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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024163267
(43)【公開日】2024-11-21
(54)【発明の名称】３－ヒドロキシプロピオン酸の２段階製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/52 20060101AFI20241114BHJP
C12N 1/21 20060101ALN20241114BHJP
C12N 1/15 20060101ALN20241114BHJP
C12N 1/19 20060101ALN20241114BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20241114BHJP
【ＦＩ】
C12P7/52 ZNA
C12P7/52
C12N1/21
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024155129
(22)【出願日】2024-09-09
(62)【分割の表示】P 2022579093の分割
【原出願日】2021-07-30
(31)【優先権主張番号】10-2020-0096238
(32)【優先日】2020-07-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(71)【出願人】
【識別番号】500239823
【氏名又は名称】エルジー・ケム・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100122161
【弁理士】
【氏名又は名称】渡部 崇
(72)【発明者】
【氏名】ジェ・ヒョン・キム
(72)【発明者】
【氏名】ドンギョン・カン
(72)【発明者】
【氏名】キュン・ムク・イ
(57)【要約】
【課題】本発明は、３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）を製造する方法および／または３－ＨＰの生産能を向上する方法に関し、より詳細には、細胞を高濃度に培養する第１段階および前記高濃度培養された細胞を触媒として利用して３－ＨＰを生産する第２段階の２段階製造方法に関する。
【解決手段】本発明は、（１）３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）生産菌株を高濃度細胞培養する段階；および（２）前記高濃度培養された細胞を分離して３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階；を含む、３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）の製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法に関し、３－ＨＰの生産能と収率を向上させることができる。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、（１）３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）生産菌株を高濃度細胞培養する段階；および（２）前記高濃度培養された細胞を分離して３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階；を含む、３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）の製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法に関し、３－ＨＰの生産能と収率を向上させることができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）生産菌株を高濃度細胞培養する段階；および
（２）前記高濃度培養された細胞を分離して３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階；を含み、
前記（２）段階は、細胞の増殖が行われないものである、
３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）の製造方法。
（２）前記高濃度培養された細胞を分離して３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階；を含み、
前記（２）段階は、細胞の増殖が行われないものである、
３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）の製造方法。
【請求項2】
前記（１）段階は、流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）方法で行われ、前記（２）段階は、発酵培養（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）で行われるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記（１）段階は、葡萄糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）を炭素源として含む培地で行われるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記（１）段階は、グリセロールを炭素源として含まない培地で行われるものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記（２）段階は、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を炭素源として含む培地で行われるものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記（２）段階は、葡萄糖を炭素源として含まない培地で行われるものである、請求項１、２、４および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記３－ＨＰ生産菌株は、グリセロール脱水酵素（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）およびアルデヒド脱水素酵素（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）からなる群より選択される一つ以上の蛋白質をコードする遺伝子を含むものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記３－ヒドロキシプロピオン酸の収率は、８０％以上である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記３－ヒドロキシプロピオン酸の生産能は、２ｇ／Ｌ／ｈ以上である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記（２）段階を２９時間行った時の３－ヒドロキシプロピオン酸の生産量が４１ｇ／Ｌ以上である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
３－ヒドロキシプロピオン酸を４５ｇ／Ｌ以上の濃度で含む、３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株の培養液。
【請求項12】
アセテートおよび乳酸からなる群より選択された副産物の濃度が０．１％（ｗ／ｖ）以下である、請求項１１に記載の培養液。
【請求項13】
請求項１１または１２に記載の培養液を含む３－ヒドロキシプロピオン酸製造用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願（ら）との相互引用
本出願は、２０２０年７月３１日付大韓民国特許出願第１０－２０２０－００９６２３８号に基づいた優先権の利益を主張し、当該大韓民国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書に一部として組み含まれる。
本出願は、２０２０年７月３１日付大韓民国特許出願第１０－２０２０－００９６２３８号に基づいた優先権の利益を主張し、当該大韓民国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書に一部として組み含まれる。
【0002】
本発明は、３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）を製造する方法および／または３－ＨＰの生産能を向上する方法に関し、より詳細には、細胞を高濃度に培養する第１段階および前記高濃度培養された細胞を触媒として利用して３－ＨＰを生産する第２段階の２段階製造方法に関する。
【背景技術】
【0003】
３－ヒドロキシプロピオン酸は、アクリル酸（ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、アクリル酸メチル（ｍｅｔｈｙｌ ａｃｒｙｌａｔｅ）、アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）などの多様な化学物質に転換可能なプラットホーム化合物である。２００４年に米国のエネルギー省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ、ＤＯＥ）からＴｏｐ １２ ｖａｌｕｅ－ａｄｄｅｄ ｂｉｏ－ｃｈｅｍｉｃａｌとして選定された後、学界と産業界で活発に研究されている。
【0004】
３－ＨＰの生産は、大きく化学的方法と生物学的方法の二つの方法から行われるが、化学的方法の場合、初期物質が高価である点、生産過程中に毒性物質が生成される点などにより環境にやさしくないという指摘があり、環境にやさしいバイオ工程が脚光を浴びている。
【0005】
微生物を利用した３－ＨＰ生合成のための基質としては、葡萄糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）とグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）が主に利用されており、現在３－ＨＰ生産と細胞の増殖が同時に起こる１段階発酵方式の研究が主に進められている。
【0006】
しかし、前記のような１段階生産時、３－ＨＰ生産用基質が細胞の増殖にも使用されて、アセテート（ａｃｅｔａｔｅ）や乳酸（ｌａｃｔａｔｅ）のような副産物が発生し、これによって３－ＨＰの収率および生産能が低下するという問題点がある。このような低い収率および生産能により３－ＨＰの可能性にもかかわらず、まだ商用化には至っていない実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本出願の一例は、（１）３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）生産菌株を高濃度細胞培養する段階；および（２）前記高濃度培養された細胞を分離し、３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種および／または３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地で培養して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階；を含む、３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）の製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法を提供する。
【0008】
前記２段階製造方法を通じて細胞の成長または副産物発生による３－ＨＰ生産能低下を改善することができる。
【0009】
他の例は、３－ヒドロキシプロピオン酸を高濃度で含む３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株の培養液を提供する。一例において、前記培養液は先に説明した２段階製造方法により生産されたものであり得る。前記培養液は、３－ヒドロキシプロピオン酸の生産用途で使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【0010】
一例は、
（１）３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）生産菌株を高濃度細胞培養する段階；および
（２）前記高濃度培養された細胞を分離し、３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種および／または３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地で培養して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階
を含む、３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）の製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法を提供する。
他の例は、３－ヒドロキシプロピオン酸を高濃度で含む３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株の培養液を提供する。前記培養液は、３－ヒドロキシプロピオン酸生産の用途で使用することができる。前記培養液は、前記の製造方法により生産されたものであり得る。
（１）３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）生産菌株を高濃度細胞培養する段階；および
（２）前記高濃度培養された細胞を分離し、３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種および／または３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地で培養して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階
を含む、３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）の製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法を提供する。
他の例は、３－ヒドロキシプロピオン酸を高濃度で含む３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株の培養液を提供する。前記培養液は、３－ヒドロキシプロピオン酸生産の用途で使用することができる。前記培養液は、前記の製造方法により生産されたものであり得る。
【0011】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0012】
２段階の３－ＨＰ生産
（１）３－ＨＰ生産菌株の高濃度培養段階
本明細書で提供される３－ＨＰの製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法は、（１）３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株を高濃度培養する段階を含む。
（１）３－ＨＰ生産菌株の高濃度培養段階
本明細書で提供される３－ＨＰの製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法は、（１）３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株を高濃度培養する段階を含む。
【0013】
３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株は、３－ヒドロキシプロピオン酸生産が可能な全ての天然または遺伝子組み換えとなった組み換え微生物の中から選択され得る。一例において、前記微生物は、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば、大腸菌など）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エンテロバクテリア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属からなる微生物から選択され得るが、これに制限されない。一具体例において、３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株は、大腸菌であり得る。
【0014】
３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株は、グリセロール脱水酵素（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）およびアルデヒド脱水素酵素（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）からなる群より選択される一つ以上または前記２種の蛋白質をコードする遺伝子を含むものであり得る。一例において、３－ＨＰ生産菌株は、グリセロール脱水酵素再活性酵素（ＧｄｒＡＢ）をコードする遺伝子（ｇｄｒＡＢ）を追加的に含むことができる。一例において、３－ＨＰ生産菌株は、追加的にビタミンＢ１２を生合成することができる菌株であり得る。
【0015】
グリセロール脱水酵素（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）は、ｄｈａＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｕ３０９０３．１）遺伝子によりコードされるものであり得るが、これに制限されない。ｄｈａＢ遺伝子は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来する酵素であり得るが、これに制限されない。グリセロール脱水酵素をコードする遺伝子は、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２および／またはｄｈａＢ３をコードする遺伝子を含むことができる。グリセロール脱水酵素蛋白質およびこれをコードする遺伝子は、グリセロールを３－ヒドロキシプロパナール（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎａｌ、３－ＨＰＡ）と水（Ｈ２Ｏ）に分解する酵素活性を維持する範囲内で遺伝子および／またはアミノ酸配列の変異を含むことができる。
【0016】
アルデヒド脱水素酵素（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子（ａｌｄＨ）は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５細胞株に由来するａｌｄＨ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｕ０００９６．３；ＥａｌｄＨ）遺伝子、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来するｐｕｕＣ遺伝子、および／またはアゾスピリルム・ブラジレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）由来のＫＧＳＡＤＨ遺伝子であり得るが、これに制限されない。アルデヒド脱水素酵素蛋白質およびこれをコードする遺伝子は、３－ＨＰＡから３－ＨＰを生産するための活性を維持する範囲内で遺伝子および／またはアミノ酸配列の変異を含むことができる。
【0017】
グリセロール脱水酵素再活性酵素（ＧｄｒＡＢ）をコードする遺伝子は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）由来のｇｄｒＡＢ遺伝子であり得る。
【0018】
３－ＨＰ生産菌株は、グリセロール脱水酵素、アルデヒド脱水素酵素、およびグリセロール脱水酵素再活性酵素からなる群より選択される１種以上、２種以上または３種全ての蛋白質をコードする遺伝子を含む組み換えベクターを含むことができる。
【0019】
前記組み換えベクターは、グリセロール脱水酵素、アルデヒド脱水素酵素、およびグリセロール脱水酵素再活性酵素からなる群より選択される１種以上、２種以上または３種全ての蛋白質をコードする遺伝子を細胞内で発現するための目的範囲でプロモーター、調節部位を当業界に知られた方法で置き換えて使用することができる。
【0020】
高濃度培養は、３－ＨＰ生産菌株を大量で確保するための目的範囲で当業界に知られた方法を制限なしに使用して行うことができ、一例において、前記培養は、流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）で行われるものであり得る。
【0021】
一例において流加培養は、ｐＨ－ｓｔａｔ方式、定速（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｅｄｉｎｇ）培養方式、またはこれらの組み合わせで行われ得る。一具現例においてｐＨ－ｓｔａｔ方式の流加培養が行われる場合、葡萄糖が１～５ｇ／Ｌ濃度で添加され得るが、これに制限されない。一具現例において定速培養方式の流加培養が行われる場合、葡萄糖が１０～２０ｇ／Ｌ／ｈ速度で注入され得るが、これに制限されない。
【0022】
一例において、前記高濃度培養時のｐＨは、５～７．５、５～７、５．５～７．５、５．５～７、６～７．５または６．５～６で維持され得るが、これに制限されない。
【0023】
一例において高濃度培養時の炭素源は、高濃度培養のための目的範囲で単糖類、二糖類および／または多糖類を制限なしに選択して使用することができる。例えば、前記炭素源は、葡萄糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、リボース（ｒｉｂｏｓｅ）、蔗糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）、麦芽糖（ｍａｌｔｏｓｅ）、乳糖（ｌａｃｔｏｓｅ）、およびセロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）からなる群より選択される１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、１０種以上、または前記１１種全ての組み合わせであり得る。高濃度培養時に使用される培地は、炭素源としてグリセロールを含まないものであり得る。このように高濃度培養時に使用される培地がグリセロールを含まないことによって高濃度培養段階で３－ＨＰ生産が起こらないこともある。
【0024】
一例において高濃度培養後の細胞濃度は、ＯＤ６００値を基準に、１０以上、３０以上、５０以上、７０以上、１００以上、または１１０以上であり得、例えば、１０以上、５０以上、１００以上、１５０以上、２００以上、２０時間培養時、ＯＤ６００値が１０～５００、１０～４００、１０～３００、１０～２５０、１０～２００、１０～１５０、３０～５００、３０～４００、３０～３００、３０～２５０、３０～２００、３０～１５０、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２５０、５０～２００、５０～１５０、７０～５００、７０～４００、７０～３００、７０～２５０、７０～２００、７０～１５０、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２５０、１００～２００、１００～１５０、１１０～５００、１１０～４００、１１０～３００、１１０～２５０、１１０～２００、または１１０～１５０であり得、例えば、１２０であり得るが、これに制限されない
【0025】
一例において高濃度培養後の細胞濃度は、培地１Ｌ当たりの細胞乾燥重量（ｇ）を基準に、１０～１００ｇ／Ｌ、１０～８０ｇ／Ｌ、１０～５０ｇ／Ｌ、１０～４０ｇ／Ｌ、１０～３５ｇ／Ｌ、１５～１００ｇ／Ｌ、１５～８０ｇ／Ｌ、１５～５０ｇ／Ｌ、１５～４０ｇ／Ｌ、１５～３５ｇ／Ｌ、２０～１００ｇ／Ｌ、２０～８０ｇ／Ｌ、２０～５０ｇ／Ｌ、２０～４０ｇ／Ｌ、２０～３５ｇ／Ｌ、２５～１００ｇ／Ｌ、２５～８０ｇ／Ｌ、２５～５０ｇ／Ｌ、２５～４０ｇ／Ｌ、または２５～３５ｇ／Ｌであり得るが、これに制限されない。
【0026】
（２）３－ＨＰ生産段階
本明細書で提供される３－ＨＰの製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法は、（２）前記高濃度培養された細胞を分離し、３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種および／または培養して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階を含む。
本明細書で提供される３－ＨＰの製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法は、（２）前記高濃度培養された細胞を分離し、３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種および／または培養して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階を含む。
【0027】
高濃度培養された細胞の分離は、細胞を遠心分離する段階、上清液を除去する段階、およびペレット（ｐｅｌｌｅｔ）をバッファーで再懸濁する段階からなる群より選択される一つ以上、二つ以上または前記段階の全てにより行われ得る。一例において前記バッファーは、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）であり得るが、これに制限されない。
【0028】
３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地は、３－ＨＰ生産菌株の追加増殖が起こらないと共に、前記菌株が３－ＨＰを生産することができるようにするための目的範囲で制限なしに使用することができる。
【0029】
一例において、３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地の炭素源は、グリセロールであり得るが、これに制限されない。一例において、前記生産用培地は、ビタミンＢ１２を追加的に含むことができる。３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地は、炭素源として葡萄糖を含まないものであり得る。
【0030】
一例において前記培地は、合成培地（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｄｉａ）または半合成培地（ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｄｉａ）であり得るが、これに制限されない。
【0031】
高濃度培養された細胞の接種は、３－ＨＰ生産の目的範囲で通常の技術者が適切に細胞接種濃度に変更することができる。一例において、接種時の細胞濃度（培地１Ｌ当たりの乾燥細胞重量（Ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ、ＤＣＷ）基準）は、１～２０ｇ／Ｌ、１～１６ｇ／Ｌ、１～１２ｇ／Ｌ、１～９ｇ／Ｌ、２～２０ｇ／Ｌ、２～１６ｇ／Ｌ、２～１２ｇ／Ｌ、２～９ｇ／Ｌ、４～２０ｇ／Ｌ、４～１６ｇ／Ｌ、４～１２ｇ／Ｌ、または４～９ｇ／Ｌであり得るが、これに制限されない。
【0032】
３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階は、３－ＨＰを生産するための目的範囲で当業界に知られた培養方法を制限なしに選択して使用することができ、一例において、前記培養段階は、発酵培養（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）で行われるものであり得る。
【0033】
３－ＨＰ生産段階では、接種された細胞の増殖が起こらないものであり得る。一例において、生産段階の終了時の細胞の数は、生産段階の開始時に接種された細胞の数の１５０％以下、１３０％以下、１００％以下、９０％以下、８０％以下、５０～１５０％、５０～１３０％、５０～１００％、５０～９０％、５０～８０％、７０～１５０％、７０～１３０％、７０～１００％、７０～９０％、または７０～８０％であり得るが、これに制限されない。
【0034】
本明細書で提供される３－ＨＰの製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法の３－ＨＰ収率は、例えば、２９時間培養（３－ＨＰ生産）を基準に、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、または９５％以上であり得るが、これに制限されない。３－ＨＰ収率は、前記（２）段階で培地内のグリセロール使用量（モル数）に対する培地内の３－ＨＰ生産量で計算され得、一例において下記数式１のように計算され得る。
【0035】
［数式１］
収率（ｙｉｅｌｄ、％）＝（最終３－ＨＰ（ｇ））／｛（発酵前グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ｇ））－（発酵後に残ったグリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ｇ））｝
収率（ｙｉｅｌｄ、％）＝（最終３－ＨＰ（ｇ））／｛（発酵前グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ｇ））－（発酵後に残ったグリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ｇ））｝
【0036】
本明細書で提供される３－ＨＰ製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法の３－ＨＰ生産能（１時間および培地１Ｌ当たりの３－ＨＰ生産量（ｇ））は、２．０ｇ／Ｌ／ｈ以上、２．５ｇ／Ｌ／ｈ以上、２．０～３０ｇ／Ｌ／ｈ、２．０～２０ｇ／Ｌ／ｈ、２．０～１０ｇ／Ｌ／ｈ、２．０～５ｇ／Ｌ／ｈ、２．５～３０ｇ／Ｌ／ｈ、２．５～２０ｇ／Ｌ／ｈ、２．５～１０ｇ／Ｌ／ｈ、または２．５～５ｇ／Ｌ／ｈであり得るが、これに制限されない。
【0037】
一具現例において、本発明の２段階３－ＨＰ製造方法で３－ＨＰを製造した結果、生産能は２．９４ｇ／Ｌ／ｈと測定され、これは現在まで文献に報告された数値の中で最も高かった。
【0038】
本明細書で提供される３－ＨＰ製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法の３－ＨＰ生産量は、例えば、２０～３０時間（例えば、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、または３０時間）培養（３－ＨＰ生産）時に培地１Ｌ当たりの３－ＨＰ含有量（ｇ）を基準に、４０ｇ／Ｌ以上、４１ｇ／Ｌ以上、４２ｇ／Ｌ以上、４３ｇ／Ｌ以上、４４ｇ／Ｌ以上、４５ｇ／Ｌ以上、４６ｇ／Ｌ以上、４７ｇ／Ｌ以上、４８ｇ／Ｌ、４９ｇ／Ｌ以上、５０ｇ／Ｌ以上、５１ｇ／Ｌ以上、５２ｇ／Ｌ以上、または５３ｇ／Ｌ以上であり得る（上限値は６０～１０００ｇ／Ｌの中で特別な制限なしに選択され得、例えば、１０００ｇ／Ｌ、５００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇＬ、７０ｇ／Ｌ、または６０ｇ／Ｌであり得るが、これに制限されない）。
【0039】
本発明が提供する３－ＨＰ製造方法および／または３－ＨＰの生産能向上方法は、３－ＨＰ生産による副産物を生産しないものであり得る。副産物は、アセテート（ａｃｅｔａｔｅ）および／または乳酸（ｌａｃｔａｔｅ）であり得る。一例において副産物は、全体培養液内の濃度が１％（ｗ／ｖ）以下、０．５％（ｗ／ｖ）以下、０．１％（ｗ／ｖ）以下、０．０１％（ｗ／ｖ）以下、０．００１％（ｗ／ｖ）以下、０．０００１％（ｗ／ｖ）、または０．００００１％（ｗ／ｖ）以下生産されたり（この時、副産物濃度の下限値は０～０．０００００１（ｗ／ｖ）より選択され得るが、これに制限されるのではない）、０％（ｗ／ｖ）の濃度で生産（副産物が検出可能な濃度で生成されない）され得る。
【0040】
本明細書で提供される２段階３－ＨＰ製造方法は、細胞増殖および３－ＨＰ生産が同時に起こる１段階発酵方式に比べて、３－ＨＰ収率（％）が１．０５倍以上または１．１倍以上高くてもよく、例えば、１．０５～１０倍、１．０５～５倍、１．０５～２倍、１．０５～１．７倍、１．０５～１．５倍、１．０５～１．２倍、１．１～１０倍、１．１～５倍、１．１～２倍、１．１～１．７倍、１．１～１．５倍または１．１～１．２倍高くてもよく、例えば約１．１３倍高くてもよい。
【0041】
本発明が提供する２段階３－ＨＰ製造方法は、前記１段階発酵方式に比べて３－ＨＰ生産能（ｇ／Ｌ／ｈ）が１．１倍以上、１．３倍以上、または１．５倍以上高くてもよく、例えば、１．１～１０倍、１．１～５倍、１．１～３倍、１．１～２．５倍、１．１～２倍、１．３～１０倍、１．３～５倍、１．３～３倍、１．３～２．５倍、１．３～２倍、１．５～１０倍、１．５～５倍、１．５～３倍、１．５～２．５倍、１．５～２倍、１．９～３倍、１．９～２．５倍または１．９～２倍高くてもよく、例えば、約１．９６倍高くてもよい。
【0042】
本発明が提供する２段階３－ＨＰ製造方法は、（２）高濃度培養された細胞を分離し、３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種および／または培養して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階の後に、前記培養液から３－ヒドロキシプロピオン酸を分離、回収、および／または精製する段階を追加的に含むことができる。
【0043】
３－ＨＰを含む培養液
本出願の他の例は、３－ヒドロキシプロピオン酸を高濃度で含む３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株の培養液を提供する。培養液は、細胞（３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株）を含まないかまたは含むものであり得る。前記培養液は、葡萄糖を含まないものであり得る。
本出願の他の例は、３－ヒドロキシプロピオン酸を高濃度で含む３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株の培養液を提供する。培養液は、細胞（３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株）を含まないかまたは含むものであり得る。前記培養液は、葡萄糖を含まないものであり得る。
【0044】
３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株は、先に説明したとおりである。
培養液は、高濃度細胞培養した３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株を３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種して得られた細胞（菌注）を含むかまたは細胞を含まない培養液であり得、３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地および／または培養液は、葡萄糖を含まないものであり得る。高濃度細胞培養は、前記の（１）段階で説明したとおりである。
培養液は、高濃度細胞培養した３－ヒドロキシプロピオン酸生産菌株を３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種して得られた細胞（菌注）を含むかまたは細胞を含まない培養液であり得、３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地および／または培養液は、葡萄糖を含まないものであり得る。高濃度細胞培養は、前記の（１）段階で説明したとおりである。
【0045】
一例において、培養液は、先に説明した（１）段階および（２）段階により得られるものであり得る。
【0046】
培養液は、３－ヒドロキシプロピオン酸の濃度が４１ｇ／Ｌ以上、４２ｇ／Ｌ以上、４３ｇ／Ｌ以上、４４ｇ／Ｌ以上、４５ｇ／Ｌ以上、４６ｇ／Ｌ以上、４７ｇ／Ｌ以上、４８ｇ／Ｌ、４９ｇ／Ｌ以上、５０ｇ／Ｌ以上、５１ｇ／Ｌ以上、５２ｇ／Ｌ以上、または５３ｇ／Ｌ以上であり得る（上限値は６０～１０００ｇ／Ｌの中で特別な制限はなしに選択され得、例えば、１０００ｇ／Ｌ、５００ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、または６０ｇ／Ｌであり得るが、これに制限されない）。前記培養液は、アセテートおよび乳酸からなる群より選択された副産物の濃度が１％（ｗ／ｖ）以下、０．５％（ｗ／ｖ）以下、０．１％（ｗ／ｖ）以下、０．０１％（ｗ／ｖ）以下、０．００１％（ｗ／ｖ）、０．０００１％（ｗ／ｖ）、または０．００００１％（ｗ／ｖ）以下（この時、副産物濃度の下限値は０～０．０００００１（ｗ／ｖ）より選択され得るが、これに制限されない）であるか、または０％（ｗ／ｖ）であり得る。
【0047】
前記培養液は、３－ヒドロキシプロピオン酸生産用途で使用することができる。
【0048】
他の例は、前記培養液を含む３－ヒドロキシプロピオン酸生産用組成物を提供する。
【0049】
他の例は、前記３－ヒドロキシプロピオン酸生産用組成物から３－ヒドロキシプロピオン酸を分離、回収、および／または精製する段階を含む３－ヒドロキシプロピオン酸生産方法を提供する。
【発明の効果】
【0050】
本発明が提供する２段階３－ＨＰ生産方法は、１段階培養に比べて３－ＨＰ生産能と収率が顕著に向上して、－ＨＰの商用化に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0051】
【図1】本発明の一実施例による３－ＨＰ生産菌株の高濃度細胞培養を行った結果、時間の変化に応じたＯＤ変化を示すグラフである。
【図2】本発明の一実施例により高濃度培養された３－ＨＰ生産菌株を３－ＨＰ生産用培地に接種した後（０ｈ）、時間の経過により３－ＨＰ（３ＨＰ）、グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、アセテート（Ａｃｅｔａｔｅ）、および乳酸（Ｌａｃｔａｔｅ）の濃度を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0052】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の権利範囲は下記の実施例により制限されない。
【0053】
本明細書で特別な言及がない限り、温度は全て摂氏温度を基準とし、核酸配列は特別な事情がない限り、５’末端から３’末端方向に記載されている。
【実施例0054】
実施例１．３－ＨＰ生産菌株の高濃度細胞培養
１－１．３－ＨＰ生産菌株の製造
１－１．３－ＨＰ生産菌株の製造
【0055】
グリセロールを基質として使用して３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ、３－ＨＰ）を生産することが知られているグリセロール脱水酵素（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）およびアルデヒド脱水素酵素（Ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子を導入した組み換えベクターを製造した。前記製造された組み換えベクターを大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０菌株に導入して３－ＨＰ生産菌株を製作した。
【0056】
具体的に、グリセロール脱水酵素をコーディングする遺伝子（ｄｈａＢ）、アルデヒド脱水素酵素をコーディングする遺伝子（ａｌｄＨ）およびグリセロール脱水酵素再活性酵素をコーディングする遺伝子（ｇｄｒＡＢ）をプラスミドｐＣＤＦにクローニングして３ＨＰ生産用組み換えベクター（ｐＣＤＦ＿Ｊ２３１０１＿ｄｈａＢ＿ｇｄｒＡＢ＿Ｊ２３１００＿ａｌｄＨ）を製作した。
【0057】
前記組み換えベクターの製作に使用されたｐＣＤＦＤｕｅｔＪ２３ベクターは、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１ベクターのプロモーター部分をＪ２３１０１とＪ２３１００プロモーターに置き換えたベクターである。前記ベクターに挿入されるｄｈａＢ（Ｕ３０９０３．１；約２．７ｋｂ；ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２およびｄｈａＢ３を含む）とｇｄｒＡＢ遺伝子（約２．２ｋｂ；ｇｄｒＡ、ｇｄｒＢ）は、クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ２５９５５）の染色体で、下記表１のプライマーを使用して増幅した。クレブシエラ・ニューモニエの染色体上にｄｈａＢ１２３とｇｄｒＡ遺伝子が並んで位置していて共に増幅し、ｇｄｒＢはｄｈａＢ１２３、ｇｄｒＡと反対方向に位置しているため、ｇｄｒＢだけ別に増幅した。
【0058】
ａｌｄＨ遺伝子は、下記表１の配列番号５および配列番号６の核酸配列からなるプロモーター対を利用してＥ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５菌株の遺伝体から増幅して分離した。下記表１に各遺伝子増幅に使用されたプライマーの核酸配列を表し、名称中の「－Ｆ」は正方向プロモーターを、「－Ｒ」は逆方向プロモーターを意味する。
【0059】
【表1】
【0060】
各遺伝子の増幅後、ｄｈａＢ１２３、ｇｄｒＡ遺伝子は制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩを、ｇｄｒＢ遺伝子は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＡｆｌＩＩを利用して前記ｐＣＤＦＤｕｅｔａＪ２３ベクターのＪ２３１０１プロモーターの下流にクローニングした。ａｌｄＨは、制限酵素ＫｐｎＩとＮｄｅＩを利用してＪ２３１０８プロモーターの下にクローニングした。各遺伝子のクローニング方法は、当業界に知られた方法で行われた。
前記プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＫＣＣＭ ４０２１９）に電気穿孔法で導入して、３ＨＰ生産菌株を製造した。
前記プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＫＣＣＭ ４０２１９）に電気穿孔法で導入して、３ＨＰ生産菌株を製造した。
【0061】
１－２．細胞の高濃度培養
前記製造された３－ＨＰ生産菌株は、流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）方法で、５Ｌ発酵機（Ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ ２Ｌ）で高濃度細胞培養を行った。
前記製造された３－ＨＰ生産菌株は、流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）方法で、５Ｌ発酵機（Ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ ２Ｌ）で高濃度細胞培養を行った。
【0062】
具体的に、ＭＲ培地（１Ｌ当たりのＫＨ２ＰＯ４ ６．６７ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８ｇ、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）０．８ｇ、およびトレースメタル溶液（ｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）５ｍＬ；ここで、トレースメタル溶液（ｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は１Ｌ当たりの５Ｍ ＨＣｌ ５ｍＬ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ２ ２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２・４Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、およびＮａ２Ｂ４Ｏ２・１０Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ）に葡萄糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ）２０ｇ／Ｌ、選別のための抗生剤（ストレプトマイシン）２５ｍｇ／Ｌを添加して細胞培養培地として使用し、摂氏３５度の温度を維持した。ｐＨはアンモニア水を利用して６．９５に維持し、溶存酸素量（ＤＯ）は攪拌速度を段階的に９００ｒｐｍまで高めながら２０％を維持し、通気量（ａｅｒａｔｉｏｎ）は１ｖｖｍを維持した。
【0063】
流加培養は、ｐＨ－ｓｔａｔ ｆｅｅｄｉｎｇ方式を利用し、葡萄糖を３ｇ／Ｌで添加した。
【0064】
培養時間の経過によりＵＶ－スペクトロメーター（ＵＶ－Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を利用して吸光度（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ、ＯＤ）を測定して細胞濃度を測定した。図１に時間経過によるＯＤ６００数値の変化グラフを示した。培養開始後２０時間目にＯＤ６００は約１２０（乾燥細胞重量３０ｇ／Ｌ）を示した。
【0065】
前記２０時間の高濃度細胞培養を終えた後、細胞培養液を、６，０００ｒｐｍ、摂氏４度で１０分間遠心分離して細胞を回収した。回収された細胞はＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で懸濁して以降の段階に使用した。
【0066】
実施例２．３－ＨＰ生産段階
３－ＨＰ生産用培地は、葡萄糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ）を含まないＭ９培地にグリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）７０ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２ ５０マイクロＭを添加して準備した。３－ＨＰ生産用培地に前記実施例１－２で準備した細胞懸濁液を細胞接種量５ｇ／Ｌ（乾燥細胞重量基準）になるように接種し、５Ｌ発酵機（Ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ ２Ｌ）で３－ＨＰ生産段階を行った。
３－ＨＰ生産用培地は、葡萄糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ）を含まないＭ９培地にグリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）７０ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２ ５０マイクロＭを添加して準備した。３－ＨＰ生産用培地に前記実施例１－２で準備した細胞懸濁液を細胞接種量５ｇ／Ｌ（乾燥細胞重量基準）になるように接種し、５Ｌ発酵機（Ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ ２Ｌ）で３－ＨＰ生産段階を行った。
【0067】
３－ＨＰ生産のための培養条件は、温度摂氏３５℃、攪拌速度３００ｒｐｍ、通気量（ａｅｒａｔｉｏｎ）は１ｖｖｍを維持し、Ｃａ（ＯＨ）２を利用してｐＨを７．０に維持した。
【0068】
前記３－ＨＰ生産過程で時間の経過による３－ＨＰ、グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、アセテート（ａｃｅｔａｔｅ）、および乳酸（ｌａｃｔａｔｅ）の濃度を高圧液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＨＰＬＣ）で測定して、その結果を下記表２および図２に示した。表２は３－ＨＰ生産用培養段階（２段階培養）で接種後、発酵時間の経過に応じた３－ＨＰ、グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、アセテート（Ａｃｅｔａｔｅ）、および乳酸（Ｌａｃｔａｔｅ）の濃度（ｇ／Ｌ）を測定した結果である。
【0069】
【表2】
【0070】
図２で確認されるように、３－ＨＰ生産用培地に菌株接種後、１７時間経過時に３－ＨＰ濃度が５０．０ｇ／Ｌ以上であることが示され、生産能は２．９４ｇ／Ｌ／ｈであること確認されて、現在まで文献に報告された数値の中で最も高い３－ＨＰ生産能が確認された。
【0071】
接種後２９時間が経過した時、最終３－ＨＰ濃度は５３．３ｇ／Ｌであることが確認され、収率（ｙｉｅｌｄ）は約９５．７％という非常に優れた収率と３－ＨＰ生産能を示した一方で、３－ＨＰ生産による副産物である乳酸とアセテートは２９時間が経過するまでほとんど生成されなかった。
【0072】
比較例１．１段階３－ＨＰ生産方式と比較
本出願で提供される葡萄糖を含まない３－ＨＰ生産用培地を使用する２段階生産方式の３－ＨＰ生産能を既存の１段階生産方式と比較するために、前記実施例１－１で製造された３－ＨＰ生産菌株を流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）方法で培養し、培養培地に細胞成長に必要な葡萄糖と基質であるグリセロールを同時に添加して細胞増殖と３－ＨＰ生産を同時に進行した（１段階生産方式）。
本出願で提供される葡萄糖を含まない３－ＨＰ生産用培地を使用する２段階生産方式の３－ＨＰ生産能を既存の１段階生産方式と比較するために、前記実施例１－１で製造された３－ＨＰ生産菌株を流加培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）方法で培養し、培養培地に細胞成長に必要な葡萄糖と基質であるグリセロールを同時に添加して細胞増殖と３－ＨＰ生産を同時に進行した（１段階生産方式）。
【0073】
比較のために行われた１段階生産過程を、以下でより具体的に説明する。培養培地は、実施例１－２のＭＲ培地に葡萄糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ）２０ｇ／Ｌおよび選別のための抗生剤（ストレプトマイシン、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを添加して使用し、摂氏３５度の温度を維持した。ｐＨはアンモニア水を利用して６．９５に維持し、溶存酸素量（ＤＯ）は攪拌速度を段階的に９００ｒｐｍまで高めながら２０％を維持し、通気量（ａｅｒａｔｉｏｎ）は１ｖｖｍを維持した。
【0074】
培養培地内の初期に添加された葡萄糖が全て消耗すると定速（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｅｄｉｎｇ）培養方式で葡萄糖を３ｇ／Ｌを添加し、グリセロールを培養後２０時間後に７０ｇ／Ｌで添加した。以降の過程は実施例２と同一に行った。
【0075】
前記３－ＨＰ生産過程を通じて製造された３－ＨＰ収率および生産能を、高圧液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＨＰＬＣ）で測定した。このように得られた３－ＨＰ収率および生産能の結果を、実施例１および２を実施した２段階３－ＨＰ生産過程を通じた３－ＨＰ収率および生産能と比較して、下記表３に示した。
【0076】
【表3】
【0077】
前記表３で確認されるように２段階３－ＨＰ生産方式が既存の１段階生産方式に比べて３－ＨＰ収率および生産能に優れている。また、２段階３－ＨＰ生産方式では１段階生産方式とは異なり、副産物であるアセテート（ａｃｅｔａｔｅ）および乳酸（ｌａｃｔａｔｅ）が生産されないことから、３－ＨＰの２段階生産方式が優れていることを確認した。
【図1】
【図2】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）生産菌株を高濃度細胞培養する段階；および
（２）前記高濃度培養された細胞を分離して３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階；を含み、
前記（２）段階は、細胞の増殖が行われないものである、
３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）の製造方法。
（２）前記高濃度培養された細胞を分離して３－ヒドロキシプロピオン酸生産用培地に接種して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する段階；を含み、
前記（２）段階は、細胞の増殖が行われないものである、
３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３－ＨＰ）の製造方法。
【外国語明細書】