ただし、該ヘテロアリールは１つ以上の環窒素原子を含み、およびここで、該１つ以上のヘテロアリール環炭素原子は、任意に置換されている）；および

【0119】

（ｉｖ）４－１０個の環原子を含むヘテロシクリル（ここで、１－３個の環原子は、ヘテロ原子であり、それぞれがＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｎ（Ｃ_１－１０アルキル）、およびＯからなる群から独立して選択され、ただし、該ヘテロシクリルは、１つ以上の環窒素原子を含み、およびここで、該１つ以上のヘテロシクリル環炭素原子は、任意に置換されている）からなる群から選択され；

【0120】

Ｒ^１Ｖは、
（ｉ）任意に置換されたＣ_１－６アルキル；
（ｉｉ）５－１０個の環原子を含むヘテロアリール（ここで、１－４個の環原子は、ヘテロ原子であり、それぞれがＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｎ（Ｃ_１－１０アルキル）、Ｏ、およびＳからなる群から独立して選択され、ただし、該ヘテロアリールは、１つ以上の環窒素原子を含み、およびここで、該１つ以上のヘテロアリール環炭素原子は、任意に置換されている）；および
（ｉｉｉ）任意に置換されたＣ_６－１０アリール（ここで、該アリールは、１つ以上のアミノアルキル、モノアミノアルキル、またはジアミノアルキルで置換されている）からなる群から選択される］である。

【0121】

式（Ｉ－ａ０）のいくつかの実施態様においては、Ｕ^ａは、－ＣＯＲ^１Ｕ、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕ、または－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１Ｕ（例えば、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕ、または－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１Ｕ）である。
式（Ｉ－ａ０）の特定の実施態様においては、Ｖ^ａは、ＨまたはＲ^１Ｖであり；Ｒ^１Ｖは、任意に置換されたＣ_１－６アルキル（例えば、非置換のＣ_１－６アルキル、例えば、メチル）である。
式（Ｉ－ａ０）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｕは、１つ以上のＮ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）_２（例えば、Ｎ（Ｃ_３－Ｃ_１０アルキル）_２）で置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキルである。
式（Ｉ－ａ０）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｕは、１つ以上のＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）（例えば、ＮＨ（Ｃ_３－Ｃ_１０アルキル））で置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキルである。

【0122】

式（Ｉ－ａ０）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｕは、５－７個の環原子を含むヘテロシクリルで置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキルであり、ここで、１－３個の環原子は、そ
れぞれＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｎ（Ｃ_１－１０アルキル）、およびＯからなる群から独立して選択されるヘテロ原子であり、ただし、該ヘテロシクリルは、１つ以上の環窒素原子を含み、およびここで、１つ以上のヘテロシクリル環炭素原子は、任意に置換されている。上述の実施態様の非限定的な例として、Ｒ^１Ｕは、ピロリジニル、モルホリニル、またはピペリアジニルで置換されたＣ_２－Ｃ_６アルキルであり得る。

【0123】

式（Ｉ－ａ０）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｕは、５－１０個（例えば、５または６個）の環原子を含むヘテロアリールで置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキルであり、ここで、１－４の環原子は、それぞれＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｎ（Ｃ_１－１０アルキル）、Ｏ、およびＳからなる群から独立してから選択されるヘテロ原子であり、ただし、該ヘテロアリールは、１つ以上の環窒素原子を含み、およびここで、１つ以上のヘテロアリール環炭素原子は、任意に置換されている。上述の実施態様の非限定的な例として、Ｒ^１Ｕは、イミダゾリルまたはピリジニルで置換されたＣ_２－Ｃ_６アルキルであり得る。

【0124】

式（Ｉ－ａ０）の特定の実施態様においては、Ｕ^ａは、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕであり；Ｒ^１Ｕは、Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）_２（例えば、Ｎ（Ｃ_３－Ｃ_１０アルキル）_２）で置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキル（例えば、Ｃ_２－４）である。
式（Ｉ－ａ０）の特定の実施態様においては、Ｕ^ａは、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕであり；Ｒ^１Ｕは、ＮＨ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）（例えば、ＮＨ（Ｃ_３－Ｃ_１０アルキル））で置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキル（例えば、Ｃ_２－４）である。
式（Ｉ－ａ０）の特定の実施態様においては、Ｕ^ａは、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕであり；Ｒ^１Ｕは、５－７個の環原子を含むヘテロシクリルで置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキルであり、ここで、１－３個の環原子は、それぞれＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｎ（Ｃ_１－１０アルキル）、およびＯからなる群から独立して選択されるヘテロ原子であり、ただし、該ヘテロシクリルは、１つ以上の環窒素原子を含み、およびここで、１つ以上のヘテロシクリル環炭素原子は、任意に置換されている。

【0125】

式（Ｉ－ａ０）の特定の実施態様においては、Ｕ^ａは、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕであり；Ｒ^１Ｕは、５－１０個の環原子を含むヘテロアリールで置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキルであり、ここで、１－４個の環原子は、それぞれＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｎ（Ｃ_１－１０アルキル）、Ｏ、およびＳからなる群から独立して選択されるヘテロ原子であり、ただし、該ヘテロアリールは、１つ以上の環窒素原子を含み、およびここで、１つ以上のヘテロアリール環炭素原子は、任意に置換されている。
式（Ｉ－ａ０）の特定の実施態様においては、Ｕ^ａは、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１Ｕであり；Ｒ^１Ｕは、Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_１０アルキル）_２（例えば、Ｎ（Ｃ_３－Ｃ_１０アルキル）_２）で置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキルである。

【0126】

式（Ｉ－ａ０）の特定の実施態様においては、Ｕ^ａは、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ^１Ｕであり；Ｒ^１Ｕは、５－７個の環原子を含むヘテロシクリルで置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキルであり、ここで、１－３個の環原子は、それぞれＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｎ（Ｃ_１－１０アルキル）、およびＯからなる群から独立して選択されるヘテロ原子であり、ただし、該ヘテロシクリルは、１つ以上の環窒素原子を含み、およびここで、１つ以上のヘテロシクリル環炭素原子は、任意に置換されている。
式（Ｉ－ａ０）の特定の実施態様においては、Ｕ^ａは、－Ｃ（Ｏ）Ｒ^１Ｕであり；Ｒ^１Ｕは、５－７個の環原子を含むヘテロシクリルであり、ここで、１－３個の環原子は、それぞれＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｎ（Ｃ_１－１０アルキル）、およびＯからなる群から独立して選択されるヘテロ原子であり、ただし、該ヘテロシクリルは、１つ以上の環窒素原子を含み、およびここで、１つ以上のヘテロシクリル環炭素原子は、任意に置換されている。

【0127】

式（Ｉ－ａ０）のいくつかの実施態様においては、Ｕ^ａは、水素であり；Ｖ^ａは、Ｒ^１
Ｖであり、ここで、Ｒ^１Ｖは、５－１０個の環原子を含むヘテロアリールであり、ここで、１－４個の環原子は、それぞれＮ、Ｎ（Ｈ）、Ｎ（Ｃ_１－１０アルキル）、Ｏ、およびＳからなる群から独立して選択されるヘテロ原子であり、ただし、該ヘテロアリールは、１つ以上の環窒素原子を含み、およびここで、１つ以上のヘテロアリール環炭素原子は、任意に置換されている。上述の実施態様の非限定的な例として、Ｒ^１Ｕは、イミダゾリルまたはピリジニルであり得る。
式（Ｉ－ａ０）のいくつかの実施態様においては、Ｕ^ａは、水素であり；Ｖ^ａは、Ｒ^１Ｖであり、ここで、Ｒ^１Ｖは、任意に置換されたＣ_６－１０アリールであり、ここで、該アリールは、１つ以上のアミノアルキル、モノアミノアルキル、またはジアミノアルキルで置換されている。

【0128】

式（Ｉ－ａ）または（Ｉ－ａ０）のエチレン性不飽和モノマーの非限定的な例は、

【0129】

【化8】

【0130】

を含む。
式（Ｉ－ａ）または（Ｉ－ａ０）のエチレン性不飽和モノマーの非限定的な例はまた、

【0131】

【化9】

【0132】

も含む。
式（Ｉ－ａ）または（Ｉ－ａ０）のエチレン性不飽和モノマーのさらなる非限定的な例は、

【0133】

【化10】

【0134】

を含む。
いくつかの実施態様においては、式（Ｉ－ａ）のエチレン性不飽和モノマーは、式（Ｉ－ａ１）：

【0135】

【化11】

【0136】

（式中、Ｕ^ａは、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕであり；
Ｖ^ａは、ＨまたはＲ^１Ｖであり；
Ｒ^１Ｕは、１つ以上のＮ（Ｃ_３－Ｃ_１０アルキル）_２で置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキルであり；
Ｒ^１Ｖは、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキルである）である。

【0137】

式（Ｉ－ａ１）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｕは、１つ以上のＮ（Ｃ_３－Ｃ_５アルキル）_２で置換されたＣ_２－Ｃ_６アルキル（例えば、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ（ｉＰｒ）_２）である。
式（Ｉ－ａ１）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｖは、非置換のＣ_１－Ｃ_３アルキル（例えば、メチル）である。
式（Ｉ－ａ１）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｕは、１つ以上のＮ（Ｃ_３－Ｃ_５アルキル）_２で置換されたＣ_２－Ｃ_６アルキル（例えば、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ（ｉＰｒ）_２）であり；Ｒ^１Ｖは、非置換のＣ_１－Ｃ_３アルキル（例えば、メチル）である。

【0138】

上述の実施態様の非限定的な例として、式（Ｉ－ａ１）のモノマーは、以下の式を有することができる。

【0139】

【化12】

【0140】

いくつかの実施態様においては、式（Ｉ－ａ）のエチレン性不飽和モノマーは、式（Ｉ－ａ２）：

【0141】

【化13】

【0142】

（式中、Ｕ^ａは、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕであり；
Ｖ^ａは、ＨまたはＲ^１Ｖであり；
Ｒ^１Ｕは、１つ以上のＣ_１－Ｃ_１８アルコキシで置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキルであり、ここで、Ｃ_１－Ｃ_１８アルコキシは、Ｃ_１－Ｃ_１８アルコキシから選択される１つ以上の置換基で任意に置換されており；
Ｒ^１Ｖは、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキルである）である。

【0143】

式（Ｉ－ａ２）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｕは、１つ以上のＣ_１－Ｃ_１８アルコキシで任意に置換されたＣ_２－Ｃ_６アルキルであり、ここで、Ｃ_１－Ｃ_１８アルコキシは、Ｃ_１－Ｃ_１８アルコキシから選択される１つ以上の置換基で任意に置換されている（例えば、Ｒ^１Ｕは、ｎ－ブチルであり得；またはＲ^１Ｕは、

【0144】

【化14】

【0145】

であり得る）。
式（Ｉ－ａ２）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｖは、非置換のＣ_１－Ｃ_３アルキル（例えば、メチル）である。
式（Ｉ－ａ２）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｕは、１つ以上のＣ_１－Ｃ_１８アルコキシで任意に置換されたＣ_２－Ｃ_６アルキルであり、ここで、Ｃ_１－Ｃ_１８アルコキシは、Ｃ_１－Ｃ_１８アルコキシから選択される１つ以上の置換基で任意に置換されており（例えば、Ｒ^１Ｕは、ｎ－ブチルであり得；またはＲ^１Ｕは、

【0146】

【化15】

【0147】

であり得る）；Ｒ^１Ｖは、非置換のＣ_１－Ｃ_３アルキル（例えば、メチル）である。
上述の実施態様の非限定的な例として、式（Ｉ－ａ２）のモノマーは、以下の式を有することができる。

【0148】

【化16】

【0149】

いくつかの実施態様においては、式（Ｉ－ａ）のエチレン性不飽和モノマーは、式（Ｉ－ａ３）：

【0150】

【化17】

【0151】

（式中、Ｕ^ａは、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕであり；
Ｖ^ａは、ＨまたはＲ^１Ｖであり；
Ｒ^１Ｕは、１つ以上のＮ（Ｃ_１－Ｃ_２アルキル）_２で置換されたＣ_１－Ｃ_２２アルキルであり；
Ｒ^１Ｖは、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキルである）である。

【0152】

式（Ｉ－ａ３）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｕは、１つ以上のＮ（Ｃ_１－Ｃ_２アルキル）_２で置換されたＣ_２－Ｃ_６アルキル（例えば、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ（Ｍｅ）_２）である。
式（Ｉ－ａ３）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｖは、非置換のＣ_１－Ｃ_３アルキル（例えば、メチル）である。
式（Ｉ－ａ３）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｕは、１つ以上のＮ（Ｃ_１－Ｃ_２アルキル）_２で置換されたＣ_２－Ｃ_６アルキル（例えば、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ（Ｍｅ）_２）であり；Ｒ^１Ｖは、非置換のＣ_１－Ｃ_３アルキル（例えば、メチル）である。

【0153】

上述の実施態様の非限定的な例として、式（Ｉ－ａ１）のモノマーは、以下の式を有することができる。

【0154】

【化18】

【0155】

いくつかの実施態様においては、式（Ｉ－ａ）のエチレン性不飽和モノマーは、式（Ｉ－ａ４）：

【0156】

【化19】

【0157】

（式中、Ｕ^ａは、－ＣＯ_２Ｒ^１Ｕであり；
Ｖ^ａは、ＨまたはＲ^１Ｖであり；
Ｒ^１Ｕは、任意に置換されたポリマー鎖であり；
Ｒ^１Ｖは、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキルである）である。

【0158】

式（Ｉ－ａ４）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｕは、ポリアルキレンオキシド鎖である（例えば、Ｒ^１Ｕは、ポリエチレンオキシドであり得る）。
式（Ｉ－ａ４）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｖは、非置換のＣ_１－Ｃ_３アルキル（例えば、メチル）である。
式（Ｉ－ａ４）の特定の実施態様においては、Ｒ^１Ｕは、ポリアルキレンオキシド鎖であり（例えば、Ｒ^１Ｕは、ポリエチレンオキシドであり得る）；Ｒ^１Ｖは、非置換のＣ_１－Ｃ_３アルキル（例えば、メチル）である。

【0159】

上述の実施態様の非限定的な例として、式（Ｉ－ａ４）のモノマーは、以下の式を有することができる。

【0160】

【化20】

【0161】

［式中、ｎは、３－１００の整数（例えば、ｎ＝５）である］
いくつかの実施態様においては、式（Ｉ－ａ）のエチレン性不飽和モノマーは、式（Ｉ－ａ５）：

【0162】

【化21】

【0163】

（式中、Ｕ^ａおよびＶ^ａは、それぞれが結合している炭素と一緒になって、５－６個の環原子を含む複素環を形成し、ここで、１－３個の環原子は、それぞれＮ、Ｎ（Ｈ）、およびＯから独立して選択されるヘテロ原子であり、ここで、該複素環は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、およびオキソから選択される１つ以上の置換基で任意に置換されている）である。
上述の実施態様の非限定的な例として、式（Ｉ－ａ５）のモノマーは、以下の式を有することができる。

【0164】

【化22】

【0165】

いくつかの実施態様においては、コポリマー鎖の親水性ブロックは、式（Ｉ－ａ３）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基を含む。
いくつかの実施態様においては、コポリマー鎖の親水性ブロックは、式（Ｉ－ａ４）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基を含む。
特定の実施態様においては、コポリマー鎖の親水性ブロックは、式（Ｉ－ａ３）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基および式（Ｉ－ａ４）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基を含む。

【0166】

いくつかの実施態様においては、コポリマー鎖の疎水性ブロックは、式（Ｉ－ａ０）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基を含む。
いくつかの実施態様においては、コポリマー鎖の疎水性ブロックは、式（Ｉ－ａ１）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基を含む。
いくつかの実施態様においては、コポリマー鎖の疎水性ブロックは、式（Ｉ－ａ２）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基を含む。
特定の実施態様においては、コポリマー鎖の疎水性ブロックは、式（Ｉ－ａ１）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基および式（Ｉ－ａ２）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基を含む。

【0167】

いくつかの実施態様においては、コポリマー鎖は、式（Ｉ－ａ１）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基；および式（Ｉ－ａ３）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基を含む。

【0168】

いくつかの実施態様においては、コポリマー鎖は、
１）式（Ｉ－ａ３）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基および式（Ｉ－ａ４）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基を含む親水性ブロック；並びに
２）式（Ｉ－ａ１）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基および式（Ｉ－ａ２）のモノマーに由来する重合されたモノマー残基を含む疎水性ブロック
を含む。

【0169】

本発明に従って使用されるコポリマー鎖は、当業者に知られている任意の適切な方法によって調製されてもよい。例えば、コポリマー鎖は、当業者に周知のラジカル、配位またはイオン重合技術によって（本明細書に記載されているものなどの）エチレン性不飽和モノマーを重合することによって調製されてもよい。

【0170】

コポリマー鎖を調製するために使用される重合技術は、リビングであっても非リビングであってもよい。

【0171】

リビング重合は、一般に、当技術分野では、不可逆的な連鎖停止が実質的に存在しない連鎖重合の一形態であると考えられている。リビング重合の重要な特徴は、モノマーおよび重合をサポートする反応条件が提供されている間、ポリマー鎖が成長し続けることである。リビング重合によって調製されたポリマー鎖は、明確に定義された分子構造、所定の分子量および狭い分子量分布または低い多分散性を有利に示すことができる。

【0172】

リビング重合の例は、イオン重合および制御ラジカル重合（ＣＲＰ）を含む。ＣＲＰの例は、イニファーター重合、安定フリーラジカル媒介重合（ＳＦＲＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、および可逆的付加フラグメンテーション連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合を含むが、これらに限定されない。

【0173】

本明細書に記載のナノ粒子のコポリマー鎖は、リビング重合技術を使用して調製されてもよいことが想定される。コポリマーを調製するためにリビング重合を実施するための当業者に周知の装置、条件、および試薬は、以下でより詳細に論じられるであろう。

【0174】

１つ以上のエチレン性不飽和モノマーがリビング重合技術によって重合される場合、一般に、１つ以上の反応物としてリビング重合剤を含むことが必要であろう。「リビング重合剤」によっては、１つ以上のエチレン性不飽和モノマーのリビング重合に関与し、制御または媒介して、リビングポリマー鎖（すなわち、リビング重合技術に従って形成されたポリマー鎖）を形成することができる化合物が意味される。

【0175】

本発明に従う１つ以上の反応物として含まれてもよいリビング重合剤は、イニファーター重合剤、ＳＦＲＰ剤、ＡＴＲＰ剤およびＲＡＦＴ重合剤などのイオン重合およびＣＲＰから選択されるリビング重合技術を促進するものを含むが、これらに限定されない。

【0176】

本発明に従う使用に適したＲＡＦＴ剤は、（－Ｃ（Ｓ）Ｓ－によって表される二価部分である）チオカルボニルチオ基を含む。ＲＡＦＴ剤の例は、Ｍｏａｄ Ｇ．；Ｒｉｚｚａｒｄｏ，Ｅ；Ｔｈａｎｇ Ｓ，Ｈ． Ｐｏｌｙｍｅｒ ２００８、４９、１０７９－１１３１（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、キサントゲン酸塩、ジチオエステル、ジチオカーボネート、ジチオカーバネートおよびトリチオカーボネート化合物を含む。

【0177】

ポリマーナノ粒子のコア内に含まれているのは、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターである。本明細書で使用される用語「エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達のモジュレーター」は、エンドサイトーシスされてエンドソームにされたＧＰＣＲのアゴニストおよびアンタゴニストまたは阻害剤を指す。エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達のモジュレーターは、有機分子、ポリペプチド配列、ホルモン、タンパク質フラグメントまたはこれらの任意のものの誘導体を含むがこれらに限定されない任意の形態であってもよい。

【0178】

本明細書で使用される用語「エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達」は、エンドサイトー
シスされてエンドソーム、好ましくは初期エンドソームにされた活性化ＧＰＣＲによって伝達されるシグナルを指す。

【0179】

一つの実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達は、原形質膜で最初に伝達され、受容体が初期エンドソームにエンドサイトーシスされるときに維持されるシグナル伝達であろう。

【0180】

別の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達は、受容体エンドサイトーシスを必要とするおよび／またはもっぱらエンドソーム膜上で起こるシグナル伝達、例えば、β－アレスチン媒介シグナル伝達である。βａｒｒは、細胞表面でアゴニスト占有Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）リン酸化ＧＰＣＲと相互作用し、ダイナミンおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスを介した細胞表面から初期エンドソームへのリガンド結合受容体の移動を促進すると考えられている。この経路が、原形質膜でのＧタンパク質依存性シグナル伝達とは異なる第２の一連のエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を媒介し得ることが、最近発見された。このメカニズムの重要性は、ＧＲＫによるＧＰＣＲリン酸化の程度に依存して変動する、ＧＰＣＲがβａｒｒと相互作用する親和性に依存すると考えられている。「クラスＡ」ＧＰＣＲ（例えば、β_２ＡＲ、α_１ｂＡＲ）は、リン酸化部位をほとんど有さず、主に原形質膜で、βａｒｒ２に対してより高い親和性をもって、βａｒｒ１およびβａｒｒ２と一過性に相互作用する。「クラスＢ」ＧＰＣＲ（例えば、ＡＴ_１ＡＲ、ＮＫ_１Ｒ、ＰＡＲ_２）は、複数の部位でリン酸化され、原形質膜およびエンドソーム膜で長期間にわたって高い親和性でβａｒｒ１および２の両方と相互作用する。「クラスＣ」ＧＰＣＲ（例えば、ブラジキニンＢ_２受容体）は、βａｒｒとともにエンドソームにインターナライズし、アゴニストを除去するとβａｒｒが迅速に解離される。

【0181】

βａｒｒ誘発性のＭＡＰＫシグナル伝達の程度は、受容体の構造および７つの哺乳類ＧＲＫのいずれが受容体をリン酸化するかに依存する、βａｒｒに対する受容体の親和性に依存すると考えられている。すなわち、ＡＴ_１ＡＲおよびＶ_２Ｒの活性化は、α_１ｂＡＲおよびβ_２ＡＲの活性化よりも大きなβａｒｒ結合ＥＲＫ１／２のリン酸化を引き起こし、クラスＢ受容体がこの経路を通してより強力にシグナル伝達することを示唆する。クラスＢ ＧＰＣＲは、セクレチン受容体、ＶＰＡＣ_１受容体、ＶＰＡＣ_２受容体、ＰＡＣ_１受容体、グルカゴン受容体、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）受容体、グルカゴン関連ペプチド１（ＧＬＰ－１）受容体、グルカゴン関連ペプチド２（ＧＬＰ－２）受容体、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）受容体、コルチコトロピン放出因子１（ＣＲＦ１）受容体、コルチコトロピン放出因子２（ＣＲＦ２）受容体、副甲状腺ホルモン１（ＰＴＨ１）受容体、副甲状腺ホルモン２（ＰＴＨ２）受容体、カルシトニン受容体様受容体（ＣＬＲ）、カルシトニン受容体、アンジオテンシンＩＩ受容体１型、バソプレシン受容体２型、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）受容体、ニューロキニン１受容体（ＮＫ_１Ｒ）、およびプロテアーゼ活性化２受容体（ＰＡＲ_２）を含む。

【0182】

一つの実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達のモジュレーターは、エンドソームＮＫ_１受容体のモジュレーターである。

【0183】

いくつかの実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達のモジュレーターである。これらの実施態様のいくつかにおいては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、アプレピタント、フォサプレピタント、トラディピタント、マロピタント、ＨＴＸ－０１９、ネツピタント、セルロピタント、オルベピタント、ＮＡＳ－９１１Ｂ、ＺＤ－６０２１、ＫＤ－０１８、ＤＮＫ－３３３、ＮＴ－４３２、ＮＫ－９４９、ＮＴ－８１４、ＥＵ－Ｃ－００１、ベスチピタ
ント、１１４４８１４、ＳＣＨ－９００９７８、ＡＺＤ－２７３８、ＢＬ－１８３３、カソピタント、ＡＶ－８１０、ＫＲＰ－１０３、４２４８８７、シゾリルチン、ボフォピタント、Ｌ－７４２６９４、カプサゼピン、ＧＲ－８２３３４、ＭＥＮ－１１１４９、Ｌ－７３２１３８、ＮｉＫ－００４、ＴＡ－５５３８、ＣＰ－９６３４５、ラネピタント、ＬＹ－２５９０４４３、ダピタント、ブラピタント、ベフェツピタント、ＣＪ－１７４９３、ＡＶＥ－５８８３、ＣＧＰ－４９８２３、ＣＰ－１２２７２１、ＣＰ－９９９９４、ＳＬＶ－３１７、ＴＡＫ－６３７、Ｌ－７３３０６０、Ｌ－７０３６０６、ジロペチン、ＭＰＣ－４５０５、Ｌ－７４２３１１、ＦＫ－８８８、ＷＩＮ－６４８２１、ＮＩＰ－５３０、ＳＬＶ－３３６、エズロピタント、ＴＫＡ－４５７、フィゴピタント、ＺＤ－４７９４、ＣＰ－１００２６３、ＧＲ－２０３０４０、Ｌ－７０９２１０、ＭＥＮ－１０９３０、ＭＥＮ－１１４６７、ＬＹ－３０６７４０、ＦＫ－３５５、ＷＩＮ－６７６８９、ＷＩＮ－５１７０８、ＦＫ－２２４、ＢＬ－１８３２、ＣＡＭ－６１０８、ＣＰ－９８９８４、ＷＳ－９３２６Ａ、Ｌ－７４１６７１、Ｌ－７３７４８８、Ｌ－７４０１４１、Ｌ－７６０７３５、Ｌ－１６１６６４、ＹＭ－４９２４４、Ｓｃｈ－６００５９、ＳＤＺ－ＮＫＴ－３４３、Ｓ－１８５２３、ＲＰＲ－１１１９０５、Ｓ－１９７５２、Ｌ－１６１６４４、ＬＹ－２９７９１１、ＲＰＲ－１０７８８０、Ｌ－７３６２８１、アントロテニン、ＲＰ－７３４６７、ＷＩＮ－６４７４５、ＷＩＮ－６８５７７、ＷＩＮ－６２５７７ ＷＩＮ－６６３０６、ＲＰ－６７５８０、ＣＰ－０３６４、Ｌ－７４３９８６、Ｓ－１６４７４、ＣＧＰ－４７８９９、ＦＲ－１１３６８０、ＹＭ－４４７７８、ＧＲ－１３８６７６、ＣＧＰ－７３４００、ＣＡＭ－２４４５、ＭＤＬ－１０５１７２Ａ、Ｌ－７５６８６７、イスブフィリン、Ｒ－６７３、ＳＲ－４８９６８およびＳＲ－１４０３３、ＧＷ６７９７６９、ＣＰ－０５７８、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。

【0184】

非限定的な例として、疎水性モジュレーターエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達またはその薬学的に許容される塩は、アプレピタント、ボフォピタント、Ｌ－７３３０６０、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択することができる。例えば、疎水性モジュレーターエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達またはその薬学的に許容される塩は、アプレピタントまたはその薬学的に許容される塩である。

【0185】

一つの実施態様においては、本発明は、有効量の本発明による水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療方法を提供する（例えば、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達のモジュレーターが、上記のようにエンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達のモジュレーター（例えば、阻害剤）であるとき）。

【0186】

別の実施態様においては、本発明は、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療のための薬剤の製造における本発明による水性液体の使用を提供する（例えば、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達のモジュレーターが、上記のようにエンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達のモジュレーター（例えば、阻害剤）であるとき）。

【0187】

さらなる実施態様においては、本発明は、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療における使用のための本発明による水性液体を提供する（例えば、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達のモジュレーターが、上記のようにエンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達のモジュレーター（例えば、阻害剤）であるとき）。

【0188】

好ましい実施態様においては、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害は、化学療法誘発性の吐き気および嘔吐（ＣＩＮＶ）、周期的嘔吐症候群、術後の吐き気および嘔吐、鬱病および不安を含む情動性および中毒性の障害、全般性不
安障害（ＧＡＤ）、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、胃麻痺および機能性消化不良を含む胃腸障害、関節炎を含む慢性炎症性障害、ＣＯＰＤおよび喘息を含む呼吸器障害、泌尿生殖器障害、感覚障害並びに体性痛および内臓痛を含む疼痛、掻痒、ウイルス性および細菌性感染症並びに増殖性疾患（癌）、並びにそれらの組合せから選択される。

【0189】

一つの実施態様においては、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害は、体性痛または内臓痛である。

【0190】

本発明の文脈において、用語「疼痛」は、慢性炎症性疼痛（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、リウマチ性脊椎炎、痛風性関節炎および若年性関節炎に関連する疼痛）；筋骨格痛、腰および首の疼痛、捻挫および緊張、神経因性疼痛、交感神経的に維持される疼痛、筋炎、癌および線維筋痛症に関連する疼痛、片頭痛に関連する疼痛、クラスターおよび慢性の毎日の頭痛に関連する疼痛、一般的な風邪などのインフルエンザまたは他のウイルス感染に関連する疼痛、リウマチ熱、非潰瘍性呼吸困難、非心臓胸部痛および過敏性腸症候群などの機能性腸障害に関連する疼痛、心筋虚血に関連する疼痛、術後の疼痛、頭痛、歯痛、月経困難症、神経痛、線維筋痛症候群、複雑な局所疼痛症候群（ＣＲＰＳタイプＩおよびＩＩ）、神経因性疼痛症候群（糖尿病性神経障害、化学療法によって誘発される神経因性疼痛、坐骨神経痛、非特異的腰痛、多発性硬化症疼痛、ＨＩＶ関連神経障害、帯状疱疹後神経痛、三叉神経痛を含む）並びに身体的外傷、切断、癌、毒素または慢性炎症状態に起因する疼痛を含む。好ましい実施態様においては、疼痛は、体性痛または内臓痛である。

【0191】

別の実施態様においては、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害は、慢性疾患または障害である。

【0192】

いくつかの実施態様においては、本方法または使用は、有効量のエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することをさらに含む。

【0193】

特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、ＭＫ－３２０７、オルセゲパントなどのエンドソームＣＧＲＰおよび／またはＣＬＲシグナル伝達の阻害剤、またはそれらの薬学的に許容される塩である。

【0194】

いくつかの実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、コポリマー鎖のポリマーナノ粒子のコア内に含まれ、
ここで、該コポリマー鎖は、コア／シェル構造を形成するように集合し、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有する。

【0195】

いくつかの実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、エンドソームＣＧＲＰおよび／若しくはＣＬＲシグナル伝達の阻害剤または薬学的に許容される塩である。

【0196】

これらの実施態様のいくつかにおいては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、ＢＩ ４４３７０、ＭＫ－３２０７、オルセゲパント、ウブロゲパント、リメゲパント、ＳＢ－２６８２６２、テルカゲパン
ト、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。

【0197】

非限定的な例として、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、オルセゲパント、ＭＫ－３２０７、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択することができる。例えば、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターまたは薬学的に許容される塩は、ＭＫ－３２０７またはその薬学的に許容される塩である。

【0198】

別の面においては、本明細書で提供されるのは、有効量の本開示による水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、エンドソームＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療方法である（例えば、エンドソームＧＰＣＲ受容体シグナル伝達のモジュレーター（例えば、ＣＬＲシグナル伝達モジュレーター）が、上記のようにエンドソームＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達のモジュレーター（例えば、阻害剤）であるとき）。

【0199】

別の実施態様においては、本開示は、ＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲエンドソームシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療のための薬剤の製造における本発明による水性液体の使用を提供する（例えば、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達モジュレーターが、上記のようにエンドソームＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達のモジュレーター（例えば、阻害剤）であるとき）。

【0200】

さらなる実施態様においては、本開示は、エンドソームＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療における使用のための本発明による水性液体を提供する（例えば、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達モジュレーターが、上記のようにエンドソームＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達のモジュレーター（例えば、阻害剤）であるとき）。

【0201】

特定の実施態様においては、エンドソームＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害は、片頭痛並びに疼痛、光恐怖症、音声恐怖症、悪心および嘔吐を含む片頭痛に関連する症状、感覚障害、体性痛および内蔵痛を含む疼痛、クラスターおよび慢性の毎日の頭痛に関連する疼痛、ＣＯＰＤおよび喘息を含む呼吸器疾患、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、胃麻痺および機能性消化不良を含む胃腸障害、並びに変形性関節症および関節リウマチを含む慢性炎症性障害からなる群から選択される。

【0202】

特定の実施形態において、エンドソームＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害は、体性痛または内臓痛である。

【0203】

特定の実施態様においては、エンドソームＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害は、慢性疾患または障害である。

【0204】

特定の実施態様においては、本方法または使用は、有効量のエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩を対象に投与することをさらに含む。

【0205】

特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、アプレピタント、ボフォピタント、Ｌ－７３３０６０、またはそれらの薬学的に許容される塩などのエンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達の阻害剤である。

【0206】

特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、コポリマー鎖のポリマーナノ粒子のコア内に含まれ、
ここで、該コポリマー鎖は、コア／シェル構造を形成するように集合し、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有する。

【0207】

いくつかの実施態様においては、本明細書の水性液体は、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩をさらに含み、ここで、該エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、ポリマーナノ粒子のコア内に含まれる。

【0208】

特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、ＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達の阻害剤である。

【0209】

特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、ＢＩ ４４３７０、ＭＫ－３２０７、オルセゲパント、ウブロゲパント、リメゲパント、ＳＢ－２６８２６２、テルカゲパント、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。

【0210】

非限定的な例として、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、オルセゲパント、ＭＫ－３２０７、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択することができる。例えば、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、ＭＫ－３２０７、またはその薬学的に許容される塩である。

【0211】

いくつかの実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とのモル比は、１：１０から１０：１である。

【0212】

いくつかの実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とのモル比は、１：１から４：１（例えば、１：２から２：１（例えば、１：１））である。

【0213】

特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩であり；エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、エンドソームＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩である。

【0214】

非限定的な例として、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、アプレピタント、ボフォピタント、Ｌ－７３３０６０、またはそれらの薬学的に許容される塩であり得；エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、オルセゲパント、
ＭＫ－３２０７、またはそれらの薬学的に許容される塩であり得る。

【0215】

従って、別の面においては、本明細書で提供されるのは、コア／シェル構造を形成するように集合したコポリマー鎖のポリマーナノ粒子を含む水性液体であり、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有し、
ここで、該ナノ粒子は、それらのコア内に、
ａ）エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の最初の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩；および
ｂ）エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含む。

【0216】

これらの実施態様のいくつかにおいては、水性液体は、本明細書のどこにでも記載されているような１つ以上の特徴を有することができる。例えば、
酸応答性疎水性ポリマーブロックは、酸性環境において（例えば、約ｐＨ＝６．１で）プロトン化される第三級アミン官能基を含むことができ；
酸応答性疎水性ポリマーブロックは、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤｉＰＡＥＭＡ）のホモポリマーまたはコポリマーを含むことができ；
酸応答性疎水性ポリマーブロックは、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤｉＰＡＥＭＡ）およびポリアルキレンオキシドメタクリレートのコポリマーを含むことができ；
酸応答性疎水性ポリマーブロックは、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤｉＰＡＥＭＡ）およびジエチレングリコールメタクリレート（ＤＥＧＭＡ）のコポリマーを含むことができ；
親水性ポリマーブロックは、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）および２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）のコポリマーを含むことができ；および／または
ナノ粒子の直径は、１５から１２０ｎｍ（例えば、１５から１００ｎｍ（例えば、２５から５０ｎｍ））であり得る。

【0217】

特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、エンドソームＧＰＣＲの阻害剤である。
特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩である。

【0218】

これらの実施態様のいくつかにおいては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、アプレピタント、フォサプレピタント、トラディピタント、マロピタント、ＨＴＸ－０１９、ネツピタント、セルロピタント、オルベピタント、ＮＡＳ－９１１Ｂ、ＺＤ－６０２１、ＫＤ－０１８、ＤＮＫ－３３３、ＮＴ－４３２、ＮＫ－９４９、ＮＴ－８１４、ＥＵ－Ｃ－００１、ベスチピタント、１１４４８１４、ＳＣＨ－９００９７８、ＡＺＤ－２７３８、ＢＬ－１８３３、カソピタント、ＡＶ－８１０、ＫＲＰ－１０３、４２４８８７、シゾリルチン、ボフォピタント、Ｌ－７４２６９４、カプサゼピン、ＧＲ－８２３３４、ＭＥＮ－１１１４９、Ｌ－７３２１３８、ＮｉＫ－００４、ＴＡ－５５３８、ＣＰ－９６３４５、ラネピタント、ＬＹ－２５９０４４３、ダピタント、ブラピタント、ベフェツピタント、ＣＪ－１７４９３、ＡＶＥ－５８８３、ＣＧＰ－４９８２３、ＣＰ－１２２７２１、ＣＰ－９９９９４、ＳＬＶ－３１７、ＴＡＫ－６３７、Ｌ－７３３０６０、Ｌ７０３，６０６、ジロペチン、ＭＰ
Ｃ－４５０５、Ｌ－７４２３１１、ＦＫ－８８８、ＷＩＮ－６４８２１、ＮＩＰ－５３０、ＳＬＶ－３３６、エズロピタント、ＴＫＡ－４５７、フィゴピタント、ＺＤ－４７９４、ＣＰ－１００２６３、ＧＲ－２０３０４０、Ｌ－７０９２１０、ＭＥＮ－１０９３０、ＭＥＮ－１１４６７、ＬＹ－３０６７４０、ＦＫ－３５５、ＷＩＮ－６７６８９、ＷＩＮ－５１７０８、ＦＫ－２２４、ＢＬ－１８３２、ＣＡＭ－６１０８、ＣＰ－９８９８４、ＷＳ－９３２６Ａ、Ｌ－７４１６７１、Ｌ－７３７４８８、Ｌ－７４０１４１、Ｌ－７６０７３５、Ｌ－１６１６６４、ＹＭ－４９２４４、Ｓｃｈ－６００５９、ＳＤＺ－ＮＫＴ－３４３、Ｓ－１８５２３、ＲＰＲ－１１１９０５、Ｓ－１９７５２、Ｌ－１６１６４４、ＬＹ－２９７９１１、ＲＰＲ－１０７８８０、Ｌ－７３６２８１、アントロテニン、ＲＰ－７３４６７、ＷＩＮ－６４７４５、ＷＩＮ－６８５７７、ＷＩＮ－６２５７７ ＷＩＮ－６６３０６、ＲＰ－６７５８０、ＣＰ－０３６４、Ｌ－７４３９８６、Ｓ－１６４７４、ＣＧＰ－４７８９９、ＦＲ－１１３６８０、ＹＭ－４４７７８、ＧＲ－１３８６７６、ＣＧＰ－７３４００、ＣＡＭ－２４４５、ＭＤＬ－１０５１７２Ａ、Ｌ－７５６８６７、イスブフィリン、Ｒ－６７３、ＳＲ－４８９６８およびＳＲ－１４０３３、ＧＷ６７９７６９、ＣＰ－０５７８、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。

【0219】

非限定的な例として、第１の疎水性モジュレーターエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達またはその薬学的に許容される塩は、アプレピタント、ボフォピタント、Ｌ－７３３０６０、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択され得る。

【0220】

特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、ＣＧＲＰおよび／またはＣＬＲシグナル伝達の阻害剤である。
特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、ＢＩ ４４３７０、ＭＫ－３２０７、オルセゲパント、ウブロゲパント、リメゲパント、ＳＢ－２６８２６２、テルカゲパント、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
非限定的な例として、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、オルセゲパント、ＭＫ－３２０７、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択することができる。

【0221】

特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とのモル比は、１：１０から１０：１である。
特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩とのモル比は、１：４から４：１（例えば、１：２から２：１（例えば、１：１））である。

【0222】

特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩であり；エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、エンドソームＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達の阻害剤またはその薬学的に許容される塩である。

【0223】

非限定的な例として、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、アプレピタント、ボフォピタント、Ｌ－７３３０
６０、またはそれらの薬学的に許容される塩であり得；エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーターまたはその薬学的に許容される塩は、オルセゲパント、ＭＫ－３２０７、またはそれらの薬学的に許容される塩であり得る。

【0224】

従って、別の面においては、本明細書で提供されるのは、有効量の本開示による水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法であり、ここで、ポリマーナノ粒子のコアは、上記のようにエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１のモジュレーターおよびエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターを含む。

【0225】

別の面においては、本明細書で提供されるのは、コア／シェル構造を形成するように集合したコポリマー鎖のポリマーナノ粒子を含む水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法であり、該コポリマー鎖は、
（ｉ）ナノ粒子のコアを形成する酸応答性疎水性ポリマーブロック；および
（ｉｉ）ナノ粒子のシェルを形成し、水性液体によって溶媒和される親水性ポリマーブロックを有し、
ここで、該ナノ粒子は、そのコア内に、
ａ）エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩；および
ｂ）エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含み；
およびここで、該酸応答性ポリマーブロックは、エンドソーム内腔の酸性環境において遷移を受け、これにより、集合したコポリマー鎖が解体し、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩がエンドソームに放出される。

【0226】

別の面においては、本明細書で提供されるのは、有効量の本開示による水性液体をそれを必要とする対象に投与することを含む、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療方法であり、ここで、該疾患または障害は、ＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達、および／またはＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介され、ここで、ポリマーナノ粒子のコアは、上記のようにエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第１のモジュレーターおよびエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２のモジュレーターを含む。

【0227】

いくつかの実施態様においては、本疾患または障害は、片頭痛並びに疼痛、光恐怖症、音声恐怖症、悪心および嘔吐を含む片頭痛に関連する症状、感覚障害、体性痛および内蔵痛を含む疼痛、クラスターおよび慢性の毎日の頭痛に関連する疼痛、ＣＯＰＤおよび喘息を含む呼吸器疾患、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、胃麻痺および機能性消化不良を含む胃腸障害、または変形性関節症および関節リウマチを含む慢性炎症性障害などの、エンドソームＣＧＲＰ受容体シグナル伝達、例えば、ＣＬＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害である。

【0228】

いくつかの実施態様においては、本疾患または障害は、化学療法誘発性の吐き気および嘔吐（ＣＩＮＶ）、周期的嘔吐症候群、術後の吐き気および嘔吐、鬱病および不安を含む情動性および中毒性の障害、全般性不安障害（ＧＡＤ）、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、胃麻痺および機能性消化不良を含む胃腸障害、関節炎を含む慢性炎症性障害、ＣＯＰＤおよび喘息を含む呼吸器障害、泌尿生殖器障害、感覚障害並びに体性痛および内臓痛を含む疼痛、掻痒、ウイルス性および細菌性感染症並びに増殖性疾患（癌）、並びにそれらの組合せなどの、エンドソームＮＫ_１Ｒシグナル伝達によって媒介される疾患または障害で
ある。

【0229】

特定の実施態様においては、本疾患または障害は、体性痛または内臓痛である。

【0230】

特定の実施態様においては、本疾患または障害は、慢性疾患または障害である。

【0231】

別の面においては、本明細書で提供されるのは、有効量の
１）第１の水性液体またはその医薬組成物（ここで、該第１の水性液体は、本明細書のどこにでも記載されているように、ポリマーナノ粒子のコア内にＮＫ_１Ｒ阻害剤を含む）；および
２）第２の水性液体またはその医薬組成物（ここで、該第２の水性液体は、本明細書のどこにでも記載されているように、ポリマーナノ粒子のコア内にＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲ阻害剤を含む）
をそれを必要とする対象に投与することを含む、該対象におけるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を調節する方法である。

【0232】

別の面においては、本明細書で提供されるのは、有効量の
１）第１の水性液体またはその医薬組成物（ここで、該第１の水性液体は、本明細書のどこにでも記載されているように、ポリマーナノ粒子のコア内にＮＫ_１Ｒ阻害剤を含む）；および
２）第２の水性液体またはその医薬組成物（ここで、該第２の水性液体は、本明細書のどこにでも記載されているように、ポリマーナノ粒子のコア内にＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲ阻害剤を含む）
を対象に投与することを含む、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害の治療方法である。

【0233】

特定の実施態様においては、ＮＫ_１Ｒ阻害剤；ＣＧＲＰ受容体、例えば、ＣＬＲ阻害剤；並びに／または第１のおよび／若しくは第２の水性液体は、本明細書のどこにでも記載されているような１つ以上の特徴を有することができる。
特定の実施態様においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達によって媒介される疾患または障害は、本明細書のどこにでも記載されているとおりであり得る。
本明細書に記載の上述の実施態様のいくつかにおいては、阻害剤は、アンタゴニストである。

【0234】

エンドソームＧＰＣＲの疎水性モジュレーターが、プロトン化または脱プロトン化され得る（例えば生理学的ｐＨで）１つ以上の官能基を含む場合、該モジュレーターは、薬学的に許容される塩として調製および／または単離されてもよい。モジュレーターは、与えられたｐＨで双性イオン性であってもよいことが理解されるであろう。本明細書で使用される場合、表現「薬学的に許容される塩」は、与えられた化合物の塩を指し、ここで、塩は、医薬品としての投与に適している。そのような塩は、例えば、酸または塩基とそれぞれアミンまたはカルボン酸基との反応によって形成されてもよい。

【0235】

薬学的に許容される酸付加塩は、無機および有機酸から調製されてもよい。無機酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などを含む。有機酸の例は、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸などを含む。

【0236】

薬学的に許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基から調製されてもよい。無機塩基に由来する対応する対イオンは、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カ
ルシウム、およびマグネシウム塩を含む。有機塩基は、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２－ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ－アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、およびＮ－エチルピペリジンを含む、第一級、第二級および第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、および環状アミンを含む。

【0237】

本発明はまた、治療有効量の本発明による水性液体を、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤と共に含む医薬組成物を提供する。

【0238】

エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター、またはその薬学的に許容される塩を含むポリマーナノ粒子を含む本発明による水性液体は、対象に投与される唯一の有効成分であってもよいが、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターとの他の有効成分（１つ以上）の投与は、本発明の範囲内である。１つ以上の実施態様においては、２つ以上のエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達のモジュレーターの組合せが対象に投与されるであろうことが想定される。モジュレーター（１つ以上）はまた、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与され得るであろうことも想定される。組合せは、本明細書で前述したようなエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーター（１つ以上）と他の有効成分（１つ以上）との別々の、連続的なまたは同時の投与を許し得る。組合せは、医薬組成物の形態で提供されてもよい。

【0239】

本明細書で使用される用語「組合せ」は、上記で定義された組合せパートナーが、依存して若しくは独立してまたは異なる量の組合せパートナーとの異なる固定された組合せの使用によって、すなわち、同時にまたは異なる時点で投与され得る複数部分の組成物またはキットを指す。次いで、組合せパートナーは、例えば、同時にまたは時系列的にずらして、すなわち、異なる時点でかつ複数の部分のキットの任意の部分に対して等しいまたは異なる時間間隔で投与することができる。組合せで投与される組合せパートナーの総量の比率は、例えば、治療される患者の亜集団のニーズ、または患者の年齢、性別、体重などによって異なるニーズがあり得る単一の患者のニーズに対処するために、変えることができる。

【0240】

当業者によって容易に理解されるであろうように、投与経路および薬学的に許容される担体の性質は、状態の性質および治療される哺乳動物に依存するであろう。特定の担体または送達システム、および投与経路の選択は、当業者によって容易に決定できるであろうと考えられている。本発明による水性液体を含む任意の製剤の調製においては、エンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の疎水性モジュレーターの活性がその過程で破壊されないこと、およびモジュレーターが破壊されることなくその作用部位に到達することができることを確実にするために注意を払うべきである。同様に、選択される投与経路は、化合物がその作用部位に到達するようなものであるべきである。

【0241】

当業者は、従来のアプローチを使用して、本発明の水性液体のための適切な製剤を容易に決定し得る。好ましいｐＨ範囲および適切な薬学的に許容される賦形剤、例えば抗酸化剤の同定は、当技術分野では日常的である。緩衝系は、所望の範囲のｐＨ値を提供するために日常的に使用されており、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩およびコハク酸塩などのカルボン酸緩衝液を含む。ＢＨＴまたはビタミンＥなどのフェノール化合物、メチオニンまたは亜硫酸塩などの還元剤、およびＥＤＴＡなどの金属キレート剤を含む、さまざまな抗酸化剤が、そのような製剤に利用できる。

【0242】

本発明による水性液体は、静脈内、髄腔内、および脳内または硬膜外送達に適したもの
を含む、非経口剤形で調製されるであろうことが想定される。注射可能な使用に適した医薬剤形は、無菌の注射可能な溶液または分散液、および無菌の注射可能な溶液の即時調製のための無菌の粉末を含む。それらは、製造および保管の条件下で安定であるべきであり、還元または酸化および細菌または真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されてもよい。

【0243】

注射可能な溶液または分散液の溶媒または分散液は、活性化合物の従来の溶媒または担体システムのいずれを含んでもよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含んでもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒子サイズの維持によっておよび界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどを含むことによって、必要によりもたらすことができる。多くの場合、浸透圧を調整するための剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。好ましくは、注射用の製剤は、血液と等張であろう。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物における吸収を遅らせる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。注射可能な使用に適した医薬剤形は、静脈内、筋肉内、脳内、髄腔内、硬膜外注射または注入を含む任意の適切な経路によって送達されてもよい。

【0244】

無菌の注射可能な溶液は、本発明の水性液体を必要な量で適切な溶媒に、必要に応じて上記で列挙した成分などのさまざまな他の成分と共に組み込み、次いで濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、さまざまな滅菌された有効成分を、基礎の分散媒体および上記で列挙した成分からの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。

【0245】

薬学的に許容されるビヒクルおよび／または希釈剤は、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当技術分野でよく知られている。従来の媒体または剤が有効成分と適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるそれらの使用が企図される。補足的な有効成分も組成物に組み込むことができる。

【0246】

投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位剤形で組成物を作製することは特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療される哺乳動物対象のための単一剤形として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要な薬学的に許容されるビヒクルに関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性物質を含む。本発明の新規な単位剤形の仕様は、（ａ）活性物質の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、並びに（ｂ）本明細書に詳細に開示されるような身体の健康が損なわれている病状を有する生きている対象における疾患の治療のための活性物質を配合する技術に固有の制限によって影響され、直接依存する。

【0247】

上記のように、主要な有効成分は、便利で効果的な投与のために、治療上有効な量で適切な薬学的に許容されるビヒクルと単位剤形で配合されてもよい。単位剤形は、例えば、０．２５μｇから約２０００ｍｇの範囲の量の主要な活性化合物を含むことができる。比率で表される場合、活性化合物は、約０．２５μｇから約２０００ｍｇ／ｍＬの担体中に存在してもよい。補足的な有効成分を含む組成物の場合、投与量は、前記成分の投与の通常の用量および方法を参照することによって決定される。

【0248】

本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、所望の投薬レジメンに従って投与され
たときに、所望の治療活性を提供する化合物の量を指す。投与は、１回、または数分若しくは数時間の間隔で、またはこれらの期間のいずれかで継続的に行うことができる。適切な投与量は、投与量あたり体重１ｋｇあたり約０．１ｎｇから体重１ｋｇあたり１ｇの範囲内にあってもよい。典型的な投与量は、投与量あたり体重１ｋｇあたり１ｍｇから１ｇの範囲にあるなどの、投与量あたり体重１ｋｇあたり１μｇから１ｇの範囲である。一つの実施態様においては、投与量は、投与量あたり体重１ｋｇあたり１ｍｇから５００ｍｇの範囲であってもよい。別の実施態様においては、投与量は、投与量あたり体重１ｋｇあたり１ｍｇから２５０ｍｇの範囲であってもよい。さらに別の実施態様においては、投与量は、投与量あたり体重あたり５０ｍｇまでなどの、投与量あたり体重１ｋｇあたり１ｍｇから１００ｍｇの範囲であってもよい。

【0249】

本明細書で使用される用語「処置」および「処置すること」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける状態または疾患の任意の処置をカバーする。本明細書で使用される用語「予防」および「予防すること」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける状態または疾患の予防または予防法をカバーする。

【0250】

本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の求めがない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと」などの変形は、記載された整数または整数若しくはステップのグループを含むことを意味すると理解されるであろうが、いかなる他の整数または整数のグループを排除することを意味するとは理解されないであろう。

【0251】

この明細書における以前のいかなる刊行物（またはそれから派生する情報）への、または既知のいかなる事項への言及も、その以前の刊行物（またはそれから派生する情報）または既知の事項が、この明細書が関連する努力の分野における共通の一般知識の一部を形成するということの了承または承認またはいかなる形式の示唆でもなく、またそのように解釈されるべきでない。

【0252】

次に、本発明を、以下の非限定的な実施例を参照して説明する。

【実施例0253】

実施例１：ジブロックコポリマーの合成および特性評価
ジブロックコポリマーは、スキーム５／スキーム５Ｂおよび以下に概説される方法に従って合成された。これらのジブロックコポリマーは、両方とも同じ親水性コポリマーＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）を含んでいたが、異なる疎水性コポリマーを含んでいた。Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）を使用してポリマーおよびＰ（ＢＭａ）に酸応答特性を与え、非酸応答特性を有する対照ポリマーを形成した。各合成の前に、モノマーは、塩基性酸化アルミニウムを使用して脱抑制された。

【0254】

【化23】

【0255】

Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ－ｃｏ－Ｃｙ５）ジブロックコポリマーは、スキーム５Ｂおよび以下に概説される方法に従って合成された。

【0256】

【化24】

【0257】

高分子連鎖移動剤：Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）親水性ブロックコポリマー。
高分子連鎖移動剤（Ｍａｃｒｏ－ＣＴＡ）は、ＲＡＦＴ剤としての２－シアノプロプ－２－イルジチオベンゾエート（ＣＰＢＤ）および開始剤としてのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を２：０．２の比率で使用して、可逆的付加フラグメンテーション連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合によって合成された。ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート平均Ｍｎ約５００（ＰＥＧＭＡ）、２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ、９８％）、２－（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ、９９％）、２－（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＩＰＡＥＭＡ、９７％）、ブチルメタクリレート（ＢＭＡ、９９％）、および４，４－ジメチル－２－ビニル－２－オキサゾリン－５－オン（ＶＤＭ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。

【0258】

Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）親水性ブロックコポリマー
高分子連鎖移動剤（Ｍａｃｒｏ－ＣＴＡ）、Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）は、ＲＡＦＴ剤としての２－シアノプロプ－２－イルジチオベンゾエート（ＣＰＢＤ）および開始剤としてのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を２：０．２の比率でを使用する可逆的付加フラグメンテーション鎖（ＲＡＦＴ）重合法によって合成された。ＰＥＧＭＡおよびＤＭＡＥＭＡ（１２０：１２の比率）をＣＰＢＤおよびＡＩＢＮを有する３０ｍＬのトルエンに溶解した。窒素を３０分間散布することにより、溶液を脱酸素化した。７０℃および４００ＲＰＭで２１時間重合した後、反応物を氷浴で０℃に冷却し、空気に曝した。溶液のアリコートをサンプリングし、^１ＨＮＭＲにより変換率を決定した。次いで、溶液をアセトンに対して９６時間透析し（ＭＷＣＯ ３５００）、残っているモノマーを全て除去した。溶媒を蒸発させ、生成物を真空オーブン内で３７℃および１０００ミリバールで２４時間乾燥させた。

【0259】

Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）ジブロックコポリマー。 鎖延長反応は、親水性ブロックＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）並びにモノマーＤＩＰＭＡおよびＤＥＧＭＡを１：０．１５：１００：１１の比率
で使用してＡＩＢＮの存在下で実施された。混合物をトルエンに溶解していったん脱酸素化し、７０℃、４００ＲＰＭで１７．５時間反応させた。最終生成物を、前述のように精製した。

【0260】

Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＢＭＡ）ジブロックコポリマー。 ＢＭＡは、トルエン中のＡＩＢＮの存在下での鎖延長反応により、親水性Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）ブロックから重合された。［ＢＭＡ］：［Ｍａｃｒｏ－ＣＴＡ］：［ＡＩＢＮ］の比率は１２０：１：０．２であった。溶液を脱酸素化し、バイアルの内容物を７０℃および４００ＲＰＭで１５時間反応させた。最終生成物を、前述のように精製した。

【0261】

Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ－ｃｏ－Ｃｙ５）ジブロックコポリマー。
Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）の鎖延長は、ＡＩＢＮの存在下で、ＤＩＰＭＡ、ＤＥＧＭＡおよび４，４－ジメチル－２－ビニル－２－オキサゾリン－５－オン（ＶＤＭ）を１：１００：１１：０．１５の比率で添加することによりトルエン中で行われた。混合物を脱酸素化し、７０℃、４００ＲＰＭで１７．５時間反応させた。Ｃｙ５カップリングは、反応物をシアニン５アミンと混合することによって２番目のステップで実施された。混合物を室温、４００ＲＰＭで７２時間暗所条件で反応させ、最終生成物を、記載のように精製した。

【0262】

ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）。 ポリマーの分子量を決定するためのＧＰＣ分析は、４０℃で作動する５．０μｍビーズサイズガードカラム（５０ｘ７．８ｍｍ）、次いで３つのＳｈｏｄｅｘ ＫＦ－８５０Ｌカラム（３００ｘ８ｍｍ、ビーズサイズ：１０μｍ、最大ポアサイズ：５０００Å）に直列に接続された（ＲＩＤ－１０Ａ）示差屈折率検出器（λ＝６３３ｎＭ）およびＳＰＤ－２０Ａ紫外線検出器を備えた島津（京都、日本）液体クロマトグラフィーシステムで実施された。溶離液は、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ、０．０３％ｗ／ｖ ＬｉＢｒを有するＨＰＬＣグレード）で、１ｍＬ／分で流れていた。分子量検量線は、５００から２ｘ１０^６Ｄａの範囲の狭い分子量分布を有するポリスチレン標準を使用して作成された。

【0263】

プロトン核磁気共鳴（^１Ｈ－ＮＭＲ）。 ポリマーの変換率を決定するための^１Ｈ－ＮＭＲ分析は、重水素化クロロホルム（クロロホルム－ｄ）を溶媒として使用し、Ｔｏｐｓｐｉｎバージョン１．３を実行するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ４００ Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ Ｐｌｕｓ分光計（ＭＡ、米国）を使用して４００ｍＨｚで実施された。Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）の変換率は、生の^１Ｈ－ＮＭＲ上の５．７ｐｐｍのモノマーピークの積分によって決定された。ＰＥＧＭＡおよびＤＭＡＥＭＡの組成は、４．２５ｐｐｍのＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）のピークおよび２．５ｐｐｍのＤＭＡＥＭＡのピークを使用して決定された（図２Ａ）。Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）上のＤＩＰＭＡおよびＤＥＧＭＡモノマーの組成は、２．９９ｐｐｍのＤＩＰＭＡピークの積分並びに３．３７５および３．３９５ｐｐｍのＰＥＧＭＡおよびＤＥＧＭＡモノマーのピークの積分の比率によって決定された。（図２Ｂ）。Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）の変換率は、ＤＩＰＭＡおよびＤＥＧＭＡの初期比率（１００：１１）並びに^１Ｈ－ＮＭＲによって得られた比率（９０：１２）を使用して決定された。同様に、Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－（ＢＭＡ）変換率は、ＢＭＡおよびＭａｃｒｏ－ＣＴＡの初期比率（１２０：１）並びに^１Ｈ－ＮＭＲによって得られた比率（９８：１）を使用して決定された。ＢＭＡの単位は、３．９４ｐｐｍのピークの積分によって決定された（図２Ｃ）。

【0264】

変換率（Ｃｏｎｖ％）および繰り返しモノマー単位（ｎ）は、ピーク積分（Ｉ）を使用した^１Ｈ－ＮＭＲによって計算され、ここで、下付き番号は、ｐｐｍでピークの位置を示す（Ｉ_ｘ）。Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）のＣｏｎｖ％およびｎは、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（図２）を使用して

【0265】

【数1】

【0266】

で計算された。Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）のＣｏｎｖ％およびｎは、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（図２）を使用して

【0267】

【数2】

【0268】

で計算された。Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－（ＢＭＡ）のＣｏｎｖ％およびｎは、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（図２）を使用して

【0269】

【数3】

【0270】

で計算された。
表１は、合成されたコポリマーおよびジブロックコポリマーの結果として得られる特性を要約する。ＧＰＣによって決定された分子量は、ＧＰＣがポリスチレン標準に較正されているため、^１Ｈ－ＮＭＲによって得られた分子量よりも低いことがわかった。ＧＰＣクロマトグラムは、単峰性のピークを示し、ここで、ジブロックコポリマーは、分子量が増加するにつれてより高い保持時間にシフトした（図３）。ポリマーの化学構造は^１Ｈ－ＮＭＲによって確認され（図２）、マクロＣＴＡの共重合は５４％の変換率となったが、ジブロックコポリマーＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）およびＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－（ＢＭＡ）は、より高い変換率（９２％および８２％）に達した。全てのコポリマーの詳細な組成を、表１に示す。

【0271】

【表1】

【0272】

実施例２：本発明によるポリマーナノ粒子および対照ナノ粒子の自己集合および特性評価。
ナノ粒子の自己集合。 Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）を、本発明による酸応答性ポリマーナノ粒子を自己集合させるためのジブロックコポリマーとして使用し、Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＢＭＡ）を、酸応答特性を有さない対照ナノ粒子を自己集合させるために使用した。

【0273】

アプレピタント（Ａｐ）をロードしたポリマーナノ粒子の自己集合では、５３．５μｇのＡｐおよび５ｍｇのジブロックコポリマーの混合物を０．５ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、空のナノ粒子は、Ａｐの添加なしに自己集合された。次いで、混合物を、室温でハーバード装置のシリンジポンプ（ＭＡ、米国）を使用して、１．２ｍＬ／時の流速で激しく攪拌しながら、４．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加えた。Ａｐをロードした酸応答性ポリマーナノ粒子（ＤＩＰＭＡ－Ａｐ）およびロードした非酸応答性ナノ粒子（ＢＭＡ－Ａｐ）の集合は、透析バッグ（ＭＷＣＯ ３５００、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、米国）を使用して、窒素流下でＰＢＳに対して２４時間透析した。Ａｐを含まない酸応答性ナノ粒子（ＤＩＰＭＡ－空およびＢＭＡ－空）の集合は、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒミニ透析装置ＭＷＣＯ ３．５Ｋ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、米国）を使用して２４時間透析した。生細胞イメージング用のナノ粒子の集合は、ＡＰなしのナノ粒子について記載したように行われた。使用したジブロックコポリマーは、疎水性部分でＣｙ５と結合するＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ－ｃｏ－Ｃｙ５）であり、Ｃｙ５がコアに局在するナノ粒子（ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５）をもたらした。

【0274】

ＭＫ－３２０７をロードしたＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＢＭＡ）ポリマーナノ粒子（ＤＩＭＰＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子）は、上記と同様の方法で調製された。
動的光散乱。 ナノ粒子のサイズ分布は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ ＺＥ
Ｎ３６００粒子サイズアナライザー（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用した動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定された。１ｍｇ／ｍＬの濃度のＤＩＰＭＡ－Ａｐ、ＤＩＰＭＡ－空、およびＢＭＡ－Ａｐを、０．４５μｍナイロンフィルターを使用してろ過し、ポリスチレンキュベットに添加した。測定は、２５℃および１７３°の後方散乱角で実施された。

【0275】

質量分析と組み合わせた超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ－ＭＳ）。 ポリマーナノ粒子のコアにロードされたＡｐは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（ＭＡ、米国）に接続されたＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒトリプル四重極質量分析計を使用したＵＰＬＣ－ＭＳによって決定された。１ｍｇ／ｍＬの濃度の凍結乾燥ＤＩＰＭＡ－ＡｐおよびＢＭＡ－Ａｐを、水中のＤＭＳＯ：０．１％ギ酸の５：２混合物に溶解した。サンプルは、各調製物のアリコートを内部標準溶液（ジアゼパム、５μｇ／ｍＬ）と５：２の比率で混合することによって分析用に調製され、希釈溶媒（５０％アセトニトリルおよび０．１％ギ酸のの１：１混合物）で５００μＬとされた。クロマトグラフィー分離は、Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｐｏｌａｒカートリッジを装着したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ Ｇｕａｒｄプレカラムを備えたＳｕｐｅｌｃｏ Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＰ Ａｍｉｄｅカラム（５０ｍｍ ｘ ２．１ｍｍ、２．７μｍの粒子サイズ）で行われ、両方とも４０℃のカラム温度に維持された。ＡＰロードは、ＡＰ標準（０．０１６から２０μＭ）に対して定量化された。移動相は、水中の０．０５％ギ酸およびアセトニトリルからなり、化合物は、グラジエント条件下で溶出された。質量分析は、ポジティブエレクトロスプレーイオン化条件で行われ、化合物の溶出は、複数反応モニタリングでモニターされた。

【0276】

ｐＨ依存の解体。 ナイルレッド（Ｎｒ）は、非極性溶媒中でのみ蛍光を発するソルベートクロミック色素であり、ナノ粒子の解体のｐＨの測定を可能にする。具体的には、解体のｐＨは、ナノ粒子のコアからのＮＲの放出によるＮｒの蛍光の損失を観察することによって同定される。ナノ粒子が、前述のように自己集合され、Ａｐが、ポリマー１ｍｇあたり０．５ｍｇのナイルレッドに置き換えられ、記載のように透析された。ナイルレッド（ＤＩＰＭＡ－Ｎｒ）をロードした酸応答性ポリマーナノ粒子および非酸応答性ポリマーナノ粒子（ＢＭＡ－Ｎｒ）を２００μｇ／ｍＬの濃度で調製した。７．６から５．０のｐＨ範囲のＰＢＳ溶液を調製し、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ、米国）を使用してナイルレッド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ、米国）の蛍光（励起／発光 ５５２／６３６ｎｍ）を測定してｐＨ解体特性を評価した。

【0277】

臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）。 ＣＭＣは、ピレンＩ_１／Ｉ_３比によって決定した。ピレンストック溶液（５０μＭ）をＴＨＦ中で調製し、５μＬのピレンストックを、ナノ粒子ストック溶液をＰＢＳ中で希釈して得られた９９５μＬの段階的濃度のナノ粒子（４００から０．５μｇ／ｍＬ）に添加した。混合物を室温で３時間撹拌し、ピレンの蛍光スペクトルを、島津分光蛍光光度計ＲＦ５３０１ＰＣ（京都、日本）で３３６ｎｍの励起波長を使用して３６０から４１０ｎｍで記録した。３７３ｎｍ（Ｉ_１）および３８４ｎｍ（Ｉ_３）で測定された発光強度を使用して、ピレンＩ_１／Ｉ_３比を計算した。

【0278】

表２は、酸応答性ナノ粒子にはＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）を使用し、対照ナノ粒子にはＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＢＭＡ）を使用して自己集合したナノ粒子の特性を要約し、ＤＩＰＭＡおよびＢＭＡナノ粒子は、疎水性ＮＫ_１Ｒアンタゴニストであるアプレピタント（ＡＰ、ＭＫ－８６９）の存在下で自己集合し、それぞれＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）－Ａｐ（ＤＩＰＭＡ－ＡＰと略記）およびＰ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＢＭＡ）－Ａｐナノ粒子（ＢＭＡ－ＡＰと略記）を形成した。ＤＩＰＭＡ－ＡＰナノ粒子は、自己集合プロセスで最初に添加さ
れたＡＰの５７±１１．４％に相当する１１．４±２．３μＭ ＡＰをロードした（表２）。ＢＭＡ－ＡＰナノ粒子は、１２．３±２．７μＭのＡＰ（６０．９±１３．４％）をロードした。自己集合ナノ粒子は、ポリマーの濃度がそれらの集合状態（臨界ミセル濃度、ＣＭＣ）に有利になるのに十分高いときに集合したままである動的構造である。ＤＩＰＭＡ－空（ＤＩＰＭＡ－空）およびＢＭＡ－空ナノ粒子のＣＭＣは、類似していた（それぞれ１．９±１．１および１．５±１．１μｇ／ｍＬ）。ＤＩＰＭＡ－ＡＰ（２．４±０．５μｇ／ｍＬ）のＣＭＣは、ＢＭＡ－ＡＰ（１．５±０．８μｇ／ｍＬ）ナノ粒子よりもわずかに高かった。ＤＩＰＭＡ－ＡＰナノ粒子は、透過型電子顕微鏡で評価したところ、均一に球形であるように見え、ここで、動的光散乱は、４０．４±５．１ｎｍの直径、－０．２±１．６ｍＶの表面ζ電位を示した（表２、図１Ｃ）。ＤＩＰＭＡ－空ナノ粒子は、直径３７±４．２ｎｍで、－０．５±２．０ｍＶの表面ζ電位であった。ＢＭＡ－ＡＰおよびＢＭＡ－空ナノ粒子は、直径がより小さかった（それぞれ、直径２８±２．５および３０±４．４ｎｍ）が、同様のζ電位（それぞれ、－１．１±２．８および－０．３±０．３ｍＶ）であった。

【0279】

【表2】

【0280】

実施例３：ＤＩＰＭＡナノ粒子は、ＳＰ ＮＫ_１Ｒ陽性エンドソームにインターナライズされる。
ＧＦＰでタグ付けされたｒＮＫ_１Ｒ（ｒＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰ）でトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３細胞を、Ｃｙ５とコンジュゲートしたＤＩＰＭＡ－空ナノ粒子（ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５）と４０分でインキュベートした。次いで、細胞を、ｒＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰの活性化およびインターナリゼーションを促進するために１０ｎＭ ＳＰでチャレンジし、ＳＰ添加の３０分後および６０分後に画像化した。３０分時に、ｒＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰおよびＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子がエンドソームに共局在した（図４Ａ）。この共局在は、ＳＰ添加の６０分後に増加し（図４Ｂ）、ＤＩＰＭＡナノ粒子がＨＥＫ－２９３細胞によってインターナライズされ得るだけでなく、陽性のｒＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰエンドソームに分布することもできることを示す。

【0281】

実施例４：核ＥＲＫシグナル伝達の特徴付け。
ＳＰ濃度応答曲線は、経時的に増加する迅速な核ＥＲＫ活性化を示した。興味深いことに、ＳＰ １０ｎＭは、シグナルに対して迅速な増加を示し、次いで徐々に減少を示した（図５Ａ）。曲線下面積（ＡＵＣ）は、実験期間（６５分）で計算したときに１４．９ｎＭのＳＰのＥＣ_５０を示し（図５Ｃ）、５ｎＭのＳＰ（ＥＣ_３０）を、その後の実験でＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞を刺激するのに選択した。Ａｐ濃度応答曲線は、５ｎＭ ＳＰ刺激後、使用したＡｐの最高の濃度（１０μＭ、１μＭおよび１００ｎＭ）のみがＳＰによって引き起こされる核ＥＲＫを減少させることができることを示した（図５Ｂ）。ＡＵＣは、Ａｐに対して１２３．９ｎＭのＩＣ_５０を示した（図５Ｃ）。

【0282】

実施例５：酸応答性ポリマーナノ粒子によるＮＫ_１Ｒシグナル伝達の制御。
細胞内カルシウムの測定を、細胞内カルシウムの増加を媒介するチャネルおよび受容体の活性化に対するナノ粒子および遊離ポリマーの効果を調査するために、ＤＩＰＭＡ－空およびＢＭＡ－空ナノ粒子を用いてＨＥＫ－２９３およびＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞で実施した。ナノ粒子を、ＣＭＣの上（１０μｇ／ｍＬ）および下（３．１６および１μｇ／ｍＬ）の３つの異なる濃度で添加した。両方の細胞株において、観察された効果は、類似していた；ＤＩＰＭＡ－空およびＢＭＡ－空ナノ粒子は、２８分の実験中に細胞内カルシウム流入を増加させることができなかった。これらの知見は、ナノ粒子がｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内カルシウムを増加させないことを実証する（図６）。

【0283】

ＥＲＫ活性に対するナノ粒子の効果を、ＨＥＫ－ｈ ＮＫ_１Ｒ細胞をビヒクル添加前の３０分間ＤＩＰＭＡ－空およびＢＭＡ－空ナノ粒子（１０、２０および３０μｇ／ｍＬ）またはビヒクルとプレインキュベートすることによって評価した（図７）。ＤＩＰＭＡ－空およびＢＭＡ－空は、調査した濃度のいずれにおいても核ＥＲＫ活性化を引き起こなかった（図７Ａ）。

【0284】

細胞の生存率を、蛍光によって検出できる、活性化合物レザスリン（Ｒｅｓａｓｕｒｉｎ）をレソフリン（ｒｅｓｏｆｕｒｉｎ）に還元する生細胞の能力を評価するａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを使用して調べた。細胞は、ナノ粒子（１、３、１０、３０および１００μｇ／ｍＬ）とのインキュベーションの２４時間後（図７Ｃ）および４８時間後（図７Ｄ）にレザスリンを還元するその能力のいかなる有意な減少も示さなかった。

【0285】

実施例６：核ＥＲＫ活性に対するアプレピタントをロードしたポリマーナノ粒子の効果。
ＳＰ刺激およびＮＫ_１Ｒのインターナリゼーションの後、ＮＫ_１Ｒは、一連のタンパク質をリクルートして、それからシグナル伝達できるシグナロソームを形成し、核ＥＲＫおよびｃＡＭＰを増加させる（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｄ．Ｄ．ら、Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ａ ｖｉａｂｌｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｐａｉｎ ｒｅｌｉｅｆ、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ． ２０１７ ３１（９）、３９２）。核ＥＲＫシグナル伝達を減少させるＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子の能力を試験するために、ＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞を、ＤＩＰＭＡ－Ａｐ（１０μｇ／ｍＬ－１００ｎＭ）ナノ粒子およびＢＭＡ－Ａｐ（１０μｇ／ｍＬ－１００ｎＭ）ナノ粒子とプレインキュベートした後、ＳＰを添加した。１００ｎＭのアプレピタントをロードした１０μｇのＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子は、ＳＰによって引き起こされる核ＥＲＫを減少させることができることが見い出された。同様の結果が、１００ｎＭのアプレピタントをロードした１０μｇ／ｍＬのＢＭＡ－Ａｐナノ粒子で観察されたが、１００ｎＭの遊離アプレピタントはより低い減少を示した（図８）。

【0286】

実施例７：自発運動パターンに対するナノ粒子の効果。
ロータロッド試験を、動物の運動能力に対するナノ粒子の効果を評価するために使用した。処置は、調べたどの時点でも、ビヒクル群と比較して落下までの潜時に有意差を生じなかったが、これは、ナノ粒子のｉ．ｔ．投与が自発運動パターンを変更せずマウスの神経筋協調に影響を与えないことを示す（図９）。

【0287】

実施例８：ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子の分布。
ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子の投与により、ｉｎ ｖｉｖｏでのナノ粒子の動きの追跡が可能となった。単回投与後、ナノ粒子は、評価した時点を通して注射部位（Ｌ３－Ｌ４）内に局在した（図１０）。Ｃｙ５蛍光の減少は、４～６時間の間に観察され、そのシグナルは８時間まで弱まった。２４時間時には、何の蛍光も観察されなかったが、これは、
ナノ粒子の分解を示している可能性があるであろう。それにもかかわらず、ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子の解体およびジブロックコポリマー形成ユニットのさらなる分解の後、分解されたＣｙ５コンジュゲートジブロックコポリマーがＣｙ５蛍光を消光し、それがＣｙ５蛍光の喪失を正確に解釈することにおける困難性につながったであろう可能性がある。

【0288】

実施例９：ポリマーナノ粒子の髄腔内投与は、急性疼痛モデルの痛覚反応を緩和する。
急性疼痛の発生に関与するＮＫ_１Ｒのエンドソームシグナル伝達を選択的に阻害する酸応答性ポリマーナノ粒子の有効性を評価するために、ＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子、対照（ＤＩＰＭＡ－空、遊離アプレピタントと混合したＤＩＰＭＡ－空、ＢＭＡ－Ａｐおよび遊離アプレピタント）およびビヒクルの単回用量を、右後足（同側）にカプサイシンを皮下注射する３０分前に髄腔内に投与した（図１１）。ビヒクルおよびＤＩＰＭＡ－空は、カプサイシン誘発性の機械的アロディニアと一致して、フォンフレイ反応の強力かつ迅速な減少を示し、これは、２４時間時に基底レベルに戻った。分離した鎮痛（３０％）が、最初の１時間時に、遊離アプレピタントの群および遊離アプレピタントと混合されたＤＩＰＭＡ－空ナノ粒子の群において観察され、次いで、鎮痛が徐々に減衰し、３時間時にその効果が完全に失われた。興味深いことに、ＢＭＡ－Ａｐナノ粒子は、最初の３０分時に遊離アプレピタントと同様の鎮痛値を示し、効果を１．５時間延長した。しかしながら、効果の減衰についての同じ挙動が観察された。対照的に、ＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子は、最初の６０分間で対照群よりも高い鎮痛を示し、その後増加して４時間持続的な効果に達した。

【0289】

実施例１０：ポリマーナノ粒子の髄腔内投与は、慢性疼痛モデルにおける痛覚反応を緩和する。
慢性疼痛モデルを、坐骨神経の結紮によって誘発し、疼痛に対する感作（アロディニア、痛覚過敏）を１０日間発症させた。感作を、ランダルセリット電子痛覚計を使用してベースライン（手術前）および手術後の足の引っ込めを測定することで確認した（Ｅｖａ Ｓａｎｔｏｓ－Ｎｏｇｕｅｉｒａら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ． ２０１２、２９（５）：８９８－９０４）。

【0290】

次いで、ラットに、ポリマーナノ粒子（ＤＩＰＭＡ、ＢＭＡ：空またはアプレピタントをロード）、ビヒクル対照（人工脳脊髄液）または漸増濃度のアプレピタント（１００、３００ｎＭおよび１μＭ、各濃度あたりｎ＝４）を、髄腔内注射した（脊椎のＬ３－Ｌ４位置、総量１０μＬ）。どの薬物濃度が慢性疼痛モデルにおいて鎮痛効果を示すために必要とされるかを決定するために、３つの異なる濃度のアプレピタントを試験した。１０、３０または５０μｇの非酸応答性ＢＭＡナノ粒子に１００、３００または５００ｎＭのアプレピタント（各濃度あたりｎ＝６）をロードし、１０、３０または５０μｇの酸応答性ＤＩＰＭＡナノ粒子に１００、３００または５００ｎＭのアプレピタント（各濃度あたりｎ＝６）をロードした。

【0291】

ランダルセリットを、１５、３０分１時間時に実施した後、３０分ごとに５時間、次いで１時間ごとに７時間測定し、その結果を、図１２Ａ、１２Ｂおよび１３に示す。明らかなように、アプレピタントをロードしたナノ粒子は、より大きな鎮痛およびより長く続く効果を提供する。３００ｎＭの遊離アプレピタントは、圧力において２０ｇの改善（約２５％の疼痛の回復）をもたらしたが、この効果は２時間しか持続しなかった。一方、ＤＩＰＭＡポリマーナノ粒子にロードした３００ｎＭのアプレピタントは、圧力において５時間持続する６０ｇの改善（＜８０％の回復）を提供した。

【0292】

実施例１１：ＡＴＰ生成に対するナノ粒子の効果の評価
歴史的に、ナノ粒子の毒性は、細胞の健康について無数の異なるアッセイを使用して評価されてきた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ、ヨウ化プロピジウムおよびＡｌａｍａｒＢ
ｌｕｅを使用して、ミトコンドリアの健康、核膜の完全性および細胞の酸化還元電位に対するナノ粒子の効果がそれぞれ評価される。これらは、アッセイを選択する前に考慮される必要がある細胞の健康のさまざまな指標を測定する一般的に使用されるアッセイである。

【0293】

ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイを、ミトコンドリア活性の指標としてのＡＴＰ生成に対するポリマーナノ粒子の効果を測定するために使用した。このアッセイは、ＡＴＰ依存性のＵｌｔｒａ－Ｇｌｏ組換えルシフェラーゼによるカブトムシルシフェリンの酵素変換を使用して、オキシルシフェリンおよび光を生成する。この酵素的相互作用からの生物発光を測定し、ＡＴＰおよび細胞生存率と相関させることができる。この分析を使用する利点は、感度が高く、血清またはフェノールレッド（増殖培地における一般的なｐＨ指示薬）の影響を受けず、試薬を１回添加するだけでよく、定常的な発光シグナルを得るために室温で最低１０分間のインキュベーションを必要とするだけであることである。これにより、必要な工程の数および手動の取扱いが減るため、エラーを制限できる。しかしながら、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬は、また細胞を溶解して検出のためにＡＴＰを放出するための界面活性剤およびＡＴＰａｓｅ阻害剤も含み、細胞生存率を経時的にモニターするために使用することはできない。細胞を、漸増濃度ＤＥＡＥＭＡおよびＤＩＰＭＡナノ粒子並びに０～５０％で組み込んだＤＥＧＭＡで処置した。細胞をナノ粒子とともに２４時間までインキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏを使用して生存率を測定した。ＤＥＡＥＭＡおよびＤＩＰＭＡナノ粒子のインキュベーション８時間までで、毒性は５０μｇ／ｍＬの濃度でのみ観察された（図１３）。２４時間時に、１０μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬの濃度のナノ粒子は、細胞生存率を低下させた。５０％ＤＥＧＭＡの導入により、測定した全ての時点で５０μｇ／ｍＬのＤＥＡＥＭＡナノ粒子で処置した細胞の細胞生存率が増加した。ＤＩＰＭＡで処置した細胞においては、０～２０％のＤＥＧＭＡナノ粒子は、０％のナノ粒子と比較して細胞生存率を低下させた。興味深いことに、５０％のＤＥＧＭＡ－ＤＩＰＭＡナノ粒子のみが細胞生存率プロファイルを改善した。

【0294】

実施例１２：膜の完全性および透過性に対するナノ粒子の効果の評価
ポリマーナノ粒子が膜の完全性を破壊したかどうかを決定するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アッセイを実施した。この細胞不透過性色素は、核塩基をインターカレーとすることによって核および染色体を対比染色し、細胞死を検出するために使用される。ＣＭＣ未満の濃度では、ＤＥＡＥＭＡおよびＤＩＰＭＡは、膜の完全性に影響を与えなかった。ＡＴＰ検出アッセイと一致して、２～２４時間インキュベートした５０μｇ／ｍＬのＤＥＡＥＭＡナノ粒子は、ＰＩ検出アッセイにおいて約４０％の細胞死を誘導した（図１４）。ＤＥＡＥＭＡナノ粒子の毒性は、細胞と２、８および２４時間インキュベートしたとき、５０％ＤＥＧＭＡの導入により有意に減少した。ＤＩＰＭＡナノ粒子は、毒性が低く、２４時間のインキュベーション後、粒子の最高濃度で細胞集団の約１５％の死を示した。これは、同等の濃度および時間のＤＩＰＭＡナノ粒子で約４０％の細胞生存率低下を示したＡＴＰ検出と比較して低い。ＤＥＡＥＭＡおよびＤＩＰＭＡの毒性における違いは、エンドソームネットワークを介した粒子移行の運命に影響を与え得るｐＫａに起因し得る。ＤＥＡＥＭＡは、ＤＩＰＭＡよりも高いｐＫａを有し、報告されているｐＫａはそれぞれ７．１および６．１である。従って、ＤＥＡＥＭＡは、より高いｐＨでのエンドソーム成熟プロセスにおいてより早く解体しそうであり、一方、ＤＩＰＭＡナノ粒子は、エンドソームネットワークにおいてさらにインタクトなままでありそうである。解離の遅延は、ポリカチオン依存性細胞死のよりゆっくりとした開始をもたらし得、また細胞死のメカニズムを決定し得る。

【0295】

実施例１３：細胞内酸化還元電位に対するナノ粒子の効果の評価
膜の完全性およびＡＴＰ生成アッセイは、ＤＥＡＥＭＡおよびＤＩＰＭＡナノ粒子が、試験された濃度および時間のパラメーターを使用して完全な細胞毒性に至らないことを示
した。従って、粒子の完全な細胞毒性プロファイルを観察するために、細胞内酸化還元電位に対するナノ粒子のより高い濃度（０．４～２５０μｇ／ｍＬ）および延長した曝露（１２～７２時間）の効果を、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬を使用して調査した。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（レサズリン（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ））は、代謝が活発な細胞の細胞質において蛍光生成物であるレゾルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）に還元される細胞透過性酸化還元指示薬である。測定された蛍光は、集団内の生細胞の数と相関する。膜の完全性およびＡＴＰ生成アッセイと一致して、ＤＥＡＥＭＡナノ粒子は、７２時間にわたって５０μｇ／ｍＬで細胞死を誘導した（図１５）。２５０μｇ／ｍＬのＤＥＡＥＭＡナノ粒子でも、１００％の細胞毒性が観察された。５０％ＤＥＧＭＡを組み込むと、７２時間までそして７２時間を含める５０μｇ／ｍＬの細胞生存率が完全に回復し、２５０μｇ／ｍＬ（１２時間）で１４．４±５．５％の細胞生存率が回復した。ＤＩＰＭＡナノ粒子は、５０μｇ／ｍＬおよび２５０μｇ／ｍＬでの４８時間の処置の後並びに１０～２５０μｇ／ｍＬでの７２時間のインキュベーションの後に細胞死を誘発した。５０％ＤＥＧＭＡを組み込むと、４８時間処置した細胞におけるＤＩＰＭＡ粒子の生体適合性が改善された。しかしながら、５０μｇ／ｍＬ（２２．５±７．５％）および２５０μｇ／ｍＬ（１９．６±２．０％）の濃度で細胞をインキュベートしたとき、５０％ＤＥＧＭＡのシールド効果は、細胞生存率を部分的にしか改善しなかった。７２時間時に、１０μｇ／ｍＬのナノ粒子とインキュベートしたとき、５％および１０％ＤＥＧＭＡが細胞毒性を防ぎ、２０％および５０％が細胞生存率を部分的に増加させた。より高濃度のナノ粒子との７２時間のインキュベーション後、ＤＥＧＭＡの組み込みは、細胞生存率に対する最小の効果を有した。

【0296】

実施例１４：ＮＫ_１Ｒ陽性初期エンドソームにおけるナノ粒子のクラスリンおよびダイナミン依存性の細胞取り込みおよびｐＨ依存性解体
シアニン５（ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５）をロードしたＤＩＰＭＡナノ粒子の取り込みおよび細胞内輸送を、共焦点顕微鏡で調べた。エンドソームへの輸送を調べるため、ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子を、初期エンドソームを同定するＲａｂ５－ＧＦＰ、または後期エンドソームをマークするＲａｂ７－ＧＦＰを発現するＨＥＫ－２９３細胞とインキュベートした。ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子の取り込みは、１５０秒以内に検出され、３００秒までにＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子が、Ｒａｂ５－ＧＦＰ陽性の初期エンドソームにおいて検出された（図１６Ａ）。３０分および６０分後、ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子は、Ｒａｂ５－ＧＦＰ初期エンドソームおよびＲａｂ７－ＧＦＰ後期エンドソームに広範囲に局在した（図１６Ｂ、図１７Ａ）。ナノ粒子がＮＫ_１Ｒを含むエンドソームに移動するかどうかを決定するために、ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子をｒＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰでトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３細胞とインキュベートした。３０分後、ｒＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰのインターナリゼーションを促進するために、細胞を１０ｎＭ ＳＰでチャレンジした。ＳＰの３０分後および６０分後、ｒＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰおよびＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子は、エンドソームに共局在した（図１６Ｃ、図１７Ｂ）。すなわち、ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子は、インターナライズし、ｒＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰを含む初期エンドソームに輸送される。

【0297】

水性環境では発光するが疎水性コアでは発光しないクマリン１５３をロードしたＤＩＰＭＡナノ粒子（ＤＩＰＭＡ－ＣＯ）の取り込みおよび解体を、ハイコンテントイメージング（共焦点顕微鏡）で調べた。ＤＩＰＭＡ－ＣＯナノ粒子をＨＥＫ－２９３細胞とインキュベートしたとき、５分以内に細胞の蛍光が著しく増加し、３０分間継続した（図１６Ｄ、Ｅ）。クラスリン阻害剤ＰｉｔＳｔｏｐ２およびダイナミン阻害剤Ｄｙｎｇｏ４ａは、細胞の蛍光を阻害した。エンドソームを酸性化する液胞Ｈ^＋ＡＴＰａｓｅを阻害するバフィロマイシンＡ１、およびエンドソームをアルカリ化するＮＨ_４Ｃｌも、蛍光を抑制した（図１６Ｆ）。これらの結果は、ナノ粒子のクラスリンおよびダイナミン依存性エンドサイトーシス、並びに酸性化された初期エンドソームにおけるｐＨ依存性解体と一致する。

【0298】

実施例１５：痛覚に対するナノ粒子カプセル化ＡＰの効果
ＡＰは、急性化学療法誘発性の悪心および嘔吐を抑制するが、ＮＫ_１Ｒアンタゴニストは、うつおよび疼痛を含む慢性障害の回復には効果がなかった。ＮＫ_１Ｒは、ＳＰによる継続的な刺激後にエンドソームに再分布するため、アンタゴニストの失敗は、酸性エンドソームにおいてはＮＫ_１Ｒに接近および結合できないことに起因し得る。ナノ粒子への組み込みが脊髄ニューロンのＮＫ_１Ｒ陽性エンドソームへの送達に起因するＡＰの抗痛覚作用を増幅するという仮説を検証するために、遊離ＡＰ、またはｐＨ応答性（ＤＩＰＭＡ－ＡＰ）および非応答性（ＢＭＡ－ＡＰ）ナノ粒子に組み込まれたＡＰを含むＡＰ製剤を、マウスまたはラットに髄腔内注射によって投与した。（図１８Ａ）。空のナノ粒子またはビヒクルを対照として使用した。急性および慢性の炎症性および神経因性痛覚を調べた。

【0299】

カプサイシン誘発性の機械的アロディニア。
ＡＰ、ナノ粒子またはビヒクル（５μｌ）を、ＴＲＰＶ１を活性化して急性アロディニアおよび神経性炎症を引き起こすカプサイシンの後足への足底内注射の３０分前に、髄腔内注射によってマウスに投与した。カプサイシンの前後に、較正されたフォンフレイフィラメント（ＶＦＦ）での、注射された後足の足底表面の刺激に対する引っ込め反応を測定した。ビヒクルまたはＤＩＰＭＡ－空ナノ粒子を受けたマウスにおいては、カプサイシンは、ＶＦＦ閾値を０．５～４時間から減少させ、これは機械的アロディニアと一致し、２４時間後にベースラインに戻った（図１８Ｂ）。遊離ＡＰ（５μｌ、１００ｎＭ）および遊離ＡＰ（１００ｎＭ）と混合されたＤＩＰＭＡ－空ナノ粒子は、１時間後に中程度の抗アロディニアを引き起こしたが（それぞれ１６±４％および１５±３％阻害）、これは１．５時間後には検出されなかった。ＢＭＡ－ＡＰナノ粒子（１００ｎＭ ＡＰ）は０．５～１時間後に同様の効果を有したが、効果は遊離ＡＰよりも持続し、２時間延長した。同じ用量のＡＰ（５μｌ、１００ｎＭ）を送達したＤＩＰＭＡ－ＡＰナノ粒子は、０．５～１時間で顕著な抗アロディニアを引き起こし（１時間、３４±３％阻害）、それは４時間（３５±２％阻害）持続し、このとき他の処置は有効でなかった。積分応答（０～４時間の曲線下面積、ＡＵＣ）の分析により、ＤＩＰＭＡ－ＡＰナノ粒子がカプサイシン誘発性の機械的アロディニアの最も有効な阻害を提供することが確認された（図１８Ｃ）。

【0300】

完全フロイントアジュバント誘発性の機械的痛覚過敏。
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の足底内注射は、持続的な機械的痛覚過敏を引き起こし、これは、治療的様式で投与されるナノ粒子カプセル化ＡＰの、炎症性疼痛を逆転させる能力の検査を可能にした（図１８Ａ）。足底内ＣＦＡの４８時間後までに、機械的痛覚過敏と一致して、ＶＦＦ閾値の著しい減少があった（図１８Ｄ）。ＣＦＡの４８時間後のビヒクルの髄腔内注射は、機械的痛覚過敏に影響を与えず、これは２４時間持続した。ＡＰ（５μｌ、１００または３００ｎＭ）は、２～３時間の間、用量依存的に痛覚過敏を逆転させた（１．５時間、％阻害：１００ｎＭ、３０±６；３００ｎＭ、４７±３％）。ＢＭＡ－ＡＰナノ粒子（１００ｎＭ ＡＰ）は、遊離ＡＰ（３００ｎＭ）と同程度に有効であった。ＤＩＰＭＡ－ＡＰナノ粒子（１００ｎＭ ＡＰ）は、同じ用量の遊離ＡＰよりも大きなアロディニアの抑制をもたらし（１．５時間、％抑制：５４±４％）、抑制は６時間維持され、このとき他のＡＰ処置は有効でなかった。全身的なモルヒネ（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）は、０．５時間後に機械的痛覚過敏を完全に逆転させたが、効果は３時間後にベースラインに急速に減衰した。積分応答（０～８時間のＡＵＣ、半値幅応答）の分析は、ＤＩＰＭＡ－ＡＰナノ粒子が痛覚過敏の最も持続的な逆転をもたらすことを示した（図１８Ｅ、Ｆ）。

【0301】

神経損傷誘発性の機械的痛覚過敏。
腓腹神経温存（ｓｕｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｓｐａｒｅｄ）（ＳＮＳ）モデルは、ラットに５０日より長く続き得る安定した強力な機械的痛覚過敏をもたらし、これにより、別の種における慢性神経因性疼痛を緩和するナノ粒子カプセル化ＡＰの有効性を調べることが
できた。手術後１０日時に、ＳＮＳは、偽手術ラットと比較したときに、機械的痛覚過敏を示す後足の引っ込めを誘発する圧力を低下させた（ランダルセリット試験）（図１８Ａ、Ｇ）。ビヒクルの髄腔内注射を受けたラットにおいては、機械的痛覚過敏は、７時間維持された（図１８Ｇ）。ＡＰ（１０μｌ、１００ｎＭ）は、引っ込め閾値を変更しなかったが、ＡＰ（３００ｎＭ）は、０．５時間後に、１時間後の最大４０±２％の阻害まで引っ込め閾値を阻害し、２．５時間後にベースラインに戻った。ＡＰ（１μＭ）は、１時間後に痛覚過敏をほぼ完全に逆転させた（７５±４％阻害）が、痛覚過敏は３時間後にベースラインに戻った（図１９）。ＢＭＡ－ＡＰ（１０μｌ、１００、３００ｎＭ ＡＰ）は、遊離ＡＰ（３００ｎＭ）と同程度に痛覚過敏を阻害した。ＤＩＰＭＡ－ＡＰ（１００、３００ｎＭ ＡＰ）は、痛覚過敏を強く逆転させ、１．５時間後にほぼ完全に阻害し（３００ｎＭ、８０±４％阻害）、４．５時間維持し、このとき他の治療法のどれもが有効でなかった。ＤＩＰＭＡ－ＡＰ（５００ｎＭ）は、４．５時間痛覚過敏からの完全な緩和を提供した（図１９）。モルヒネは、２時間痛覚過敏を完全に逆転させたが、その効果はＤＩＰＭＡ－ＡＰと比較して短命であり、２．５時間後にはなかった。積分応答（０～７時間のＡＵＣ、半値幅応答）の分析は、ＤＩＰＭＡ－ＡＰナノ粒子が痛覚過敏の最も持続的な逆転をもたらすことを示した（図１８Ｈ、Ｉ）。

【0302】

すなわち、ｐＨ応答性ＤＩＰＭＡナノ粒子へのカプセル化は、２つの種における急性（カプサイシン）、炎症性（ＣＦＡ）および神経因性（ＳＮＳ）疼痛のモデルにおいて、ＡＰの抗痛覚作用を増強し、応答の大きさおよび持続時間を増加させる。非ｐＨ応答性ナノ粒子にカプセル化されたＡＰは、遊離ＡＰよりも有効ではなかったため、ＤＩＰＭＡ－ＡＰの有効性の増強は、ｐＨ応答性の送達に依存し、ナノ粒子のカプセル化自体には依存しない。

【0303】

実施例１６：一次感覚および脊髄ニューロンの感作および活性化に対するナノ粒子カプセル化ＡＰの効果
脊髄後角の一次感覚ニューロン（Ｃ線維侵害受容器）の中央突起から放出されるＳＰ、ＣＧＲＰおよびグルタメートは、二次脊髄ニューロンの受容体を活性化して痛覚伝達を媒介する。一次感覚ニューロンおよび二次脊髄ニューロンの感作は、慢性的疼痛の特徴である。感作を調べるために、本発明者らは、Ｃ線維反射を活性化するために必要な閾値電流を測定し、ワインドアップ（Ｃ線維の電気刺激によって誘発される脊髄ニューロンの興奮性における周波数依存性の増加）を評価した。同側大腿二頭筋におけるＣ線維媒介反射応答の活性化に必要な閾値電流は、偽の対照と比較してＳＮＳラットで減少した（ＳＮＳ、３．２±２．８ｍＡ；偽、１０．３±１．２ｍＡ、Ｐ＜０．０５）。電気刺激（０．１Ｈｚ）を適用すると、経時的に一定で安定したＣ反射活動並びに誘発されたワインドアップ活動が導かれる（図２０Ａ－Ｆ）。ＳＮＳラットへのＡＰ（１０μｌ、１μＭ髄腔内）の投与は、Ｃ反射を減少させたが、３０分時のみであり、ワインドアップには影響を与えなかった。ＤＩＰＭＡ－ＡＰナノ粒子（３００ｎＭ ＡＰ）は、４５分以内にＣ反射を、１５分以内にワインドアップ活動を減少させ、観察期間（１２０分）の間応答を阻害した。

【0304】

痛覚を抑制するためのＤＩＰＭＡ－ＡＰの髄腔内注射の有効性は、エンドソームからのＮＫ_１Ｒシグナル伝達を必要とする脊髄ニューロンの持続的なＳＰ誘発興奮の拮抗作用に起因し得る。この可能性を調べるために、本発明者らは、ラット脊髄のスライスのラミナＩおよびＩＩのニューロンの細胞付着パッチクランプ記録を作製した。ビヒクルで処置したスライスにおいては、ＳＰ（１μＭ、２分）が活動電位発火の迅速な開始を引き起こし、これは、ウォッシュアウト(ｗａｓｈｏｕｔ)後１６分間持続した（図２０Ｇ～Ｉ）。ＡＰ（１００ｎＭ）またはＢＭＡ－ＡＰ（１００ｎＭ ＡＰ）とのプレインキュベーションは、ＳＰ誘発発火の開始、速度または持続時間に影響を与えなかった。ＤＩＰＭＡ－ＡＰ（１００ｎＭ）は、ＳＰ誘発発火の最初の開始に影響を与えなかったが、ウォッシュアウト後の放電速度および興奮の持続時間を阻害した。これらの結果は、ＡＰが、ｐＨ応答性
ナノ粒子中で送達されるとき、酸性化エンドソームにおいてＮＫ_１Ｒに拮抗し、脊髄ニューロンの持続的な興奮および持続的な汎伝達（ｐａｎ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）を駆動する信号を阻害するという仮説を支持する。

【0305】

実施例１７：エンドソームＮＫ_１Ｒの拮抗作用
遺伝的にコード化されたＦＲＥＴバイオセンサーの使用は、高い時空間忠実度での生存細胞のシグナル伝達経路の評価を可能にする。区画化されたシグナル伝達を評価するためのＦＲＥＴバイオセンサー、並びにクラスリンおよびダイナミン媒介ＮＫ_１Ｒエンドサイトーシスを阻害するための遺伝的および薬理学的アプローチを使用することにより、エンドソーム中のＮＫ_１Ｒが核中の細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）および細胞質ゾル中のプロテインキナーゼＣおよびｃＡＭＰを活性化することを本発明者らは以前に示している。核ＥＲＫは、転写を調節し、脊髄ニューロンのＳＰ誘発興奮を媒介する。従って、本発明者らは、核ＥＲＫのＳＰ誘発活性化に拮抗するナノ粒子カプセル化ＡＰの能力を調べた。

【0306】

核ＥＲＫの活性化を調べるために、核を標的とするＥＲＫバイオセンサーであるＮｕｃＥＫＡＲをＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞で発現させた。ＳＰ（１００ｐＭ～１μＭ）は、核ＥＲＫの迅速（２分）、持続的（＞３５分）および濃度依存性の活性化を刺激した（ＥＣ_５０ ５．９ｎＭ）（図２２Ａ、Ｂ）。５ｎＭ ＳＰ（約ＥＣ_５０）に対する核ＥＲＫ応答に拮抗する遊離ＡＰの能力を調べた。ＡＰは、核ＥＲＫのＳＰ誘発活性化を阻害したが、最高のＡＰ濃度（０．１、１、１０μＭ；ＩＣ_５０ ４５ｎＭ）のみであった（図２２Ｃ、Ｄ）。ＮＫ_１Ｒエンドサイトーシスおよびエンドソームシグナル伝達が核ＥＲＫのＳＰ誘発性活性化に必要であるかを決定するために、本発明者らは、ＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒを野生型（ＷＴ）ダイナミンまたはＮＫ_１Ｒエンドサイトーシスを阻害するドミナントネガティブダイナミンＫ４４Ｅでトランスフェクトした。ＷＴダイナミンを発現する細胞において、ＳＰは、核ＥＲＫの迅速かつ持続的な活性化を刺激した（ＥＣ_５０ １１．１ｎＭ）（図２１Ａ、Ｃ）。ダイナミンＫ４４Ｅは、全ての濃度のＳＰに対する応答を弱め、全ての時点で１０ｎＭ ＳＰに対する応答を阻害し、ＳＰの効力を約２倍低下させ（ＥＣ_５０
１９．８ｎＭ）、有効性を約３０％低下させた（図２１Ｂ、Ｃ）。すなわち、ＮＫ_１Ｒエンドサイトーシスは、核ＥＲＫの持続的なＳＰ誘発活性化に必要である。

【0307】

ロードなしのナノ粒子が核ＥＲＫの活性に影響を与えるかどうかを決定するために、ＨＥＫ２９３細胞をＤＩＰＭＡ－空およびＢＭＡ－空のナノ粒子（１０、２０、３０μｇ／ｍＬ）とともに３０分間インキュベートした。ＤＩＰＭＡ－空およびＢＭＡ－空ナノ粒子は、研究されたいかなる濃度でも核ＥＲＫを活性化しなかった（図２１Ｄ～Ｅ）。細胞の生存率を、活性化合物レザスリンをレソフリンに還元する生細胞の能力を評価するａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを使用して調べた。ＨＥＫ２９３細胞のＤＩＰＭＡ－空およびＢＭＡ－空ナノ粒子（１～１００μｇ／ｍＬ）への２４時間または４８時間の曝露は、細胞生存率に影響を及ぼさなかった（図２１Ｆ）。すなわち、ナノ粒子は、ＥＲＫを活性化しないか、またはＨＥＫ２９３細胞において細胞毒性作用を有さない。

【0308】

エンドソームにおいてＮＫ_１Ｒに拮抗する遊離ＡＰおよびナノ粒子カプセル化ＡＰの能力を比較するために、本発明者らは、ＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞における核ＥＲＫのＳＰ誘発活性化を測定した。細胞を、ビヒクル、遊離ＡＰ（１００ｎＭ）、ＢＭＡ－ＡＰ（１００ｎＭ ＡＰ）、ＤＩＰＭＡ－ＡＰ（１００ｎＭ ＡＰ）と３０分間プレインキュベートし、次いでＳＰ（５ｎＭ）でチャレンジした。ビヒクルで処置した細胞においては、ＳＰは、核ＥＲＫを迅速に活性化し、それは約３０分間活性なままであった（図２１Ｇ、Ｉ）。遊離ＡＰは、部分的に応答を阻害したが、ＢＭＡ－ＡＰおよびＤＩＰＭＡ－ＡＰは、応答を消失させた。エンドソームにおいてＮＫ_１Ｒの持続的な拮抗作用を誘発する遊離ＡＰおよびナノ粒子カプセル化ＡＰの能力を比較するために、細胞を、ビヒクル、ＡＰ、ＢＭ
Ａ－ＡＰまたはＤＩＰＭＡ－ＡＰと３０分間インキュベートし、洗浄し、アンタゴニストを含まない培地中で３０分間回復させ、次いでＳＰでチャレンジした。遊離ＡＰは、そのとき不活性であったが、ＢＭＡ－ＡＰおよびＤＩＰＭＡ－ＡＰは、核ＥＲＫのＳＰ誘発活性化を消失させた（図２１Ｈ、Ｉ）。すなわち、ナノ粒子へのカプセル化は、細胞からのウォッシュアウト後でさえも、ＡＰの作用の持続時間を著しく増強する。

【0309】

実施例１８：ＤＩＰＭＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子の髄腔内投与
酸応答性ＤＩＰＭＡ－ＭＫ－３２０７ナノ粒子の鎮痛能力を、ＣＦＡモデルで評価した。機械的アロディニアは、フォンフレイヘアで評価した。

【0310】

３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、および１μＭのＭＫ－３２０７（濃度あたりｎ＝４）を、髄腔内（マウス）に投与した。足引っ込め閾値（ＰＷＴ／ｇ）を、経時的に測定した。結果を、図２３（Ａ）にグラフで要約した。

【0311】

３０ｎＭ、５０ｎＭ、および１００ｎＭのＭＫ－３２０７（ＤＩＭＰＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子）を有する酸応答性ＤＩＰＭＡナノ粒子組成物を、髄腔内（マウス）に投与した（１００ｎＭ ＭＫ－３２０７の投与と比較して）。足引っ込め閾値（ＰＷＴ／ｇ）を、経時的に測定した。結果を、図２３（Ｂ）にグラフで要約する。

【0312】

実施例１９：二重ロードしたＤＩＭＰＡナノ粒子－ＤＩＰＭＡ－（Ａｐ＋ＭＫ－３２０７）ナノ粒子の調製
アプレピタント（Ａｐ）およびＭＫ－３２０７を二重ロードした酸応答性ＤＩＰＭＡナノ粒子を、Ｐ（ＰＥＧＭＡ－ｃｏ－ＤＭＡＥＭＡ）－ｂ－Ｐ（ＤＩＰＭＡ－ｃｏ－ＤＥＧＭＡ）ジブロックポリマーを用いて本明細書の他所（例えば、実施例２）で記載されている方法と同様の方法を使用して調製した。１：０．５、１：１、１：２、および１：４の比率のロード比のアプレピタントおよびＭＫ－３２０７は、以下の表に示される二重ロードナノ粒子組成をもたらした。ナノ粒子組成物中のロードされたアプレピタントおよびＭＫ－３２０７の濃度を、ＬＣ－ＭＳで評価し、以下の表に要約した（２番目と３番目の列を参照）（図２４も参照）。

【0313】

【0314】

実施例２０：二重ロードＤＩＰＭＡ－（Ａｐ＋ＭＫ－３２０７）ナノ粒子の髄腔内投与
アプレピタントおよびＭＫ－３２０７を二重ロードした酸応答性ＤＩＰＭＡナノ粒子の鎮痛能力を、ＣＦＡモデルで評価した。機械的アロディニアを、フォンフレイヘアで評価した。

【0315】

８２ｎＭのアプレピタント＋１２ｎＭのＭＫ－３２０７、８１ｎＭのアプレピタント＋２５ｎＭのＭＫ－３２０７、および８０ｎＭのアプレピタント＋８１ｎＭのＭＫ－３２０７をロードした酸応答性ＤＩＰＭＡナノ粒子組成物を、髄腔内投与した（マウス）。足引っ込め閾値（ＰＷＴ／ｇ）を、経時的に測定した。これを、１２０ｎＭのアプレピタント＋１２０ｎＭのＭＫ－３２０７の髄腔内投与（マウス）と比較した。結果を、図２５にグラフで要約する。

【0316】

二重ロードＤＩＰＭＡ－（Ａｐ＋ＭＫ－３２０７）ナノ粒子の投与により、遊離ＡｐおよびＭＫ－３２０７の投与と比較して、有効性および作用の持続時間が増強された。

【0317】

実施例２１：ＤＩＰＭＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子およびＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子の髄腔内同時投与
ＣＧＲＰ_８－３７（膜非透過性ＣＬＲアンタゴニスト）のコレスタノールコンジュゲート（すなわち、ＣＧＲＰ_８－３７－Ｃｈｏｌ）の投与は、機械的痛覚過敏を逆転させた（約２０％）が、非コンジュゲートＣＧＲＰ_８－３７は、そうではなかった。スパンタイド（ＮＫ_１阻害剤）コレスタノールコンジュゲート（すなわち、Ｓｐａｎ－Ｃｈｏｌ）およびＣＧＲＰ_８－３７－Ｃｈｏｌの同時投与は、ＣＦＡ誘発機械的痛覚過敏の著しい（約７５％）逆転を引き起こしたが、非コンジュゲートＳｐａｎおよびＣＧＲＰ_８－３７の組合せは、効果がなかった（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１４（４６）：１２３０９－１２３１４。例えば、その中の図７Ｅおよび７Ｆを参照）。

【0318】

ＤＩＰＭＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子のＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子との同時投与の鎮痛能力を、ＣＦＡモデルで評価した。機械的アロディニアを、フォンフレイヘアで評価した。

【0319】

ＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子（Ａｐで３０ｎＭ）＋ＤＩＰＭＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子（ＭＫ－３２０７で３０ｎＭ）、ＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子（Ａｐで６０ｎＭ）＋ＤＩＰＭＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子（ＭＫ－３２０７で６０ｎＭ）、およびＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子（Ａｐで１２０ｎＭ）＋ＤＩＰＭＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子（ＭＫ－３２０７で１２０ｎＭ）を、髄腔内（マウス）に投与した。足引っ込め閾値（ＰＷＴ／ｇ）を、経時的に測定した。これを、１２０ｎＭのアプレピタント＋１２０ｎＭのＭＫ－３２０７の髄腔内投与（マウス）と比較した。結果を、図２６にグラフで要約する。

【0320】

ＤＩＰＭＡ－（ＭＫ－３２０７）ナノ粒子およびＤＩＰＭＡ－Ａｐナノ粒子の同時投与は、ＣＦＡ疼痛モデルにおいて有効であり：ナノ粒子をそれぞれ１２０ｎＭで同時投与するとき、同じ濃度での遊離ＡＰおよびＭＫ－３２０７の投与と比較して、鎮痛効果および持続効果の改善が観察される。

【0321】

材料および方法
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）。ナノ粒子の形態を、ＴＥＭイメージングによって決定した。ＴＥＭイメージングを、Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０透過型電子顕微鏡を使用して、周囲温度で２００ｋＶの加速電圧で実施した。０．１ｗｔ％ラテックス溶液（ＭｉｌｉＱ水で希釈）のアリコート（５μＬ）を、Ｆｏｒｍｖａｒコーティングされた銅グリッド（ＧＳＣｕ１００Ｆ－５０、Ｐｒｏｓｃｉｔｅｃｈ）に堆積し、空気中および室温で一晩乾燥させた。

【0322】

細胞株。ＣＤ８シグナル配列およびＮ末端ＦＬＡＧタグを有するヒトＮＫ_１Ｒ（ｈＮＫ_１Ｒ）ＯＲＦを、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）を使用して、ｐｃＤＮＡ５ ＦＲＴ／ＴＯにＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ制限部位の間でクローン化した。ｈＮＫ_１Ｒを発現する安定な細胞株（ＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ）を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を１：６のＤＮＡ：ＰＥＩ比で使用して、０．５μｇのｈＮＫ_１Ｒベクターおよび４μｇのｐＯＧ４４でＦｌｐｎ ＨＥＫ－２９３細胞を同時トランスフェクトすることによって生成させた。約０．７ｘ１０^６個の細胞を、ペニシリン（５０Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（５０Ｕ／ｍＬ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）中でＴ－２５組織培養フラスコ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ、米国）に播種し、２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ_２）。トランスフェクション前に培地を新鮮なＤＭＥＭ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐに交換し、次いでフラスコを２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ_２）後、培地を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびハイグロマイシンＢ（２００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＦＢＳ／Ｈｙｇｒｏ）に交換した。

【0323】

細胞培養。ＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞を、ＦＢＳおよびハイグロマイシンＢ（５％ＣＯ_２、３７℃）を補充したＤＭＥＭで培養した。細胞を、ｆｏｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ用のポリ－Ｌ－リジンでコーティングされた黒色の９６ウェルＣｕｌｔｕｒＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ、米国）、および細胞内カルシウム測定用の９６ウェル透明プラスチックプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、米国）にプレーティングした。

【0324】

細胞株におけるナノ粒子の輸送。ＨＥＫ－２９３細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ＤＭＥＭ／ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中のポリ－Ｄ－リジンでコーティングされたｉｂｉｄｉチャンバー（ドイツ）にプレーティングした。２４時間後、ＰＥＩを１：６の比率で使用して、３００ｎｇのラット（ｒ）ＮＫ_１Ｒ－ＧＦＰ／チャンバーで細胞をトランスフェクトし、さらに４８時間培養した。エンドソーム区画を同定するために、ＨＥＫ－２９３細胞を、Ｒａｂ５ａ－ＧＦＰ（初期エンドソームに常在）またはＲａｂ７ａ－ＧＦＰ（後期エンドソーム）（ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）でイメージングの１６時間前に感染させた。ナノ粒子の局在を調べるために、細胞を、ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子（２０μｇ／ｍＬ、３０分、３７℃）またはビヒクルを含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ－１５培地でインキュベートした後、ＳＰ（１０ｎＭ）を添加した。細胞を、ＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ４０ｘ（ＮＡ１．３０）およびＨＣＸ
ＰＬ ＡＰＯ ６３ｘ（ＮＡ１．４０）オイル対物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡を使用して、ＳＰ添加後３０分および６０分時に画像化した。Ｆｉｊｉを使用して画像を分析し、シグナル・ノイズ比１０および１００反復でＣＭＬＥアルゴリズムを使用して、Ｈｕｙｇｅｎｓ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌバージョン１８．０４（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖｏｌｕｍｅ Ｉｍａｇｉｎｇ、オランダ）でデコンボリューションを行った。

【0325】

ＦＲＥＴバイオセンサーを使用した区画化されたシグナル伝達の決定。ＨＥＫ－ｈＮＫ_１Ｒ細胞（約２ｘ１０^６）をＤＭＥＭ／ＦＢＳ／Ｈｙｇｒｏ中で９０ｍｍペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）、米国）に播種し、２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ_２）。トランスフェクションの前に、培地を新鮮なＤＭＥＭ／ＦＢＳ／Ｈｙｇｒｏに交換し、ＰＥＩを１：６の比率で使用して、核ＥＲＫ（ｎｕｃＥＫＡＲ）センサーをトランスフェクトした（２．５μｇ ｎｕｃＥＫＡＲ ＤＮＡ／ディッシュ）。２４時間後、細胞を、ポリ－Ｌ－リジンでコーティングされた黒色の９６ウェルＣｕｌｔｕｒＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国）にプレーティングし、さらに２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ_２）。アッセイ当日、細胞を、６～８時間血清飢餓状態にし、次いで１２ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸（ＨＥＰ
ＥＳ）を補充したＨＢＳＳ中で３７℃でＣＯ_２フリーのインキュベーター中で平衡化した。ＦＲＥＴを、光学モジュールＦＩ ４３０ ５３０ ４８０を有するＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ、ドイツ）を使用して評価し、測定を１分ごとに行った。ベースラインを５分間測定した後、ＳＰ、ビヒクル（ＨＢＳＳ）または陽性対照であるホルボール１２，１３－ジブチレート（１μＭ、ＰＤＢｕ）で刺激し、さらに３０分間測定した。ＳＰ濃度応答曲線については、ＳＰの半対数希釈液を添加し（１μＭから１００ｐＭ）、ＳＰ添加後の曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して（３０分の読み取り）最大半数効果濃度（ＥＣ_５０）を決定した。ＡＰ濃度応答曲線については、ＡＰの対数希釈液（１０μＭから１ｐＭ）をベースライン測定の３０分前に添加した後、５ｎＭのＳＰを添加した。記載されているように、ＡＰについて最大半数阻害濃度（ＩＣ_５０）を決定した。核ＥＲＫシグナル伝達に対するナノ粒子の効果を評価するために、ＤＩＰＭＡ－空、ＤＩＰＭＡ－ＡＰまたはＢＭＡ－ＡＰ（３０、２０、１０μｇ／ｍＬ）を、ベースライン測定の３０分前に添加した後、ＳＰ ５ｎＭまたはビヒクルを添加した。データを、陽性対照に対する最大応答によって正規化されたビヒクル補正値として表した。

【0326】

細胞内カルシウム（ｉＣａ^＋２）測定。細胞を、Ｆｕｒａ２－Ａｍエステル色素１μＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、米国）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７（０．０２％）を補充したＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．６ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、０．５％ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ プロベネシド；ｐＨ７．４）中でＣＯ_２フリーのインキュベーター中、３７℃暗所で４５分間インキュベートした。細胞を、ＨＢＳで２回洗浄し、３７℃で１０分間静置した。ｉＣａ^２＋の変化を観察するために、Ｆｕｒａ－２蛍光を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ、米国）を使用して１分ごとに３０分間測定した。ベースラインを５分間測定した後、ＳＰ（５ｎＭ）、ビヒクル（ＨＢＳ）、陽性対照のイオノマイシン（１μＭ）またはナノ粒子（１０μｇ、ＤＩＰＭＡ－空、ＤＩＰＭＡ－ＡｐおよびＢＭＡ－Ａｐ）を添加し、さらに２５分間測定した。

【0327】

ＨＥＫ－２９３細胞におけるナノ粒子の取り込みおよび解体。クマリン１５３は、極性溶媒中でのみ蛍光を発するソルバトクロミック色素であり、インタクトな細胞におけるクマリン蛍光の出現として観察される、ナノ粒子のコアにロードされたクマリンの放出の検出を可能にする。ナノ粒子を、ＤＩＰＭＡポリマー１ｍｇあたり０．５ｍｇのクマリン１５３を使用して自己集合させた（ＤＩＰＭＡ－ＣＯ）。ＨＥＫ－２９３細胞を、ビヒクル（ハンクス平衡塩類溶液、ＨＢＳＳ）、ダイナミン阻害剤（Ｄｙｎｇｏ４ａ、Ｄｙ４、３０μＭ）、クラスリン阻害剤（Ｐｉｔｓｔｏｐ、ＰＳ２、３０μＭ）、液胞Ｈ^＋ＡＴＰａｓｅ阻害剤（バフィロマイシンＡ１、ＢＦＡ、１μＭ）またはエンドソームをアルカリ化するためのＮＨ_４Ｃｌ（２０ｍＭ）とともに３０分間プレインキュベートした。画像を、ＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ６３ｘ（ＮＡ２．０）オイル対物レンズを使用して、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡で取得した。画像を、１０秒ごとに３０分間撮影し、最初の５つの読み取りは、ＤＩＰＭＡ－ＣＯナノ粒子（２０μｇ／ｍＬ）を添加する前のベースライン画像に対応した。全ての画像を、Ｆｉｊｉを使用して分析した。

【0328】

動物。成体雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～１０週）を、Ｍｏｎａｓｈ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｌａｔｆｏｒｍから購入し、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（２２５～２５０ｇ）を、チリ大学医学部の施設から入手した。全ての動物を、４匹の群で収容し、１２時間の明暗サイクルで温度（２２±４℃）および湿度が制御された環境で維持した。餌および水は、自由利用可能であった。動物に対するす全ての行動試験を、処置群に対して目隠しされた実験者によって盲検法で実施した。実験を、光サイクル中に実施し、各ケージの動物を、異なる処置群にランダムに割り当てた。動物を、麻酔薬の過剰摂取および開胸術によって安楽死させた。研究を、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験
動物のケアと使用に関するガイドに従って行い、ＩＡＳＰの倫理ガイドラインを遵守した。収容条件および実験手順は、Ｍｏｎａｓｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの動物倫理委員会、Ｍｏｎａｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、およびｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｎｔｉａｇｏ ｏｆ Ｃｈｉｌｅの生命倫理委員会によって承認された。

【0329】

薬物投与。マウス。以下の薬物を、意識のあるマウスの椎間腔（Ｌ４、Ｌ５）に髄腔内（ｉ．ｔ．）注射（５μＬ）によって投与した：ＡＰ（１００、３００ｎＭ）、ＡＰの等用量を送達するナノ粒子（ＤＩＰＭＡ－ＡＰ、ＢＭＡ－ＡＰ、１０μｇ／ｍＬ－１００ｎＭ、３０μｇ／ｍＬ－３００ｎＭ）、対照（１０μｇ／ｍＬのＤＩＰＭＡ－空並びに１０μｇ／ｍＬのＤＩＰＭＡ－空およびＡＰ １００ｎＭの混合物）またはビヒクル（人工脳脊髄液、ａＣＳＦ）。処置を、ロータロッド実験および急性疼痛の誘発の３０分前または炎症性疼痛の確立の４８時間後に行った。生体内分布の研究については、ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ナノ粒子（１０μｇ／ｍＬ）を、対照画像を取得した直後にｉ．ｔ投与した。ラット。薬物を、意識のあるラットの椎間腔（Ｌ４、Ｌ５）にｉ．ｔ．注射（１０μＬ）によって投与した：ＡＰ（１００、３００ｎＭ、１μＭ）、ＡＰをロードしたナノ粒子（ＤＩＰＭＡ－ＡＰ、ＢＭＡ－ＡＰ、１０μｇ／ｍＬ－１００ｎＭ、３０μｇ／ｍＬ－３００ｎＭ、５０μｇ／ｍＬ－５００ｎＭ）、ＤＩＰＭＡ－空ナノ粒子（１０、３０、５０μｇ／ｍＬ）、またはビヒクル（ａＣＳＦ）。処置を、腓腹神経切断の１０日後に行った。電気生理学的研究については、薬物を、麻酔下（イソフルラン１．２～１．５％）でのｉ．ｔ．注射によって投与した：ＡＰ（１μＭ）またはナノ粒子（ＤＩＰＭＡ－ＡＰ、ＢＭＡ－ＡＰ、３０μｇ／ｍＬ－３００ｎＭ）。

【0330】

ロータロッド試験。実験の前に、マウスを気候順応させ、２日間連続で３回連続実行するロータロッド装置でトレーニングして、運動能力を評価した。実験当日、３つのベースライン読み取り値を記録し、１２０秒のカットオフ閾値を事前設定した。ＤＩＰＭＡ－Ａｐ、ＢＭＡ－Ａｐ、ＤＩＰＭＡ－空またはビヒクル（ａＣＳＦ）を、髄腔内に注射した（５μＬ）。引き続いて、マウスの落下までの潜時（秒）を、注射後３０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分および２４０分時に記録した。

【0331】

ＮＰの生体内分布。マウスを、鎮静させ（２％イソフルラン）、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、米国）に配置した。画像を、ＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５ ＮＰ（１０μｇ／ｍＬ）のｉ．ｔ投与前に取得した。後の画像を、マウスの２つの群から収集し、第１の群をＤＩＰＭＡ－Ｃｙ５投与後２および６時間時に、第２の群を４および８時間時に画像化した。

【0332】

マウスにおける急性および炎症性疼痛の誘導および評価
急性疼痛。カプサイシン（ＣＡＰ、５μｇ）またはビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を、薬物のｉ．ｔ．注射３０分後に鎮静させたマウス（２％イソフルラン）の左後足に皮下足底内（ｉ．ｐｌ．）注射（１０μＬ）によって投与した。
炎症性疼痛。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、０．５ｍｇ／ｍＬ）またはビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を、鎮静させたマウス（２％イソフルラン）の左後足にｉ．ｐｌ．注射（１０μＬ）によって投与した。薬物を、ＣＦＡの４８時間後にｉ．ｔ．注射によって投与した。

【0333】

機械的アロディニアおよび痛覚過敏。機械的痛覚を、較正されたフォンフレイフィラメント（ＶＦＦ）での同側および対側の後足の足底表面の刺激に対する引っ込め閾値を測定することによって評価した。実験の前に、マウスを、実験装置および環境に２日間連続して２時間気候順応させた。ＶＦＦ引っ込め閾値を３連で測定して、各マウスのベースラインを確立した。ＣＡＰモデルについては、ＶＦＦ引っ込め閾値を、ｉ．ｔ．薬物投与後の最
初の２時間は３０分間隔で、次いで次の２時間は６０分間隔で、および最後に２４時間後に測定した。ＣＦＡモデルについては、ＶＦＦ引っ込め閾値を、ｉ．ｔ．薬物投与後の最初の３時間は３０分ごとに、次いで次の５時間は６０分間隔で、および最後に２４時間後に測定した。結果を、各マウスのベースラインの引っ込め閾値に対して正規化した。結果を、ベースラインのパーセンテージとして、曲線下面積（ＡＵＣ）として、および半値幅応答（最大鎮痛応答の５０％を達成する時間として計算された各処置の効果の持続時間）として表す。

【0334】

ラットにおける神経因性疼痛の誘導および評価
神経因性疼痛。神経因性疼痛を、迅速な発症並びに持続的な機械的および温度痛覚過敏を誘発する、ラットの腓腹神経温存（ＳＮＳ）損傷モデルの変形を使用してラットにおいて誘発した。麻酔下（２％イソフルラン）で、坐骨神経（脛骨、総腓骨、腓腹神経）の３つの末端遠位枝を同定し、腓腹神経を切断した。対照（偽）については、ラットに同様の手術を行ったが、腓腹神経の切断は行わなかった。手術後、ケトプロフェン（３ｍｇ／ｋｇ）およびエンロフロキサシン（５ｍｇ／ｋｇ）を２日間皮下（ｓ．ｃ．）投与した。
機械的痛覚過敏。機械的痛覚過敏を、損傷を防ぐための５７０ｇのカットオフ値で痛覚計（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、イタリア）を使用して後足引っ込め圧力閾値を測定することによってラットで評価した。機械的痛覚過敏を、手術の前（基底）並びに５、９および１０日後に評価した。１０日目の評価の後、薬物をｉ．ｔ．注射によって投与し、引っ込め閾値を、３０分ごとに７時間記録した。結果を、足引っ込め圧力閾値（ｇ．ｃｍ^２）、ＡＵＣおよび半値幅応答として表す。

【0335】

ラットにおけるＣ線維誘発性痛覚反射およびワインドアップ活動の電気生理学的評価。
痛覚シナプス伝達を、腓腹神経のＣ線維の電気的活性化によって誘発される後肢屈曲痛覚反射（Ｃ反射）に関連する筋電（ＥＭＧ）活動の測定によって評価した。ラットを、麻酔下で維持し（隔膜げっ歯類フェイスマスクを使用した酸素中の１．２－１．５％イソフルラン）、調節された熱パッド（３７±０．５℃）上に置いた。ＥＭＧ活動を、第３および第４趾の外側部分に皮下挿入された一対の白金刺激電極、および同側の大腿二頭筋に皮膚を通して挿入された記録電極を使用して測定した。Ｃ反射は、刺激後１５０～４５０ｍｓの時間枠への反射応答の積分に対応する。ワインドアップは、刺激周波数が１Ｈｚに増加したときのＣ反射応答の増強である。ワインドアップは、１Ｈｚの刺激で記録された最初の７つの連続するウィンドウの積分応答に適合させた回帰直線の傾きに対応する。安定したＣ反射応答（約３０分）を取得するために記録した後、Ｃ反射の閾値を見積もり、実験期間中、ラットを閾値強度の２倍で刺激したままにした。Ｃ反射を、０．１Ｈｚでの１５回の連続刺激の平均値によって評価し、１Ｈｚでの次の７回の刺激は、ワインドアップを評価するために使用した。記録を、手術１０日後、ｉ．ｔ．薬物投与の前（基底）並びに３０、６０、９０および１２０分後に行った。積分されたＣ反射応答を、基底応答のパーセンテージとして表した。

【0336】

ラット脊髄ニューロンの細胞付着パッチクランプ記録。傍矢状のスライス（３００～４００μｍ）を、記載されているようにラットの腰髄から調製した。スライスを記録チャンバーに移し、ａＣＳＦ（２ｍｌ．ｍｉｎ^－１、３６℃）を用いて表面灌流した。Ｄｏｄｔコントラスト光学を使用して、位置、サイズおよびラミナＩに限定された樹状突起を有する紡錘状の形状に基づいて、ラミナＩの大きな（静電容量≧２０ｐＦ）推定のＮＫ_１Ｒ陽性ニューロンを同定した。パッチ電極を使用して、細胞付着配置のＮＫ_１Ｒ陽性のラミナＩニューロンから、自発電流を記録した。スライスを、ＤＩＰＭＡ－ＡＰ（１０μｇ／ｍｌ－１００ｎＭ ＡＰ）、ＢＭＡ－ＡＰ（１０μｇ／ｍｌ－１００ｎＭ ＡＰ）またはＡＰ（１００ｎＭ）中で１２０分間プレインキュベートし、洗浄し、記録する前にアンタゴニストを含まないａＣＳＦ中でさらに３０～６０分インキュベートした。スライスを、ＳＰでチャレンジし（１μＭ、２分）、各細胞についての発火率を２～４分の時点間の応答に
対して正規化し、これは群間で有意差はなかった。発火時間を、最後の活動電位に対する応答の持続時間として決定した。

【0337】

細胞生存率アッセイ。ＨＥＫ－ｈ ＮＫ_１Ｒ細胞を、ＤＩＰＭＡ－空およびＢＭＡ－空ナノ粒子と１から１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で２４時間および４８時間インキュベートした。培地をフェノールレッドを含まないＤＭＥＭに置き換えた後、１０％（ｖ／ｖ）ａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を添加した。細胞をａｌａｍａｒＢｌｕｅと２時間インキュベートし（３７℃、５％ＣＯ_２）、還元された活性化合物であるレソフリンの蛍光を、ＣｌａｒｉｏＳｔａｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を使用して測定した（５１０／６１０ｎｍ ｅｘｃ／ｅｍ）。

【0338】

ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を、Ｐｒｏｍｅｇａによって供給された説明書に従って調製した。処置後、プレートを室温で３０分間インキュベートした。最初に５０μＬの細胞培地を各ウェルから取り除き、廃棄した。各ウェルの残りの内容物を、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬で処置した。細胞を、室温で最低１０分間インキュベートし、生物発光をＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、λ＝５５５±４０ｎｍで測定した。次いで、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００対照を差し引いて、ビヒクル対照のパーセンテージとして値を表すことにより、細胞生存率を計算した。データを、５つの個別の実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示す。

【0339】

ヨウ化プロピジウム細胞毒性アッセイを、５００ｎＭの最終ウェル濃度を使用して実施した。細胞を、色素と室温で３０分間インキュベートした。ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒを使用して蛍光を検出した（ｅｘ：λ＝５３５±１０ｎｍおよびｅｍ：λ＝６１７±１０ｎｍ）。細胞毒性値を、ビヒクルベースライン減算によって計算し、細胞死についてのＴｒｉｔｏｎＸ－１００対照のパーセンテージとして表した。データを、５つの個別の実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示す。

【0340】

ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ細胞生存率アッセイにおいて、細胞培地を除去し、１００μＬの新鮮な培地で置き換えた。細胞を、ある範囲の粒子濃度（０．４～２５０μｇ／ｍＬ）で１２、２４、４８および７２時間、３７℃、５％ＣＯ_２で処置した。細胞を冷却したＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で２回洗浄し、次いで培地中の１０％（ｖ／ｖ）ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。細胞をさらに４時間インキュベートし、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒを使用して蛍光を測定した（ｅｘ：λ＝５７０±１０ｎｍ、ｅｍ：λ＝６０５±１５ｎｍ）。次いで、細胞生存率を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００対照を差し引いて、ビヒクル対照のパーセンテージとして値を表すことによって計算した。データを、３つの個別の実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして示す。

【0341】

統計分析。特に断らない限り、データを、平均値±ＳＥＭとして示す。２つの比較について、スチューデントのｔ検定を使用して差異を評価した。複数の比較については、１または２元配置分散分析の後、ダネットの多重比較検定（機械的痛覚過敏および浮腫）およびテューキーの多重比較検定（ＦＲＥＴおよびｉＣａ^２＋）を使用して差異を評価した。Ｐ＜０．０５を、有意であるとみなした。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14-1】

【図14-2】

【図15-1】

【図15-2】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18-1】

【図18-2】

【図18-3】

【図18-4】

【図18-5】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【図20-3】

【図20-4】

【図20-5】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図21-4】

【図22-1】

【図22-2】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【手続補正書】

【提出日】2024-08-02

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

明細書及び／又は図面に記載された発明。

【外国語明細書】