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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024169694
(43)【公開日】2024-12-05
(54)【発明の名称】顕微鏡
(51)【国際特許分類】
G02B 21/06 20060101AFI20241128BHJP
G01N 21/17 20060101ALI20241128BHJP
【ＦＩ】
G02B21/06
G01N21/17 620
【審査請求】有
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024166978
(22)【出願日】2024-09-26
(62)【分割の表示】P 2024528236の分割
【原出願日】2022-06-24
(71)【出願人】
【識別番号】000004112
【氏名又は名称】株式会社ニコン
(74)【代理人】
【識別番号】100113549
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 守
(74)【代理人】
【識別番号】100092897
【弁理士】
【氏名又は名称】大西 正悟
(74)【代理人】
【識別番号】100157417
【弁理士】
【氏名又は名称】並木 敏章
(74)【代理人】
【識別番号】100115808
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 真司
(74)【代理人】
【識別番号】100218224
【弁理士】
【氏名又は名称】長嶺 浩之
(72)【発明者】
【氏名】池田 諭史
(72)【発明者】
【氏名】福武 直樹
(57)【要約】
【課題】 標本における３次元の屈折率分布をより正確に求めることが可能な顕微鏡を提供する。
【解決手段】 顕微鏡は、照明用対物レンズを含み、照明用対物レンズの光軸方向に交差する面内において、走査部を介して、光源からの照明光によって、標本を走査して照射する照明光学系と、照明用対物レンズとは異なる検出用対物レンズを含み、標本を透過した光を検出部へ導く検出光学系と、検出部からの信号に基づき、画像を生成する画像処理部と、を備え、検出光学系は、検出用対物レンズの瞳又はその共役位置に配置され、光の透過率が瞳の面内又は共役位置の面内で変化する強度変調素子を有し、検出部は、検出用対物レンズの瞳の共役位置に配置される。
【選択図】 図１
【解決手段】 顕微鏡は、照明用対物レンズを含み、照明用対物レンズの光軸方向に交差する面内において、走査部を介して、光源からの照明光によって、標本を走査して照射する照明光学系と、照明用対物レンズとは異なる検出用対物レンズを含み、標本を透過した光を検出部へ導く検出光学系と、検出部からの信号に基づき、画像を生成する画像処理部と、を備え、検出光学系は、検出用対物レンズの瞳又はその共役位置に配置され、光の透過率が瞳の面内又は共役位置の面内で変化する強度変調素子を有し、検出部は、検出用対物レンズの瞳の共役位置に配置される。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
照明用対物レンズを含み、前記照明用対物レンズの光軸方向に交差する面内において、走査部を介して、光源からの照明光によって、標本を走査して照射する照明光学系と、
前記照明用対物レンズとは異なる検出用対物レンズを含み、前記標本を透過した光を検出部へ導く検出光学系と、
前記検出部からの信号に基づき、画像を生成する画像処理部と、
を備え、
前記検出光学系は、前記検出用対物レンズの瞳又はその共役位置に配置され、前記光の透過率が前記瞳の面内又は前記共役位置の面内で変化する強度変調素子を有し、
前記検出部は、前記検出用対物レンズの瞳の共役位置に配置される顕微鏡。
前記照明用対物レンズとは異なる検出用対物レンズを含み、前記標本を透過した光を検出部へ導く検出光学系と、
前記検出部からの信号に基づき、画像を生成する画像処理部と、
を備え、
前記検出光学系は、前記検出用対物レンズの瞳又はその共役位置に配置され、前記光の透過率が前記瞳の面内又は前記共役位置の面内で変化する強度変調素子を有し、
前記検出部は、前記検出用対物レンズの瞳の共役位置に配置される顕微鏡。
【請求項2】
制御部を更に備え、
前記制御部は、前記強度変調素子を制御又は挿脱して他の強度変調素子と切り替えて、前記光の透過率の状態を変化させることにより、前記検出光学系が前記検出部へ導く前記光を互いに異なる状態にし、
前記検出部は、前記互いに異なる状態の光をそれぞれ受光する請求項１に記載の顕微鏡。
前記制御部は、前記強度変調素子を制御又は挿脱して他の強度変調素子と切り替えて、前記光の透過率の状態を変化させることにより、前記検出光学系が前記検出部へ導く前記光を互いに異なる状態にし、
前記検出部は、前記互いに異なる状態の光をそれぞれ受光する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項3】
前記強度変調素子の透過率は、連続関数に従って変化する請求項１又は２に記載の顕微鏡。
【請求項4】
前記強度変調素子の前記光の透過率は、前記連続関数に従って前記瞳の面内もしくは前共役位置の面内で一方向に沿って変化する請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項5】
前記強度変調素子の前記光の透過率は、前記連続関数に従って前記瞳の面内もしくは前記共役位置の面内で一方向に沿って単調に増加もしくは減少し、前記瞳の面内もしくは前記共役位置の面内の外周の一部において零となる請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項6】
前記連続関数が、一次関数、二次関数、ガウス関数、１周期より小さい範囲での正弦関数、１周期より小さい範囲での余弦関数のうちのいずれかの関数である請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項7】
前記光の透過率の状態の変化は、前記透過率が、一方向において一次関数に従って単調増加する状態から、前記一方向において一次関数に従って単調減少する状態への変化である請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項8】
前記画像処理部は、前記検出部から出力された複数の信号により形成された複数の画像に基づいて、差分画像を生成する請求項７に記載の顕微鏡。
【請求項9】
前照明用対物レンズ及び前記検出用対物レンズは、前記標本を載置するステージを介して、互い対向する位置関係で配置される請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項10】
前記照明用対物レンズ及び前記検出用対物レンズは、前記標本を載置するステージを介することなく、前記標本に対して、互いに対向する位置関係で配置される請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項11】
前記照明用対物レンズの開口数と前記検出用対物レンズの開口数とが同じである請求項１、２、７から１０のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項12】
前記画像処理部は、前記差分画像に基づき、前記画像として、３次元屈折率分布を生成する請求項８に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、顕微鏡に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、位相物体等の試料における３次元の屈折率分布を求める方法が考案されている（例えば、特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開第２０２０／１６１８２６号パンフレット
【発明の概要】
【0004】
本発明に係る顕微鏡は、照明用対物レンズを含み、前記照明用対物レンズの光軸方向に交差する面内において、走査部を介して、光源からの照明光によって、標本を走査して照射する照明光学系と、前記照明用対物レンズとは異なる検出用対物レンズを含み、前記標本を透過した光を検出部へ導く検出光学系と、前記検出部からの信号に基づき、画像を生成する画像処理部と、を備え、前記検出光学系は、前記検出用対物レンズの瞳又はその共役位置に配置され、前記光の透過率が前記瞳の面内又は前記共役位置の面内で変化する強度変調素子を有し、前記検出部は、前記検出用対物レンズの瞳の共役位置に配置される。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】第１実施形態に係る顕微鏡装置の模式図である。
【図2】第１実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図3】第１実施形態におけるステージの拡大図である。
【図4】変調素子の光の透過率の分布を示すグラフである。
【図5】試料の複数の断面の画像データに基づいてデコンボリューションを行う方法を示す模式図である。
【図6】従来の方法で生成した明視野観察による試料の画像を示す図である。
【図7】従来の方法で生成した試料の屈折率分布の画像を示す図である。
【図8】従来におけるＰＯＴＦの分布を示す図である。
【図9】従来におけるＰＯＴＦのミッシングコーン領域を推定して補完したスペクトルの分布を示す図である。
【図10】明視野観察による試料の画像を示す図である。
【図11】試料の屈折率分布の画像を示す図である。
【図12】ＰＯＴＦの分布を示す図である。
【図13】ＰＯＴＦのミッシングコーン領域を推定して補完したスペクトルの分布を示す図である。
【図14】第１実施形態に係るデータ生成方法を示すフローチャートである。
【図15】第１実施形態に係る顕微鏡装置の変形例を示す概略構成図である。
【図16】第２実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図17】第２実施形態におけるステージの拡大図である。
【図18】第２実施形態に係る顕微鏡装置の変形例を示す概略構成図である。
【図19】第３実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図20】第３実施形態におけるステージの拡大図である。
【図21】第３実施形態に係る顕微鏡装置の変形例を示す概略構成図である。
【図22】第４実施形態に係る顕微鏡装置の模式図である。
【図23】第４実施形態に係る顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図24】第４実施形態におけるステージの拡大図である。
【図25】第５実施形態に係る顕微鏡装置の模式図である。
【図26】第６実施形態に係る顕微鏡装置の模式図である。
【図27】変形例に係る第１顕微鏡部を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【0006】
以下、各実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。以下の説明で用いる図は、特徴を分かり易くするために、便宜上、構成部品を拡大して示している場合があり、各構成部品の寸法比率等が実際と同じであるとは限らない。
【0007】
＜第１実施形態＞
まず、図１および図２を用いて、第１実施形態に係る顕微鏡装置１について説明する。第１実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１および図２に示すように、第１顕微鏡部１０と、第２顕微鏡部５０とを有する。さらに、顕微鏡装置１は、図２に示すように、ステージ２と、制御部９０と、画像処理部９１とを有する。ステージ２は、試料ＳＡを支持する。試料ＳＡは、例えば細胞等の位相物体である。ステージ２には、ステージ駆動部（図示せず）が設けられる。ステージ駆動部は、ステージ２を第１顕微鏡部１０の光軸ＡＸ１に沿って移動させる。
まず、図１および図２を用いて、第１実施形態に係る顕微鏡装置１について説明する。第１実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１および図２に示すように、第１顕微鏡部１０と、第２顕微鏡部５０とを有する。さらに、顕微鏡装置１は、図２に示すように、ステージ２と、制御部９０と、画像処理部９１とを有する。ステージ２は、試料ＳＡを支持する。試料ＳＡは、例えば細胞等の位相物体である。ステージ２には、ステージ駆動部（図示せず）が設けられる。ステージ駆動部は、ステージ２を第１顕微鏡部１０の光軸ＡＸ１に沿って移動させる。
【0008】
図２に示すように、第１顕微鏡部１０の光軸方向（上下方向）に延びる座標軸をｚ軸とし、ｚ軸と垂直な座標軸をｘ軸およびｙ軸とする。ステージ駆動部によりステージ２をｚ方向に移動させることで、図３に示すように、所定の位置Ｚ０、位置Ｚ０から＋Δｚだけ離れた位置Ｚ０＋Δｚ、位置Ｚ０から－Δｚだけ離れた位置Ｚ０－Δｚ、位置Ｚ０から＋２Δｚだけ離れた位置Ｚ０＋２Δｚ、位置Ｚ０から－２Δｚだけ離れた位置Ｚ０－２Δｚ…における試料ＳＡの断面の画像データを取得することが可能である。
【0009】
第１顕微鏡部１０は、図１および図２に示すように、第１光源１１と、第１照明光学系２０と、第１検出光学系３０と、第１検出器４０とを有する。第１光源１１は、ハロゲンランプやＬＥＤ（Light Emitting Diode）等の白色光源を用いて構成される。また、第１光源１１は、ハロゲンランプやＬＥＤ等の近赤外光源を用いて構成されてもよい。第１光源１１は、所定の波長帯域の照明光（以降、第１照明光と称する）を発生させる。
【0010】
第１照明光学系２０は、第１光源１１から発光した第１照明光Ｌ１を－ｚ方向（第１の方向）に向けて試料ＳＡに照射する。第１照明光学系２０は、図２に示すように、第１光源１１側から順に、コレクタレンズ２１と、視野絞り２３と、リレーレンズ２４と、第１変調素子２５と、開口絞り２６と、コンデンサレンズ２７とを有する。第１光源１１として白色光源が用いられる場合、第１照明光の波長帯域を狭くする素子が設けられることが好ましい。例えば、第１照明光学系２０におけるコレクタレンズ２１と視野絞り２３との間の光路に、所定の分光透過率特性を有するバンドパスフィルター２２を挿入することで、第１照明光の波長帯域を狭くすることが可能である。第１照明光の波長帯域を狭くすることで、詳細は後述するＰＯＴＦ等の計算値の精度を高くすることができる。バンドパスフィルター２２の分光透過率特性は、明視野観察等の観察の用途に応じた照明光の波長帯域に基づいて設定される。なお、第１照明光学系２０における視野絞り２３とリレーレンズ２４との間の光路に、バンドパスフィルター２２を挿入してもよい。
【0011】
第１変調素子２５および開口絞り２６は、第１照明光学系２０におけるリレーレンズ２４とコンデンサレンズ２７との間の瞳（以降、照明瞳と称する場合がある）の位置Ｐ１において第１顕微鏡部１０（第１照明光学系２０）の光軸ＡＸ１と垂直な面に配置される。第１変調素子２５は、開口絞り２６に隣接して（一例として、図２のように開口絞り２６の上側に）配置される。照明瞳の位置Ｐ１における第１顕微鏡部１０の光軸ＡＸ１と垂直な面を、照明瞳の面と称する。第１変調素子２５は、一例として、光の透過性を有する平板であって、この平板の面内で光の透過率が変化する平板である。この平板は、例えば、ガラス基板等の平行平板に、光の透過率を低減させることが可能な（遮光性のある）膜を蒸着させることにより形成される。一例として、金属膜を蒸着させる。例えば、膜が蒸着される平行平板の部位に応じて膜厚を変化させることにより、平行平板の部位に応じて光の透過率を変化させることができる（膜厚が厚いほど、透過率は低くなる）。この第１変調素子２５を、照明瞳の面に配置することによって、照明瞳の面内で光の透過率を変化させることができる。したがって、第１変調素子２５の光の透過率が照明瞳の面内で変化すると言える。第１変調素子２５の光の透過率は、照明瞳の面内で連続的（もしくは離散的）に変化する。
【0012】
なお、第１変調素子２５の部位に応じて光の透過率が変化することにより、第１変調素子２５の光の透過率の分布（言い換えれば、照明瞳の面における光の透過率の分布）が決まる。第１変調素子２５として、光の透過率の変化、すなわち光の透過率の分布が異なる複数の第１変調素子２５のうちいずれかを選択して照明瞳の位置Ｐ１に配置することが可能である。第１変調素子２５の光の透過率の詳細については、後述する。なお、第１変調素子２５が配置される位置は、照明瞳の位置Ｐ１に限られない。例えば、第１変調素子２５は、照明瞳と共役な位置において光軸ＡＸ１と垂直な面（言い換えれば、照明瞳と共役な面）に配置されてもよい。また、第１光源１１は、照明瞳と共役な位置に配置される。
【0013】
コンデンサレンズ２７は、ステージ２の上方に対向して配置される。コンデンサレンズ２７として、光学特性が異なる複数のコンデンサレンズ２７のうちいずれかを選択してステージ２の上方に配置することが可能である。
【0014】
第１検出光学系３０は、試料ＳＡを挟んで第１照明光学系２０と反対の側から第１照明光Ｌ１の照射に応じた試料ＳＡからの光を受ける。第１検出光学系３０は、図２に示すように、試料ＳＡ側から順に、対物レンズユニット３１と、結像レンズ３６と、ミラー３７とを有する。対物レンズユニット３１は、複数の第１対物レンズ３２と、レンズ保持部３３と、ユニット駆動部３４とを有する。第１対物レンズ３２は、ステージ２の下方に対向して配置される。レンズ保持部３３は、焦点距離が異なる複数の第１対物レンズ３２を保持する。レンズ保持部３３は、例えば、レボルバやターレット等を用いて構成される。ユニット駆動部３４は、レンズ保持部３３を駆動し、複数の第１対物レンズ３２のうちいずれかを選択してステージ２の下方に配置することが可能である。なお、ユニット駆動部３４は、レンズ保持部３３をｚ軸に沿って移動させてもよい。この場合、前述のステージ駆動部を併用してもよいし、ステージ駆動を使わなくてもよい。
【0015】
ステージ２の下方に配置された第１対物レンズ３２には、第１照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光が入射する。第１対物レンズ３２を透過した光は、結像レンズ３６に入射する。結像レンズ３６を透過した光は、ミラー３７で反射して所定の像面Ｉで結像する。ここで、所定の像面Ｉの位置は、試料ＳＡにおける第１対物レンズ３２の焦点位置と共役な位置である。なお、ミラー３７の代わりにハーフミラーを設け、当該ハーフミラーを透過する光の光路上に接眼レンズ（図示せず）を有する観察光学系（図示せず）を設けてもよい。これにより、観察者は、接眼レンズを用いて試料ＳＡの像を観察することが可能である。
【0016】
第１検出光学系３０の像面Ｉに、第１検出器４０が配置される。第１検出器４０は、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）等の撮像素子を用いて構成される。第１検出器４０は、第１検出光学系３０を介して試料ＳＡからの光を検出する。
【0017】
第２顕微鏡部５０は、図１および図２に示すように、光源ユニット５１と、第２照明光学系７０と、第２検出光学系７５と、第２検出器８０とを有する。光源ユニット５１は、ビーム操作ユニット（Beam Steering unit）とも称される。光源ユニット５１は、図２に示すように、第２光源５２と、第１レンズ５３と、第１ガルバノミラー５４と、第２レンズ５５と、第３レンズ５６と、第２ガルバノミラー５７と、液体レンズ５９と、第４レンズ６０と、第５レンズ６１とを有する。また、光源ユニット５１は、第１レンズ５３と第１ガルバノミラー５４との間の光路に挿脱可能なシリンドリカルレンズ（図示せず）を有する。
【0018】
第２光源５２は、レーザー光源を用いて構成される。第２光源５２は、所定の波長帯域の照明光（以降、第２照明光と称する）を発光させる。第１レンズ５３は、第２光源５２から発光した第２照明光を平行にする。第１ガルバノミラー５４は、第１レンズ５３からの第２照明光を第２レンズ５５に向けて反射させる。第１ガルバノミラー５４は、反射面の向きを変化させることにより、第２照明光の進行方向を変化させることが可能である。第１ガルバノミラー５４が第２照明光の進行方向を変化させることで、試料ＳＡにおける第２照明光の集光位置をｙ方向に変化させる。第２レンズ５５および第３レンズ５６は、第１ガルバノミラー５４で反射した第２照明光を第２ガルバノミラー５７に入射させる。なお、第１ガルバノミラー５４と第２ガルバノミラー５７が瞳と共役な位置に配置される場合、第２レンズ５５および第３レンズ５６は、設けられていなくてもよい。
【0019】
第２ガルバノミラー５７は、第３レンズ５６からの第２照明光を液体レンズ５９に向けて反射させる。第２ガルバノミラー５７は、反射面の向きを変化させることにより、第２照明光の進行方向を変化させることが可能である。第２ガルバノミラー５７が第２照明光の進行方向を変化させることで、試料ＳＡにおける第２照明光の集光位置をｚ方向に変化させる。
【0020】
液体レンズ５９は、レンズ面の曲率半径を変化させることにより、液体レンズ５９の焦点距離を変化させることが可能である。液体レンズ５９が液体レンズ５９の焦点距離を変化させることで、試料ＳＡにおける第２照明光の集光位置をｘ方向に変化させる。第４レンズ６０および第５レンズ６１は、液体レンズ５９を透過した第２照明光を第２照明光学系７０に入射させる。第１ガルバノミラー５４と、第２ガルバノミラー５７と、液体レンズ５９により、試料ＳＡにおける第２照明光の集光位置を３次元方向（ｘ方向とｙ方向とｚ方向の３つの方向）に変化させて、試料ＳＡを３次元的に走査することが可能である。
【0021】
なお、デコンボリューションの観点から、第１照明光学系２０による第１照明光の照射範囲（試料ＳＡにおける３次元的な観察範囲）と、第２照明光学系７０による第２照明光の照射範囲（試料ＳＡにおける３次元的な観察範囲）とを、予め一致させるように調整しておくことが好ましい。第１照明光と第２照明光の照射範囲（観察範囲）を一致させる調整は、例えば、光源ユニット５１における第１ガルバノミラー５４および第２ガルバノミラー５７のうち少なくとも一方の振り角を制御することで実現することができる。また、第１照明光と第２照明光の照射範囲（観察範囲）を一致させる調整を行わずに、第１照明光と第２照明光の共通する照射範囲（観察範囲）を特定することで、試料ＳＡに対する３次元的な走査による画像構築を行うようにしてもよい。
【0022】
第２照明光学系７０は、光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した第２照明光Ｌ２を＋ｘ方向（第１の方向と直交する第２の方向）に向けて試料ＳＡに集光して照射する。なお、図２、図１５、図１６、図１８、図１９、および図２１においては、第１照明光Ｌ１と区別し易くするため、第２照明光Ｌ２を破線で示す。第２照明光学系７０は、図２および図３に示すように、照明用第２対物レンズ７１を有する。照明用第２対物レンズ７１は、試料ＳＡの左方に対向して配置される。照明用第２対物レンズ７１は、光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した第２照明光Ｌ２を試料ＳＡに集光する。第２顕微鏡部５０における第２照明光学系７０と第２検出光学系７５との間の光軸ＡＸ２は、第１顕微鏡部１０における第１照明光学系２０と第１検出光学系３０との間の光軸ＡＸ１と直交する。
【0023】
第２検出光学系７５は、試料ＳＡを挟んで第２照明光学系７０と反対の側から第２照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光を受ける。第２検出光学系７５は、図２および図３に示すように、試料ＳＡ側から順に、検出用第２対物レンズ７６と、第２変調素子７７とを有する。検出用第２対物レンズ７６は、試料ＳＡを挟んで照明用第２対物レンズ７１と反対の側に設けられる。検出用第２対物レンズ７６には、第２照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光が入射する。なお、照明用第２対物レンズ７１と検出用第２対物レンズ７６とは、同一で且つ高いＮＡ（開口数）を有してもよい。
【0024】
第２変調素子７７は、第２検出光学系７５における検出用第２対物レンズ７６の瞳（以降、検出瞳と称する場合がある）と共役な位置Ｐ２において第２顕微鏡部５０（第２検出光学系７５）の光軸ＡＸ２と垂直な面に配置される。検出瞳と共役な位置Ｐ２における第２顕微鏡部５０の光軸ＡＸ２と垂直な面を、検出瞳と共役な面と称する。第２変調素子７７は、一例として、第１変調素子２５と同様に、ガラス基板等の平行平板に、光の透過率を低減させることが可能な膜を蒸着させることにより形成される。この第２変調素子７７を、検出瞳と共役な面に配置することによって、検出瞳と共役な面内で光の透過率を変化させることができる。したがって、第２変調素子７７の光の透過率が検出瞳と共役な面内で変化すると言える。第２変調素子７７の光の透過率は、検出瞳と共役な面内で連続的（もしくは離散的）に変化する。第２変調素子７７として、光の透過率の分布が異なる複数の第２変調素子７７のうちいずれかを選択して検出瞳と共役な位置Ｐ２に配置することが可能である。第２変調素子７７の光の透過率の詳細については、後述する。なお、第２変調素子７７が配置される位置は、検出瞳と共役な位置Ｐ２に限られない。例えば、第２変調素子７７は、検出瞳の位置において光軸ＡＸ２と垂直な面（言い換えれば、検出瞳の面）に配置されてもよい。この場合、例えば、第２変調素子７７は、検出用第２対物レンズ７６に内蔵されてもよい。
【0025】
第２検出器８０は、第２検出光学系７５における検出瞳と共役な位置Ｐ２に、第２変調素子７７に隣接して配置される。第２検出器８０は、ＰＭＴ(Photomultiplier tube)やＮＤＤ(Non-Descanned Detection)等を用いて構成される。第２検出器８０は、第２検出光学系７５を介して試料ＳＡからの光を検出する。
【0026】
第１変調素子２５および第２変調素子７７の、瞳の面内における光の透過率の変化（言い換えると、瞳の面内における光の透過率の分布）の例について述べる。図４は、第１変調素子２５および第２変調素子７７の光の透過率の分布の一例を示すグラフである。図４において、Ｘは光軸（第１顕微鏡部１０の光軸ＡＸ１または第２顕微鏡部５０の光軸ＡＸ２）が通る座標位置を原点とするｘ方向の座標であり、Ｙは光軸が通る座標位置を原点とするｙ方向の座標である。
【0027】
図４に示す例では、第１変調素子２５または第２変調素子７７の光の透過率が、連続関数に従って一方向に沿って変化する。具体的には、第１変調素子２５または第２変調素子７７の光の透過率が、Ｘ方向（例えば－Ｘ方向）において正弦関数に従って単調に減少する（光の透過率の等しい部分がＹ方向へ延びる直線状に分布する）。つまり、第１変調素子２５または第２変調素子７７の光の透過率が、正弦関数に従って変化する。なお、第１変調素子２５または第２変調素子７７の光の透過率は、瞳の面内で、Ｘ方向（例えば＋Ｘ方向）において正弦関数に従って単調に増加するとも言えるし、Ｘ方向において単調に減少もしくは増加するとも言える。
【0028】
なお、第１変調素子２５または第２変調素子７７の光の透過率が、Ｙ方向において正弦関数に従って単調に減少もしくは増加してもよい（光の透過率の等しい部分がＸ方向へ延びる直線状に分布してもよい）。また、第１変調素子２５または第２変調素子７７の光の透過率が、Ｘ方向やＹ方向に限らず、ＸＹ座標系における任意の方向において正弦関数に従って単調に減少もしくは増加してもよい（光の透過率の等しい部分が上記ＸＹ座標系における任意の方向と垂直な方向へ延びる直線状に分布してもよい）。
【0029】
図４に示す例において、第１変調素子２５または第２変調素子７７の光の透過率が、Ｘ方向（例えば－Ｘ方向）において一次関数に従って単調に減少してもよい。つまり、第１変調素子２５または第２変調素子７７の光の透過率が、正弦関数に限られず、一次関数に従って変化してもよい。
【0030】
図４に示す例において、上記の連続関数は、一次関数、二次関数、ガウス関数、正弦関数、余弦関数のうちいずれかであればよい。なお、上記の連続関数は、一次関数、二次関数、ガウス関数、正弦関数、余弦関数に限られず、三次関数など他の関数であってもよい。また、第１変調素子２５や第２変調素子７７において光の透過率が変化する範囲は、瞳（照明瞳、検出瞳）の大きさ（直径）に合わせて設定すればよい。例えば、図４に示す場合には、光の透過率が０となる領域が瞳（照明瞳、検出瞳）の外周部と合うように第１変調素子２５や第２変調素子７７を形成する。
【0031】
なお、第１変調素子２５または第２変調素子７７の光の透過率が、余弦関数や正弦関数に従って変化する場合、瞳（照明瞳、検出瞳）の面内において１周期より小さい範囲での余弦関数や正弦関数に従った変化であることが望ましい。１周期より大きい範囲になると、ＰＯＴＦの値も周期的な振る舞いをするため、デコンボリューションを行う観点から好ましくないからである。この場合、ＰＯＴＦの値が０になる周波数が複数存在することになり、デコンボリューションの過程で生じるノイズが大きくなるため、得られる試料ＳＡの屈折率分布の精度が低下する。また、第１変調素子２５または第２変調素子７７の光の透過率が、余弦関数に従って変化する場合、瞳（照明瞳、検出瞳）の外周部で光の透過率が０になる（余弦関数の値が０になる）ように工夫しているが、これは瞳の外周部における光の透過率の不連続性が、像におけるリンギング等のアーティファクトの原因となっていることを考慮したものである。
【0032】
図４に示す例において、第１変調素子２５または第２変調素子７７の光の透過率は、連続関数に従って瞳の面内もしくは瞳と共役な面内で一方向に沿って変化し、瞳の面内もしくは瞳と共役な面内の外周の一部において０（零）となるが、これに限られるものではない。例えば、第１変調素子２５または第２変調素子７７の光の透過率は、連続関数に従って瞳の面内もしくは瞳と共役な面内で光軸から離れるにつれて変化し、瞳の面内もしくは瞳と共役な面内の外周部の全周で０（零）となってもよい。
【0033】
本実施形態において、試料ＳＡの明視野観察を行う場合、第１顕微鏡部１０の第１光源１１から発光した第１照明光Ｌ１は、第１照明光学系２０のコレクタレンズ２１に入射する。コレクタレンズ２１を透過した第１照明光Ｌ１は、平行光となって視野絞り２３（第１光源１１として白色光源が用いられる場合、バンドパスフィルター２２および視野絞り２３）を通り、リレーレンズ２４に入射する。リレーレンズ２４を透過した第１照明光Ｌ１は、第１変調素子２５と開口絞り２６とを通ってコンデンサレンズ２７に入射する。コンデンサレンズ２７を透過した第１照明光Ｌ１は、平行光となってステージ２上の試料ＳＡに照射される。これにより、第１照明光学系２０は、第１光源１１から発光した第１照明光Ｌ１を－ｚ方向（第１の方向）に向けて試料ＳＡに照射する。
【0034】
第１照明光学系２０の方から試料ＳＡを透過した光（以降、第１検出光と称する場合がある）は、第１検出光学系３０の第１対物レンズ３２に入射する。第１対物レンズ３２を透過した第１検出光は、結像レンズ３６に入射する。結像レンズ３６を透過した第１検出光は、ミラー３７で反射して第１検出器４０が配置される所定の像面Ｉで結像する。第１検出器４０は、第１検出光学系３０を介して試料ＳＡからの光（第１検出光）を検出し、当該光の検出信号を出力する。第１検出器４０から出力された光（第１検出光）の検出信号は、制御部９０を介して画像処理部９１に送信される。なお、第１検出器４０は、検出光学系４０を介して試料ＳＡの像を撮像すると言い換えることができる。ここで、検出信号とは、光（検出光）の強度に応じて第１検出器４０または第２検出器８０で検出された信号強度を示す信号である。例えば、第１検出器４０がＣＣＤを用いて構成される場合、ＣＣＤの各画素における信号である。なお、第１検出器４０の検出信号は、試料ＳＡの像の強度に応じて第１検出器４０で検出された信号強度を示す信号と言い換えることができる。
【0035】
なお、試料ＳＡの明視野観察を行う場合、第２顕微鏡部５０の光源ユニット５１のシリンドリカルレンズ（図示せず）は、光源ユニット５１における第１レンズ５３と第１ガルバノミラー５４との間の光路から退避される。光源ユニット５１の第２光源５２から発光した第２照明光は、第１レンズ５３に入射する。第１レンズ５３を透過した第２照明光は、平行光となって第１ガルバノミラー５４で反射する。第１ガルバノミラー５４で反射した第２照明光は、第２レンズ５５および第３レンズ５６を透過し、第２ガルバノミラー５７で反射する。第２ガルバノミラー５７で反射した第２照明光は、液体レンズ５９に入射する。液体レンズ５９を透過した第２照明光は、第４レンズ６０および第５レンズ６１を透過して光源ユニット５１の外部に射出される。これにより、光源ユニット５１は、第２照明光を発光させる。
【0036】
光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した第２照明光Ｌ２は、第２照明光学系７０の照明用第２対物レンズ７１に入射する。照明用第２対物レンズ７１を透過した第２照明光Ｌ２は、集光されてステージ２上の試料ＳＡに照射される。これにより、第２照明光学系７０は、光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した第２照明光Ｌ２を＋ｘ方向（第１の方向と直交する第２の方向）に向けて試料ＳＡに集光して照射する。
【0037】
第２照明光学系７０の方から試料ＳＡを透過した光（以降、第２検出光と称する場合がある）は、第２検出光学系７５の検出用第２対物レンズ７６に入射する。検出用第２対物レンズ７６を透過した第２検出光は、第２変調素子７７を通って第２検出器８０に入射する。第２検出器８０は、第２検出光学系７５を介して試料ＳＡからの光（第２検出光）を検出し、当該光の検出信号を出力する。第２検出器８０から出力された光（第２検出光）の検出信号は、制御部９０を介して画像処理部９１に送信される。
【0038】
また、顕微鏡装置１を選択的平面照明顕微鏡（ＳＰＩＭ）として用いて、試料ＳＡの蛍光観察を行うことも可能である。試料ＳＡの蛍光観察を行う場合、第２顕微鏡部５０の光源ユニット５１のシリンドリカルレンズ（図示せず）は、光源ユニット５１における第１レンズ５３と第１ガルバノミラー５４との間の光路に挿入される。
【0039】
試料ＳＡの蛍光観察を行う場合、光源ユニット５１の第２光源５２から発光した励起光は、第１レンズ５３に入射する。第１レンズ５３を透過した励起光は、シリンドリカルレンズ（図示せず）を透過し、第１ガルバノミラー５４で反射する。第１ガルバノミラー５４で反射した励起光は、第２レンズ５５および第３レンズ５６を透過し、第２ガルバノミラー５７で反射する。第２ガルバノミラー５７で反射した励起光は、液体レンズ５９に入射する。液体レンズ５９を透過した励起光は、第４レンズ６０および第５レンズ６１を透過して光源ユニット５１の外部に射出される。これにより、光源ユニット５１は、シート光である励起光を発光させる。
【0040】
光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した励起光は、第２照明光学系７０の照明用第２対物レンズ７１に入射する。照明用第２対物レンズ７１を透過した励起光は、集光されてステージ２上の試料ＳＡに照射される。これにより、第２照明光学系７０は、光源ユニット５１（第２光源５２）から発光したシート光である励起光を試料ＳＡに照射する。
【0041】
励起光の照射によって、試料ＳＡに含まれる蛍光物質が励起されて蛍光が出射する。試料ＳＡからの蛍光は、第１顕微鏡部１０の第１検出光学系３０の第１対物レンズ３２に入射する。第１対物レンズ３２を透過した蛍光は、結像レンズ３６に入射する。結像レンズ３６を透過した蛍光は、ミラー３７で反射して第１検出器４０が配置される所定の像面Ｉで結像する。第１検出器４０は、第１検出光学系３０を介して試料ＳＡからの蛍光を検出し、当該蛍光の検出信号を出力する。第１検出器４０から出力された蛍光の検出信号は、制御部９０を介して画像処理部９１に送信される。
【0042】
制御部９０は、顕微鏡装置１の全体的な制御を行う。制御部９０は、ステージ駆動部（図示せず）、ユニット駆動部３４、第１検出器４０、光源ユニット５１、第２検出器８０、画像処理部９１、操作入力部（図示せず）、画像表示部（図示せず）等と電気的に接続される。
【0043】
画像処理部９１は、試料ＳＡの明視野観察を行う場合、第１検出器４０から出力された光（第１検出光）の検出信号および、第２検出器８０から出力された光（第２検出光）の検出信号に基づいて、試料ＳＡに関する屈折率のデータを生成する。ここで、試料ＳＡに関する屈折率のデータとは、試料ＳＡの屈折率を表すデータであり、例えば、試料ＳＡにおける各位置での屈折率のデータ、すなわち試料ＳＡにおける屈折率分布を示すデータである。また、試料ＳＡに関する屈折率のデータは、例えばルックアップテーブルとして記憶部（図示せず）に記憶される。また、画像処理部９１は、試料ＳＡにおける屈折率分布の各位置での屈折率の値に応じて各画素の輝度値を設定した画像データ（以降、試料ＳＡの屈折率分布の画像データと称する場合がある）を生成する。また、画像処理部９１は、第１検出器４０から出力された光（第１検出光）の検出信号および、第２検出器８０から出力された光（第２検出光）の検出信号に基づいて、試料ＳＡにおける各位置（第１検出器４０の各画素）での検出信号の信号強度の値に応じて各画素の輝度値を設定した画像データ（以降、明視野観察による試料ＳＡの画像データと称する場合がある）を生成する。
【0044】
なお、画像処理部９１は、試料ＳＡの蛍光観察を行う場合、第１検出器４０から出力された蛍光の検出信号に基づいて、試料ＳＡにおける各位置での検出信号の信号強度の値に応じて各画素の輝度値を設定した画像データ（以降、蛍光観察による試料ＳＡの画像データと称する場合がある）を生成する。
【0045】
これにより、画像処理部９１で生成された試料ＳＡの屈折率分布の画像データに基づいて、画像表示部（図示せず）に試料ＳＡにおける屈折率分布の画像を表示することが可能である。また、画像処理部９１で生成された明視野観察による試料ＳＡの画像データに基づいて、画像表示部に明視野観察による試料ＳＡの画像を表示することが可能である。画像処理部９１で生成された蛍光観察による試料ＳＡの画像データに基づいて、蛍光観察による試料ＳＡの画像を表示することが可能である。
【0046】
次に、画像処理部９１により、試料ＳＡに関する屈折率のデータとして試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布を求める公知の方法について説明する。試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布を求める代表的な例として、ＰＣ－ＯＤＴ(Partially Coherent－Optical Diffraction Tomography)と称される理論を用いる方法がある。以下、ＰＣ－ＯＤＴの理論について簡単に述べる。部分コヒーレント結像の式より、３次元の物体の像の強度Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）は、下記の式（１）のように表すことができる。
【0047】
【数1】
【0048】
式（１）において、ｏは物体の複素振幅透過率を表す。ＴＣＣは相互透過係数(Transmission Cross Coefficient)を表す。（ξ，η，ζ）は回折光(もしくは直接光)の方向余弦を表す。また、この場合の像とは、照明により試料ＳＡの少なくとも一部を透過した光（検出光）が結像して得られる試料ＳＡの像である。したがって、３次元の物体の像、すなわち３次元の試料ＳＡの像の強度Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）は、画像処理においては第１検出器４０等から出力される検出信号の信号強度（例えば、第１検出器４０で試料ＳＡを撮像した際の第１検出器４０の各画素における信号強度）に置き換えることができる。図２に示すように、第１顕微鏡部１０の光軸方向（上下方向）に延びる座標軸をｚ軸とし、ｚ軸と垂直な座標軸をｘ軸およびｙ軸とする。相互透過係数ＴＣＣは、下記の式（２）のように表すことができる。
【0049】
【数2】
【0050】
式（２）において、Ｓは照明瞳を表す。Ｇは検出瞳を表す。相互透過係数ＴＣＣは、エルミート共役であることから、下記の式（３）に示す性質を持つ。
【0051】
【数3】
【0052】
細胞のような厚みの薄い試料の場合、散乱の影響は小さいので、第１次Ｂｏｒｎ近似（低コントラスト近似）が成り立つ。このとき、試料を透過した直接光（０次回折光）と、試料で回折した回折光（１次回折光）との干渉のみを考えればよい。そのため、第１次Ｂｏｒｎ近似によって、上記の式（１）～（３）から下記の式（４）が得られる。
【0053】
【数4】
【0054】
また、物体の複素振幅透過率oは、下記の式（５）のように近似することができる。
【0055】
【数5】
【0056】
式（５）において、Ｐは散乱ポテンシャルの実部を表す。Φは散乱ポテンシャルの虚部を表す。上記の式（４）は、式（５）を利用して、下記の式（６）のように表される。
【0057】
【数6】
【0058】
ここで、ＴＣＣをＷＯＴＦ(Weak Object Transfer Function)と改める。ＷＯＴＦは下記の式（７）で定義される。
【0059】
【数7】
【0060】
上記の式（６）および式（７）より、透過照明方式の顕微鏡で得られる３次元の物体の像の強度Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）は、下記の式（８）のように表される。
【0061】
【数8】
【0062】
ここで、試料の振幅変化は、小さくて無視できるものとする。すなわち、Ｐ＝０とする。この場合、上記の式（８）を実空間上で表すと、下記の式（９）が得られる。
【0063】
【数9】
【0064】
式（９）において、ＥＰＳＦは、有効点像分布（Effective Point Spread Function)を表す。ＥＰＳＦは、ＷＯＴＦを逆フーリエ変換したものに等しい。ＥＰＳＦは、一般的に複素関数である。式（９）の第１項は、背景強度を表す。式（９）の第２項は、試料の持つ散乱ポテンシャルの虚部Φに、ＥＰＳＦの虚部Ｉｍ［ＥＰＳＦ］がかかっていることを表す。この式（９）を利用して、試料の持つ散乱ポテンシャルの虚部Φを求めることができる。
【0065】
Φ（ｘ，ｙ，ｚ）を求める第１の方法として、Ｉｍ［ＥＰＳＦ］を用いて直接デコンボリューションを行う方法がある。図５に、ステージ２をｚ方向（つまり、光軸方向）に移動させて、試料ＳＡのｚ方向の位置（つまり、光軸方向の位置）が異なる複数の断面（ｘｙ断面）の像の強度（第１検出器４０等から出力される検出信号の信号強度）を取得し、デコンボリューションを行う過程を模式的に示す。なお、試料ＳＡのｚ方向の位置（つまり、光軸方向の位置）が異なる複数の断面の像を纏めて、試料ＳＡのｚスタック像と称する場合がある。式（９）の第１項は、背景強度を表す定数項である。まず、式（９）の両辺をこの定数項で割って規格化した後、規格化した式（９）の第１項を実空間（もしくは周波数空間）上で除く。そして、Ｉｍ［ＥＰＳＦ］を用いてデコンボリューションを行うことで、下記の式（１０）が得られる。
【0066】
【数10】
【0067】
式（１０）において、Ｉｍ［ＥＰＳＦ］を３次元フーリエ変換したものをＰＯＴＦ(Phase Optical Transfer Function)とする。なお、Ｉｍ［ＥＰＳＦ］は正の値から負の値までとり得るため、ＰＯＴＦの値も、正の値から負の値までとり得る。ここで、ＰＯＴＦは、明視野観察による試料ＳＡの画像（像）のコントラストや分解能を表す指標となる。具体的には、ＰＯＴＦの絶対値は画像のコントラストを表し、ＰＯＴＦの絶対値が高いほど、明視野観察による試料ＳＡの画像（像）のコントラストは高くなる。また、周波数空間においてＰＯＴＦの値が０ではない領域が広いほど、明視野観察による試料ＳＡの画像（像）の分解能は高くなる。また、試料ＳＡのｚスタック像における試料ＳＡの各断面の像の強度Ｉ（例えば、図５におけるＩ１～Ｉ６）を式（９）の定数項で規格化したものをI’とする。γは、任意の小さい値を取るものとする。
【0068】
Φ（ｘ，ｙ，ｚ）を求める第２の方法として、試料ＳＡのｚ方向の位置（つまり、光軸方向の位置）が異なる２つの断面の像の強度の差分を求めることで、式（９）の定数項を除いた後、求めた強度の差分のＩｍ［ＥＰＳＦ］を用いてデコンボリューションを行う方法がある。この方法は、国際公開第２０２１／０６４８０７号パンフレットにも記載されており、説明を省略する。
【0069】
なお、散乱ポテンシャルΦは、Ｐ＝０の場合、下記の式（１１）で定義される。
【0070】
【数11】
【0071】
式（１１）において、ｎ（ｘ，ｙ，ｚ）は試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布を表し、ｋ０は真空中の波数を表し、ｎｍは媒質の屈折率を表す。式（１１）を用いれば、上述した方法によって求めた散乱ポテンシャルΦを、３次元の屈折率分布に換算することができる。画像処理部９１は、上記の式（１０）と式（１１）とを用いて、第１検出器４０等から出力される検出信号の信号強度、すなわち３次元の試料ＳＡの像の強度Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）から試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布ｎ（ｘ，ｙ，ｚ）を算出する。一例として画像処理部９１は、算出した試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布の各位置（座標）での屈折率の値に応じて各画素の輝度値を設定した画像データ、すなわち試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像データを生成する。なお、３次元の試料ＳＡの像の強度は、試料ＳＡのｚスタック像における試料ＳＡの各断面の像の強度として表すことができる。すなわち、３次元の試料ＳＡの像の強度は、試料ＳＡにおけるｚ方向の位置（つまり、光軸方向の位置）が異なる複数の像の強度とも言える。
【0072】
従来のように、第１顕微鏡部１０のみを用いて試料ＳＡからの光を検出する場合、ＰＯＴＦがｚ方向に対して情報の欠落する領域（以降、missing cone領域と称する）を持つため、ｚ方向の屈折率の変化にエラーが生じる。そのため、試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像や、明視野観察による試料ＳＡの画像を生成することが難しい。図６に、従来の方法で生成した明視野観察による試料ＳＡ（ｘｚ断面）の画像の一例を示す。図７に、従来の方法で生成した試料ＳＡの３次元の屈折率分布（ｘｚ断面）の画像の一例を示す。図６および図７に示す試料ＳＡとして、屈折率等が既知である略球形の疑似細胞を用いている。図６および図７に示す例では、試料ＳＡ（疑似細胞）の屈折率が～１．３５に設定され、媒質の屈折率が１．３３に設定される。また、図６および図７に示す例で使用される顕微鏡の照明側ＮＡ（開口数）および検出側ＮＡが０．９５に設定される。
【0073】
図８に、従来におけるＰＯＴＦの分布を示す。図８において、白色（背景）はＰＯＴＦの値が０であることを示し、黒色はＰＯＴＦの値が正または負の値であることを示す。したがって、図８において、黒色が濃いほどＰＯＴＦの絶対値が大きくなる。図８に示すように、従来におけるＰＯＴＦの分布の中心側に、大きなmissing cone領域が存在する。そのため、明視野観察による試料ＳＡの画像は、例えば図６に示すように、本来の略球形の形状から乖離し、ｚ方向に延びてしまう。
【0074】
また、ＰＯＴＦがmissing cone領域を持つため、上記の式（１０）と式（１１）とを用いて、３次元の屈折率分布を求める場合、屈折率の補正が必要となる。そこで、Gerchberg-Papoulis法、Edge-Preserving Regularization法、Total Variation Regularization法などのmissing cone推定手法を用いて、屈折率の補正を行う。具体的には、missing cone推定アルゴリズムを使用して、最小の屈折率値が所定の屈折率値（例えば、既知である試料ＳＡにおける媒質の屈折率値）となるように拘束条件を設定し、missing cone領域を推定する。
【0075】
図９に、従来におけるＰＯＴＦのmissing cone領域を推定して補完したスペクトルの分布を示す。図９に示すように、ＰＯＴＦのmissing cone領域を補完したとしても、試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像は、例えば図７に示すように、本来の略球形の形状から乖離し、ｚ方向に延びてしまう。
【0076】
本実施形態において、画像処理部９１は、第１照明光学系２０が第１照明光Ｌ１を－ｚ方向（第１の方向）に向けて試料ＳＡに照射することによって第１検出器４０から出力された光の検出信号および、第２照明光学系７０が第２照明光Ｌ２を＋ｘ方向（第１の方向と直交する第２の方向）に向けて試料ＳＡに集光して照射することによって第２検出器８０から出力された光の検出信号に基づいて、試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像データを生成する。これにより、本実施形態によれば、第２検出器８０から出力された光の検出信号に基づいて、ＰＯＴＦにおけるmissing cone領域を小さくすることが可能になるため、試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像や、明視野観察による試料ＳＡの画像をより正確に生成することが可能になる。
【0077】
図１０に、本実施形態に係る方法で生成した明視野観察による試料ＳＡ（ｘｚ断面）の画像の一例を示す。図１１に、本実施形態に係る方法で生成した試料ＳＡの３次元の屈折率分布（ｘｚ断面）の画像の一例を示す。図１０および図１１に示す試料ＳＡとして、屈折率等が既知である略球形の疑似細胞を用いている。図１０および図１１に示す例では、試料ＳＡ（疑似細胞）の屈折率が～１．３５に設定され、媒質の屈折率が１．３３に設定される。また、第１顕微鏡部１０の照明側ＮＡ（開口数）および検出側ＮＡが０．９５に設定され、第２顕微鏡部５０の照明側ＮＡおよび検出側ＮＡが０．５に設定される。
【0078】
図１２に、本実施形態におけるＰＯＴＦの分布を示す。図１２において、図８と同様に、黒色が濃いほどＰＯＴＦの絶対値が大きくなる。図１２に示すように、本実施形態におけるＰＯＴＦの分布の中心側に、missing cone領域を埋めるように、第２検出器８０から出力された光の検出信号に基づくＰＯＴＦが存在する。そのため、明視野観察による試料ＳＡの画像は、例えば図１０に示すように、本来の略球形の形状に近くなる。図１３に、本実施形態におけるＰＯＴＦのmissing cone領域を推定して補完したスペクトルの分布を示す。図１３に示すように、従来よりも広い範囲でＰＯＴＦのmissing cone領域を補完することができ、試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像は、例えば図１１に示すように、本来の略球形の形状に近くなる。
【0079】
また、ｆを空間周波数とし、照明側ＮＡ（開口数）を決定するレンズ(対物レンズ・コンデンサレンズ)の瞳関数をＰill（ｆ）とし、検出側ＮＡを決定するレンズ(対物レンズ・コンデンサレンズ)の瞳関数をＰcol（ｆ）とする。ＰＯＴＦは、照明系有効瞳関数と検出系有効瞳関数のコンボリューションで得られる。ケーラー照明顕微鏡である第１顕微鏡部１０において、照明系有効瞳関数は｜Ｐill（ｆ）｜2Ｐ*col（ｆ）、検出系有効瞳関数はＰcol（ｆ）となることが知られている。一方、非共焦点レーザー顕微鏡である第２顕微鏡部５０において、照明系有効瞳関数はＰill（ｆ）、検出系有効瞳関数は｜Ｐcol（ｆ）｜2Ｐill*（ｆ）となることが知られている。なお、コンボリューションは順序を入れ替えても変わらないため、ケーラー照明顕微鏡（第１顕微鏡部１０）および非共焦点レーザー顕微鏡（第２顕微鏡部５０）は、ＮＡ等の条件が同じである場合、同じＰＯＴＦが得られる。
【0080】
ケーラー照明顕微鏡（第１顕微鏡部１０）における照明瞳の位置に１次関数強度透過マスク（例えば、光の透過率が一次関数に従って瞳面内で一方向に沿って単調に増加もしくは減少する第１変調素子２５）を配置した場合、｜Ｐill（ｆ）｜2が１次関数となるため、照明系有効瞳関数が１次関数となる。そのため、ＰＯＴＦの分布が図１２に示す例では左右対称に大きくなり、光軸に対して直交する方向での試料ＳＡの解像度が改善される。一方、非共焦点レーザー顕微鏡（第２顕微鏡部５０）における検出瞳と共役な位置に１次関数強度透過マスク（例えば、光の透過率が一次関数に従って瞳と共役な面内で一方向に沿って単調に増加もしくは減少する第２変調素子７７）を配置した場合、｜Ｐcol（ｆ）｜2が１次関数となるため、検出系有効瞳関数が１次関数となる。そのため、ＰＯＴＦの分布が図１２に示す例では上下対称に大きくなり、光軸に対して直交する方向での試料ＳＡの解像度が改善される。ケーラー照明顕微鏡と非共焦点レーザー顕微鏡とを直交するように配置することによって、２つの方向（図１２に示す例では、ｘ方向とｚ方向）での解像度を改善することができ、透明な位相物体である試料ＳＡについて、３次元での正確な像を形成することができる。従って、ケーラー照明顕微鏡（第１顕微鏡部１０）による光の検出信号および、非共焦点レーザー顕微鏡（第２顕微鏡部５０）による光の検出信号に基づく演算により、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布をより正確に求めることが可能となる。
【0081】
なお、ケーラー照明顕微鏡（第１顕微鏡部１０）および非共焦点レーザー顕微鏡（第２顕微鏡部５０）は、照明側ＮＡと検出側ＮＡが同じである場合、下記の式（１２）を満足してもよい。
【0082】
【数12】
【0083】
ここで、ＮＡ_１は、ケーラー照明顕微鏡（第１顕微鏡部１０）のＮＡ（開口数）である。ＮＡ_２は、非共焦点レーザー顕微鏡（第２顕微鏡部５０）のＮＡ（開口数）である。ｎ_１は、ケーラー照明顕微鏡（第１顕微鏡部１０）での試料ＳＡにおける浸液の屈折率である。ｎ_２は、非共焦点レーザー顕微鏡（第２顕微鏡部５０）での試料ＳＡにおける浸液の屈折率である。式（１２）を満足することにより、ＰＯＴＦにおけるmissing cone領域が完全に埋まるため、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布をより正確に求めることが可能となる。
【0084】
また、第１顕微鏡部１０と第２顕微鏡部５０とを直交するように配置することが理想的であるが、これに限られるものではない。第１顕微鏡部１０と第２顕微鏡部５０とを異なる角度で配置しても、第１顕微鏡部１０のみを用いる場合と比較して、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布をより正確に求めることが可能である。
【0085】
ケーラー照明顕微鏡である第１顕微鏡部１０を垂直方向に配置し、非共焦点レーザー顕微鏡である第２顕微鏡部５０を水平方向に配置すれば、従来のケーラー照明顕微鏡の構成を利用することができるため、顕微鏡装置としての実用性が高くなる。但し、第１顕微鏡部と第２顕微鏡部との組み合わせは、ケーラー照明顕微鏡と非共焦点レーザー顕微鏡との組み合わせに限られるものではない。例えば、ケーラー照明顕微鏡同士の組み合わせや、非共焦点レーザー顕微鏡同士の組み合わせであっても、同様にして、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布をより正確に求めることが可能である。
【0086】
第１変調素子２５および第２変調素子７７の光の透過率は、一次関数に従って瞳の面内もしくは瞳と共役な面内で一方向に沿って単調に増加もしくは減少することが理想的であるが、これに限られるものではない。第１変調素子２５と第２変調素子７７のうち一方の光の透過率が、一次関数に従って瞳の面内もしくは瞳と共役な面内で一方向に沿って単調に増加もしくは減少するようにしてもよい。前述したように、第１変調素子２５と第２変調素子７７との少なくとも一方の光の透過率が、連続関数に従って瞳の面内もしくは瞳と共役な面内で一方向に沿って単調に増加もしくは減少してもよく、連続関数が、正弦関数、余弦関数、二次関数、ガウス関数のうちのいずれかの関数であってもよい。このような構成であっても、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布をより正確に求めることが可能である。
【0087】
前述したように、第１変調素子２５として、光の透過率の変化、すなわち光の透過率の分布が異なる複数の第１変調素子２５のうちいずれかを選択して照明瞳の位置Ｐ１に配置することが可能である。この場合、複数の第１変調素子２５を保持したターレット（図示せず）を設け、当該ターレットを回動させることで照明瞳の位置Ｐ１に配置する第１変調素子２５を選択してもよい。なお、複数の第１変調素子２５のうちいずれかを選択して照明瞳の位置Ｐ１に配置することが可能な素子選択部として、ターレットに限られず、スライダー等の既存の機構を用いてもよい。これにより、制御部９０が、複数の第１変調素子２５のうちいずれかに切り替えて照明瞳の位置Ｐ１に配置するように素子選択部を制御することで、照明瞳の面内における光の透過率の分布を変更する。
【0088】
また、第２変調素子７７として、光の透過率の分布が異なる複数の第２変調素子７７のうちいずれかを選択して検出瞳と共役な位置Ｐ２に配置することが可能である。この場合、複数の第２変調素子７７を保持したターレット（図示せず）を設け、当該ターレットを回動させることで検出瞳と共役な位置Ｐ２に配置する第２変調素子７７を選択してもよい。なお、複数の第２変調素子７７のうちいずれかを選択して検出瞳と共役な位置Ｐ２に配置する手段として、複数の第１変調素子２５のうちいずれかを選択して照明瞳の位置Ｐ１に配置する手段と同様の手段（素子選択部）を用いることが可能である。これにより、制御部９０が、複数の第２変調素子７７のうちいずれかに切り替えて検出瞳と共役な位置Ｐ２に配置するように素子選択部を制御することで、検出瞳と共役な面内における光の透過率の分布を変更する。
【0089】
次に、第１実施形態に係る顕微鏡装置１における屈折率のデータ生成方法について説明する。図１４は、第１実施形態に係るデータ生成方法を示すフローチャートである。なお、試料ＳＡは、予めステージ２の上に載置されているものとする。制御部９０は、例えばコンピュータシステムを含む。制御部９０は、記憶部に記憶されている制御プログラムを読み出し、この制御プログラムに従って各種の処理を実行する。
【0090】
まず、第１顕微鏡部１０の第１照明光学系２０は、第１の方向に向けた第１照明光を試料ＳＡに照射する（ステップＳＴ１）。次に、第１検出光学系３０は、第１照明光に照射に応じた試料ＳＡからの光を受ける（ステップＳＴ２）。次に、第１検出器４０は、第１検出光学系３０を介して試料ＳＡからの光を検出して光の検出信号を出力する（ステップＳＴ３）。次に、第２顕微鏡部５０の第２照明光学系７０は、第１の方向と直交する第２の方向に向けた第２照明光を試料ＳＡに照射する（ステップＳＴ４）。次に、第２検出光学系７５は、第２照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光を受ける（ステップＳＴ５）。次に、第２検出器８０は、第２検出光学系８５を介して試料ＳＡからの光を検出して光の検出信号を出力する（ステップＳＴ６）。なお、試料ＳＡのｚ方向の位置（光軸方向の位置）が異なる複数の断面の像、すなわち試料ＳＡのｚスタック像に対応する試料ＳＡの各断面からの光をそれぞれ検出するように、ステップＳＴ１～ＳＴ６の処理を繰り返す。例えば、ステップＳＴ１～ＳＴ３において、ステージ駆動部（図示せず）によりステージ２（試料ＳＡ）をｚ方向に移動させることで、第１顕微鏡部１０（第１検出器４０）により試料ＳＡの各断面からの光をそれぞれ検出してもよい。ステップＳＴ４～ＳＴ６において、第１ガルバノミラー５４と、第２ガルバノミラー５７と、液体レンズ５９により、試料ＳＡを３次元的に走査することで、第２顕微鏡部５０（第２検出器８０）により試料ＳＡの各断面からの光をそれぞれ検出してもよい。そして、画像処理部９１は、第１検出器４０から出力された光の検出信号および、第２検出器８０から出力された光の検出信号に基づいて、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布（例えば、試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像データ）を生成する（ステップＳＴ７）。このとき例えば、画像処理部９１は、第１検出器４０から出力された検出信号の信号強度に応じた試料ＳＡの像の強度と、第２検出器８０から出力された検出信号の信号強度に応じた試料ＳＡの像の強度とをマージして得られる試料ＳＡの像の強度に基づいて、上記の式（１０）と式（１１）とを用いて、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布を算出してもよい。これにより、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布をより正確に求めることができる。
【0091】
図１４に示すフローにおいて、第１顕微鏡部１０により、第１の方向に向けた第１照明光を試料ＳＡに照射して第１照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光を検出する工程（ステップＳＴ１～ＳＴ３）と、第２顕微鏡部５０により、第１の方向と直交する第２の方向に向けた第２照明光を試料ＳＡに照射して第２照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光を検出する工程（ステップＳＴ４～ＳＴ６）を、この順に行っているが、これに限られるものではない。例えば、第１顕微鏡部１０による各工程（ステップＳＴ１～ＳＴ３）と、第２顕微鏡部５０による各工程（ステップＳＴ４～ＳＴ６）を同時に行うようにしてもよい。これにより、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布を短時間で求めることができる。
【0092】
上述の第１実施形態において、画像処理部９１は、試料ＳＡのｚスタック像に対応する試料ＳＡの各断面について、第１検出器４０により検出された光の検出信号および、第２検出器８０により検出された光の検出信号に基づいて、３次元のデコンボリューションを行い、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布（例えば、試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像データ）を求めているが、これに限られるものではない。例えば、画像処理部９１は、試料ＳＡのｚスタック像に対応する試料ＳＡの断面ごとに、第１検出器４０により検出された光の検出信号および、第２検出器８０により検出された光の検出信号に基づいて、２次元のデコンボリューション（例えば、図１２に例示される３次元のＰＯＴＦの分布におけるＦｚ（Ｆｘ）＝０の断面でのＰＯＴＦに基づく２次元のデコンボリューション）を行い、試料ＳＡの各断面における屈折率分布を求めることで、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布を求めるようにしてもよい。
【0093】
上述の第１実施形態において、第２顕微鏡部５０の光源ユニット５１は、第１ガルバノミラー５４と第２ガルバノミラー５７とを有しているが、これに限られるものではない。例えば、図１５に示す顕微鏡装置１ａのように、第２顕微鏡部５０ａの光源ユニット５１ａは、１つだけガルバノミラー６４を有する構成であってもよい。この場合、光源ユニット５１ａにおいて、第２ガルバノミラー５７の代わりにミラー６７が配置される。第２ガルバノミラー５７に代えて、ステージ駆動部（図示せず）によりステージ２をｚ方向に移動させることで、試料ＳＡにおける第２照明光の集光位置をｚ方向に変化させる。また、ガルバノミラー６４は、第１ガルバノミラー５４と同様の構成であり、第２照明光の進行方向を変化させることで、試料ＳＡにおける第２照明光の集光位置をｙ方向に変化させる。ガルバノミラー６４と、液体レンズ５９と、ステージ駆動部により、試料ＳＡにおける第２照明光の集光位置を３次元方向に変化させて、試料ＳＡを３次元的に走査することが可能である。この場合、ステージ駆動部によりステージ２（試料ＳＡ）をｚ方向に移動させることで、第１顕微鏡部１０（第１検出器４０）により試料ＳＡの各断面からの光をそれぞれ検出するのに合わせて、ガルバノミラー６４と液体レンズ５９により試料ＳＡを走査して、第２顕微鏡部５０ａ（第２検出器８０）により試料ＳＡの各断面からの光をそれぞれ検出するようにしてもよい。これにより、第１顕微鏡部１０による各工程（ステップＳＴ１～ＳＴ３）と、第２顕微鏡部５０ａによる各工程（ステップＳＴ４～ＳＴ６）を同時に行うことが可能である。
【0094】
＜第２実施形態＞
次に、図１６を用いて、第２実施形態に係る顕微鏡装置１０１について説明する。第２実施形態に係る顕微鏡装置１０１は、第２顕微鏡部の他は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と要部が共通の構成である。そのため、第１実施形態と同様の構成については、第１実施形態と同一の符号を付して詳細な説明を省略する。第２実施形態に係る顕微鏡装置１０１は、第１顕微鏡部１１０と、第２顕微鏡部１５０とを有する。さらに、第２実施形態に係る顕微鏡装置１０１は、ステージ２と、制御部９０と、画像処理部９１とを有する。
次に、図１６を用いて、第２実施形態に係る顕微鏡装置１０１について説明する。第２実施形態に係る顕微鏡装置１０１は、第２顕微鏡部の他は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と要部が共通の構成である。そのため、第１実施形態と同様の構成については、第１実施形態と同一の符号を付して詳細な説明を省略する。第２実施形態に係る顕微鏡装置１０１は、第１顕微鏡部１１０と、第２顕微鏡部１５０とを有する。さらに、第２実施形態に係る顕微鏡装置１０１は、ステージ２と、制御部９０と、画像処理部９１とを有する。
【0095】
第１顕微鏡部１１０は、第１光源１１と、第１照明光学系２０と、第１検出光学系１３０と、第１検出器４０とを有する。第１光源１１と、第１照明光学系２０と、第１検出器４０は、第１実施形態と同様に構成される。第１検出光学系１３０は、第１実施形態と同様、試料ＳＡ側から順に、対物レンズユニット３１と、結像レンズ３６と、ミラー３７とを有する。さらに、第１検出光学系１３０は、第２顕微鏡部１５０のハーフミラー１７２を含む。対物レンズユニット３１と、結像レンズ３６と、ミラー３７は、第１実施形態と同様に構成される。
【0096】
第２顕微鏡部１５０は、光源ユニット５１と、第２照明光学系１７０と、第２検出光学系１７５と、第２検出器８０とを有する。光源ユニット５１と、第２検出器８０は、第１実施形態と同様に構成される。
【0097】
第２照明光学系１７０は、光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した第２照明光Ｌ２を－ｘ方向（第１の方向と直交する第２の方向）に向けて試料ＳＡに集光して照射する。第２照明光学系１７０は、図１６および図１７に示すように、ハーフミラー１７２と、照明用ミラー１７４とを有する。さらに、第２照明光学系１７０は、第１顕微鏡部１１０（第１検出光学系１３０）の対物レンズユニット３１（第１対物レンズ３２）を含む。
【0098】
ハーフミラー１７２は、第１顕微鏡部１１０（第１検出光学系１３０）における第１対物レンズ３２と結像レンズ３６との間の光路に配置される。ハーフミラー１７２の透過率と反射率の比率は、例えば１：１に設定される。ハーフミラー１７２は、光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した第２照明光Ｌ２の一部を第１対物レンズ３２における検出瞳（後側焦点面）に向けて反射させる。第１対物レンズ３２は、ハーフミラー１７２で反射した第２照明光Ｌ２を集光する。なお、ハーフミラー１７２で反射した第２照明光Ｌ２は、第１対物レンズ３２の中心軸に対し傾斜した方向から第１対物レンズ３２における検出瞳（後側焦点面）を通るため、第１対物レンズ３２を透過すると第１対物レンズ３２の中心軸に対しオフセットして＋ｚ方向に進む。照明用ミラー１７４は、第１対物レンズ３２（およびステージ２）の上方において試料ＳＡの右方に対向して配置される。照明用ミラー１７４は、第１対物レンズ３２を透過して第１対物レンズ３２の中心軸に対しオフセットして＋ｚ方向に進む第２照明光Ｌ２を、－ｘ方向（第２の方向）に向けて反射させる。第２顕微鏡部１５０における第２照明光学系１７０と第２検出光学系１７５との間の光軸ＡＸ２は、第１顕微鏡部１１０における第１照明光学系２０と第１検出光学系１３０との間の光軸ＡＸ１と直交する。
【0099】
第２検出光学系１７５は、試料ＳＡを挟んで第２照明光学系１７０と反対の側から第２照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光を受ける。第２検出光学系１７５は、図１６および図１７に示すように、試料ＳＡ側から順に、検出用第２対物レンズ１７６と、第２変調素子１７７とを有する。検出用第２対物レンズ１７６は、試料ＳＡを挟んで照明用ミラー１７４と反対の側に設けられる。検出用第２対物レンズ１７６には、第２照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光が入射する。第２変調素子１７７は、第２検出光学系１７５における検出用第２対物レンズ１７６の検出瞳と共役な面（検出瞳と共役な位置Ｐ２において第２顕微鏡部１５０（第２検出光学系１７５）の光軸ＡＸ２と垂直な面）に配置される。第２変調素子１７７は、第１実施形態に係る第２変調素子７７と同様に構成される。
【0100】
第２実施形態において、試料ＳＡの明視野観察を行う場合、第１顕微鏡部１１０の第１照明光学系２０は、第１実施形態と同様に、第１光源１１から発光した第１照明光Ｌ１を－ｚ方向（第１の方向）に向けて試料ＳＡに照射する。
【0101】
第１照明光学系２０の方から試料ＳＡを透過した第１検出光は、第１検出光学系１３０の第１対物レンズ３２に入射する。第１対物レンズ３２を透過した第１検出光は、ハーフミラー１７２に入射する。ハーフミラー１７２に入射した第１検出光の一部は、当該ハーフミラー１７２を透過して結像レンズ３６に入射する。結像レンズ３６を透過した第１検出光は、ミラー３７で反射して第１検出器４０が配置される所定の像面Ｉで結像する。第１検出器４０は、第１検出光学系１３０を介して試料ＳＡからの光（第１検出光）を検出し、当該光の検出信号を出力する。第１検出器４０から出力された光（第１検出光）の検出信号は、制御部９０を介して画像処理部９１に送信される。
【0102】
第２顕微鏡部１５０の光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した第２照明光Ｌ２は、第２照明光学系１７０のハーフミラー１７２に入射する。ハーフミラー１７２に入射した第２照明光Ｌ２の一部は、当該ハーフミラー１７２で反射して第１対物レンズ３２に入射し、第１対物レンズ３２の中心軸に対し傾斜した方向から第１対物レンズ３２における検出瞳を通る。第１対物レンズ３２を透過した第２照明光Ｌ２は、照明用ミラー１７４で反射して集光されてステージ２上の試料ＳＡに照射される。これにより、第２照明光学系１７０は、光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した第２照明光Ｌ２を－ｘ方向（第１の方向と直交する第２の方向）に向けて試料ＳＡに集光して照射する。
【0103】
第２照明光学系１７０の方から試料ＳＡを透過した第２検出光は、第２検出光学系１７５の検出用第２対物レンズ１７６に入射する。検出用第２対物レンズ１７６を透過した第２検出光は、第２変調素子１７７を通って第２検出器８０に入射する。第２検出器８０は、第２検出光学系１７５を介して試料ＳＡからの光（第２検出光）を検出し、当該光の検出信号を出力する。第２検出器８０から出力された光（第２検出光）の検出信号は、制御部９０を介して画像処理部９１に送信される。
【0104】
また、第２顕微鏡部１５０により試料ＳＡの蛍光観察を行う場合、第２顕微鏡部１５０の光源ユニット５１のシリンドリカルレンズ（図示せず）は、光源ユニット５１における第１レンズ５３と第１ガルバノミラー５４との間の光路に挿入される。また、第１対物レンズ３２と結像レンズ３６との間の光路に、ハーフミラー１７２に代えて蛍光フィルターキューブ１７３が挿入される。蛍光フィルターキューブ１７３は、ダイクロイックミラー１７３ａと、励起フィルター１７３ｂと、吸収フィルター１７３ｃとを有する。
【0105】
光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した励起光は、蛍光フィルターキューブ１７３の励起フィルター１７３ｂを通ってダイクロイックミラー１７３ａに入射する。蛍光フィルターキューブ１７３のダイクロイックミラー１７３ａに入射した励起光は、当該ダイクロイックミラー１７３ａで反射して第１対物レンズ３２に入射し、第１対物レンズ３２の中心軸に対し傾斜した方向から第１対物レンズ３２における検出瞳を通る。第１対物レンズ３２を透過した励起光は、照明用ミラー１７４で反射して集光されてステージ２上の試料ＳＡに照射される。これにより、第２照明光学系１７０は、光源ユニット５１（第２光源５２）から発光したシート光である励起光を試料ＳＡに照射する。
【0106】
励起光の照射によって、試料ＳＡに含まれる蛍光物質が励起されて蛍光が出射する。試料ＳＡからの蛍光は、第１検出光学系１３０の第１対物レンズ３２に入射する。第１対物レンズ３２を透過した蛍光は、蛍光フィルターキューブ１７３のダイクロイックミラー１７３ａに入射する。蛍光フィルターキューブ１７３のダイクロイックミラー１７３ａに入射した蛍光は、当該ダイクロイックミラー１７３ａを透過して吸収フィルター１７３ｃを通り、結像レンズ３６に入射する。結像レンズ３６を透過した蛍光は、ミラー３７で反射して第１検出器４０が配置される所定の像面Ｉで結像する。第１検出器４０は、第１検出光学系１３０を介して試料ＳＡからの蛍光を検出し、当該蛍光の検出信号を出力する。第１検出器４０から出力された蛍光の検出信号は、制御部９０を介して画像処理部９１に送信される。
【0107】
第２実施形態では、第１実施形態に係る屈折率のデータ生成方法と同様の方法で、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布（例えば、試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像データ）を生成することができる。そのため、第２実施形態によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。
【0108】
上述の第２実施形態において、第２顕微鏡部１５０の光源ユニット５１は、第１ガルバノミラー５４と第２ガルバノミラー５７とを有しているが、これに限られるものではない。例えば、図１８に示す顕微鏡装置１０１ａのように、第２顕微鏡部１５０ａの光源ユニット５１ａは、１つだけガルバノミラー６４を有する構成であってもよい。この場合、第１実施形態の変形例に係る顕微鏡装置１ａと同様に、光源ユニット５１ａにおいて、第２ガルバノミラー５７の代わりにミラー６７が配置される。
【0109】
＜第３実施形態＞
次に、図１９を用いて、第３実施形態に係る顕微鏡装置２０１について説明する。第３実施形態に係る顕微鏡装置２０１は、第２顕微鏡部の他は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と要部が共通の構成である。そのため、第１実施形態と同様の構成については、第１実施形態と同一の符号を付して詳細な説明を省略する。第３実施形態に係る顕微鏡装置２０１は、第１顕微鏡部２１０と、第２顕微鏡部２５０とを有する。さらに、第３実施形態に係る顕微鏡装置２０１は、ステージ２と、制御部９０と、画像処理部９１とを有する。
次に、図１９を用いて、第３実施形態に係る顕微鏡装置２０１について説明する。第３実施形態に係る顕微鏡装置２０１は、第２顕微鏡部の他は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と要部が共通の構成である。そのため、第１実施形態と同様の構成については、第１実施形態と同一の符号を付して詳細な説明を省略する。第３実施形態に係る顕微鏡装置２０１は、第１顕微鏡部２１０と、第２顕微鏡部２５０とを有する。さらに、第３実施形態に係る顕微鏡装置２０１は、ステージ２と、制御部９０と、画像処理部９１とを有する。
【0110】
第１顕微鏡部２１０は、第１光源１１と、第１照明光学系２０と、第１検出光学系２３０と、第１検出器４０とを有する。第１光源１１と、第１照明光学系２０と、第１検出器４０は、第１実施形態と同様に構成される。第１検出光学系２３０は、試料ＳＡ側から順に、対物レンズユニット３１と、結像レンズ３６と、偏光ビームスプリッタ２３７とを有する。さらに、第１検出光学系２３０は、第２顕微鏡部２５０のハーフミラー２７２を含む。対物レンズユニット３１と、結像レンズ３６とは、第１実施形態と同様に構成される。偏光ビームスプリッタ２３７は、第１照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光（ｓ偏光）を反射させ、第２照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光（ｐ偏光）を透過させる。
【0111】
第２顕微鏡部２５０は、光源ユニット５１と、第２照明光学系２７０と、第２検出光学系２７５と、第２検出器８０とを有する。光源ユニット５１と、第２検出器８０は、第１実施形態と同様に構成される。
【0112】
第２照明光学系２７０は、光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した第２照明光Ｌ２を－ｘ方向（第１の方向と直交する第２の方向）に向けて試料ＳＡに集光して照射する。第２照明光学系２７０は、図１９および図２０に示すように、ハーフミラー２７２と、照明用ミラー２７４とを有する。さらに、第２照明光学系２７０は、第１顕微鏡部２１０（第１検出光学系２３０）の対物レンズユニット３１（第１対物レンズ３２）を含む。
【0113】
ハーフミラー２７２は、第１顕微鏡部２１０（第１検出光学系２３０）における第１対物レンズ３２と結像レンズ３６との間の光路に配置される。ハーフミラー２７２の透過率と反射率の比率は、例えば１：１に設定される。ハーフミラー２７２は、光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した第２照明光Ｌ２の一部を第１対物レンズ３２における検出瞳（後側焦点面）に向けて反射させる。第１対物レンズ３２は、ハーフミラー２７２で反射した第２照明光Ｌ２を集光する。なお、ハーフミラー２７２で反射した第２照明光Ｌ２は、第１対物レンズ３２の中心軸に対し傾斜した方向から第１対物レンズ３２における検出瞳（後側焦点面）を通るため、第１対物レンズ３２を透過すると第１対物レンズ３２の中心軸に対しオフセットして＋ｚ方向に進む。照明用ミラー２７４は、第１対物レンズ３２（およびステージ２）の上方において試料ＳＡの右方に対向して配置される。照明用ミラー２７４は、第１対物レンズ３２を透過して第１対物レンズ３２の中心軸に対しオフセットして＋ｚ方向に進む第２照明光Ｌ２を、－ｘ方向（第２の方向）に向けて反射させる。第２顕微鏡部２５０における第２照明光学系２７０と第２検出光学系２７５との間の光軸ＡＸ２は、第１顕微鏡部２１０における第１照明光学系２０と第１検出光学系２３０との間の光軸ＡＸ１と直交する。
【0114】
第２検出光学系２７５は、試料ＳＡを挟んで第２照明光学系２７０と反対の側から第２照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光を受ける。第２検出光学系２７５は、図１９および図２０に示すように、検出用ミラー２７６と、リレーレンズ２７８と、第２変調素子２７７とを有する。さらに、第２検出光学系２７５は、第１顕微鏡部２１０（第１検出光学系２３０）の対物レンズユニット３１（第１対物レンズ３２）と、結像レンズ３６と、偏光ビームスプリッタ２３７と、第２照明光学系２７０のハーフミラー２７２とを含む。
【0115】
検出用ミラー２７６は、第１対物レンズ３２（およびステージ２）の上方において、試料ＳＡを挟んで照明用ミラー２７４と反対の側に設けられる。照明用ミラー２７４は、第２照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光を、第１対物レンズ３２の中心軸に対しオフセットした－ｚ方向（すなわち第１対物レンズ３２）に向けて反射させる。第１対物レンズ３２には、検出用ミラー２７６を介して第２照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光が入射する。リレーレンズ２７８は、偏光ビームスプリッタ２３７を透過した試料ＳＡからの光（ｐ偏光）を第２変調素子２７７に入射させる。第２変調素子２７７は、第２検出光学系２７５における第１対物レンズ３２の検出瞳と共役な面（検出瞳と共役な位置Ｐ２において第２顕微鏡部２５０（第２検出光学系２７５）の光軸と垂直な面）に配置される。第２変調素子２７７は、第１実施形態に係る第２変調素子７７と同様に構成される。
【0116】
第３実施形態において、試料ＳＡの明視野観察を行う場合、第１顕微鏡部１１０の第１照明光学系２０は、第１実施形態と同様に、第１光源１１から発光した第１照明光Ｌ１を－ｚ方向（第１の方向）に向けて試料ＳＡに照射する。なお、第３実施形態において、偏光ビームスプリッタ２３７に対してｓ偏光（第１検出光）が入射するように、例えば、第１照明光学系２０における光路（例えば、コレクタレンズ２１と視野絞り２３との間の光路）に偏光板（図示せず）が配置される。
【0117】
第１照明光学系２０の方から試料ＳＡを透過した第１検出光（ｓ偏光）は、第１検出光学系２３０の第１対物レンズ３２に入射する。第１対物レンズ３２を透過した第１検出光は、ハーフミラー２７２に入射する。ハーフミラー２７２に入射した第１検出光の一部は、当該ハーフミラー２７２を透過して結像レンズ３６に入射する。結像レンズ３６を透過した第１検出光（ｓ偏光）は、偏光ビームスプリッタ２３７で反射して第１検出器４０が配置される所定の像面Ｉで結像する。第１検出器４０は、第１検出光学系２３０を介して試料ＳＡからの光（第１検出光）を検出し、当該光の検出信号を出力する。第１検出器４０から出力された光（第１検出光）の検出信号は、制御部９０を介して画像処理部９１に送信される。
【0118】
第２顕微鏡部２５０の光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した第２照明光Ｌ２は、第２照明光学系２７０のハーフミラー２７２に入射する。なお、第３実施形態において、偏光ビームスプリッタ２３７に対してｐ偏光（第２検出光）が入射するように、例えば、光源ユニット５１（第２光源５２）が直線偏光である第２照明光Ｌ２を発光させる。ハーフミラー２７２に入射した第２照明光Ｌ２の一部は、当該ハーフミラー２７２で反射して第１対物レンズ３２に入射し、第１対物レンズ３２の中心軸に対し傾斜した方向から第１対物レンズ３２における検出瞳を通る。第１対物レンズ３２を透過した第２照明光Ｌ２は、照明用ミラー２７４で反射して集光されてステージ２上の試料ＳＡに照射される。これにより、第２照明光学系２７０は、光源ユニット５１（第２光源５２）から発光した第２照明光Ｌ２を－ｘ方向（第１の方向と直交する第２の方向）に向けて試料ＳＡに集光して照射する。
【0119】
第２照明光学系２７０の方から試料ＳＡを透過した第２検出光（ｐ偏光）は、第２検出光学系２７５の検出用ミラー２７６で反射して第１対物レンズ３２に入射する。第１対物レンズ３２を透過した第２検出光は、ハーフミラー２７２に入射する。ハーフミラー２７２に入射した第２検出光の一部は、当該ハーフミラー２７２を透過して結像レンズ３６に入射する。結像レンズ３６を透過した第２検出光（ｐ偏光）は、偏光ビームスプリッタ２３７を透過してリレーレンズ２７８に入射する。リレーレンズ２７８を透過した第２検出光は、第２変調素子２７７を通って第２検出器８０に入射する。第２検出器８０は、第２検出光学系２７５を介して試料ＳＡからの光（第２検出光）を検出し、当該光の検出信号を出力する。第２検出器８０から出力された光（第２検出光）の検出信号は、制御部９０を介して画像処理部９１に送信される。
【0120】
第３実施形態では、第１実施形態に係る屈折率のデータ生成方法と同様の方法で、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布（例えば、試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像データ）を生成することができる。そのため、第３実施形態によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。
【0121】
上述の第３実施形態において、第２顕微鏡部２５０の光源ユニット５１は、第１ガルバノミラー５４と第２ガルバノミラー５７とを有しているが、これに限られるものではない。例えば、図２１に示す顕微鏡装置２０１ａのように、第２顕微鏡部２５０ａの光源ユニット５１ａは、１つだけガルバノミラー６４を有する構成であってもよい。この場合、第１実施形態の変形例に係る顕微鏡装置１ａと同様に、光源ユニット５１ａにおいて、第２ガルバノミラー５７の代わりにミラー６７が配置される。
【0122】
＜第４実施形態＞
次に、図２２および図２３を用いて、第４実施形態に係る顕微鏡装置３０１について説明する。第４実施形態に係る顕微鏡装置３０１は、第１顕微鏡部と第２顕微鏡部の他は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と共通の構成である。そのため、第１実施形態と同様の構成については、第１実施形態と同一の符号を付して詳細な説明を省略する。第４実施形態に係る顕微鏡装置３０１は、図２２および図２３に示すように、第１顕微鏡部３１０と、第２顕微鏡部３５０とを有する。さらに、第４実施形態に係る顕微鏡装置３０１は、図２３に示すように、ステージ２と、制御部９０と、画像処理部９１とを有する。なお、第４実施形態において、図２３に示すように、第２顕微鏡部３５０の光軸方向（上下方向）に延びる座標軸をｚ軸とし、ｚ軸と垂直な座標軸をｘ軸およびｙ軸とする。
次に、図２２および図２３を用いて、第４実施形態に係る顕微鏡装置３０１について説明する。第４実施形態に係る顕微鏡装置３０１は、第１顕微鏡部と第２顕微鏡部の他は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と共通の構成である。そのため、第１実施形態と同様の構成については、第１実施形態と同一の符号を付して詳細な説明を省略する。第４実施形態に係る顕微鏡装置３０１は、図２２および図２３に示すように、第１顕微鏡部３１０と、第２顕微鏡部３５０とを有する。さらに、第４実施形態に係る顕微鏡装置３０１は、図２３に示すように、ステージ２と、制御部９０と、画像処理部９１とを有する。なお、第４実施形態において、図２３に示すように、第２顕微鏡部３５０の光軸方向（上下方向）に延びる座標軸をｚ軸とし、ｚ軸と垂直な座標軸をｘ軸およびｙ軸とする。
【0123】
第１顕微鏡部３１０は、図２２および図２３に示すように、第１光源３１１と、第１照明光学系３２０と、第１検出光学系３３０と、第１検出器３４０とを有する。第１光源３１１は、第１実施形態に係る第１光源１１と同様に構成される。第１光源３１１は、第１照明光を発生させる。また、第１光源３１１は、照明瞳と共役な位置に配置される。
【0124】
第１照明光学系３２０は、第１光源３１１から発光した第１照明光Ｌ１を＋ｘ方向（第１の方向）に向けて試料ＳＡに照射する。なお、図２３においては、第２照明光Ｌ２と区別し易くするため、第１照明光Ｌ１を破線で示す。第１照明光学系３２０は、図２３に示すように、第１光源３１１側から順に、コレクタレンズ３２１と、視野絞り（図示せず）と、リレーレンズ３２４と、第１変調素子３２５と、開口絞り（図示せず）と、コンデンサレンズ３２７とを有する。コレクタレンズ３２１、視野絞り、リレーレンズ３２４、第１変調素子３２５、開口絞り、およびコンデンサレンズ３２７は、ｘ方向に並んで配置される他は、第１実施形態に係るコレクタレンズ２１、視野絞り２３、リレーレンズ２４、第１変調素子２５、開口絞り２６、およびコンデンサレンズ２７と同様に構成される。なお、コンデンサレンズ３２７は、ステージ２の左方に対向して配置される。また、第１光源３１１として白色光源が用いられる場合、第１実施形態と同様に、第１照明光の波長帯域を狭くする素子（例えば、バンドパスフィルター）が設けられてもよい。
【0125】
第１検出光学系３３０は、試料ＳＡを挟んで第１照明光学系３２０と反対の側から第１照明光Ｌ１の照射に応じた試料ＳＡからの光を受ける。第１検出光学系３３０は、図２３および図２４に示すように、試料ＳＡ側から順に、第１対物レンズ３３２と、結像レンズ３３６とを有する。第１対物レンズ３３２は、試料ＳＡを挟んでコンデンサレンズ３２７と反対の側に設けられる。第１対物レンズ３３２には、第１照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光が入射する。第１対物レンズ３３２を透過した光は、結像レンズ３３６に入射する。結像レンズ３３６を透過した光は、所定の像面Ｉ（図２２を参照）で結像する。
【0126】
第１検出光学系３３０の像面Ｉに、第１検出器３４０が配置される。第１検出器３４０は、第１実施形態に係る第１検出器４０と同様に構成される。第１検出器３４０は、第１検出光学系３３０を介して試料ＳＡからの光を検出する。
【0127】
第２顕微鏡部３５０は、図２２および図２３に示すように、光源ユニット３５１と、第２照明光学系３６０と、第２検出光学系３７０と、第２検出器３８０とを有する。光源ユニット３５１は、ビーム操作ユニット（Beam Steering unit）とも称される。光源ユニット３５１は、図２３に示すように、第２光源３５２と、第１レンズ３５３と、第１ガルバノミラー３５４と、第２レンズ３５５と、第３レンズ３５６と、第２ガルバノミラー３５７と、第４レンズ３５８とを有する。また、光源ユニット３５１は、第１レンズ３５３と第１ガルバノミラー３５４との間の光路に挿脱可能なシリンドリカルレンズ（図示せず）を有する。
【0128】
第２光源３５２、第１レンズ３５３、第１ガルバノミラー３５４、第２レンズ３５５、第３レンズ３５６、および第２ガルバノミラー３５７は、第１実施形態に係る第２光源５２、第１レンズ５３、第１ガルバノミラー５４、第２レンズ５５、第３レンズ５６、および第２ガルバノミラー５７と同様に構成される。なお、第１ガルバノミラー３５４が第２照明光の進行方向を変化させることで、試料ＳＡにおける第２照明光の集光位置をｙ方向に変化させる。第２ガルバノミラー３５７が第２照明光の進行方向を変化させることで、試料ＳＡにおける第２照明光の集光位置をｘ方向に変化させる。
【0129】
第４レンズ３５８は、第２ガルバノミラー３５７で反射した第２照明光を所定の中間像面ＩＭで集光させて、第２照明光学系３６０に入射させる。所定の中間像面ＩＭの位置は、試料ＳＡにおける第２対物レンズ３６６の焦点位置と共役な位置である。第１ガルバノミラー３５４と、第２ガルバノミラー３５７と、ステージ駆動部により、試料ＳＡにおける第２照明光の集光位置を３次元方向（ｘ方向とｙ方向とｚ方向の３つの方向）に変化させて、試料ＳＡを３次元的に走査することが可能である。
【0130】
第２照明光学系３６０は、光源ユニット３５１（第２光源３５２）から発光した第２照明光Ｌ２を＋ｚ方向（第１の方向と直交する第２の方向）に向けて試料ＳＡに集光して照射する。第２照明光学系３６０は、図２２および図２３に示すように、光源ユニット３５１側から順に、ミラー３６１と、コリメータレンズ３６２と、対物レンズユニット３６６とを有する。ミラー３６１は、光源ユニット３５１（第２光源３５２）から発光した第２照明光Ｌ２をコリメータレンズ３６２に向けて反射させる。コリメータレンズ３６２は、ミラー３６１で反射した第２照明光Ｌ２を平行にする。
【0131】
対物レンズユニット３６６は、複数の照明用第２対物レンズ３６７と、レンズ保持部３６８と、ユニット駆動部３６９とを有する。照明用第２対物レンズ３６７は、ステージ２の下方に対向して配置される。レンズ保持部３６８は、光学特性が異なる複数の照明用第２対物レンズ３６７を保持する。レンズ保持部３６８は、例えば、レボルバやターレット等を用いて構成される。ユニット駆動部３６９は、レンズ保持部３６８を駆動し、複数の照明用第２対物レンズ３６７のうちいずれかを選択してステージ２の下方に配置することが可能である。なお、ユニット駆動部３６９は、レンズ保持部３６８をｚ軸に沿って移動させてもよい。この場合、前述のステージ駆動部を併用してもよいし、ステージ駆動を使わなくてもよい。
【0132】
ステージ２の下方に配置された照明用第２対物レンズ３６７は、コリメータレンズ３６２を透過した第２照明光Ｌ２を試料ＳＡに集光する。図２４にも示すように、第２顕微鏡部３５０における第２照明光学系３６０と第２検出光学系３７０との間の光軸ＡＸ２は、第１顕微鏡部３１０における第１照明光学系３２０と第１検出光学系３３０との間の光軸ＡＸ１と直交する。
【0133】
第２検出光学系３７０は、試料ＳＡを挟んで第２照明光学系３６０と反対の側から第２照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光を受ける。第２検出光学系３７０は、図２２および図２３に示すように、試料ＳＡ側から順に、検出用第２対物レンズ３７１と、開口絞り３７２と、第２変調素子３７３と、集光レンズ３７４と、ミラー３７６と、リレーレンズ３７７とを有する。検出用第２対物レンズ３７１は、試料ＳＡを挟んで照明用第２対物レンズ３６７と反対の側に設けられる。検出用第２対物レンズ３７１として、光学特性が異なる複数の検出用第２対物レンズ３７１のうちいずれかを選択してステージ２の上方に配置することが可能である。検出用第２対物レンズ３７１には、第２照明光の照射に応じた試料ＳＡからの光が入射する。
【0134】
開口絞り３７２および第２変調素子３７３は、第２検出光学系３７０における検出用第２対物レンズ３７１の検出瞳と共役な面（検出瞳と共役な位置Ｐ２Ａにおいて第２顕微鏡部３５０（第２検出光学系３７０）の光軸と垂直な面）に配置される。第２変調素子３７３は、開口絞り３７２に隣接して（一例として、図２３のように開口絞り３７２の上側に）配置される。第２変調素子３７３は、第１実施形態に係る第２変調素子７７と同様に構成される。集光レンズ３７４は、開口絞り３７２および第２変調素子３７３を通った光を集光する。ミラー３７６は、集光レンズ３７４を透過した光をリレーレンズ３７７に向けて反射させる。リレーレンズ３７７は、ミラー３７６で反射した光を第２検出器３８０に入射させる。
【0135】
第２検出器３８０は、第２検出光学系３７０における検出瞳と共役な位置Ｐ２Ｂに配置される。第２検出器３８０は、第１実施形態に係る第２検出器８０と同様に構成される。第２検出器３８０は、第２検出光学系３７０を介して試料ＳＡからの光を検出する。
【0136】
第４実施形態において、試料ＳＡの明視野観察を行う場合、第１顕微鏡部３１０の第１光源３１１から発光した第１照明光Ｌ１は、第１照明光学系３２０のコレクタレンズ３２１に入射する。コレクタレンズ３２１を透過した第１照明光Ｌ１は、平行光となって視野絞り（図示せず）を通り、リレーレンズ３２４に入射する。リレーレンズ３２４を透過した第１照明光Ｌ１は、第１変調素子３２５と開口絞り（図示せず）とを通ってコンデンサレンズ３２７に入射する。コンデンサレンズ３２７を透過した第１照明光Ｌ１は、平行光となってステージ２上の試料ＳＡに照射される。これにより、第１照明光学系３２０は、第１光源３１１から発光した第１照明光Ｌ１を＋ｘ方向（第１の方向）に向けて試料ＳＡに照射する。
【0137】
第１照明光学系３２０の方から試料ＳＡを透過した第１検出光は、第１検出光学系３３０の第１対物レンズ３３２に入射する。第１対物レンズ３３２を透過した第１検出光は、結像レンズ３３６に入射する。結像レンズ３３６を透過した第１検出光は、第１検出器３４０が配置される所定の像面Ｉで結像する。第１検出器３４０は、第１検出光学系３３０を介して試料ＳＡからの光（第１検出光）を検出し、当該光の検出信号を出力する。第１検出器３４０から出力された光（第１検出光）の検出信号は、制御部９０を介して画像処理部９１に送信される。
【0138】
なお、試料ＳＡの明視野観察を行う場合、第２顕微鏡部３５０の光源ユニット３５１のシリンドリカルレンズ（図示せず）は、光源ユニット３５１における第１レンズ３５３と第１ガルバノミラー３５４との間の光路から退避される。光源ユニット３５１の第２光源３５２から発光した第２照明光は、第１レンズ３５３に入射する。第１レンズ３５３を透過した第２照明光は、平行光となって第１ガルバノミラー３５４で反射する。第１ガルバノミラー３５４で反射した第２照明光は、第２レンズ３５５および第３レンズ３５６を透過し、第２ガルバノミラー３５７で反射する。第２ガルバノミラー３５７で反射した第２照明光は、第４レンズ３５８を透過して光源ユニット３５１の外部に射出される。これにより、光源ユニット３５１は、第２照明光を発光させる。
【0139】
光源ユニット３５１（第２光源３５２）から発光した第２照明光Ｌ２は、第２照明光学系３６０のミラー３６１で反射してコリメータレンズ３６２に入射する。コリメータレンズ３６２を透過した第２照明光Ｌ２は、平行光となって照明用第２対物レンズ３６７に入射する。照明用第２対物レンズ３６７を透過した第２照明光Ｌ２は、集光されてステージ２上の試料ＳＡに照射される。これにより、第２照明光学系３６０は、光源ユニット３５１（第２光源３５２）から発光した第２照明光Ｌ２を＋ｚ方向（第１の方向と直交する第２の方向）に向けて試料ＳＡに集光して照射する。
【0140】
第２照明光学系３６０の方から試料ＳＡを透過した第２検出光は、第２検出光学系３７０の検出用第２対物レンズ３７１に入射する。検出用第２対物レンズ３７１を透過した第２検出光は、開口絞り３７２と第２変調素子３７３とを通って集光レンズ３７４に入射する。集光レンズ３７４を透過した第２検出光は、ミラー３７６で反射してリレーレンズ３７７に入射する。リレーレンズ３７７を透過した第２検出光は、第２検出器３８０に入射する。第２検出器３８０は、第２検出光学系３７０を介して試料ＳＡからの光（第２検出光）を検出し、当該光の検出信号を出力する。第２検出器３８０から出力された光（第２検出光）の検出信号は、制御部９０を介して画像処理部９１に送信される。
【0141】
また、第２顕微鏡部３５０により試料ＳＡの蛍光観察を行う場合、第２顕微鏡部３５０の光源ユニット３５１のシリンドリカルレンズ（図示せず）は、光源ユニット３５１における第１レンズ３５３と第１ガルバノミラー３５４との間の光路に挿入される。
【0142】
光源ユニット３５１（第２光源３５２）から発光した励起光は、第２照明光学系３６０のミラー３６１で反射してコリメータレンズ３６２に入射する。コリメータレンズ３６２を透過した励起光は、平行光となって照明用第２対物レンズ３６７に入射する。照明用第２対物レンズ３６７を透過した励起光は、集光されてステージ２上の試料ＳＡに照射される。
【0143】
励起光の照射によって、試料ＳＡに含まれる蛍光物質が励起されて蛍光が出射する。試料ＳＡからの蛍光は、第１顕微鏡部３１０の第１検出光学系３３０の第１対物レンズ３３２に入射する。第１対物レンズ３３２を透過した蛍光は、結像レンズ３３６に入射する。結像レンズ３３６を透過した蛍光は、第１検出器３４０が配置される所定の像面Ｉで結像する。第１検出器３４０は、第１検出光学系３３０を介して試料ＳＡからの蛍光を検出し、当該蛍光の検出信号を出力する。第１検出器３４０から出力された蛍光の検出信号は、制御部９０を介して画像処理部９１に送信される。
【0144】
第４実施形態では、第１実施形態に係る屈折率のデータ生成方法と同様の方法で、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布（例えば、試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像データ）を生成することができる。そのため、第４実施形態によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。
【0145】
＜第５実施形態＞
次に、図２５を用いて、第５実施形態に係る顕微鏡装置４０１について簡潔に説明する。第５実施形態に係る顕微鏡装置４０１は、第２顕微鏡部の他は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と要部が共通の構成である。そのため、第１実施形態と同様の構成については、第１実施形態と同一の符号を付して詳細な説明を省略する。第５実施形態に係る顕微鏡装置４０１は、第１顕微鏡部４１０と、第２顕微鏡部４５０とを有する。さらに、第５実施形態に係る顕微鏡装置４０１は、図示を省略するが、ステージと、制御部と、画像処理部とを有する。ステージ、制御部、および画像処理部は、第１実施形態に係るステージ２、制御部９０、および画像処理部９１と同様に構成される。
次に、図２５を用いて、第５実施形態に係る顕微鏡装置４０１について簡潔に説明する。第５実施形態に係る顕微鏡装置４０１は、第２顕微鏡部の他は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と要部が共通の構成である。そのため、第１実施形態と同様の構成については、第１実施形態と同一の符号を付して詳細な説明を省略する。第５実施形態に係る顕微鏡装置４０１は、第１顕微鏡部４１０と、第２顕微鏡部４５０とを有する。さらに、第５実施形態に係る顕微鏡装置４０１は、図示を省略するが、ステージと、制御部と、画像処理部とを有する。ステージ、制御部、および画像処理部は、第１実施形態に係るステージ２、制御部９０、および画像処理部９１と同様に構成される。
【0146】
第１顕微鏡部４１０は、第１光源１１と、第１照明光学系２０と、第１検出光学系３０と、第１検出器４０とを有する。第１光源１１と、第１照明光学系２０と、第１検出光学系３０と、第１検出器４０は、第１実施形態と同様に構成される。なお、第１照明光学系２０の第１変調素子２５は、照明瞳の位置Ｐ１Ａに配置される。第１検出器４０は、所定の像面ＩＡに配置される。
【0147】
第２顕微鏡部４５０は、第２光源４５１と、第２照明光学系４６０と、第２検出光学系４７０と、第２検出器４８０とを有する。第２光源４５１は、第４実施形態に係る第１光源３１１と同様に構成される。第２照明光学系４６０は、第４実施形態に係る第１照明光学系３２０と同様に構成される。なお、第２照明光学系４６０の第２変調素子４６５は、第４実施形態に係る第１変調素子３２５と同様に構成され、照明瞳の位置Ｐ１Ｂに配置される。第２検出光学系４７０は、第４実施形態に係る第１検出光学系３３０と同様に構成される。第２検出器４８０は、第４実施形態に係る第１検出器３４０と同様に構成され、所定の像面ＩＢに配置される。
【0148】
第５実施形態では、第１実施形態に係る屈折率のデータ生成方法と同様の方法で、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布（例えば、試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像データ）を生成することができる。そのため、第５実施形態によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。
【0149】
＜第６実施形態＞
次に、図２６を用いて、第６実施形態に係る顕微鏡装置５０１について簡潔に説明する。第６実施形態に係る顕微鏡装置５０１は、第１顕微鏡部の他は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と要部が共通の構成である。そのため、第１実施形態と同様の構成については、第１実施形態と同一の符号を付して詳細な説明を省略する。第６実施形態に係る顕微鏡装置５０１は、第１顕微鏡部５１０と、第２顕微鏡部５５０とを有する。さらに、第６実施形態に係る顕微鏡装置５０１は、図示を省略するが、ステージと、制御部と、画像処理部とを有する。ステージ、制御部、および画像処理部は、第１実施形態に係るステージ２、制御部９０、および画像処理部９１と同様に構成される。
次に、図２６を用いて、第６実施形態に係る顕微鏡装置５０１について簡潔に説明する。第６実施形態に係る顕微鏡装置５０１は、第１顕微鏡部の他は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と要部が共通の構成である。そのため、第１実施形態と同様の構成については、第１実施形態と同一の符号を付して詳細な説明を省略する。第６実施形態に係る顕微鏡装置５０１は、第１顕微鏡部５１０と、第２顕微鏡部５５０とを有する。さらに、第６実施形態に係る顕微鏡装置５０１は、図示を省略するが、ステージと、制御部と、画像処理部とを有する。ステージ、制御部、および画像処理部は、第１実施形態に係るステージ２、制御部９０、および画像処理部９１と同様に構成される。
【0150】
第１顕微鏡部５１０は、第１光源５１２を有する第１光源ユニット５１１と、第１照明光学系５２０と、第１検出光学系５３０と、第１検出器５４０とを有する。第１光源ユニット５１１は、第４実施形態に係る第２光源ユニット３５１と同様に構成される。第１照明光学系５２０は、第４実施形態に係る第２照明光学系３６０と同様に構成される。第１検出光学系５３０は、第４実施形態に係る第２検出光学系３７０と同様に構成される。なお、第１検出光学系５３０の第１変調素子５３３は、第４実施形態に係る第２変調素子３７３と同様に構成され、検出瞳と共役な位置Ｐ２Ａに配置される。第１検出器５４０は、第４実施形態に係る第２検出器３８０と同様に構成され、検出瞳と共役な位置Ｐ２Ｂに配置される。
【0151】
第２顕微鏡部５５０は、光源ユニット５１と、第２照明光学系７０と、第２検出光学系７５と、第２検出器８０とを有する。光源ユニット５１と、第２照明光学系７０と、第２検出光学系７５と、第２検出器８０は、第１実施形態と同様に構成される。なお、第２検出光学系７５の第２変調素子７７は、検出瞳と共役な位置Ｐ２Ｃに配置される。第２検出器８０も、検出瞳と共役な位置Ｐ２Ｃに配置される。
【0152】
第６実施形態では、第１実施形態に係る屈折率のデータ生成方法と同様の方法で、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布（例えば、試料ＳＡの３次元の屈折率分布の画像データ）を生成することができる。そのため、第６実施形態によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。
【0153】
＜変形例＞
上述の第１～第３実施形態において、第１顕微鏡部１０，１１０，２１０の第１検出光学系３０，１３０，２３０は、第１照明光学系２０と別体に設けられているが、これに限られるものではなく、第１照明光学系の一部を含んでもよい。例えば、図２７に示すように、変形例に係る第１顕微鏡部６１０は、第１光源１１と、第１照明光学系６２０と、第１検出光学系６３０と、第１検出器４０とを有する。第１光源１１と、第１検出器４０は、第１実施形態と同様に構成される。
上述の第１～第３実施形態において、第１顕微鏡部１０，１１０，２１０の第１検出光学系３０，１３０，２３０は、第１照明光学系２０と別体に設けられているが、これに限られるものではなく、第１照明光学系の一部を含んでもよい。例えば、図２７に示すように、変形例に係る第１顕微鏡部６１０は、第１光源１１と、第１照明光学系６２０と、第１検出光学系６３０と、第１検出器４０とを有する。第１光源１１と、第１検出器４０は、第１実施形態と同様に構成される。
【0154】
第１照明光学系６２０は、第１光源１１側から順に、コレクタレンズ６２１と、第１リレーレンズ６２２と、第１変調素子６２３と、第２リレーレンズ６２４と、集光レンズ６２５と、ハーフミラー６２６と、対物レンズユニット６３１と、照明用ミラー６２８とを有する。なお、第１光源１１として白色光源が用いられる場合、第１実施形態と同様に、第１照明光の波長帯域を狭くする素子（例えば、バンドパスフィルター）が設けられてもよい。第１変調素子６２３は、第１リレーレンズ６２２と第２リレーレンズ６２４との間の照明瞳の位置Ｐ１において第１照明光学系６２０の光軸ＡＸ１と垂直な面に配置される。第１変調素子６２３は、第１実施形態に係る第１変調素子２５と同様に構成される。
【0155】
ハーフミラー６２６は、第１光源１１からの第１照明光の一部をステージ２に向けて反射させる。ハーフミラー６２６は、ステージ２上の試料ＳＡを透過した光（第１検出光）の一部を検出光学系６３０の結像レンズ６３６に向けて透過させる。ハーフミラー６２６の透過率と反射率の比率は、例えば１：１に設定される。対物レンズユニット６３１は、複数の第１対物レンズ６３２と、レンズ保持部６３３と、ユニット駆動部６３４とを有する。第１対物レンズ６３２は、ステージ２の下方に対向して配置される。レンズ保持部６３３は、焦点距離が異なる複数の第１対物レンズ６３２を保持する。レンズ保持部６３３は、例えば、レボルバやターレット等を用いて構成される。ユニット駆動部６３４は、レンズ保持部６３３を駆動し、複数の第１対物レンズ６３２のうちいずれかを選択してステージ２の下方に配置することが可能である。照明用ミラー６２８は、ステージ２の上方に対向して配置される。
【0156】
第１検出光学系６３０は、対物レンズユニット６３１と、ハーフミラー６２６とを含む。さらに、第１検出光学系６３０は、ハーフミラー６２６側から順に、結像レンズ６３６と、ミラー６３７とを有する。結像レンズ６３６およびミラー６３７は、第１実施形態に係る結像レンズ３６およびミラー３７と同様に構成される。
【0157】
第１顕微鏡部６１０の第１光源１１から発光した第１照明光は、第１照明光学系６２０のコレクタレンズ６２１に入射する。コレクタレンズ６２１を透過した第１照明光は、平行光となって第１リレーレンズ６２２に入射する。第１リレーレンズ６２２を透過した第１照明光は、第１変調素子６２３を通って第２リレーレンズ６２４に入射する。第２リレーレンズ６２４を透過した第１照明光は、集光レンズ６２５を通ってハーフミラー６２６に入射する。ハーフミラー６２６に入射した第１照明光の一部は、当該ハーフミラー６２６で反射して第１対物レンズ６３２に入射する。第１対物レンズ６３２を透過した第１照明光は、ステージ２および試料ＳＡを透過して照明用ミラー６２８で反射する。照明用ミラー６２８で反射した第１照明光は、ステージ２上の試料ＳＡに照射される。これにより、第１照明光学系６２０は、第１光源１１から発光した第１照明光を－ｚ方向（第１の方向）に向けて試料ＳＡに照射する。
【0158】
照明用ミラー６２８で反射して試料ＳＡを透過した第１検出光は、第１検出光学系６３０としての第１対物レンズ６３２に入射する。第１対物レンズ６３２を透過した第１検出光は、ハーフミラー６２６に入射する。ハーフミラー６２６に入射した第１検出光の一部は、当該ハーフミラー６２６を透過して結像レンズ６３６に入射する。結像レンズ６３６を透過した第１検出光は、ミラー６３７で反射して第１検出器４０が配置される所定の像面Ｉで結像する。第１検出器４０は、第１検出光学系６３０を介して試料ＳＡからの光（第１検出光）を検出し、当該光の検出信号を出力する。
【0159】
上述の各実施形態において、画像処理部９１は、光の透過率に関して１つの検出条件で検出された光の検出信号に基づいて、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布を求めているが、これに限られるものではない。画像処理部９１は、光の透過率に関して複数の検出条件で検出された光の検出信号に基づいて、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布を求めてもよい。例えば、画像処理部９１は、ユーザーの設定等による２つの検出条件で検出された光の検出信号に基づくＰＯＴＦの線形和もしくは差分を求める。これにより、ユーザーの設定等による１つの検出条件で検出された光の検出信号に基づく場合よりも、広範囲の周波数帯域にわたり、高いＰＯＴＦの絶対値を得ることができる。そのため、コントラストと解像度（分解能）が共に高い、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布の画像を生成することができる。なお、画像処理部９１は、ＰＯＴＦを含む上記の式（１０）と式（１１）とを用いて、試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布ｎ（ｘ，ｙ，ｚ）を算出することが可能である。
【0160】
例えば、第１～第４実施形態に係る顕微鏡装置において、第１の検出条件では、光の透過率が図４に示す例において一次関数に従って変化する第１変調素子（一方向変化の第１変調素子）を照明瞳の位置に配置する。第２の検出条件では、光の透過率が一次関数に従って図４に示す例（第１の検出条件）とは逆方向に変化する第１変調素子（逆方向変化の第１変調素子）を照明瞳の位置に配置する。この変形例において、第１の検出条件で検出された光の検出信号に基づくＰＯＴＦと、第２の検出条件で検出された光の検出信号に基づくＰＯＴＦとの差分を求める。そうすると、第１の検出条件におけるＰＯＴＦの値と、第２の検出条件におけるＰＯＴＦの値とが互いに逆の符号になるため、ＰＯＴＦの絶対値が０にはならない周波数帯域の広さは大きく変化しないものの、ＰＯＴＦの絶対値が増加する。従って、コントラストに優れた試料ＳＡにおける３次元の屈折率分布の画像を生成することができる。
【0161】
上述の各実施形態において、第１変調素子および第２変調素子は、平板の面内で光の透過率が変化する素子として、ガラス基板等の平行平板に、光の透過率を低減させることが可能な膜を蒸着させることにより形成されている素子を例示しているが、これに限られるものではない。例えば、第１変調素子と第２変調素子との少なくとも一方は、ガラス基板等の平行平板に、光の透過率を低減させることが可能な（遮光性のある）微小なドットパターンを形成したものであってもよい。この場合、既存のリソグラフィープロセス等を用いて、平行平板（ガラス基板）上に、粗密が異なるようにドットパターンを形成することにより、光の透過率を変えることが可能である（ドットパターンが密の領域は、粗の領域に比べて透過率が低くなる）。第１変調素子と第２変調素子との少なくとも一方は、上述したような光学素子に限らず、透過型液晶素子、反射型液晶素子、ＤＭＤ（デジタルミラーデバイス）等のＳＬＭ（空間光変調器）を用いて構成されてもよい。ＳＬＭを用いる場合、ＳＬＭを、上述の各実施形態における光学素子と同様に、瞳（照明瞳と検出瞳の少なくとも一方）もしくは瞳と共役な位置に配置する。例えば、ＳＬＭとして透過型液晶素子を用いる場合は、素子の各画素の透過率を制御することで、所望の光の透過率の分布を設定することができる。また、ＳＬＭとしてＤＭＤを用いる場合は、各ミラーの角度を制御することにより、所望の光の透過率の分布を設定することができる。
【0162】
なお、第１変調素子として、上述の各実施形態における光学素子（すなわち、光の透過性を有する平板）を用いる場合、制御部９０は、複数の第１変調素子のうちいずれかに切り替えて照明瞳の位置に配置するように素子選択部を制御することで、照明瞳の面内における光の透過率の分布を変更してもよい。第２変調素子として、上述の各実施形態における光学素子（すなわち、光の透過性を有する平板）を用いる場合、制御部９０は、複数の第２変調素子のうちいずれかに切り替えて検出瞳と共役な位置に配置するように素子選択部を制御することで、検出瞳と共役な面内における光の透過率の分布を変更してもよい。第１変調素子および第２変調素子としてＳＬＭを用いる場合、制御部９０は、ＳＬＭを制御することで、瞳の面内もしくは瞳と共役な面内における光の透過率の分布を変更する。そのため、制御部９０により光の透過率の分布を変更するために、複数の素子や素子選択部を設ける必要がない。
【0163】
上述の各実施形態において、コレクタレンズ２１等の「レンズ」は、説明の便宜上、各図において１枚のレンズとして記載されているが、これに限られるものではない。例えば、コレクタレンズ２１等の「レンズ」は、複数枚のレンズから構成されてもよく、レンズとレンズ以外の既存の光学素子とを組み合わせた構成であってもよい。
【符号の説明】
【0164】
１ 顕微鏡装置（第１実施形態）
２ ステージ
１０ 第１顕微鏡部 ５０ 第２顕微鏡部
９０ 制御部
９１ 画像処理部（データ処理部）
１０１ 顕微鏡装置（第２実施形態）
１１０ 第１顕微鏡部 １５０ 第２顕微鏡部
２０１ 顕微鏡装置（第３実施形態）
２１０ 第１顕微鏡部 ２５０ 第２顕微鏡部
３０１ 顕微鏡装置（第４実施形態）
３１０ 第１顕微鏡部 ３５０ 第２顕微鏡部
４０１ 顕微鏡装置（第５実施形態）
４１０ 第１顕微鏡部 ４５０ 第２顕微鏡部
５０１ 顕微鏡装置（第６実施形態）
５１０ 第１顕微鏡部 ５５０ 第２顕微鏡部
２ ステージ
１０ 第１顕微鏡部 ５０ 第２顕微鏡部
９０ 制御部
９１ 画像処理部（データ処理部）
１０１ 顕微鏡装置（第２実施形態）
１１０ 第１顕微鏡部 １５０ 第２顕微鏡部
２０１ 顕微鏡装置（第３実施形態）
２１０ 第１顕微鏡部 ２５０ 第２顕微鏡部
３０１ 顕微鏡装置（第４実施形態）
３１０ 第１顕微鏡部 ３５０ 第２顕微鏡部
４０１ 顕微鏡装置（第５実施形態）
４１０ 第１顕微鏡部 ４５０ 第２顕微鏡部
５０１ 顕微鏡装置（第６実施形態）
５１０ 第１顕微鏡部 ５５０ 第２顕微鏡部
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】