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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024171032
(43)【公開日】2024-12-11
(54)【発明の名称】遺伝子改変植物の作製方法
(51)【国際特許分類】
A01H 1/00 20060101AFI20241204BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20241204BHJP
A01H 5/02 20180101ALI20241204BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20241204BHJP
【ＦＩ】
A01H1/00 A ZNA
C12N15/09 110
A01H5/02
A01H5/00 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023087879
(22)【出願日】2023-05-29
(71)【出願人】
【識別番号】000004226
【氏名又は名称】日本電信電話株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】304021831
【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学
(71)【出願人】
【識別番号】517347643
【氏名又は名称】特定非営利活動法人植物工場研究会
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(72)【発明者】
【氏名】今村 壮輔
(72)【発明者】
【氏名】高谷 和宏
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】チン ドンポー
(72)【発明者】
【氏名】三位 正洋
(72)【発明者】
【氏名】吉村 有
(72)【発明者】
【氏名】林 絵理
(72)【発明者】
【氏名】雨谷 弓弥子
【テーマコード（参考）】
2B030
【Ｆターム（参考）】
2B030AD11
2B030CA14
(57)【要約】
【課題】 開花時期を人為的に調節できるように改変された遺伝子改変植物を作製するための新たな技術を提供すること。
【解決手段】 ゲノム編集技術を用いて、対象植物の内在性花成誘導遺伝子を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性花成誘導遺伝子とを含む発現カセットと置換することを含む、遺伝子改変植物の作製方法。
【選択図】 図１
【解決手段】 ゲノム編集技術を用いて、対象植物の内在性花成誘導遺伝子を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性花成誘導遺伝子とを含む発現カセットと置換することを含む、遺伝子改変植物の作製方法。
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム編集技術を用いて、対象植物の内在性花成誘導遺伝子を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性花成誘導遺伝子とを含む発現カセットと置換することを含む、遺伝子改変植物の作製方法。
【請求項2】
前記置換が、前記発現カセット、前記内在性花成誘導遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域、およびＣａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子を前記対象植物に導入することにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ガイドＲＮＡが、前記内在性花成誘導遺伝子に含まれるイントロンの少なくとも一部と相補的な配列を含む請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記外来性花成誘導遺伝子が、前記内在性花成誘導遺伝子のコード配列と同じ塩基配列を有する請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記外来性花成誘導遺伝子が、前記内在性花成誘導遺伝子のコード配列の塩基配列を、以下の条件：
（i）改変花成誘導遺伝子が、前記Ｃａｓ９タンパク質によって切断されないように改変されていること；および
（ii）改変花成誘導遺伝子が、前記内在性花成誘導遺伝子によりコードされるタンパク質と同じタンパク質をコードすること
を満たすように改変した改変花成誘導遺伝子である請求項２に記載の方法。
（i）改変花成誘導遺伝子が、前記Ｃａｓ９タンパク質によって切断されないように改変されていること；および
（ii）改変花成誘導遺伝子が、前記内在性花成誘導遺伝子によりコードされるタンパク質と同じタンパク質をコードすること
を満たすように改変した改変花成誘導遺伝子である請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記置換が、前記対象植物の前記内在性花成誘導遺伝子を破壊して、内在性花成誘導遺伝子破壊株を得ることと、前記内在性花成誘導遺伝子破壊株に、前記発現カセットを導入することにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記内在性花成誘導遺伝子が内在性ＦＴ（Flowering Locus T）遺伝子であり、前記外来性花成誘導遺伝子が外来性ＦＴ（Flowering Locus T）遺伝子である請求項１～６の何れか１項に記載の方法。
【請求項8】
対象植物の内在性花成誘導遺伝子を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性花成誘導遺伝子とを含む発現カセットと置換するように改変された遺伝子改変植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子改変植物の作製方法、具体的には、開花時期を人為的に調節できるように改変された遺伝子改変植物の作製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
作物栽培においては、開花、結実、採種などの花芽分化からはじまる一連の生殖プロセスを、目的とした時期に安全かつ確実に行い、高品質かつ高収量の作物を安定して収穫することが求められている。
【0003】
従来は、電照による長日条件を植物に一定期間与えることにより、あるいは完全遮光による暗黒条件で短日条件を植物に一定期間与えることにより、開花時期の調節が行われている（非特許文献１）。かかる従来法は、処理施設を設置する必要があるとともに、処理期間内に人為的な諸作業を行う必要がある。このため、従来法は、大掛かりな設備や人手が必要で、大変な手間がかかる。
【0004】
一方、植物の花芽分化は、日長を感受してＦＴ（Flowering Locus T）遺伝子が発現することによって起こる過程が知られている（非特許文献２）。具体的には、花芽分化は、花芽分化に適した所定の日長であることを葉が感受して、その葉の維管束に隣接した細胞内でＦＴ遺伝子が発現し、ＦＴタンパク質が作られる。ＦＴタンパク質は、維管束内を移動して茎頂の細胞内に到達し、茎頂の細胞内でＦＤ（Flowering Locus D）タンパク質と結合する。これにより、茎頂分裂組織で花芽分化が開始される。
【0005】
このため、突然変異や人為的な遺伝子操作により内在性ＦＴ遺伝子の機能が破壊された場合や、不適切な日長条件下など、花芽分化に適した環境が得られない条件下では、所望の時期に所望の品質の作物を収穫することが困難となってしまう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】コトバンク「開花調節」，https://kotobank.jp/word/%E9%96%8B%E8%8A%B1%E8%AA%BF%E7%AF%80-1515349
【非特許文献2】Kobayashi, Y. et al., “A pair of related genes with antagonistic roles in mediating flowering signals.” Science (1999) 286, 1960-1962
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、開花時期を人為的に調節できるように改変された遺伝子改変植物を作製するための新たな技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
一つの側面によれば、ゲノム編集技術を用いて、対象植物の内在性花成誘導遺伝子（例えば、内在性ＦＴ遺伝子）を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性花成誘導遺伝子（例えば、外来性ＦＴ遺伝子）とを含む発現カセットと置換することを含む、遺伝子改変植物の作製方法が提供される。
【0009】
別の側面によれば、対象植物の内在性花成誘導遺伝子（例えば、内在性ＦＴ遺伝子）を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性花成誘導遺伝子（例えば、外来性ＦＴ遺伝子）とを含む発現カセットと置換するように改変された遺伝子改変植物が提供される。
【発明の効果】
【0010】
本発明によると、開花時期を人為的に調節できるように改変された遺伝子改変植物を作製するための新たな技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】第１実施形態に係る方法および第２実施形態に係る方法の概要を示す図。
【図2】ターゲット遺伝子のターゲット配列をイントロンを含むようにデザインした例を示す図。
【図3】改変ＦＴ遺伝子の配列のデザインの仕方を示す図。
【図4】変形例に係る方法の概要を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下に、本発明の実施形態について説明する。以下に説明する実施形態は、上記側面の何れかをより具体化したものである。以下に記載する事項は、単独で又は複数を組み合わせて、上記側面の各々に組み入れることができる。
【0013】
以下の説明は、花成誘導遺伝子としてＦＴ（Flowering Locus T）遺伝子を採用した場合を例に説明する。ただし、本発明は、ＦＴ遺伝子に限定されるものではなく、ＦＴ遺伝子以外の「花成誘導遺伝子」に広く適用可能である。本発明の一実施形態に従って、ゲノム編集技術を用いて、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を、誘導性プロモーターと、誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子とを含む発現カセットと置換して遺伝子改変植物を作製する。得られた遺伝子改変植物の誘導性プロモーターを人為的に活性化すると、外来性ＦＴ遺伝子の発現が誘導され、花芽形成を所望のタイミングで引き起こすことができる。これにより、開花時期を人為的に調節することができる。
【0014】
＜１．ゲノム編集技術＞
本発明では、ゲノム編集技術を利用する。まず、ゲノム編集技術について説明する。ゲノム編集技術は、部位特異的ヌクレアーゼを利用して、ターゲット遺伝子を改変する技術として公知である。ゲノム編集技術の代表的な例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Crispr Associated protein 9の略語である。
本発明では、ゲノム編集技術を利用する。まず、ゲノム編集技術について説明する。ゲノム編集技術は、部位特異的ヌクレアーゼを利用して、ターゲット遺伝子を改変する技術として公知である。ゲノム編集技術の代表的な例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Crispr Associated protein 9の略語である。
【0015】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術では、ターゲット遺伝子のターゲット配列と相補的な配列（例えば１７～２０塩基）を含むガイドＲＮＡをコードするＤＮＡと、Ｃａｓ９タンパク質と呼ばれる部位特異的ヌクレアーゼをコードするＣａｓ９遺伝子とを、対象生物の細胞の核内へ導入する。ガイドＲＮＡは、一般的には、ターゲット遺伝子のターゲット配列と相補的な配列（ｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓ９タンパク質をｃｒＲＮＡと結合させるための足場として機能する配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とが連結した一本鎖ＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術では、ターゲット遺伝子のターゲット配列の下流に、ＰＡＭ（protospacer adjacent motif）配列が存在することが必要である。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９タンパク質により認識される特定の塩基配列であり、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９タンパク質の場合、５’－ＮＧＧ－３’（ここで、Ｎは任意の塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）を指す）である。Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列の３塩基上流の塩基とＰＡＭ配列の４塩基上流の塩基との間でターゲット遺伝子（二本鎖ＤＮＡ）を切断する。この切断部位に外来性遺伝子を挿入する場合、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡおよびＣａｓ９遺伝子に加えて、外来性遺伝子を対象細胞に導入する。外来性遺伝子の５’末端および３’末端に、ターゲット遺伝子の切断部位の上流配列および下流配列と相同なアーム配列を配置しておくことにより、相同組換えが起こり、ターゲット遺伝子が外来性遺伝子によって置換される。
【0016】
＜２．用語の説明＞
本発明の一実施形態では、ゲノム編集により、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を、「誘導性プロモーターと、誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子とを含む発現カセット」と置換する。ここでの置換は、内在性ＦＴ遺伝子を破壊しつつ、内在性ＦＴ遺伝子のゲノム上の位置と同じ位置に発現カセットを導入する場合と、内在性ＦＴ遺伝子を破壊しつつ、内在性ＦＴ遺伝子のゲノム上の位置とは異なる位置に発現カセットを導入する場合の両方を包含する。
本発明の一実施形態では、ゲノム編集により、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を、「誘導性プロモーターと、誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子とを含む発現カセット」と置換する。ここでの置換は、内在性ＦＴ遺伝子を破壊しつつ、内在性ＦＴ遺伝子のゲノム上の位置と同じ位置に発現カセットを導入する場合と、内在性ＦＴ遺伝子を破壊しつつ、内在性ＦＴ遺伝子のゲノム上の位置とは異なる位置に発現カセットを導入する場合の両方を包含する。
【0017】
本明細書において、「対象植物」の用語は、ゲノム編集によって遺伝子改変される植物を指す。本明細書において「植物」は、一般的には、花を咲かせる植物（すなわち顕花植物）、具体的には、ゲノム内に花成誘導遺伝子（例えば、ＦＴ（Flowering Locus T）遺伝子）をもつことが知られている植物である。ＦＴ遺伝子は、花成誘導遺伝子とも呼ばれ、ＦＴ遺伝子の発現が花芽形成を誘導する。
【0018】
「植物」は、好ましくは被子植物であり、より好ましくは双子葉植物である。また、「植物」は、一年生植物であっても、多年生植物であってもよい。本明細書において「植物」の用語は、生長段階や分化の有無を問わず、当該植物がとることができるあらゆる形態の植物を指す。「植物」の用語には、例えば、植物体、種子、果実、不定胚、不定芽、脱分化状態の細胞集塊、プロトプラストなどが包含される。本明細書において「植物体」の用語は、根、茎、葉等から構成される植物の個体を指す。
【0019】
また、本明細書において、「内在性遺伝子」の用語は、対象植物のゲノム内に生得的に存在する遺伝子を指し、「外来性遺伝子」の用語は、ゲノム編集により対象植物のゲノム内に導入される予定の遺伝子（例えばベクター内の遺伝子）またはゲノム編集により対象植物のゲノム内に導入された遺伝子を指す。
【0020】
＜３．第１実施形態＞
一実施形態によれば、ＦＴ遺伝子の置換は、「誘導性プロモーターと、誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子とを含む発現カセット」、「内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域」、および「Ｃａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子」を対象植物に導入することにより行うことができる。
一実施形態によれば、ＦＴ遺伝子の置換は、「誘導性プロモーターと、誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子とを含む発現カセット」、「内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域」、および「Ｃａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子」を対象植物に導入することにより行うことができる。
【0021】
好ましい実施形態によれば、ＦＴ遺伝子の置換は、「誘導性プロモーターと、誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子とを含む発現カセット」、「内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域」、「Ｃａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子」、および「誘導性プロモーターに結合して外来性ＦＴ遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子をコードする遺伝子」を対象植物に導入することにより行うことができる。
【0022】
例えば、ＦＴ遺伝子の置換は、上記の発現カセット（以下、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットともいう）と、ガイドＲＮＡのコード領域と、Ｃａｓ９遺伝子と、（必要に応じて、転写活性化因子をコードする遺伝子）を含むベクターを対象植物に導入することにより行うことができる。外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットと、ガイドＲＮＡのコード領域と、Ｃａｓ９遺伝子と、転写活性化因子をコードする遺伝子とを含むベクターの一例を図１に示す。
【0023】
図１における略語は、以下のとおりである。
ＬＢ レフトボーダー
ＫａｎＲ カナマイシン耐性遺伝子
Ａｒｍ アーム配列
ＦＴｃｄｓ ＦＴ遺伝子のコード配列（外来性ＦＴ遺伝子）
Ｔｅｒ ターミネーター
Ｇｖｇ 転写活性化因子ＧＶＧをコードする遺伝子
ｃｒＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡのコード領域
ｔｒａｃｒＲＮＡ トランス活性化型ｃｒＲＮＡのコード領域
ｇＲＮＡ ガイドＲＮＡのコード領域
Ｃａｓ９ Ｃａｓ９遺伝子
ＲＢ ライトボーダー
ＦＴ ｌｏｃｕｓ 内在性ＦＴ遺伝子の遺伝子座。
ＬＢ レフトボーダー
ＫａｎＲ カナマイシン耐性遺伝子
Ａｒｍ アーム配列
ＦＴｃｄｓ ＦＴ遺伝子のコード配列（外来性ＦＴ遺伝子）
Ｔｅｒ ターミネーター
Ｇｖｇ 転写活性化因子ＧＶＧをコードする遺伝子
ｃｒＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡのコード領域
ｔｒａｃｒＲＮＡ トランス活性化型ｃｒＲＮＡのコード領域
ｇＲＮＡ ガイドＲＮＡのコード領域
Ｃａｓ９ Ｃａｓ９遺伝子
ＲＢ ライトボーダー
ＦＴ ｌｏｃｕｓ 内在性ＦＴ遺伝子の遺伝子座。
【0024】
図１に示すベクターは、５’末端から順に、選択マーカー遺伝子、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセット、転写活性化因子をコードする遺伝子、およびゲノム編集カセットを含む。「選択マーカー遺伝子」は、ベクターが導入された植物細胞を選択するためのマーカー遺伝子である。「外来性ＦＴ遺伝子の発現カセット」は、５’末端から順に、内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）の切断部位の上流配列に相同なアーム配列、誘導性プロモーター、外来性ＦＴ遺伝子、ターミネーター、および内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）の切断部位の下流配列に相同なアーム配列を含む。「転写活性化因子をコードする遺伝子」は、誘導性プロモーターに結合して外来性ＦＴ遺伝子の転写を活性化する因子をコードするため、誘導性プロモーターの種類に応じて選択される。「ゲノム編集カセット」は、５’末端から順に、ｃｒＲＮＡのコード領域、ｔｒａｃｒＲＮＡのコード領域、およびＣａｓ９遺伝子を含む。
【0025】
以下、「選択マーカー遺伝子」、「外来性ＦＴ遺伝子の発現カセット」、「ゲノム編集カセット」、および「転写活性化因子をコードする遺伝子」について順に説明する。
【0026】
（選択マーカー遺伝子）
選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された植物細胞を選択するためのマーカーとして機能することができれば、薬剤耐性遺伝子などの任意の選択マーカー遺伝子を使用することができる。図１では、選択マーカー遺伝子の一例としてカナマイシン耐性遺伝子を示す。
選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された植物細胞を選択するためのマーカーとして機能することができれば、薬剤耐性遺伝子などの任意の選択マーカー遺伝子を使用することができる。図１では、選択マーカー遺伝子の一例としてカナマイシン耐性遺伝子を示す。
【0027】
カナマイシン耐性遺伝子の塩基配列（配列番号１）を以下に示す。
【0028】
【表1】
【0029】
選択マーカー遺伝子は、その上流に構成的プロモーター（例えば、CaMV 35Sプロモーター）を含み、その下流にポリアデニル化シグナル（例えば、CaMVポリアデニル化シグナル）を含んでいてもよい。CaMV 35Sプロモーターの塩基配列（配列番号２）およびCaMVポリアデニル化シグナルの塩基配列（配列番号３）を以下に示す。
【0030】
【表2】
【0031】
【表3】
【0032】
（外来性ＦＴ遺伝子の発現カセット）
図１において、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットは、５’末端から順に、誘導性プロモーターと、誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子と、ターミネーターとを含む。すなわち、外来性ＦＴ遺伝子の発現は、誘導性プロモーターの活性により制御されている。
図１において、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットは、５’末端から順に、誘導性プロモーターと、誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子と、ターミネーターとを含む。すなわち、外来性ＦＴ遺伝子の発現は、誘導性プロモーターの活性により制御されている。
【0033】
「誘導性プロモーター」は、特定の条件下においてのみ活性化されるプロモーター、すなわち、特定の条件下においてのみ外来性ＦＴ遺伝子の発現を誘導するプロモーターを指す。「誘導性プロモーター」として、例えば、薬剤誘導性プロモーターや刺激誘導性プロモーターが知られている。薬剤誘導性プロモーターとして、例えば、糖質コルチコイド誘導性プロモーター、エストロゲン誘導性プロモーターが知られている。刺激誘導性プロモーターとして、例えば、光誘導性プロモーター（例えば、青色光誘導性プロモーター）が知られている。
【0034】
糖質コルチコイド誘導性プロモーターの塩基配列（配列番号４）を以下に示す。
【0035】
【表4】
【0036】
外来性ＦＴ遺伝子は、ＦＴ遺伝子のコード配列を有し、イントロンを含まない。第１実施形態に係る方法において、外来性ＦＴ遺伝子は、内在性ＦＴ遺伝子のコード配列と同じ塩基配列を有することができる。内在性ＦＴ遺伝子のコード配列と同じ塩基配列を有する外来性ＦＴ遺伝子の塩基配列（配列番号５）を以下に示す。
【0037】
【表5】
【0038】
外来性ＦＴ遺伝子のターミネーターの塩基配列の一例（配列番号６）を以下に示す。
【0039】
【表6】
【0040】
図１において、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットは、５’側に、内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）の切断部位の上流領域の配列に相同なアーム配列（Ａｒｍ）を含み、３’側に、内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）の切断部位の下流領域の配列に相同なアーム配列（Ａｒｍ）を更に含む。５’側のアーム配列は、内在性ＦＴ遺伝子の切断部位の上流領域の配列に相同な配列とすることができる。３’側のアーム配列は、内在性ＦＴ遺伝子の切断部位の下流領域の配列に相同な配列とすることができる。このようなアーム配列を発現カセットの５’側および３’側に配置しておくことにより、対象植物のゲノムＤＮＡと相同組換えが起こり、外来性ＦＴ遺伝子を誘導性プロモーターとともに対象植物のゲノムＤＮＡに組込むことができる。
【0041】
５’側のアーム配列の一例（配列番号７）および３’側のアーム配列の一例（配列番号８）を以下に示す。
【0042】
【表7】
【0043】
【表8】
【0044】
（ゲノム編集カセット）
図１において、ゲノム編集カセットは、５’末端から順に、ｃｒＲＮＡのコード領域、ｔｒａｃｒＲＮＡのコード領域、およびＣａｓ９遺伝子を含む。なお、本明細書において「ＲＮＡのコード領域」は、ＲＮＡをコードするＤＮＡを指す。
図１において、ゲノム編集カセットは、５’末端から順に、ｃｒＲＮＡのコード領域、ｔｒａｃｒＲＮＡのコード領域、およびＣａｓ９遺伝子を含む。なお、本明細書において「ＲＮＡのコード領域」は、ＲＮＡをコードするＤＮＡを指す。
【0045】
ｃｒＲＮＡは、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）の一部の配列（ターゲット配列）と相補的な配列を有する。ｃｒＲＮＡは、「ガイド配列」とも呼ばれ、例えば１７～２０塩基とすることができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質をｃｒＲＮＡと結合させるための足場として機能する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、ガイドＲＮＡを構成する（図１参照）。ガイドＲＮＡとして、一般的には、内在性ＦＴ遺伝子のターゲット配列と相補的な配列（ｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓ９タンパク質をｃｒＲＮＡと結合させるための足場として機能する配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とが連結した一本鎖ＲＮＡを使用することができる。このような一本鎖ＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として公知である。
【0046】
「ｃｒＲＮＡのコード領域」の塩基配列の一例（配列番号９）を以下に示す。
【0047】
【表9】
【0048】
この配列がコードするｃｒＲＮＡ（配列番号９）は、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子に含まれるイントロンの少なくとも一部と相補的な配列を有する。
【0049】
「ｔｒａｃｒＲＮＡのコード領域」の塩基配列（配列番号１０）を以下に示す。
【0050】
【表10】
【0051】
上述のとおり、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とすることができる。「シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のコード領域」の塩基配列の一例（配列番号１１）を以下に示す。
【0052】
【表11】
【0053】
Ｃａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子の塩基配列（配列番号１２）を以下に示す。Ｃａｓ９遺伝子は、その上流に構成的プロモーター（例えば、CaMV 35Sプロモーター：配列番号２）を含むことができる。
【0054】
【表12-1】
【0055】
【表12-2】
【0056】
【表12-3】
【0057】
【表12-4】
【0058】
（転写活性化因子をコードする遺伝子）
図１に示すベクターは、「選択マーカー遺伝子」、「外来性ＦＴ遺伝子の発現カセット」、および「ゲノム編集カセット」に加えて、誘導性プロモーターの種類に応じて、「転写活性化因子をコードする遺伝子」を更に含んでいてもよい。
図１に示すベクターは、「選択マーカー遺伝子」、「外来性ＦＴ遺伝子の発現カセット」、および「ゲノム編集カセット」に加えて、誘導性プロモーターの種類に応じて、「転写活性化因子をコードする遺伝子」を更に含んでいてもよい。
【0059】
例えば、誘導性プロモーターが糖質コルチコイド誘導性プロモーターである場合、ベクターは、「転写活性化因子ＧＶＧをコードする遺伝子」を更に含むことができる。「転写活性化因子ＧＶＧ」は、酵母由来のＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、単純ヘルペス由来のＶＰ１６の転写活性化ドメインと、ラット由来の糖質コルチコイドホルモン結合ドメインとから構成されるキメラ転写因子である。転写活性化因子ＧＶＧにデキサメタゾンなどの糖質コルチコイドホルモンが結合した場合のみ、転写活性化因子ＧＶＧは、糖質コルチコイド誘導性プロモーターに結合し、下流遺伝子の転写を活性化することができる。この転写誘導系は、ＧＶＧ転写誘導系として公知である。
【0060】
「転写活性化因子ＧＶＧをコードする遺伝子」は、例えば、発現カセットとゲノム編集カセットとの間に位置することができる。また、「転写活性化因子ＧＶＧをコードする遺伝子」は、その上流に構成的プロモーター（例えば、CaMV 35Sプロモーター：配列番号２）を含み、その下流にターミネーター（例えば、エンドウ由来のリブロース－１，５－二リン酸カルボキシラーゼのスモールサブユニット（RbcS）のターミネーター：配列番号１４）を含むことができる。
【0061】
「転写活性化因子ＧＶＧをコードする遺伝子」の塩基配列（配列番号１３）および「転写活性化因子ＧＶＧをコードする遺伝子のターミネーター」の塩基配列の一例（配列番号１４）を以下に示す。
【0062】
【表13】
【0063】
上記の塩基配列において、一重下線を付した配列が、酵母由来のＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードする領域を示し、下線を付していない配列が、単純ヘルペス由来のＶＰ１６の転写活性化ドメインをコードする領域を示し、二重下線を付した配列が、ラット由来の糖質コルチコイドホルモン結合ドメインをコードする領域を示す。
【0064】
【表14】
【0065】
（ターゲット配列のデザイン）
第１実施形態に係る方法では、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）のターゲット配列を、内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）のイントロンを含むようにデザインすることができる。ターゲット配列は、ガイドＲＮＡに含まれるｃｒＲＮＡがターゲットとする配列であり、ｃｒＲＮＡは、ターゲット配列に相補的な配列を有する。したがって、ｃｒＲＮＡは、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子に含まれるイントロンの少なくとも一部と相補的な配列を有することができる。この相補的な配列は、「ガイド配列」と呼ばれる。
第１実施形態に係る方法では、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）のターゲット配列を、内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）のイントロンを含むようにデザインすることができる。ターゲット配列は、ガイドＲＮＡに含まれるｃｒＲＮＡがターゲットとする配列であり、ｃｒＲＮＡは、ターゲット配列に相補的な配列を有する。したがって、ｃｒＲＮＡは、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子に含まれるイントロンの少なくとも一部と相補的な配列を有することができる。この相補的な配列は、「ガイド配列」と呼ばれる。
【0066】
このように、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）のターゲット配列を、内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）のイントロンを含むようにデザインした例を図２に示す。図２では、一例として、内在性ＦＴ遺伝子のエキソン２（ｅｘ２）と、その上流側のイントロンとに跨がる境界領域を、ターゲット配列（５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＮＮＮＮＮ－３’）と決定している。あるいは、図２では、別の例として、内在性ＦＴ遺伝子のエキソン１（ｅｘ１）と、その下流側のイントロンとに跨がる境界領域を、ターゲット配列（５’－ＮＮＮＮＮＮＧＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－３’）と決定している。これらのターゲット配列において、Ｎは任意の塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）を指す。下線を付した塩基がイントロンを指し、下線を付していない塩基がエキソンを指す。
【0067】
ターゲット配列のデザイン（またはｃｒＲＮＡ（ガイド配列）のデザイン）は、例えば、SnapGene（GSL Biotech LLC）という名称のソフトウェアを用いて行うことができる。例えば、ターゲット配列は、ｃｒＲＮＡ（ガイド配列）のＧＣ含量が３０～７０％になるように設計することができる。
【0068】
このように、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）のターゲット配列を、内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）のイントロンを含むようにデザインし、ｃｒＲＮＡ（ガイド配列）が、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子に含まれるイントロンの少なくとも一部と相補的な配列を有する場合、以下の利点を有することができる。すなわち、かかるｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡは、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子（これは、イントロンを含む）に特異的に結合することができるが、発現カセット内の外来性ＦＴ遺伝子（これは、ＦＴ遺伝子のコード配列であるため、イントロンを含まない）に結合することはできない。したがって、この場合、Ｃａｓ９タンパク質が、発現カセット内の外来性ＦＴ遺伝子を切断することを防ぐことができ、結果として、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子のみを切断することができる。これにより、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットと効率良く置換することができる。
【0069】
図１に示すベクター（選択マーカー遺伝子、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセット、転写活性化因子をコードする遺伝子、およびゲノム編集カセットを含む）は、市販のゲノム編集用ベクター（例えば、pKSE401（addgene））を利用して調製することができる。例示した市販のゲノム編集用ベクターは、予め、選択マーカー遺伝子、ｔｒａｃｒＲＮＡのコード領域、およびＣａｓ９遺伝子を含んでいる。このため、市販のゲノム編集用ベクターに、ｃｒＲＮＡ（ガイド配列）のコード領域、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセット、および転写活性化因子をコードする遺伝子を導入することにより、図１に示すベクターを調製することができる。
【0070】
以上説明したとおり、図１に示すベクターを対象植物の細胞に導入することにより、ゲノム編集を行うことができる。ベクターの対象植物への導入は、アグロバクテリウム法やパーティクルガンを用いたカルス誘導法など常法に従って行うことができる。図１に示すとおり、ゲノム編集により、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子は切断されるとともに、内在性ＦＴ遺伝子のゲノム上の位置と同じ位置に外来性ＦＴ遺伝子が導入される。
【0071】
（効果）
上記ベクターが導入された植物細胞から植物体を再生し、得られた遺伝子改変植物の誘導性プロモーターを人為的に活性化すると、外来性ＦＴ遺伝子の発現が誘導され、花芽の形成を所望のタイミングで引き起こすことができる。これにより、開花時期を人為的に調節することができる。その結果、季節外の切り花や果実の生産、安定した種子生産、栄養成長を持続した野菜の収量増などが期待でき、農産物生産の安定化や収入増に大きく貢献することができる。
上記ベクターが導入された植物細胞から植物体を再生し、得られた遺伝子改変植物の誘導性プロモーターを人為的に活性化すると、外来性ＦＴ遺伝子の発現が誘導され、花芽の形成を所望のタイミングで引き起こすことができる。これにより、開花時期を人為的に調節することができる。その結果、季節外の切り花や果実の生産、安定した種子生産、栄養成長を持続した野菜の収量増などが期待でき、農産物生産の安定化や収入増に大きく貢献することができる。
【0072】
背景技術の欄に記載したとおり、従来法は、処理施設を設置する必要があるとともに、処理期間内に人為的な諸作業を行う必要がある。このため、従来法は、大掛かりな設備や人手が必要で、大変な手間がかかる。一方、本発明により提供される技術は、通常の栽培条件下に置かれた植物に対して、誘導性プロモーターの活性を誘導する（例えば、薬剤誘導性プロモーターの場合、所定の薬剤を散布する）ことにより開花を誘導できるため、きわめて簡便である。このように、本発明により提供される技術は、従来法と比較してきわめて簡便に開花時期を調節することができる点で優れている。
【0073】
＜４．第２実施形態＞
以下、第２実施形態に係る方法を説明するが、第１実施形態に係る方法と重複する説明は省略し、第１実施形態に係る方法と異なる点のみ説明する。
以下、第２実施形態に係る方法を説明するが、第１実施形態に係る方法と重複する説明は省略し、第１実施形態に係る方法と異なる点のみ説明する。
【0074】
第２実施形態に係る方法においても、図１に示す構造を有するベクター（すなわち、選択マーカー遺伝子、発現カセット、転写活性化因子をコードする遺伝子、およびゲノム編集カセットを含むベクター）を対象植物の細胞に導入することにより、ゲノム編集を行うことができる。
【0075】
上述のとおり、第１実施形態に係る方法では、「外来性ＦＴ遺伝子」として、内在性ＦＴ遺伝子のコード配列と同じ塩基配列を有するもの（配列番号５）を使用し、「ｃｒＲＮＡ（ガイド配列）のコード領域」として、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子に含まれるイントロンの少なくとも一部と相補的な配列を有するもの（配列番号９）を使用する。一方、第２実施形態に係る方法では、「外来性ＦＴ遺伝子」として、以下で説明する改変ＦＴ遺伝子を使用し、「ｃｒＲＮＡ（ガイド配列）のコード領域」として、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子に含まれるエキソンと相補的な配列を有しているものを使用する。
【0076】
かかる「ｃｒＲＮＡのコード領域」の塩基配列の一例（配列番号１５）を以下に示す。
【0077】
【表15】
【0078】
上述のとおり、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とすることができる。「シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のコード領域」の塩基配列の一例（配列番号１６）を以下に示す。
【0079】
【表16】
【0080】
すなわち、第２実施形態に係る方法では、「ｃｒＲＮＡのコード領域」として、第１実施形態に係る方法で使用した「ｃｒＲＮＡのコード領域」（すなわち、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子に含まれるイントロンの少なくとも一部と相補的な配列を有しているもの）を使用する必要がない。
【0081】
（改変ＦＴ遺伝子の配列のデザイン）
第２実施形態に係る方法では、外来性ＦＴ遺伝子が、内在性ＦＴ遺伝子のコード配列の塩基配列を、以下の条件：
（i）改変ＦＴ遺伝子が、Ｃａｓ９タンパク質によって切断されないように改変されていること；および
（ii）改変ＦＴ遺伝子が、内在性ＦＴ遺伝子によりコードされるタンパク質（すなわち、内在性ＦＴタンパク質）と同じタンパク質をコードすること
を満たすように改変した改変ＦＴ遺伝子である。
第２実施形態に係る方法では、外来性ＦＴ遺伝子が、内在性ＦＴ遺伝子のコード配列の塩基配列を、以下の条件：
（i）改変ＦＴ遺伝子が、Ｃａｓ９タンパク質によって切断されないように改変されていること；および
（ii）改変ＦＴ遺伝子が、内在性ＦＴ遺伝子によりコードされるタンパク質（すなわち、内在性ＦＴタンパク質）と同じタンパク質をコードすること
を満たすように改変した改変ＦＴ遺伝子である。
【0082】
改変ＦＴ遺伝子は、例えば、以下のようにデザインすることができる。図３に、改変ＦＴ遺伝子の配列のデザインの仕方を示す。内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）のターゲット配列の下流に存在するＰＡＭ（protospacer adjacent motif）配列を、Ｃａｓ９タンパク質に認識されないように改変する。このように改変したＦＴ遺伝子を「改変ＦＴ遺伝子」とする。これにより、改変ＦＴ遺伝子がＣａｓ９タンパク質によって切断されないようにすることができる。このＰＡＭ配列の改変によって、改変ＦＴ遺伝子は、内在性ＦＴ遺伝子とは異なる塩基配列を有するが、内在性ＦＴタンパク質と異なるアミノ酸配列をコードしないようにする（図３参照）。すなわち、このＰＡＭ配列の改変は、改変ＦＴ遺伝子が、内在性ＦＴタンパク質と同じアミノ酸配列をコードするように（すなわち、サイレント変異になるように）行う。なお、図３では、内在性ＦＴタンパク質のアミノ酸配列を、簡略化してＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７と示した。このＰＡＭ配列の改変は、対象植物のコドン頻度の情報に基づいて、比較的メジャーなコドンに変更する（すなわち、レアコドンに変更しない）ように行うことが望ましい。
【0083】
改変ＦＴ遺伝子の配列のデザインは、例えば、SnapGene（GSL Biotech LLC）という名称のソフトウェアを用いて行うことができる。
【0084】
改変ＦＴ遺伝子の一例の塩基配列（配列番号１７）を以下に示す。
【0085】
【表17】
【0086】
上記の改変ＦＴ遺伝子において、改変部位を下線により示す。上記の改変ＦＴ遺伝子において、ＰＡＭ配列ＧＧＧは、Ｃａｓ９タンパク質に認識されないようにＧＡＧに改変されている。また、この改変ＦＴ遺伝子は、未改変のＦＴ遺伝子によりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列をコードすることができる。具体的には、未改変のＦＴ遺伝子の改変部位におけるコドン：ＡＧＧ ＧＴＴと、改変ＦＴ遺伝子の改変部位におけるコドン：ＡＧＡ ＧＴＴは、同じアミノ酸をコードすることができる。
【0087】
上述のとおり、発現カセット内の外来性ＦＴ遺伝子として、上記の改変ＦＴ遺伝子を使用すると、Ｃａｓ９タンパク質が、発現カセット内の外来性ＦＴ遺伝子を切断することを防ぐことができ、結果として、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子のみを切断することができる。これにより、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットと効率良く置換することができる。
【0088】
第２実施形態に係る方法においても、ゲノム編集により、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子は切断されるとともに、内在性ＦＴ遺伝子のゲノム上の位置と同じ位置に外来性ＦＴ遺伝子を導入することができる。
【0089】
＜５．変形例＞
第１実施形態および第２実施形態に係る方法では、ゲノム編集は、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットと、ゲノム編集カセットとを含むベクターを、対象植物の細胞に導入することにより行うことができる。かかるゲノム編集の手法は、Wolter et al., “Efficient in planta gene targeting in Arabidopsis using egg cell-specific expression of Cas9 nuclease of Staphylococcus aureus”, The Plant Journal (2018) 94, 735-746を参照することができる。
第１実施形態および第２実施形態に係る方法では、ゲノム編集は、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットと、ゲノム編集カセットとを含むベクターを、対象植物の細胞に導入することにより行うことができる。かかるゲノム編集の手法は、Wolter et al., “Efficient in planta gene targeting in Arabidopsis using egg cell-specific expression of Cas9 nuclease of Staphylococcus aureus”, The Plant Journal (2018) 94, 735-746を参照することができる。
【0090】
あるいは、ゲノム編集は、Ｃａｓ９遺伝子の発現カセットを含む第１ベクターを対象植物に導入し、Ｃａｓ９遺伝子を過剰に発現する植物体（形質転換体）を取得し、その後、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットと、ガイドＲＮＡのコード領域とを含む第２ベクター（図４参照）を形質転換体に導入することにより行ってもよい。外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットと、ガイドＲＮＡのコード領域と、転写活性化因子をコードする遺伝子とを含む第２ベクターの一例を図４に示す。上述のとおり、ガイドＲＮＡとして、一般的には、内在性ＦＴ遺伝子のターゲット配列と相補的な配列（ｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓ９タンパク質をｃｒＲＮＡと結合させるための足場として機能する配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とが連結した一本鎖ＲＮＡを使用することができる。このような一本鎖ＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として公知である。
【0091】
図４における略語は、以下のとおりである。
ＬＢ レフトボーダー
ＨｍＲ ハイグロマイシン耐性遺伝子
Ａｒｍ アーム配列
ＦＴｃｄｓ ＦＴ遺伝子のコード配列（外来性ＦＴ遺伝子）
Ｔｅｒ ターミネーター
Ｇｖｇ 転写活性化因子ＧＶＧをコードする遺伝子
ｃｒＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡのコード領域
ｔｒａｃｒＲＮＡ トランス活性化型ｃｒＲＮＡのコード領域
ｇＲＮＡ ガイドＲＮＡのコード領域
ＲＢ ライトボーダー
ＦＴ ｌｏｃｕｓ 内在性ＦＴ遺伝子の遺伝子座。
ＬＢ レフトボーダー
ＨｍＲ ハイグロマイシン耐性遺伝子
Ａｒｍ アーム配列
ＦＴｃｄｓ ＦＴ遺伝子のコード配列（外来性ＦＴ遺伝子）
Ｔｅｒ ターミネーター
Ｇｖｇ 転写活性化因子ＧＶＧをコードする遺伝子
ｃｒＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡのコード領域
ｔｒａｃｒＲＮＡ トランス活性化型ｃｒＲＮＡのコード領域
ｇＲＮＡ ガイドＲＮＡのコード領域
ＲＢ ライトボーダー
ＦＴ ｌｏｃｕｓ 内在性ＦＴ遺伝子の遺伝子座。
【0092】
図４に示すベクターは、５’末端から順に、選択マーカー遺伝子、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセット、転写活性化因子をコードする遺伝子、およびガイドＲＮＡのコード領域を含む。「選択マーカー遺伝子」は、ベクターが導入された植物細胞を選択するためのマーカー遺伝子である。「外来性ＦＴ遺伝子の発現カセット」は、５’末端から順に、内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）の切断部位の上流配列に相同なアーム配列、誘導性プロモーター、外来性ＦＴ遺伝子、ターミネーター、および内在性ＦＴ遺伝子（ターゲット遺伝子）の切断部位の下流配列に相同なアーム配列を含む。「転写活性化因子をコードする遺伝子」は、誘導性プロモーターに結合して外来性ＦＴ遺伝子の転写を活性化する因子をコードするため、誘導性プロモーターの種類に応じて選択される。「ガイドＲＮＡのコード領域」は、５’末端から順に、ｃｒＲＮＡのコード領域およびｔｒａｃｒＲＮＡのコード領域を含む。
【0093】
このように２回の形質転換を行うゲノム編集の手法は、Miki et al., “CRISPR/Cas9-mediated gene targeting in Arabidopsis using sequential transformation”, Nature Communications (2018) 9, 1967を参照することができる。
【0094】
＜６．第３実施形態＞
第３実施形態によれば、ＦＴ遺伝子の置換は、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を破壊して、内在性ＦＴ遺伝子破壊株を得ることと、内在性ＦＴ遺伝子破壊株に、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットを導入することにより行うことができる。
第３実施形態によれば、ＦＴ遺伝子の置換は、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を破壊して、内在性ＦＴ遺伝子破壊株を得ることと、内在性ＦＴ遺伝子破壊株に、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットを導入することにより行うことができる。
【0095】
第３実施形態に係る方法では、まず、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を破壊して、内在性ＦＴ遺伝子破壊株を取得する。例えば、内在性ＦＴ遺伝子の破壊は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術などのゲノム編集技術を用いて行うことができる。具体的には、内在性ＦＴ遺伝子の破壊は、内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域、およびＣａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子を対象植物に導入することにより行うことができる。このゲノム編集において、「ｃｒＲＮＡ（ガイド配列）のコード領域」として、配列番号１５に示される塩基配列を使用することができる。あるいは、内在性ＦＴ遺伝子破壊株は、突然変異処理（例えば、放射線照射による処理や、メタンスルホン酸エチルによる処理など）により準備してもよいし、自然変異により準備してもよい。
【0096】
次に、得られた内在性ＦＴ遺伝子破壊株のゲノムに、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットを導入する。外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットは、誘導性プロモーターと、誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子とを含む。発現カセットの対象植物への導入は、アグロバクテリウム法やパーティクルガンを用いたカルス誘導法など常法に従って行うことができる。この形質転換において、「外来性ＦＴ遺伝子」として、配列番号５に示される塩基配列を使用することができる。
【0097】
この形質転換の結果、外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットは、内在性ＦＴ遺伝子破壊株のゲノム上の任意の位置に挿入され、特定の位置に挿入されない。一般に、目的の発現カセットが挿入されるゲノム上の位置によって、外来性遺伝子の発現量に違いが生じる「位置効果」が観察される。そのため、得られた形質転換体のなかから、花芽形成効率が高い植物体を選択してもよい。例えば、数ラインの形質転換体を取得し、各形質転換体の誘導性プロモーターを人為的に活性化し、外来性ＦＴ遺伝子の発現を誘導する。各形質転換体の花芽形成効率を確認し、花芽形成効率が高い植物体を選択することができる。
【0098】
上述のとおり、第３実施形態に係る方法では、内在性ＦＴ遺伝子を破壊しつつ、内在性ＦＴ遺伝子のゲノム上の位置とは異なる位置に外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットが導入される。
【0099】
＜７．別の側面に係る発明および一般化された発明＞
別の側面によれば、上述の「遺伝子改変植物の作製方法」により作製される遺伝子改変植物が提供される。すなわち、別の側面によれば、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子とを含む発現カセットと置換するように改変された遺伝子改変植物が提供される。
別の側面によれば、上述の「遺伝子改変植物の作製方法」により作製される遺伝子改変植物が提供される。すなわち、別の側面によれば、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子とを含む発現カセットと置換するように改変された遺伝子改変植物が提供される。
【0100】
また、ここまで、「ゲノム編集により内在性ＦＴ遺伝子を外来性ＦＴ遺伝子の発現カセットに置換した遺伝子改変植物に関する発明」を説明してきたが、上記発明において、対象遺伝子はＦＴ遺伝子に限定されず、ＦＴ遺伝子以外の花成誘導遺伝子に一般化することができる。「花成誘導遺伝子」は、この遺伝子を破壊した場合に、花芽の形成ができなくなったり花芽の形成が遅れたりする遺伝子をいう。「花成誘導遺伝子」は、ＦＴ遺伝子に加えて、ＦＴホモログ遺伝子として知られている花成誘導遺伝子を使用することができる。ＦＴホモログ遺伝子として知られている花成誘導遺伝子は、例えば、イネ由来のＨｄ３ａ遺伝子、トマト由来のＳＦＴ遺伝子、カンキツ由来のＣｉＦＴ遺伝子、シロイヌナズナ由来のＬＥＡＦＹ（ＬＦＹ）遺伝子などが挙げられる。
【0101】
すなわち、一般化された発明によれば、ゲノム編集技術を用いて、対象植物の内在性花成誘導遺伝子を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性花成誘導遺伝子とを含む発現カセットと置換することを含む、遺伝子改変植物の作製方法が提供される。更に、一般化された発明によれば、対象植物の内在性花成誘導遺伝子を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性花成誘導遺伝子とを含む発現カセットと置換するように改変された遺伝子改変植物が提供される。
【0102】
＜８．好ましい実施形態＞
好ましい実施形態を以下にまとめて示す。
（Ａ１）ゲノム編集技術を用いて、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子とを含む発現カセットと置換することを含む、遺伝子改変植物の作製方法。
（Ａ２）前記置換が、
前記発現カセット、
前記内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域、および
Ｃａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子
を前記対象植物に導入することにより行われる（Ａ１）に記載の方法。
（Ａ３）前記置換が、
前記発現カセット、
前記内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域、
Ｃａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子、および
前記誘導性プロモーターに結合して前記外来性ＦＴ遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子をコードする遺伝子
を前記対象植物に導入することにより行われる（Ａ１）に記載の方法。
好ましい実施形態を以下にまとめて示す。
（Ａ１）ゲノム編集技術を用いて、対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子とを含む発現カセットと置換することを含む、遺伝子改変植物の作製方法。
（Ａ２）前記置換が、
前記発現カセット、
前記内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域、および
Ｃａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子
を前記対象植物に導入することにより行われる（Ａ１）に記載の方法。
（Ａ３）前記置換が、
前記発現カセット、
前記内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域、
Ｃａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子、および
前記誘導性プロモーターに結合して前記外来性ＦＴ遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子をコードする遺伝子
を前記対象植物に導入することにより行われる（Ａ１）に記載の方法。
【0103】
（Ａ４）前記ガイドＲＮＡが、前記内在性ＦＴ遺伝子に含まれるイントロンの少なくとも一部と相補的な配列を含む（Ａ２）または（Ａ３）に記載の方法。
（Ａ５）前記外来性ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子のコード配列と同じ塩基配列を有する（Ａ４）に記載の方法。
（Ａ５）前記外来性ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子のコード配列と同じ塩基配列を有する（Ａ４）に記載の方法。
【0104】
（Ａ６）前記外来性ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子のコード配列の塩基配列を、以下の条件：
（i）改変ＦＴ遺伝子が、前記Ｃａｓ９タンパク質によって切断されないように改変されていること（好ましくは、改変ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子に含まれるＰＡＭ（protospacer adjacent motif）配列がＣａｓ９タンパク質に認識されないように改変されていること）；および
（ii）改変ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子によりコードされるタンパク質と同じタンパク質をコードすること
を満たすように改変した改変ＦＴ遺伝子である（Ａ２）または（Ａ３）に記載の方法。
（Ａ７）前記ガイドＲＮＡが、前記内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列（ｃｒＲＮＡ）と、前記Ｃａｓ９タンパク質を前記ｃｒＲＮＡと結合させるための足場として機能する配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とが連結した一本鎖ＲＮＡである（Ａ２）～（Ａ６）の何れか１に記載の方法。
（i）改変ＦＴ遺伝子が、前記Ｃａｓ９タンパク質によって切断されないように改変されていること（好ましくは、改変ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子に含まれるＰＡＭ（protospacer adjacent motif）配列がＣａｓ９タンパク質に認識されないように改変されていること）；および
（ii）改変ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子によりコードされるタンパク質と同じタンパク質をコードすること
を満たすように改変した改変ＦＴ遺伝子である（Ａ２）または（Ａ３）に記載の方法。
（Ａ７）前記ガイドＲＮＡが、前記内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列（ｃｒＲＮＡ）と、前記Ｃａｓ９タンパク質を前記ｃｒＲＮＡと結合させるための足場として機能する配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とが連結した一本鎖ＲＮＡである（Ａ２）～（Ａ６）の何れか１に記載の方法。
【0105】
（Ａ８）前記置換が、
ゲノム編集技術を用いて、前記対象植物の前記内在性ＦＴ遺伝子を破壊して、内在性ＦＴ遺伝子破壊株を得ることと、
前記内在性ＦＴ遺伝子破壊株に、前記発現カセットを導入すること
により行われる（Ａ１）に記載の方法。
（Ａ９）前記置換が、
ゲノム編集技術を用いて、前記対象植物の前記内在性ＦＴ遺伝子を破壊して、内在性ＦＴ遺伝子破壊株を得ることと、
前記内在性ＦＴ遺伝子破壊株に、前記発現カセットと、前記誘導性プロモーターに結合して前記外来性ＦＴ遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子をコードする遺伝子とを導入すること
により行われる（Ａ１）に記載の方法。
ゲノム編集技術を用いて、前記対象植物の前記内在性ＦＴ遺伝子を破壊して、内在性ＦＴ遺伝子破壊株を得ることと、
前記内在性ＦＴ遺伝子破壊株に、前記発現カセットを導入すること
により行われる（Ａ１）に記載の方法。
（Ａ９）前記置換が、
ゲノム編集技術を用いて、前記対象植物の前記内在性ＦＴ遺伝子を破壊して、内在性ＦＴ遺伝子破壊株を得ることと、
前記内在性ＦＴ遺伝子破壊株に、前記発現カセットと、前記誘導性プロモーターに結合して前記外来性ＦＴ遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子をコードする遺伝子とを導入すること
により行われる（Ａ１）に記載の方法。
【0106】
（Ｂ１）対象植物の内在性ＦＴ遺伝子を、誘導性プロモーターと、前記誘導性プロモーターに作動可能に連結された外来性ＦＴ遺伝子とを含む発現カセットと置換するように改変された遺伝子改変植物。
（Ｂ２）前記置換が、
前記発現カセット、
前記内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域、および
Ｃａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子
を前記対象植物に導入することにより行われる（Ｂ１）に記載の遺伝子改変植物。
（Ｂ３）前記置換が、
前記発現カセット、
前記内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域、
Ｃａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子、および
前記誘導性プロモーターに結合して前記外来性ＦＴ遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子をコードする遺伝子
を前記対象植物に導入することにより行われる（Ｂ１）に記載の遺伝子改変植物。
（Ｂ２）前記置換が、
前記発現カセット、
前記内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域、および
Ｃａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子
を前記対象植物に導入することにより行われる（Ｂ１）に記載の遺伝子改変植物。
（Ｂ３）前記置換が、
前記発現カセット、
前記内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列を含むガイドＲＮＡのコード領域、
Ｃａｓ９タンパク質をコードするＣａｓ９遺伝子、および
前記誘導性プロモーターに結合して前記外来性ＦＴ遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子をコードする遺伝子
を前記対象植物に導入することにより行われる（Ｂ１）に記載の遺伝子改変植物。
【0107】
（Ｂ４）前記ガイドＲＮＡが、前記内在性ＦＴ遺伝子に含まれるイントロンの少なくとも一部と相補的な配列を含む（Ｂ２）または（Ｂ３）に記載の遺伝子改変植物。
（Ｂ５）前記外来性ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子のコード配列と同じ塩基配列を有する（Ｂ４）に記載遺伝子改変植物。
（Ｂ５）前記外来性ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子のコード配列と同じ塩基配列を有する（Ｂ４）に記載遺伝子改変植物。
【0108】
（Ｂ６）前記外来性ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子のコード配列の塩基配列を、以下の条件：
（i）改変ＦＴ遺伝子が、前記Ｃａｓ９タンパク質によって切断されないように改変されていること（好ましくは、改変ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子に含まれるＰＡＭ（protospacer adjacent motif）配列がＣａｓ９タンパク質に認識されないように改変されていること）；および
（ii）改変ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子によりコードされるタンパク質と同じタンパク質をコードすること
を満たすように改変した改変ＦＴ遺伝子である（Ｂ２）または（Ｂ３）に記載の遺伝子改変植物。
（Ｂ７）前記ガイドＲＮＡが、前記内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列（ｃｒＲＮＡ）と、前記Ｃａｓ９タンパク質を前記ｃｒＲＮＡと結合させるための足場として機能する配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とが連結した一本鎖ＲＮＡである（Ｂ２）～（Ｂ６）の何れか１に記載の遺伝子改変植物。
（i）改変ＦＴ遺伝子が、前記Ｃａｓ９タンパク質によって切断されないように改変されていること（好ましくは、改変ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子に含まれるＰＡＭ（protospacer adjacent motif）配列がＣａｓ９タンパク質に認識されないように改変されていること）；および
（ii）改変ＦＴ遺伝子が、前記内在性ＦＴ遺伝子によりコードされるタンパク質と同じタンパク質をコードすること
を満たすように改変した改変ＦＴ遺伝子である（Ｂ２）または（Ｂ３）に記載の遺伝子改変植物。
（Ｂ７）前記ガイドＲＮＡが、前記内在性ＦＴ遺伝子の少なくとも一部と相補的な配列（ｃｒＲＮＡ）と、前記Ｃａｓ９タンパク質を前記ｃｒＲＮＡと結合させるための足場として機能する配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とが連結した一本鎖ＲＮＡである（Ｂ２）～（Ｂ６）の何れか１に記載の遺伝子改変植物。
【0109】
（Ｂ８）前記置換が、
ゲノム編集技術を用いて、前記対象植物の前記内在性ＦＴ遺伝子を破壊して、内在性ＦＴ遺伝子破壊株を得ることと、
前記内在性ＦＴ遺伝子破壊株に、前記発現カセットを導入すること
により行われる（Ｂ１）に記載の遺伝子改変植物。
（Ｂ９）前記置換が、
ゲノム編集技術を用いて、前記対象植物の前記内在性ＦＴ遺伝子を破壊して、内在性ＦＴ遺伝子破壊株を得ることと、
前記内在性ＦＴ遺伝子破壊株に、前記発現カセットと、前記誘導性プロモーターに結合して前記外来性ＦＴ遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子をコードする遺伝子とを導入すること
により行われる（Ｂ１）に記載の遺伝子改変植物。
ゲノム編集技術を用いて、前記対象植物の前記内在性ＦＴ遺伝子を破壊して、内在性ＦＴ遺伝子破壊株を得ることと、
前記内在性ＦＴ遺伝子破壊株に、前記発現カセットを導入すること
により行われる（Ｂ１）に記載の遺伝子改変植物。
（Ｂ９）前記置換が、
ゲノム編集技術を用いて、前記対象植物の前記内在性ＦＴ遺伝子を破壊して、内在性ＦＴ遺伝子破壊株を得ることと、
前記内在性ＦＴ遺伝子破壊株に、前記発現カセットと、前記誘導性プロモーターに結合して前記外来性ＦＴ遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子をコードする遺伝子とを導入すること
により行われる（Ｂ１）に記載の遺伝子改変植物。
【0110】
なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々に変形することが可能である。また、各実施形態は適宜組み合わせて実施してもよく、その場合組み合わせた効果が得られる。更に、上記実施形態には種々の発明が含まれており、開示される複数の構成要件から選択された組み合わせにより種々の発明が抽出され得る。例えば、実施形態に示される全構成要件からいくつかの構成要件が削除されても、課題が解決でき、効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。
【実施例0111】
［１］ベクターの作製
図１に示すベクターを以下のとおり作製した。まず、設計したガイドRNAのガイド配列（配列番号９）を、ゲノム編集用ベクターpKSE401（addgene）に導入した。pKSE401（addgene）は、カナマイシン耐性遺伝子（配列番号１～３）、tracrRNAのコード領域（配列番号１０）、およびCas9遺伝子（配列番号２および１２）を予め含んでいる。具体的には、ガイドRNAのガイド配列の導入は、pKSE401（addgene）をBsaIによって制限酵素処理して線状化ベクターを調製し、線状化ベクターにアニールしたオリゴヌクレオチドをライゲーションによって導入することにより行った。次に、外来性FT遺伝子の発現カセット（薬剤誘導コンストラクト；配列番号４～８の塩基配列を含む）および転写活性化因子GVG遺伝子（配列番号２、１３および１４）を、ライゲーションまたはIn-Fusionなどのシームレスクローニングにより、ゲノム編集カセット（配列番号９、１０および１２の塩基配列を含む）と連結した。これにより、図１に示すベクターを作製した。
図１に示すベクターを以下のとおり作製した。まず、設計したガイドRNAのガイド配列（配列番号９）を、ゲノム編集用ベクターpKSE401（addgene）に導入した。pKSE401（addgene）は、カナマイシン耐性遺伝子（配列番号１～３）、tracrRNAのコード領域（配列番号１０）、およびCas9遺伝子（配列番号２および１２）を予め含んでいる。具体的には、ガイドRNAのガイド配列の導入は、pKSE401（addgene）をBsaIによって制限酵素処理して線状化ベクターを調製し、線状化ベクターにアニールしたオリゴヌクレオチドをライゲーションによって導入することにより行った。次に、外来性FT遺伝子の発現カセット（薬剤誘導コンストラクト；配列番号４～８の塩基配列を含む）および転写活性化因子GVG遺伝子（配列番号２、１３および１４）を、ライゲーションまたはIn-Fusionなどのシームレスクローニングにより、ゲノム編集カセット（配列番号９、１０および１２の塩基配列を含む）と連結した。これにより、図１に示すベクターを作製した。
【0112】
［２］対象植物へのベクターの導入
作製されたベクターを、アグロバクテリウム法またはパーティクルガン法によって対象植物の細胞に導入し、ベクターが導入された植物細胞から植物体を再生した。ゲノム編集や相同組換えの確認は、ターゲット領域のPCR解析またはサザンブロット解析により行った。
作製されたベクターを、アグロバクテリウム法またはパーティクルガン法によって対象植物の細胞に導入し、ベクターが導入された植物細胞から植物体を再生した。ゲノム編集や相同組換えの確認は、ターゲット領域のPCR解析またはサザンブロット解析により行った。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】