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特開2024-161435ＭＨＣおよび腫瘍抗原を同時発現する抗原提示細胞を含む組成物およびこれを用いた癌治療
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024161435
(43)【公開日】2024-11-19
(54)【発明の名称】ＭＨＣおよび腫瘍抗原を同時発現する抗原提示細胞を含む組成物およびこれを用いた癌治療
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20241112BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241112BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241112BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20241112BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241112BHJP
C12N 5/0784 20100101ALI20241112BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241112BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 H
A61P35/00 ZNA
A61P37/04
A61K35/15
C12N5/10
C12N5/0784
C12N15/12
A61P35/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024133155
(22)【出願日】2024-08-08
(62)【分割の表示】P 2022542022の分割
【原出願日】2021-01-08
(31)【優先権主張番号】10-2020-0003910
(32)【優先日】2020-01-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0133005
(32)【優先日】2020-10-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】500239823
【氏名又は名称】エルジー・ケム・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100122161
【弁理士】
【氏名又は名称】渡部 崇
(72)【発明者】
【氏名】ジュン・ホ・シェン
(72)【発明者】
【氏名】ジュン・チョル・クォン
(72)【発明者】
【氏名】スンヘ・キム
(57)【要約】
【課題】ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）および腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現された抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を含む癌予防または治療用ワクチン組成物およびこれを用いた癌治療に関するものである。
【解決手段】本発明は、患者腫瘍由来細胞特異的ＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原を同時に最大量で発現するバイシストロニック遺伝子コンストラクトまたはｍＲＮＡ転写体を使用して、標準化された特定抗原提示細胞でも、“特異的ＭＨＣ対立遺伝子および基準細胞発現量による抗原提示能の制約要素”を解決しようとするアイデアに基づいたものである。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、患者腫瘍由来細胞特異的ＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原を同時に最大量で発現するバイシストロニック遺伝子コンストラクトまたはｍＲＮＡ転写体を使用して、標準化された特定抗原提示細胞でも、“特異的ＭＨＣ対立遺伝子および基準細胞発現量による抗原提示能の制約要素”を解決しようとするアイデアに基づいたものである。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）および腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現された抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を含む、
癌予防または治療用ワクチン組成物。
癌予防または治療用ワクチン組成物。
【請求項2】
前記抗原提示細胞が樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記抗原提示細胞は、
ＭＨＣ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）および腫瘍抗原遺伝子を同時に発現する遺伝子コンストラクト；
前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター；または
前記遺伝子コンストラクトから転写された、ＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原遺伝子を同時に発現するＲＮＡ転写体；または
前記遺伝子コンストラクト、発現ベクターまたはＲＮＡ転写体から生成されたポリペプチドを含むことによって
ＭＨＣおよび腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現されたものである、請求項１に記載の組成物。
ＭＨＣ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）および腫瘍抗原遺伝子を同時に発現する遺伝子コンストラクト；
前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター；または
前記遺伝子コンストラクトから転写された、ＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原遺伝子を同時に発現するＲＮＡ転写体；または
前記遺伝子コンストラクト、発現ベクターまたはＲＮＡ転写体から生成されたポリペプチドを含むことによって
ＭＨＣおよび腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現されたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
ＭＨＣは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩである、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記遺伝子コンストラクトがＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列および腫瘍抗原をコーディングする核酸配列を含むものである、請求項３に記載の組成物。
【請求項6】
ＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列がそのＮ－末端にベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコーディングする配列と融合されたものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
ＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原が治療対象癌患者の腫瘍細胞に由来したものである、請求項３に記載の組成物。
【請求項8】
腫瘍抗原が腫瘍関連抗原（Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原（Ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＳＡ）または腫瘍由来新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
腫瘍由来新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）が癌細胞に特異的に発現される突然変異を含むものである、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＡＧＥ（黒色腫抗原Ｅ）、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－Ａ３、チロシナーゼ、ＴＲＰ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＰＳＡ、ｐ５３、ママグロビンＡ（Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ－Ａ）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、Ｍｕｃ１（ムチン１）／ＤＦ３、メタロパンスチムリン－１（ｍｅｔａｌｌｏｐａｎｓｔｉｍｕｌｉｎ－１、ＭＰＳ－１）、シトクロムＰ４５０イソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）１Ｂ１、９０Ｋ／Ｍａｃ－２結合タンパク質、Ｅｐ－ＣＡＭ（ＭＫ－１）、ＨＳＰ－７０、ｈＴＥＲＴ（ＴＲＴ）、ＬＥＡ、ＬＡＧＥ－１／ＣＡＭＥＬ、ＴＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ、５Ｔ４、ｇｐ７０、ＳＣＰ－１、ｃ－ｍｙｃ、サイクリンＢ１、ＭＤＭ２、ｐ６２、Ｋｏｃ、ＩＭＰ１、ＲＣＡＳ１、ＴＡ９０、ＯＡ１、ＣＴ－７、ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０／ＳＳＸ－２、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１４／ＳＣＰ－１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＨＤＡＣ５、ＭＢＤ２、ＴＲＩＰ４、ＮＹ－ＣＯ－４５、ＫＮＳＬ６、ＨＩＰ１Ｒ、Ｓｅｂ４Ｄ、ＫＩＡＡ１４１６、ＩＭＰ１、９０Ｋ／Ｍａｃ－２結合タンパク質、ＭＤＭ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、またはＬＭＮＡである、請求項８に記載の組成物。
【請求項11】
前記遺伝子コンストラクトが、
（ａ）５’から３’方向に、プロモーター、５’－ＵＴＲ、ＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）の核酸配列、腫瘍抗原をコーディングする核酸配列、および３’－ＵＴＲを含むか、
（ｂ）５’から３’方向に、プロモーター、５’－ＵＴＲ、腫瘍抗原をコーディングする核酸配列、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）の核酸配列、ＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列、および３’－ＵＴＲを含む、請求項３に記載の組成物。
（ａ）５’から３’方向に、プロモーター、５’－ＵＴＲ、ＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）の核酸配列、腫瘍抗原をコーディングする核酸配列、および３’－ＵＴＲを含むか、
（ｂ）５’から３’方向に、プロモーター、５’－ＵＴＲ、腫瘍抗原をコーディングする核酸配列、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）の核酸配列、ＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列、および３’－ＵＴＲを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項12】
ＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列がそのＮ－末端にベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコーディングする配列と融合されたものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記ＲＮＡ転写体がｍＲＮＡ転写体である、請求項３に記載の組成物。
【請求項14】
前記発現ベクターがバイシストロニック発現ベクターである、請求項３に記載の組成物。
【請求項15】
前記遺伝子コンストラクト、発現ベクター、ＲＮＡ転写体、またはポリペプチドが電気穿孔法で抗原提示細胞に導入されたものである、請求項３に記載の組成物。
【請求項16】
前記抗原提示細胞が癌患者の自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）または同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）由来である、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互引用
本出願は２０２０年１月１０日付大韓民国特許出願第１０－２０２０－０００３９１０号および２０２０年１０月１４日付大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１３３００５号に基づいた優先権の利益を主張し、前記出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の参照として含まれる。
本出願は２０２０年１月１０日付大韓民国特許出願第１０－２０２０－０００３９１０号および２０２０年１０月１４日付大韓民国特許出願第１０－２０２０－０１３３００５号に基づいた優先権の利益を主張し、前記出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の参照として含まれる。
【0002】
ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）および腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現された抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を含む癌予防または治療用ワクチン組成物およびこれを用いた癌治療に関するものである。
【背景技術】
【0003】
抗癌目的の細胞基盤治療ワクチン（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ）は、腫瘍抗原を特化された抗原提示細胞、例えば、樹状免疫細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）に抗原を負荷（ａｎｔｉｇｅｎ ｌｏａｄｉｎｇ）して癌患者に投与することによって抗癌ワクチン役割の遂行を期待する。
【0004】
しかし、抗原負荷に普遍的に使用するエピトープペプチドインキュベーション（ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）方法は、機序的に抗原提示細胞の特定ＭＨＣ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）と抗原エピトープの相補的制限原理（ｅｐｉｔｏｐｅ－ＭＨＣ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）により、抗原提示細胞に既に発現されている特定ＭＨＣ対立遺伝子およびその発現量（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）によって抗原提示可能なエピトープ配列の範囲および全体的抗原提示効能が制限されざるをえない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
腫瘍抗原、特に、互いに異なる細胞特異的ＭＨＣを有する個別癌患者に由来した多様な患者オーダーメード型新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）を治療目的で標準化された抗癌細胞ワクチンに用いるためには、窮極的に個別抗原提示細胞のＭＨＣ制限性を克服する新たな細胞ワクチン製作技術の開発が要求されるので、これを解決しようとする。
【0006】
一例は、ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）および腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現された抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を含む、癌予防または治療用ワクチン組成物を提供する。
【0007】
他の例は、ＭＨＣおよび腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現された抗原提示細胞を患者に投与する段階を含む、癌治療方法を提供する。
【0008】
他の例は、癌治療に使用するためのＭＨＣおよび腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰に発現された抗原提示細胞を提供する。
【0009】
他の例は、癌治療用薬剤の製造に使用するためのＭＨＣおよび腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰に発現された抗原提示細胞の用途を提供する。
【0010】
他の例は、ＭＨＣ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）および腫瘍抗原遺伝子を同時に発現する遺伝子コンストラクト；前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター；前記遺伝子コンストラクトから転写されたＲＮＡ転写体；または前記遺伝子コンストラクト、発現ベクターまたはＲＮＡ転写体から生成されたポリペプチドを抗原提示細胞に導入する段階を含む、癌予防または治療用ワクチン組成物の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、患者腫瘍由来細胞特異的ＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原を同時に最大量で発現するバイシストロニック遺伝子コンストラクトまたはｍＲＮＡ転写体を使用して、標準化された特定抗原提示細胞でも、“特異的ＭＨＣ対立遺伝子および基準細胞発現量による抗原提示能の制約要素”を解決しようとするアイデアに基づいたものである。
【0012】
特に、本発明では患者腫瘍分析で得られた腫瘍由来新抗原配列（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および各患者の腫瘍由来ＭＨＣ対立遺伝子を同時に抗原提示細胞で過量に発現させて、最大量の“ｅｐｉｔｏｐｅ－ＭＨＣ免疫刺激複合体”を細胞表面に発現して抗原提示細胞の腫瘍抗原提示効能を極大化し、これを患者に投与することによって、窮極的に患者オーダーメード型抗癌Ｔ細胞の増殖および活性化を最大限に触発し、新抗原特異的抗癌免疫効果を増大し極大化させようとする。
【0013】
本発明の一側面により、ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）および腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現された抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を含む、癌予防または治療用ワクチン組成物が提供される。
【0014】
また、ＭＨＣおよび腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現された抗原提示細胞を患者に投与する段階を含む、癌治療方法が提供される。
【0015】
また、癌治療に使用するためのＭＨＣおよび腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現された抗原提示細胞が提供される。
【0016】
また、癌治療用薬剤の製造に使用するためのＭＨＣおよび腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現された抗原提示細胞の用途が提供される。
【0017】
一実施形態として、前記抗原提示細胞が樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）であってもよい。
【0018】
一実施形態として、前記抗原提示細胞は、ＭＨＣ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）および腫瘍抗原遺伝子を同時に発現する遺伝子コンストラクト；前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター；または前記遺伝子コンストラクトから転写された、ＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原遺伝子を同時に発現するＲＮＡ転写体；または前記遺伝子コンストラクト、発現ベクターまたはＲＮＡ転写体から生成されたポリペプチドを含むことによって、ＭＨＣおよび腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現されたものであってもよい。
【0019】
一実施形態として、ＭＨＣは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩであってもよい。
【0020】
一実施形態として、前記遺伝子コンストラクトは、ＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列および腫瘍抗原をコーディングする核酸配列を含むことができる。
【0021】
一実施形態として、ＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列は、そのＮ－末端にベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコーディングする配列と融合されたものであってもよい。
【0022】
一実施形態として、ＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原は、治療対象癌患者の腫瘍細胞に由来したものであってもよい。
【0023】
一実施形態として、腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＡＡ）、腫瘍特異的抗原（Ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＳＡ）または腫瘍由来新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）を含むことができる。
【0024】
一実施形態として、腫瘍由来新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）は、癌細胞に特異的に発現される突然変異を含むことができる。
【0025】
一実施形態として、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＡＧＥ（黒色腫抗原Ｅ）、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－Ａ３、チロシナーゼ、ＴＲＰ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＰＳＡ、ｐ５３、ママグロビンＡ（Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ－Ａ）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、Ｍｕｃ１（ムチン１）／ＤＦ３、メタロパンスチムリン－１（ｍｅｔａｌｌｏｐａｎｓｔｉｍｕｌｉｎ－１、ＭＰＳ－１）、シトクロムＰ４５０イソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）１Ｂ１、９０Ｋ／Ｍａｃ－２結合タンパク質、Ｅｐ－ＣＡＭ（ＭＫ－１）、ＨＳＰ－７０、ｈＴＥＲＴ（ＴＲＴ）、ＬＥＡ、ＬＡＧＥ－１／ＣＡＭＥＬ、ＴＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ、５Ｔ４、ｇｐ７０、ＳＣＰ－１、ｃ－ｍｙｃ、サイクリンＢ１、ＭＤＭ２、ｐ６２、Ｋｏｃ、ＩＭＰ１、ＲＣＡＳ１、ＴＡ９０、ＯＡ１、ＣＴ－７、ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０／ＳＳＸ－２、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１４／ＳＣＰ－１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＨＤＡＣ５、ＭＢＤ２、ＴＲＩＰ４、ＮＹ－ＣＯ－４５、ＫＮＳＬ６、ＨＩＰ１Ｒ、Ｓｅｂ４Ｄ、ＫＩＡＡ１４１６、ＩＭＰ１、９０Ｋ／Ｍａｃ－２結合タンパク質、ＭＤＭ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、またはＬＭＮＡであってもよい。
【0026】
一実施形態として、前記遺伝子コンストラクトは、（ａ）５’から３’方向に、プロモーター、５’－ＵＴＲ、ＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）の核酸配列、腫瘍抗原をコーディングする核酸配列、および３’－ＵＴＲを含むか、（ｂ）５’から３’方向に、プロモーター、５’－ＵＴＲ、腫瘍抗原をコーディングする核酸配列、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）の核酸配列、ＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列、および３’－ＵＴＲを含むことができる。好ましい実施形態として、ＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列は、そのＮ－末端にベータ－２－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコーディングする配列と融合したものであってもよい。
【0027】
一実施形態として、前記ＲＮＡ転写体は、ｍＲＮＡ転写体であってもよい。
【0028】
一実施形態として、前記発現ベクターは、バイシストロニック発現ベクターであってもよい。
【0029】
一実施形態として、前記遺伝子コンストラクト、発現ベクター、ＲＮＡ転写体、またはポリペプチドが電気穿孔法で抗原提示細胞に導入されたものであってもよい。
【0030】
一実施形態として、前記抗原提示細胞は、癌患者の自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）または同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）由来であってもよい。
【0031】
一実施形態として、前記ワクチンは、個人オーダーメード型抗癌ワクチンであってもよい。
【0032】
本発明の他側面により、ＭＨＣ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）および腫瘍抗原遺伝子を同時に発現する遺伝子コンストラクト；前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター；前記遺伝子コンストラクトから転写されたＲＮＡ転写体；または前記遺伝子コンストラクト、発現ベクターまたはＲＮＡ転写体から生成されたポリペプチドを抗原提示細胞に導入する段階を含む、癌予防または治療用ワクチン組成物の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】本願の一実施形態による、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（ＯＲＦ１）および腫瘍抗原（ＯＲＦ２）を同時に発現する遺伝子コンストラクトおよびこれからインビトロ転写されたｍＲＮＡ転写体の構造を示す。
【図2a】本願の一実施形態による、基準鋳型（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ）“ＬＧＶ１００７”の全体配列構造を示す。
【図3】本願の一実施形態によって基準鋳型“ＬＧＶ１００７”に対するインビトロ転写を行ってｍＲＮＡ転写体が生産されたことを電気泳動法で確認した結果を示す。
【図4a】本願の一実施形態によるＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体をＫ５６２細胞に電気穿孔した後、発現量が最大値に到達する条件を導出するために、ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体を１×１０６細胞当り０、３、５、または１０μｇの量でＫ５６２細胞に電気穿孔した後、９日間ＨＬＡ－Ａ＊０２０１分子の発現量を確認した結果を示す。
【図5】本願の一実施形態によってＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体のインビトロ翻訳を行って腫瘍抗原がタンパク質として発現されたことをウェスタンブロットで確認した結果を示す。
【図6】（ａ）は本願の一実施形態によってＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体をＫ５６２細胞に電気穿孔した後、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（ＯＲＦ１）がタンパク質として発現されたことをウェスタンブロットで確認した結果であり、（ｂ）は腫瘍抗原（ＯＲＦ２）が全てタンパク質として発現されたことをウェスタンブロットで確認した結果を示す。
【図7】ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体をＫ５６２細胞に電気穿孔して２４時間以後にＫ５６２細胞表面での発現量をフローサイトメトリー法を用いて確認した結果を示す。
【図8】ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体が電気穿孔されたＫ５６２抗原提示細胞によるＰＢＭＣ Ｔ細胞の免疫活性を測定したＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγ分泌分析結果を示す。
【図9】ＬＧＶ１０３２ ｍＲＮＡ転写体の構造説明と個人オーダーメード型単核球由来自家樹状細胞（ＭｏＤＣ、ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）での細胞発現結果を示す。ＬＧＶ１０３２は、ＬＧＶ１００７と同種のｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ転写体構造（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を有しＯＲＦ２（腫瘍抗原パート）は維持し、ＯＲＦ１に細胞発現マーカーとしてＧＦＰ ｒｅｐｏｒｔｅｒタンパク質が位置した構造である。ＬＧＶ１０３２は、ＬＧＶ１００７のように、個人由来自家樹状細胞でも電気穿孔方法によって細胞内に流入後、効果的に細胞発現されることを確認した。
【図10】個人由来自家樹状細胞に電気穿孔されたＬＧＶ１０３２が、効果的な抗原提示を通じて抗原特異的Ｔ細胞免疫活性を触発するというＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγ分泌検証結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【0035】
本願の一例は、ＭＨＣおよび腫瘍抗原を同時に発現する核酸分子に関するものである。
【0036】
または、ＭＨＣおよび腫瘍抗原を同時に発現する核酸組成物に関するものである。
【0037】
または、ＭＨＣおよび腫瘍抗原を同時に発現する、遺伝子コンストラクトに関するものである。
【0038】
または、ＭＨＣおよび腫瘍抗原を同時に発現する遺伝子コンストラクトからのＲＮＡ転写体に関するものである。
【0039】
または、ＭＨＣおよび腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現された抗原提示細胞；およびこれを含む癌予防または治療用ワクチン組成物に関するものである。
【0040】
用語、“核酸”、“核酸分子”、または“核酸配列”はＤＮＡまたはＲＮＡ分子または配列を意味し、“核酸組成物”はこのような核酸、核酸分子または核酸配列を含む組成物を意味する。
【0041】
用語、“遺伝子コンストラクト”は、目的タンパク質をコーディングする遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された核酸構造物をいう。一実施形態として、遺伝子コンストラクトは、２以上の目的タンパク質をバイシストロニック転写体として暗号化する線形または円形、または単一鎖または二重鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡなどであってもよい。遺伝子コンストラクトは、宿主を形質転換、形質感染またはトランスフェクションさせるために使用することができるベクターの一部を成すことができるが、これに制限されるわけではなく、それ自体でインビトロで転写および／または翻訳することができる。
【0042】
用語、“作動可能に連結された”は核酸配列間の結合が機能的に連関していることを意味する。例えば、コーディング配列（例えば、目的タンパク質をコーディングする配列）は、その複製、転写および／または翻訳が可能なように適切な調節要素と作動可能に連結できる。例えば、コーディング配列は、プロモーターがそのコーディング配列の転写を推進することができる場合、プロモーターに作動可能に連結されるものである。調節要素は、これが正しく機能しさえすればコーディング配列に隣接する必要がない。例えば、翻訳されないが転写される介在配列がプロモーター配列とコーディング配列の間に存在することがあり、プロモーター配列は依然としてコーディング配列に“作動可能に連結された”ものと見なされる。
【0043】
遺伝子コンストラクト内の各構成要素は互いに作動可能に連結されなければならず、これら構成要素配列の連結は便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）によって行われ、そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用して行われる。
【0044】
用語“バイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）”またはこれと互換可能な用語の“ポリシストロニック（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）”とは、真核細胞内でｍＲＮＡの内部でもリボソームがポリペプチドを合成することができるようになって一つのｍＲＮＡから様々なポリペプチドが合成可能になったシステムを意味する。本願の一実施形態の場合、ＭＨＣ対立遺伝子をコーディングする核酸配列および腫瘍抗原をコーディングする核酸配列が一つのｍＲＮＡから同時に発現できるように遺伝子コンストラクトをデザインした。
【0045】
一般に、原核細胞は一つのｍＲＮＡの様々な位置にリボソームが結合して一度に様々なタンパク質を合成することができるポリシストロニック（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）システムを有するが、真核生物は原則的に一つのプロモーターで一つのｍＲＮＡが作られその遺伝子のみ翻訳されてポリペプチドが合成されるモノシストロニック（ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）システムを有する。しかし、本願の遺伝子コンストラクトは、真核細胞内で一つのｍＲＮＡから様々なポリペプチドを発現させることができ、例えば、各遺伝子をそれぞれのプロモーター下に位置させて発現させるか、二つの遺伝子の間にＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）を置いて一つのプロモーター下で二つの遺伝子を同時に発現させることが可能である。
【0046】
本明細書に記載されたものとして、“（所定の成分を）含む”は記載された成分以外の成分を含むことができること（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）または記載された成分を必須的に含む（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）ことを意味することができる。
【0047】
用語、“ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）”または“主組織適合性複合体”は免疫細胞が自己、非自己分子を区分することができるように抗原断片を免疫細胞に提供する役割を果たすタンパク質であって、ＭＨＣクラスＩとＭＨＣクラスＩＩの二種類があり、ＭＨＣクラスＩは核がある全ての細胞にある反面、ＭＨＣクラスＩＩは抗原提示細胞で発見される。本願で提供される技術的な思想はＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ全てに適用可能である。
【0048】
一般に、後天的（ａｄａｐｔｉｖｅ）免疫反応で、病原体または抗原が体内に入ると抗原提示細胞がこれを摂取して短いペプチド断片に分解させ、ペプチドは細胞内でＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子と結合して細胞表面に運搬することができる。このように病原体または抗原のペプチドがＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩに結合して抗原提示細胞の細胞表面に提示されると、Ｔ細胞がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を通じてこれを認識して活性化され免疫反応を始めるようになる。このような側面から、前記病原体または抗原のペプチドはＴ細胞の“エピトープ”に該当する。
【0049】
ヒトのＭＨＣはヒト白血球抗原（ＨＬＡ：Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）といい、ＭＨＣクラスＩ（またはＨＬＡクラスＩ）分子としてはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃがある。ＭＨＣクラスＩ分子は、アルファポリペプチド鎖とベータ－２－マイクログロブリンから構成されている。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞と相互作用をし臓器移植の拒否反応や感染した細胞を破壊することに重要な役割を果たす。
【0050】
ＭＨＣクラスＩＩ（またはＨＬＡクラスＩＩ）分子としてはＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱおよびＨＬＡ－ＤＰがある。ＭＨＣクラスＩＩ分子はアルファポリペプチド鎖とベータポリペプチド鎖から構成されている。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＣＤ４＋補助Ｔ細胞と相互作用を通じて非自己抗原を認知して細胞性免疫を引き起こす際に重要な役割を果たす。
【0051】
ＭＨＣをコーディングする遺伝子は激しい多型性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を示す遺伝子であって、多様な病原体または抗原に対する免疫反応を誘導することができるように多数の対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）が存在する。例えば、人間でＨＬＡクラスＩ対立遺伝子数は２０２０年１月基準に１８、０００個以上が報告されており、ＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子数は７、０００個以上が報告されている。個別遺伝子座別には、ＨＬＡ－Ａ ５，７３５個、ＨＬＡ－Ｂ ７，０５３個、ＨＬＡ－Ｃ ５，６５３個、ＨＬＡ－ＤＲＢ１ ２，６７６個、ＨＬＡ－ＤＱＢ１ １，７７１個、ＨＬＡ－ＤＰＢ１ １，５１９個などが報告された（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）。比較的頻度が高い対立遺伝子としては、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２、ＨＬＡ－Ａ＊３３０３、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２０６、ＨＬＡ－Ａ＊３１０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２０７、ＨＬＡ－Ａ＊２６０１、ＨＬＡ－Ａ＊２６０２、ＨＬＡ－Ａ＊３００１、ＨＬＡ－Ａ＊０１０１、ＨＬＡ－Ａ＊３００４、ＨＬＡ－Ａ＊０２０３、ＨＬＡ－Ａ＊０３０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５、ＨＬＡ－Ａ＊０２１５Ｎ、ＨＬＡ－Ａ＊２４０８、ＨＬＡ－Ａ＊２４２０、ＨＬＡ－Ａ＊２６１０、ＨＬＡ－Ａ＊２９０１、ＨＬＡ－Ａ＊２６０３、ＨＬＡ－Ａ＊３２０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４６０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５４０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３０２、ＨＬＡ－Ｂ＊２７０５、ＨＬＡ－Ｂ＊０７０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４００６、ＨＬＡ－Ｂ＊４８０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４００１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１３０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４００２、ＨＬＡ－Ｂ＊５２０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５９０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３９０１、ＨＬＡ－Ｂ＊６７０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０８０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５０７、ＨＬＡ－Ｂ＊１５１８、ＨＬＡ－Ｂ＊３７０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７０５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５３８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５１１、ＨＬＡ－Ｂ＊４００３、ＨＬＡ－Ｂ＊４４０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５００１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１０２、ＨＬＡ－Ｂ＊５６０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５１１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５２７、ＨＬＡ－Ｂ＊３５０３、ＨＬＡ－Ｂ＊４７０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５６０５、ＨＬＡ－Ｂ＊５７０、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０１０２、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０３０４、ＨＬＡ－Ｃｗ＊１４０２、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０７０２、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０４０１、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０３０２、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０３０３、ＨＬＡ－Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０６０２、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０７０１、ＨＬＡ－Ｃｗ＊１２０２、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０２、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０２０２、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０７０４、ＨＬＡ－Ｃｗ＊１２０３、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０５０１、ＨＬＡ－Ｃｗ＊１５０５、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０１０３、ＨＬＡ－Ｃｗ＊１５０２、ＨＬＡ－Ｃｗ＊１５０７を例示することができるが、本願がこれに制限されるわけではない。また、ＨＬＡ遺伝子は６番染色体短腕に４メガベース（ｍｅｇａｂａｓｅ）にわたって互いに近接して位置するので、両親から子供に遺伝する時、一つのハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）で遺伝するという特徴がある。
【0052】
好ましい実施形態として、ＭＨＣ対立遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子またはＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子である。
【0053】
好ましい実施形態として、ＭＨＣ対立遺伝子は、対象患者の腫瘍に由来したものである。
【0054】
また好ましい実施形態として、遺伝子コンストラクトは、ＭＨＣ対立遺伝子の核酸配列および腫瘍抗原をコーディングする核酸配列を含む。
【0055】
また、ＭＨＣ対立遺伝子をコーディングする核酸配列は、そのＮ－末端にＢ２Ｍ（ベータ－２－マイクログロブリン）をコーディングする配列と融合でき、これはＭＨＣ対立遺伝子が抗原提示細胞で発現時、細胞表面での構造的安定性に寄与できる。Ｂ２Ｍは、ＭＨＣ、特にＭＨＣクラスＩのアルファポリペプチド鎖を安定化させる作用を果たす約１２ｋＤａの非糖化のタンパク質である。ヒトＢ２Ｍ遺伝子はリーダー配列を暗号化する２０個Ｎ－末端アミノ酸を有する１１９個アミノ酸のタンパク質を暗号化する。成熟タンパク質は９９個アミノ酸を含む。遺伝子は４個のエクソンと３個のイントロンを含み、第１エクソンは５’非解読領域、全体リーダー配列および成熟ポリペプチドの第１の２個のアミノ酸を含み；第２エクソンは成熟タンパク質の大部分を暗号化し；第３エクソンは成熟タンパク質の最後の４個のアミノ酸および終止コドンを暗号化し；第４エクソンは３’非解読領域を含む。本願では、Ｂ２Ｍとの融合によってＭＨＣ分子上のペプチドの安定性が増加し、抗原提示細胞で発現時、細胞表面での構造的安定性を増加させることができる。
【0056】
Ｂ２Ｍをコーディングする配列は、全体ヒトベータ－２－マイクログロブリン遺伝子に相応する核酸残基の全体または一部を含むことができる。
【0057】
用語“腫瘍抗原（ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ）”または“癌抗原（ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ）”は腫瘍（癌）で発現する抗原であって免疫反応を起こす分子をいう。このような免疫反応は、抗体生成、または特定免疫学的－適格細胞の活性化、または両方共を伴うことができる。
【0058】
腫瘍抗原は腫瘍を有する有機体、死滅するか非活性化された全体腫瘍細胞、または溶解質に由来することができ、腫瘍に由来した任意の抗原を含む。溶解質は細胞の正常構造の分裂を引き起こす過程の適用から発生する物質をいう。また、腫瘍抗原は腫瘍細胞に含まれ正常細胞とは異なるように発現される、抗原特性を有する任意のタンパク質またはその他物質を含む。
【0059】
例えば、腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＡＡ）と腫瘍特異的抗原（Ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＳＡ）を含む。
【0060】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は正常細胞より癌細胞で多く現れるか正常細胞と異なる分化段階で現れる抗原であって、正常細胞でも微量が存在する腫瘍共有抗原（ｔｕｍｏｒ ｓｈａｒｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）である。したがって、これを用いた免疫反応は自己細胞の損傷を防止するための免疫抑制機序である自己寛容によって失敗に終わる可能性が高く、あるいは逆に自己免疫によって望まない臓器が攻撃を受けることがある。
【0061】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の例としては、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、ＭＡＧＥ（黒色腫抗原Ｅ）、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－Ａ３、チロシナーゼ、ＴＲＰ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＰＳＡ、ｐ５３、ママグロビンＡ（Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ－Ａ）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、Ｍｕｃ１（ムチン１）／ＤＦ３、メタロパンスチムリン－１（ｍｅｔａｌｌｏｐａｎｓｔｉｍｕｌｉｎ－１、ＭＰＳ－１）、シトクロムＰ４５０イソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）１Ｂ１、９０Ｋ／Ｍａｃ－２結合タンパク質、Ｅｐ－ＣＡＭ（ＭＫ－１）、ＨＳＰ－７０、ｈＴＥＲＴ（ＴＲＴ）、ＬＥＡ、ＬＡＧＥ－１／ＣＡＭＥＬ、ＴＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ、５Ｔ４、ｇｐ７０、ＳＣＰ－１、ｃ－ｍｙｃ、サイクリンＢ１、ＭＤＭ２、ｐ６２、Ｋｏｃ、ＩＭＰ１、ＲＣＡＳ１、ＴＡ９０、ＯＡ１、ＣＴ－７、ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０／ＳＳＸ－２、ＳＳＸ－１、ＳＳＸ－４、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１４／ＳＣＰ－１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＨＤＡＣ５、ＭＢＤ２、ＴＲＩＰ４、ＮＹ－ＣＯ－４５、ＫＮＳＬ６、ＨＩＰ１Ｒ、Ｓｅｂ４Ｄ、ＫＩＡＡ１４１６、ＩＭＰ１、９０Ｋ／Ｍａｃ－２結合タンパク質、ＭＤＭ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、またはＬＭＮＡを含むが、これに制限されない。
【0062】
腫瘍特異的抗原（Ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＳＡ）は、癌細胞にのみ特異的に存在する抗原をいう。特に、癌患者において腫瘍が増殖する時、癌細胞特異的な遺伝子突然変異が発生してＴ細胞を刺激することができる新たな抗原エピトープが生成され、これを新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）という。即ち、新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）は癌細胞特異的な遺伝子突然変異を含み、正常細胞でも微量発現される腫瘍共有抗原とは異なり癌細胞のみで選別的に発現されるため自己免疫体系によって非自己外来エピトープ（ｎｏｎ－ｓｅｌｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｅｐｉｔｏｐｅ）として認識されて強い抗癌免疫活性を誘発する。
【0063】
変異が起こったＤＮＡを通じて生成されたペプチドが細胞表面のＭＨＣＩに提示されると、Ｔ細胞の受容体（ＴＣＲ）がこれを認識し、正常細胞や組織では突然変異が発生しないため、新抗原－特異的Ｔ細胞は自己寛容や自己免疫問題から自由である。このような長所のため、新抗原はＴ細胞基盤の癌免疫治療に理想的なターゲットと考えられている。
【0064】
新抗原が発生する原因としては、ＤＮＡを成すヌクレオチドが一つまたはそれ以上が欠失または挿入されることによって遺伝暗号の解読がずれるフレームシフト（ｆｒａｍｅ－ｓｈｉｆｔ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｒ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、一つのヌクレオチドが他のもので置換されることによって発生する点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、その他スプライス部位（ｓｐｌｉｃｅ－ｓｉｔｅ）突然変異、リードスルー（ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ）突然変異または遺伝子融合（ｇｅｎｅ－ｆｕｓｉｏｎ）突然変異などがあるが、これに制限されるわけではない。
【0065】
新抗原は個別癌患者の特定癌細胞遺伝体分析を通じて予測され、一例として、患者の腫瘍から癌細胞を得てＤＮＡを抽出した後、塩基配列を分析し、これを正常細胞の塩基配列と比較分析して変異が発生した部分を選別した後、変異が発生した様々な部分の塩基配列の中のＴ細胞を刺激する新抗原を同定することができる。これには、次世代塩基配列分析法（Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）、全エクソームシーケンシング（ｗｈｏｌｅ－ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＷＥＳ）またはＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）のようなビックデータの処理、ＭＨＣ結合予測コンピュータプログラム、または新抗原予測のための人工知能（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ、ＡＩ）などが活用できるが、これに制限されるわけではない。患者ごとに変異形態が共有されないため、新抗原は個人オーダーメード型抗癌ワクチン（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ）として製作可能である。
【0066】
用語“負荷（ｌｏａｄｉｎｇまたはｐｕｌｓｉｎｇ）”とは樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）が抗原を捕獲して分解した後、これをＭＨＣ分子にのせて表面に表出することを言い、このように抗原が搭載された細胞は強力な抗原特異的なＴリンパ球の活性を誘導することができる。
【0067】
遺伝子コンストラクトは、当該遺伝子が選択された宿主内で発現されるようにする転写および解読発現調節配列を含むことができる。発現調節配列としては、転写を実施するためのプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、および／または転写および解読の終結を調節する配列を含むことができる。開始コドンおよび終止コドンは一般に目的タンパク質をコーディングする核酸配列の一部として見なされ、遺伝子作製物が投与された時、個体で作用を示さなければならずコーディング配列とインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）になければならない。
【0068】
例えば、遺伝子コンストラクトは、（ａ）５’から３’方向に、プロモーター、５’－ＵＴＲ、ＭＨＣ対立遺伝子をコーディングする核酸配列、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）の核酸配列、腫瘍抗原をコーディングする核酸配列、および３’－ＵＴＲを含むか、（ｂ）５’から３’方向に、プロモーター、５’－ＵＴＲ、腫瘍抗原をコーディングする核酸配列、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）の核酸配列、ＭＨＣ対立遺伝子をコーディングする核酸配列、および３’－ＵＴＲを含むことができる。
【0069】
用語、“プロモーター”は転写調節因子が結合するＤＮＡ塩基配列部位を意味し、本発明の目的上、遺伝子発現率を高めるために強力且つ安定的な遺伝子発現を誘導することができるプロモーターを使用することができる。
【0070】
プロモーターは、構成的または誘導性であってもよい。プロモーターはこれに制限されないが、アデノウイルスの初期および後期プロモーター、猿ウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶの長い末端反復部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタインウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ±プロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域などを例示することができる。
【0071】
用語、“５’－ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）”または“５’－非翻訳領域”とは、ｍＲＮＡ転写体の５’－末端に存在するが、アミノ酸に翻訳されない領域をいう。ゲノム配列で、５’－ＵＴＲは、転写開始部位と開始コドンの間にある領域と一般に定義される。脊椎動物ｍＲＮＡの５’－ＵＴＲは、数十個の塩基から数百個の塩基長さに至るものであり得る。ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される過程は、リボソームの３０Ｓサブユニットが５’－ＵＴＲに結合することから始まる。具体的に、リボソームの３０Ｓサブユニット内の１６Ｓ ｒＲＮＡ（１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ）が５’－ＵＴＲのリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ、ＲＢＳ）に結合し、ｔＲＮＡがｍＲＮＡの開始コドン（ＡＵＧ）を認識して結合すると、タンパク質への翻訳が始まる。５’－ＵＴＲのリボソーム結合部位と開始コドンは大略６～８ヌクレオチド距離に存在し、リボソーム結合部位の中には１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端の配列と相補的な配列が存在し、これをシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列という。
【0072】
用語“ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）”または“内部リボソーム流入部位”は、転写体の翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）時、リボソームが翻訳進行の開始と認識する塩基配列をいう。即ち、ＩＲＥＳは真核細胞で、一つのｍＲＮＡから様々なポリペプチドの合成が可能なようにリボソームが直接結合するｍＲＮＡ内部に存在している特定領域であって、本願の遺伝子コンストラクトがバイシストロニックになるようにする役割を果たす。即ち、翻訳が行われる過程でＩＲＥＳの５’側の側面に位置したポリペプチドコーディング配列は５’末端のキャップ構造から翻訳が行われ、ＩＲＥＳの他側面に位置したポリペプチドコーディング配列はＩＲＥＳにリボソームサブユニットが付着されて翻訳が行われるので、様々なポリペプチドをそれぞれ別途に得ることができる。
【0073】
ＩＲＥＳは天然からまたは合成により得ることができ、ポリオウイルス、ＥＭＣウイルスなどのウイルス由来であるか、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、ショウジョウバエのアンテナ遺伝子（Ａｎｔｐ）などの細胞由来であってもよいが、これに制限されない。
【0074】
用語、“３’－ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）”または“３’－非翻訳領域”とは、ｍＲＮＡ転写体の３’－末端に存在するが、アミノ酸に翻訳されない領域をいう。
【0075】
その他に、遺伝子コンストラクトは、アダプターまたはリンカー、エンハンサー、選別マーカー（例えば、抗生剤耐性マーカー）、複製可能単位、ｐｏｌｙＡ配列、精製用タグ（例えば、ＧＳＴ、ｐｏｌｙ－Ａｒｇ、ＦＬＡＧ、ヒスチジン－タグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）またはｃ－ｍｙなど）または原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節すると知られた構成と誘導のその他の配列およびこれらの様々な組み合わせをなどを適切に含むことができる。
【0076】
本願はまた、前述の遺伝子コンストラクトから転写された、ＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原を同時に発現する、ＲＮＡ転写体に関するものである。ＲＮＡ転写体からＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原が同時に翻訳および合成できるという点から、ＲＮＡ転写体はバイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）である。
【0077】
ＲＮＡ転写体はｍＲＮＡ転写体であってもよく、前述の遺伝子コンストラクトが細胞内で転写された後、分離および精製されてもよいが、好ましくは、インビトロ転写法によって試験管内で転写できる。
【0078】
本願はまた、前記遺伝子コンストラクトを含む、バイシストロニック発現ベクターに関するものである。用語、“ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）”は個体の細胞内で目的タンパク質をコーディングする遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物を言い、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、など多様な形態のベクターを使用することができる。
【0079】
発現ベクターおよびＲＮＡ転写体の各構成要素に対する説明は、前述の遺伝子コンストラクトの各構成要素に対する説明で代替する。
【0080】
本願の他の例は、前記遺伝子コンストラクト、前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター、または前記遺伝子コンストラクトから転写されたＲＮＡ転写体から生成された、ポリペプチドに関するものである。
【0081】
本願の他の例は、前述の遺伝子コンストラクト；前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター；前記遺伝子コンストラクトから転写されたＲＮＡ転写体；または前記遺伝子コンストラクト、発現ベクターまたはＲＮＡ転写体から生成されたポリペプチドを含む、ＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原を同時に発現するための組成物に関するものである。
【0082】
本願はまた、前記遺伝子コンストラクト；前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター；前記遺伝子コンストラクトから転写されたＲＮＡ転写体；または前記遺伝子コンストラクト、発現ベクターまたはＲＮＡ転写体から生成されたポリペプチドを含む、抗原提示細胞に関するものである。
【0083】
本願はまた、前記遺伝子コンストラクト、前記遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター、前記遺伝子コンストラクトから転写されたＲＮＡ転写体；または前記遺伝子コンストラクト、発現ベクターまたはＲＮＡ転写体から生成されたポリペプチドを抗原提示細胞に導入する段階を含む、癌予防または治療用ワクチン組成物の製造方法に関するものである。
【0084】
用語“抗原提示細胞”は抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する免疫反応の向上を促進することによって本願の目的を達成する任意の細胞をいう。抗原提示細胞は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＤＣ）、大食細胞、またはＢ細胞を含む。抗原提示細胞は、癌患者の自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）または同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）由来であってもよい。用語“自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）”は個体から得られて、同一個体を治療することに使用される細胞を意味し、“同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）”は同一種の他の個体から得られた細胞を意味する。
【0085】
樹状細胞（ＤＣ）は身体の最も有効な抗原提示細胞類型であって、これは外来抗原を貪食してこれをナイーブ（ｎａｉｖｅ）（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ）および記憶Ｔ細胞に提示することができる。樹状細胞は、一般に、細胞の微飲作用および／または貪食作用によって抗原を吸収した後、このような抗原を細胞内的に加工した後、免疫系のＴ細胞に抗原を提示する。このような加工は一般に身体内で発生するが、身体から樹状細胞を分離して、これらを試験管内で培養し、抗原を前記試験管内で培養された樹状細胞に提供した後、前記細胞をＴ細胞と相互作用して関心抗原に対する増加された免疫反応を誘発させることができる身体に復帰させることが可能である。前記抗原を樹状細胞に提供する前記過程は、一般に、負荷（ｌｏａｄｉｎｇまたはｐｕｌｓｉｎｇ）または共同培養として言及される。
【0086】
一具体例として、対象患者または同種または異種の個体から樹状細胞の前駆細胞を得て樹状細胞に分化させた後、前述の遺伝子コンストラクト、ＲＮＡ転写体、発現ベクター、またはポリペプチドを導入することができる。例えば、樹状細胞は、ワクチン投与対象患者の血液から単離された単核球の分化によって得ることができる。単核球から樹状細胞の分化のための技術は当該分野によく確立されている。非制限的な例として、典型的プロトコールで、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は密度勾配遠心分離によって全体血液から単離でき、ＰＢＭＣから単核球を分離することは単核球の付着性を用いるか免疫－自己ビードを用いて行うことができる。分離された単核球はＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４の存在下で培養されて未成熟樹状細胞に分化できる。未成熟樹状細胞は、成熟因子、典型的にＴＬＲ－４作動薬、例えば、ＬＰＳの存在下で培養されるか、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－１βおよびＰＧＥ２を含む単核球成熟カクテルを使用して培養されて成熟できる。樹状細胞の成熟とベクター導入は同時に行われてもよい。
【0087】
遺伝子コンストラクト、ＲＮＡ転写体、または発現ベクターを細胞に導入することは、当分野で公知されたように適した標準技術、例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、電気注入法（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム共沈殿法（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、レトロウイルス感染（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥ－デキストラン（ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ）、カチオン性リポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法、ポリエチレングリコール沈殿法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ）、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）などを用いることができるが、これに制限されるわけではない。この時、円形の構造物を適切な制限酵素で切断して線形の形で導入することができる。
【0088】
好ましい実施形態として、遺伝子コンストラクト、ＲＮＡ転写体、発現ベクターまたはポリペプチドが電気穿孔法で導入できる。電気穿孔は、非透過性物質の細胞への進入を促進させるために細胞に電流または電場を適用させることをいう。例えば、導入しようとする非透過性物質（例えば、核酸、ベクターなど）が含まれている溶液に細胞を懸濁して直流高電圧のパルスを通過させると、電気によって細胞膜に孔が空き同時に電気泳動の作用で非透過性物質が細胞内に導入されることになる。電気穿孔装置は、静止形態の電気穿孔装置であるか流動形態の電気穿孔装置であってもよい。静止形態の電気穿孔装置は、固定量の標的細胞と接触される流体中に埋没成形された電極を含む特化されたキュベットを含む。関心分子は二つの電極の間に配置され、高電圧でパルシング（ｐｕｌｓｉｎｇ）される。
【0089】
他の例は、前述の遺伝子コンストラクト、ＲＮＡ転写体、発現ベクター、またはポリペプチドを含む、癌予防または治療用ワクチン組成物およびその製造方法に関するものである。
【0090】
他の例は、前述の遺伝子コンストラクト、ＲＮＡ転写体、発現ベクター、またはポリペプチドが導入された抗原提示細胞を含む、癌予防または治療用ワクチン組成物およびその製造方法に関するものである。
【0091】
他の例は、ＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現された抗原提示細胞を含む、癌予防または治療用ワクチン組成物およびその製造方法に関するものである。
【0092】
用語“ワクチン”は、本願による抗原提示細胞を含有して被検体に投与できる形態の剤形をいう。従って、本発明のワクチン組成物は、疾患を予防するか改善させるか治療するために便利に使用できる。被検体または宿主に導入された後、ワクチンは抗体、サイトカインおよび／またはその他細胞反応の生成を含むが、これに制限されない免疫反応を誘発させることができる。
【0093】
好ましい実施形態として、ＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原は、前記組成物が投与される治療対象癌患者の腫瘍細胞に由来したものであってもよい。
【0094】
本願の癌ワクチン組成物は患者腫瘍分析で得られた腫瘍抗原配列、特に新抗原配列（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および各患者の腫瘍由来ＭＨＣ対立遺伝子を同時に抗原提示細胞（ＡＰＣ）で過量発現させることができ、これによって最大量の抗原（またはｅｐｉｔｏｐｅ）－ＭＨＣ免疫刺激複合体を細胞表面に発現してＡＰＣの腫瘍抗原提示効能を極大化することによって、窮極的に患者オーダーメード型抗癌Ｔ細胞の増殖および活性化を最大限に触発して抗癌免疫効果を増大させることができる。
【0095】
具体的に、本願の癌ワクチン組成物に含まれる抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）はＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原を同時に過量発現することができ、これによってＭＨＣ対立遺伝子および腫瘍抗原が結合して抗原提示細胞の表面に発現することによってＴリンパ球に抗原を提示することができ、これを通じてＴリンパ球を活性化させると、強力な癌特異的細胞毒性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＣＴＬ）が誘導されて癌細胞を破壊することによって癌を免疫学的に治療することができる。また、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）で豊富に発現される共同刺激物質がＴリンパ球受容体と抗原－ＭＨＣ結合体間の反応に重要な役割を担当し、Ｔリンパ球の分化と成長または流入に関する様々なサイトカインを分泌して免疫反応の活性を調節することができるため、抗癌免疫治療に有用に使用できる。
【0096】
本願のワクチン組成物はまた、ワクチンの有効性を増強させる追加の免疫補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）を含むことができる。適した免疫補強剤は、（１）アルミニウム塩（明礬）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；（２）水中油エマルション製剤（ムラミルペプチドまたは細菌細胞壁成分と同じ特定免疫刺激剤を含有するか含有しない）、例えば、（ａ）ミクロン以下の粒子に製剤化された５％スクアレン、０．５％ツイン８０および０．５％スパン８５（必須的ではないが、選択的に多様な量のＮ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’，２’－ジパルミトイルジ－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリールオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）を含有する）を含むＭＦ５９（ＷＯ９０／１４８３７）、（ｂ）ミクロン以下の粒子にマイクロ流体化されるか大きい粒子大きさのエマルションを生成するように振とうされた、１０％スクアレン、０．４％ツイン８０、５％プルロニックブロック化重合体およびＮ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）を含むＳＡＦ、および（ｃ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）から構成された群より選択される一つ以上の細菌細胞壁成分、２％スクアレン、および０．２％ツイン８０を含むＲｉｂｉＴＭ免疫補強剤システム（ＲＡＳ）；（３）サポニン免疫補強剤；（４）フロイントの完全免疫補強剤（ＣＦＡ）および不完全免疫補強剤（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、大食細胞コロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（６）細菌のＡＤＰ－リボシル化毒素、例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱に不安定な毒素（ＬＴ）、特にＬＴ－Ｒ７２、ＣＴ－Ｓ１０９、ＰＴ－Ｋ９／Ｇ１２９の脱毒素化された突然変異体（ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５）；および（７）ワクチンの有効性を増強させる免疫刺激剤として作用するその他の物質を含むが、これに制限されるわけではない。
【0097】
ワクチン組成物は懸濁または溶解された通常の塩水または緩衝された水溶液培地を含むことができる。例えば、通常、希釈剤、例えば、水、塩水、グリセロール、エタノールなどを含むことができ、補助物質、例えば、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤などが組成物中に存在してもよい。
【0098】
注射用として適した形態は、滅菌注射用水または分散液の即席製造用滅菌水性溶液（水溶性）または分散液および滅菌粉末を含む。これらは製造条件下で安定でなければならず、細菌または真菌のような微生物の汚染に対抗して保存されなければならない。微生物の汚染は、多様な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどを使用して予防することができる。多くの場合で、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレートまたはゼラチンを組成物中に使用することによって可能になる。
【0099】
前述の溶媒中に必要量の抗原提示細胞と前記で列挙した多様なその他の成分を結合させ、必要によって抗原提示細胞および／または熱に敏感な免疫補強剤サイトカインなどを除いた残り成分、例えば、ＰＢＳのような緩衝溶液をろ過滅菌することによって滅菌注射用水を製造する。一般に、基本的な分散培地および前述のものから必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル内に多様な滅菌化活性成分を含ませることによって分散液を製造する。滅菌注射用水の製造用滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥技法である。このような技法によって活性成分、および前述のその滅菌－ろ過された溶液から任意の目的とする成分の粉末を得る。
【0100】
本発明の作用をいかなる方式にも制限せず、本発明によって樹状細胞を伝達することは免疫反応を誘導し、特に抗原に対する細胞毒性Ｔ－リンパ球の反応を誘導するのに特に有用である。前記免疫反応は、特異的（Ｔ細胞および／またはＢ細胞）および／または非特異的免疫反応であってもよい。
【0101】
したがって、本発明のまた他の側面は人間、特に癌患者において抗原に対する免疫反応を起こすか、誘導するか、または促進する方法に関するものであって、前記方法は前述のようなワクチン組成物または抗原提示細胞の有効量を癌患者に投与することを含む。
【0102】
前記免疫反応は細胞毒性Ｔ－リンパ球反応を含むことが好ましく、本発明の細胞毒性リンパ球反応はヘルパーＴ細胞反応、体液性反応またはその他の特異的または非特異的な免疫反応と共にまたは独立して起こってもよい。
【0103】
本発明のまた他の側面は、疾病状態の治療および／または予防に関連して本発明の樹状細胞を使用することに関係する。本発明の方法によって治療できる疾病の例としては、各種癌疾患および難治性癌疾患を含む。
【0104】
例えば、癌は固形癌または血液癌であってもよく、非制限的な例示としては、乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、肝癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、子宮癌、結腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、腎芽細胞腫、皮膚癌、経口扁平上皮癌、表皮癌、鼻咽頭癌、頭頸部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、リンパ管癌（例えば、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫）、胃癌、すい臓癌、睾丸癌、甲状腺癌、甲状腺濾胞癌、黒色腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、中皮腫、骨肉腫、骨髄異形成症候群、間葉起源の腫瘍、軟部組織肉腫、脂肪肉腫、消化管間質腫瘍、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、間葉性軟骨肉腫、リンパ肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、奇形癌腫、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、皮膚の良性腫瘍、または白血病であってもよい。肺癌は、例えば、小細胞肺癌腫（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）であってもよい。白血病は、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）または慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）であってもよい。治療される被検体は、２次的な抗過多増殖療法を受けている被検体であってもよい。例えば、２次的な抗過多増殖療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、光線療法、冷凍療法、毒素療法、ホルモン療法、または外科手術であってもよい。
【0105】
したがって、本発明のまた他の側面は、前記癌ワクチン組成物を用いて腫瘍特異的免疫反応を増強させることによって癌を治療する方法を提供する。ここで、前記組成物の投与は、病気状態の発病または進行を阻害するか、中止させるか、遅延させるか、予防する免疫反応を起こすか、誘導するか、または促進する。
【0106】
組成物の直接伝達は、一般に、全身的、皮下、皮内、腹腔内、血管内（静脈内）、筋肉内または局所伝達でき、または組織の間隙に伝達される。組成物はまた、病変に投与できる。投与療法は、単一用量または多重用量スケジュールであってもよい。
【0107】
用語“有効量”は、人間をはじめとする個体に投与した時、所望の結果を達成するのに十分な量、例えば、癌を治療または予防するのに効果的な量を意味する。有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重などの因子によって変わることになる。投与量または治療用法は、当業者らが理解するように、最適の治療反応を提供するように調整することができる。
【0108】
治療学的有効量を用いた個体の治療用法は１回投与から構成されるか、または他の例として、一連の適用を含むことができる。治療の期間は疾患の重症度、個体の年齢、癌ワクチンの濃度、癌ワクチンに対する患者の反応性またはこれらの組み合わせのような多様な因子によって決定される。また、治療に使用される癌ワクチンの有効投与量は個別治療用法のコースの間に高めるか低めることができるのが理解されるはずである。投与量に変化が生じることがあり、当該技術分野に公知された標準診断分析を通じて明確になり得る。本発明の癌ワクチンは、いくつかの側面で、通常の抗ガン剤、放射線治療、ホルモン治療、バイオテラピーおよび／または外科的腫瘍切除を用いた治療前に、治療中にまたは治療後に、投与することができる。
【0109】
以下、本発明を次の実施例によってより具体的に説明する。しかし、これらは本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるわけではない。
【実施例0110】
実施例１．バイシストロニック発現ベクターの製造
ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子および腫瘍抗原を同時に発現するためのバイシストロニックベクターは図１のように構成されており、具体的に、５’から３’方向にそれぞれ５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（組換えＢ２ＭおよびＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の融合を含むオープンリーディングフレーム；具体的に、Ｎ－末端にＢ２ＭおよびＣ－末端に腫瘍由来ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を含む融合タンパク質のコーディング配列）－ＩＲＥＳ－ＯＲＦ２（ｂｅａｄｓ－ｏｎ－ａ－ｓｔｒｉｎｇ構造の多重抗原性エピトープから構成された組換えタンパク質のコーディング配列）－３’ＵＴＲの遺伝子コンストラクトを含む。具体的に、基準鋳型（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ）は“ＬＧＶ１００７”と命名し、ＯＲＦ１としてＮ－末端からＣ－末端方向に信号配列、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－Ａ＊０２０１を含む融合タンパク質（配列番号１）をコーディングする配列を有し、ＯＲＦ２としてＮＹ－ＥＳＯ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＭＵＬＴＩ－ＭＡＧＥ－Ａ、およびＭＥＬＡＮ－Ａを含む共有抗原組換えタンパク質（配列番号２）のコーディング配列を有する。このような前記ＬＧＶ１００７の全体配列構造は図２に示した通りであり、前記ＬＧＶ１００７の５’末端のＢａｍＨＩから３’末端のＸｂａＩ制限酵素位置を含む全体ＤＮＡ配列（３，５２３ｂｐ）を配列番号３に示し、その遺伝子合成を依頼して得た（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。しかし、ＬＧＶ１００７は本願の一実施形態による代表例示に過ぎないだけであり、その塩基配列は前述のように個別癌患者によってオーダーメード型で自家由来の配列を含むようにＯＲＦ１およびＯＲＦ２塩基配列が変化でき、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２を除いた塩基配列は当業界に広く知られた配列を用いて抗原提示のために最適化および標準化することができる。
ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子および腫瘍抗原を同時に発現するためのバイシストロニックベクターは図１のように構成されており、具体的に、５’から３’方向にそれぞれ５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（組換えＢ２ＭおよびＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の融合を含むオープンリーディングフレーム；具体的に、Ｎ－末端にＢ２ＭおよびＣ－末端に腫瘍由来ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を含む融合タンパク質のコーディング配列）－ＩＲＥＳ－ＯＲＦ２（ｂｅａｄｓ－ｏｎ－ａ－ｓｔｒｉｎｇ構造の多重抗原性エピトープから構成された組換えタンパク質のコーディング配列）－３’ＵＴＲの遺伝子コンストラクトを含む。具体的に、基準鋳型（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ）は“ＬＧＶ１００７”と命名し、ＯＲＦ１としてＮ－末端からＣ－末端方向に信号配列、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－Ａ＊０２０１を含む融合タンパク質（配列番号１）をコーディングする配列を有し、ＯＲＦ２としてＮＹ－ＥＳＯ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＭＵＬＴＩ－ＭＡＧＥ－Ａ、およびＭＥＬＡＮ－Ａを含む共有抗原組換えタンパク質（配列番号２）のコーディング配列を有する。このような前記ＬＧＶ１００７の全体配列構造は図２に示した通りであり、前記ＬＧＶ１００７の５’末端のＢａｍＨＩから３’末端のＸｂａＩ制限酵素位置を含む全体ＤＮＡ配列（３，５２３ｂｐ）を配列番号３に示し、その遺伝子合成を依頼して得た（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。しかし、ＬＧＶ１００７は本願の一実施形態による代表例示に過ぎないだけであり、その塩基配列は前述のように個別癌患者によってオーダーメード型で自家由来の配列を含むようにＯＲＦ１およびＯＲＦ２塩基配列が変化でき、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２を除いた塩基配列は当業界に広く知られた配列を用いて抗原提示のために最適化および標準化することができる。
【0111】
実施例２．インビトロ転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＩＶＴ）を用いたｍＲＮＡ転写体生成
バイシストロニックｍＲＮＡ転写体を生成するために、前述の実施例１で得られたバイシストロニックベクター（ＤＮＡプラスミドベクター）を制限酵素Ｘｂａｌを使用して切断することによって線形化し、線形化されたＤＮＡをＥｘｐｉｎＴＭ ｃｏｍｂｏ ＧＰキット（ＧｅｎｅＡｌｌ、１１２－１０２）を使用して精製した。精製した線形化されたプラスミド鋳型を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅＴＭ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したＩＶＴ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ｍＲＮＡ生産に使用し、製造者の指示書に従った。生成されたｍＲＮＡ転写体をＬｉＣｌ沈殿法を使用して最終精製した。具体的に、ｍＲＮＡ産物をＬｉＣｌ沈殿溶液（ＩＶＴ反応物２０μＬ当り５０μＬ）軽く混合し－２０℃で３０分以上インキュベーションした。その次に、サンプルを４℃で１４分間２０，０００ｘ ｇで遠心分離でスピンダウンした。その後、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。最終ｍＲＮＡ産物をヌクレアーゼのない脱イオン水に再懸濁した。ｍＲＮＡ産物の量をＮａｎｏｄｒｏｐ２０００を使用して測定した。
バイシストロニックｍＲＮＡ転写体を生成するために、前述の実施例１で得られたバイシストロニックベクター（ＤＮＡプラスミドベクター）を制限酵素Ｘｂａｌを使用して切断することによって線形化し、線形化されたＤＮＡをＥｘｐｉｎＴＭ ｃｏｍｂｏ ＧＰキット（ＧｅｎｅＡｌｌ、１１２－１０２）を使用して精製した。精製した線形化されたプラスミド鋳型を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅＴＭ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用したＩＶＴ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ｍＲＮＡ生産に使用し、製造者の指示書に従った。生成されたｍＲＮＡ転写体をＬｉＣｌ沈殿法を使用して最終精製した。具体的に、ｍＲＮＡ産物をＬｉＣｌ沈殿溶液（ＩＶＴ反応物２０μＬ当り５０μＬ）軽く混合し－２０℃で３０分以上インキュベーションした。その次に、サンプルを４℃で１４分間２０，０００ｘ ｇで遠心分離でスピンダウンした。その後、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。最終ｍＲＮＡ産物をヌクレアーゼのない脱イオン水に再懸濁した。ｍＲＮＡ産物の量をＮａｎｏｄｒｏｐ２０００を使用して測定した。
【0112】
図３は基準鋳型ＬＧＶ１００７に対するインビトロ転写を行い、ｍＲＮＡ転写体が生産されたことをＰＡＧＥ電気泳動法で確認した結果であって、生成物の予想される正確なサイズ（～３．５Ｋｂ、レーン１）を確認した。
【0113】
実施例３．細胞内ｍＲＮＡ感染のための細胞電気穿孔
前述の項目２で得られたｍＲＮＡ転写体を細胞電気穿孔法を使用して人間細胞に転移させた。Ｋ５６２ヒト骨髄由来リンパ芽球性白血病細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２４３ＴＭ）をＡｍａｘａＴＭ ４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｕｎｉｔ装置およびＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｏｎｚａ）を使用して電気穿孔し、製造者のプロトコールに従った。Ｋ５６２細胞を電気穿孔する二日前に３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに新鮮に分離した。電気穿孔当日、細胞を計数し、必要な数の細胞（１～２×１０６ｃｅｌｌｓ）を室温に準備した。電気穿孔前、細胞を無血清ＲＰＭＩまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で二回洗浄し、１００μｌのＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（８２μｌのヌクレオフェクション溶液、１８μｌの補充剤）内に最終的に再懸濁した。その後、０．１ｍｌの細胞懸濁液をｐｒｏｇｒａｍ ＦＦ－１２０を用いてインビトロ転写された（ＩＶＴ）ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ０～２０μｇと共に混合した。電気穿孔後、新鮮培養培地を細胞懸濁液に添加し、電気穿孔された細胞を３７℃、ＣＯ２細胞培養インキュベータで直ちにインキュベーションした。
前述の項目２で得られたｍＲＮＡ転写体を細胞電気穿孔法を使用して人間細胞に転移させた。Ｋ５６２ヒト骨髄由来リンパ芽球性白血病細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２４３ＴＭ）をＡｍａｘａＴＭ ４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｕｎｉｔ装置およびＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｏｎｚａ）を使用して電気穿孔し、製造者のプロトコールに従った。Ｋ５６２細胞を電気穿孔する二日前に３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに新鮮に分離した。電気穿孔当日、細胞を計数し、必要な数の細胞（１～２×１０６ｃｅｌｌｓ）を室温に準備した。電気穿孔前、細胞を無血清ＲＰＭＩまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で二回洗浄し、１００μｌのＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（８２μｌのヌクレオフェクション溶液、１８μｌの補充剤）内に最終的に再懸濁した。その後、０．１ｍｌの細胞懸濁液をｐｒｏｇｒａｍ ＦＦ－１２０を用いてインビトロ転写された（ＩＶＴ）ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ０～２０μｇと共に混合した。電気穿孔後、新鮮培養培地を細胞懸濁液に添加し、電気穿孔された細胞を３７℃、ＣＯ２細胞培養インキュベータで直ちにインキュベーションした。
【0114】
図４はＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体をＫ５６２細胞に電気穿孔した後、発現量が最大値に到達する条件を導出するために、ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体を１×１０６細胞当り０、３、５、または１０μｇの量でＫ５６２細胞に電気穿孔した後、９日間ＨＬＡ－Ａ＊０２０１分子の発現量を確認した結果であって、転写体１０μｇを電気穿孔した後２４時間に最大発現量（最大～６５倍基準値発現量）が観察され、４８時間以後には急激に減少して５～２倍基準値程度の発現量で持続的に維持された。このような、非抗原提示細胞（即ち、個別患者腫瘍オーダーメード型）ＭＨＣ－Ｉ対立遺伝子の最大値過量発現は、実質的に特定抗原提示細胞のＭＨＣ－Ｉ表現型を、患者腫瘍オーダーメード型で単一化させる効果を起こして、個別患者の抗癌免疫Ｔ細胞を活性化を最大化させる作用を期待することができる。
【0115】
実施例４．ｍＲＮＡ産物のインビトロ翻訳（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）
Ｆｌａｇ－タグされたポリ抗原組換えタンパク質のインビトロ翻訳のために、ＬＧＶ１００７鋳型ＤＮＡプラスミドを、ＴｎＴ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）または１－Ｓｔｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ Ｍｉｎｉ ＩＶＴキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した単一チューブインビトロ転写／インビトロ翻訳反応に使用し、製造者のマニュアルに従った。反応体積を１００μｌから２５μｌにスケールダウンした。ＴｎＴ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）の場合、反応混合物を３０℃で６０～９０分間インキュベーションし、１－Ｓｔｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ Ｍｉｎｉ ＩＶＴキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の場合、反応時間が６～１６時間であった。
図５は、ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体のインビトロ翻訳を行ってＦｌａｇ－タグされたポリ抗原組換えタンパク質が生成されたことをウェスタンブロットで確認した結果を示す。
Ｆｌａｇ－タグされたポリ抗原組換えタンパク質のインビトロ翻訳のために、ＬＧＶ１００７鋳型ＤＮＡプラスミドを、ＴｎＴ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）または１－Ｓｔｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ Ｍｉｎｉ ＩＶＴキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した単一チューブインビトロ転写／インビトロ翻訳反応に使用し、製造者のマニュアルに従った。反応体積を１００μｌから２５μｌにスケールダウンした。ＴｎＴ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）の場合、反応混合物を３０℃で６０～９０分間インキュベーションし、１－Ｓｔｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ Ｍｉｎｉ ＩＶＴキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の場合、反応時間が６～１６時間であった。
図５は、ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体のインビトロ翻訳を行ってＦｌａｇ－タグされたポリ抗原組換えタンパク質が生成されたことをウェスタンブロットで確認した結果を示す。
【0116】
実施例５．タンパク質発現分析
Ｋ５６２細胞へのｍＲＮＡ電気穿孔後、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－Ａ＊０２０１が融合された組換えＭＨＣ－Ｉタンパク質の細胞発現に対するウェスタンブロット分析を行った。また、インビトロ翻訳されたｆｌａｇ－タグされたポリ抗原組換えタンパク質のウェスタンブロットを行ってポリ抗原組換えタンパク質のタンパク質発現を確認した。具体的に、ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡが電気穿孔されたＫ５６２細胞を収集し、ＰＢＳで二回洗浄し、４℃でプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＡＴＴＯ）を含有するＲＩＰＡ溶解バッファー（ＡＴＴＯ）で溶解した。標準ウェスタンブロットプロトコールに従って、２０～３０μｇのタンパク質をＳＤＳサンプルバッファーと混合し、Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐｒｅｃａｓｔ１２％または４－２０％ゲル（ＫＯＭＡＢＩＯＴＥＣＨ）上でランニング（ｒｕｎｎｉｎｇ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。免疫ブロット抗体を次のソースから得た：ベータ－２マイクログロブリン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。抗－ベータ－２マイクログロブリン抗体または抗－ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を４℃で一晩適用した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合された２次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を室温で１時間適用した。増強された化学発光感知キット（ＥＣＬ、ＡｍｅｒｓｈａｍまたはＰｉｅｒｃｅ）を使用して免疫反応性タンパク質を究明した。ウェスタンブロッティングの信号はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ６８０を使用して検出した。
Ｋ５６２細胞へのｍＲＮＡ電気穿孔後、Ｂ２ＭおよびＨＬＡ－Ａ＊０２０１が融合された組換えＭＨＣ－Ｉタンパク質の細胞発現に対するウェスタンブロット分析を行った。また、インビトロ翻訳されたｆｌａｇ－タグされたポリ抗原組換えタンパク質のウェスタンブロットを行ってポリ抗原組換えタンパク質のタンパク質発現を確認した。具体的に、ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡが電気穿孔されたＫ５６２細胞を収集し、ＰＢＳで二回洗浄し、４℃でプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＡＴＴＯ）を含有するＲＩＰＡ溶解バッファー（ＡＴＴＯ）で溶解した。標準ウェスタンブロットプロトコールに従って、２０～３０μｇのタンパク質をＳＤＳサンプルバッファーと混合し、Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐｒｅｃａｓｔ１２％または４－２０％ゲル（ＫＯＭＡＢＩＯＴＥＣＨ）上でランニング（ｒｕｎｎｉｎｇ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。免疫ブロット抗体を次のソースから得た：ベータ－２マイクログロブリン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。抗－ベータ－２マイクログロブリン抗体または抗－ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を４℃で一晩適用した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合された２次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を室温で１時間適用した。増強された化学発光感知キット（ＥＣＬ、ＡｍｅｒｓｈａｍまたはＰｉｅｒｃｅ）を使用して免疫反応性タンパク質を究明した。ウェスタンブロッティングの信号はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ６８０を使用して検出した。
【0117】
図６はＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体をＫ５６２細胞に電気穿孔した後、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子（ＯＲＦ１）および腫瘍抗原（ＯＲＦ２）が全てタンパク質として発現されたことをウェスタンブロットで確認した結果であって、ＯＲＦ１（Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１）タンパク質は～５１ｋＤａサイズを確認し（図６ａ）、ＯＲＦ２（腫瘍抗原融合タンパク質）は～３０ｋＤａ程度の予想される大きさで発現されることを確認した（図６ｂ）。しかし、腫瘍抗原融合タンパク質は、細胞発現時には迅速にプロテアソームによって分解されるので、インビトロ翻訳方法によってのみ明確に発現されることを確認した。
【0118】
実施例６．フローサイトメトリー分析
Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅＴＭ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フローサイトメーターでフローサイトメトリーを行った。具体的に、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）後２４～７２時間または最大２週に、ＬＧＶシリーズｍＲＮＡが電気穿孔されたＫ５６２細胞を収集し、３００ｘｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットをフローサイトメトリーバッファー（１％ＦＢＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＤＰＢＳ）に再懸濁した。細胞染色のために、ＡＰＣ接合された－マウス抗－ヒトＨＬＡ－Ａ２（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を推奨濃度で添加した後、細胞を暗闇および室温で３０分～１時間インキュベーションして染色した。染色インキュベーション後、細胞をペレット化しＰＢＳに再懸濁した。フローサイトメトリー結果は、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＦｏｒｅＣｙｔソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で分析した。
Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅＴＭ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ ＰＬＵＳ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フローサイトメーターでフローサイトメトリーを行った。具体的に、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）後２４～７２時間または最大２週に、ＬＧＶシリーズｍＲＮＡが電気穿孔されたＫ５６２細胞を収集し、３００ｘｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットをフローサイトメトリーバッファー（１％ＦＢＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＤＰＢＳ）に再懸濁した。細胞染色のために、ＡＰＣ接合された－マウス抗－ヒトＨＬＡ－Ａ２（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を推奨濃度で添加した後、細胞を暗闇および室温で３０分～１時間インキュベーションして染色した。染色インキュベーション後、細胞をペレット化しＰＢＳに再懸濁した。フローサイトメトリー結果は、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＦｏｒｅＣｙｔソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で分析した。
【0119】
図７はＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体を１×１０６細胞当り１ｕｇの量でＫ５６２細胞に電気穿孔して２４時間以後にＫ５６２細胞表面での発現量をフローサイトメトリー法を用いて確認した結果であって、基準値に比べて～１０倍以上の過量発現を確認した。
【0120】
実施例７．ＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγサイトカイン分泌分析を使用した免疫細胞活性化
Ｋ５６２ａｐｃ抗原提示細胞で、既存の伝統的な抗原搭載方法であるペプチド搭載（ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｕｌｓｅ）とＲＮＡ抗原搭載間の免疫活性効能優位比較を実験した。具体的に、１日目、実施例３で製造した、ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体（含まれている五抗原配列：ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＭＡＲＴ１、ＮＹＥＳＯ１、ＭＡＧＥＡ３、ＭＵＬＴＩＭＡＧＥ）が電気穿孔されたＫ５６２ａｐｃ細胞と、参考抗原（ＳＵＲＶＩＶＩＮ９ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓペプチド）搭載されたＫ５６２ａｐｃ細胞、またはペプチド無処理Ｋ５６２ａｐｃ対照群細胞とＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγ免疫活性比較実験を行った。ＡＰＣ ２．５×１０ｅ５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液中の精製されたＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞を刺激した。１００μＬ／ウェルのＴ細胞と１００μＬＡＰＣｓ／ウェルを添加して（２：１～１０：１比率でＴ細胞ｖｓ．ＡＰＣ比率で混合）細胞混合物を３７℃で２４時間インキュベーションした。２日目、培養培地を１０Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２および５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５で交替して７日後、ＩＬ－２を再補充した。ＡＰＣ刺激１１日後、ＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγプロトコール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＩＦＮγ分泌Ｔ細胞を分析し、製造者の指示書に従った。陽性スポット（ｓｐｏｔ）発色を注意深くモニタリングし、完全に乾燥するまで室温で２時間～一晩分析プレートを空気中に乾燥した。解剖顕微鏡で観察して直接陽性スポットを数えるかＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダーを使用して自動で陽性スポットを数えてＰＢＭＣ Ｔ細胞活性化分析を行った。
Ｋ５６２ａｐｃ抗原提示細胞で、既存の伝統的な抗原搭載方法であるペプチド搭載（ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｕｌｓｅ）とＲＮＡ抗原搭載間の免疫活性効能優位比較を実験した。具体的に、１日目、実施例３で製造した、ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体（含まれている五抗原配列：ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＭＡＲＴ１、ＮＹＥＳＯ１、ＭＡＧＥＡ３、ＭＵＬＴＩＭＡＧＥ）が電気穿孔されたＫ５６２ａｐｃ細胞と、参考抗原（ＳＵＲＶＩＶＩＮ９ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓペプチド）搭載されたＫ５６２ａｐｃ細胞、またはペプチド無処理Ｋ５６２ａｐｃ対照群細胞とＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγ免疫活性比較実験を行った。ＡＰＣ ２．５×１０ｅ５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液中の精製されたＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞を刺激した。１００μＬ／ウェルのＴ細胞と１００μＬＡＰＣｓ／ウェルを添加して（２：１～１０：１比率でＴ細胞ｖｓ．ＡＰＣ比率で混合）細胞混合物を３７℃で２４時間インキュベーションした。２日目、培養培地を１０Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２および５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５で交替して７日後、ＩＬ－２を再補充した。ＡＰＣ刺激１１日後、ＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγプロトコール（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＩＦＮγ分泌Ｔ細胞を分析し、製造者の指示書に従った。陽性スポット（ｓｐｏｔ）発色を注意深くモニタリングし、完全に乾燥するまで室温で２時間～一晩分析プレートを空気中に乾燥した。解剖顕微鏡で観察して直接陽性スポットを数えるかＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダーを使用して自動で陽性スポットを数えてＰＢＭＣ Ｔ細胞活性化分析を行った。
【0121】
図８は、ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体が電気穿孔されたＫ５６２ａｐｃ細胞、参考抗原（ＳＵＲＶＩＶＩＮ９ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓペプチド）搭載されたＫ５６２ａｐｃ細胞、およびペプチド無処理Ｋ５６２ａｐｃ対照群細胞によるＰＢＭＣ Ｔ細胞の免疫活性をそれぞれ測定したＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγ分泌分析結果を示す。Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡであるＬＧＶ１００７の電気穿孔を通じて活性化されたＫ５６２抗原提示細胞は同種のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子型（ＨＬＡ－Ａ＊０２０１）を有するＰＢＭＣ ＣＤ８＋ Ｔ細胞をプライミング活性化させて、ＩＦＮγを分泌する陽性スポットを確認することができた。反面、ＭＨＣ遺伝型制限性対照群として使用した異種ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子型（ｎｏｎ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１）由来のＣＤ８ Ｔ細胞はＡＰＣによってプライミングされなかった。本実験を通じて、ＬＧＶ１００７ ｍＲＮＡ転写体が電気穿孔されたＫ５６２ａｐｃ細胞は、伝統的なペプチド抗原搭載に比べて、優れたｅｘ ｖｉｖｏ ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ免疫細胞活性化を導出することを確認した。
【0122】
実施例８．ＬＧＶ１０３２が導入された自家樹状細胞の製造およびこれを用いた免疫細胞活性化
ＬＧＶ ＲＮＡ抗原搭載方法が、実験室で技術的に最適化されたＫ５６２ａｐｃだけでなく、各患者から抽出後培養熟成された、多様なＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉとｃｌａｓｓ ＩＩを有する、個人オーダーメード型自家樹状細胞でも効果的に抗原搭載および抗原提示を通じて抗原特異的免疫細胞活性化を効果的に触発するかを検証する実験を行い、その結果を図９および図１０に示した。
ＬＧＶ ＲＮＡ抗原搭載方法が、実験室で技術的に最適化されたＫ５６２ａｐｃだけでなく、各患者から抽出後培養熟成された、多様なＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉとｃｌａｓｓ ＩＩを有する、個人オーダーメード型自家樹状細胞でも効果的に抗原搭載および抗原提示を通じて抗原特異的免疫細胞活性化を効果的に触発するかを検証する実験を行い、その結果を図９および図１０に示した。
【0123】
図９は、ＬＧＶ１０３２ ｍＲＮＡ転写体の構造および個人由来自家樹状細胞での細胞発現を確認したＦＡＣＳ分析結果を示す。ＬＧＶ１０３２は、ＬＧＶ１００７（実施例１）と同種のバイシストロニック転写体構造（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を有しＯＲＦ２（腫瘍抗原パート）は維持し、ＯＲＦ１に細胞発現マーカーとしてＧＦＰリポータータンパク質が位置した構造である。したがって、ＬＧＶ１０３２の製造方法はＬＧＶ１００７の製造方法と同一である。前述のようなフローサイトメトリーの結果、ＬＧＶ１０３２は、ＬＧＶ１００７のように、個人由来自家樹状細胞でも電気穿孔方法によって細胞内に流入後、効果的に細胞発現されることを確認した。個人由来または個人オーダーメード型自家樹状細胞は、血液を採取後、単球細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）を樹状細胞に未熟性状態で一応分化（ｉｍｍａｔｕｒｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）させた後、成熟過程を経て熟成樹状細胞（ｍａｔｕｒｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）を得る。このような試験管内細胞分化および熟成過程は一週間程度かかるが、最終熟成樹状細胞は最大値の抗原提示能を保有すると知られている。図９のＧＦＰリポータータンパク質のＦＡＣＳ分析結果から分かるように、ＬＧＶ１０３２は効果的に全ての段階（ｍｏｎｏｃｙｔｅ、ｉｍｍａｔｕｒｅ ＤＣ、ｍａｔｕｒｅ ＤＣ）の細胞に電気穿孔され、細胞流入後、形質発現されることを確認した。
【0124】
図１０は、個人由来自家樹状細胞（ＭｏＤＣ）に電気穿孔されたＬＧＶ１０３２が抗原特異的Ｔ細胞免疫活性を効果的に触発することを証明した、ＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγ分泌スポット増大確認結果を示す。ＬＧＶ１０３２電気穿孔された自家樹状細胞（図１０、列３＆４）は、伝統的方法であるペプチド抗原が搭載（ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｕｌｓｅ）された自家樹状細胞（図１０、列２）に比べて、ＭＡＲＴ１抗願特異的ＴＣＲｅ Ｔ細胞活性化を非常に効果的に触発することを、ＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγ分泌スポット増大を通じて明確に検証した。
【0125】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は本発明がその技術的な思想や必須的特徴を変更せず他の具体的な形態に実施できるということが理解できるはずである。したがって、以上で記述した実施形態は全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないこととして理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは後述の特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導出される全ての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-06
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）および腫瘍抗原の複合体が細胞表面に過剰発現された抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）を含む、
癌予防または治療用ワクチン組成物。
癌予防または治療用ワクチン組成物。
【外国語明細書】