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特開2024-169303耐アルカリ性の向上したアデノ随伴ウイルス結合性タンパク質
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024169303
(43)【公開日】2024-12-05
(54)【発明の名称】耐アルカリ性の向上したアデノ随伴ウイルス結合性タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20241128BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20241128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241128BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241128BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241128BHJP
C07K 17/00 20060101ALI20241128BHJP
C12N 7/02 20060101ALI20241128BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/705 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12P21/02
C07K17/00
C12N7/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024026427
(22)【出願日】2024-02-26
(31)【優先権主張番号】P 2023084423
(32)【優先日】2023-05-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】竹村 俊晃
(72)【発明者】
【氏名】栗原 健人
(72)【発明者】
【氏名】眞鍋（牧野） 友理子
(72)【発明者】
【氏名】岩渕 圭篤
(72)【発明者】
【氏名】田中 亨
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA13
4B065AA26X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC01
4B065BD14
4B065CA24
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA60
4H045CA40
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】 耐アルカリ性が向上した、改良アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク
質を提供すること。
【解決の手段】 ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外
領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する領域中の特定位置
にあるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、前記課題を解決する。
【選択図】 図１
質を提供すること。
【解決の手段】 ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外
領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する領域中の特定位置
にあるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、前記課題を解決する。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるＡＡＶ結合性タンパク質：
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目
までのアミノ酸残基において以下の（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つの
アミノ酸置換が生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（１）配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２）配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（２）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列において、前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目
までのアミノ酸残基において以下の（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つの
アミノ酸置換が生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（１）配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２）配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（２）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列において、前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
【請求項2】
さらに以下の（３）に示すアミノ酸置換が少なくとも生じた、請求項１に記載のＡＡＶ結合性タンパク質；
（３）配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換
（３）配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換
【請求項3】
配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において、以下の（Ａ）から（Ｄ）に示すいずれかのアミノ酸置換が少なくとも生じ、かつＡＡＶ結合活性を有する、請求項２に記載のＡＡＶ結合性タンパク質；
（Ａ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、かつ配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換
（Ｂ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換
（Ｃ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換
（Ｄ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換。
（Ａ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、かつ配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換
（Ｂ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換
（Ｃ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換
（Ｄ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換。
【請求項4】
請求項１から３のいずれかに記載のＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項5】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項6】
請求項５に記載の発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項7】
請求項６に記載の形質転換体を培養することによりＡＡＶ結合性タンパク質を発現させる工程と、得られた培養物から発現されたＡＡＶ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、ＡＡＶ結合性タンパク質の製造方法。
【請求項8】
不溶性担体と、当該担体に固定化した請求項１から３のいずれかに記載のＡＡＶ結合性タンパク質とを含む、ＡＡＶ吸着剤。
【請求項9】
請求項８に記載のＡＡＶ吸着剤を含むカラム。
【請求項10】
請求項９に記載のカラムにＡＡＶを含む溶液を添加して当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、ＡＡＶの精製または分析方法。
【請求項11】
ＡＡＶを溶出させる工程後のＡＡＶ吸着剤をアルカリ溶液により洗浄する工程をさらに含む、請求項１０に記載のＡＡＶの精製または分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）に結合性を有するタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、耐アルカリ性の向上した、改良ＡＡＶ結合性タンパク質に関する。
【背景技術】
【0002】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に分類される非エンベロープウイルスである。ＡＡＶ外殻粒子は３種類のタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）で構成されており、約６０のタンパク質分子がおよそＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３＝１：１：１０の比率で混在し集合することで、直径２０ｎｍから３０ｎｍの正二十面体の形状をしている。
【0003】
自然界でのＡＡＶは自立性の増殖能を欠き、複製はアデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスに依存する。前記ヘルパーウイルスが存在すると、ＡＡＶゲノムは宿主細胞内で複製され、ＡＡＶゲノムを含む完全なＡＡＶ粒子が形成され、宿主細胞からＡＡＶ粒子が放出される。一方、前記ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶゲノムはエピソームに維持された状態または宿主染色体に組込まれた状態（潜伏状態）となる。
【0004】
ＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞などの分化を終えた非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること、などから、先天性遺伝子疾患の治療を目的とした遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が注目されている。
【0005】
遺伝子組換えＡＡＶベクター（以下、単に「ＡＡＶベクター」とも表記）の製造は、通常、ＡＡＶ粒子形成に必須な要素をコードする核酸を細胞に導入することで、ＡＡＶを産生する能力を有する細胞（以下、ＡＡＶ産生細胞とも表記）を作製し、当該細胞を培養してＡＡＶ粒子形成に必須な要素を発現させることで行なう。製造したＡＡＶベクターはＡＡＶ産生細胞から回収精製し、治療用ＡＡＶベクター製剤を得る。
【0006】
ＡＡＶ産生細胞からＡＡＶベクターを回収精製する方法として、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質とを含む吸着剤を用いた、ＡＡＶとの結合親和性に基づくアフィニティークロマトグラフィによる方法があり、夾雑物質が共存したＡＡＶベクターを含む溶液から当該ベクターを回収精製できる。具体例として、特許文献１には、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）を含み、ただしこれらドメイン中の特定位置にあるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで、熱、酸およびアルカリに対する安定性が向上したポリペプチドを、不溶性担体に固定化するＡＡＶ結合性タンパク質（以下、単に「リガンドタンパク質」とも表記）として用いることで、ＡＡＶベクターの高純度な精製を実現している。
【0007】
一方で、上記吸着剤を精製用途として用いる場合、ＡＡＶ精製後は通常、残存したＡＡＶや夾雑物質を高濃度（例えば０．１Ｍ以上０．５Ｍ以下）の水酸化ナトリウム水溶液を使用してアルカリ洗浄する。したがって、当該アルカリ洗浄に耐えうるリガンドタンパク質の創製が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】ＷＯ２０２１／１０６８８２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
前述した通り、ＷＯ２０２１／１０６８８２号でリガンドタンパク質として用いたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質は、天然型（アミノ酸置換がないＡＡＶ結合性タンパク質）よりも熱、酸およびアルカリに対する安定性が向上している。一方で、前記公報で開示のＡＡＶ結合性タンパク質よりもアルカリ洗浄に耐えうるリガンドタンパク質が求められた。
【0010】
つまり本発明の課題は、前記公報で開示のＡＡＶ結合性タンパク質よりも耐アルカリ性の向上したＡＡＶ結合性タンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を構成するアミノ酸残基のうち特定の残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、耐アルカリ性が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
すなわち、本願発明は以下の［１］から［１１］の態様を包含する。
【0013】
［１］以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるＡＡＶ結合性タンパク質：
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目
までのアミノ酸残基において以下の（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つの
アミノ酸置換が生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（１）配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２）配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（２）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列において、前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目
までのアミノ酸残基において以下の（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つの
アミノ酸置換が生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（１）配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２）配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（２）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列において、前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
【0014】
［２］さらに以下の（３）に示すアミノ酸置換が少なくとも生じた、［１］に記載のＡＡＶ結合性タンパク質；
（３）配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換
［３］配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において、以下の（Ａ）から（Ｄ）に示すいずれかのアミノ酸置換が少なくとも生じ、かつＡＡＶ結合活性を有する、［１］または［２］に記載のＡＡＶ結合性タンパク質；
（Ａ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、かつ配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換
（Ｂ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換
（Ｃ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換
（Ｄ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換。
（３）配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換
［３］配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において、以下の（Ａ）から（Ｄ）に示すいずれかのアミノ酸置換が少なくとも生じ、かつＡＡＶ結合活性を有する、［１］または［２］に記載のＡＡＶ結合性タンパク質；
（Ａ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、かつ配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換
（Ｂ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換
（Ｃ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換
（Ｄ）配列番号２の４２番目のアスパラギンがリジンに置換し、配列番号２の７９番目のイソロイシンがフェニルアラニンに置換し、配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換し、配列番号２の１０７番目のバリンがアラニンに置換し、配列番号２の１１４番目のグルタミン酸がグリシンに置換し、配列番号２の１３９番目のスレオニンがアラニンに置換し、配列番号２の１６８番目のリジンがアルギニンに置換し、配列番号２の１７４番目のアラニンがプロリンに置換し、配列番号２の１８０番目のグルタミンがアスパラギンに置換し、配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換し、かつ配列番号２の２１０番目のリジンがグルタミン酸に置換。
【0015】
［４］［１］から［３］のいずれかに記載のＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0016】
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【0017】
［６］［５］に記載の発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体。
【0018】
［７］［６］に記載の形質転換体を培養することによりＡＡＶ結合性タンパク質を発現させる工程と、得られた培養物から発現されたＡＡＶ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、ＡＡＶ結合性タンパク質の製造方法。
【0019】
［８］不溶性担体と、当該担体に固定化した［１］から［３］のいずれかに記載のＡＡＶ結合性タンパク質とを含む、ＡＡＶ吸着剤。
【0020】
［９］［８］に記載のＡＡＶ吸着剤を含むカラム。
【0021】
［１０］［９］に記載のカラムにＡＡＶを含む溶液を添加して当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、ＡＡＶの精製または分析方法。
【0022】
［１１］ＡＡＶを溶出させる工程後のＡＡＶ吸着剤をアルカリ溶液により洗浄する工程をさらに含む、［１０］に記載のＡＡＶの精製または分析方法。
【発明の効果】
【0023】
本発明のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質は、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する領域中の特定位置におけるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したタンパク質である。本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、従来のＡＡＶ結合性タンパク質よりも耐アルカリ性が著しく向上している。したがって、ＡＡＶ結合性タンパク質をリガンドとしたＡＡＶの吸着剤は、アルカリ洗浄が可能であり、ＡＡＶの精製に繰返し利用可能であるため、ＡＡＶの工業的製造に有用である。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】ＡＶＲ２７ａ固定化ゲルおよびＰＯＲＯＳ ＡＡＶＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を２４時間アルカリ溶液に浸漬した後、ＡＡＶ８を補捉し、酸性下で溶出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下に、本発明について詳細に説明する。
【0026】
本明細書においてＡＡＶ結合性タンパク質とは、天然型ＡＡＶ結合性タンパク質である配列番号１に記載のＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）のアミノ酸配列のうち、細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する領域である３１２番目のセリン（Ｓ）から５００番目のアスパラギン酸（Ｄ）までのアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質であり、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において特定位置にあるアミノ酸置換が生じたタンパク質である。
【0027】
詳細には、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるＡＡＶ結合性タンパク質であってよい。
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目
までのアミノ酸残基において以下の（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つの
アミノ酸置換が生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（１）配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２）配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（２）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列において、前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目
までのアミノ酸残基において以下の（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つの
アミノ酸置換が生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（１）配列番号２の１０２番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２）配列番号２の１９３番目のバリンがスレオニンに置換
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じており、さらに前記（１）から（２）に示すアミノ酸置換以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上さらに生じ、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列において、前記（１）から（２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列全体に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
【0028】
前記（ｉｉ）において、「１もしくは数個」とは、ＡＡＶ結合性タンパク質の立体構造におけるアミノ酸置換の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、一例として、１から５０個、１から４０個、１から３０個、１から２５個、１から２０個、１から１５個、１から１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、１から３個、１から２個、１個のいずれかを意味する。
【0029】
前記（ｉｉ）に記載の置換、欠失、挿入、または付加の例として、ＷＯ２０２１／１０６８８２号およびＷＯ２０２３／１４０１９７号で開示しているアミノ酸残基の置換があげられる。
【0030】
なお前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換」には、前述した特定位置におけるアミノ酸置換の他に、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が生じてもよい。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとスレオニン間、またはグルタミン酸とアスパラギン酸間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。また前記アミノ酸置換の別の例としては、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を単量体化させるための置換があげられる。具体的には、高次構造を構成しやすいシステイン残基をセリン残基またはメチオニン残基とするアミノ酸置換があげられる。
【0031】
また前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加」には、ＡＡＶ結合性タンパク質の由来の違いや、種の違いなどに基づく、天然にも存在する変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【0032】
前記（ｉｉｉ）におけるアミノ酸配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は７０％以上あればよく、それ以上の同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。「アミノ酸配列の同一性」とは、アミノ酸配列全体に対する同一性を意味する。アミノ酸配列間の「同一性」とは、それらアミノ酸配列におけるアミノ酸の種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学，３１（３），羊土社）。アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。
【0033】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、前記タンパク質のＣ末端側にある他の細胞外領域ドメイン（ドメイン３（ＰＫＤ３）、ドメイン４（ＰＫＤ４）およびドメイン５（ＰＫＤ５））の全てまたは一部を含んでもよいし、ＰＫＤ１のＮ末端側にあるＭＡＮＳＣ（Ｍｏｔｉｆ Ａｔ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｖｅｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ）ドメインなどのシグナル配列やシステインリッチな領域の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＮ端側および／またはＣ末端側にある膜貫通領域ならびに細胞内領域の全てまたは一部を含んでもよい。
【0034】
前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、
Ｖ３１７Ｄ（この表記は、配列番号１の３１７番目のバリンがアスパラギン酸に置換されていることを表す、以下同様）、Ｎ３２４Ｈ、Ｖ３２６Ａ、Ａ３３０Ｖ、Ｑ３３４Ｌ、Ｅ３３５Ｖ、Ｔ３４１Ａ、Ｙ３４２Ｓ、Ｋ３６２Ｅ、Ｋ３７１Ｎ、Ｆ３７９Ｙ、Ｋ３８０Ｒ、Ｖ３８１Ａ、Ｉ３８２Ｖ、Ｇ３９０Ｓ、Ｋ３９９Ｅ、Ｓ４７６Ｒ、Ｓ４８２Ｔ、Ｎ４８７Ｄ、およびＮ４９２Ｄのアミノ酸置換を少なくとも含み、かつＨ３８９ＹおよびＶ４８０Ｔのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じていると、アルカリに対する安定性が向上するため好ましい。さらにＨ３８９Ｙおよび／またはＶ４８０Ｔのアミノ酸置換に、Ｋ（Ｑ）４６７Ｎ（この表記は、配列番号１の４６７番目のリジンが配列番号２で一旦グルタミンに置換された後、さらにアスパラギンに置換されていることを表す、以下同様）のアミノ酸置換が生じていると、熱およびアルカリに対する安定性がさらに向上するためより好ましい。
Ｖ３１７Ｄ（この表記は、配列番号１の３１７番目のバリンがアスパラギン酸に置換されていることを表す、以下同様）、Ｎ３２４Ｈ、Ｖ３２６Ａ、Ａ３３０Ｖ、Ｑ３３４Ｌ、Ｅ３３５Ｖ、Ｔ３４１Ａ、Ｙ３４２Ｓ、Ｋ３６２Ｅ、Ｋ３７１Ｎ、Ｆ３７９Ｙ、Ｋ３８０Ｒ、Ｖ３８１Ａ、Ｉ３８２Ｖ、Ｇ３９０Ｓ、Ｋ３９９Ｅ、Ｓ４７６Ｒ、Ｓ４８２Ｔ、Ｎ４８７Ｄ、およびＮ４９２Ｄのアミノ酸置換を少なくとも含み、かつＨ３８９ＹおよびＶ４８０Ｔのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じていると、アルカリに対する安定性が向上するため好ましい。さらにＨ３８９Ｙおよび／またはＶ４８０Ｔのアミノ酸置換に、Ｋ（Ｑ）４６７Ｎ（この表記は、配列番号１の４６７番目のリジンが配列番号２で一旦グルタミンに置換された後、さらにアスパラギンに置換されていることを表す、以下同様）のアミノ酸置換が生じていると、熱およびアルカリに対する安定性がさらに向上するためより好ましい。
【0035】
なお配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基からなり、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、Ｖ３１７Ｄ、Ｎ３２４Ｈ、Ｖ３２６Ａ、Ａ３３０Ｖ、Ｑ３３４Ｌ、Ｅ３３５Ｖ、Ｔ３４１Ａ、Ｙ３４２Ｓ、Ｋ３６２Ｅ、Ｋ３７１Ｎ、Ｆ３７９Ｙ、Ｋ３８０Ｒ、Ｖ３８１Ａ、Ｉ３８２Ｖ、Ｇ３９０Ｓ、Ｋ３９９Ｅ、Ｋ４６７Ｑ、Ｓ４７６Ｒ、Ｓ４８２Ｔ、Ｎ４８７Ｄ、およびＮ４９２Ｄのアミノ酸置換が生じたＡＡＶ結合性タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基からなるＡＡＶ結合性タンパク質と同義である。また配列番号２におけるアミノ酸残基の位置は、配列番号１におけるアミノ酸残基の位置から２８７差し引いた位置に相当する。具体的にはＨ３８９Ｙのアミノ酸置換は配列番号２では１０２番目に位置するアミノ酸残基の置換に相当し、Ｖ４８０Ｔのアミノ酸置換は配列番号２では１９３番目に位置するアミノ酸残基の置換に相当する。
【0036】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質において、置換するアミノ酸の数に特に制限はない。一例として、以下の（Ａ）から（Ｄ）に示すＡＡＶ結合性タンパク質があげられる。これらのＡＡＶ結合性タンパク質はアルカリに対する安定性が向上する点でより好ましい。
【0037】
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、かつ当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において、Ｎ３２９Ｋ（この表記は、配列番号１の３２９番目（配列番号２では４２番目）のアスパラギンがリジンに置換されていることを示す、以下同様）、Ｈ３８９Ｙ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６Ａ、Ａ４６１Ｐ、Ｋ（Ｑ）４６７ＮおよびＶ４８０Ｔのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
【0038】
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、かつ当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において、Ｎ３２９Ｋ、Ｉ３６６Ｆ、Ｖ３９４Ａ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６Ａ、Ｋ４５５Ｒ、Ａ４６１Ｐ、Ｋ（Ｑ）４６７Ｎ、Ｖ４８０ＴおよびＫ４９７Ｅのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
【0039】
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、かつ当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において、Ｎ３２９Ｋ、Ｉ３６６Ｆ、Ｈ３８９Ｙ、Ｖ３９４Ａ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６Ａ、Ｋ４５５Ｒ、Ａ４６１Ｐ、Ｋ（Ｑ）４６７ＮおよびＫ４９７Ｅのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
【0040】
（Ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を含み、かつ当該２５番目から２１３番目までのアミノ酸残基において、Ｎ３２９Ｋ、Ｉ３６６Ｆ、Ｈ３８９Ｙ、Ｖ３９４Ａ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６Ａ、Ｋ４５５Ｒ、Ａ４６１Ｐ、Ｋ（Ｑ）４６７Ｎ、Ｖ４８０ＴおよびＫ４９７Ｅのアミノ酸置換が少なくとも生じたＡＡＶ結合性タンパク質。
【0041】
また、本発明のタンパク質は、以下の（ｉｖ）から（ｖｉ）のいずれかから選択されるＡＡＶ結合性タンパク質であってもよい。
（ｉｖ）配列番号２９、３２、３３、３８、４３、４４または４５に記載のアミノ酸配列を少なくとも含む、ＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｖ）配列番号２９、３２、３３、３８、４３、４４または４５に記載のアミノ酸配列であって、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上を含むアミノ酸配列であり、ただし、特定の変異が維持された、アミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（ｖｉ）配列番号２９、３２、３３、３８、４３、４４または４５に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし、特定の変異が維持された、アミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｉｖ）配列番号２９、３２、３３、３８、４３、４４または４５に記載のアミノ酸配列を少なくとも含む、ＡＡＶ結合性タンパク質。
（ｖ）配列番号２９、３２、３３、３８、４３、４４または４５に記載のアミノ酸配列であって、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上を含むアミノ酸配列であり、ただし、特定の変異が維持された、アミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質；
（ｖｉ）配列番号２９、３２、３３、３８、４３、４４または４５に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし、特定の変異が維持された、アミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するＡＡＶ結合性タンパク質。
【0042】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＡＡＶ結合性タンパク質をクロマトグラフィ用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。
【0043】
ＡＡＶ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のＡＡＶ結合性や安定性を損なわない限り特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＡＡＶ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＡＡＶ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。
【0044】
さらに本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主として用いる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。前記シグナルペプチドとしては、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ，ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示できる（特開２０１１－０９７８９８号公報）。なおＮ末端側へのシグナルペプチドの付加は行なわなくても良い。このことにより、タンパク質調製の際、タンパク質の均質性が向上する点で好ましい。
【0045】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」とも表記）の作製方法の一例として、
（Ｉ）本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）ＡＡＶ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＡＡＶ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
（Ｉ）本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）ＡＡＶ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＡＡＶ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
【0046】
前記（Ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主である大腸菌におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。具体的には、アルギニン（Ｒ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
【0047】
本発明のポリヌクレオチドへ変異を導入する場合、エラープローンＰＣＲ法が利用できる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ２を０．０１ｍＭ以上１０ｍＭ以下（好ましくは０．１ｍＭ以上１ｍＭ以下）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入できる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、ＡＡＶ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。
【0048】
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主である大腸菌を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主（大腸菌）内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクターを例示できる。
【0049】
また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータがあげられる。
【0050】
前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクター（以下、単に「本発明の発現ベクター」とも表記）を用いて宿主である大腸菌を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。具体的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），２５６，１９９２等の公知の文献に記載の方法により形質転換すればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、単に「本発明の形質転換体」とも表記）を取得できる。
【0051】
本発明の形質転換体から、本発明の発現ベクターを調製するには、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。
【0052】
本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を回収することで、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を製造できる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。
【0053】
本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主（大腸菌）の培養に適した培地で培養すればよく、好ましい培地の一例として、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地があげられる。なお、本発明のベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。
【0054】
また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。培養温度は一般に１０℃以上４０℃以下、好ましくは２０℃以上３７℃以下、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは、ｐＨ６．８以上ｐＨ７．４以下、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。
【0055】
誘導剤としてはＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示できる。培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、概ね０．５以上１．０以下となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、ＡＡＶ結合性タンパク質の発現を誘導できる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲から適宜選択すればよいが、０．０１ｍＭ以上０．５ｍＭ以下の範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【0056】
本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を回収するには、本発明の形質転換体における本発明のＡＡＶ結合性タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕して本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を抽出した後、精製すればよい。
【0057】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィには、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ等があり、これらのクロマトグラフィを組み合わせて精製操作を行なうことで、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質を高純度に調製できる。
【0058】
得られた本発明のＡＡＶ結合性タンパク質のＡＡＶに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＡＡＶに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ法（以下、ＥＬＩＳＡ法と表記）や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＡＡＶとしてはＡＡＶベクターでもＶＬＰ（ウイルス様粒子）でもよい。また、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質に対し結合活性を示せば、どのセロタイプ（血清型）のＡＡＶベクターおよびＶＬＰを使用してもよい。
【0059】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、例えば、ＡＡＶの精製または分析に使用できる。当該目的で使用した場合、結合するＡＡＶの限定は特になく、自然界に存在するＡＡＶであってもよいし、人工的に作製されたＡＡＶでもよい。自然界に存在するＡＡＶの例として、血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型１０（ＡＡＶ１０）、血清型１１（ＡＡＶ１１）、血清型１２（ＡＡＶ１２）、血清型１３（ＡＡＶ１３）があげられる。また人工的に作製されたＡＡＶとしては、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０や、これら血清型のうち二以上の特徴（細胞指向性や感染能）を有したキメラＡＡＶがあげられる。
【0060】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、例えば、不溶性担体に固定化して使用できる。すなわち、ＡＡＶの精製または分析は、具体的には、例えば、不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化された本発明のＡＡＶ結合性タンパク質とを含む、ＡＡＶ吸着剤を用いて実施できる。本明細書では、不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化された本発明のＡＡＶ結合性タンパク質とを含むＡＡＶ吸着剤を、本発明のＡＡＶ吸着剤ともいう。なおＡＡＶの精製とは、夾雑物質共存化の溶液からＡＡＶの精製に限らず、構造、性質または活性等に基づくＡＡＶの精製も含まれる。不溶性担体の素材、形状等に限定はなく、一例としてＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示の不溶性担体があげられる。また不溶性担体は多孔性であってもよく、非多孔性であってもよい。
【0061】
本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、例えば、共有結合を介して不溶性担体に固定化できる。本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は、具体的には、例えば、不溶性担体が有する活性基を介して本発明のＡＡＶ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで、不溶性担体に固定化できる。本発明のＡＡＶ結合性タンパク質の不溶性担体への固定化は、例えば、ＷＯ２０２１／１０６８８２号での開示内容に基づき実施すればよい。
【0062】
本発明のＡＡＶ吸着剤は、例えば、カラムに充填してＡＡＶの精製や分析に使用できる。具体的には、例えば、本発明のＡＡＶ吸着剤を充填したカラム（以下、単に「本発明のカラム」とも表記）にＡＡＶを含む溶液を添加して当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させ、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出させることで、ＡＡＶの精製や分析ができる。すなわち、本発明は、例えば、本発明のカラムにＡＡＶを含む溶液を添加して当該ＡＡＶを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着したＡＡＶを溶出させる工程とを含む、ＡＡＶの精製または分析方法を提供する。本発明のカラムを用いたＡＡＶの精製は、例えば、ＷＯ２０２１／１０６８８２号での開示内容に基づき実施すればよい。
【0063】
本発明のＡＡＶ吸着剤を用いてＡＡＶの精製を実施することで、例えば、精製されたＡＡＶが得られる。すなわち、ＡＡＶの精製方法は、一態様において、ＡＡＶの製造方法であってよく、具体的には、精製されたＡＡＶの製造方法であってよい。ＡＡＶは、例えば、ＡＡＶを含む溶出画分として得られる。すなわち、溶出されたＡＡＶを含む画分を分取できる。ＡＡＶ画分の分取は、例えば、常法で行なえる。ＡＡＶ画分を分取する方法としては、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等画分の分取をする方法が挙げられる。さらに、ＡＡＶを含む画分からＡＡＶを回収することもできる。ＡＡＶを含む画分からのＡＡＶの回収は、例えば、タンパク質の精製に用いられる公知の方法で行なえる。
【0064】
本発明のＡＡＶ吸着剤を用いてアルカリ洗浄を実施することで、例えば残存していたＡＡＶや夾雑物の混入を防ぐことができる。すなわち、ＡＡＶの洗浄方法は、一態様において、ＡＡＶの洗浄方法であってよく、具体的には、精製後のアルカリ洗浄方法であってよい。また本発明のＡＡＶ結合性タンパク質は耐酸性も有しているため、ｐＨの低い溶液で洗浄したのち、アルカリ洗浄する方法であってもよい。使用される洗浄用のアルカリ溶液の例としては、０．１Ｍ以上０．５Ｍ以下の水酸化ナトリウム水溶液があげられる。
【実施例0065】
以下、実施例および参考例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものでない。なお参考例は本発明を構成しない。
【0066】
実施例１ ＶＬＰ２の調製
（１）ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）のカプシドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＲＣ２－ｍｉ３４２ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）およびｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む２×ＹＴ培地（１．６％（ｗ／ｖ）のＴｒｙｐｔｏｎｅ、１％（ｗ／ｖ）のＹｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム）１Ｌが入った、５Ｌバッフルフラスコにて、３７℃で一晩振とう培養した。
（１）ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）のカプシドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＲＣ２－ｍｉ３４２ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）およびｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む２×ＹＴ培地（１．６％（ｗ／ｖ）のＴｒｙｐｔｏｎｅ、１％（ｗ／ｖ）のＹｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム）１Ｌが入った、５Ｌバッフルフラスコにて、３７℃で一晩振とう培養した。
【0067】
（２）（１）の培養液を遠心することで菌体を回収後、当該回収菌体からＰｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２ ＶｅｃｔｏｒおよびｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒを大量に調製した。
【0068】
（３）１０％（ｖ／ｖ）のウシ血清を含んだＤ－ＭＥＭ培地（富士フイルム和光純薬社製）４０ｍＬが入ったＴ－２２５フラスコ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）５枚でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。
【0069】
（４）ＴｒａｎｓＩＴ－ＶｉｒｕＧＥＮ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を用いて、（２）で調製したｐＲＣ２－ｍｉ３４２ ＶｅｃｔｏｒおよびｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒを、（３）で培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し、５％の二酸化炭素、３７℃の条件で３日間静置培養した。
【0070】
（５）（４）で培養した細胞を回収し、ＡＡＶｐｒｏ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）で抽出、精製することでＶＬＰ２（ウイルス様粒子、ＡＡＶセロタイプ２型の外殻タンパク粒子）を得た。５枚のＴ－２２５フラスコから約１ｍＬのＶＬＰ２精製溶液を調製した。
【0071】
参考例１ ＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２１への変異ライブラリー作製とスクリーニング
ＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２１を含むポリペプチド（配列番号２）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ２１を鋳型とし、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲを用いてランダムに変異導入を施した。なお配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、１番目のメチオニン（Ｍ）から２２番目のアラニン（Ａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１のＮ末端側２２アミノ酸残基）であり、２５番目のセリン（Ｓ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ｄ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２１であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。またＡＶＲ２１は、天然型ＡＡＶ結合性タンパク質であるＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）のうち、細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する、配列番号１の３１２番目から５００番までのアミノ酸残基において、以下の２１箇所のアミノ酸置換が生じたポリペプチドである（ＷＯ２０２３／１４０１９７号）。
配列番号１の３１７番目（配列番号２では３０番目）のバリン（Ｖ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換
配列番号１の３２４番目（配列番号２では３７番目）のアスパラギン（Ｎ）がヒスチジン（Ｈ）に置換
配列番号１の３２６番目（配列番号２では３９番目）のバリン（Ｖ）がアラニン（Ａ）に置換
配列番号１の３３０番目（配列番号２では４３番目）のアラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）に置換
配列番号１の３３４番目（配列番号２では４７番目）のグルタミン（Ｑ）がロイシン（Ｌ）に置換
配列番号１の３３５番目（配列番号２では４８番目）のグルタミン酸（Ｅ）がバリン（Ｖ）に置換
配列番号１の３４１番目（配列番号２では５４番目）のスレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換
配列番号１の３４２番目（配列番号２では５５番目）のチロシン（Ｙ）がセリン（Ｓ）に置換
配列番号１の３６２番目（配列番号２では７５番目）のリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換
配列番号１の３７１番目（配列番号２では８４番目）のリジン（Ｋ）がアスパラギン（Ｎ）に置換
配列番号１の３７９番目（配列番号２では９２番目）のフェニルアラニン（Ｆ）がチロシン（Ｙ）に置換
配列番号１の３８０番目（配列番号２では９３番目）のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換
配列番号１の３８１番目（配列番号２では９４番目）のバリン（Ｖ）がアラニン（Ａ）に置換
配列番号１の３８２番目（配列番号２では９５番目）のイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）に置換
配列番号１の３９０番目（配列番号２では１０３番目）のグリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）に置換
配列番号１の３９９番目（配列番号２では１１２番目）のリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換
配列番号１の４６７番目（配列番号２では１８０番目）のリジン（Ｋ）がグルタミン（Ｑ）に置換
配列番号１の４７６番目（配列番号２では１８９番目）のセリン（Ｓ）がアルギニン（Ｒ）に置換
配列番号１の４８２番目（配列番号２では１９５番目）のセリン（Ｓ）がスレオニン（Ｔ）に置換
配列番号１の４８７番目（配列番号２では２００番目）のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換
配列番号１の４９２番目（配列番号２では２０５番目）のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換。
ＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２１を含むポリペプチド（配列番号２）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ２１を鋳型とし、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲを用いてランダムに変異導入を施した。なお配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、１番目のメチオニン（Ｍ）から２２番目のアラニン（Ａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１のＮ末端側２２アミノ酸残基）であり、２５番目のセリン（Ｓ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ｄ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２１であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。またＡＶＲ２１は、天然型ＡＡＶ結合性タンパク質であるＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）のうち、細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する、配列番号１の３１２番目から５００番までのアミノ酸残基において、以下の２１箇所のアミノ酸置換が生じたポリペプチドである（ＷＯ２０２３／１４０１９７号）。
配列番号１の３１７番目（配列番号２では３０番目）のバリン（Ｖ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換
配列番号１の３２４番目（配列番号２では３７番目）のアスパラギン（Ｎ）がヒスチジン（Ｈ）に置換
配列番号１の３２６番目（配列番号２では３９番目）のバリン（Ｖ）がアラニン（Ａ）に置換
配列番号１の３３０番目（配列番号２では４３番目）のアラニン（Ａ）がバリン（Ｖ）に置換
配列番号１の３３４番目（配列番号２では４７番目）のグルタミン（Ｑ）がロイシン（Ｌ）に置換
配列番号１の３３５番目（配列番号２では４８番目）のグルタミン酸（Ｅ）がバリン（Ｖ）に置換
配列番号１の３４１番目（配列番号２では５４番目）のスレオニン（Ｔ）がアラニン（Ａ）に置換
配列番号１の３４２番目（配列番号２では５５番目）のチロシン（Ｙ）がセリン（Ｓ）に置換
配列番号１の３６２番目（配列番号２では７５番目）のリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換
配列番号１の３７１番目（配列番号２では８４番目）のリジン（Ｋ）がアスパラギン（Ｎ）に置換
配列番号１の３７９番目（配列番号２では９２番目）のフェニルアラニン（Ｆ）がチロシン（Ｙ）に置換
配列番号１の３８０番目（配列番号２では９３番目）のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換
配列番号１の３８１番目（配列番号２では９４番目）のバリン（Ｖ）がアラニン（Ａ）に置換
配列番号１の３８２番目（配列番号２では９５番目）のイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）に置換
配列番号１の３９０番目（配列番号２では１０３番目）のグリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）に置換
配列番号１の３９９番目（配列番号２では１１２番目）のリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換
配列番号１の４６７番目（配列番号２では１８０番目）のリジン（Ｋ）がグルタミン（Ｑ）に置換
配列番号１の４７６番目（配列番号２では１８９番目）のセリン（Ｓ）がアルギニン（Ｒ）に置換
配列番号１の４８２番目（配列番号２では１９５番目）のセリン（Ｓ）がスレオニン（Ｔ）に置換
配列番号１の４８７番目（配列番号２では２００番目）のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換
配列番号１の４９２番目（配列番号２では２０５番目）のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換。
【0072】
（１）鋳型としてＡＶＲ２１を含むポリペプチド（配列番号２）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ２１を用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で２分間熱処理し、９８℃で３０秒間の第１ステップ、５５℃で２０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲによりＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入され、その平均変異導入率は１分子当たり１．４アミノ酸変異であった。
【0073】
【表1】
【0074】
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化し、あらかじめ同じ制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（Ｍｅｒｃｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にライゲーションした。
【0075】
（３）ライゲーション反応終了後、反応液により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）プレート培地で培養（３７℃で１８時間）後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
【0076】
（４）（３）で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
【0077】
（５）（４）の培養液を遠心分離し、得られた培養上清を超純水で２倍に希釈した。希釈した培養液６０μＬと０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液６０μＬとを混合し３０℃で３０分間アルカリ処理を行なった。
【0078】
（６）（５）の処理を行なったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性と、（５）の処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、以下に示すＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法で評価した。
【0079】
（６－１）実施例１で調製したＶＬＰ２を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２００倍に希釈し、９６穴マイクロプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ ＭＩＬＫ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）でブロッキングした。
【0080】
（６－２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．４））でｗｅｌｌを洗浄後、（３）で調製した培養上清を添加し、ＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２とを反応させた（３０℃で１時間）。
【0081】
（６－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
【0082】
（６－４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0083】
アルカリ処理を行なった時のＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、アルカリ処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性で除することで、残存活性を算出した。
【0084】
（７）（６）の方法で約１８００株のランダム変異体ライブラリーを評価し、その中から親分子であるＡＶＲ２１と比較して残存活性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて発現ベクターを調製した。
【0085】
（８）得られた発現ベクターに挿入されたＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、全自動ＤＮＡシークエンサーＧｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３５００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にてヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。なお当該解析の際、配列番号３（５’－ＴＡＡＴＡＣｇＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡｇｇｇ－３’）または配列番号４（５’－ＡＴｇＣＴＡｇＴＴＡＴＴｇＣＴＣＡｇＣｇｇ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【0086】
前記（７）で選択した形質転換体が発現するＡＡＶ結合性タンパク質の、ＡＶＲ２１に対するアミノ酸置換位置ならびにアルカリ処理後の残存活性［％］をまとめたものを表２に示す。
【0087】
配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリン（Ｓ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ｄ）までのアミノ酸残基において、Ｉ３１９Ｎ（この表記は、配列番号１の３１９番目（配列番号２では３２番目）のイソロイシンがアスパラギンに置換されていることを示す、以下同様）、Ｌ３２１Ｑ、Ｌ３２８Ｐ、Ｎ３２９Ｋ、Ｎ３２９Ｓ、Ｖ３３２Ａ、Ｅ（Ｖ）３３５Ａ（この表記は、配列番号１の３３５番目（配列番号２では４８番目）のグルタミン酸が配列番号２で一旦バリンに置換された後、さらにアラニンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｋ３３８Ｒ、Ｅ３４０Ｇ、Ｔ３４３Ａ、Ｔ３４３Ｓ、Ｙ３４４Ｆ、Ｄ３４５Ｇ、Ｑ３４７Ｋ、Ｔ３５０Ａ、Ｅ３６０Ｄ、Ｑ３６５Ｒ、Ｉ３６６Ｆ、Ｌ３６７Ｐ、Ｋ３６８Ｒ、Ｌ３６９Ｓ、Ｋ（Ｎ）３７１Ｄ、Ｋ（Ｎ）３７１Ｓ、Ｌ３７６Ｐ、Ｙ３７７Ｆ、Ｙ３７７Ｎ、Ｅ３７８Ｇ、Ｆ（Ｙ）３７９Ｓ、Ｖ（Ａ）３８１Ｔ、Ｉ（Ｖ）３８２Ｉ、Ｅ３８４Ｄ、Ｈ３８９Ｒ、Ｖ３９４Ａ、Ｖ３９４Ｉ、Ｖ３９６Ｅ、Ｔ３９７Ａ、Ｔ３９７Ｓ、Ｅ４０１Ｇ、Ｐ４０２Ｓ、Ｖ４１２Ａ、Ｔ４２６Ａ、Ｄ４３５Ａ、Ｅ４５３Ｄ、Ｅ４５４Ｄ、Ａ４６１Ｐ、Ｓ４６６Ｔ、Ｎ４７２Ｋ、Ｋ４９７ＥおよびＤ５００Ｎのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＡＡＶ結合性タンパク質は、ＡＶＲ２１と比較しアルカリへの安定性が向上しているといえる。
【0088】
【表2】
【0089】
参考例２ ＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ８ｇへの変異ライブラリー作製とスクリーニング
ＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ８ｇを含むポリペプチド（配列番号２３）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ８ｇを鋳型とし、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲを用いてランダムに変異導入を施した。なお配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、１番目のメチオニン（Ｍ）から２２番目のアラニン（Ａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ｄ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ８ｇであり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。またＡＶＲ８ｇは、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する、配列番号１の３１２番目から５００番までアミノ酸残基において、Ｖ３１７Ｄ、Ｙ３４２Ｃ、Ｋ３６２Ｅ、Ｋ３７１Ｎ、Ｇ３９０Ｓ、Ｋ３９９Ｅ、Ｓ４７６ＲおよびＮ４８７Ｄのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである（ＷＯ２０２１／１０６８８２号）。
ＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ８ｇを含むポリペプチド（配列番号２３）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ８ｇを鋳型とし、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲを用いてランダムに変異導入を施した。なお配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、１番目のメチオニン（Ｍ）から２２番目のアラニン（Ａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ｄ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ８ｇであり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。またＡＶＲ８ｇは、ＫＩＡＡ０３１９Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｑ８ＩＺＡ０）の細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する、配列番号１の３１２番目から５００番までアミノ酸残基において、Ｖ３１７Ｄ、Ｙ３４２Ｃ、Ｋ３６２Ｅ、Ｋ３７１Ｎ、Ｇ３９０Ｓ、Ｋ３９９Ｅ、Ｓ４７６ＲおよびＮ４８７Ｄのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである（ＷＯ２０２１／１０６８８２号）。
【0090】
（１）ＡＶＲ８ｇ（配列番号２３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２４）を挿入したプラスミドｐＥＴ－ＡＶＲ８ｇを鋳型とし、当該鋳型の濃度を１０ｎｇ／μＬとした他は、参考例１（１）と同様な方法でエラープローンＰＣＲを行なった。前記エラープローンＰＣＲによりＡＶＲ８ｇをコードするポリヌクレオチドに変異が導入され、その平均変異導入率は１分子当たり２．３アミノ酸変異であった。
【0091】
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、参考例１（２）および（３）に記載の方法によりランダム変異体ライブラリーを作製した。
【0092】
（３）（２）で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
【0093】
（４）（３）で作製した培養液１０μＬを０．１ｍＭのＩＰＴＧ（ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ＴｈｉｏＧａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）および５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５００μＬの２×ＹＴ液体培地に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２５℃で一晩振とう培養した。
【0094】
（５）（４）の培養液を遠心分離して得られた培養上清を、超純水で１６倍に希釈した。当該希釈培養上清６０μＬと０．１Ｍのグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）６０μＬとを混合し５１．３℃で１５分間熱およびアルカリ処理を行なった。
【0095】
（６）（５）の処理を行なったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活
性と、（５）の処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、参考例１（６）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定した。
性と、（５）の処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、参考例１（６）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【0096】
熱処理を行なったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、熱処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性で除することで、残存活性を算出した。
【0097】
（７）（６）に記載の方法で約１８００株のランダム変異体ライブラリーを評価し、その中から親分子であるＡＶＲ８ｇと比較して残存活性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて発現ベクターを調製した。
【0098】
（８）得られた発現ベクターに挿入されたＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、参考例１（８）に記載の方法で解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。
【0099】
前記（７）で選択した形質転換体が発現するＡＡＶ結合性タンパク質の、ＡＶＲ８ｇに対するアミノ酸置換位置ならびに熱およびアルカリ処理後の残存活性［％］をまとめたものを表３に示す。表３からわかるように、Ｙ３３１Ｈ、Ｆ３７９Ｓ、Ｋ４６７ＮおよびＡ４９１Ｔの４つのアミノ酸置換が生じることで、熱およびアルカリ処理後の残存活性がＡＶＲ８ｇよりも向上していた。
【0100】
【表3】
【0101】
参考例３ ＡＶＲ８ｇアミノ酸置換体のアルカリ安定性評価
参考例２で明らかになった、ＡＡＶ結合性タンパク質の熱およびアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換（Ｙ３３１Ｈ、Ｆ３７９Ｓ、Ｋ４６７ＮおよびＡ４９１Ｔ）のうち、任意の１つをＡＶＲ８ｇ（配列番号２３）に対し導入しても熱およびアルカリ安定性が向上するか確認した。具体的には、以下の（ａ）から（ｄ）に示す４種類のＡＡＶ結合性タンパク質の熱およびアルカリ安定性を確認した。
（ａ）ＡＶＲ８ｇに対し、Ｙ３３１Ｈのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２５、ＡＶＲ９ａと命名）
（ｂ）ＡＶＲ８ｇに対し、Ｆ３７９Ｓのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２６、ＡＶＲ９ｂと命名）
（ｃ）ＡＶＲ８ｇに対し、Ｋ４６７Ｎのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２７、ＡＶＲ９ｃと命名）
（ｄ）ＡＶＲ８ｇに対し、Ａ４９１Ｔのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２８、ＡＶＲ９ｄと命名）
（１）ＡＶＲ９ａ（配列番号２５）、ＡＶＲ９ｂ（配列番号２６）、ＡＶＲ９ｃ（配列番号２７）およびＡＶＲ９ｄ（配列番号２８）のいずれかを発現可能な形質転換体（宿主：大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３））を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２×ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
参考例２で明らかになった、ＡＡＶ結合性タンパク質の熱およびアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換（Ｙ３３１Ｈ、Ｆ３７９Ｓ、Ｋ４６７ＮおよびＡ４９１Ｔ）のうち、任意の１つをＡＶＲ８ｇ（配列番号２３）に対し導入しても熱およびアルカリ安定性が向上するか確認した。具体的には、以下の（ａ）から（ｄ）に示す４種類のＡＡＶ結合性タンパク質の熱およびアルカリ安定性を確認した。
（ａ）ＡＶＲ８ｇに対し、Ｙ３３１Ｈのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２５、ＡＶＲ９ａと命名）
（ｂ）ＡＶＲ８ｇに対し、Ｆ３７９Ｓのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２６、ＡＶＲ９ｂと命名）
（ｃ）ＡＶＲ８ｇに対し、Ｋ４６７Ｎのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２７、ＡＶＲ９ｃと命名）
（ｄ）ＡＶＲ８ｇに対し、Ａ４９１Ｔのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２８、ＡＶＲ９ｄと命名）
（１）ＡＶＲ９ａ（配列番号２５）、ＡＶＲ９ｂ（配列番号２６）、ＡＶＲ９ｃ（配列番号２７）およびＡＶＲ９ｄ（配列番号２８）のいずれかを発現可能な形質転換体（宿主：大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３））を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２×ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
【0102】
（２）５００ｍＬのバッフルフラスコに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２００ｍＬの２×ＹＴ液体培地に（１）の前培養液をそれぞれ２ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
【0103】
（３）培養開始２．０時間後、氷上にて冷却し、終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧをそれぞれ添加後、引き続き２５℃で２０時間、好気的に振とう培養した。
【0104】
（４）培養終了後、培養液を４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することで各菌体を回収した。
【0105】
（５）（４）で回収した菌体を１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび２０ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「平衡化液Ａ」とも表記）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁後、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ［久保田商事社製］）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、各上清を回収した。
【0106】
（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ平衡化液Ａで平衡化した、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（サイティバ社製）１．５ｍＬを充填したオープンカラムにアプライした。平衡化液Ａで洗浄後、０．５Ｍのイミダゾールおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。
【0107】
（７）（６）で得た各溶出液を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析することで、ＡＡＶ結合性タンパク質を調製した。
【0108】
（８）（７）で調製したＡＡＶ結合性タンパク質と、実施例１で調製したＶＬＰ２との結合活性を、参考例１（６）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。前記測定結果である４５０ｎｍにおける吸光度に基づき、当該測定値が同様になるよう（７）で得たＡＡＶ結合性タンパク質を純水で希釈した。
【0109】
（９）希釈したＡＡＶ結合性タンパク質溶液６０μＬと０．１Ｍグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）６０μＬとを混合し、５５．７℃、６０．１℃、６６．１℃または７０℃で１５分間熱およびアルカリ処理を行なった。
【0110】
（１０）（９）の処理を行なったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活
性と、（９）の処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結
合活性を、参考例１（６）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定した。（９）の処理を行なった時のＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、（９）の熱処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性で除することで、残存活性を算出した。
性と、（９）の処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結
合活性を、参考例１（６）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定した。（９）の処理を行なった時のＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、（９）の熱処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性で除することで、残存活性を算出した。
【0111】
結果を表４に示す。ＡＶＲ８ｇ（配列番号２９）のアミノ酸配列のうち２５番目のセリン（Ｓ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ｄ）までのアミノ酸残基において、Ｙ３３１Ｈ、Ｆ３７９Ｓ、Ｋ４６７ＮおよびＡ４９１Ｔのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じたＡＡＶ結合性タンパク質は、ＡＶＲ８ｇと比較し熱およびアルカリへの安定性が向上しているといえる。
【0112】
【表4】
【0113】
実施例２ ＡＶＲ２１アミノ酸置換集積体の作製
参考例１で明らかになったＡＡＶ結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中からＮ３２９Ｋ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６ＡおよびＡ４６１Ｐを、参考例２および３で明らかとなったＡＡＶ結合性タンパク質の熱およびアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中からＫ４６７Ｎを、さらに、Ｈ３８９ＹおよびＶ４８０Ｔを、それぞれ選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ２１（配列番号２）に対し集積することで、さらなるアルカリ安定性の向上を図った。具体的には、以下（ａ）および（ｂ）に示す２種類のＡＡＶ結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＡＶＲ２１に対し、Ｎ３２９Ｋ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６ＡおよびＡ４６１Ｐのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号５、ＡＶＲ２５ａと命名）
（ｂ）ＡＶＲ２１に対し、Ｎ３２９Ｋ、Ｈ３８９Ｙ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６Ａ、Ａ４６１Ｐ、Ｋ（Ｑ）４６７ＮおよびＶ４８０Ｔのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号６、ＡＶＲ２７ａと命名）
以下、前記（ａ）および（ｂ）に示す２種類のＡＡＶ結合性タンパク質の作製方法について説明する。
参考例１で明らかになったＡＡＶ結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中からＮ３２９Ｋ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６ＡおよびＡ４６１Ｐを、参考例２および３で明らかとなったＡＡＶ結合性タンパク質の熱およびアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中からＫ４６７Ｎを、さらに、Ｈ３８９ＹおよびＶ４８０Ｔを、それぞれ選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ２１（配列番号２）に対し集積することで、さらなるアルカリ安定性の向上を図った。具体的には、以下（ａ）および（ｂ）に示す２種類のＡＡＶ結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＡＶＲ２１に対し、Ｎ３２９Ｋ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６ＡおよびＡ４６１Ｐのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号５、ＡＶＲ２５ａと命名）
（ｂ）ＡＶＲ２１に対し、Ｎ３２９Ｋ、Ｈ３８９Ｙ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６Ａ、Ａ４６１Ｐ、Ｋ（Ｑ）４６７ＮおよびＶ４８０Ｔのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号６、ＡＶＲ２７ａと命名）
以下、前記（ａ）および（ｂ）に示す２種類のＡＡＶ結合性タンパク質の作製方法について説明する。
【0114】
変異集積体を作成するためのＰＣＲプライマーセットを設計した。具体的には、
Ｎ３２９Ｋのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号７（Ｆｏｒｗａｒｄ）および８（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｅ４０１Ｇのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号９（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｔ４２６Ａのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号１１（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ａ４６１Ｐのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号１３（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１４（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｈ３８９Ｙのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号１５（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１６（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｋ（Ｑ）４６７Ｎのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号１７（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１８（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｖ４８０Ｔのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号１９（Ｆｏｒｗａｒｄ）および２０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
それぞれ設計した。
Ｎ３２９Ｋのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号７（Ｆｏｒｗａｒｄ）および８（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｅ４０１Ｇのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号９（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｔ４２６Ａのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号１１（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ａ４６１Ｐのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号１３（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１４（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｈ３８９Ｙのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号１５（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１６（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｋ（Ｑ）４６７Ｎのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号１７（Ｆｏｒｗａｒｄ）および１８（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｖ４８０Ｔのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号１９（Ｆｏｒｗａｒｄ）および２０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
それぞれ設計した。
【0115】
（ａ）ＡＶＲ２５ａ
本タンパク質は、参考例１で明らかになったアルカリ安定性に関与するアミノ酸置換の中から、Ｎ３２９Ｋ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６Ａ、およびＡ４６１Ｐを選択し、当該アミノ酸置換をＡＶＲ２１（配列番号２）に導入することで作製した。
本タンパク質は、参考例１で明らかになったアルカリ安定性に関与するアミノ酸置換の中から、Ｎ３２９Ｋ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６Ａ、およびＡ４６１Ｐを選択し、当該アミノ酸置換をＡＶＲ２１（配列番号２）に導入することで作製した。
【0116】
（ａ－１）ＡＶＲ２１を含むポリペプチド（配列番号２）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ２１を鋳型とし、配列番号７（５’－ＡＧＣＴＧＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＴＡＣＴＧＣＴＧＧＴ－３’）および配列番号８（５’－ＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴＧＴＴ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。
【0117】
【表5】
【0118】
（ａ－２）（ａ－１）で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号９（５’－ＡＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＣＡＡＧＡＡＴＣＧＴＣＣ－３’）および配列番号１０（５’－ＣＧＣＧＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＣＧＴＴＡＣＧＴ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。
【0119】
（ａ－３）（ａ－２）で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１１（５’－ＣＡＡＧＴＧＣＧＧＴＧＡＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＧＣＡ－３’）および配列番号１２（５’－ＡＴＣＡＣＣＧＣＡＣＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＧＡＧＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。
【0120】
（ａ－４）（ａ－３）で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１３（５’－ＡＴＡＣＣＣＣＧＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＴＣＴＣＧＣＡ－３’）および配列番号１４（５’－ＡＧＡＡＴＣＧＧＧＧＴＡＴＣＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＴ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。
【0121】
（ａ－５）（ａ－４）で得られたＰＣＲ産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養後、遠心分離で回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、天然型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して２５箇所アミノ酸置換したＡＶＲ２５ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ２５ａを得た。
【0122】
（ａ－６）ｐＥＴ－ＡＶＲ２５ａのヌクレオチド配列を参考例１（８）と同様な方法で解析し、確認した。
【0123】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ２５ａのアミノ酸配列を配列番号５に示す。なお配列番号５において、１番目のメチオニン（Ｍ）から２２番目のアラニン（Ａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ｄ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２５ａ（配列番号２の２５番目から２１３番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。また配列番号５において、Ｖ３１７Ｄのアスパラギン酸は３０番目に、Ｎ３２４Ｈのヒスチジンは３７番目に、Ｖ３２６Ａのアラニンは３９番目に、Ｎ３２９Ｋのリジンは４２番目に、Ａ３３０Ｖのバリンは４３番目に、Ｑ３３４Ｌのロイシンは４７番目に、Ｅ３３５Ｖのバリンは４８番目に、Ｔ３４１Ａのアラニンは５４番目に、Ｙ３４２Ｓのセリンは５５番目に、Ｋ３６２Ｅのグルタミン酸は７５番目に、Ｋ３７１Ｎのアスパラギンは８４番目に、Ｆ３７９Ｙのチロシンは９２番目に、Ｋ３８０Ｒのアルギニンは９３番目に、Ｖ３８１Ａのアラニンは９４番目に、Ｉ３８２Ｖのバリンは９５番目に、Ｇ３９０Ｓのセリンは１０３番目に、Ｋ３９９Ｅのグルタミン酸は１１２番目に、Ｅ４０１Ｇのグリシンは１１４番目に、Ｔ４２６Ａのアラニンは１３９番目に、Ａ４６１Ｐのプロリンは１７４番目に、Ｋ４６７Ｑのグルタミンは１８０番目に、Ｓ４７６Ｒのアルギニンは１８９番目に、Ｓ４８２Ｔのスレオニンは１９５番目に、Ｎ４８７Ｄのアスパラギン酸は２００番目に、Ｎ４９２Ｄのアスパラギン酸は２０５番目に、それぞれ存在する。
【0124】
（ｂ）ＡＶＲ２７ａ
本タンパク質は、前述したアミノ酸置換全て（Ｎ３２９Ｋ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６Ａ、Ａ４６１Ｐ、Ｈ３８９Ｙ、Ｋ（Ｑ）４６７ＮおよびＶ４８０Ｔ）をＡＶＲ２１（配列番号２）に導入することで作製した。
本タンパク質は、前述したアミノ酸置換全て（Ｎ３２９Ｋ、Ｅ４０１Ｇ、Ｔ４２６Ａ、Ａ４６１Ｐ、Ｈ３８９Ｙ、Ｋ（Ｑ）４６７ＮおよびＶ４８０Ｔ）をＡＶＲ２１（配列番号２）に導入することで作製した。
【0125】
（ｂ－１）ＡＶＲ２１を含むポリペプチド（配列番号２）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ２１を鋳型とし、配列番号７（５’－ＡＧＣＴＧＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＴＡＣＴＧＣＴＧＧＴ－３’）および配列番号８（５’－ＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴＧＴＴ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。
【0126】
（ｂ－２）（ｂ－１）で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号９（５’－ＡＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＣＧＣＡＡＧＡＡＴＣＧＴＣＣ－３’）および配列番号１０（５’－ＣＧＣＧＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＣＧＴＴＡＣＧＴ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。
【0127】
（ｂ－３）（ｂ－２）で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１１（５’－ＣＡＡＧＴＧＣＧＧＴＧＡＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＧＣＡ－３’）および配列番号１２（５’－ＡＴＣＡＣＣＧＣＡＣＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＧＡＧＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。
【0128】
（ｂ－４）（ｂ－３）で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１３（５’－ＡＴＡＣＣＣＣＧＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＴＣＴＣＧＣＡ－３’）および配列番号１４（５’－ＡＧＡＡＴＣＧＧＧＧＴＡＴＣＣＴＣＧＣＴＧＡＴＣＴ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。
【0129】
（ｂ－５）（ｂ－４）で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１５（５’－ＡＣＧＣＧＴＡＴＴＣＣＧＡＧＧＧＧＴＡＴＧＴＴＡＡ－３’）および配列番号１６（５’－ＴＣＧＧＡＡＴＡＣＧＣＧＴＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＡ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。
【0130】
（ｂ－６）（ｂ－５）で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１７（５’－ＴＣＴＣＧＡＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＴＡＡＣＴＡ－３’）および配列番号１８（５’－ＡＣＣＡＧＡＴＴＣＧＡＧＡＧＣＴＴＡＡＧＡＡＴＧＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。
【0131】
（ｂ－７）（ｂ－６）で得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１９（５’－ＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＴＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＧＡＣ－３’）および配列番号２０（５’－ＧＴＡＴＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＡＧＧＣＧＡＡＡＣＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。
【0132】
（ｂ－８）（ｂ－７）で得られたＰＣＲ産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養後、遠心分離で回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、天然型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して２７箇所アミノ酸置換したＡＶＲ２７ａをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ２７ａを得た。
【0133】
（ｂ－９）ｐＥＴ－ＡＶＲ２７ａのヌクレオチド配列を参考例１（８）と同様な方法で解析し、確認した。
【0134】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ２７ａのアミノ酸配列を配列番号６に示す。なお配列番号６において、１番目のメチオニン（Ｍ）から２２番目のアラニン（Ａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ｄ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２７ａ（配列番号２の２５番目から２１３番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。また配列番号６において、Ｖ３１７Ｄのアスパラギン酸は３０番目に、Ｎ３２４Ｈのヒスチジンは３７番目に、Ｖ３２６Ａのアラニンは３９番目に、Ｎ３２９Ｋのリジンは４２番目に、Ａ３３０Ｖのバリンは４３番目に、Ｑ３３４Ｌのロイシンは４７番目に、Ｅ３３５Ｖのバリンは４８番目に、Ｔ３４１Ａのアラニンは５４番目に、Ｙ３４２Ｓのセリンは５５番目に、Ｋ３６２Ｅのグルタミン酸は７５番目に、Ｋ３７１Ｎのアスパラギンは８４番目に、Ｆ３７９Ｙのチロシンは９２番目に、Ｋ３８０Ｒのアルギニンは９３番目に、Ｖ３８１Ａのアラニンは９４番目に、Ｉ３８２Ｖのバリンは９５番目に、Ｈ３８９Ｙのチロシンは１０２番目に、Ｇ３９０Ｓのセリンは１０３番目に、Ｋ３９９Ｅのグルタミン酸は１１２番目に、Ｅ４０１Ｇのグリシンは１１４番目に、Ｔ４２６Ａのアラニンは１３９番目に、Ａ４６１Ｐのプロリンは１７４番目に、Ｋ（Ｑ）４６７Ｎのアスパラギンは１８０番目に、Ｓ４７６Ｒのアルギニンは１８９番目に、Ｖ４８０Ｔのスレオニンは１９３番目に、Ｓ４８２Ｔのスレオニンは１９５番目に、Ｎ４８７Ｄのアスパラギン酸は２００番目に、Ｎ４９２Ｄのアスパラギン酸は２０５番目に、それぞれ存在する。
【0135】
実施例３ ＡＶＲ２１アミノ酸置換集積体のアルカリ安定性評価
（１）ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体として、実施例２で取得した２種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ２５ａ［配列番号５］およびＡＶＲ２７ａ［配列番号６］）、ならびにＡＶＲ２１（配列番号２）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し得られた形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２×ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（１）ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体として、実施例２で取得した２種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ２５ａ［配列番号５］およびＡＶＲ２７ａ［配列番号６］）、ならびにＡＶＲ２１（配列番号２）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し得られた形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬの２×ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
【0136】
（２）１Ｌのバッフルフラスコに５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２００ｍＬの２×ＹＴ液体培地に（１）の前培養液をそれぞれ２ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
【0137】
（３）培養開始２．０時間後、氷上にて冷却し、終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧをそれぞれ添加後、引き続き２５℃で２０時間、好気的に振とう培養した。
【0138】
（４）培養終了後、培養液を４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することで各培養菌体（形質転換体）を回収した。
【0139】
（５）（４）で回収した菌体を平衡化液Ａに５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁後、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（久保田商事社製））を用いて、８℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、各上清を回収した。
【0140】
（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ平衡化液Ａで平衡化した、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（サイティバ社製）１．５ｍＬを充填したオープンカラムにアプライした。平衡化液Ａで洗浄後、０．５Ｍのイミダゾールおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。
【0141】
（７）（６）で得た各溶出液を、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析することで、ＡＡＶ結合性タンパク質を調製した。
【0142】
（８）参考例１（６）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて、（７）で調製したＡＡＶ結合性タンパク質と、実施例１で調製したＶＬＰ２との結合活性を測定した。前記測定結果である４５０ｎｍにおける吸光度に基づき、当該測定値が同様になるよう（７）で得たＡＡＶ結合性タンパク質を純水で希釈した。
【0143】
（９）（８）で希釈した各ＡＡＶ結合性タンパク質溶液を２つの画分に分けた。そのうち一方の画分には、０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を等量混合し、一定温度／一定時間静置するアルカリ処理を行ない（処理温度：３０℃、処理時間：０、３０、６０分）、もう一方の画分は前記アルカリ処理を行なわなかった（アルカリ処理「開始時」に相当）。
【0144】
（１０）（９）の処理後の画分に、０．５ＭのＭＥＳ（２－（Ｎ－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ６．０）を、８：２の割合で混合することでｐＨを６付近にした後、参考例１（６）に記載のＥＬＩＳＡ法にてＶＬＰ２との結合活性を測定した。
【0145】
（１１）（１０）のアルカリ処理を行なったときの４５０ｎｍの吸光度を、処理時間０時間のときの４５０ｎｍの吸光度で除することで、残存活性を算出した。
【0146】
結果を表６に示す。実施例２で取得したＡＶＲ２１アミノ酸置換集積体は、ＡＶＲ２１（配列番号２）と比較して残存活性が高く、アルカリに対する安定性が向上していることがわかる。
【0147】
【表6】
【0148】
実施例４ ＡＡＶベクターの作製
以降の実施例でＡＡＶとして使用するＡＡＶベクターを以下の方法で調製した。
以降の実施例でＡＡＶとして使用するＡＡＶベクターを以下の方法で調製した。
【0149】
（１）配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列（ＧＡＡＴＴＣ）を、３’末端側に終止コドン（ＴＡＧ）およびＢａｍＨＩ認識配列（ＧＧＡＴＴＣ）を、それぞれ付加したヌクレオチド配列（配列番号２２）を設計した。
【0150】
（２）配列番号２２に記載の配列からなるポリヌクレオチドを全合成しプラスミドにクローニングした（ＦＡＳＭＡＣ社に委託、ｐＵＣ－ＥＧＦＰと命名）。ｐＵＣ－ＥＧＦＰで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られた形質転換体を培養した。培養液からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてｐＵＣ－ＥＧＦＰを抽出した。
【0151】
（３）（２）で得られたｐＵＣ－ＥＧＦＰを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化した発現ベクターｐＡＡＶ－ＣＭＶ（タカラバイオ社製）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【0152】
（４）（３）で得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む２×ＹＴ培地（１．６％（ｗ／ｖ）のＴｒｙｐｔｏｎｅ、１％（ｗ／ｖ）のＹｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム）１Ｌが入った、５Ｌバッフルフラスコにて、３７℃で一晩振とう培養した。培養終了後、遠心分離することで菌体を回収し、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、当該回収した菌体からｐＡＡＶ－ＥＧＦＰを大量に調製した。
【0153】
（５）血清型８（ＡＡＶ８）のカプシドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（以下、「ｐＲＣ８ Ｖｅｃｔｏｒ」とも表記）およびｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を用いて（４）と同様の操作を行なうことで、ｐＲＣＸ ＶｅｃｔｏｒおよびｐＨｅｌｐｅｒを大量に調製した。
【0154】
（６）１０％（ｖ／ｖ）のウシ血清を含むＤ－ＭＥＭ培地（富士フイルム和光純薬社製）４５ｍＬが入ったＴ－２２５フラスコ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）１０枚でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。そこへ（４）で調製したｐＡＡＶ－ＥＧＦＰ、（５）で調製したｐＲＣ８ ＶｅｃｔｏｒおよびｐＨｅｌｐｅｒならびにポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の複合体を添加することで遺伝子導入し、５％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素、３７℃の条件で３日間静置培養した。培養後、遠心分離により剥離した細胞を回収し、Ｔ－２２５フラスコ５枚分から得られた細胞ごとに－８０℃で冷凍保存した。
【0155】
（７）（６）で得られた冷凍細胞を解凍し、０．５Ｍの塩化ナトリウム、４ｍＭの塩化マグネシウムおよび０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍＬに懸濁した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（メルクミリポア社製）を１／２０００量加えて３７℃で１時間静置後、１３０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し上清を得た。得られた上清に１５％飽和となるよう硫安（硫酸アンモニウム）を添加し、再度同条件で遠心分離した。得られた上清を孔径０．４５μｍのフィルターに供し、浮遊物を除去した。
【0156】
（８）浮遊物を除去した上清を、あらかじめ０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、「平衡化液Ｂ」とも表記）で平衡化した、７ｍＬのＰＯＲＯＳ ＡＡＶＸカラム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にアプライした。
【0157】
（９）平衡化液Ｂで洗浄後、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ２．５）で溶出した。得られた溶出液に、２０ｍＭの塩化マグネシウムを含む１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を１／４量加えることで中和し、ＡＡＶベクターであるＡＡＶ８－ＥＧＦＰ溶液を得た。
【0158】
（１０）（９）で得られた溶液中のＡＡＶ８－ＥＧＦＰ濃度を、ＡＡＶｐｒｏ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｑＰＣＲで定量した。また前記溶液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて銀染色することで前記溶液中に含まれるＡＡＶベクターの純度を確認した。
【0159】
実施例５ ＡＡＶ結合性タンパク質固定化ゲルの作製
（１）分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー社製：トヨパール）の表面のヒドロキシ基に化学修飾を施すことでヨードアセトアミド基を導入したゲルを調製した。前記調製したゲル１．０ｇに、実施例４で調製したＡＶＲ２７ａタンパク質１６ｍｇおよび還元剤として終濃度０．１ｍＭのＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２－ＣａｒｂｏｘｙＥｔｈｙｌ）Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）を加え、ｐＨ７．４、２５℃の条件で３時間振盪することで反応させた。これによりＡＶＲ２７ａを固定化したゲル（ＡＶＲ２７ａ固定化ゲルと命名）を調製した。
（１）分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー社製：トヨパール）の表面のヒドロキシ基に化学修飾を施すことでヨードアセトアミド基を導入したゲルを調製した。前記調製したゲル１．０ｇに、実施例４で調製したＡＶＲ２７ａタンパク質１６ｍｇおよび還元剤として終濃度０．１ｍＭのＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２－ＣａｒｂｏｘｙＥｔｈｙｌ）Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）を加え、ｐＨ７．４、２５℃の条件で３時間振盪することで反応させた。これによりＡＶＲ２７ａを固定化したゲル（ＡＶＲ２７ａ固定化ゲルと命名）を調製した。
【0160】
（２）（１）で調製したＡＶＲ２７ａ固定化ゲルおよび市販品ＰＯＲＯＳ ＡＡＶＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、それぞれ約１０μＬコスモスピンフィルターＧ（ナカライテスク社製）に充填し、ミニカラム（それぞれＡＶＲ２７ａミニカラム、ＰＯＲＯＳ ＡＡＶＸミニカラムと命名）を２つずつ作製した。
【0161】
（３）片方のミニカラムには、０．１Ｍの水酸化ナトリウムおよび１ｍＭの塩化カルシウムを含む水溶液を９０μＬ添加し、２４時間静置（浸漬）した。その後、０．５ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を２１０μＬ添加することで中和した。
【0162】
（４）各ミニカラムに対し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭの酢酸緩衝液
（ｐＨ６．０）（以下、「平衡化液Ｃ」とも表記する）で平衡化後、実施例４で得られたＡＡＶ８－ＥＧＦＰ精製品をＦｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ画分に、ＡＡＶ８－ＥＧＦＰが十分に漏れ出すのが確認できる量アプライした。最終的にアプライしたＡＡＶ８－ＥＧＦＰのそれぞれのカラム当たりの量は、６．９×１０１１ＶＧ（ベクターゲノム）となった。
（ｐＨ６．０）（以下、「平衡化液Ｃ」とも表記する）で平衡化後、実施例４で得られたＡＡＶ８－ＥＧＦＰ精製品をＦｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ画分に、ＡＡＶ８－ＥＧＦＰが十分に漏れ出すのが確認できる量アプライした。最終的にアプライしたＡＡＶ８－ＥＧＦＰのそれぞれのカラム当たりの量は、６．９×１０１１ＶＧ（ベクターゲノム）となった。
【0163】
（５）ゲルに結合したＡＡＶを溶出回収するため、平衡化液Ｃで２００μＬ×２回カラムを洗浄し、各ろ液を（４）のＦｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ画分とともに回収した。
【0164】
（６）２００μＬの５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ２．０）（以下、「溶出液Ａ」とも表記する）を各ミニカラムに添加し、５分振盪後、遠心分離して溶出液を回収した。再度溶出液Ａをミニカラムに２００μＬ加えて同様に１分振盪後、遠心分離し、先の溶出液と合わせて４００μＬ回収した。さらに、溶出液Ａを４００μＬ加えて、遠心分離し、溶出液を回収した（以下、「Ｅｌｕｔｅ １」とも表記する）。Ｅｌｕｔｅ １には、２０ｍＭの塩化マグネシウムを含む１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を２００μＬ加えることで中和した。
【0165】
（７）（６）で得られたＥｌｕｔｅ １に含まれるＡＡＶ８－ＥＧＦＰベクターゲノム数を、ＡＡＶｐｒｏ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｑＰＣＲ（定量ＰＣＲ）で定量した。それぞれのＥｌｕｔｅ １について、水酸化ナトリウムで２４時間浸漬した後のＡＡＶ結合量を、浸漬しなかった場合のＡＡＶ結合量で割ることで、残存活性［％］を算出した。
【0166】
結果を図１に示す。ＰＯＲＯＳ ＡＡＶＸでは、ほとんどＡＡＶを補捉できなかったのに対し、ＡＶＲ２７ａ固定化ゲルの場合には、２４時間アルカリ溶液で浸漬しても、浸漬前と同様のＡＡＶ結合量を有していた。
【0167】
参考例４ ＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２５ａへのアミノ酸置換導入
実施例２でアルカリ安定性を評価したＡＶＲ２１アミノ酸置換集積体の中からＡＶＲ２５ａ（配列番号５）を選択し、当該ＡＶＲ２５ａに対し、参考例１および２で熱およびアルカリ安定性が向上するアミノ酸置換であると判明したＫ４６７Ｎのアミノ酸置換を導入したＡＶＲ２１アミノ酸置換集積体（ＡＶＲ２５ｃと命名）を作製した。なおＫ４６７Ｎのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号３０（Ｆｏｒｗａｒｄ）および３１（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、それぞれ設計した。
実施例２でアルカリ安定性を評価したＡＶＲ２１アミノ酸置換集積体の中からＡＶＲ２５ａ（配列番号５）を選択し、当該ＡＶＲ２５ａに対し、参考例１および２で熱およびアルカリ安定性が向上するアミノ酸置換であると判明したＫ４６７Ｎのアミノ酸置換を導入したＡＶＲ２１アミノ酸置換集積体（ＡＶＲ２５ｃと命名）を作製した。なおＫ４６７Ｎのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号３０（Ｆｏｒｗａｒｄ）および３１（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、それぞれ設計した。
【0168】
（１）ＡＶＲ２５ａを含むポリペプチド（配列番号７）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ２５ａを鋳型とし、配列番号３０（５’－ＧＡＧＡＧＣＴＴＡＡＧＡＡＴＧＧＧＧＧＴＡＴＣＣＴＣ－３’）および配列番号３１（５’－ＴＴＣＴＴＡＡＧＣＴＣＴＣＧＡＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、実施例２（ａ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0169】
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物から、実施例２（ａ－５）と同様な方法で、天然型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して２５箇所アミノ酸置換したＡＶＲ２５ｃをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ２５ｃを得た。
【0170】
（３）ｐＥＴ－ＡＶＲ２５ｃのヌクレオチド配列を参考例１（８）と同様な方法で解析し、確認した。
【0171】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ２５ｃのアミノ酸配列を配列番号２９に示す。なお配列番号２９において、１番目のメチオニン（Ｍ）から２２番目のアラニン（Ａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ｄ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２５ｃ（配列番号２の２５番目から２１３番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。また配列番号２９において、Ｖ３１７Ｄのアスパラギン酸は３０番目に、Ｎ３２４Ｈのヒスチジンは３７番目に、Ｖ３２６Ａのアラニンは３９番目に、Ｎ３２９Ｋのリジンは４２番目に、Ａ３３０Ｖのバリンは４３番目に、Ｑ３３４Ｌのロイシンは４７番目に、Ｅ３３５Ｖのバリンは４８番目に、Ｔ３４１Ａのアラニンは５４番目に、Ｙ３４２Ｓのセリンは５５番目に、Ｋ３６２Ｅのグルタミン酸は７５番目に、Ｋ３７１Ｎのアスパラギンは８４番目に、Ｆ３７９Ｙのチロシンは９２番目に、Ｋ３８０Ｒのアルギニンは９３番目に、Ｖ３８１Ａのアラニンは９４番目に、Ｉ３８２Ｖのバリンは９５番目に、Ｇ３９０Ｓのセリンは１０３番目に、Ｋ３９９Ｅのグルタミン酸は１１２番目に、Ｅ４０１Ｇのグリシンは１１４番目に、Ｔ４２６Ａのアラニンは１３９番目に、Ａ４６１Ｐのプロリンは１７４番目に、Ｋ４６７Ｎのアスパラギンは１８０番目に、Ｓ４７６Ｒのアルギニンは１８９番目に、Ｓ４８２Ｔのスレオニンは１９５番目に、Ｎ４８７Ｄのアスパラギン酸は２００番目に、Ｎ４９２Ｄのアスパラギン酸は２０５番目に、それぞれ存在する。
【0172】
参考例５ ＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２５ｃへの変異ライブラリー作製とスクリーニング
参考例４で作製したＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２５ｃを含むポリペプチド（配列番号２９）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ２５ｃを鋳型とし、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲを用いてランダムに変異導入を施した。
参考例４で作製したＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２５ｃを含むポリペプチド（配列番号２９）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ２５ｃを鋳型とし、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンＰＣＲを用いてランダムに変異導入を施した。
【0173】
（１）鋳型としてＡＶＲ２５ｃを含むポリペプチド（配列番号２９）を発現可能なベクターｐＥＴ－ＡＶＲ２５ｃを用いた他は、参考例１（１）の記載と同様な方法でエラープローンＰＣＲを行なった。前記エラープローンＰＣＲによりＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入され、その平均変異導入率は１分子当たり１．８アミノ酸変異であった。
【0174】
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物から、参考例１（２）および（３）に記載の方法でランダム変異体ライブラリーを作製した。
【0175】
（３）（２）で作製したランダム変異体ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で一晩振とう培養した。
【0176】
（４）（３）の培養液を遠心分離し、得られた培養上清を超純水で２倍に希釈した。希釈した培養上清５０μＬと１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液５０μＬとを混合後、３０℃で１５分間アルカリ処理を行なった。
【0177】
（５）（４）の処理を行なったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性と、（４）の処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、参考例１（６）に記載のＥＬＩＳＡ法で評価した。アルカリ処理を行なった時のＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性を、アルカリ処理を行なわなかったときのＡＡＶ結合性タンパク質とＶＬＰ２との結合活性で除することで、残存活性を算出した。
【0178】
（６）（５）の方法で約１８００株のランダム変異体ライブラリーを評価し、その中から親分子であるＡＶＲ２５ｃと比較して残存活性が向上したＡＡＶ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。
【0179】
（７）（６）で選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて発現ベクターを調製後、当該ベクターに挿入されたＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を参考例１（８）に記載の方法で解析し（ＦＡＳＭＡＣ社に委託）、アミノ酸置換箇所を特定した。
【0180】
前記（７）で選択した形質転換体が発現するＡＡＶ結合性タンパク質の、ＡＶＲ２５ｃに対するアミノ酸置換位置ならびにアルカリ処理後の残存活性［％］をまとめたものを表７に示す。
【0181】
配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリン（Ｓ）から５００番目のアスパラギン酸（Ｄ）までのアミノ酸残基において、Ｇ３１４Ｄ、Ｖ（Ｄ）３１７Ｇ、Ｑ３１８Ｒ、Ｐ３２２Ａ、Ｅ３２５Ｖ、Ｑ３４７Ｒ、Ｔ３５０Ａ、Ｅ３６２Ｄ、Ｈ３６３Ｐ、Ｉ３６６Ｆ、Ｅ３７８Ｇ、Ｆ（Ｙ）３７９Ｎ、Ｇ３９２Ｅ、Ｖ３９４Ａ、Ｖ３９８Ａ、Ｅ３９９Ｋ、Ｒ４０６Ｈ、Ｑ４１５Ｒ、Ｆ４１６Ｌ、Ｌ４２１Ｐ、Ｓ４３３Ｇ、Ｔ４３４Ｓ、Ｄ４３７Ｖ、Ｅ４４５Ｋ、Ｋ４５５Ｒ、Ｓ４５７Ｒ、Ｔ４７４Ｒ、Ｔ４７８Ｉ、Ａ４８５Ｖ、Ｔ４８６Ａ、Ｌ４９３Ｍ、Ｎ４９６Ｄ、Ｋ４９７Ｅ、Ｖ４９９ＩおよびＤ５００Ｇのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＡＡＶ結合性タンパク質は、ＡＶＲ２５ｃ（配列番号２９）と比較しアルカリへの安定性が向上しているといえる。
【0182】
【表7】
【0183】
参考例６ ＡＶＲ２５ｃアミノ酸置換集積体の調製
参考例５で明らかになった、ＡＡＶ結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中からＩ３６６Ｆ、Ｖ３９４Ａ、Ｋ４５５ＲおよびＫ４９７Ｅを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ２５ｃ（配列番号２９）に対し集積することで、さらなるアルカリ安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）および（ｂ）に示す２種類のＡＡＶ結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＡＶＲ２５ｃに対し、Ｉ３６６Ｆ、Ｖ３９４ＡおよびＫ４５５Ｒのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号３２、ＡＶＲ２８と命名）
（ｂ）ＡＶＲ２５ｃに対し、Ｉ３６６Ｆ、Ｖ３９４Ａ、Ｋ４５５ＲおよびＫ４９７Ｅのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号３３、ＡＶＲ２９ｃと命名）
以下、前記（ａ）および（ｂ）に示す２種類のＡＡＶ結合性タンパク質の作製方法について説明する。
参考例５で明らかになった、ＡＡＶ結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換の中からＩ３６６Ｆ、Ｖ３９４Ａ、Ｋ４５５ＲおよびＫ４９７Ｅを選択し、これらアミノ酸置換をＡＶＲ２５ｃ（配列番号２９）に対し集積することで、さらなるアルカリ安定性の向上を図った。具体的には、以下の（ａ）および（ｂ）に示す２種類のＡＡＶ結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＡＶＲ２５ｃに対し、Ｉ３６６Ｆ、Ｖ３９４ＡおよびＫ４５５Ｒのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号３２、ＡＶＲ２８と命名）
（ｂ）ＡＶＲ２５ｃに対し、Ｉ３６６Ｆ、Ｖ３９４Ａ、Ｋ４５５ＲおよびＫ４９７Ｅのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号３３、ＡＶＲ２９ｃと命名）
以下、前記（ａ）および（ｂ）に示す２種類のＡＡＶ結合性タンパク質の作製方法について説明する。
【0184】
変異集積体を作成するためのＰＣＲプライマーセットを設計した。具体的には、
Ｋ４９７Ｅのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号３４（Ｆｏｒｗａｒｄ）および３５（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
設計した。
Ｋ４９７Ｅのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号３４（Ｆｏｒｗａｒｄ）および３５（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
設計した。
【0185】
（ａ）ＡＶＲ２８
本タンパク質は、参考例５で明らかになったアルカリ安定性に関与するアミノ酸置換の中から、Ｉ３６６Ｆ、Ｖ３９４Ａ、およびＫ４５５Ｒを選択した。なお本タンパク質は参考例５で取得済（表７参照）のため、それを流用した。
本タンパク質は、参考例５で明らかになったアルカリ安定性に関与するアミノ酸置換の中から、Ｉ３６６Ｆ、Ｖ３９４Ａ、およびＫ４５５Ｒを選択した。なお本タンパク質は参考例５で取得済（表７参照）のため、それを流用した。
【0186】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ２８のアミノ酸配列を配列番号３２に示す。なお配列番号３２において、１番目のメチオニン（Ｍ）から２２番目のアラニン（Ａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ｄ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２８（配列番号２の２５番目から２１３番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。また配列番号３２において、Ｖ３１７Ｄのアスパラギン酸は３０番目に、Ｎ３２４Ｈのヒスチジンは３７番目に、Ｖ３２６Ａのアラニンは３９番目に、Ｎ３２９Ｋのリジンは４２番目に、Ａ３３０Ｖのバリンは４３番目に、Ｑ３３４Ｌのロイシンは４７番目に、Ｅ３３５Ｖのバリンは４８番目に、Ｔ３４１Ａのアラニンは５４番目に、Ｙ３４２Ｓのセリンは５５番目に、Ｋ３６２Ｅのグルタミン酸は７５番目に、Ｉ３６６Ｆのフェニルアラニンは７９番目に、Ｋ３７１Ｎのアスパラギンは８４番目に、Ｆ３７９Ｙのチロシンは９２番目に、Ｋ３８０Ｒのアルギニンは９３番目に、Ｖ３８１Ａのアラニンは９４番目に、Ｉ３８２Ｖのバリンは９５番目に、Ｇ３９０Ｓのセリンは１０３番目に、Ｖ３９４Ａのアラニンは１０７番目に、Ｋ３９９Ｅのグルタミン酸は１１２番目に、Ｅ４０１Ｇのグリシンは１１４番目に、Ｔ４２６Ａのアラニンは１３９番目に、Ｋ４５５Ｒのアルギニンは１６８番目に、Ａ４６１Ｐのプロリンは１７４番目に、Ｋ４６７Ｎのアスパラギンは１８０番目に、Ｓ４７６Ｒのアルギニンは１８９番目に、Ｓ４８２Ｔのスレオニンは１９５番目に、Ｎ４８７Ｄのアスパラギン酸は２００番目に、Ｎ４９２Ｄのアスパラギン酸は２０５番目に、それぞれ存在する。
【0187】
（ｂ）ＡＶＲ２９ｃ
本タンパク質は、参考例５で明らかになったアルカリ安定性に関与するアミノ酸置換の中から、Ｋ４９７Ｅを選択し、当該アミノ酸置換をＡＶＲ２８（配列番号３２）に導入することで作製した。
本タンパク質は、参考例５で明らかになったアルカリ安定性に関与するアミノ酸置換の中から、Ｋ４９７Ｅを選択し、当該アミノ酸置換をＡＶＲ２８（配列番号３２）に導入することで作製した。
【0188】
（ｂ－１）ＡＶＲ２８を含むポリペプチド（配列番号３２）を発現可能なベクターを鋳型とし、配列番号３４（５’－ＴＴＡＡＣＧＡＡＧＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡ－３’）および配列番号３５（５’－ＡＣＧＧＣＴＴＣＧＴＴＡＡＣＧＧＴＣＡＡＧＴＣＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、表８に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップを５５℃で５秒間の第２ステップを７２℃で６分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することでＰＣＲを行なった。
【0189】
【表8】
【0190】
（ｂ－２）（ｂ－１）で得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）で処理することで鋳型鎖を消化後、ＰＣＲ産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養後、遠心分離で回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、天然型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して２９箇所アミノ酸置換したＡＶＲ２９ｃをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ２９ｃを得た。
【0191】
（ｂ－３）ｐＥＴ－ＡＶＲ２９ｃのヌクレオチド配列を参考例１（８）と同様な方法で解析し、確認した。
【0192】
シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ２９ｃのアミノ酸配列を配列番号３３に示す。なお配列番号３３において、１番目のメチオニン（Ｍ）から２２番目のアラニン（Ａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ｄ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２９ｃ（配列番号２の２５番目から２１３番目までの領域に相当）であり、２１４番目から２１９番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。また配列番号３３において、Ｖ３１７Ｄのアスパラギン酸は３０番目に、Ｎ３２４Ｈのヒスチジンは３７番目に、Ｖ３２６Ａのアラニンは３９番目に、Ｎ３２９Ｋのリジンは４２番目に、Ａ３３０Ｖのバリンは４３番目に、Ｑ３３４Ｌのロイシンは４７番目に、Ｅ３３５Ｖのバリンは４８番目に、Ｔ３４１Ａのアラニンは５４番目に、Ｙ３４２Ｓのセリンは５５番目に、Ｋ３６２Ｅのグルタミン酸は７５番目に、Ｉ３６６Ｆのフェニルアラニンは７９番目に、Ｋ３７１Ｎのアスパラギンは８４番目に、Ｆ３７９Ｙのチロシンは９２番目に、Ｋ３８０Ｒのアルギニンは９３番目に、Ｖ３８１Ａのアラニンは９４番目に、Ｉ３８２Ｖのバリンは９５番目に、Ｇ３９０Ｓのセリンは１０３番目に、Ｖ３９４Ａのアラニンは１０７番目に、Ｋ３９９Ｅのグルタミン酸は１１２番目に、Ｅ４０１Ｇのグリシンは１１４番目に、Ｔ４２６Ａのアラニンは１３９番目に、Ｋ４５５Ｒのアルギニンは１６８番目に、Ａ４６１Ｐのプロリンは１７４番目に、Ｋ４６７Ｎのアスパラギンは１８０番目に、Ｓ４７６Ｒのアルギニンは１８９番目に、Ｓ４８２Ｔのスレオニンは１９５番目に、Ｎ４８７Ｄのアスパラギン酸は２００番目に、Ｎ４９２Ｄのアスパラギン酸は２０５番目に、Ｋ４９７Ｅのグルタミン酸は２１０番目に、それぞれ存在する。
【0193】
参考例７ シグナルペプチド配列を除去したＡＡＶ結合性タンパク質の調製
（１）参考例６（ｂ）で作製したｐＥＴ－ＡＶＲ２９ｃを鋳型とし、配列番号３６（５’－ＡＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣＧＡＣ－３’）および配列番号３７（５’－ＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は参考例６（ｂ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
（１）参考例６（ｂ）で作製したｐＥＴ－ＡＶＲ２９ｃを鋳型とし、配列番号３６（５’－ＡＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣＧＡＣ－３’）および配列番号３７（５’－ＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は参考例６（ｂ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0194】
（２）（１）で得られたＰＣＲ産物から参考例６（ｂ－２）と同様な方法で、天然型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して２９箇所アミノ酸置換したＡＶＲ２９ｃをコードし、かつそのＮ末端側にシグナル配列を有さないポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ２９ｃ（－）を得た。
【0195】
（３）ｐＥＴ－ＡＶＲ２９ｃ（－）のヌクレオチド配列を参考例１（８）と同様な方法で解析し、確認した。
【0196】
ポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ２９ｃ（－）のアミノ酸配列を配列番号３８に示す。なお配列番号３８において、２番目のセリン（Ｓ）から１９０番目のアスパラギン酸（Ｄ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２９ｃ（配列番号２の２５番目から２１３番目までの領域に相当）であり、１９１番目から１９６番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。また配列番号３８において、Ｖ３１７Ｄのアスパラギン酸は７番目に、Ｎ３２４Ｈのヒスチジンは１４番目に、Ｖ３２６Ａのアラニンは１６番目に、Ｎ３２９Ｋのリジンは１９番目に、Ａ３３０Ｖのバリンは２０番目に、Ｑ３３４Ｌのロイシンは２４番目に、Ｅ３３５Ｖのバリンは２５番目に、Ｔ３４１Ａのアラニンは３１番目に、Ｙ３４２Ｓのセリンは３２番目に、Ｋ３６２Ｅのグルタミン酸は５２番目に、Ｉ３６６Ｆのフェニルアラニンは５６番目に、Ｋ３７１Ｎのアスパラギンは６１番目に、Ｆ３７９Ｙのチロシンは６９番目に、Ｋ３８０Ｒのアルギニンは７０番目に、Ｖ３８１Ａのアラニンは７１番目に、Ｉ３８２Ｖのバリンは７２番目に、Ｇ３９０Ｓのセリンは８０番目に、Ｖ３９４Ａのアラニンは８４番目に、Ｋ３９９Ｅのグルタミン酸は８９番目に、Ｅ４０１Ｇのグリシンは９１番目に、Ｔ４２６Ａのアラニンは１１６番目に、Ｋ４５５Ｒのアルギニンは１４５番目に、Ａ４６１Ｐのプロリンは１５１番目に、Ｋ４６７Ｎのアスパラギンは１５７番目に、Ｓ４７６Ｒのアルギニンは１６６番目に、Ｓ４８２Ｔのスレオニンは１７２番目に、Ｎ４８７Ｄのアスパラギン酸は１７７番目に、Ｎ４９２Ｄのアスパラギン酸は１８２番目に、Ｋ４９７Ｅのグルタミン酸１８７番目に、それぞれ存在する。
【0197】
実施例６ ＡＶＲ２９ｃ（－）アミノ酸置換集積体の調製
前述した安定性向上に関与するアミノ酸置換であるＨ３８９Ｙおよび／またはＶ４８０Ｔを、参考例７で作製したＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２９ｃ（－）（配列番号３８の２番目から１９０番目までの領域に相当）に導入した、ＡＡＶ結合性タンパク質を作製した。具体的には、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に示す３種類のＡＡＶ結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＡＶＲ２９ｃ（－）に対し、Ｖ４８０Ｔのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号４３、ＡＶＲ３０ａ（－）と命名）
（ｂ）ＡＶＲ２９ｃ（－）に対し、Ｈ３８９Ｙのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号４４、ＡＶＲ３０ｂ（－）と命名）
（ｃ）ＡＶＲ２９ｃ（－）に対し、Ｈ３８９ＹおよびＶ４８０Ｔのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号４５、ＡＶＲ３１ｂ（－）と命名）
以下、前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に示す３種類のＡＡＶ結合性タンパク質の作製方法について説明する。
前述した安定性向上に関与するアミノ酸置換であるＨ３８９Ｙおよび／またはＶ４８０Ｔを、参考例７で作製したＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ２９ｃ（－）（配列番号３８の２番目から１９０番目までの領域に相当）に導入した、ＡＡＶ結合性タンパク質を作製した。具体的には、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に示す３種類のＡＡＶ結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａ）ＡＶＲ２９ｃ（－）に対し、Ｖ４８０Ｔのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号４３、ＡＶＲ３０ａ（－）と命名）
（ｂ）ＡＶＲ２９ｃ（－）に対し、Ｈ３８９Ｙのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号４４、ＡＶＲ３０ｂ（－）と命名）
（ｃ）ＡＶＲ２９ｃ（－）に対し、Ｈ３８９ＹおよびＶ４８０Ｔのアミノ酸置換を導入したＡＡＶ結合性タンパク質（配列番号４５、ＡＶＲ３１ｂ（－）と命名）
以下、前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に示す３種類のＡＡＶ結合性タンパク質の作製方法について説明する。
【0198】
変異集積体を作成するためのＰＣＲプライマーセットを設計した。具体的には、
Ｈ３８９Ｙのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号３９（Ｆｏｒｗａｒｄ）および４０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｖ４８０Ｔのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号４１（Ｆｏｒｗａｒｄ）および４２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
それぞれ設計した。
Ｈ３８９Ｙのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号３９（Ｆｏｒｗａｒｄ）および４０（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
Ｖ４８０Ｔのアミノ酸置換を導入するためのＰＣＲプライマーとして、配列番号４１（Ｆｏｒｗａｒｄ）および４２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を、
それぞれ設計した。
【0199】
（ａ）ＡＶＲ３０ａ（－）
（ａ－１）参考例７で作製したｐＥＴ－ＡＶＲ２９ｃ（－）を鋳型とし、配列番号４１（５’－ＣＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＧＧＣＡＡＣ－３’）および配列番号４２（５’－ＧＴＧＴＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＡＡＧＣＧＡＡＡＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、参考例６（ｂ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
（ａ－１）参考例７で作製したｐＥＴ－ＡＶＲ２９ｃ（－）を鋳型とし、配列番号４１（５’－ＣＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＧＧＣＡＡＣ－３’）および配列番号４２（５’－ＧＴＧＴＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＴＡＡＧＣＧＡＡＡＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、参考例６（ｂ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0200】
（ａ－２）（ａ－１）で得られたＰＣＲ産物から参考例６（ｂ－２）と同様な方法で、天然型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して３０箇所アミノ酸置換したＡＶＲ３０ａ（－）をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ３０ａ（－）を得た。
【0201】
（ａ－３）ｐＥＴ－ＡＶＲ３０ａ（－）のヌクレオチド配列を参考例１（８）と同様な方法で解析し、確認した。
【0202】
ポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ３０ａ（－）のアミノ酸配列を配列番号４３に示す。なお配列番号４３において、２番目のセリン（Ｓ）から１９０番目のアスパラギン酸（Ｄ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ３０ａ（配列番号２の２５番目から２１３番目までの領域に相当）であり、１９１番目から１９６番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。また配列番号４３において、Ｖ３１７Ｄのアスパラギン酸は７番目に、Ｎ３２４Ｈのヒスチジンは１４番目に、Ｖ３２６Ａのアラニンは１６番目に、Ｎ３２９Ｋのリジンは１９番目に、Ａ３３０Ｖのバリンは２０番目に、Ｑ３３４Ｌのロイシンは２４番目に、Ｅ３３５Ｖのバリンは２５番目に、Ｔ３４１Ａのアラニンは３１番目に、Ｙ３４２Ｓのセリンは３２番目に、Ｋ３６２Ｅのグルタミン酸は５２番目に、Ｉ３６６Ｆのフェニルアラニンは５６番目に、Ｋ３７１Ｎのアスパラギンは６１番目に、Ｆ３７９Ｙのチロシンは６９番目に、Ｋ３８０Ｒのアルギニンは７０番目に、Ｖ３８１Ａのアラニンは７１番目に、Ｉ３８２Ｖのバリンは７２番目に、Ｇ３９０Ｓのセリンは８０番目に、Ｖ３９４Ａのアラニンは８４番目に、Ｋ３９９Ｅのグルタミン酸は８９番目に、Ｅ４０１Ｇのグリシンは９１番目に、Ｔ４２６Ａのアラニンは１１６番目に、Ｋ４５５Ｒのアルギニンは１４５番目に、Ａ４６１Ｐのプロリンは１５１番目に、Ｋ４６７Ｎのアスパラギンは１５７番目に、Ｓ４７６Ｒのアルギニンは１６６番目に、Ｖ４８０Ｔのスレオニンは１７０番目に、Ｓ４８２Ｔのスレオニンは１７２番目に、Ｎ４８７Ｄのアスパラギン酸は１７７番目に、Ｎ４９２Ｄのアスパラギン酸は１８２番目に、Ｋ４９７Ｅのグルタミン酸は１８７番目に、それぞれ存在する。
【0203】
（ｂ）ＡＶＲ３０ｂ（－）
（ｂ－１）配列番号３９（５’－ＡＴＧＣＴＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣ－３’）および配列番号４０（５’－ＴＣＴＧＡＡＴＡＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＣＣＣＴＣＣＡＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
（ｂ－１）配列番号３９（５’－ＡＴＧＣＴＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＣ－３’）および配列番号４０（５’－ＴＣＴＧＡＡＴＡＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＣＣＣＴＣＣＡＣ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ａ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0204】
（ｂ－２）（ｂ－１）で得られたＰＣＲ産物から参考例６（ｂ－２）と同様な方法で、天然型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して３０箇所アミノ酸置換したＡＶＲ３０ｂ（－）をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ３０ｂ（－）を得た。
【0205】
（ｂ－３）ｐＥＴ－ＡＶＲ３０ｂ（－）のヌクレオチド配列を参考例１（８）と同様な方法で解析し、確認した。
【0206】
ポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ３０ｂ（－）のアミノ酸配列を配列番号４４に示す。なお配列番号４４において、２番目のセリン（Ｓ）から１９０番目のアスパラギン酸（Ｄ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ３０ｂ（配列番号２の２５番目から２１３番目までの領域に相当）であり、１９１番目から１９６番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。また配列番号４４において、Ｖ３１７Ｄのアスパラギン酸は７番目に、Ｎ３２４Ｈのヒスチジンは１４番目に、Ｖ３２６Ａのアラニンは１６番目に、Ｎ３２９Ｋのリジンは１９番目に、Ａ３３０Ｖのバリンは２０番目に、Ｑ３３４Ｌのロイシンは２４番目に、Ｅ３３５Ｖのバリンは２５番目に、Ｔ３４１Ａのアラニンは３１番目に、Ｙ３４２Ｓのセリンは３２番目に、Ｋ３６２Ｅのグルタミン酸は５２番目に、Ｉ３６６Ｆのフェニルアラニンは５６番目に、Ｋ３７１Ｎのアスパラギンは６１番目に、Ｆ３７９Ｙのチロシンは６９番目に、Ｋ３８０Ｒのアルギニンは７０番目に、Ｖ３８１Ａのアラニンは７１番目に、Ｉ３８２Ｖのバリンは７２番目に、Ｈ３８９Ｙのチロシンは７９番目に、Ｇ３９０Ｓのセリンは８０番目に、Ｖ３９４Ａのアラニンは８４番目に、Ｋ３９９Ｅのグルタミン酸は８９番目に、Ｅ４０１Ｇのグリシンは９１番目に、Ｔ４２６Ａのアラニンは１１６番目に、Ｋ４５５Ｒのアルギニンは１４５番目に、Ａ４６１Ｐのプロリンは１５１番目に、Ｋ４６７Ｎのアスパラギンは１５７番目に、Ｓ４７６Ｒのアルギニンは１６６番目に、Ｓ４８２Ｔのスレオニンは１７２番目に、Ｎ４８７Ｄのアスパラギン酸は１７７番目に、Ｎ４９２Ｄのアスパラギン酸は１８２番目に、Ｋ４９７Ｅのグルタミン酸は１８７番目に、それぞれ存在する。
【0207】
（ｃ）ＡＶＲ３１ｂ（－）
本タンパク質は、Ｖ４８０Ｔのアミノ酸置換をＡＶＲ３０ｂ（－）（配列番号４４）に導入することで作製した。
本タンパク質は、Ｖ４８０Ｔのアミノ酸置換をＡＶＲ３０ｂ（－）（配列番号４４）に導入することで作製した。
【0208】
（ｃ－１）（ｂ）で作製したｐＥＴ－ＡＶＲ３０ｂ（－）を鋳型とした他は、（ａ－１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
【0209】
（ｃ－２）（ｃ－１）で得られたＰＣＲ産物から参考例６（ｂ－２）と同様な方法で、天然型ＡＡＶ結合性タンパク質に対して３１箇所アミノ酸置換したＡＶＲ３１ｂ（－）をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）ｐＥＴ－ＡＶＲ３１ｂ（－）を得た。
【0210】
（ｃ－３）ｐＥＴ－ＡＶＲ３１ｂ（－）のヌクレオチド配列を参考例１（８）と同様な方法で解析し、確認した。
【0211】
ポリヒスチジンタグを付加したＡＶＲ３１ｂ（－）のアミノ酸配列を配列番号４５に示す。なお配列番号４５において、２番目のセリン（Ｓ）から１９０番目のアスパラギン酸（Ｄ）がＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ３１ｂ（配列番号２の２５番目から２１３番目までの領域に相当）であり、１９１番目から１９６番目のヒスチジン（Ｈ）がタグ配列である。また配列番号４５において、Ｖ３１７Ｄのアスパラギン酸は７番目に、Ｎ３２４Ｈのヒスチジンは１４番目に、Ｖ３２６Ａのアラニンは１６番目に、Ｎ３２９Ｋのリジンは１９番目に、Ａ３３０Ｖのバリンは２０番目に、Ｑ３３４Ｌのロイシンは２４番目に、Ｅ３３５Ｖのバリンは２５番目に、Ｔ３４１Ａのアラニンは３１番目に、Ｙ３４２Ｓのセリンは３２番目に、Ｋ３６２Ｅのグルタミン酸は５２番目に、Ｉ３６６Ｆのフェニルアラニンは５６番目に、Ｋ３７１Ｎのアスパラギンは６１番目に、Ｆ３７９Ｙのチロシンは６９番目に、Ｋ３８０Ｒのアルギニンは７０番目に、Ｖ３８１Ａのアラニンは７１番目に、Ｉ３８２Ｖのバリンは７２番目に、Ｈ３８９Ｙのチロシンは７９番目に、Ｇ３９０Ｓのセリンは８０番目に、Ｖ３９４Ａのアラニンは８４番目に、Ｋ３９９Ｅのグルタミン酸は８９番目に、Ｅ４０１Ｇのグリシンは９１番目に、Ｔ４２６Ａのアラニンは１１６番目に、Ｋ４５５Ｒのアルギニンは１４５番目に、Ａ４６１Ｐのプロリンは１５１番目に、Ｋ４６７Ｎのアスパラギンは１５７番目に、Ｓ４７６Ｒのアルギニンは１６６番目に、Ｖ４８０Ｔのスレオニンは１７０番目に、Ｓ４８２Ｔのスレオニンは１７２番目に、Ｎ４８７Ｄのアスパラギン酸は１７７番目に、Ｎ４９２Ｄのアスパラギン酸は１８２番目に、Ｋ４９７Ｅのグルタミン酸は１８７番目に、それぞれ存在する。
【0212】
実施例７ アミノ酸置換集積体のアルカリ安定性評価
（１）ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体として、参考例７で取得したＡＶＲ２９ｃ（－）（配列番号３８）、ならびに実施例６で取得した３種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ２９ｃ（－）アミノ酸置換集積体、具体的にはＡＶＲ３０ａ（－）（配列番号４３）、ＡＶＲ３０ｂ（－）（配列番号４４）ならびにＡＶＲ３１ｂ（－）（配列番号４５））のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し得られた形質転換体を用いた他は、実施例３（１）から（４）と同様な方法で形質転換体を培養し、菌体（形質転換体）を回収した。
（１）ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体として、参考例７で取得したＡＶＲ２９ｃ（－）（配列番号３８）、ならびに実施例６で取得した３種類のＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＶＲ２９ｃ（－）アミノ酸置換集積体、具体的にはＡＶＲ３０ａ（－）（配列番号４３）、ＡＶＲ３０ｂ（－）（配列番号４４）ならびにＡＶＲ３１ｂ（－）（配列番号４５））のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し得られた形質転換体を用いた他は、実施例３（１）から（４）と同様な方法で形質転換体を培養し、菌体（形質転換体）を回収した。
【0213】
（２）（１）で回収した菌体から実施例３（５）に記載の方法で菌体破砕し、上清を回収後、実施例３（６）から（７）に記載の方法でＡＡＶ結合性タンパク質を調製した。
【0214】
（３）参考例１（６）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて、（２）で調製したＡＡＶ結合性タンパク質と、実施例１で調製したＶＬＰ２との結合活性を測定した。（２）で調製したＡＡＶ結合性タンパク質溶液の濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ ＯｎｅＣ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で測定後、タンパク質濃度として５μｇ／ｍＬになるように２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。
【0215】
（４）（３）で希釈した各ＡＡＶ結合性タンパク質溶液を、１ｍＭの塩化カルシウムを含む１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液と等量混合し、一定温度／一定時間静置するアルカリ処理を行なった（処理温度：３０℃、処理時間：０、２０、３０分）。
【0216】
（５）（４）の処理後の画分に、０．５ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を、８：２の割合で混合することでｐＨを６付近にした後、参考例１（６）に記載のＥＬＩＳＡ法にてＶＬＰ２との結合活性を測定した。
【0217】
（６）（５）のアルカリ処理を行なったときの４５０ｎｍの吸光度を、処理時間０分のときの４５０ｎｍの吸光度で除することで、残存活性を算出した。
【0218】
結果を表９に示す。実施例６で取得したＡＶＲ２９ｃ（－）アミノ酸置換集積体は、ＡＶＲ２９ｃ（－）（配列番号３８）と比較して残存活性が高く、アルカリに対する安定性が向上していることがわかる。
【0219】
【表9】
【図1】
【配列表】