ホーム > 特許ランキング > 富士フイルム株式会社
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 富士フイルム株式会社の特許一覧 ▶ 独立行政法人国立病院機構の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024172827
(43)【公開日】2024-12-12
(54)【発明の名称】脂質組成物および医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7105 20060101AFI20241205BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241205BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241205BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20241205BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20241205BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20241205BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7105 ZNA
A61P35/00
A61K48/00
A61K9/127
A61K47/18
C12N15/113 130Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023090825
(22)【出願日】2023-06-01
(71)【出願人】
【識別番号】306037311
【氏名又は名称】富士フイルム株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504136993
【氏名又は名称】独立行政法人国立病院機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】山浦 剛
(72)【発明者】
【氏名】田代 裕尊
(72)【発明者】
【氏名】田澤 宏文
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA95
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076CC27
4C076DD09F
4C076DD46
4C076DD49
4C076DD50
4C076DD70
4C076EE23F
4C076FF16
4C084AA13
4C084NA13
4C084ZB26
4C086AA01
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA24
4C086NA13
4C086ZB26
(57)【要約】 （修正有）
【課題】配列Ａで表される塩基配列からなる人工ｓｉＲＮＡを含む、核酸送達に優れた脂質組成物および医薬組成物を提供する。
【解決手段】ＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡ、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、リン脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質を含む、脂質組成物であって、上記人工ｓｉＲＮＡが、配列Ａで表される塩基配列からなる核酸分子および配列Ｂで表される塩基配列からなる核酸分子を含む、脂質組成物。（配列Ａ）５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’（配列Ｂ）５’-ＧＧＡＡＣＵＵＵＣＣＣＡＣＡＣＵＡＣＵ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’（式中、ｄＴは、３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。）
【選択図】なし
【解決手段】ＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡ、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、リン脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質を含む、脂質組成物であって、上記人工ｓｉＲＮＡが、配列Ａで表される塩基配列からなる核酸分子および配列Ｂで表される塩基配列からなる核酸分子を含む、脂質組成物。（配列Ａ）５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’（配列Ｂ）５’-ＧＧＡＡＣＵＵＵＣＣＣＡＣＡＣＵＡＣＵ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’（式中、ｄＴは、３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。）
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡ、下記式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、リン脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質を含む、脂質組成物であって、前記人工ｓｉＲＮＡが、下記配列Ａで表される塩基配列からなる核酸分子および下記配列Ｂで表される塩基配列からなる核酸分子を含む、脂質組成物。
（配列Ａ）
５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
（配列Ｂ）
５’-ＧＧＡＡＣＵＵＵＣＣＣＡＣＡＣＵＡＣＵ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
式中、ｄＴは、３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。
（配列Ａ）
５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
（配列Ｂ）
５’-ＧＧＡＡＣＵＵＵＣＣＣＡＣＡＣＵＡＣＵ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
式中、ｄＴは、３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。
【化1】
【請求項2】
ポリエチレングリコール構造を有する脂質が、ジアシルグリセロール構造とポリエチレングリコール構造とを有する脂質である、請求項１に記載の脂質組成物。
【請求項3】
脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対する式（１）で表される化合物又はその塩である脂質の含有率が３０～６０モル％である、請求項１に記載の脂質組成物。
【請求項4】
脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対するコレステロールの含有率が２５～６０モル％である、請求項１に記載の脂質組成物。
【請求項5】
脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対するポリエチレングリコール構造を有する脂質の含有率が０．５～５モル％である、請求項１に記載の脂質組成物。
【請求項6】
脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対するＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡの含有率が１～２５質量％である、請求項１に記載の脂質組成物。
【請求項7】
請求項１から６の何れか一項に記載の脂質組成物を含有する、医薬組成物。
【請求項8】
胃、肺、大腸、膵および前立腺から選択される少なくとも１つの臓器に生じる腫瘍、又は前記腫瘍から派生する疾患の処置剤である、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、人工ｓｉＲＮＡと脂質を含む脂質組成物、及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、タンパク質の発現を抑制する核酸分子として知られている。ｓｉＲＮＡは以下のようなプロセスを経て、遺伝子がコードするタンパク質翻訳を抑制することが知られている。まず、ｓｉＲＮＡは、細胞質内においてＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）と呼ばれるタンパク質複合体によって取り込まれる。ＲＩＳＣ複合体を形成後、ｓｉＲＮＡの二本鎖のうち分解されずに残るアンチセンス鎖が標的配列を見つけるガイドとして機能し、そのアンチセンス鎖と相補的な遺伝子配列をもつ標的ｍＲＮＡに結合する。結合後、ヌクレアーゼ活性により標的ｍＲＮＡが切断され、結果としてタンパク質翻訳が阻害される。
【0003】
ｍＲＮＡは、分化、細胞増殖又はアポトーシス等の生命現象、およびウイルス感染症又は癌等の多くの疾患に深く関与していることが明らかになっており、それらの疾患に関わるｍＲＮＡのタンパク質翻訳を阻害可能なｓｉＲＮＡは、核酸医薬品への応用が期待されている。例えば、非特許文献１には、ＴＭＰＲＳＳ４（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｓｅｒｉｎｅ ４）を標的としたｓｉＲＮＡ処置によりｉｎ ｖｉｔｒｏ実験でのがん細胞の増殖・浸潤能の抑制が確認されたことが記載されている。
【0004】
一方、核酸を細胞に送達できる技術が開発されてきたことから、核酸医薬品の開発が活発に行われている。核酸の送達技術の一つとして、核酸を粒子（リポソームまたは脂質粒子）に内包した核酸含有粒子を投与する方法が知られている。この技術においては、アミノ基などを有し低ｐＨでカチオンとなる脂質を用いて核酸含有粒子を調製しているが、粒子に適切な電荷を付与することにより核酸の送達を実現している。例えば、脂質粒子に含有させる化合物として、特許文献１には、脂肪族基とアミノ基とを繋ぐ連結基としてエステル基、アセタール基などを有する化合物が開示されている。特許文献２には、脂肪族基とアミノ基とを繋ぐ連結基としてビニルオキシ基やアミド基、オキシム基などを有する化合物が開示されている。なお、本明細書中では、アミノ基などを有し低ｐＨでカチオンとなる脂質のことを、カチオン性脂質と呼ぶことがある。
【0005】
さらに核酸含有粒子を製造する際に使用する脂質化合物の種類及び組成比を変更することについても検討されている。特許文献３には、（ａ）核酸；（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質；（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質；及び（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する複合化脂質、を含む核酸－脂質粒子が記載されている。特許文献４には、４０～６５％の特定の構造のカチオン性脂質、５～１０％の中性脂質、２５～４０％のステロール、及び０．５～１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む脂質製剤が記載されている。
【0006】
特許文献５には、高い核酸内包率および優れた核酸送達を実現できる脂質粒子を構成するための化合物としてのカチオン性脂質が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ（２０２２）２６：３０５-３１３
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開公報２０１０／０５４４０１号パンフレット
【特許文献2】国際公開公報２０１０／０５４４０５号パンフレット
【特許文献3】国際公開公報２００９／１２７０６０号パンフレット
【特許文献4】国際公開公報２０１０／１４４７４０号パンフレット
【特許文献5】国際公開公報２０１９／２３５６３５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
アミノ基を有する脂質による核酸の送達技術はまだ十分ではなく、核酸をさらに効率的に送達できる技術が求められている。
【0010】
一方、下記配列Ａで表される塩基配列からなる核酸（ｓｉＲＮＡ）はがん細胞の増殖・浸潤能を抑制することが知られているものの標的となるがん細胞への送達法Ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ（ＤＤＳ）に乏しく臨床応用への課題となっている。
【0011】
本発明は、下記配列Ａで表される塩基配列からなる人工ｓｉＲＮＡを含む、核酸送達に優れた脂質組成物および医薬組成物を提供することを解決すべき課題とする。
（配列Ａ）５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
式中、「ｄＴ」は３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。
（配列Ａ）５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
式中、「ｄＴ」は３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、式（１）で示される化合物またはその塩と、配列Ａで表される塩基配列からなる人工ｓｉＲＮＡとを用いて調製した脂質組成物が、インビボにおいて優れた薬効を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。本発明によれば、以下の発明が提供される。
【0013】
＜１＞ ＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡ、下記式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、リン脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質を含む、脂質組成物であって、上記人工ｓｉＲＮＡが、下記配列Ａで表される塩基配列からなる核酸分子および下記配列Ｂで表される塩基配列からなる核酸分子を含む、脂質組成物。
（配列Ａ）
５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
（配列Ｂ）
５’-ＧＧＡＡＣＵＵＵＣＣＣＡＣＡＣＵＡＣＵ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
式中、ｄＴは、３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。
＜２＞ ポリエチレングリコール構造を有する脂質が、ジアシルグリセロール構造とポリエチレングリコール構造とを有する脂質である、＜１＞に記載の脂質組成物。
＜３＞ 脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対する式（１）で表される化合物又はその塩である脂質の含有率が３０～６０モル％である、＜１＞又は＜２＞に記載の脂質組成物。
＜４＞ 脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対するコレステロールの含有率が２５～６０モル％である、＜１＞～＜３＞の何れか一に記載の脂質組成物。
＜５＞ 脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対するポリエチレングリコール構造を有する脂質の含有率が０．５～５モル％である、＜１＞～＜４＞の何れか一に記載の脂質組成物。
＜６＞ 脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対するＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡの含有率が１～２５質量％ある、＜１＞～＜５＞の何れか一に記載の脂質組成物。
＜７＞ ＜１＞～＜６＞の何れか一に記載の脂質組成物を含有する、医薬組成物。
＜８＞ 胃、肺、大腸、膵および前立腺から選択される少なくとも１つの臓器に生じる腫瘍、又は上記腫瘍から派生する疾患の処置剤である、＜７＞に記載の医薬組成物。
（配列Ａ）
５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
（配列Ｂ）
５’-ＧＧＡＡＣＵＵＵＣＣＣＡＣＡＣＵＡＣＵ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
式中、ｄＴは、３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。
【化1】
＜３＞ 脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対する式（１）で表される化合物又はその塩である脂質の含有率が３０～６０モル％である、＜１＞又は＜２＞に記載の脂質組成物。
＜４＞ 脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対するコレステロールの含有率が２５～６０モル％である、＜１＞～＜３＞の何れか一に記載の脂質組成物。
＜５＞ 脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対するポリエチレングリコール構造を有する脂質の含有率が０．５～５モル％である、＜１＞～＜４＞の何れか一に記載の脂質組成物。
＜６＞ 脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対するＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡの含有率が１～２５質量％ある、＜１＞～＜５＞の何れか一に記載の脂質組成物。
＜７＞ ＜１＞～＜６＞の何れか一に記載の脂質組成物を含有する、医薬組成物。
＜８＞ 胃、肺、大腸、膵および前立腺から選択される少なくとも１つの臓器に生じる腫瘍、又は上記腫瘍から派生する疾患の処置剤である、＜７＞に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【0014】
本発明の脂質組成物は、配列Ａで表される塩基配列からなる人工ｓｉＲＮＡを効率的に送達することができ、タンパク質の翻訳抑制効果に優れる。そのため、本発明の脂質組成物は、医薬組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明について詳細に説明する。
本明細書において「～」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において「～」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
【0017】
本発明の脂質組成物は、ＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡ、下記式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、リン脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質を含む。上記人工ｓｉＲＮＡは、下記配列Ａで表される塩基配列からなる核酸分子および下記配列Ｂで表される塩基配列からなる核酸分子を含む。
（配列Ａ）
５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
（配列Ｂ）
５’-ＧＧＡＡＣＵＵＵＣＣＣＡＣＡＣＵＡＣＵ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
式中、ｄＴは、３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。ここで、配列Ａがアンチセンス鎖であることが好ましく、配列Ｂがセンス鎖であることが好ましい。
（配列Ａ）
５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
（配列Ｂ）
５’-ＧＧＡＡＣＵＵＵＣＣＣＡＣＡＣＵＡＣＵ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
式中、ｄＴは、３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。ここで、配列Ａがアンチセンス鎖であることが好ましく、配列Ｂがセンス鎖であることが好ましい。
【化2】
【0018】
＜人工ｓｉＲＮＡ＞
本発明の脂質組成物は、ＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡを含む。ＴＭＰＲＳＳ４（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｅｒｉｎｅ ４）タンパクは、ＩＩ型膜タンパク（Ｔｙｐｅ ＩＩ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ： ＴＴＳＰ）のセリンプロテアーゼである。胃、肺、大腸、膵および前立腺がんでは、ＴＭＰＲＳＳ４の発現とその予後が相関することが報告され、さらにがん細胞を用いた研究ではＴＭＰＲＳＳ４の強発現によりＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、ＦＡＫの細胞内経路を介して、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ａ５やｕｒｏｋｉｎａｓｅ－ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒの発現を増強し細胞浸潤能を亢進させ、またＲＮＡ干渉でのＴＭＰＲＳＳ４発現の抑制によりがん細胞の増殖・浸潤能は低下することが報告されている。よって、本発明の脂質組成物によるＴＭＰＲＳＳ４の発現抑制により抗腫瘍効果が期待される。
本発明の脂質組成物は、ＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡを含む。ＴＭＰＲＳＳ４（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｓｅｒｉｎｅ ４）タンパクは、ＩＩ型膜タンパク（Ｔｙｐｅ ＩＩ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ： ＴＴＳＰ）のセリンプロテアーゼである。胃、肺、大腸、膵および前立腺がんでは、ＴＭＰＲＳＳ４の発現とその予後が相関することが報告され、さらにがん細胞を用いた研究ではＴＭＰＲＳＳ４の強発現によりＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、ＦＡＫの細胞内経路を介して、ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ａ５やｕｒｏｋｉｎａｓｅ－ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒの発現を増強し細胞浸潤能を亢進させ、またＲＮＡ干渉でのＴＭＰＲＳＳ４発現の抑制によりがん細胞の増殖・浸潤能は低下することが報告されている。よって、本発明の脂質組成物によるＴＭＰＲＳＳ４の発現抑制により抗腫瘍効果が期待される。
【0019】
本発明の脂質組成物は、人工ｓｉＲＮＡを含む。人工ｓｉＲＮＡは、下記配列Ａで表される塩基配列からなる核酸分子および下記配列Ｂで表される塩基配列からなる核酸分子を含む。
配列Ａ：５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
配列Ｂ：５’-ＧＧＡＡＣＵＵＵＣＣＣＡＣＡＣＵＡＣＵ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
式中、「ｄＴ」は３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。
配列Ａ：５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
配列Ｂ：５’-ＧＧＡＡＣＵＵＵＣＣＣＡＣＡＣＵＡＣＵ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’
式中、「ｄＴ」は３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。
【0020】
配列Ａで表される塩基配列からなる核酸分子は、ホスホロアミダイト法に基づき、市販の核酸合成機により合成することができる。ＲＮＡアミダイトとしては、例えば、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号）を用いることができ、アミダイトの脱保護は、定法により行うことができる。
【0021】
本発明の脂質組成物において、脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対するＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡの含有率は、１質量％～２５質量％であることが好ましく、２質量％～１５質量％であることがさらに好ましい。
【0022】
本発明の脂質組成物は、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質を含む。
【化3】
【0023】
式（１）で表される化合物は、２－ブチルオクチル３－エチル－１２－ヘキシル－６－（２－（オクタノイルオキシ）エチル）－１０－オキソ－９，１１－ジオキサ－３，６－ジアザヘニコサン－２１－オエートである。
【0024】
式（１）で表される化合物又はその塩の製造方法は、公知の方法を組み合わせることにより製造することができるが、例えば、国際公開ＷＯ２０１９／２３５６３５に記載されている製造法に従い、製造することができる。具体的には、式（１）で表される化合物は、国際公開ＷＯ２０１９／２３５６３５の実施例８８に記載した方法により製造することができる。
【0025】
式（１）で表される化合物は塩を形成していてもよい。
塩基性基における塩としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硝酸および硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。
塩基性基における塩としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硝酸および硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。
【0026】
本発明の脂質組成物において、脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対する式（１）で表される化合物又はその塩である脂質の含有率は３０～６０モル％が好ましく、３５～５５モル％がより好ましく、４０～５０モル％がさらに好ましい。
【0027】
なお、脂質組成物が、脂質として、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、リン脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質を含む場合には、脂質組成物に含まれる全脂質の合計量とは、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、リン脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質の合計量を意味する。
【0028】
本発明の脂質組成物は、コレステロールを含む。コレステロールを含むことで、膜流動性を低下させ、脂質粒子の安定化効果を得ることができる。
【0029】
本発明の脂質組成物において、脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対するコレステロールの含有率は２５～６０モル％が好ましく、３０～５５モル％がより好ましく、４０～５０モル％がさらに好ましい。
【0030】
本発明の脂質組成物は、リン脂質を含む。リン脂質としては、特に限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリンなどが挙げられ、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
【0031】
ホスファチジルコリンとしては、特に限定されないが、大豆レシチン（ＳＰＣ）、水添大豆レシチン（ＨＳＰＣ）、卵黄レシチン（ＥＰＣ）、水添卵黄レシチン（ＥＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＯＰＣ）などが挙げられる。なかでも、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＭＰＣ）が好ましい。
【0032】
ホスファチジルエタノールアミンとしては特に限定されないが、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＬｏＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（Ｄ（Ｐｈｙ）ＰＥ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２－ジテトラデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、１，２－ジヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、１，２－ジオクタデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン、１，２－ジフィタニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミンなどが挙げられる。
【0033】
これらリン脂質のなかでも、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）がより好ましい。
【0034】
本発明の脂質組成物において、リン脂質の含有率は、脂質組成物に含まれる脂質の総量に対して１～２０モル％が好ましく、２～１８モル％がより好ましく、５～１５モル％がさらに好ましい。
【0035】
本発明の脂質組成物は、ポリエチレングリコール構造を有する脂質を含む。ポリエチレングリコール構造を有する脂質を含むことで、脂質粒子の分散安定化効果を得ることができる。
【0036】
ポリエチレングリコール構造を有する脂質としては、特に限定されないが、ＰＥＧ修飾ホスホエタノールアミン、ジアシルグリセロールＰＥＧ誘導体、ジアルキルグリセロールＰＥＧ誘導体、コレステロールＰＥＧ誘導体、セラミドＰＥＧ誘導体などが挙げられる。これらの中でも、ジアシルグリセロールＰＥＧが好ましい。すなわち、ポリエチレングリコール構造を有する脂質としては、ジアシルグリセロール構造とポリエチレングリコール構造とを有する脂質であることが好ましく、ジアシルグリセロール構造のアシル基が炭素数１２～２２であるアシル基であることがより好ましい。
【0037】
上記ポリエチレングリコール誘導体のＰＥＧ鎖の重量平均分子量は、５００～５０００が好ましく、７５０～３０００がより好ましい。
【0038】
本発明の脂質組成物において、脂質組成物中に含まれる全脂質の合計量に対するポリエチレングリコール構造を有する脂質の含有率は０．５～５モル％が好ましく、０．５～３モル％がより好ましく、１．０～２．０モル％がさらに好ましい。
【0039】
＜脂質組成物の製造方法＞
本発明の脂質組成物の製造方法について説明する。
脂質組成物の製造方法は限定されないが、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、リン脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質など、脂質に分類される成分全てまたは一部の油溶性成分を有機溶媒等に溶解させ油相とし、人工ｓｉＲＮＡなどの水溶性成分を水に溶解させ水相とし、油相と水相を混合して製造することができる。混合にはマイクロミキサーを使用してもよく、ホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化してもよい。
本発明の脂質組成物の製造方法について説明する。
脂質組成物の製造方法は限定されないが、式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、リン脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質など、脂質に分類される成分全てまたは一部の油溶性成分を有機溶媒等に溶解させ油相とし、人工ｓｉＲＮＡなどの水溶性成分を水に溶解させ水相とし、油相と水相を混合して製造することができる。混合にはマイクロミキサーを使用してもよく、ホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化してもよい。
【0040】
あるいは、脂質を含む溶液をエバポレータなどによる減圧乾固または噴霧乾燥機などによる噴霧乾燥などにより脂質を含む乾燥した混合物を調製し、この混合物を水系溶媒に添加し、さらに前述の乳化機などで乳化することで製造することもできる。
【0041】
脂質組成物の製造方法の一例としては、
式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、リン脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質など、脂質に分類される成分を有機溶媒に溶解して油相を得る工程（ａ）；
工程（ａ）で得た油相と、人工ｓｉＲＮＡなどの水溶性成分を含む水相と、を混合する工程（ｂ）；
工程（ｂ）で得た油相及び水相を含む混合液を希釈して、脂質粒子の分散液を得る工程（ｃ）；
工程（ｃ）で得られた脂質粒子の分散液から上記有機溶媒を除去する工程（ｄ）；及び
工程（ｄ）で得られた脂質粒子の分散液の濃度を調節する工程（ｅ）；
を含む方法が挙げられる。
式（１）で表される化合物又はその塩である脂質、リン脂質、コレステロール、及びポリエチレングリコール構造を有する脂質など、脂質に分類される成分を有機溶媒に溶解して油相を得る工程（ａ）；
工程（ａ）で得た油相と、人工ｓｉＲＮＡなどの水溶性成分を含む水相と、を混合する工程（ｂ）；
工程（ｂ）で得た油相及び水相を含む混合液を希釈して、脂質粒子の分散液を得る工程（ｃ）；
工程（ｃ）で得られた脂質粒子の分散液から上記有機溶媒を除去する工程（ｄ）；及び
工程（ｄ）で得られた脂質粒子の分散液の濃度を調節する工程（ｅ）；
を含む方法が挙げられる。
【0042】
工程（ａ）においては、脂質に分類される構成成分を、有機溶媒（エタノールなどのアルコール、またはエステルなど）に溶解させることを含む。有機溶媒に溶解させた後の総脂質濃度は特に限定されないが、一般的には１ｍｍｏｌ／Ｌ～１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ～５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ～３０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【0043】
工程（ｂ）において、水相は、人工ｓｉＲＮＡを、水または緩衝液に溶解することで得ることができる。人工ｓｉＲＮＡの濃度は特に限定されないが、１～１０００μｇ／ｍＬが好ましく、１０～５００μｇ／ｍＬがより好ましい。必要に応じてｐＨ調整のための緩衝成分や酸化防止剤などの成分を添加することができる。水相のｐＨは２．０～７．０であることが好ましく、３．０～６．０であることがより好ましい。上記ｐＨに調整するために緩衝成分として酢酸、クエン酸、リンゴ酸、リン酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳなどが好ましく用いられ、必要に応じて塩強度を調整することを目的に、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩や、浸透圧を調整することを目的に、スクロース、トレハロース、マンニトールなどの糖や糖アルコールを添加してもよい。
【0044】
工程（ｂ）において、油相と水相は任意の方法で混合してよく、バッチ式でも流路デバイスを用いたインライン方式でもよい。インライン方式としてはマイクロ流路デバイスを用いることが好ましく、用いるマイクロ流路デバイスとしては、Ｙ字ミキサー、Ｔ字ミキサー、ヘリンボーンミキサー、リングマイクロミキサー、インピンジメントジェットミキサーなどを用いることができる。水相と油相を混合する比率（体積比）は、５：１～１：１が好ましく、４：１～２：１がより好ましい。
【0045】
工程（ｃ）において、脂質粒子の分散液を希釈溶液と混合することにより、有機溶媒の含有率を下げ、脂質粒子を安定化することができる。希釈溶液は、水でもよいが、ｐＨや塩強度を調整することを含んでもよい。希釈溶液に含まれる成分は目的に応じて任意に選択することができる。例えば、ｐＨを調整する目的で、緩衝液（例えばクエン酸緩衝液、クエン酸緩衝生理食塩水、酢酸緩衝液、酢酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液など）を用いてもよい。また、塩強度や浸透圧を調整することを目的として塩化ナトリウム、塩化カリウム、スクロース、トレハロース、フルクトースまたはマンニトールなどを含んでもよく、上記緩衝液にこれらの添加剤をさらに添加したものも使用できる。
【0046】
脂質粒子の分散液と希釈溶液は任意の方法で混合してよく、バッチ式でも流路デバイスを用いたインライン方式でもよい。混合時に用いる流路デバイスは、Ｙ字ミキサー、Ｔ字ミキサーなどを用いることができる。また、油相と水相を混合してから希釈溶液を混合するまでの時間は特に限定されないが、油相及び水相を混合してから３０秒以内に希釈を実施することが好ましく、１０秒以内に希釈を実施することがより好ましい。
脂質粒子の分散液と希釈溶液を混合する比率（液量比）は、１：０．５～１：１０が好ましく、１：１～１：５がより好ましい。
脂質粒子の分散液と希釈溶液を混合する比率（液量比）は、１：０．５～１：１０が好ましく、１：１～１：５がより好ましい。
【0047】
いくつかの実施形態では、工程（ｃ）において脂質粒子の分散液は目的に応じて複数回希釈溶液と混合してもよい。また用いる希釈溶液は同一であっても異なっていてもよい。脂質粒子の分散液では、ｐＨによって脂質粒子の粒径が変化することがあり、分散液のｐＨ調整は重要となる。そのため、例えば希釈溶液との混合後の脂質粒子の分散液のｐＨを調整するために、それに適した濃度およびｐＨを有する緩衝液や、さらに他の成分を含む緩衝液を用いてもよい。
【0048】
さらに、複数の希釈工程は連続的に実施してもよく、希釈工程と次の希釈工程の間隔を任意に設定することができ、例えば、その間隔は１０秒、３０秒、１分、５分、１０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間または２４時間であってもよい。
また、工程（ｃ）を行った後の脂質粒子の分散液のｐＨはｐＨ３．０～１０．０が好ましく、ｐＨ３．５～ｐＨ９．０がより好ましく、ｐＨ４．０～ｐＨ８．５が特に好ましい。
また、工程（ｃ）を行った後の脂質粒子の分散液のｐＨはｐＨ３．０～１０．０が好ましく、ｐＨ３．５～ｐＨ９．０がより好ましく、ｐＨ４．０～ｐＨ８．５が特に好ましい。
【0049】
脂質組成物には、必要に応じてサイジングを施すことができる。サイジングの方法は、特に限定されないが、エクストルーダーなどを用いて粒子径を小さくすることができる。
また、本発明の脂質組成物を含む分散液には、一般的な方法により、凍結や凍結乾燥を施すことができる。
また、本発明の脂質組成物を含む分散液には、一般的な方法により、凍結や凍結乾燥を施すことができる。
【0050】
工程（ｄ）において、脂質粒子の分散液から有機溶媒を除去する方法としては、特に限定されず、一般的な手法を使用することができる。例えば、透析液としてリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液などのｐＨ緩衝液を用いて透析を行うことにより有機溶媒を除去することができる。必要に応じて浸透圧の調整や凍結からの保護を目的として任意の塩や糖などの添加剤を加えることができる。
【0051】
工程（ｅ）において、工程（ｄ）で得られた分散液の濃度を調整することができる。希釈する場合は、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水もしくはトリス塩酸緩衝液、などを希釈液として用いて適切な濃度に希釈することができる。濃縮する場合は、工程（ｄ）で得られた分散液を限外ろ過膜を用いた限外ろ過などにより濃縮することができる。濃縮した分散液をそのまま用いても好ましく、濃縮した後に上記希釈液を用いて所望の濃度に調整しても好ましい。
【0052】
また、いくつかの実施形態では、接線流ろ過（ＴＦＦ）を用いて有機溶媒除去工程（工程（ｄ））、濃度調整工程（工程（ｅ））を連続的に行うことができる。本工程において有機溶媒除去工程と濃度調整工程を任意の順番で実施してもよい。必要に応じて有機溶媒除去工程と濃度調整工程をそれぞれ複数回ずつ実施してもよい。
【0053】
工程（ｄ）における透析や、工程（ｅ）における希釈において用いることのできる溶液には、賦形剤、凍結保護剤、緩衝剤や酸化防止剤を添加してもよい。賦形剤や凍結保護剤としては、特に限定されないが、糖類や糖アルコール類が挙げられる。糖類としては、例えばスクロース、トレハロース、マルトース、グルコース、ラクトース、フルクトースなどが、糖アルコール類としては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、キシリトールなどが挙げられる。緩衝剤としては、特に限定されないが、例えば、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、トリス、リン酸、酢酸、クエン酸などが挙げられる。酸化防止剤としては、ＥＤＴＡ、アスコルビン酸、トコフェロールなどが挙げられる。
【0054】
本発明の脂質組成物の分散液を医薬組成物とするために、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜、メンブレンフィルターなどを用いて、脂質組成物の分散液から不要なものを除去することができる。本発明では、特に限定されないが、滅菌できる孔径を有するフィルター（好ましくは０．２μｍのろ過滅菌フィルター）によってろ過することが好ましい。また、無菌ろ過を行うのは、工程（ｃ）もしくは工程（ｄ）または工程（ｅ）の後が好ましい。
さらに必要に応じて本発明の脂質組成物の分散液を、凍結または凍結乾燥を施すことができる。
さらに必要に応じて本発明の脂質組成物の分散液を、凍結または凍結乾燥を施すことができる。
【0055】
＜脂質組成物について＞
本発明の脂質組成物は、脂質粒子を含むことが好ましい。脂質粒子は、脂質に分類される成分から構成される粒子を意味する。脂質粒子の構造としては、脂質が凝集している脂質凝集体、ミセル、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）から選択されるいずれかの構造が考えられるが、これに限定されない。
また、人工ｓｉＲＮＡは脂質粒子に内包されることが好ましい。
本発明の脂質組成物は、脂質粒子を含むことが好ましい。脂質粒子は、脂質に分類される成分から構成される粒子を意味する。脂質粒子の構造としては、脂質が凝集している脂質凝集体、ミセル、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）から選択されるいずれかの構造が考えられるが、これに限定されない。
また、人工ｓｉＲＮＡは脂質粒子に内包されることが好ましい。
【0056】
脂質粒子の形態は、電子顕微鏡観察またはエックス線を用いた構造解析などにより確認できる。例えば、Ｃｒｙｏ透過型電子顕微鏡観察（ＣｒｙｏＴＥＭ法）を用いた方法により、リポソームのように脂質粒子が脂質二分子膜構造（ラメラ構造）及び内水層を持つ構造であるか、粒子内部に電子密度が高いコアを持ち、脂質をはじめとする構成成分が詰まった構造を有しているか、などが確認できる。エックス線小角散乱（ＳＡＸＳ）測定によっても、脂質粒子についての脂質二分子膜構造（ラメラ構造）の有無を確認できる。
【0057】
脂質粒子の粒子径は特に限定されないが、好ましくは１０～１０００ｎｍであり、より好ましくは３０～５００ｎｍであり、さらに好ましくは５０～２５０ｎｍである。脂質粒子の粒子径は、一般的な方法（例えば、動的光散乱法、レーザー回折法など）により測定することができる。
【0058】
＜脂質組成物の利用＞
本発明の脂質組成物の利用の一例としては、脂質組成物を細胞に導入することによって、ＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡを細胞に導入することができる。また、本発明の脂質組成物は、医薬組成物として生体に投与することができる。即ち、本発明によれば、本発明の脂質組成物を含有する、医薬組成物が提供される。
本発明の脂質組成物の利用の一例としては、脂質組成物を細胞に導入することによって、ＴＭＰＲＳＳ４タンパクの発現を抑制する人工ｓｉＲＮＡを細胞に導入することができる。また、本発明の脂質組成物は、医薬組成物として生体に投与することができる。即ち、本発明によれば、本発明の脂質組成物を含有する、医薬組成物が提供される。
【0059】
本発明の医薬組成物は、胃、肺、大腸、膵および前立腺から選択される少なくとも１つの臓器に生じる腫瘍、又は上記腫瘍から派生する疾患の処置剤として用いることができる。
【0060】
本発明によれば、本発明の医薬組成物を、対象に投与することを含む、胃、肺、大腸、膵および前立腺などの臓器に生じる腫瘍もしくは上記腫瘍から派生する疾患を処置する方法が提供される。
【0061】
本発明によれば、胃、肺、大腸、膵および前立腺などの臓器に生じる腫瘍もしくは上記腫瘍から派生する疾患の処置において使用するための、本発明の医薬組成物が提供される。
【0062】
本発明によれば、胃、肺、大腸、膵および前立腺などの臓器に生じる腫瘍もしくは上記腫瘍から派生する疾患の処置剤の製造のための、本発明の医薬組成物の使用が提供される。
【0063】
本発明における腫瘍としては、良性腫瘍、悪性腫瘍（がん）、又は前がん状態を包含するものとする。腫瘍から派生する疾患としては、転移腫瘍、悪液質などが挙げられるが、特に限定されない。
【0064】
処置の対象は、ヒト及びヒト以外の哺乳動物を含む。ヒト以外の哺乳動物として、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、マウス、ラット等が挙げられる。
処置は、所望の治療効果、例えば、状態の進行の阻害または遅延が実現される任意の処置及び療法であってよく、進行の速度の低下、進行の速度の休止、状態の好転、状態の治癒もしくは寛解（部分的なものであるか完全なものであるかにかかわらず）、状態の１つもしくは複数の症状及び／もしくは徴候の予防、遅延、軽減もしくは停止、または対象もしくは対象の生存が処置の不在下で予測されるものよりも延長されることを含む。
処置は予防も含む。例えば、胃、肺、大腸、膵および前立腺などの臓器に生じる腫瘍もしくは上記腫瘍から派生する疾患の発症または再発症しやすいまたはそのリスクがある対象を処置することにより、対象における胃、肺、大腸、膵および前立腺などの臓器に生じる腫瘍もしくは上記腫瘍から派生する疾患の発症または再発症が予防され得るまたは遅延し得る。
処置は、所望の治療効果、例えば、状態の進行の阻害または遅延が実現される任意の処置及び療法であってよく、進行の速度の低下、進行の速度の休止、状態の好転、状態の治癒もしくは寛解（部分的なものであるか完全なものであるかにかかわらず）、状態の１つもしくは複数の症状及び／もしくは徴候の予防、遅延、軽減もしくは停止、または対象もしくは対象の生存が処置の不在下で予測されるものよりも延長されることを含む。
処置は予防も含む。例えば、胃、肺、大腸、膵および前立腺などの臓器に生じる腫瘍もしくは上記腫瘍から派生する疾患の発症または再発症しやすいまたはそのリスクがある対象を処置することにより、対象における胃、肺、大腸、膵および前立腺などの臓器に生じる腫瘍もしくは上記腫瘍から派生する疾患の発症または再発症が予防され得るまたは遅延し得る。
【0065】
処置剤の対象疾患としては、胃、肺、大腸、膵および前立腺などの臓器に生じる腫瘍（即ち、胃がん、肺がん、大腸がん、膵がんおよび前立腺がん）、および上記腫瘍から派生する疾患（例えば、上記のがんから生じる転移性腫瘍など）が挙げられる。
【0066】
本発明の脂質組成物を医薬組成物として使用する場合には、本発明の脂質組成物は単独でまたは薬学的に許容される投与媒体（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液）と混合して、生体に投与することができる。
【0067】
薬学的に許容される投与媒体との混合物中における脂質組成物の濃度は、特に限定されず、一般的には０．０５質量％から９０質量％とすることができる。また、本発明の脂質組成物を含む医薬組成物には、他の添加物質（例えば、塩、保存剤、ｐＨ調整緩衝剤、浸透圧調整剤など）を添加してもよい。
【0068】
本発明の医薬組成物を投与する際の投与経路は、特に限定されず、任意の方法で投与することができる。投与方法としては、経口投与、非経口投与（関節内投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、硝子体内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、膣内投与、膀胱内投与、髄腔内投与、肺投与、直腸投与、結腸投与、頬投与、鼻投与、大槽内投与、吸入など）が挙げられるが、非経口投与が好ましい。非経口投与方法としては、静脈注射、皮下注射、皮内注射、腹腔内注射または筋肉内注射が好ましい。
【0069】
投与量としては、例えば、一回の投与につき対象の体重１ｋｇあたり医薬組成物に含まれるｓｉＲＮＡ量として１０μｇから１００μｇの範囲で投与量が選択できる。
【0070】
次に本発明について実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例0071】
＜化合物の合成＞
下記の式（１）で表される脂質を国際公報２０１９／２３５６３５の実施例８８に記載の方法で合成した。
下記の式（１）で表される脂質を国際公報２０１９／２３５６３５の実施例８８に記載の方法で合成した。
【化4】
【0072】
＜人工ｓｉＲＮＡの作製＞
下記配列ＡおよびＢで表わされる核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、株式会社ＦＡＳＭＡＣにて合成し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。
（配列Ａ）
５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’（配列番号１）
（配列Ｂ）
５’-ＧＧＡＡＣＵＵＵＣＣＣＡＣＡＣＵＡＣＵ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’ （配列番号２）
式中、「ｄＴ」は３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。
下記配列ＡおよびＢで表わされる核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、株式会社ＦＡＳＭＡＣにて合成し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。
（配列Ａ）
５’-ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＡＧＵＵＣＣ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’（配列番号１）
（配列Ｂ）
５’-ＧＧＡＡＣＵＵＵＣＣＣＡＣＡＣＵＡＣＵ「ｄＴ」「ｄＴ」-３’ （配列番号２）
式中、「ｄＴ」は３’末端に付加されたデオキシチミンを示す。
【0073】
＜核酸分子内包脂質粒子の調製＞
＜化合物の合成＞で製造した脂質（（式）１）を、カチオン性脂質として使用した。
上記のカチオン性脂質、リン脂質としてＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）、製品名：ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＣ－８０８０；ＮＯＦ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コレステロール（製品名：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ＨＰ；日本精化株式会社）、ＰＥＧ脂質としてＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（製品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＭ－０２０；ＮＯＦ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、表１に記載のモル比で、総脂質濃度が１２．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにエタノールに溶解させ、油相を得た。
＜化合物の合成＞で製造した脂質（（式）１）を、カチオン性脂質として使用した。
上記のカチオン性脂質、リン脂質としてＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフォコリン（1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）、製品名：ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＭＣ－８０８０；ＮＯＦ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、コレステロール（製品名：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ＨＰ；日本精化株式会社）、ＰＥＧ脂質としてＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（製品名：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＭ－０２０；ＮＯＦ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、表１に記載のモル比で、総脂質濃度が１２．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにエタノールに溶解させ、油相を得た。
【0074】
＜人工ｓｉＲＮＡの作製＞で作製した核酸分子６．５５５ｍｇ（配列Ａと配列Ｂの１：１混合物）を滅菌水６．５５５ｍＬに溶解し、ｐＨ４の５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファーで核酸濃度が０．１６３ｍｇ/ｍＬになるように希釈して水相を得た。続いて水相と油相の体積比が水相：油相＝３：１となるようにシリンジポンプを用いてマイクロミキサー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ社製ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ）で混合し、混合液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍希釈した（混合時の全脂質に対する核酸分子の質量比を表１に記載した。）。さらにトリス塩酸緩衝液を用いて透析を行いエタノールを除去して核酸内包脂質粒子の分散物を得た。得られた分散物を０．２μｍのフィルター（ザルトリウス社 Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｓ６５３４－ＦＭＯＳＫ）でろ過後、限外ろ過膜をもつ遠心式フィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ社 Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ １００ｋＤａ）を用いて濃縮した。
【0075】
【表1】
【0076】
＜粒子径と核酸分子内包率の測定＞
＜粒子径の測定＞
核酸分子内包脂質粒子の粒子径は、核酸内包脂質粒子分散液について、粒径測定システムＥＬＳ－Ｚ２（大塚電子）を用いて、ＰＢＳで３０倍希釈した後測定した。
＜粒子径の測定＞
核酸分子内包脂質粒子の粒子径は、核酸内包脂質粒子分散液について、粒径測定システムＥＬＳ－Ｚ２（大塚電子）を用いて、ＰＢＳで３０倍希釈した後測定した。
【0077】
＜核酸分子の内包率の測定＞
核酸分子の内包率は、以下の方法にて測定した。
（総核酸濃度定量）
１０倍希釈した核酸内包脂質粒子分散液５０μＬに、メタノール４５０μＬを加え混合し、吸光度計Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて波長：２６０ｎｍの吸光度を測定することで核酸内包脂質粒子分散液の総核酸濃度を定量した。
核酸分子の内包率は、以下の方法にて測定した。
（総核酸濃度定量）
１０倍希釈した核酸内包脂質粒子分散液５０μＬに、メタノール４５０μＬを加え混合し、吸光度計Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて波長：２６０ｎｍの吸光度を測定することで核酸内包脂質粒子分散液の総核酸濃度を定量した。
【0078】
（外水相における核酸濃度の定量）
Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、プロトコルに従って定量した。まず、上述のキットに含まれる２０×ＴＥバッファーを水で希釈し、１×ＴＥバッファーとした。なお、ＴＥは、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を示す。外水相の核酸のみを定量するため、核酸内包脂質粒子分散液を１×ＴＥバッファーで２５０倍に希釈した。
Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、プロトコルに従って定量した。まず、上述のキットに含まれる２０×ＴＥバッファーを水で希釈し、１×ＴＥバッファーとした。なお、ＴＥは、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を示す。外水相の核酸のみを定量するため、核酸内包脂質粒子分散液を１×ＴＥバッファーで２５０倍に希釈した。
【0079】
２５０倍に希釈した核酸内包脂質粒子分散液１００μＬを、９６ウェルプレートに入れ、つづいて１×ＴＥバッファーで２００倍に希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬（上記したＱｕａｎｔｉ－ｉＴ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに含まれている試薬）１００μＬをサンプルに加え、プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔ ＥＦ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて蛍光（励起波長：４８５ｎｍ、蛍光波長：５３５ｎｍ）を測定することで、外水相における核酸濃度を定量した。
【0080】
（内包率の算出）
上述の定量で得られた総核酸濃度及び外水相における核酸濃度を用いて、下記式に従って、核酸内包脂質粒子の核酸内包率を算出した。
核酸内包率（％）＝（総核酸濃度－外水相における核酸濃度）÷総核酸濃度×１００
上述の定量で得られた総核酸濃度及び外水相における核酸濃度を用いて、下記式に従って、核酸内包脂質粒子の核酸内包率を算出した。
核酸内包率（％）＝（総核酸濃度－外水相における核酸濃度）÷総核酸濃度×１００
【0081】
上記の測定の結果、粒子径は９７ｎｍであり、核酸内包率は９３％であった、
【0082】
上記において調製した核酸分子内包脂質粒子（以下、ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰとも称する）を用いて、以下の薬効試験を行った。
【0083】
＜薬効試験＞
（１）Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ によるＴＭＰＲＳＳ４－ｍＲＮＡの抑制効果
胃がんＮＵＧＣ－３細胞を用いて、ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ（１０ｎＭ、７２時間トランスフェクション）のｍＲＮＡ抑制効果をＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いて検討した。
図１において、ＬＮＰ／ＮＣ＃１は、ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ（ｓｉＲＮＡ １０ｎｍｏｌ／Ｌ）｛ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡはＭＩＳＳＯＮ－ｓｉＲＮＡ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた｝の結果を示し、ＬＮＰ／ＴＭＰＲＳＳ４＃２は、ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰの結果を示す。
図１のように、ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ（ｓｉＲＮＡ １０ｎｍｏｌ／Ｌ）は、コントロールｓｉＲＮＡ－ＬＮＰに比較しＴＭＰＲＳＳ４－ｍＲＮＡの発現レベルを有意に抑制した。
（１）Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ によるＴＭＰＲＳＳ４－ｍＲＮＡの抑制効果
胃がんＮＵＧＣ－３細胞を用いて、ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ（１０ｎＭ、７２時間トランスフェクション）のｍＲＮＡ抑制効果をＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法を用いて検討した。
図１において、ＬＮＰ／ＮＣ＃１は、ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ（ｓｉＲＮＡ １０ｎｍｏｌ／Ｌ）｛ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡはＭＩＳＳＯＮ－ｓｉＲＮＡ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた｝の結果を示し、ＬＮＰ／ＴＭＰＲＳＳ４＃２は、ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰの結果を示す。
図１のように、ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ（ｓｉＲＮＡ １０ｎｍｏｌ／Ｌ）は、コントロールｓｉＲＮＡ－ＬＮＰに比較しＴＭＰＲＳＳ４－ｍＲＮＡの発現レベルを有意に抑制した。
【0084】
（２）ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰの抗腫瘍効果
７週齢雄Ｂａｌｂ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ マウス の背中に０．２×１０７個のＳＵＩＴ－２膵がん細胞株を０．２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０溶液で皮下注し，腫瘍径が約５ｍｍ（約１４日後）になってから５－ＦＵ（２０ｍｇ／ｋｇ，腹腔内）を週３回投与し３週間行った。ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ（１７μｇ／ｋｇ）（ｎ＝６）またはｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ（１７μｇ／ｋｇ）｛ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡはＭＩＳＳＯＮ－ｓｉＲＮＡ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた｝（ｎ＝６）も５－ＦＵと同様に腫瘍径５ｍｍ（約１４日後）になってから０．２ｍｌの容量で尾静脈注射を週２回、３週間投与を行う。投与３週間は毎日腫瘍径を測定し、投与開始後３週後に安楽死させる。図２のＮＣは、ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ投与群を示し、ｓｉＲＮＡは、ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ投与群を示す。結果は、図２に示す通り、２３日目と３３日目で有意に、ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ投与群で、腫瘍が抑制されていた。
７週齢雄Ｂａｌｂ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ マウス の背中に０．２×１０７個のＳＵＩＴ－２膵がん細胞株を０．２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０溶液で皮下注し，腫瘍径が約５ｍｍ（約１４日後）になってから５－ＦＵ（２０ｍｇ／ｋｇ，腹腔内）を週３回投与し３週間行った。ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ（１７μｇ／ｋｇ）（ｎ＝６）またはｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ（１７μｇ／ｋｇ）｛ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡはＭＩＳＳＯＮ－ｓｉＲＮＡ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた｝（ｎ＝６）も５－ＦＵと同様に腫瘍径５ｍｍ（約１４日後）になってから０．２ｍｌの容量で尾静脈注射を週２回、３週間投与を行う。投与３週間は毎日腫瘍径を測定し、投与開始後３週後に安楽死させる。図２のＮＣは、ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ投与群を示し、ｓｉＲＮＡは、ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ投与群を示す。結果は、図２に示す通り、２３日目と３３日目で有意に、ＴＭＰＲＳＳ４－ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ投与群で、腫瘍が抑制されていた。
【図1】
【図2】
【配列表】