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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024171246
(43)【公開日】2024-12-11
(54)【発明の名称】ヌクレオチドの可視化方法およびその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20241204BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20241204BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241204BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241204BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z ZNA
C12Q1/02
C12N5/10
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023088218
(22)【出願日】2023-05-29
(71)【出願人】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】紙谷 浩之
(72)【発明者】
【氏名】藤川 芳宏
(72)【発明者】
【氏名】河合 秀彦
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 哲矢
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QQ02
4B063QR80
4B063QS38
4B063QX02
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】生細胞内のヌクレオチドを可視化する方法を提供する。
【解決手段】特定の構造を有する第１の融合タンパク質、および特定の構造を有する第２の融合タンパク質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内ヌクレオチドの可視化法。
【選択図】図２
【解決手段】特定の構造を有する第１の融合タンパク質、および特定の構造を有する第２の融合タンパク質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内ヌクレオチドの可視化法。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞内ヌクレオチドの可視化法であって、
第１の融合タンパク質、および
第２の融合タンパク質を細胞内で発現させることを特徴とし、
前記第１の融合タンパク質は、Ａ－Ｌｎ－Ｘ、またはＸ－Ｌｎ－Ａで示され、
前記第２の融合タンパク質は、Ｂ－Ｌｎ－Ｙ、またはＹ－Ｌｎ－Ｂで示される、細胞内ヌクレオチドの可視化法。
（式中、
Ａは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第１の部分であり、
Ｂは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第２の部分であり、
前記第１の部分および前記第２の部分は、それぞれ異なるアミノ酸配列を有し、かつ前記細胞内ヌクレオチドと相互作用し、
ＸおよびＹは、前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質と、前記細胞内ヌクレオチドとが、細胞内で会合した場合に、蛍光を発する、または発光する物質であり、
Ｌは、リンカーであり、
ｎは、前記Ｌのアミノ酸数を示し、０～１００である。）
第１の融合タンパク質、および
第２の融合タンパク質を細胞内で発現させることを特徴とし、
前記第１の融合タンパク質は、Ａ－Ｌｎ－Ｘ、またはＸ－Ｌｎ－Ａで示され、
前記第２の融合タンパク質は、Ｂ－Ｌｎ－Ｙ、またはＹ－Ｌｎ－Ｂで示される、細胞内ヌクレオチドの可視化法。
（式中、
Ａは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第１の部分であり、
Ｂは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第２の部分であり、
前記第１の部分および前記第２の部分は、それぞれ異なるアミノ酸配列を有し、かつ前記細胞内ヌクレオチドと相互作用し、
ＸおよびＹは、前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質と、前記細胞内ヌクレオチドとが、細胞内で会合した場合に、蛍光を発する、または発光する物質であり、
Ｌは、リンカーであり、
ｎは、前記Ｌのアミノ酸数を示し、０～１００である。）
【請求項2】
前記細胞内ヌクレオチドが、損傷ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の可視化法。
【請求項3】
前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質が、前記損傷ヌクレオチドに結合するタンパク質である、請求項２に記載の可視化法。
【請求項4】
前記ＸおよびＹが、ｆｌｕｏｐｐｉシステムを構成するＡｓｈ－ＴａｇおよびＦＰ－ｔａｇ、ＦＲＥＴを構成するドナー分子およびアクセプター分子、発光タンパク質を分割した第１の部分および第２の部分、または蛍光タンパク質を分割した第１の部分および第２の部分のいずれかの組み合わせである、請求項１～３のいずれか１項に記載の可視化法。
【請求項5】
第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質からなる、細胞内ヌクレオチドの可視化用組み合わせであり、
前記第１の融合タンパク質は、Ａ－Ｌｎ－Ｘ、またはＸ－Ｌｎ－Ａで示され、
前記第２の融合タンパク質は、Ｂ－Ｌｎ－Ｙ、またはＹ－Ｌｎ－Ｂで示される、組み合わせ。
（式中、
Ａは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第１の部分であり、
Ｂは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第２の部分であり、
前記第１の部分および前記第２の部分は、それぞれ異なるアミノ酸配列を有し、かつ前記細胞内ヌクレオチドと相互作用し、
ＸおよびＹは、前記第１の融合タンパク質、前記第２の融合タンパク質、および前記細胞内ヌクレオチドが、細胞内で会合した場合に、蛍光を発する、または発光する物質であり、
Ｌは、リンカーであり、
ｎは、前記Ｌのアミノ酸数を示し、０～１００である。）
前記第１の融合タンパク質は、Ａ－Ｌｎ－Ｘ、またはＸ－Ｌｎ－Ａで示され、
前記第２の融合タンパク質は、Ｂ－Ｌｎ－Ｙ、またはＹ－Ｌｎ－Ｂで示される、組み合わせ。
（式中、
Ａは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第１の部分であり、
Ｂは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第２の部分であり、
前記第１の部分および前記第２の部分は、それぞれ異なるアミノ酸配列を有し、かつ前記細胞内ヌクレオチドと相互作用し、
ＸおよびＹは、前記第１の融合タンパク質、前記第２の融合タンパク質、および前記細胞内ヌクレオチドが、細胞内で会合した場合に、蛍光を発する、または発光する物質であり、
Ｌは、リンカーであり、
ｎは、前記Ｌのアミノ酸数を示し、０～１００である。）
【請求項6】
請求項５に記載の第１の融合タンパク質をコードする核酸、および請求項５に記載の第２の融合タンパク質をコードする核酸を含む、ベクター。
【請求項7】
請求項５に記載の組み合わせ、または請求項６に記載のベクターを含む、形質転換体。
【請求項8】
請求項５に記載の組み合わせ、または請求項６に記載のベクターを含む、細胞内ヌクレオチドの可視化用キット。
【請求項9】
抗がん剤の候補物質のスクリーニング方法であって、
（Ａ）請求項７に記載の形質転換体と、試験物質とを接触させる工程、
（Ｂ）前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光を測定する工程、および
（Ｃ）前記試験物質と接触させた前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光が、前記試験物質を接触させない場合と比べて高い場合に、前記試験物質が抗がん剤の候補物質であると判定する工程、を含み、
可視化の対象となる前記細胞内ヌクレオチドが損傷ヌクレオチドである、スクリーニング方法。
（Ａ）請求項７に記載の形質転換体と、試験物質とを接触させる工程、
（Ｂ）前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光を測定する工程、および
（Ｃ）前記試験物質と接触させた前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光が、前記試験物質を接触させない場合と比べて高い場合に、前記試験物質が抗がん剤の候補物質であると判定する工程、を含み、
可視化の対象となる前記細胞内ヌクレオチドが損傷ヌクレオチドである、スクリーニング方法。
【請求項10】
抗酸化剤の候補物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項７に記載の形質転換体と、試験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光を測定する工程、および
（ｃ）前記試験物質と接触させた前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光が、前記試験物質を接触させない場合と比べて低い場合に、前記試験物質が抗酸化剤の候補物質であると判定する工程、を含み、
可視化の対象となる前記細胞内ヌクレオチドが損傷ヌクレオチドである、スクリーニング方法。
（ａ）請求項７に記載の形質転換体と、試験物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光を測定する工程、および
（ｃ）前記試験物質と接触させた前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光が、前記試験物質を接触させない場合と比べて低い場合に、前記試験物質が抗酸化剤の候補物質であると判定する工程、を含み、
可視化の対象となる前記細胞内ヌクレオチドが損傷ヌクレオチドである、スクリーニング方法。
【請求項11】
細胞の酸化ストレスの測定に使用するための、請求項５に記載の組み合わせ。
【請求項12】
請求項５に記載の組み合わせ、または請求項６に記載のベクターを導入した細胞を用いて、当該細胞内の蛍光または発光を指標とすることにより、細胞の酸化ストレスを測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヌクレオチドの可視化方法およびその利用に関する。
【背景技術】
【0002】
ヌクレオチドは核酸関連化合物であり、塩基部、糖部およびリン酸から構成されている。ヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡの原料、または代謝物であるが、「細胞内のエネルギー通貨」として知られるアデノシン５’－３リン酸（ＡＴＰ）、細胞内情報伝達に関与するグアノシン５’－３リン酸（ＧＴＰ）などもヌクレオチドに含まれる。
【0003】
細胞内のヌクレオチドを検出する方法として、様々な方法が提示されている。そのような方法としては例えば、細胞膜を破壊した細胞等に含まれるヌクレオチドを高速液体クロマトグラフィー等により検出する方法（非特許文献１、２）等が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】S. Matsuda and T. Kasahara, Simultaneous and absolute quantification of nucleoside triphosphates using liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry. Genes Environ. 40, 13 (2018)
【非特許文献2】Z. F. Pursell, J. T. McDonald, C. K. Mathews, T. A. Kunkel, Trace amounts of 8-oxo-dGTP in mitochondrial dNTP pools reduce DNA polymerase γ replication fidelity. Nucleic Acids Res. 36, 2174-2181 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、上述のような従来技術は、細胞内のヌクレオチドを可視化するために、細胞を破壊する必要があった。
【0006】
そこで、本発明の一態様は、細胞（とりわけ、生細胞）内のヌクレオチドを可視化する方法を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、特定の構造を有する第１の融合タンパク質と、特定の構造を有する第２の融合タンパク質と、を細胞内で発現させることにより、細胞（とりわけ、生細胞）内のヌクレオチドを可視化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本発明は、以下の構成を含む。
＜１＞細胞内ヌクレオチドの可視化法であって、第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質を細胞内で発現させることを特徴とし、前記第１の融合タンパク質は、Ａ－Ｌｎ－Ｘ、またはＸ－Ｌｎ－Ａで示され、前記第２の融合タンパク質は、Ｂ－Ｌｎ－Ｙ、またはＹ－Ｌｎ－Ｂで示される、細胞内ヌクレオチドの可視化法。（式中、Ａは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第１の部分であり、Ｂは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第２の部分であり、前記第１の部分および前記第２の部分は、それぞれ異なるアミノ酸配列を有し、かつ前記細胞内ヌクレオチドと相互作用し、ＸおよびＹは、前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質と、前記細胞内ヌクレオチドとが、細胞内で会合した場合に、蛍光を発する、または発光する物質であり、Ｌは、リンカーであり、ｎは、前記Ｌのアミノ酸数を示し、０～１００である。）
＜２＞前記細胞内ヌクレオチドが、損傷ヌクレオチドを含む、＜１＞に記載の可視化法。
＜３＞前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質が、前記損傷ヌクレオチドに結合するタンパク質である、＜２＞に記載の可視化法。
＜４＞前記ＸおよびＹが、ｆｌｕｏｐｐｉシステムを構成するＡｓｈ－ＴａｇおよびＦＰ－ｔａｇ、ＦＲＥＴを構成するドナー分子およびアクセプター分子、発光タンパク質を分割した第１の部分および第２の部分、または蛍光タンパク質を分割した第１の部分および第２の部分のいずれかの組み合わせである、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の可視化法。
＜５＞第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質からなる、細胞内ヌクレオチドの可視化用組み合わせであり、前記第１の融合タンパク質は、Ａ－Ｌｎ－Ｘ、またはＸ－Ｌｎ－Ａで示され、前記第２の融合タンパク質は、Ｂ－Ｌｎ－Ｙ、またはＹ－Ｌｎ－Ｂで示される、組み合わせ。（式中、Ａは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第１の部分であり、Ｂは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第２の部分であり、前記第１の部分および前記第２の部分は、それぞれ異なるアミノ酸配列を有し、かつ前記細胞内ヌクレオチドと相互作用し、ＸおよびＹは、前記第１の融合タンパク質、前記第２の融合タンパク質、および前記細胞内ヌクレオチドが、細胞内で会合した場合に、蛍光を発する、または発光する物質であり、Ｌは、リンカーであり、ｎは、前記Ｌのアミノ酸数を示し、０～１００である。）
＜６＞＜５＞に記載の第１の融合タンパク質をコードする核酸、および＜５＞に記載の第２の融合タンパク質をコードする核酸を含む、ベクター。
＜７＞＜５＞に記載の組み合わせ、または＜６＞に記載のベクターを含む、形質転換体。
＜８＞＜５＞に記載の組み合わせ、または＜６＞に記載のベクターを含む、細胞内ヌクレオチドの可視化用キット。
＜９＞抗がん剤の候補物質のスクリーニング方法であって、（Ａ）＜７＞に記載の形質転換体と、試験物質とを接触させる工程、（Ｂ）前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光を測定する工程、および（Ｃ）前記試験物質と接触させた前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光が、前記試験物質を接触させない場合と比べて高い場合に、前記試験物質が抗がん剤の候補物質であると判定する工程、を含み、可視化の対象となる前記細胞内ヌクレオチドが損傷ヌクレオチドである、スクリーニング方法。
＜１０＞抗酸化剤の候補物質のスクリーニング方法であって、（ａ）＜７＞に記載の形質転換体と、試験物質とを接触させる工程、（ｂ）前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光を測定する工程、および（ｃ）前記試験物質と接触させた前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光が、前記試験物質を接触させない場合と比べて低い場合に、前記試験物質が抗酸化剤の候補物質であると判定する工程、を含み、可視化の対象となる前記細胞内ヌクレオチドが損傷ヌクレオチドである、スクリーニング方法。
＜１１＞細胞の酸化ストレスの測定に使用するための、＜５＞に記載の組み合わせ。
＜１２＞＜５＞または＜１１＞に記載の組み合わせ、または＜６＞に記載のベクターを導入した細胞を用いて、当該細胞内の蛍光または発光を指標とすることにより、細胞の酸化ストレスを測定する方法。
＜１＞細胞内ヌクレオチドの可視化法であって、第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質を細胞内で発現させることを特徴とし、前記第１の融合タンパク質は、Ａ－Ｌｎ－Ｘ、またはＸ－Ｌｎ－Ａで示され、前記第２の融合タンパク質は、Ｂ－Ｌｎ－Ｙ、またはＹ－Ｌｎ－Ｂで示される、細胞内ヌクレオチドの可視化法。（式中、Ａは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第１の部分であり、Ｂは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第２の部分であり、前記第１の部分および前記第２の部分は、それぞれ異なるアミノ酸配列を有し、かつ前記細胞内ヌクレオチドと相互作用し、ＸおよびＹは、前記第１の融合タンパク質および前記第２の融合タンパク質と、前記細胞内ヌクレオチドとが、細胞内で会合した場合に、蛍光を発する、または発光する物質であり、Ｌは、リンカーであり、ｎは、前記Ｌのアミノ酸数を示し、０～１００である。）
＜２＞前記細胞内ヌクレオチドが、損傷ヌクレオチドを含む、＜１＞に記載の可視化法。
＜３＞前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質が、前記損傷ヌクレオチドに結合するタンパク質である、＜２＞に記載の可視化法。
＜４＞前記ＸおよびＹが、ｆｌｕｏｐｐｉシステムを構成するＡｓｈ－ＴａｇおよびＦＰ－ｔａｇ、ＦＲＥＴを構成するドナー分子およびアクセプター分子、発光タンパク質を分割した第１の部分および第２の部分、または蛍光タンパク質を分割した第１の部分および第２の部分のいずれかの組み合わせである、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の可視化法。
＜５＞第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質からなる、細胞内ヌクレオチドの可視化用組み合わせであり、前記第１の融合タンパク質は、Ａ－Ｌｎ－Ｘ、またはＸ－Ｌｎ－Ａで示され、前記第２の融合タンパク質は、Ｂ－Ｌｎ－Ｙ、またはＹ－Ｌｎ－Ｂで示される、組み合わせ。（式中、Ａは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第１の部分であり、Ｂは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第２の部分であり、前記第１の部分および前記第２の部分は、それぞれ異なるアミノ酸配列を有し、かつ前記細胞内ヌクレオチドと相互作用し、ＸおよびＹは、前記第１の融合タンパク質、前記第２の融合タンパク質、および前記細胞内ヌクレオチドが、細胞内で会合した場合に、蛍光を発する、または発光する物質であり、Ｌは、リンカーであり、ｎは、前記Ｌのアミノ酸数を示し、０～１００である。）
＜６＞＜５＞に記載の第１の融合タンパク質をコードする核酸、および＜５＞に記載の第２の融合タンパク質をコードする核酸を含む、ベクター。
＜７＞＜５＞に記載の組み合わせ、または＜６＞に記載のベクターを含む、形質転換体。
＜８＞＜５＞に記載の組み合わせ、または＜６＞に記載のベクターを含む、細胞内ヌクレオチドの可視化用キット。
＜９＞抗がん剤の候補物質のスクリーニング方法であって、（Ａ）＜７＞に記載の形質転換体と、試験物質とを接触させる工程、（Ｂ）前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光を測定する工程、および（Ｃ）前記試験物質と接触させた前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光が、前記試験物質を接触させない場合と比べて高い場合に、前記試験物質が抗がん剤の候補物質であると判定する工程、を含み、可視化の対象となる前記細胞内ヌクレオチドが損傷ヌクレオチドである、スクリーニング方法。
＜１０＞抗酸化剤の候補物質のスクリーニング方法であって、（ａ）＜７＞に記載の形質転換体と、試験物質とを接触させる工程、（ｂ）前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光を測定する工程、および（ｃ）前記試験物質と接触させた前記形質転換体における細胞内の蛍光または発光が、前記試験物質を接触させない場合と比べて低い場合に、前記試験物質が抗酸化剤の候補物質であると判定する工程、を含み、可視化の対象となる前記細胞内ヌクレオチドが損傷ヌクレオチドである、スクリーニング方法。
＜１１＞細胞の酸化ストレスの測定に使用するための、＜５＞に記載の組み合わせ。
＜１２＞＜５＞または＜１１＞に記載の組み合わせ、または＜６＞に記載のベクターを導入した細胞を用いて、当該細胞内の蛍光または発光を指標とすることにより、細胞の酸化ストレスを測定する方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明の一態様によれば、細胞（とりわけ、生細胞）内のヌクレオチドを可視化する方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】実施例１に係る、ｄＧまたはｄＧＯを添加して培養した生細胞中のｄＧＯＴＰの検出結果の観察像である。
【図2】実施例２の試験１に係る、ｄＧＯＴＰの検出結果の観察像である。
【図3】実施例２の試験１に係る、ｄＧＯＴＰの検出結果を示したグラフである。
【図4】実施例２の試験２に係る、ｄＧＯＴＰの検出結果の観察像である。
【図5】実施例２の試験２に係る、ｄＧＯＴＰの検出結果を示したグラフである。
【図6】実施例３の試験１に係る、ｄＧＯＴＰの検出結果の観察像である。
【図7】実施例３の試験１に係る、ｄＧＯＴＰの検出結果を示したグラフである。
【図8】実施例３の試験２に係る、ｄＧＯＴＰの検出結果の観察像である。
【図9】実施例３の試験２に係る、ｄＧＯＴＰの検出結果を示したグラフである。
【図10】実施例４に係る、ｄＧＯＴＰの検出結果の観察像である。
【図11】実施例４に係る、ｄＧＯＴＰの検出結果を示したグラフである。
【図12】実施例５に係る、ｄＧＯＴＰの検出結果を示した観察像である。
【図13】実施例５に係る、ｄＧＯＴＰの検出結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
〔１．本発明の概要〕
細胞内のヌクレオチドには様々な種類が存在している。例えばＡＴＰ、ＧＴＰ等のヌクレオチドは生体の恒常性の維持に関与しており、これらの濃度異常は疾病の原因となり得る。また、化学変化が生じた損傷ヌクレオチドは変異、発がん、および細胞死等の原因となっていることが知られており、細胞中のこれらの損傷ヌクレオチドを検出することにより、薬剤のスクリーニングを実施することができる。
細胞内のヌクレオチドには様々な種類が存在している。例えばＡＴＰ、ＧＴＰ等のヌクレオチドは生体の恒常性の維持に関与しており、これらの濃度異常は疾病の原因となり得る。また、化学変化が生じた損傷ヌクレオチドは変異、発がん、および細胞死等の原因となっていることが知られており、細胞中のこれらの損傷ヌクレオチドを検出することにより、薬剤のスクリーニングを実施することができる。
【0012】
従来、ヌクレオチドを検出するためには、細胞膜を破壊した細胞、または組織を使用する必要があった。この方法ではヌクレオチドを定量的に解析することはできるが、細胞内での局在を調べることは困難である。また、従来の方法ではヌクレオチドを解析するたびに細胞を破壊する必要があったため、多数の試料が必要となる場合もあった。
【0013】
上述した従来の方法に対して、本発明の一実施形態に係るヌクレオチドの可視化方法は、融合タンパク質を細胞内で発現させることによりヌクレオチドを可視化するため、細胞を破壊する必要がない。それだけではなく、可視化されたヌクレオチドは蛍光を発するため、蛍光顕微鏡等を用いた観察も可能となる。それゆえ、本発明の一実施形態に係る可視化方法によれば、生細胞内のヌクレオチドの局在も調べることが可能である。このように、融合タンパク質の発現により生細胞内のヌクレオチドを可視化して、検出可能とする方法は従来には存在しなかったものであり、驚くべきことである。
【0014】
また、本発明の一実施形態に係るヌクレオチドの可視化方法は、損傷ヌクレオチドの濃度変化も可視化できるため、バイオマーカー、治療薬のスクリーニング、細胞の酸化ストレス測定等に有用である。
【0015】
〔２．細胞内ヌクレオチドの可視化法〕
本発明の一実施形態に係る細胞内ヌクレオチドの可視化法（以下、「本可視化方法」と称する。）は、特定の構造を有する第１の融合タンパク質、および特定の構造を有する第２の融合タンパク質を細胞内で発現させることを特徴とする。本可視化方法は、前記第１の融合タンパク質と、特定の構造を有する第２の融合タンパク質とが、細胞内のヌクレオチドと結合することで、細胞内のヌクレオチドを可視化することを可能とする。
本発明の一実施形態に係る細胞内ヌクレオチドの可視化法（以下、「本可視化方法」と称する。）は、特定の構造を有する第１の融合タンパク質、および特定の構造を有する第２の融合タンパク質を細胞内で発現させることを特徴とする。本可視化方法は、前記第１の融合タンパク質と、特定の構造を有する第２の融合タンパク質とが、細胞内のヌクレオチドと結合することで、細胞内のヌクレオチドを可視化することを可能とする。
【0016】
第１の融合タンパク質は、Ａ－Ｌｎ－Ｘ、またはＸ－Ｌｎ－Ａで示される。式中、Ａは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第１の部分であり、かつ細胞内ヌクレオチドと相互作用し、Ｘは第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質と、前記細胞内ヌクレオチドとが細胞内で会合した場合に、蛍光を発する物質、または発光する物質である。Ｌは、リンカーであり、ｎは、前記Ｌのアミノ酸数を示し、０～１００である。
【0017】
第２の融合タンパク質は、Ｂ－Ｌｎ－Ｙ、またはＹ－Ｌｎ－Ｂで示される。Ｂは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第２の部分であり、前記第２の部分は、前記第１の部分とは異なるアミノ酸配列を有し、かつ細胞内ヌクレオチドと相互作用し、Ｙは、前記第１の融合タンパク質、前記第２の融合タンパク質、および前記細胞内ヌクレオチドが、細胞内で会合した場合に、蛍光を発する物質、または発光する物質である。Ｌは、リンカーであり、ｎは、前記Ｌのアミノ酸数を示し、０～１００である。
【0018】
本明細書中、「相互作用する」とは、前記ＡおよびＢがそれぞれヌクレオチドに結合可能であること、または前記ＡおよびＢがそれぞれヌクレオチドを認識可能であることを意味する。すなわち、ＡおよびＢはそれぞれ単独でヌクレオチドに結合可能であってもよいし、ＡおよびＢが細胞内で会合した場合にのみヌクレオチドに結合可能であってもよい。
【0019】
第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質は、細胞内で一過性に発現されていてもよいし、恒常的に発現されていてもよい。後述するスクリーニング方法、酸化ストレスの測定方法等において簡便に使用できる観点からは、細胞内で恒常的に発現させることが好ましい。これらの融合タンパク質を細胞内で発現させる方法としては、後述するベクターを細胞に導入する方法等が挙げられる。
【0020】
前記ＡおよびＢは、１つのタンパク質中に少なくとも２つ存在する細胞内ヌクレオチドと相互作用する部分であり、かつそれぞれ異なるアミノ酸配列を有する部分である。前記ＡおよびＢは、前記定義に含まれるものであれば特に限定されず、１つのタンパク質の全長を分割した各々の部分であってもよいし、１つのタンパク質中の一部分であってもよい。前者の場合は、分割したＮ末端側およびＣ末端側のそれぞれに細胞内ヌクレオチドと相互作用する領域を含む。また、後者の場合は、１つのタンパク質中の各一部分に、細胞内ヌクレオチドと相互作用する領域を含む。以下、前記ＡおよびＢの一例として、１つのタンパク質の全長を分割した場合について説明する。前記タンパク質の分割位置は、前記ＡおよびＢの各々を含む第１の融合タンパク質と、第２の融合タンパク質とを用いて、細胞内のヌクレオチドを可視化できる位置であれば特に限定されない。
【0021】
前記タンパク質の、分割位置を決定する方法としては、例えば、立体構造解析または構造解析予測ソフトウエアによって分割する位置を絞り込んだ後、後述する実施例１に記載の方法を実施して、その結果に基づいて決定することができる。より具体的には、細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質として、例えば、ＭｕｔＴを選択した場合、Ｘ線結晶構造解析による解析結果に基づくと、前記ＡおよびＢとして使用可能な候補として、４２番目と４３番目のアミノ酸の間の位置、または９５番目と９６番目のアミノ酸の間の位置で分割した断片が得られる。タンパク質の分割は、例えば、二次構造を有さないループ部分であり、かつヌクレオチドに結合する部位ではない領域で分割することが好ましい。さらに、前記ＡおよびＢの両方に、ヌクレオチドに結合する部位が存在するような領域で分割されることがより好ましい。次に、分割した前記タンパク質のそれぞれをＸまたはＹとリンカーにより結合させた、発現ベクタープラスミドを、任意のヒト細胞に公知の方法を用いて導入する。その後、蛍光顕微鏡等により蛍光、または発光等を確認し、最適なタンパク質の組み合わせを見つけることができる。
【0022】
本発明の特徴は、ヌクレオチドに特異的に結合するタンパク質を分割し、分割したタンパク質のそれぞれを細胞内で会合した場合に蛍光を発する、または発光する物質と結合させることにある。すなわち、本可視化方法において使用されるタンパク質は、検出したいヌクレオチドに特異的に結合する任意のタンパク質であればよい。また、検出対象となるヌクレオチドも、特異的に結合するタンパク質が知られているヌクレオチドであればよい。その一例として、実施例ではヌクレオチドであるｄＧＯＴＰに特異的に結合する、タンパク質のＭｕｔＴを使用して、ｄＧＯＴＰを可視化できることが実証されている。したがって、当業者であれば、ｄＧＯＴＰおよびＭｕｔＴを適宜変更して、任意のヌクレオチドとタンパク質の組み合わせに適用することができる。
【0023】
また、前記ＡおよびＢとして使用する断片は、前記タンパク質の断片のうち、いずれであってもよい。すなわち、前記タンパク質としてＭｕｔＴを採用した場合、９５番目のアミノ酸までの断片をＡ、９６番目のアミノ酸からの断片をＢとしてもよいし、９６番目のアミノ酸からの断片をＡ、９５番目のアミノ酸までの断片をＢとしてもよい。
【0024】
本可視化方法において、可視化されるヌクレオチドは特に限定されず、例えば、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびこれらの損傷ヌクレオチド等が挙げられる。本明細書において、「損傷ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドに化学物質、または放射線等が作用することにより、または酵素的に化学変化が生じたヌクレオチドを意図する。本可視化方法において、可視化されるヌクレオチドは、損傷ヌクレオチドを含むことが好ましく、損傷ヌクレオチドであることがより好ましい。損傷ヌクレオチドとしては、例えば、２'－デオキシグアノシン５’－三リン酸（ｄＧＴＰ）に活性酸素が作用した７，８－ジヒドロ－８－オクソ－２’－デオキシグアノシン５’－三リン酸（ｄＧＯＴＰ）、２－ヒドロキシ－２’－デオキシアデノシン５’－三リン酸（ｄＡＯＴＰ）、ｄＵＴＰ、２’－デオキシイノシン５’－三リン酸（ｄＩＴＰ）等が挙げられる。可視化されるヌクレオチドが損傷ヌクレオチドであれば、生体内の異常、または疾病等を検出しやすくなる。
【0025】
損傷ヌクレオチドは、ＤＮＡ等に取り込まれることにより、細胞変異、発がん、細胞死の原因となる。がん細胞には損傷ヌクレオチドが蓄積していると考えられているため、損傷ヌクレオチドを可視化または検出することにより、がん細胞に対するスクリーニング等が可能となる。
【0026】
ヌクレオチドに結合する前記タンパク質は、上述した通り、目的とするヌクレオチドに結合可能なタンパク質であれば特に限定されない。前記ヌクレオチドに結合するタンパク質としては例えば、ｄＧＯＴＰに結合するＭｕｔＴ、ｄＡＯＴＰに結合するＯｒｆ１３５、ｄＧＯＴＰおよびｄＡＯＴＰに結合するＭＴＨ１、ｄＵＴＰに結合するｄＵＴＰａｓｅ、ｄＩＴＰに結合するＩＴＰＡ、ＡＴＰに結合する種々のキナーゼ、ＧＴＰに結合するＧｓα、ＲＡＳ ｐ２１等が挙げられる。これらの中でも、損傷ヌクレオチドに結合するタンパク質が好ましく、より好ましくは、ＭｕｔＴ、Ｏｒｆ１３５、ＭＴＨ１、ｄＵＴＰａｓｅ、ＩＴＰＡ等である。損傷ヌクレオチドに結合するタンパク質を使用することにより、生体内の異常、または疾病等を検出しやすくなる。ヌクレオチドに結合する前記タンパク質は、ヌクレオチドに対する結合能を失わない範囲で、アミノ酸が置換または欠失されていてもよい。
【0027】
前記式中、ＸおよびＹは、細胞内で会合して、蛍光を発するか、または発光する物質であれば特に限定されない。本明細書において「蛍光を発する物質」は、蛍光輝点を形成する物質も含む。すなわち、本明細書において「蛍光を発する」との概念には、「蛍光輝点を形成する」ことも包含される。また、本明細書において「蛍光輝点」は、第１の融合タンパク質のＸ、および第２の融合タンパク質のＹが会合することにより生じ、これらの融合タンパク質が拡散状態で存在しているよりも高い蛍光強度を有する領域を意味する。蛍光輝点の大きさは、通常１０ｎｍ～１０μｍである。上述した事項は、「蛍光」を「発光」に置き換えた場合も同様である。
【0028】
蛍光を発する、または発光する物質の組み合わせとしては、ｆｌｕｏｐｐｉ（登録商標）システムを構成するＡｓｈ－ＴａｇおよびＦＰ－ｔａｇ、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を構成するドナー分子およびアクセプター分子、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼタンパク質）を分割した第１の部分および第２の部分等であり得る。これらの物質は、会合により蛍光を発する、または発光するため、ヌクレオチドの検出を容易に行うことができる。
【0029】
また、ヌクレオチドの検出にｆｌｕｏｐｐｉシステム等を採用する場合、蛍光輝点が生じている場合に、ヌクレオチドが検出できていると判定する。この場合、ＸおよびＹが単独で蛍光を発している状態は、ヌクレオチドが検出できているとは判定しない。なお、ＸおよびＹが単独で蛍光を発している状態と、ＸおよびＹが会合して蛍光輝点を形成している状態とは、当業者であれば明確に区別することができる。
【0030】
上記に加えて、本明細書中「発光する」とは、その物質自体が発光することだけでなく、対象となる物質が任意の発光反応を触媒することも含む。なお、可視化する細胞内ヌクレオチドがＡＴＰである場合は、発光するためにＡＴＰを使用する物質ではなく、ＡＴＰに依存しないタイプの物質（例えば、ＮａｎｏＬｕｃ等ルシフェラーゼ）を使用することが好ましい。
【0031】
ＸおよびＹがｆｌｕｏｐｐｉシステムを構成するＡｓｈ－ＴａｇおよびＦＰ－ｔａｇである場合、例えば、ＸがＡｓｈ－Ｔａｇ、ＹがＦＰ－ｔａｇであってもよく、ＸがＦＰ－ｔａｇ、ＹがＡｓｈ－Ｔａｇであってもよい。なお、ＦＰ－ｔａｇに使用可能な蛍光タンパク質としては例えば、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ（ＡＧ）、ヒト化Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ（ｈＡＧ）、およびＭｏｎｔｉ－Ｒｅｄ等が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、ＸおよびＹがＦＲＥＴを構成するドナー分子およびアクセプター分子である場合、例えばＸがドナー分子、Ｙがアクセプター分子であってもよく、Ｘがアクセプター分子、Ｙがドナー分子であってもよい。さらに、ＸおよびＹが蛍光タンパク質または発光タンパク質を分割した第１の部分および第２の部分である場合、例えばＸが第１の部分、Ｙが第２の部分であってもよく、Ｘが第２の部分、Ｙが第１の部分であってもよい。
【0032】
本発明の一実施形態において、第１の融合タンパク質は配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有し、第２の融合タンパク質は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有していてもよい。前記構成であれば、ｄＧＯヌクレオチドを効率的に可視化することができる。
【0033】
前記式中、Ｌはリンカーである。リンカーは、任意のリンカーを使用することができ、特段限定されないが、例えば、グリシン－セリンリンカー、グリシンリンカー等が挙げられる。柔軟性の観点から、好ましくは、グリシン－セリンリンカーが使用される。リンカーを構成するアミノ酸の数は、リンカーの種類により異なり得るが、０～１００であり、好ましくは０～５０であり、より好ましくは１～３０である。
【0034】
本可視化方法において、前記細胞としては、特に限定されないが、例えば、細菌、酵母、昆虫、植物、真核生物、哺乳動物、原核生物の細胞等が挙げられる。細胞としては、単離された細胞であってもよいし、生体内の細胞であってもよい。好ましくは、魚類、鳥類、哺乳動物等の細胞であり、より好ましくは哺乳動物の細胞、さらに好ましくはヒト細胞である。
【0035】
また、本可視化方法により検出されるヌクレオチドは、細胞の核内のヌクレオチドであってもよいし、小胞体等の細胞小器官内のヌクレオチドであってもよいし、細胞質内のヌクレオチドであってもよい。細胞の酸化ストレス等の評価を行いやすい観点から、細胞質内のヌクレオチドであることが好ましい。
【0036】
〔３．組み合わせ〕
本発明の一実施形態に係る細胞内ヌクレオチドの可視化用組み合わせ（以下、「本組み合わせ」と称する。）は、第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質からなり、前記第１の融合タンパク質は、Ａ－Ｌｎ－Ｘ、またはＸ－Ｌｎ－Ａで示され、前記第２の融合タンパク質は、Ｂ－Ｌｎ－Ｙ、またはＹ－Ｌｎ－Ｂで示される。（式中、Ａは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第１の部分であり、Ｂは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第２の部分であり、前記第１の部分および前記第２の部分は、それぞれ異なるアミノ酸配列を有し、かつ細胞内ヌクレオチドと相互作用し、ＸおよびＹは、前記第１の融合タンパク質、前記第２の融合タンパク質、および前記細胞内ヌクレオチドが、細胞内で会合した場合に、蛍光を発する、発光する物質であり、Ｌは、リンカーであり、ｎは、前記Ｌのアミノ酸数を示し、０～１００である。）以下、前記〔１．ヌクレオチドの可視化方法〕において既に説明した事項については、適宜記載を省略する。
本発明の一実施形態に係る細胞内ヌクレオチドの可視化用組み合わせ（以下、「本組み合わせ」と称する。）は、第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質からなり、前記第１の融合タンパク質は、Ａ－Ｌｎ－Ｘ、またはＸ－Ｌｎ－Ａで示され、前記第２の融合タンパク質は、Ｂ－Ｌｎ－Ｙ、またはＹ－Ｌｎ－Ｂで示される。（式中、Ａは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第１の部分であり、Ｂは、前記細胞内ヌクレオチドに結合するタンパク質の第２の部分であり、前記第１の部分および前記第２の部分は、それぞれ異なるアミノ酸配列を有し、かつ細胞内ヌクレオチドと相互作用し、ＸおよびＹは、前記第１の融合タンパク質、前記第２の融合タンパク質、および前記細胞内ヌクレオチドが、細胞内で会合した場合に、蛍光を発する、発光する物質であり、Ｌは、リンカーであり、ｎは、前記Ｌのアミノ酸数を示し、０～１００である。）以下、前記〔１．ヌクレオチドの可視化方法〕において既に説明した事項については、適宜記載を省略する。
【0037】
本組み合わせは、種々の用途に使用し得るが、好ましくは、細胞の酸化ストレスを測定するために使用される。本発明の一実施形態において、本組み合わせは、細胞の酸化ストレスのバイオマーカーとして使用されてもよい。本組み合わせが、細胞の酸化ストレスの測定に使用される場合、本組み合わせにより可視化されるヌクレオチドは、損傷ヌクレオチドであることが好ましく、ｄＧＯＴＰまたはｄＡＯＴＰであることがより好ましい。
【0038】
細胞の酸化ストレスの測定の詳細については、後述する〔４．酸化ストレスの測定方法〕の項で記載する。
【0039】
（ベクター）
本発明の一実施形態に係るベクター（以下、「本ベクター」と称する。）は、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸、および前記第２の融合タンパク質をコードする核酸を含む。
本発明の一実施形態に係るベクター（以下、「本ベクター」と称する。）は、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸、および前記第２の融合タンパク質をコードする核酸を含む。
【0040】
本ベクターの母体となる基材ベクターとしては、一般的に使用される種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージまたはコスミド等を用いることができ、導入される細胞または導入方法に応じて適宜選択できる。つまり、ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。宿主細胞の種類に応じて、確実に第１の融合タンパク質をコードする遺伝子、および第２のタンパク質をコードする遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。かかる発現ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来ベクター等を利用可能である。
【0041】
また、本ベクターにおいて、前記第１の融合タンパク質をコードする核酸、および前記第２の融合タンパク質をコードする核酸は、適切なプロモーターに作動可能に連結されることが好ましい。使用されるプロモーターは、宿主細胞の種類等に応じて、適宜選択することができる。本ベクターにおいて、第１の融合タンパク質をコードする核酸と、第２の融合タンパク質をコードする核酸は、同一のベクターに導入されていてもよいし、別々のベクターにそれぞれ導入されていてもよい。前記核酸が同一のベクターに導入されている場合、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とが別々に発現するように、これらの核酸配列がＴ２Ａリンカー等の自己切断ペプチドにより結合されていてもよい。
【0042】
本ベクターは、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含むことが好ましい。ベクター構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始ＡＵＧを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含むことになる。
【0043】
本ベクターは、例えば、配列番号３または４の塩基配列を有するｃＤＮＡが挿入された組み換え発現ベクターであってもよい。
【0044】
（形質転換体）
本発明の一実施形態に係る形質転換体（以下、「本形質転換体」と称する。）は、本組み合わせ、または本ベクターを含有する。
本発明の一実施形態に係る形質転換体（以下、「本形質転換体」と称する。）は、本組み合わせ、または本ベクターを含有する。
【0045】
本形質転換体には、細胞・組織・器官のみならず、細菌、酵母、昆虫、植物、真核生物、哺乳動物、原核生物の個体も含まれる。これらの中でも哺乳動物個体が好ましい。哺乳動物としては特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが例示される。
【0046】
本組み合わせ、または本ベクターを対象に導入する方法も特に限定されない。本組み合わせを対象に導入する場合、第１の融合タンパク質、および第２の融合タンパク質を直接細胞に導入してもよい。そのような方法としては例えば、細胞タンパク質導入試薬、膜透過ペプチド、エンベロープ、磁性ナノ粒子を使用する方法等が挙げられる。本ベクターを対象に導入する場合、対象の種類に応じて、適宜プロモーター配列を選択し、各種プラスミドに遺伝子配列を組み込んだベクター等を導入してもよい。ベクターの導入方法も特に限定されず、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション等を適宜使用することができる。
【0047】
（キット）
本発明の一実施形態に係るヌクレオチドの可視化用キット（以下、「本キット」と称する。）は、本組み合わせ、または本ベクターを含有する。
本発明の一実施形態に係るヌクレオチドの可視化用キット（以下、「本キット」と称する。）は、本組み合わせ、または本ベクターを含有する。
【0048】
本キットは、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュ等）を備えた包装物が意図される。本発明のキットは、それに含まれる各材料が独立して存在している形態であってもよく、複数の材料が混在している形態（例えば、組成物の形態）であってもよい。キットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましい。
【0049】
〔４．スクリーニング方法〕
本発明の一実施形態において、抗がん剤の候補物質のスクリーニング方法であって、（Ａ）本形質転換体と、試験物質とを接触させる工程、（Ｂ）本形質転換体における細胞内の蛍光または発光を測定する工程、および（Ｃ）前記試験物質を接触させない場合と比べて、本形質転換体における細胞内の蛍光または発光が高い場合に、前記試験物質が抗がん剤の候補物質であると判定する工程、を含む、スクリーニング方法（以下、「本スクリーニング方法」と称する。）を提供する。本スクリーニング方法によれば、がんに関連しているヌクレオチドの増減が可視化により容易に判定できるため、本スクリーニング方法により、抗がん剤の候補物質を取得できる。以下、前記〔３．組み合わせ〕において既に説明した事項については、適宜記載を省略する。
本発明の一実施形態において、抗がん剤の候補物質のスクリーニング方法であって、（Ａ）本形質転換体と、試験物質とを接触させる工程、（Ｂ）本形質転換体における細胞内の蛍光または発光を測定する工程、および（Ｃ）前記試験物質を接触させない場合と比べて、本形質転換体における細胞内の蛍光または発光が高い場合に、前記試験物質が抗がん剤の候補物質であると判定する工程、を含む、スクリーニング方法（以下、「本スクリーニング方法」と称する。）を提供する。本スクリーニング方法によれば、がんに関連しているヌクレオチドの増減が可視化により容易に判定できるため、本スクリーニング方法により、抗がん剤の候補物質を取得できる。以下、前記〔３．組み合わせ〕において既に説明した事項については、適宜記載を省略する。
【0050】
本スクリーニング方法においては、損傷ヌクレオチドを含む形質転換体（例えば、悪性腫瘍由来細胞（がん細胞））を使用することが好ましい。あるいは、一実施形態として、本スクリーニング方法は、後述する工程（Ａ）の前に、形質転換体中に損傷ヌクレオチドを生じさせる工程（薬剤投与、放射線処理等）を含んでいても良い。
【0051】
（工程（Ａ））
工程（Ａ）は、本形質転換体と、試験物質とを接触させる工程である。試験物質としては、任意の物質が使用され得る。試験物質の種類は特に限定されず、例えば、天然物の抽出物中に存在する化合物、低分子合成化合物、合成ペプチド等が用いられる。本発明の一実施形態において、試験物質は、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリー等に含まれる化合物であってよい。本発明の一実施形態において、試験物質は、好ましくは、低分子化合物であり、より好ましくは、低分子化合物の化合物ライブラリーであり得る。化合物ライブラリーは、市販の化合物ライブラリーを用いてもよく、当該技術分野における通常の方法により構築された化合物ライブラリーを用いてもよい。
工程（Ａ）は、本形質転換体と、試験物質とを接触させる工程である。試験物質としては、任意の物質が使用され得る。試験物質の種類は特に限定されず、例えば、天然物の抽出物中に存在する化合物、低分子合成化合物、合成ペプチド等が用いられる。本発明の一実施形態において、試験物質は、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリー等に含まれる化合物であってよい。本発明の一実施形態において、試験物質は、好ましくは、低分子化合物であり、より好ましくは、低分子化合物の化合物ライブラリーであり得る。化合物ライブラリーは、市販の化合物ライブラリーを用いてもよく、当該技術分野における通常の方法により構築された化合物ライブラリーを用いてもよい。
【0052】
工程（Ａ）において、本形質転換体と試験物質とを接触させる方法は特に限定されず、公知の方法であり得る。例えば、本形質転換体が細胞である場合、細胞が培養されている容器に試験物質を添加する方法等が挙げられる。細胞が培養されている容器への試験物質の添加は、当該容器内の培地に試験物質を直接添加してもよいし、培地等の溶液に溶解させた試験物質を容器に添加することにより行ってもよい。本形質転換体に接触させる試験物質の量は、試験物質の種類に応じて適宜設定することができる。
【0053】
（工程（Ｂ））
工程（Ｂ）は、試験物質と接触した本形質転換体の蛍光または発光を測定する工程である。蛍光または発光の測定は、公知の方法が適用でき、特に限定されないが、例えば、蛍光輝点の数の計測、蛍光スペクトルの測定、蛍光強度の測定等によって行うことができる。発光の測定も公知の方法が適用でき、特に限定されないが、例えば、発光輝点の数の計測、発光スペクトルの測定、発光強度の測定等によって行うことができる。
工程（Ｂ）は、試験物質と接触した本形質転換体の蛍光または発光を測定する工程である。蛍光または発光の測定は、公知の方法が適用でき、特に限定されないが、例えば、蛍光輝点の数の計測、蛍光スペクトルの測定、蛍光強度の測定等によって行うことができる。発光の測定も公知の方法が適用でき、特に限定されないが、例えば、発光輝点の数の計測、発光スペクトルの測定、発光強度の測定等によって行うことができる。
【0054】
蛍光輝点または発光輝点の数の計測は、市販の蛍光検出装置を用いて行うことができる。蛍光検出装置としては、例えば、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナ、ＣＣＤカメラタイプイメージャー、ＩＮＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）等のイメージングサイトメーター、マイクロタイタープレートリーダー（蛍光プレートリーダー）、フローサイトメータ等の検出装置を用いることができる。
【0055】
また、得られた画像を画像解析プログラムにより処理することによっても、蛍光輝点を検出することができる。なお、蛍光輝点の検出において、検出する蛍光輝点の特性（蛍光輝点が発する蛍光の波長、強度等）、並びに用いる装置及びプログラム等に合わせて、フィルター、検出器、各種パラメーター等の選択、設定は、当業者であれば適宜行うことができる。
【0056】
（工程（Ｃ））
工程（Ｃ）は、前記試験物質を接触させない場合と比べて、本形質転換体における細胞内の蛍光または発光が高い場合に、前記試験物質が抗がん剤の候補物質であると判定する工程である。
工程（Ｃ）は、前記試験物質を接触させない場合と比べて、本形質転換体における細胞内の蛍光または発光が高い場合に、前記試験物質が抗がん剤の候補物質であると判定する工程である。
【0057】
工程（Ｃ）において、前記蛍光または発光の判定基準としては、例えば、本形質転換体の蛍光輝点の数が、前記試験物質を接触させない場合と比べて、１０％以上多い場合に、本形質転換体内の蛍光または発光が高いとすることができる。また、別の態様として、本形質転換体の蛍光スペクトルのピークが、前記試験物質を接触させない場合と比べて、１０％以上高い場合に、本形質転換体内の蛍光が高いとすることができる。
【0058】
（その他）
また、別の一実施形態として、本スクリーニング方法は、抗酸化剤の候補物質のスクリーニング方法として実施することもできる。
また、別の一実施形態として、本スクリーニング方法は、抗酸化剤の候補物質のスクリーニング方法として実施することもできる。
【0059】
〔５．酸化ストレスの測定方法〕
本発明の一実施形態において、本組み合わせ、または本ベクターを導入した細胞を用いて、当該細胞内の蛍光または発光を指標とすることにより、細胞の酸化ストレスを測定する方法（以下、「本測定方法」と称する。）を提供する。上述の通り、本組み合わせ、および本ベクターはヌクレオチドの可視化を可能とするため、本測定方法によれば、細胞を破砕することなく、生細胞の酸化ストレスをモニターすることができる。以下、前記〔４．スクリーニング方法〕において既に説明した事項については、適宜記載を省略する。
本発明の一実施形態において、本組み合わせ、または本ベクターを導入した細胞を用いて、当該細胞内の蛍光または発光を指標とすることにより、細胞の酸化ストレスを測定する方法（以下、「本測定方法」と称する。）を提供する。上述の通り、本組み合わせ、および本ベクターはヌクレオチドの可視化を可能とするため、本測定方法によれば、細胞を破砕することなく、生細胞の酸化ストレスをモニターすることができる。以下、前記〔４．スクリーニング方法〕において既に説明した事項については、適宜記載を省略する。
【0060】
本測定方法において、「蛍光または発光を指標とする」とは、本組み合わせ、または本ベクターを導入した細胞における蛍光または発光に基づいて、細胞の酸化ストレスを評価することを意味する。
【0061】
本発明の一実施形態において、本測定方法は、以下の工程の一つまたはそれ以上を含み得る：
（１）本組み合わせ、または本ベクターを細胞に導入する工程、
（２）前記工程（１）で得られた細胞を特定の条件に曝す工程、
（３）前記工程（２）後の細胞の蛍光または発光を測定する工程、
（４）前記工程（３）で測定した蛍光または発光に基づいて、細胞の酸化ストレスを評価する工程。
（１）本組み合わせ、または本ベクターを細胞に導入する工程、
（２）前記工程（１）で得られた細胞を特定の条件に曝す工程、
（３）前記工程（２）後の細胞の蛍光または発光を測定する工程、
（４）前記工程（３）で測定した蛍光または発光に基づいて、細胞の酸化ストレスを評価する工程。
【0062】
工程（２）を実施する方法としては、例えば臭素酸カリウム（ＫＢｒＯ３）処理、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）処理等が挙げられる。
【0063】
工程（３）における細胞の蛍光または発光の測定は、例えば蛍光または発光スペクトルの測定、蛍光または発光輝点の数の計測、蛍光または発光強度の測定等によって行うことができる。また、蛍光または発光強度の測定は、他の細胞に対する細胞の蛍光または発光強度の相対値により測定してもよいし、細胞の蛍光または発光強度に基づく絶対値により測定してもよい。
【0064】
工程（４）における蛍光または発光に基づく酸化ストレスの判定基準としては、例えば、同じ培地条件で培養した２種類の細胞の蛍光または発光強度を比較した場合、蛍光または発光強度の相対的な値が大きいほど、細胞の酸化ストレスも大きいと判定できる。また別の例としては、酸化ストレスを測定される細胞において、蛍光または発光強度を経時的に測定し、測定された蛍光または発光強度の絶対値が大きい程、細胞の酸化ストレスも大きいと判定できる。
【0065】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例0066】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0067】
〔培地〕
各実施例において、細胞の培養に使用した培地の組成は、以下の通りである。
各実施例において、細胞の培養に使用した培地の組成は、以下の通りである。
【0068】
（ＭＥＭ）
５００ｍＬのイーグル最少必須培地（ＳＩＧＭＡ社製、Ｍ４５２６－５００ＭＬ）に、５０ｍＬのウシ胎児血清（ＣＣＢ社製、コード１７１０１２）、５ｍＬの２００ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社製、コード２５０３０－０８１）を加えたものを、培地として使用した。
５００ｍＬのイーグル最少必須培地（ＳＩＧＭＡ社製、Ｍ４５２６－５００ＭＬ）に、５０ｍＬのウシ胎児血清（ＣＣＢ社製、コード１７１０１２）、５ｍＬの２００ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社製、コード２５０３０－０８１）を加えたものを、培地として使用した。
【0069】
（ＤＭＥＭ（－，＋））
８６．４ｍＬのダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」２（日水製薬株式会社製、０５９１９）に、１．８ｍＬの濾過滅菌した０．０３ｇ／ｍＬ Ｌ－グルタミン（富士フィルム和光純薬製、０７４－００５２２）、１．８ｍＬの濾過滅菌した０．０８ｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム（富士フィルム和光純薬製、１９１－０１３０５）、１０ｍＬの非働化ウシ胎児血清（ｂｉｏＳｅｒａ社製、ＦＢ－１２８５１５００）を加えたものを、培地として使用した。
８６．４ｍＬのダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」２（日水製薬株式会社製、０５９１９）に、１．８ｍＬの濾過滅菌した０．０３ｇ／ｍＬ Ｌ－グルタミン（富士フィルム和光純薬製、０７４－００５２２）、１．８ｍＬの濾過滅菌した０．０８ｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム（富士フィルム和光純薬製、１９１－０１３０５）、１０ｍＬの非働化ウシ胎児血清（ｂｉｏＳｅｒａ社製、ＦＢ－１２８５１５００）を加えたものを、培地として使用した。
【0070】
（ＤＭＥＭ（－，－））
８６．４ｍＬのダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」２（日水製薬株式会社製、Ｃｏｄｅ０５９１９）に、１．８ｍＬの濾過滅菌した０．０３ｇ／ｍＬ Ｌ－グルタミン（富士フィルム和光純薬製、０７４－００５２２）、１．８ｍＬの濾過滅菌した０．０８ｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム（富士フィルム和光純薬製、１９１－０１３０５）を加えたものを、培地として使用した。
８６．４ｍＬのダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」２（日水製薬株式会社製、Ｃｏｄｅ０５９１９）に、１．８ｍＬの濾過滅菌した０．０３ｇ／ｍＬ Ｌ－グルタミン（富士フィルム和光純薬製、０７４－００５２２）、１．８ｍＬの濾過滅菌した０．０８ｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム（富士フィルム和光純薬製、１９１－０１３０５）を加えたものを、培地として使用した。
【0071】
（ＤＭＥＭ（－，＋）、ピルビン酸不含）
８６．４ｍＬのダルベッコ改変イーグル培地－低グルコース（ピルビン酸不含、SIGMA-Aldrich社製、Ｄ５９２１－５００ＭＬ）に、１．８ｍＬの濾過滅菌した０．０３ｇ／ｍＬ Ｌ－グルタミン（富士フィルム和光純薬製、０７４－００５２２）、１．８ｍＬの濾過滅菌した０．０８ｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム（富士フィルム和光純薬製、１９１－０１３０５）、１０ｍＬの非働化ウシ胎児血清（ｂｉｏＳｅｒａ社製、ＦＢ－１２８５１５００）を加えたものを、培地として使用した。
８６．４ｍＬのダルベッコ改変イーグル培地－低グルコース（ピルビン酸不含、SIGMA-Aldrich社製、Ｄ５９２１－５００ＭＬ）に、１．８ｍＬの濾過滅菌した０．０３ｇ／ｍＬ Ｌ－グルタミン（富士フィルム和光純薬製、０７４－００５２２）、１．８ｍＬの濾過滅菌した０．０８ｇ／ｍＬ炭酸水素ナトリウム（富士フィルム和光純薬製、１９１－０１３０５）、１０ｍＬの非働化ウシ胎児血清（ｂｉｏＳｅｒａ社製、ＦＢ－１２８５１５００）を加えたものを、培地として使用した。
【0072】
〔実施例１：Ｕ２ＯＳ細胞でのｄＧＯＴＰ検出〕
ｄＧＯＴＰの検出には、２種類のタンパク質が結合することにより発せられる蛍光が、輝点（ｐｕｎｃｔｕｍ）として観察可能なＦｌｕｏｐｐｉシステムを用いた。蛍光を発するための２種類のタンパク質としては、ｈＡＧ（塩基配列：配列番号２、アミノ酸配列：配列番号１１）およびＡｓｈ（塩基配列：配列番号１、アミノ酸配列：配列番号１０）を使用した。ｄＧＯＴＰを特異的に分解する、大腸菌由来のＭｕｔＴタンパク質（塩基配列：配列番号７、アミノ酸配列：配列番号１６）を９５番目と９６番目のアミノ酸の間の位置で分割し、それぞれｎＭｕｔＴ（配列番号１７）、ｃＭｕｔＴ（配列番号１８）とした。なお、ｎＭｕｔＴについてはｄＧＯＴＰの加水分解反応を触媒するアミノ酸残基である、Ｇｌｕ－５３をＡｌａ－５３に置換しており、結合能は維持したまま分解能のみを抑制している。
ｄＧＯＴＰの検出には、２種類のタンパク質が結合することにより発せられる蛍光が、輝点（ｐｕｎｃｔｕｍ）として観察可能なＦｌｕｏｐｐｉシステムを用いた。蛍光を発するための２種類のタンパク質としては、ｈＡＧ（塩基配列：配列番号２、アミノ酸配列：配列番号１１）およびＡｓｈ（塩基配列：配列番号１、アミノ酸配列：配列番号１０）を使用した。ｄＧＯＴＰを特異的に分解する、大腸菌由来のＭｕｔＴタンパク質（塩基配列：配列番号７、アミノ酸配列：配列番号１６）を９５番目と９６番目のアミノ酸の間の位置で分割し、それぞれｎＭｕｔＴ（配列番号１７）、ｃＭｕｔＴ（配列番号１８）とした。なお、ｎＭｕｔＴについてはｄＧＯＴＰの加水分解反応を触媒するアミノ酸残基である、Ｇｌｕ－５３をＡｌａ－５３に置換しており、結合能は維持したまま分解能のみを抑制している。
【0073】
それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を、グリシン－セリンリンカーにより組み合わせたベクタープラスミドであるＡｓｈ－ｎＭｕｔＴ（配列番号３）およびｈＡＧ－ｃＭｕｔＴ（配列番号４）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用いて導入し、５時間後に培地を交換した。培養開始から２４時間後、７，８－ジヒドロ－８－オクソ－２’－デオキシグアノシン（ｄＧＯ）を、１０μＭ、１００μＭ添加した培地に移し替え、さらに４８時間培養した。ｄＧＯは細胞内でリン酸化され、ｄＧＯＴＰになる成分である。また、対照となるヒトＵ２ＯＳ細胞は、ｄＧＯを添加していない培地で４８時間培養した後、１００μＭのｄＧＯを含む培地で５分間処理した。培養、および処理が完了した後、培地を除去し、４％パラホルムアルデヒド（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で固定した（４℃、終夜処理）。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２により核染色を行った。ｄＧＯを１００μＭ添加した培地で培養したＵ２ＯＳ細胞と、対照となる細胞の、蛍光顕微鏡による観察結果を図１に示す。また、細胞質ごとの蛍光輝点数の合計値を表１に示す。
【0074】
【表1】
【0075】
図１および表１より、ｄＧＯの濃度依存的に蛍光輝点が確認できた。したがって、上述したＡｓｈ－ｎＭｕｔＴおよびｈＡＧ－ｃＭｕｔＴを使用することによって、細胞内のヌクレオチドであるｄＧＯＴＰを特異的に検出できることが示された。また、対象となるヌクレオチドが存在せず、Ａｓｈ－ｎＭｕｔＴおよびｈＡＧ－ｃＭｕｔＴのみの場合は、蛍光輝点は観察できないことが示された。
【0076】
なお、実施例では観察を容易にする観点からパラホルムアルデヒドにより細胞を固定しているが、観察対象として生細胞を用いた場合も、同様の結果が得られる。
【0077】
〔実施例２：ｓＭｕｔＴ細胞でのｄＧＯＴＰ検出〕
ヒトＵ２ＯＳ細胞に対して、Ａｓｈ－ｎＭｕｔＴおよびｈＡＧ－ｃＭｕｔＴの配列をＴ２Ａリンカー（塩基配列：配列番号５、アミノ酸配列：配列番号１４）配列で結合した遺伝子（塩基配列：配列番号６、アミノ酸配列：配列番号１５）を導入した細胞をｓＭｕｔＴ細胞とした。ｓＭｕｔＴ細胞において、Ｔ２Ａリンカーの作用により、Ａｓｈ－ｎＭｕｔＴとｈＡＧ－ｃＭｕｔＴとは、それぞれ別々にタンパク質を生成する。
ヒトＵ２ＯＳ細胞に対して、Ａｓｈ－ｎＭｕｔＴおよびｈＡＧ－ｃＭｕｔＴの配列をＴ２Ａリンカー（塩基配列：配列番号５、アミノ酸配列：配列番号１４）配列で結合した遺伝子（塩基配列：配列番号６、アミノ酸配列：配列番号１５）を導入した細胞をｓＭｕｔＴ細胞とした。ｓＭｕｔＴ細胞において、Ｔ２Ａリンカーの作用により、Ａｓｈ－ｎＭｕｔＴとｈＡＧ－ｃＭｕｔＴとは、それぞれ別々にタンパク質を生成する。
【0078】
（実施例２－試験１）
ｓＭｕｔＴ細胞（１．０×１０４細胞）をＤＭＥＭ（－，＋）培地にて４８時間培養した後、５０μＭのｄＧＯで３０分処理した。処理後、培地を除去し、４％パラホルムアルデヒド（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で、４℃、終夜、固定した。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２により核染色を行った。対照として、ｄＧＯを２’－デオキシグアノシン（ｄＧ）に変えたこと以外は同様の処理を行い、蛍光輝点を観察した。結果を図２および図３に示す。
ｓＭｕｔＴ細胞（１．０×１０４細胞）をＤＭＥＭ（－，＋）培地にて４８時間培養した後、５０μＭのｄＧＯで３０分処理した。処理後、培地を除去し、４％パラホルムアルデヒド（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で、４℃、終夜、固定した。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２により核染色を行った。対照として、ｄＧＯを２’－デオキシグアノシン（ｄＧ）に変えたこと以外は同様の処理を行い、蛍光輝点を観察した。結果を図２および図３に示す。
【0079】
図２は、核染色の結果を蛍光顕微鏡により観察した観察像である。また、図３は細胞質内の蛍光輝点の数を、蛍光顕微鏡を使用して数えた結果を示すグラフである。図２および３より、ｄＧＯで処理した細胞は、対照に比べて、有意に多くの蛍光輝点を有していた。したがって、ｓＭｕｔＴ細胞内でも、ヌクレオチドであるｄＧＯＴＰを特異的に検出可能であることが示された。
【0080】
（実施例２－試験２）
ｓＭｕｔＴ細胞において、ｄＧＯＴＰを特異的に分解する酵素のＭＴＨ１を、ｓｉＲＮＡ（センス鎖：配列番号８、アンチセンス鎖：配列番号９）によりノックダウンした後、実施例２－試験１と同様の試験を行った。対照として、ｓｉＲＮＡの代わりにｓｉ－Ｃｔｒｌ（Stealth RNAi（商標）、siRNA Negative Control Med GC Duplex、Thermo Fisher Scientific製）を使用して、ＭＴＨ１のノックダウンを行っていない細胞を作製した後、同様の試験を行った。結果を図４および図５に示す。
ｓＭｕｔＴ細胞において、ｄＧＯＴＰを特異的に分解する酵素のＭＴＨ１を、ｓｉＲＮＡ（センス鎖：配列番号８、アンチセンス鎖：配列番号９）によりノックダウンした後、実施例２－試験１と同様の試験を行った。対照として、ｓｉＲＮＡの代わりにｓｉ－Ｃｔｒｌ（Stealth RNAi（商標）、siRNA Negative Control Med GC Duplex、Thermo Fisher Scientific製）を使用して、ＭＴＨ１のノックダウンを行っていない細胞を作製した後、同様の試験を行った。結果を図４および図５に示す。
【0081】
図４は、核染色の結果を蛍光顕微鏡により観察した観察像である。また、図５は細胞質内の蛍光輝点の数を、蛍光顕微鏡を使用して数えた結果を示すグラフである。図４、５より、ＭＴＨ１をノックダウンした細胞は、そうでない細胞よりも多くの蛍光輝点が観察された。したがって、蛍光輝点として可視化されているのはｄＧＯＴＰであることが分かった。
【0082】
〔実施例３：ｄＧＯＴＰ導入細胞におけるｄＧＯＴＰ検出〕
（実施例３－試験１）
ｓＭｕｔＴ細胞（１．０×１０４細胞）をＤＭＥＭ（－，＋）培地にて４８時間培養した後、２ｍＭのｄＧＯＴＰを含むＫＨ緩衝液（３０ｍＭ ＫＣｌ,１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ,ｐＨ７．４）で３７℃、１５分処理することによりｄＧＯＴＰを強制的に浸透圧シフト法により導入した。また、対照として、同じ方法により、ｄＧＴＰを導入した。その後、実施例２－試験１と同様の処理を行い、蛍光輝点を観察した。結果を図６および図７に示す。
（実施例３－試験１）
ｓＭｕｔＴ細胞（１．０×１０４細胞）をＤＭＥＭ（－，＋）培地にて４８時間培養した後、２ｍＭのｄＧＯＴＰを含むＫＨ緩衝液（３０ｍＭ ＫＣｌ,１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ,ｐＨ７．４）で３７℃、１５分処理することによりｄＧＯＴＰを強制的に浸透圧シフト法により導入した。また、対照として、同じ方法により、ｄＧＴＰを導入した。その後、実施例２－試験１と同様の処理を行い、蛍光輝点を観察した。結果を図６および図７に示す。
【0083】
図６は核染色の結果を蛍光顕微鏡により観察した観察像である。図７は細胞質内の蛍光輝点の数を、蛍光顕微鏡を使用して数えた結果を示すグラフである。図６および図７より、ｄＧＯＴＰを導入した細胞は、ｄＧＴＰを導入した細胞よりも多くの蛍光輝点が観察された。したがって、図６において蛍光輝点として可視化されているのはｄＧＯＴＰであることが分かった。
【0084】
（実施例３－試験２）
ｓＭｕｔＴ細胞において、ｄＧＯＴＰの分解酵素であるＭＴＨ１を、ｓｉＲＮＡによりノックダウンした細胞（ｓｉ－ＭＴＨ１）を作製して、実施例２－試験１と同様の試験を行った。対照として、ノックダウンを行っていない細胞（ｓｉ－Ｃｔｒｌ）についても同様の試験を行った。結果を図８および図９に示す。
ｓＭｕｔＴ細胞において、ｄＧＯＴＰの分解酵素であるＭＴＨ１を、ｓｉＲＮＡによりノックダウンした細胞（ｓｉ－ＭＴＨ１）を作製して、実施例２－試験１と同様の試験を行った。対照として、ノックダウンを行っていない細胞（ｓｉ－Ｃｔｒｌ）についても同様の試験を行った。結果を図８および図９に示す。
【0085】
図８は核染色の結果を蛍光顕微鏡により観察した観察像である。図９は細胞質内の蛍光輝点の数を、蛍光顕微鏡を使用して数えた結果を示すグラフである。図８および図９より、ｄＧＯＴＰを導入した細胞は、ｄＧＴＰを導入した細胞よりも多くの蛍光輝点が観察され、ＭＴＨ１をノックダウンした細胞は、さらに蛍光輝点が多かった。したがって、図８において蛍光輝点として可視化されているのはｄＧＯＴＰであることが分かった。
【0086】
〔実施例４：阻害剤を使用した場合のｄＧＯＴＰ検出〕
ｓＭｕｔＴ細胞（５．０×１０３）を一晩培養し、ＤＭＥＭ（－，－）培地にて５日間培養した後、ＭＴＨ１に対する阻害剤である１００μＭのＴＨ２８７、または５μＭの(Ｓ)－クリゾチニブで６時間処理した。対照として、ＤＭＳＯにて処理したｓＭｕｔＴ細胞を作製した。処理後に使用した成分を取り除いた。その後、実施例１と同様の処理を行い、蛍光輝点を観察した。結果を図１０および図１１に示す。
ｓＭｕｔＴ細胞（５．０×１０３）を一晩培養し、ＤＭＥＭ（－，－）培地にて５日間培養した後、ＭＴＨ１に対する阻害剤である１００μＭのＴＨ２８７、または５μＭの(Ｓ)－クリゾチニブで６時間処理した。対照として、ＤＭＳＯにて処理したｓＭｕｔＴ細胞を作製した。処理後に使用した成分を取り除いた。その後、実施例１と同様の処理を行い、蛍光輝点を観察した。結果を図１０および図１１に示す。
【0087】
図１０は核染色の結果を蛍光顕微鏡により観察した観察像である。図１１は細胞質内の蛍光輝点の数を、蛍光顕微鏡を使用して数えた結果を示すグラフである。図１０および図１１より、ＭＴＨ１に対する阻害剤を導入した細胞は、ＤＭＳＯによる処理のみを行った細胞よりも多くの輝点が観察された。したがって、図１０において蛍光輝点として可視化されているのはｄＧＯＴＰであることが分かった。
【0088】
〔実施例５：酸化剤を使用した場合のｄＧＯＴＰ検出〕
ｓＭｕｔＴ細胞（２．０×１０４細胞）を一晩培養し、ＤＭＥＭ（－，＋）、ピルビン酸不含培地に交換した。ピルビン酸不含培地で酸化剤を希釈し、３ｍＭの臭素酸カリウムで６時間処理した。対照として、滅菌水にて処理したｓＭｕｔＴ細胞を作製した。処理後、培地を除去し、実施例１と同様の処理を行い、蛍光輝点を観察した。結果を図１２および図１３に示す。
ｓＭｕｔＴ細胞（２．０×１０４細胞）を一晩培養し、ＤＭＥＭ（－，＋）、ピルビン酸不含培地に交換した。ピルビン酸不含培地で酸化剤を希釈し、３ｍＭの臭素酸カリウムで６時間処理した。対照として、滅菌水にて処理したｓＭｕｔＴ細胞を作製した。処理後、培地を除去し、実施例１と同様の処理を行い、蛍光輝点を観察した。結果を図１２および図１３に示す。
【0089】
図１２は核染色の結果を蛍光顕微鏡により観察した観察像である。図１３は細胞質内の蛍光輝点の数を、蛍光顕微鏡を使用して数えた結果を示すグラフである。図１２および図１３より、対照の滅菌水処理を行った細胞と比較して、臭素酸カリウム処理を行った細胞では有意に多くの蛍光輝点が観察された。
【0090】
〔結果〕
以上より、本発明の一実施形態に係るヌクレオチドの可視化方法であれば、細胞（とりわけ、生細胞）内のヌクレオチドを可視化できることが示された。
以上より、本発明の一実施形態に係るヌクレオチドの可視化方法であれば、細胞（とりわけ、生細胞）内のヌクレオチドを可視化できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【0091】
本発明は、細胞（とりわけ、生細胞）内のヌクレオチドを検出できるため、バイオマーカー、治療薬のスクリーニング方法、細胞の酸化ストレス測定方法等に、好適に利用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】