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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024171973
(43)【公開日】2024-12-12
(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルス結合性タンパク質の精製方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/705 20060101AFI20241205BHJP
C07K 1/14 20060101ALI20241205BHJP
C07K 1/18 20060101ALI20241205BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20241205BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20241205BHJP
【ＦＩ】
C07K14/705 ZNA
C07K1/14
C07K1/18
C12P21/02 C
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023089360
(22)【出願日】2023-05-31
(71)【出願人】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】大江 正剛
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE02
4B064CE03
4B064CE11
4B064DA13
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA50
4H045EA60
4H045EA65
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主の培養物から、当該タンパク質を高収量かつ高純度に精製可能な方法を提供すること。
【解決の手段】 前記培養物中に含まれる遺伝子組換え宿主を溶解させる工程と得られた溶解液に終濃度０．０８％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下のポリエチレンイミンを添加する工程とポリエチレンイミン添加で生じた沈殿物を除去しＡＡＶ結合性タンパク質を含む抽出液を取得する工程とを含む方法で前記宿主が発現したＡＡＶ結合性タンパク質を抽出した後、前記抽出液中に含まれる前記タンパク質を回収することで、前記課題を解決する。
【選択図】 なし
【解決の手段】 前記培養物中に含まれる遺伝子組換え宿主を溶解させる工程と得られた溶解液に終濃度０．０８％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下のポリエチレンイミンを添加する工程とポリエチレンイミン添加で生じた沈殿物を除去しＡＡＶ結合性タンパク質を含む抽出液を取得する工程とを含む方法で前記宿主が発現したＡＡＶ結合性タンパク質を抽出した後、前記抽出液中に含まれる前記タンパク質を回収することで、前記課題を解決する。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主の培養物中に含まれる当該宿主が発現した前記タンパク質の抽出工程と、得られた抽出液中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質の回収工程とを含む、ＡＡＶ結合性タンパク質の精製方法であって、
抽出工程が以下の（１）から（３）に示す工程を少なくとも含む、前記精製方法；
（１）前記培養物中に含まれる遺伝子組換え宿主を溶解させる工程
（２）得られた溶解液に終濃度０．０８％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下のポリエチレンイミンを添加する工程
（３）ポリエチレンイミン添加で生じた沈殿物を除去し、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む抽出液を取得する工程。
抽出工程が以下の（１）から（３）に示す工程を少なくとも含む、前記精製方法；
（１）前記培養物中に含まれる遺伝子組換え宿主を溶解させる工程
（２）得られた溶解液に終濃度０．０８％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下のポリエチレンイミンを添加する工程
（３）ポリエチレンイミン添加で生じた沈殿物を除去し、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む抽出液を取得する工程。
【請求項2】
回収工程が、イオン交換クロマトグラフィ用担体に抽出液をアプライする工程と、前記担体から溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収する工程とを少なくとも含む、請求項１に記載の精製方法。
【請求項3】
宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１に記載の精製方法。
【請求項4】
ＡＡＶ結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、請求項１から３のいずれかに記載の精製方法；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質の精製方法に関する。特に本発明は、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主の培養物から、当該タンパク質を工業的に製造するのに適した精製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に分類される非エンベロープウイルスである。ＡＡＶ外殻粒子は３種類のタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）で構成されており、約６０のタンパク質分子がおよそＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３＝１：１：１０の比率で混在し集合することで、直径２０ｎｍから３０ｎｍの正二十面体の形状をしている。
【0003】
ＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞などの分化を終えた非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること、などから、先天性遺伝子疾患の治療を目的とした遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が注目されている。
【0004】
ＡＡＶを簡便かつ高純度に精製する方法として、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＡＶへの結合活性を有したタンパク質）とを含むＡＡＶ吸着剤を用いたアフィニティクロマトグラフィで精製する方法が知られている（特許文献１）。前記方法でＡＡＶを大量精製するには、ＡＡＶ吸着剤のリガンドであるＡＡＶ結合性タンパク質を高純度かつ大量に製造する必要がある。
【0005】
ＡＡＶ結合性タンパク質を遺伝子組換え技術を利用して製造する場合、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主を作製し、当該宿主を培養することで前記タンパク質を発現させた後、得られた培養物中に含まれる前記タンパク質を抽出し精製することで製造するが、精製収量と純度のさらなる向上が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】ＷＯ２０２１／１０６８８２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の課題は、アデノ随伴ウイルス結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主の培養物から、当該タンパク質を高収量かつ高純度に精製可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは鋭意検討した結果、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主の培養物に含まれる前記宿主を溶解させた後、適切な添加物を添加し、当該添加で生じた沈殿物を除去した抽出液から前記タンパク質を回収することで、ＡＡＶ結合性タンパク質を高収量、高純度かつ大量に精製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する：
［１］アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主の培養物中に含まれる当該宿主が発現した前記タンパク質の抽出工程と、
得られた抽出液中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質の回収工程とを含む、
ＡＡＶ結合性タンパク質の精製方法であって、
抽出工程が以下の（１）から（３）に示す工程を少なくとも含む、前記精製方法；
（１）前記培養物中に含まれる遺伝子組換え宿主を溶解させる工程
（２）得られた溶解液に終濃度０．０８％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下のポリエチレンイミンを添加する工程
（３）ポリエチレンイミン添加で生じた沈殿物を除去し、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む抽出液を取得する工程。
［１］アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主の培養物中に含まれる当該宿主が発現した前記タンパク質の抽出工程と、
得られた抽出液中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質の回収工程とを含む、
ＡＡＶ結合性タンパク質の精製方法であって、
抽出工程が以下の（１）から（３）に示す工程を少なくとも含む、前記精製方法；
（１）前記培養物中に含まれる遺伝子組換え宿主を溶解させる工程
（２）得られた溶解液に終濃度０．０８％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下のポリエチレンイミンを添加する工程
（３）ポリエチレンイミン添加で生じた沈殿物を除去し、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む抽出液を取得する工程。
【0010】
［２］回収工程が、イオン交換クロマトグラフィ用担体に抽出液をアプライする工程と、前記担体から溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収する工程とを少なくとも含む、前記［１］に記載の精製方法。
【0011】
［３］宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、前記［１］または［２］に記載の精製方法。
【0012】
［４］ＡＡＶ結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、前記［１］から［３］のいずれかに記載の精製方法；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【発明の効果】
【0013】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主の培養物中に含まれる当該宿主が発現した前記タンパク質を抽出し、得られた抽出液中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質を回収することで、前記タンパク質を精製する方法において、前記抽出を、前記培養物中に含まれる遺伝子組換え宿主を溶解させる工程と、得られた溶解液に終濃度０．０８％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下のポリエチレンイミンを添加する工程と、ポリエチレンイミン添加で生じた沈殿物を除去し、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む抽出液を取得する工程とを少なくとも含む方法で行なうことを特徴としており、前記タンパク質を高収量かつ高純度に精製できる。したがって、当該宿主を用いたＡＡＶ結合性タンパク質の製造方法に、本発明の精製方法を組み込むことで、高純度な前記タンパク質を工業的に大量製造できる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＡＡＶ結合性タンパク質発現大腸菌溶解液に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を未添加、または終濃度で０．０５％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）もしくは０．３％（ｗ／ｖ）添加し、当該添加で生じた沈殿物を除去した上清のキャピラリー電気泳動結果を示す図である。黒矢印で示すピークが、ＡＡＶ結合性タンパク質に相当するピーク、白抜き矢印で示すピークが、内部標準に相当するピークである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下に、本発明について詳細に説明する。
【0016】
本明細書において、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主は、例えば、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドで宿主を形質転換することで取得できる。前記宿主は、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な限り、特に限定はなく、例えば、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞に代表される動物細胞、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に代表されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌やパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）、コリネ菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に代表されるコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に代表される酵母、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に代表される糸状菌が例示できる。中でも、取扱いが簡便かつ高密度に培養可能な大腸菌を前記宿主とすると好ましい。なお宿主が大腸菌の場合は、一例として、ＷＯ２０２１／１０６８８２号に開示した方法により培養することで前記タンパク質を発現させることができるが、大腸菌が増殖しＡＡＶ結合性タンパク質を発現させることができれば、特に発現ベクターや大腸菌の種類、培養方法に限定はない。
【0017】
本発明において、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主の培養物から前記タンパク質を抽出するには、まず前記培養物に含まれる前記宿主を溶解し、前記タンパク質を含む溶解液を取得する必要がある。前記宿主の溶解は、例えば、培養液を遠心分離して得られる宿主細胞を適切な緩衝液で懸濁後、物理的および／または化学的に宿主を溶解することで、ペリプラズムを含む前記宿主の細胞内に発現したタンパク質を含む溶解液を得ればよい。なお宿主細胞を化学的に溶解させる場合、例えば、後述する実施例に記載の方法や、特開２０１３－２５２０９９号公報に開示した方法を用いてもよく、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク社製）等の市販の試薬を用いてもよい。
【0018】
本発明は、前述した方法で宿主を溶解させた液（以下、単に「溶解液」とも表記する）に終濃度０．０８％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を添加する工程と、当該添加で生じた沈殿を除去する工程とを少なくとも含む方法でＡＡＶ結合性タンパク質を精製することを特徴としている。
【0019】
本発明者は、宿主を溶解してＡＡＶ結合性タンパク質を抽出する必要がある場合、前記溶解液には、前記宿主由来の核酸などの不純物が大量に含まれており、当該不純物はＡＡＶ結合性タンパク質の精製効率および純度に影響を及ぼすのではと考えた。そこで、クロマトグラフィによる精製など後続の精製を行なう前に、前記溶解液中に含まれる核酸などを除去するためにポリエチレンイミンで処理することで、ＡＡＶ結合性タンパク質を高収量かつ高純度で精製できるのではと考え、検討した。
【0020】
溶解液に添加するＰＥＩは、液状かつ溶解液に添加した際に溶解する性状のものであれば特に限定はなく、例えば平均分子量４００以上２０万以下の直鎖または枝状のＰＥＩがあげられる。宿主溶解液へのＰＥＩ添加濃度は、具体的には、終濃度で０．０８％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下であれば高収量かつ高純度にＡＡＶ結合性タンパク質を精製でき、０．１０％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下にすると、さらに高収量かつ高純度にＡＡＶ結合性タンパク質を精製できる点でより好ましい。またＰＥＩ添加の際は、撹拌操作と同時に行なうと好ましい。撹拌時間としては、例えば、２４時間以下が好ましい。ＰＥＩ添加より生じた沈殿物は、例えば、膜ろ過や遠心分離により除去することで、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む抽出液を取得できる。
【0021】
前述した方法でＡＡＶ結合性タンパク質を含む抽出液を取得した後は、当該抽出液からＡＡＶ結合性タンパク質を回収し、精製する。高純度なＡＡＶ結合性タンパク質を回収する方法の好ましい一例として、クロマトグラフィ用担体に前記抽出液をアプライする工程と、前記担体から溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収する工程とを少なくとも含む方法があげられる。前記クロマトグラフィ用担体は、ＡＡＶ結合性タンパク質の純度が向上できる担体であれば特に限定はないが、イオン交換クロマトグラフィ用担体（陰イオン交換クロマトグラフィ用担体、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体）、疎水性相互作用クロマトグラフィ用担体、ゲルろ過クロマトグラフィ用担体、複数の分離モードを持つミックスモードクロマトグラフィ用担体などがあげられる。中でもＡＡＶ結合タンパク質が効率良く安定に回収できる点で、イオン交換クロマトグラフィ用担体をクロマトグラフィ用担体として用いると好ましい。
【0022】
クロマトグラフィ用担体の基材となる不溶性担体は、前述したＡＡＶ結合性タンパク質を含む抽出液や精製に用いる溶液（溶出液、平衡化液、洗浄液など）に対して不溶性であれば特に限定はなく、一例として、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体があげられる。
【0023】
陰イオン交換クロマトグラフィ用担体は、前述した不溶性担体と当該担体に固定化した陰イオン交換基とを含む担体であれば特に限定はない。陰イオン交換基の一例として、タンパク質精製の分野で通常用いられる、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、四級アンモニウム（Ｑ）基、一級アミノ基があげられる。またＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＤＥＡＥ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＱＡＥ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＮＨ２－７５０（以上、東ソー社製）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（サイティバ社製）といった市販の陰イオン交換クロマトグラフィ用担体をそのまま用いてもよい。
【0024】
陽イオン交換クロマトグラフィ用担体も、前述した不溶性担体と当該担体に固定化した陽イオン交換基とを含む担体であれば特に限定はない。陽イオン交換基の一例として、タンパク質精製の分野で通常用いられる、カルボキシメチル（ＣＭ）基、スルホプロピル（ＳＰ）基、スルホ基があげられる。またＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｓ－６５０（以上、東ソー社製）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（サイティバ社製）といった市販の陽イオン交換クロマトグラフィ用担体をそのまま用いてもよい。
【0025】
本発明での精製対象タンパク質である、ＡＡＶ結合性タンパク質は、ＡＡＶと結合可能なポリペプチドであれば特に制限はなく、インテグリンなどのラミニン受容体、抗ＡＡＶ抗体やＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）が例示できる。
【0026】
ＡＡＶ結合性タンパク質がＡＡＶＲである場合の好ましい態様として、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドがあげられる；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目ま置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目ま置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
【0027】
なお配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ＡＡＶＲの一態様であるＫＩＡＡ０３１９Ｌ（公式データベース：ＵｎｉＰｒｏｔ、アクセッションナンバー：Ｑ８ＩＺＡ０）のアミノ酸配列であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリン（Ｓ）から５００番目のアスパラギン酸（Ｄ）までのアミノ酸残基は、ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する領域である。
【0028】
前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドは、前述したＫＩＡＡ０３１９ＬのＰＫＤ１およびＰＫＤ２に相当する領域を少なくとも含んでいればよく、例えば、ＰＫＤ２のＣ末端側にある他の細胞外領域ドメイン（ドメイン３（ＰＫＤ３）、ドメイン４（ＰＫＤ４）およびドメイン５（ＰＫＤ５））に相当する領域の全てまたは一部を含んでもよいし、ＰＫＤ１のＮ末端側にあるＭＡＮＳＣ（Ｍｏｔｉｆ Ａｔ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｖｅｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ）ドメインなどのシグナル配列に相当する領域やシステインリッチな領域の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＮ末端側および／またはＣ末端側にある膜貫通領域ならびに細胞内領域の全てまたは一部を含んでもよい。
【0029】
前記（ｉｉ）の一例として、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドや、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示のＡＡＶ結合性タンパク質、があげられる。また前記（ｉｉ）に記載の置換、欠失、挿入、または付加の例として、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示しているアミノ酸残基の置換があげられる。
【0030】
前記（ｉｉ）における、「１もしくは数個」とは、ＡＡＶＲの立体構造におけるアミノ酸置換の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、一例として、１個以上５０個以下、１個以上３０個以下、１個以上２０個以下、１個以上１０個以下、１個以上９個以下、１個以上８個以下、１個以上７個以下、１個以上６個以下、１個以上５個以下、１個以上４個以下、１個以上３個以下、１個以上２個以下、１個のいずれかを意味する。「１もしくは数個」のアミノ酸残基の置換は、例えば、ＡＡＶ結合活性を有する限り、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示のアミノ酸残基の置換以外の位置に生じてよい。
【0031】
なお前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換」には、前述した特定位置におけるアミノ酸置換の他に、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が生じてもよい。保守的置換は、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社、９、２００５）。また前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加」には、ＡＡＶＲの由来の違いや、種の違いなどに基づく、天然にも存在する変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【0032】
前記（ｉｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上あればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本明細書において「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列の相同性」とは、アミノ酸配列全体に対する相同性を意味する。アミノ酸配列間の「同一性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。
【実施例0033】
以下、実施例および比較例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【0034】
実施例１ アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌培養物の調製
精製方法の検討で用いる、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌の培養物を、以下に示す方法で調製した。
精製方法の検討で用いる、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え大腸菌の培養物を、以下に示す方法で調製した。
【0035】
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１１ａを含むポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を含むプラスミドｐＴｒｃＡＶＲ１１ａ－ＣＲＮＤＴＣＧ－Ｖ１で大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、得られたＡＶＲ１１ａを発現可能な形質転換体を、２５０ｍＬバッフル付きフラスコに入れた５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２×ＹＴ（１．０％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．６％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）液体培地５０ｍＬに接種後、３７℃で一晩振とう培養することで前培養液を調製した。なお配列番号２において、１番目のメチオニン（Ｍ）から２２番目のアラニン（Ａ）までがＤｓｂＣシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ｄ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１１ａであり、２１４番目のシステイン（Ｃ）から２２０番目のグリシン（Ｇ）までが不溶性担体への固定化用タグであるシステインタグ配列である。またＡＶＲ１１ａは、ＡＡＶ受容体ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）（配列番号１の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基）に対して、以下の（Ｉ）から（ＸＩ）に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
（Ｉ）配列番号１の３１７番目（配列番号２では３０番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
（ＩＩ）配列番号１の３６２番目（配列番号２では７５番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ＩＩＩ）配列番号１の３７１番目（配列番号２では８４番目）のリジンがアスパラギンに置換
（ＩＶ）配列番号１の３９０番目（配列番号２では１０３番目）のグリシンがセリンに置換
（Ｖ）配列番号１の３９９番目（配列番号２では１１２番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ＶＩ）配列番号１の４７６番目（配列番号２では１８９番目）のセリンがアルギニンに置換
（ＶＩＩ）配列番号１の４８７番目（配列番号２では２００番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（ＶＩＩＩ）配列番号１の３３０番目（配列番号２では４３番目）のアラニンがバリンに置換
（ＩＸ）配列番号１の３４２番目（配列番号２では５５番目）のチロシンがセリンに置換
（Ｘ）配列番号１の３８１番目（配列番号２では９４番目）のバリンがアラニンに置換
（ＸＩ）配列番号１の３８２番目（配列番号２では９５番目）のイソロイシンがバリンに置換
（２）オートクレーブ滅菌済の本培養培地（４．０％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．３％（ｗ／ｖ）リン酸三ナトリウム・十二水和物、０．９％（ｗ／ｖ）リン酸水素二ナトリウム・十二水和物、０．２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・七水和物、０．２％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム、１．０％（ｗ／ｖ）グルコース、１０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、５ｍｇ／Ｌ塩化マンガン・四水和物、５０μｇ／ｍＬカナマイシン）１．２Ｌが入った３Ｌ容量の培養槽に、（１）の前培養液３６ｍＬを添加し、温度３０℃、撹拌数４００ｒｐｍ、ｐＨ６．９から７．１、通気量（空気）１．５Ｌ／分、溶存酸素濃度が飽和濃度の約３０％になるよう、撹拌回転数（最大７００ｒｐｍ）を自動制御する条件で本培養を開始した。なお、培地中のグルコースが消費され枯渇した時点で流加培地（４２．５％（ｗ／ｖ）グルコース、１４．２％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・七水和物）をＤＯスタット法で添加した。
（Ｉ）配列番号１の３１７番目（配列番号２では３０番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
（ＩＩ）配列番号１の３６２番目（配列番号２では７５番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ＩＩＩ）配列番号１の３７１番目（配列番号２では８４番目）のリジンがアスパラギンに置換
（ＩＶ）配列番号１の３９０番目（配列番号２では１０３番目）のグリシンがセリンに置換
（Ｖ）配列番号１の３９９番目（配列番号２では１１２番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ＶＩ）配列番号１の４７６番目（配列番号２では１８９番目）のセリンがアルギニンに置換
（ＶＩＩ）配列番号１の４８７番目（配列番号２では２００番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（ＶＩＩＩ）配列番号１の３３０番目（配列番号２では４３番目）のアラニンがバリンに置換
（ＩＸ）配列番号１の３４２番目（配列番号２では５５番目）のチロシンがセリンに置換
（Ｘ）配列番号１の３８１番目（配列番号２では９４番目）のバリンがアラニンに置換
（ＸＩ）配列番号１の３８２番目（配列番号２では９５番目）のイソロイシンがバリンに置換
（２）オートクレーブ滅菌済の本培養培地（４．０％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．３％（ｗ／ｖ）リン酸三ナトリウム・十二水和物、０．９％（ｗ／ｖ）リン酸水素二ナトリウム・十二水和物、０．２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・七水和物、０．２％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム、１．０％（ｗ／ｖ）グルコース、１０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、５ｍｇ／Ｌ塩化マンガン・四水和物、５０μｇ／ｍＬカナマイシン）１．２Ｌが入った３Ｌ容量の培養槽に、（１）の前培養液３６ｍＬを添加し、温度３０℃、撹拌数４００ｒｐｍ、ｐＨ６．９から７．１、通気量（空気）１．５Ｌ／分、溶存酸素濃度が飽和濃度の約３０％になるよう、撹拌回転数（最大７００ｒｐｍ）を自動制御する条件で本培養を開始した。なお、培地中のグルコースが消費され枯渇した時点で流加培地（４２．５％（ｗ／ｖ）グルコース、１４．２％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・七水和物）をＤＯスタット法で添加した。
【0036】
（３）本培養開始から２０時間後に０．５ｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ（ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ＴｈｉｏＧａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を０．３ｍＬ添加し、温度２５℃に、撹拌数を６００ｒｐｍに変更して、さらに２８時間培養を行なった。得られた培養液を遠心分離し、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む大腸菌の菌体（培養物）を回収した。
【0037】
（４）（３）で回収した菌体１ｇ（湿重量）に対して、抽出液（１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウム、２５０ｕｎｉｔｓ／Ｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社製）、０．００５％（ｗ／ｖ）リゾチーム、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商品名）を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０））を５ｍＬ加えることで菌体を溶解させた。
【0038】
（５）遠心分離し上清を回収後、０．２μｍのフィルターでろ過することで、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む溶解液を取得した。
【0039】
実施例２ ＡＡＶ結合性タンパク質を含む溶解液へのポリエチレンイミン添加
（１）実施例１で取得したＡＡＶ結合性タンパク質を含む溶解液に、終濃度で（ａ）０．０５％（ｗ／ｖ）、（ｂ）０．１％（ｗ／ｖ）、（ｃ）０．２％（ｗ／ｖ）または（ｄ）０．３％（ｗ／ｖ）になるよう、１０％（ｗ／ｖ）に調製したポリエチレンイミン溶液（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社のポリエチレンイミン５０％水溶液を希釈）を添加後、そのまま室温にて６０分間撹拌した。
（１）実施例１で取得したＡＡＶ結合性タンパク質を含む溶解液に、終濃度で（ａ）０．０５％（ｗ／ｖ）、（ｂ）０．１％（ｗ／ｖ）、（ｃ）０．２％（ｗ／ｖ）または（ｄ）０．３％（ｗ／ｖ）になるよう、１０％（ｗ／ｖ）に調製したポリエチレンイミン溶液（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社のポリエチレンイミン５０％水溶液を希釈）を添加後、そのまま室温にて６０分間撹拌した。
【0040】
（２）（１）の操作で生じた沈殿物を遠心分離で除去し上清を回収後、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）より回収した上清の２６０ｎｍ（Ａ２６０）および２８０ｎｍ（Ａ２８０）の吸光度を測定し、その吸光度比（Ａ２６０／Ａ２８０）を求めた。
【0041】
（３）（２）で回収した上清をキャピラリーＳＤＳゲル電気泳動分析計（ＰＡ８００ ｐｌｕｓ、ＳＣＩＥＸ社製）よりＡＡＶ結合性タンパク質量を求めた。
【0042】
比較例１
実施例２（１）で１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン溶液を添加しない他は、実施例２と同様な方法でＡＡＶ結合性タンパク質量を求めた。
実施例２（１）で１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン溶液を添加しない他は、実施例２と同様な方法でＡＡＶ結合性タンパク質量を求めた。
【0043】
実施例２および比較例１における分光光度計の結果をまとめて表１に示す。表１において吸光度比（Ａ２６０／Ａ２８０）が小さいほど、溶解液中に含まれる核酸量すなわち不純物量が少ないことを示している。ポリエチレンイミンの添加（実施例２（ａ）から（ｄ））により、ポリエチレンイミン未添加（比較例１）と比較し、吸光度比が低下した。以上の結果から、溶解液に終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）以上０．５％（ｗ／ｖ）以下のポリエチレンイミンを添加し、当該添加で生じた沈殿物を除去する工程を行なうことで、当該溶解液中に含まれる核酸などの不純物を効率的に除去できることがわかる。
【0044】
またポリエチレンイミンを終濃度で０．１％（ｗ／ｖ）（実施例２（ｂ））添加すると吸光度比がさらに低下し、０．２％（ｗ／ｖ）（実施例２（ｃ））添加するとさらにより低下した一方、０．３％（ｗ／ｖ）（実施例２（ｄ））添加したときの吸光度比は０．２％（ｗ／ｖ）（実施例２（ｃ））添加したときとほぼ同じ値を示した。このことから、ＡＡＶ結合性タンパク質の純度の点では、溶解液に添加するポリエチレンイミンを終濃度で０．０８％（ｗ／ｖ）以上０．５％（ｗ／ｖ）以下にするとより好ましく、０．１０％（ｗ／ｖ）以上０．５％（ｗ／ｖ）以下にするとさらにより好ましいことがわかる。
【0045】
【表1】
【0046】
実施例２および比較例１におけるキャピラリーＳＤＳゲル電気泳動分析計の結果（エレクトロフェログラム）をまとめて図１に示す。内部標準およびＡＡＶ結合性タンパク質に相当するピーク以外のピークは、大腸菌由来の夾雑物を示すと考えられる。またエレクトロフェログラム（図１）のうち、ＡＡＶ結合性タンパク質に相当するピーク（図１中、黒矢印で示したピーク）の面積比を算出した結果を表２に示す。なお表２中、面積比は、（ａ）ポリエチレンイミン未添加でのピーク面積をそれぞれ１００とした相対値である。ポリエチレンイミンを終濃度で０．０５％（ｗ／ｖ）（実施例２（ａ））、０．１％（ｗ／ｖ）（実施例２（ｂ））および０．２％（ｗ／ｖ）（実施例２（ｃ））添加したときは、ポリエチレンイミン未添加（比較例１）での回収量（ピーク面積）に対し８５％以上と同等の回収量を示したが、終濃度で０．３％（ｗ／ｖ）（実施例２（ｄ））添加したときは回収量が著しく低下した。
【0047】
以上の結果から、ＡＡＶ結合性タンパク質の回収量の点では、溶解液に添加するポリエチレンイミンを終濃度で０．０２％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下にすると好ましいことがわかる。
【0048】
【表2】
【0049】
表１および表２の結果を総括すると、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む溶解液に添加するポリエチレンイミン量を増加させると、核酸などの不純物をより効率的に除去できるようになるが、ある一定量以上添加してしまうと、ＡＡＶ結合性タンパク質の回収量が減ってしまうことが分かった。高純度のＡＡＶ結合性タンパク質を高収量で得るための最適なポリエチレンイミンの添加量は終濃度で０．０８％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１０％（ｗ／ｖ）以上０．２５％（ｗ／ｖ）以下であることがわかる。
【0050】
実施例３ 本発明の方法を利用したＡＡＶ結合性タンパク質の精製
（１）実施例１で得られたＡＡＶ結合性タンパク質を含む溶解液９０ｍＬに、終濃度０．２％（ｗ／ｖ）となるよう、１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン溶液１．８ｍＬを加え、室温にて６０分間撹拌した。本操作で生じた沈殿物は遠心分離で除去し上清を回収した。
（１）実施例１で得られたＡＡＶ結合性タンパク質を含む溶解液９０ｍＬに、終濃度０．２％（ｗ／ｖ）となるよう、１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン溶液１．８ｍＬを加え、室温にて６０分間撹拌した。本操作で生じた沈殿物は遠心分離で除去し上清を回収した。
【0051】
（２）（１）で回収した上清を０．２μｍのフィルターでろ過後、平衡化液Ａ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））であらかじめ平衡化した、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｍ、東ソー社製）を充填したカラム（容量８０ｍＬ）に、流速２０ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。
【0052】
（３）７カラムボリューム（ＣＶ）の平衡化液Ａを用いて洗浄した後、３ＣＶの溶出液（２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いてＡＡＶ結合性タンパク質を溶出させ、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分として１４１ｍＬを回収した。
【0053】
（４）（３）で回収した画分にイオン交換水５２５ｍＬおよび５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸７５ｍＬを添加し、ｐＨを２．８に、電気伝導度を５．５ｍＳ／ｃｍに調整後、平衡化液Ｂ（１５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ２．７））であらかじめ平衡化した、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ－６５０Ｍ、東ソー社製）を充填したカラム（容量７６ｍＬ）に、流速１９ｍＬ／ｍｉｎでアプライした。
【0054】
（５）４ＣＶの平衡化液Ｂで押出すことで、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分６３０ｍＬを回収した。
【0055】
（６）（５）で回収した画分に０．５ｍｏｌ／Ｌリン酸三ナトリウム溶液１０ｍＬを添加し、ｐＨを７．０に調整後、分画分子量１００００の限外ろ過膜を用いてＡＡＶ結合性タンパク質の濃縮および低分子物質を除去し、濃縮液を調製した（濃縮液量：４８ｍＬ）。
【0056】
（７）（６）で調製した濃縮液をサイズ排除クロマトグラフィ（使用カラム：ＴＳＫＧｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬ、東ソー社製）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動）に供し（供した量はタンパク質量として１．０μｇと１．５μｇ）、ＡＡＶ結合性タンパク質の純度を測定した。
【0057】
比較例２
実施例３（１）で１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン溶液の添加を行なわない他は、実施例３と同様な方法で、ＡＡＶ結合性タンパク質を精製し、サイズ排除クロマトグラフィで純度測定した。なお実施例（６）と同様な方法で調製した濃縮液の量は３６ｍＬである。
実施例３（１）で１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン溶液の添加を行なわない他は、実施例３と同様な方法で、ＡＡＶ結合性タンパク質を精製し、サイズ排除クロマトグラフィで純度測定した。なお実施例（６）と同様な方法で調製した濃縮液の量は３６ｍＬである。
【0058】
実施例３および比較例２の結果をまとめたものを表３に示す。ＡＡＶ結合性タンパク質を含む溶解液にポリエチレンイミンを添加して抽出液を取得し精製したとき（実施例３）の前記タンパク質の回収量は１１７ｍｇと、ポリエチレンイミンを添加せず抽出液を取得し精製したとき（比較例２）の回収量（８９ｍｇ）よりも多かった。さらにサイズ排除クロマトグラフィで求めたＡＡＶ結合性タンパク質の純度も、ポリエチレンイミンを添加して抽出液を取得し精製したとき（実施例３）のほうが、ポリエチレンイミンを添加せず抽出液を取得し精製したとき（比較例２）よりも高かった（実施例３：９８％、比較例２：９４％）。
【0059】
【表3】
【0060】
以上の結果から、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主の培養物から当該タンパク質を精製する際、前記培養物中に含まれる遺伝子組換え宿主の溶解液にポリエチレンイミンを添加し、当該添加で生じた沈殿物を除去した抽出液を用いて精製することで、高純度なＡＡＶ結合性タンパク質を高収量で得られることがわかる。
【図1】
【配列表】