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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024175031
(43)【公開日】2024-12-17
(54)【発明の名称】アトピー性皮膚炎の検出方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20241210BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 D ZNA
G01N33/50 D
【審査請求】有
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024159052
(22)【出願日】2024-09-13
(62)【分割の表示】P 2021551626の分割
【原出願日】2020-10-02
(31)【優先権主張番号】P 2019184174
(32)【優先日】2019-10-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】110003421
【氏名又は名称】弁理士法人フィールズ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】村田 幸久
(72)【発明者】
【氏名】中村 達朗
(72)【発明者】
【氏名】濱崎 雄大
(72)【発明者】
【氏名】大矢 幸弘
(72)【発明者】
【氏名】犬塚 祐介
(72)【発明者】
【氏名】山本 貴和子
(57)【要約】
【課題】アトピー性皮膚炎を検出する新規な方法と、アトピー性皮膚炎に対する治療効果の新規な判定方法の提供。
【解決手段】本発明によれば、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎の検出方法が提供される。本発明によればまた、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎に対する治療効果の判定方法が提供される。本発明によれば、アトピー性皮膚炎やアトピー性皮膚炎に対する治療効果を被験対象の生体試料に基づいて定量的に検出できる点で有利である。また、被験対象の生体試料は非侵襲的に採取したものを用いることができる点でも有利である。
【選択図】図１３
【解決手段】本発明によれば、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎の検出方法が提供される。本発明によればまた、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎に対する治療効果の判定方法が提供される。本発明によれば、アトピー性皮膚炎やアトピー性皮膚炎に対する治療効果を被験対象の生体試料に基づいて定量的に検出できる点で有利である。また、被験対象の生体試料は非侵襲的に採取したものを用いることができる点でも有利である。
【選択図】図１３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎の検出方法。
【請求項2】
前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程をさらに含む、請求項１に記載の検出方法。
【請求項3】
前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、対象がアトピー性皮膚炎に罹患していることが示される、請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項4】
前記生体試料が体液である、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項5】
対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎に対する治療効果の判定方法。
【請求項6】
前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程をさらに含む、請求項５に記載の判定方法。
【請求項7】
前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、治療前の対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、あるいは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異ならない場合に、治療効果があることが示される、請求項５または６に記載の判定方法。
【請求項8】
アトピー性皮膚炎に対する治療が、薬物療法またはプロアクティブ療法である、請求項５～７のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項9】
前記生体試料が体液である、請求項５～８のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項10】
前記脂質代謝物が、アラキドン酸代謝物、エイコサペンタエン酸代謝物およびドコサヘキサエン酸代謝物からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載の検出方法または請求項５～９のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項11】
前記脂質代謝物が、アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の濃度が健常な対象の生体試料中の濃度よりも高い傾向にあるものである、請求項１～４および１０のいずれか一項に記載の検出方法または請求項５～１０のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項12】
前記脂質代謝物が、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＪ２、テトラノル－ＰＧＤＭ、２０－ヒドロキシ－ＰＧＥ２、１５－ケト－ＰＧＥ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＥ２、テトラノル－ＰＧＥＭ、１５－ケト－ＰＧＦ２α、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１α、テトラノル－ＰＧＦＭ、６，１５－ジケト－１３，１４－ジヒドロ－ＰＧＦ１α、５－ＨｐＥＴＥ、１７－ＨＥＴＥ、１１β－１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＦ２α、ＰＧＫ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１β、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＥ２、６－ケト－ＰＧＦ１αおよびＴＸＢ２からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１１に記載の検出方法または請求項１１に記載の判定方法。
【請求項13】
前記脂質代謝物が、アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の濃度が健常な対象の生体試料中の濃度よりも低い傾向にあるものである、請求項１～４および１０のいずれか一項に記載の検出方法または請求項５～１０のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項14】
前記脂質代謝物が、５－ＨＥＴＥ、アラキドン酸（ＡＡ）、１１β－１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＦ２α、ｉＰＦ２α－ＩＶ、ＥＰＡ、４－ＨＤｏＨＥ、１０，１７－ＤｉＨＤｏＨＥおよびＰＧＤ３からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１３に記載の検出方法または請求項１３に記載の判定方法。
【請求項15】
前記脂質代謝物の濃度を質量分析法により測定する、請求項１～４および１０～１４のいずれか一項に記載の検出方法または請求項５～１４のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項16】
脂質代謝物を含んでなる、アトピー性皮膚炎マーカー。
【請求項17】
前記脂質代謝物が、アラキドン酸代謝物、エイコサペンタエン酸代謝物およびドコサヘキサエン酸代謝物からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１６に記載のアトピー性皮膚炎マーカー。
【請求項18】
前記脂質代謝物が、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＪ２、テトラノル－ＰＧＤＭ、２０－ヒドロキシ－ＰＧＥ２、１５－ケト－ＰＧＥ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＥ２、テトラノル－ＰＧＥＭ、１５－ケト－ＰＧＦ２α、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１α、テトラノル－ＰＧＦＭ、６，１５－ジケト－１３，１４－ジヒドロ－ＰＧＦ１α、５－ＨｐＥＴＥ、１７－ＨＥＴＥ、１１β－１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＦ２α、ＰＧＫ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１β、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＥ２、６－ケト－ＰＧＦ１α、ＴＸＢ２、５－ＨＥＴＥ、アラキドン酸（ＡＡ）、ｉＰＦ２α－ＩＶ、ＥＰＡ、４－ＨＤｏＨＥ、１０，１７－ＤｉＨＤｏＨＥおよびＰＧＤ３からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１６または１７に記載のアトピー性皮膚炎マーカー。
【請求項19】
アトピー性皮膚炎の治療薬または緩和剤の候補を対象に投与する工程と、前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程とを含んでなる、アトピー性皮膚炎の治療薬または緩和剤のスクリーニング方法。
【請求項20】
治療薬または緩和剤の候補の投与後の対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較する工程をさらに含む、請求項１９に記載のスクリーニング方法。
【請求項21】
治療薬または緩和剤の候補の投与後の対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、治療薬または緩和剤の候補の投与前の対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、あるいは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異ならない場合に、前記治療薬または緩和剤の候補に治療効果があることが示される、請求項１９または２０に記載のスクリーニング方法。
【請求項22】
生体試料中の脂質代謝物においてアトピー性皮膚炎マーカーを同定する方法であって、アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と、健常な対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程と、前記の測定した２つの濃度を比較する工程を含む方法。
【請求項23】
アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、当該脂質代謝物がアトピー性皮膚炎マーカーであることが示される、請求項２２に記載の同定方法。
【請求項24】
対象の生体試料中の脂質代謝物の定量手段を含んでなる、アトピー性皮膚炎の検出用キット。
【請求項25】
（Ａ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程と、（Ｂ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程と、（Ｃ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、対象がアトピー性皮膚炎に罹患していると決定する工程と、（Ｎ）アトピー性皮膚炎に罹患していると決定された対象に、アトピー性皮膚炎に対する治療を実施する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎の治療方法
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【0001】
本願は、先行する日本国出願である特願２０１９－１８４１７４（出願日：２０１９年１０月４日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【0002】
本発明は、アトピー性皮膚炎の検出方法に関する。本発明はまた、アトピー性皮膚炎に対する治療効果の判定方法に関する。
【背景技術】
【0003】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、憎悪と寛解を繰り返す、掻痒のある湿疹によって特徴づけられる炎症性皮膚疾患である。ＡＤは遺伝的な要素と環境的な要素の相互作用によって引き起こされるが、ＡＤの患者数は近年増加しており、子供と成人の有症率はそれぞれ９．８～１３．２％、２．５～９．４％と推定されている。また、乳児期におけるＡＤの発症は、食物アレルギー、気管支喘息、アレルギー性鼻炎といった他のアレルギー性疾患の発症リスクを上昇させる報告もある。ＡＤ病変では、Ｔｈ２細胞がＩＬ－４やＩＬ－１３といったＴｈ２サイトカイン、ＴＡＲＣといったケモカインと相関しており、血清ＴＡＲＣレベルはＡＤのマーカーとして有用であることが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Thijs J et al., Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology, 15(5):453-460 (2015)
【非特許文献2】Judith L et al., J. Clin. Med, 4, 479-487(2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、アトピー性皮膚炎を検出する新規な方法を提供することを目的とする。本発明はまた、アトピー性皮膚炎に対する治療効果の新規な判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは今般、アトピー性皮膚炎モデルマウスおよびアトピー性皮膚炎患者の生体試料中の脂質代謝物の量が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物とは異なることを確認した。本発明者らはまた、前記の脂質代謝物濃度を指標にすることにより、アトピー性皮膚炎を検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【0007】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎の検出方法または診断方法。
［２］前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程をさらに含む、上記［１］に記載の検出方法または診断方法。
［３］前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、対象がアトピー性皮膚炎に罹患していることが示される、上記［１］または［２］に記載の検出方法または診断方法。
［４］前記生体試料が体液である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の検出方法または診断方法。
［５］対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎に対する治療効果の判定方法。
［６］前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程をさらに含む、上記［５］に記載の判定方法。
［７］前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、治療前の対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、あるいは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異ならない場合に、治療効果があることが示される、上記［５］または［６］に記載の判定方法。
［８］アトピー性皮膚炎に対する治療が、薬物療法またはプロアクティブ療法である、上記［５］～［７］のいずれかに記載の判定方法。
［９］前記生体試料が体液である、上記［５］～［８］のいずれかに記載の判定方法。
［１０］前記脂質代謝物が、アラキドン酸代謝物、エイコサペンタエン酸代謝物およびドコサヘキサエン酸代謝物からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［１］～［４］のいずれかに記載の検出方法もしくは診断方法または上記［５］～［９］のいずれかに記載の判定方法。
［１１］前記脂質代謝物が、アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の濃度が健常な対象の生体試料中の濃度よりも高い傾向にあるものである、上記［１］～［４］および［１０］のいずれかに記載の検出方法もしくは診断方法または上記［５］～［１０］のいずれかに記載の判定方法。
［１２］前記脂質代謝物が、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＪ２、テトラノル－ＰＧＤＭ、２０－ヒドロキシ－ＰＧＥ２、１５－ケト－ＰＧＥ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＥ２、テトラノル－ＰＧＥＭ、１５－ケト－ＰＧＦ２α、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１α、テトラノル－ＰＧＦＭ、６，１５－ジケト－１３，１４－ジヒドロ－ＰＧＦ１α、５－ＨｐＥＴＥ、１７－ＨＥＴＥ、１１β－１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＦ２α、ＰＧＫ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１β、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＥ２、６－ケト－ＰＧＦ１αおよびＴＸＢ２からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［１１］に記載の検出方法もしくは診断方法または上記［１１］に記載の判定方法。
［１３］前記脂質代謝物が、アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の濃度が健常な対象の生体試料中の濃度よりも低い傾向にあるものである、上記［１］～［４］および［１０］のいずれかに記載の検出方法もしくは診断方法または上記［５］～［１０］のいずれかに記載の判定方法。
［１４］前記脂質代謝物が、５－ＨＥＴＥ、アラキドン酸（ＡＡ）、１１β－１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＦ２α、ｉＰＦ２α－ＩＶ、ＥＰＡ、４－ＨＤｏＨＥ、１０，１７－ＤｉＨＤｏＨＥおよびＰＧＤ３からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［１３］に記載の検出方法もしくは診断方法または上記［１３］に記載の判定方法。
［１５］前記脂質代謝物の濃度を質量分析法により測定する、上記［１］～［４］および［１０］～［１４］のいずれかに記載の検出方法もしくは診断方法または上記［５］～［１４］のいずれかに記載の判定方法。
［１６］脂質代謝物を含んでなる、アトピー性皮膚炎マーカー。
［１７］前記脂質代謝物が、アラキドン酸代謝物、エイコサペンタエン酸代謝物およびドコサヘキサエン酸代謝物からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［１６］に記載のアトピー性皮膚炎マーカー。
［１８］前記脂質代謝物が、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＪ２、テトラノル－ＰＧＤＭ、２０－ヒドロキシ－ＰＧＥ２、１５－ケト－ＰＧＥ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＥ２、テトラノル－ＰＧＥＭ、１５－ケト－ＰＧＦ２α、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１α、テトラノル－ＰＧＦＭ、６，１５－ジケト－１３，１４－ジヒドロ－ＰＧＦ１α、５－ＨｐＥＴＥ、１７－ＨＥＴＥ、１１β－１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＦ２α、ＰＧＫ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１β、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＥ２、６－ケト－ＰＧＦ１α、ＴＸＢ２、５－ＨＥＴＥ、アラキドン酸（ＡＡ）、ｉＰＦ２α－ＩＶ、ＥＰＡ、４－ＨＤｏＨＥ、１０，１７－ＤｉＨＤｏＨＥおよびＰＧＤ３からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［１６］または［１７］に記載のアトピー性皮膚炎マーカー。
［１９］アトピー性皮膚炎の治療薬または緩和剤の候補を対象に投与する工程と、前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程とを含んでなる、アトピー性皮膚炎の治療薬または緩和剤のスクリーニング方法。
［２０］治療薬または緩和剤の候補の投与後の対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較する工程をさらに含む、上記［１９］に記載のスクリーニング方法。
［２１］治療薬または緩和剤の候補の投与後の対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、治療薬または緩和剤の候補の投与前の対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、あるいは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異ならない場合に、前記治療薬または緩和剤の候補に治療効果があることが示される、上記［１９］または［２０］に記載のスクリーニング方法。
［２２］生体試料中の脂質代謝物においてアトピー性皮膚炎マーカーを同定する方法であって、アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と、健常な対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程と、前記の測定した２つの濃度を比較する工程を含む方法。
［２３］アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、当該脂質代謝物がアトピー性皮膚炎マーカーであることが示される、上記［２２］に記載の同定方法。
［２４］対象の生体試料中の脂質代謝物の定量手段を含んでなる、アトピー性皮膚炎の検出用キットまたは診断用キット。
［２５］（Ａ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程と、（Ｂ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程と、（Ｃ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、対象がアトピー性皮膚炎に罹患していると決定する工程と、（Ｎ）アトピー性皮膚炎に罹患していると決定された対象に、アトピー性皮膚炎に対する治療を実施する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎の治療方法。
［１］対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎の検出方法または診断方法。
［２］前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程をさらに含む、上記［１］に記載の検出方法または診断方法。
［３］前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、対象がアトピー性皮膚炎に罹患していることが示される、上記［１］または［２］に記載の検出方法または診断方法。
［４］前記生体試料が体液である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の検出方法または診断方法。
［５］対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎に対する治療効果の判定方法。
［６］前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程をさらに含む、上記［５］に記載の判定方法。
［７］前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、治療前の対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、あるいは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異ならない場合に、治療効果があることが示される、上記［５］または［６］に記載の判定方法。
［８］アトピー性皮膚炎に対する治療が、薬物療法またはプロアクティブ療法である、上記［５］～［７］のいずれかに記載の判定方法。
［９］前記生体試料が体液である、上記［５］～［８］のいずれかに記載の判定方法。
［１０］前記脂質代謝物が、アラキドン酸代謝物、エイコサペンタエン酸代謝物およびドコサヘキサエン酸代謝物からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［１］～［４］のいずれかに記載の検出方法もしくは診断方法または上記［５］～［９］のいずれかに記載の判定方法。
［１１］前記脂質代謝物が、アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の濃度が健常な対象の生体試料中の濃度よりも高い傾向にあるものである、上記［１］～［４］および［１０］のいずれかに記載の検出方法もしくは診断方法または上記［５］～［１０］のいずれかに記載の判定方法。
［１２］前記脂質代謝物が、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＪ２、テトラノル－ＰＧＤＭ、２０－ヒドロキシ－ＰＧＥ２、１５－ケト－ＰＧＥ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＥ２、テトラノル－ＰＧＥＭ、１５－ケト－ＰＧＦ２α、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１α、テトラノル－ＰＧＦＭ、６，１５－ジケト－１３，１４－ジヒドロ－ＰＧＦ１α、５－ＨｐＥＴＥ、１７－ＨＥＴＥ、１１β－１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＦ２α、ＰＧＫ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１β、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＥ２、６－ケト－ＰＧＦ１αおよびＴＸＢ２からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［１１］に記載の検出方法もしくは診断方法または上記［１１］に記載の判定方法。
［１３］前記脂質代謝物が、アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の濃度が健常な対象の生体試料中の濃度よりも低い傾向にあるものである、上記［１］～［４］および［１０］のいずれかに記載の検出方法もしくは診断方法または上記［５］～［１０］のいずれかに記載の判定方法。
［１４］前記脂質代謝物が、５－ＨＥＴＥ、アラキドン酸（ＡＡ）、１１β－１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＦ２α、ｉＰＦ２α－ＩＶ、ＥＰＡ、４－ＨＤｏＨＥ、１０，１７－ＤｉＨＤｏＨＥおよびＰＧＤ３からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［１３］に記載の検出方法もしくは診断方法または上記［１３］に記載の判定方法。
［１５］前記脂質代謝物の濃度を質量分析法により測定する、上記［１］～［４］および［１０］～［１４］のいずれかに記載の検出方法もしくは診断方法または上記［５］～［１４］のいずれかに記載の判定方法。
［１６］脂質代謝物を含んでなる、アトピー性皮膚炎マーカー。
［１７］前記脂質代謝物が、アラキドン酸代謝物、エイコサペンタエン酸代謝物およびドコサヘキサエン酸代謝物からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［１６］に記載のアトピー性皮膚炎マーカー。
［１８］前記脂質代謝物が、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＪ２、テトラノル－ＰＧＤＭ、２０－ヒドロキシ－ＰＧＥ２、１５－ケト－ＰＧＥ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＥ２、テトラノル－ＰＧＥＭ、１５－ケト－ＰＧＦ２α、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１α、テトラノル－ＰＧＦＭ、６，１５－ジケト－１３，１４－ジヒドロ－ＰＧＦ１α、５－ＨｐＥＴＥ、１７－ＨＥＴＥ、１１β－１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＦ２α、ＰＧＫ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１β、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＥ２、６－ケト－ＰＧＦ１α、ＴＸＢ２、５－ＨＥＴＥ、アラキドン酸（ＡＡ）、ｉＰＦ２α－ＩＶ、ＥＰＡ、４－ＨＤｏＨＥ、１０，１７－ＤｉＨＤｏＨＥおよびＰＧＤ３からなる群から選択される１種または２種以上である、上記［１６］または［１７］に記載のアトピー性皮膚炎マーカー。
［１９］アトピー性皮膚炎の治療薬または緩和剤の候補を対象に投与する工程と、前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程とを含んでなる、アトピー性皮膚炎の治療薬または緩和剤のスクリーニング方法。
［２０］治療薬または緩和剤の候補の投与後の対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較する工程をさらに含む、上記［１９］に記載のスクリーニング方法。
［２１］治療薬または緩和剤の候補の投与後の対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、治療薬または緩和剤の候補の投与前の対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、あるいは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異ならない場合に、前記治療薬または緩和剤の候補に治療効果があることが示される、上記［１９］または［２０］に記載のスクリーニング方法。
［２２］生体試料中の脂質代謝物においてアトピー性皮膚炎マーカーを同定する方法であって、アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と、健常な対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程と、前記の測定した２つの濃度を比較する工程を含む方法。
［２３］アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、当該脂質代謝物がアトピー性皮膚炎マーカーであることが示される、上記［２２］に記載の同定方法。
［２４］対象の生体試料中の脂質代謝物の定量手段を含んでなる、アトピー性皮膚炎の検出用キットまたは診断用キット。
［２５］（Ａ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程と、（Ｂ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程と、（Ｃ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、対象がアトピー性皮膚炎に罹患していると決定する工程と、（Ｎ）アトピー性皮膚炎に罹患していると決定された対象に、アトピー性皮膚炎に対する治療を実施する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎の治療方法。
【0008】
本発明によれば、アトピー性皮膚炎やアトピー性皮膚炎に対する治療効果を被験対象の生体試料に基づいて定量的に検出できる点で有利である。また、被験対象の生体試料は非侵襲的に採取したものを用いることができる点でも有利である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図3】図３は、ＡＤモデルマウスのＤＮＦＢ処置前、１回目、２回目、３回目の刺激における皮膚炎スコアを示す。データは平均±標準誤差（ｎ＝８）で示す。＊＊Ｐ＜０．０１は処置前と比較した場合の有意差を示す。
【図4】図４は、ＡＤモデルマウスのＤＮＦＢ処置前、１回目、２回目、３回目の刺激におけるひっかき回数を示す。データは平均±標準誤差（ｎ＝８）で示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１はＤＮＦＢ処置前と比較した場合の有意差を示し、†Ｐ＜０．０５、††Ｐ＜０．０１は１回目の刺激と比較した場合の有意差を示す。
【図6】図６は、ＡＤモデルマウスのＤＮＦＢ処置前、１回目、２回目、３回目の刺激における背部の水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１はＤＮＦＢ処置前と比較した場合の有意差を示す。
【図8】図８は、ＨＥ染色画像から測定したＡＤモデルマウスの表皮肥厚を示す。データは平均±標準誤差（ｎ＝５－７）で示す。＊＊Ｐ＜０．０１はＤＮＦＢ処置前と比較した場合の有意差を示し、†Ｐ＜０．０５は１回目の刺激と比較した場合の有意差を示す。
【図10】図１０は、ＡＤモデルマウスのＤＮＦＢ処置前、１回目、３回目の刺激におけるＣＡＥ染色の画像から定量した肥満細胞数（Ａ）、好中球数（Ｂ）を示す。データは平均±標準誤差（ｎ＝５－７）で示す。＊＊Ｐ＜０．０１はＤＮＦＢ処置前と比較した場合の有意差を示す。
【図12】図１２は、ＡＤモデルマウスのＤＮＦＢ処置前、１回目、３回目の刺激におけるＭＧＧ染色の画像から定量した好酸球数を示す。データは平均±標準誤差（ｎ＝５－７）で示す。＊＊Ｐ＜０．０１はＤＮＦＢ処置前と比較した場合の有意差を示す。
【図13】図１３Ａ～Ｃは、ＡＤモデルマウス尿中に排泄されたＡＡ由来、ＣＯＸ下流のＰＧＤ２を経由した脂質メディエーターの量を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１はＤＮＦＢ処置前と比較した場合の有意差を示す。
【図14】図１４Ａ～Ｅは、ＡＤモデルマウス尿中に排泄されたＡＡ由来、ＣＯＸ下流のＰＧＥ２を経由した脂質メディエーターの量を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１はＤＮＦＢ処置前と比較した場合の有意差を示し、††Ｐ＜０．０１は１回目の刺激と比較した場合の有意差を示す。
【図15】図１５は、ＡＤモデルマウス尿中に排泄されたＡＡ由来、ＣＯＸ下流のＰＧＦ２αを経由した脂質メディエーターの量を示す。＊＊Ｐ＜０．０１はＤＮＦＢ処置前と比較した場合の有意差を示し、†Ｐ＜０．０５は１回目の刺激と比較した場合の有意差を示す。
【図16】図１６は、ＡＤモデルマウス尿中に排泄されたＡＡ由来、ＣＯＸ下流のＰＧＩ２を経由した脂質メディエーターの量を示す。＊Ｐ＜０．０５はＤＮＦＢ処置前と比較した場合の有意差を示し、†Ｐ＜０．０５は１回目の刺激と比較した場合の有意差を示す。
【図18】図１８ＡおよびＢは、ＡＤモデルマウス尿中に排泄されたＡＡ由来で、酵素非依存的酸化により産生する脂質メディエーターの量を示す。＊Ｐ＜０．０５はＤＮＦＢ処置前と比較した場合の有意差を示し、†Ｐ＜０．０５は１回目の刺激と比較した場合の有意差を示す。
【図19】図１９ＡおよびＢは、ＡＤモデルマウス尿中に排泄されたｎ－３系脂肪酸由来、ＬＯＸ下流の脂質メディエーターの産生量を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１はＤＮＦＢ処置前と比較した場合の有意差を示し、†Ｐ＜０．０５、††Ｐ＜０．０１は１回目の刺激と比較した場合の有意差を示す。
【図20】図２０Ａ～Ｄは、ＡＤモデルマウスの３回目のＤＮＦＢ刺激後の皮膚病変部から抽出したｃｏｘ－１（Ａ）、ｃｏｘ－２（Ｂ）、ｍｐｇｅｓ－１（Ｃ）、Ａｋｒ１ｂ３（Ｄ）、Ｔｘｓ（Ｅ）、Ｈ－ｐｇｄｓ（Ｆ）、ｍｐｇｅｓ－２（Ｇ）、ｃｐｇｅｓ（Ｈ）およびＬ－ｐｇｄｓ（Ｉ）のｍＲＮＡ発現量を示す。データは平均±標準誤差（各ｎ＝５－７）で示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１は対照（溶媒処理）と比較した場合の有意差を示す。
【図21】図２１は、ＡＤモデルマウスの皮膚病変部のＣＯＸ－１、ＣＯＸ－２、ｍＰＧＥＳ－１、ＡＫＲ１Ｂ３、溶媒（ビークル）、正常ヤギ血清、正常ウサギＩｇＧおよびＴＸＳの免疫染色画像の典型例を示す。スケールバーは５０μｍを示す。
【図22】図２２ＡおよびＢは、ＡＤ患者（ｎ＝１０－１４）の尿中に排泄されたＡＡ由来、ＣＯＸ下流のＰＧＤ２を経由した脂質メディエーターの量を示す。データは内部標準に対する比率であり平均値±標準誤差で示す。＊Ｐ＜０．０５は対照（各ｎ＝３－４）と比較した場合の有意差を示す。
【図23】図２３Ａ～Ｄは、ＡＤ患者（ｎ＝１０－１４）の尿中に排泄されたＡＡ由来、ＣＯＸ下流のＰＧＥ２を経由した脂質メディエーターの量を示す。データは内部標準に対する比率であり平均値±標準誤差で示す。＊Ｐ＜０．０５は対照（各ｎ＝３－４）と比較した場合の有意差を示す。
【図24】図２４Ａ～Ｃは、ＡＤ患者（ｎ＝１０－１４）の尿中に排泄されたＡＡ由来、ＣＯＸ下流のＰＧＦ２αを経由した脂質メディエーターの量を示す。データは内部標準に対する比率であり平均値±標準誤差で示す。＊Ｐ＜０．０５は対照（ｎ＝３－４）と比較した場合の有意差を示す。
【図25】図２５は、ＡＤ患者（ｎ＝１０－１４）の尿中に排泄されたＡＡ由来、ＣＯＸ下流のＰＧＩ２を経由した脂質メディエーターの量を示す。データは内部標準に対する比率であり平均値±標準誤差で示す。＊Ｐ＜０．０５は対照（ｎ＝３－４）と比較した場合の有意差を示す。
【図26】図２６ＡおよびＢは、ＡＤ患者（ｎ＝１０－１４）の尿中に排泄されたＡＡ由来、ＬＯＸ下流の脂質メディエーターの量を示す。データは内部標準に対する比率であり平均値±標準誤差で示す。＊Ｐ＜０．０５は対照（ｎ＝３－４）と比較した場合の有意差を示す。
【図27】図２７は、ＡＤ患者（ｎ＝１０－１４）の尿中に排泄されたＡＡ由来、ＣＹＰ下流の脂質メディエーターの量を示す。データは内部標準に対する比率であり平均値±標準誤差で示す。＊Ｐ＜０．０５は対照（ｎ＝３－４）と比較した場合の有意差を示す。
【図28】図２８は、ＡＤ患者（ｎ＝１０－１４）の尿中に排泄されたＡＡ、ＡＡの酵素非依存的酸化により生じた脂質メディエーターの量を示す。データは内部標準に対する比率であり平均値±標準誤差で示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１は対照（ｎ＝３－４）と比較した場合の有意差を示す。
【図29】図２９は、ＡＤ患者（ｎ＝１０－１４）の尿中に排泄されたＥＰＡの量を示す。データは内部標準に対する比率であり平均値±標準誤差で示す。＊Ｐ＜０．０５は対照（各ｎ＝３－４）と比較した場合の有意差を示す。
【図30】図３０ＡおよびＢは、ＡＤ患者（ｎ＝１０－１４）の尿中に排泄されたＤＨＡ由来でＬＯＸ下流の脂質メディエーターの量を示す。データは内部標準に対する比率であり平均値±標準誤差で示す。＊Ｐ＜０．０５は対照（各ｎ＝３－４）と比較した場合の有意差を示す。
【図31】図３１Ａは、テープストリッピング（Ｔａｐｅ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）処置を行ったマウス（非アレルギー性皮膚炎モデルマウス）を用いた実験を時系列で示す。図３１Ｂは、非アレルギー性皮膚炎モデルマウスの背部皮膚断片のＨＥ染色像の典型例を示す。スケールバーは５０μｍを示す。図３１Ｃは、ＨＥ染色画像から測定した非アレルギー性皮膚炎モデルマウスの表皮肥厚を示す。データは平均±標準誤差（ｎ＝４－７）で示す。図３１Ｄは、非アレルギー性皮膚炎モデルマウスの皮膚部から抽出したＴｓｌｐ、Ｉｌ－４、Ｉｌ－１３およびＣｃｌ１７のｍＲＮＡ発現量を示す。データは平均±標準誤差（ｎ＝４－７）で示す。図３１Ｅは、非アレルギー性皮膚炎モデルマウスの尿中に排出されたＡＡ由来、ＣＯＸ下流の脂質メディエーターの量を示す。データは内部標準に対する比率であり平均±標準誤差（ｎ＝４－７）で示す。＊Ｐ＜０．０５はテープストリッピング処置を行った日（０日）と比較した場合の有意差を示す。図３１Ｆは、非アレルギー性皮膚炎モデルマウスの皮膚部から抽出したＣｏｘ－２、ｍＰＧＥＳ－２、Ａｋｒ１Ｂ３およびＨ－ｐｇｄｓのｍＲＮＡ発現量を示す。データは平均±標準誤差（ｎ＝４－７）で示す。図３１Ｇは、非アレルギー性皮膚炎モデルマウスの皮膚部の免疫染色画像の典型例を示す（左：ＩＳＯ（アイソタイプ抗体による陰性対照）、右：ＡＫＲ１Ｂ３抗体）。スケールバーは５０μｍを示す。
【発明の具体的説明】
【0010】
本発明において「脂質代謝物」とは、生体において酵素依存的酸化または酵素非依存的酸化（本明細書中「ＯＸ」ということがある）による分解で生じた脂質の分解物を意味し、炎症反応を制御する生理作用を持った脂質メディエーターを包含する。酵素依存的酸化は、生体内に存在する脂質代謝酵素により進行する。当該酵素としては、アトピー性皮膚炎の発症および進展に関連する脂質代謝酵素（好ましくはアトピー性皮膚炎の発症および進展により活性化される脂質代謝酵素）が挙げられ、例えば、シクロオキシゲナーゼ（本明細書中「ＣＯＸ」ということがある）、リポキシゲナーゼ（本明細書中「ＬＯＸ」ということがある）（例えば、５－ＬＯＸ、１５―ＬＯＸ）、シトクロムｐ４５０（本明細書中「ＣＹＰ」ということがある）が挙げられる。また、酵素依存的酸化または酵素非依存的酸化により分解される脂質の例としては、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸が挙げられる。
【0011】
本発明において脂質代謝物の例としては、アラキドン酸代謝物、エイコサペンタエン酸代謝物およびドコサヘキサエン酸代謝物が挙げられる。脂質代謝物は、アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の濃度が健常な対象の生体試料中の濃度よりも高い（または上回る）傾向にあるもの（脂質代謝物Ｘ）と、アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の濃度が健常な対象の生体試料中の濃度よりも低い（または下回る）傾向にあるもの（脂質代謝物Ｙ）に分類できる。脂質代謝物Ｘの例としては、アラキドン酸のＣＯＸ代謝物（例えば、１１β－１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＦ２α（１１β－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ２α）、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＪ２（１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＪ２）、テトラノル－ＰＧＤＭ（ｔｅｔｒａｎｏｒ－Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）（本明細書中「テトラノル－ＰＧＤＭ」は、９－ヒドロキシ－１１，１５－ジオキソ－１３，１４－ジヒドロ－２，３，４，５－テトラノル－プロスタン－１，２０－ジオイック酸（９－ｈｙｄｒｏｘｙ－１１，１５－ｄｉｏｘｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－２，３，４，５－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ｐｒｏｓｔａｎ－１，２０－ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）である）、２０－ヒドロキシ－ＰＧＥ２（２０－ｈｙｄｒｏｘｙ－ＰＧＥ２）、１５－ケト－ＰＧＥ２（１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＥ２）、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＥ２（１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥ２）、テトラノル－ＰＧＥＭ（ｔｅｔｒａｎｏｒ－Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）（本明細書中「テトラノル－ＰＧＥＭ」は、９，１５－ジオキソ－１１－ヒドロキシ－１３，１４－ジヒドロ－２，３，４，５－テトラノル－プロスタン－１，２０－ジオイック酸（９，１５－ｄｉｏｘｏ－１１－ｈｙｄｒｏｘｙ－１３、１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－２，３，４，５－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ｐｒｏｓｔａｎ－１，２０－ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）である）、１５－ケト－ＰＧＦ２α（１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ２α）、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１α（１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦ１α）、テトラノル－ＰＧＦＭ（ｔｅｔｒａｎｏｒ－Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）（本明細書中「テトラノル－ＰＧＦＭ」は、９α，１１－ジヒドロキシ－１５－オキソ－１３，１４－ジヒドロ－２，３，４，５－テトラノル－プロスタン－１，２０－ジオイック酸（９α，１１－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－１５－ｏｘｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－２，３，４，５－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ｐｒｏｓｔａｎ－１，２０－ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）である）、６，１５－ジケト－１３，１４－ジヒドロ－ＰＧＦ１α（６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－ＰＧＦ１α）、ＰＧＫ２、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１β（１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦ１β）、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＥ２（１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＥ２）、６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α、ＴＸＢ２、アラキドン酸のＬＯＸ代謝物（例えば、５－ＨｐＥＴＥのようなアラキドン酸の５－ＬＯＸ代謝物）、アラキドン酸のＣＹＰ代謝物（例えば、１７－ＨＥＴＥ）、アラキドン酸のＯＸ代謝物（例えば、８－ｉｓｏ－１５（Ｒ）－ＰＧＦ２α）が挙げられ、好ましくはアトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の濃度が健常な対象の生体試料中の濃度よりも有意に高いという特徴を有するものが挙げられる。また、脂質代謝物Ｙの例としては、ＡＡ、アラキドン酸のＣＯＸ代謝物（例えば、１１β－１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＦ２α）、アラキドン酸のＬＯＸ代謝物（例えば、５－ＨＥＴＥのようなアラキドン酸の５－ＬＯＸ代謝物）、アラキドン酸のＯＸ代謝物（例えば、ｉＰＦ２α－ＩＶ）、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸のＬＯＸ代謝物（例えば、４－ＨＤｏＨＥのようなドコサヘキサエン酸の５－ＬＯＸ代謝物および１０，１７－ＤｉＨＤｏＨＥのようなドコサヘキサエン酸の１５－ＬＯＸ代謝物）、エイコサペンタエン酸のＣＯＸ代謝物（例えば、ＰＧＤ３のようなエイコサペンタエン酸のＣＯＸ代謝物）が挙げられ、好ましくはアトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の濃度が健常な対象の生体試料中の濃度よりも有意に低いという特徴を有するものが挙げられる。
【0012】
本発明において「アトピー性皮膚炎」は、増悪と軽快を繰り返す、掻痒のある湿疹を主病変とする疾患を意味し、患者の多くはアトピー素因（アレルギー体質）を持つ。特徴的な左右対称性の分布を示す湿疹性の疾患であり、年齢により好発部位が異なり、乳児期あるいは幼児期から発症し小児期に寛解するか、あるいは寛解することなく再発を繰り返し、症状が成人まで持続する特徴的な湿疹病変が慢性的にみられる（アトピー性皮膚炎診療ガイドライン２０１８）。
【0013】
本発明において「生体試料」は、生体から分離された試料を意味し、例えば尿、血液、唾液、鼻汁、汗、涙、糞便などの体液である。生体試料の採取方法は侵襲的であっても非侵襲的であってもよく、被験対象に応じて選択することができる。
【0014】
本発明における「対象」は、ヒトのみならず、ヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ）を含む意味で用いられる。
【0015】
本発明の第一の側面によれば、アトピー性皮膚炎の検出方法が提供される。本発明の検出方法によれば、生体試料中の脂質代謝物を指標にしてアトピー性皮膚炎検出することができる。
【0016】
本発明の検出方法においては、まず、（Ａ）被験対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を実施する。脂質代謝物の濃度の測定は、公知の方法により実施することができ、例えば、質量分析法や、ＥＬＩＳＡ法およびイムノクロマト法等のイムノアッセイにより脂質代謝物の濃度を測定することができる。質量分析法の例としては、液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー法（ＬＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－タンデムマススペクトロメトリー法（ＬＣ－ＭＳＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー法（ＨＰＬＣ－ＭＳ）および高速液体クロマトグラフィー－タンデムマススペクトロメトリー法（ＨＰＬＣ－ＭＳＭＳ）が挙げられる。イムノアッセイは、検出可能に標識した抗脂質代謝物抗体、または検出可能に標識した、抗脂質代謝物抗体に対する抗体（二次抗体）を用いる分析法である。抗体の標識法により、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）等に分類され、これらのいずれも本発明に用いることができる。構造が類似した脂質代謝物の濃度を正確に測定する観点から、質量分析法（特に、ＬＣ－ＭＳＭＳおよびＨＰＬＣ－ＭＳＭＳ）による測定が好ましい。
【0017】
本発明の検出方法においては、前記工程（Ａ）で測定された脂質代謝物の濃度に基づいて、生体試料を採取した対象についてアトピー性皮膚炎の有無を決定する工程をさらに実施することができる。この工程では、（Ｂ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程を含んでいてもよい。ここで、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、対象がアトピー性皮膚炎に罹患していることが示される。すなわち、本発明の検出方法は、（Ｃ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、対象がアトピー性皮膚炎に罹患していると決定する工程をさらに含んでいてもよい。工程（Ｃ）の「有意に異なる」とは、脂質代謝物によって健常な対象の濃度よりも高いか、低い場合のいずれかであり、例えば、脂質代謝物が脂質代謝物Ｘの場合には、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度よりも高いこと、好ましくは有意に高いこと（例えば、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較して統計学的に有意に高いか、あるいはその約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上、約２．５倍以上または約３倍以上であること）を意味し、脂質代謝物が脂質代謝物Ｙの場合には、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度よりも低いこと、好ましくは有意に低いこと（例えば、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較して統計学的に有意に低いか、あるいはその約０．９倍以下、約０．８倍以下、約０．７倍以下、約０．６倍以下、約０．５倍以下、約０．４倍以下または約０．３倍以下であること）を意味する。健常な対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度は、事前に複数の健常な対象から生体試料を採取して脂質代謝物濃度を測定して算出した平均値を用いることができる。また、「アトピー性皮膚炎に罹患している」とは、罹患している可能性がある場合も含む意味で用いられるものとする。
【0018】
本発明の検出方法によれば、対象についてアトピー性皮膚炎を検出することができる。従って、本発明の検出方法は、アトピー性皮膚炎の診断に補助的に用いることができ、対象がアトピー性皮膚炎に罹っているか否かの判断は、場合によっては他の所見と組み合わせて、最終的には医師または獣医師が行うことができる。
【0019】
本発明の検出方法によれば、被験対象から採取された生体試料に基づいて定量的にアトピー性皮膚炎の検出を行うことができる。すなわち、本発明の検出方法は、患者への負担を軽減しつつ、簡便かつ的確にアトピー性皮膚炎を検出できる点で有利である。本発明の検出方法によればまた、採尿等の非侵襲的な方法により採取された生体試料に基づいて検出を行うことができることから、採血等の侵襲的な方法によってアトピー性皮膚炎を検出することが難しい対象、例えば、子供（乳幼児を含む）のように採血することが容易ではない対象に適用することができる点でも有利である。
【0020】
本発明の別の側面によればまた、アトピー性皮膚炎の診断方法が提供される。本発明の診断方法によれば、生体試料中の脂質代謝物を指標にして対象がアトピー性皮膚炎に罹患しているか否かを診断することができる。本発明の診断方法においては、本発明の検出方法と同様に、（Ａ’）被験対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を実施する。本発明の診断方法においては、（Ｂ’）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程をさらに含んでもよく、（Ｃ’）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、対象がアトピー性皮膚炎に罹患していると決定する工程をさらに含んでいてもよい。前記工程（Ａ’）、（Ｂ’）および（Ｃ’）は、前記工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）にそれぞれ対応し、本発明の検出方法の記載に従って実施することができる。
【0021】
本発明の第二の側面によれば、アトピー性皮膚炎に対する治療効果の判定方法が提供される。本発明の判定方法によれば、生体試料中の脂質代謝物を指標にしてアトピー性皮膚炎に対する治療効果を判定することができる。
【0022】
本発明の判定方法においては、本発明の検出方法と同様に、（Ｄ）被験対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を実施する。脂質代謝物の濃度の測定は、本発明の検出方法と同様に行うことができる。
【0023】
本発明の判定方法においては、前記工程（Ｄ）で測定された脂質代謝物の濃度に基づいて、治療を受けた対象についてアトピー性皮膚炎に対する治療効果を決定する工程をさらに実施することができる。この工程では、（Ｅ）アトピー性皮膚炎に対する治療を受けた対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程を含んでいてもよい。ここで、アトピー性皮膚炎に対する治療を受けた対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、治療前の対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、あるいは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異ならない場合に、治療効果があることが示される。すなわち、本発明の判定方法は、（Ｆ）アトピー性皮膚炎に対する治療を受けた対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、治療前の対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に（好ましくは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度に近づく方向で有意に異なる場合に）、あるいは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異ならない場合に、治療効果があると決定する工程をさらに含んでいてもよい。工程（Ｆ）の「有意に異なる」とは、脂質代謝物によって治療前の対象またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の濃度よりも高いか、低い場合のいずれかであり、例えば、脂質代謝物が脂質代謝物Ｘの場合には、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が治療前の対象またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度よりも低いこと、好ましくは有意に低いこと（例えば、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が治療前の対象またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較して統計学的に有意に低いか、あるいはその約０．９倍以下、約０．８倍以下、約０．７倍以下、約０．６倍以下、約０．５倍以下、約０．４倍以下または約０．３倍以下であること）を意味し、脂質代謝物が脂質代謝物Ｙの場合には、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が治療前の対象またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度よりも高いこと、好ましくは有意に高いこと（例えば、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が治療前の対象またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較して統計学的に有意に高いか、あるいはその約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上、約２．５倍以上または約３倍以上であること）を意味する。また、工程（Ｆ）の「有意に異ならない」とは、脂質代謝物Ｘおよび脂質代謝物Ｙのいずれについても、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と同等であること（例えば、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較して統計学的に有意に異ならないか、あるいはその約０．８倍を超え約１．２倍未満であること、または約０．９倍を超え約１．１倍未満であること）を意味する。治療前の対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度は、治療前に対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定して得た値を用いることができる。アトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度は、事前に複数のアトピー性皮膚炎に罹った対象から生体試料を採取して脂質代謝物濃度を測定して算出した平均値を用いることができる。また、健常な対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度は、事前に複数の健常な対象から生体試料を採取して脂質代謝物濃度を測定して算出した平均値を用いることができる。なお、本発明の判定方法において治療を受ける対象は、好ましくはアトピー性皮膚炎に罹った対象である。また、本発明において「アトピー性皮膚炎に罹った対象」は、他の検査方法の結果がアトピー性皮膚炎を示している対象であればよく、好ましくは医師または獣医師によりアトピー性皮膚炎を発症しているとの診断を受けた対象とすることができる。
【0024】
本発明の判定方法によって治療効果を判定できるアトピー性皮膚炎に対する治療としては、例えば、薬物療法、プロアクティブ療法が挙げられる。薬物療法としては、アトピー性皮膚炎の治療薬による治療が挙げられ、そのような治療薬の例としては、抗炎症外用薬（ステロイド外用薬、タクロリムス、非ステロイド性抗炎症薬）、抗ヒスタミン薬、シクロスポリン、ステロイド内服薬、漢方薬、抗体医薬等の医薬品が挙げられる。
【0025】
本発明の判定方法によれば、アトピー性皮膚炎に対する治療を受けた対象において、当該治療効果を判定することができるため、対象に対して行ったアトピー性皮膚炎に対する治療の有効性を検証することができる。そして、治療効果が認められない場合には直ちにその治療を中止し、別の治療計画を立てることができる。従って、本発明の判定方法は、無駄な投薬を抑制することができ、ひいては医療費削減や患者負担軽減に資することができる点で有利である。本発明の判定方法によればまた、採尿等の非侵襲的な方法により採取された生体試料に基づいて検出を行うことができることから、採血等の侵襲的な方法によって当該治療効果を判定することが難しい対象、例えば、子供（乳幼児を含む）や動物（例えば、イヌ、ネコ等の愛玩動物）のように採血することが容易ではない対象に適用することができる点でも有利である。
【0026】
本発明の第三の側面によれば、脂質代謝物を含んでなる、アトピー性皮膚炎マーカーと、アトピー性皮膚炎マーカーとしての脂質代謝物の使用が提供される。本発明において「アトピー性皮膚炎マーカー」は、その存在および量がアトピー性皮膚炎の発症の有無やその症状の重篤度の指標となる物質をいい、アトピー性皮膚炎を検出、識別、評価等するためのマーカーとして用いることができる。すなわち、本発明によれば、脂質代謝物をアトピー性皮膚炎の疾患識別マーカーとして使用することができるとともに、脂質代謝物をアトピー性皮膚炎の重篤度の評価に使用することができる。
【0027】
本発明の判定方法は、アトピー性皮膚炎の治療薬の有効性の判定に用いることができるため、本発明によればアトピー性皮膚炎の治療薬または緩和剤のスクリーニング方法も提供される。すなわち、本発明の第四の側面によれば、（Ｇ）アトピー性皮膚炎の治療薬または緩和剤の候補を対象に投与する工程と、（Ｈ）前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程とを含んでなる、アトピー性皮膚炎の治療薬または緩和剤のスクリーニング方法が提供される。本発明のスクリーニング方法においては、前記工程（Ｈ）で測定された脂質代謝物の濃度に基づいて、治療薬または緩和剤の候補の治療効果の有無を決定する工程をさらに実施することができる。この工程では、（Ｉ）治療薬または緩和剤の候補の投与後の対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程を含んでいてもよい。ここで、治療薬または緩和剤の候補の投与後の対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、治療薬または緩和剤の候補の投与前の対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、あるいは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異ならない場合に、前記治療薬または緩和剤の候補に治療効果があることが示される。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、（Ｊ）治療薬または緩和剤の候補の投与後の対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、治療薬または緩和剤の候補の投与前の対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に（好ましくは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度に近づく方向で有意に異なる場合に）、あるいは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異ならない場合に、治療効果があると決定する工程をさらに含んでいてもよく、それにより治療効果がある候補を選択することができる。工程（Ｊ）の「有意に異なる」とは、脂質代謝物によって治療薬または緩和剤の候補の投与前の対象またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の濃度よりも高いか、低い場合のいずれかであり、例えば、脂質代謝物が脂質代謝物Ｘの場合には、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が治療薬または緩和剤の候補の投与前の対象またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度よりも低いこと、好ましくは有意に低いこと（例えば、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が治療薬または緩和剤の候補の投与前の対象またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較して統計学的に有意に低いか、あるいはその約０．９倍以下、約０．８倍以下、約０．７倍以下、約０．６倍以下、約０．５倍以下、約０．４倍以下または約０．３倍以下であること）を意味し、脂質代謝物が脂質代謝物Ｙの場合には、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が治療薬または緩和剤の候補の投与前の対象またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度よりも高いこと、好ましくは有意に高いこと（例えば、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が治療薬または緩和剤の候補の投与前の対象またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較して統計学的に有意に高いか、あるいはその約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上、約２．５倍以上または約３倍以上であること）を意味する。また、工程（Ｊ）の「有意に異ならない」とは、脂質代謝物Ｘおよび脂質代謝物Ｙのいずれについても、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と同等であること（例えば、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較して統計学的に有意に異ならないか、あるいはその約０．８倍を超え約１．２倍未満であること、または約０．９倍を超え約１．１倍未満であること）を意味する。本発明のスクリーニング方法は、本発明の検出方法および判定方法の記載に従って実施することができる。本発明のスクリーニング方法において治療薬または緩和剤の候補を投与される対象は、好ましくはアトピー性皮膚炎に罹った対象である。本発明のスクリーニング方法を実施する場合には、対象はヒト以外の哺乳動物を用いることができる。本発明のスクリーニング方法の対象となるアトピー性皮膚炎の治療薬は、本発明の判定方法で述べたものと同様である。また、本発明のスクリーニング方法の対象となるアトピー性皮膚炎の緩和剤としては、アトピー性皮膚炎の症状の緩和機能を有する食品（例えば、食品組成物）、医薬部外品（例えば、薬用化粧品）、飼料（例えば、ペットフード）、化粧品（例えば、化粧組成物）、スキンケア組成物が挙げられ、前記食品には、サプリメント、特定保健用食品、機能性表示食品が含まれる。また、「緩和」は改善を含む意味で用いられる。
【0028】
本発明の第五の側面によれば、（Ｋ）アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と、健常な対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程と、（Ｌ）前記の測定した２つの濃度を比較する工程とを含んでなる、生体試料中の脂質代謝物においてアトピー性皮膚炎マーカーを同定する方法が提供される。本発明の同定方法においては、前記工程（Ｌ）で行った濃度の比較結果に基づいて、脂質代謝物をアトピー性皮膚炎マーカーと決定する工程をさらに実施することができる。この工程では、アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、当該脂質代謝物がアトピー性皮膚炎マーカーであることが示される。すなわち、本発明の同定方法は、（Ｍ）アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、当該脂質代謝物がアトピー性皮膚炎マーカーであると決定する工程をさらに含んでいてもよい。工程（Ｍ）の「有意に異なる」とは、脂質代謝物によって健常な対象の濃度よりも高いか、低い場合のいずれかであり、例えば、脂質代謝物が脂質代謝物Ｘの場合には、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度よりも高いこと、好ましくは有意に高いこと（例えば、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較して統計学的に有意に高いか、あるいはその約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上、約２．５倍以上または約３倍以上であること）を意味し、脂質代謝物が脂質代謝物Ｙの場合には、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度よりも低いこと、好ましくは有意に低いこと（例えば、対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と比較して統計学的に有意に低いか、あるいはその約０．９倍以下、約０．８倍以下、約０．７倍以下、約０．６倍以下、約０．５倍以下、約０．４倍以下または約０．３倍以下であること）を意味する。本発明の同定方法は、本発明の検出方法および判定方法の記載に従って実施することができる。
【0029】
本発明の検出方法によりアトピー性皮膚炎が検出された対象あるいは本発明の診断方法によりアトピー性皮膚炎と診断された対象に対しては、アトピー性皮膚炎に対する治療を実施することができる。従って、本発明の第六の側面によれば、（Ａ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程と、（Ｂ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程と、（Ｃ）対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、対象がアトピー性皮膚炎に罹患していると決定する工程と、（Ｎ）アトピー性皮膚炎に罹患していると決定された対象に、アトピー性皮膚炎に対する治療を実施する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎の治療方法が提供される。本発明の治療方法のうちアトピー性皮膚炎の検出工程および決定工程（すなわち、工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ））は、本発明の検出方法の記載および本発明の診断方法に従って実施することができる。またアトピー性皮膚炎に対する治療は、本発明の判定方法の記載に従って実施することができる。
【0030】
本発明の第七の側面によれば、対象の生体試料中の脂質代謝物の定量手段を含んでなる、アトピー性皮膚炎の検出用キットが提供される。本発明のキットは、典型的には、本発明の検出方法に従ってアトピー性皮膚炎を検出するためのキットである。脂質代謝物の定量手段としては、例えば、該脂質代謝物に特異的に結合する物質が挙げられ、典型的には脂質代謝物に対する抗体である。脂質代謝物の定量手段としてはまた、前記のような質量分析法に使用する質量分析計が挙げられる。
【0031】
本発明のキットにおいて、脂質代謝物の定量手段が抗体である場合には、本発明のキットは該抗体を利用するイムノアッセイにより脂質代謝物の濃度を測定するために必要な試薬（および場合によっては装置）を含むものである。
【0032】
本発明のキットの例としては、サンドイッチ法によって脂質代謝物の濃度を測定するキットが挙げられ、該キットは、マイクロタイタープレートと、捕捉用の抗脂質代謝物抗体と、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼで標識した抗脂質代謝物抗体と、アルカリホスファターゼの基質またはペルオキシダーゼの基質とを含んでいてもよい。
【0033】
本発明のキットの例としてはまた、二次抗体を使用したサンドイッチ法によって脂質代謝物の濃度を測定するキットが挙げられ、該キットは、マイクロタイタープレートと、捕捉用の抗脂質代謝物抗体と、一次抗体としての抗脂質代謝物抗体と、二次抗体としての、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼで標識した抗脂質代謝物抗体に対する抗体と、アルカリホスファターゼの基質またはペルオキシダーゼの基質とを含んでいてもよい。
【0034】
上記キットは、例えば、以下のようにして使用することができる。まず、マイクロタイタープレートに捕捉用抗体を固定し、ここに対象の生体試料を適宜希釈して添加した後インキュベートし、該試料を除去して洗浄する。続いて、一次抗体を添加してインキュベートおよび洗浄を行い、さらに酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行った後、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、脂質代謝物の濃度を求めることができる。
【0035】
本発明のキットにおいて、標識抗体は、酵素標識した抗体に限定されず、放射性物質（２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等）、発光物質（ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等）、ナノ粒子（金コロイド、量子ドット）等で標識した抗体であってもよい。また、標識抗体としてビオチン化抗体を用い、標識したアビジンまたはストレプトアビジンをキットに加えることもできる。
【0036】
本発明のキットの例としてはさらに、イムノクロマト法によって脂質代謝物の濃度を測定するキットが挙げられ、該キットは、金コロイドなどで標識した第１の抗脂質代謝物抗体が格納された抗体格納部と、第２の抗脂質代謝物抗体（好ましくは脂質代謝物の別のエピトープを認識する抗体）をセルロース膜などにライン状に固定した判定部とが細い溝でつながれた構成とすることができる。
【0037】
上記キットは、例えば、以下のようにして使用することができる。まず、抗体格納部あるいは抗体格納部に隣接する生体試料受部に生体試料を添加すると、抗体格納部で標識抗体と脂質代謝物が結合して脂質代謝物－標識抗体複合体となり、当該複合体が毛細管現象により溝を通って判定部に移動する。続いて、当該複合体が、固定された第２の抗脂質代謝物抗体に捕捉されると、金コロイドのプラズモン効果により、赤色のラインが判定部に出現し、脂質代謝物の存在を検出することができる。この場合のキットは検査用スティック等のスティック状の形態で提供することができ、該検査用スティックは生体試料を吸収するための吸収紙や、乾燥剤等をさらに備えていてもよい。
【0038】
本発明のキットにおいて、脂質代謝物の定量手段が質量分析計である場合には、本発明のキットは質量分析計に加えて、場合によっては内部標準装置を含むものである。内部標準を用いることにより質量分析器による測定の際に、分析毎の抽出効率およびイオン化効率を補正することができる。質量分析に使用する内部標準としては、重水素化脂質代謝物が挙げられる。
【0039】
本発明のキットは、上記に加えて、本発明の検出方法および判定方法の記載に従って実施することができる。
【実施例0040】
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【0041】
例１：アトピー性皮膚炎モデルマウスの作製
手順は、図１に示す通りである。ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウス（雄、７－８週齢）（日本クレア）を麻酔下にてバリカンおよび除毛クリームを用いてマウスの背部の毛を除毛し３日間馴化した。その後、０．５％ＤＮＦＢ（２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ、ナカライテスク）混合液（アセトン（富士フイルム和光純薬）：オリーブ（富士フイルム和光純薬）、４：１）をマウス背中上部に２５μＬ滴下して感作を行った（１日目）。その４日後、０．２％ＤＮＦＢ混合液（アセトン：オリーブ、４：１）をマウスの右耳に２０μＬ、背中下部に１００μＬ滴下して１回目の刺激を行った。この刺激の操作を３日おきに計３回繰り返し（１回目：５日目、２回目：８日目、３回目：１１日目）、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）モデルマウスを作製した。
手順は、図１に示す通りである。ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウス（雄、７－８週齢）（日本クレア）を麻酔下にてバリカンおよび除毛クリームを用いてマウスの背部の毛を除毛し３日間馴化した。その後、０．５％ＤＮＦＢ（２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ、ナカライテスク）混合液（アセトン（富士フイルム和光純薬）：オリーブ（富士フイルム和光純薬）、４：１）をマウス背中上部に２５μＬ滴下して感作を行った（１日目）。その４日後、０．２％ＤＮＦＢ混合液（アセトン：オリーブ、４：１）をマウスの右耳に２０μＬ、背中下部に１００μＬ滴下して１回目の刺激を行った。この刺激の操作を３日おきに計３回繰り返し（１回目：５日目、２回目：８日目、３回目：１１日目）、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）モデルマウスを作製した。
【0042】
例２：アトピー性皮膚炎の症状の評価
例１で作製したＡＤモデルマウスの症状を評価した。
例１で作製したＡＤモデルマウスの症状を評価した。
【0043】
（１）皮膚病態の観察
ＡＤモデルマウスの皮膚病態の経時変化は、図２に示す通りであった。ＡＤモデルマウス背部の炎症状態が１回目の刺激から３回目の刺激にかけて悪化する状態が確認された。
ＡＤモデルマウスの皮膚病態の経時変化は、図２に示す通りであった。ＡＤモデルマウス背部の炎症状態が１回目の刺激から３回目の刺激にかけて悪化する状態が確認された。
【0044】
（２）病態スコア
結果は、図３に示す通りであった。ヒトのＡＤの診断指標であるＳＣＯＲＡＤ（Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｓｃｏｒｉｎｇ ｏｆ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）を基準にして、ＤＮＦＢ処置前、刺激１回目、２回目、３回目のＡＤモデルマウスの背部の皮膚病変部の病態スコアを算出した。ＳＣＯＲＡＤは、紅班、出血、浮腫、丘疹、表皮剥離、糜爛、引っ掻き痕、乾燥、苔癬化などの指標から構成され、それぞれの症状の程度に伴いスコア（０：なし、１：軽症、２：中等症、３：重症）を算出し、最大スコアは１２点となる。ＤＮＦＢ処置前と比較して、刺激２回目、３回目においてスコアが有意に増加することが確認された。
結果は、図３に示す通りであった。ヒトのＡＤの診断指標であるＳＣＯＲＡＤ（Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｓｃｏｒｉｎｇ ｏｆ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）を基準にして、ＤＮＦＢ処置前、刺激１回目、２回目、３回目のＡＤモデルマウスの背部の皮膚病変部の病態スコアを算出した。ＳＣＯＲＡＤは、紅班、出血、浮腫、丘疹、表皮剥離、糜爛、引っ掻き痕、乾燥、苔癬化などの指標から構成され、それぞれの症状の程度に伴いスコア（０：なし、１：軽症、２：中等症、３：重症）を算出し、最大スコアは１２点となる。ＤＮＦＢ処置前と比較して、刺激２回目、３回目においてスコアが有意に増加することが確認された。
【0045】
（３）ひっかき回数
結果は、図４に示す通りであった。ＤＮＦＢ処置前、刺激１回目、２回目、３回目の各回の処置１時間後におけるＡＤモデルマウスのひっかき回数を目視で１０分間計測した。ひっかきは後ろ足で引っかいたものをひっかきとした。ＤＮＦＢ処置前と比較して、刺激１回目、２回目、３回目のいずれにおいてもスコアが有意に増加することが確認された。
結果は、図４に示す通りであった。ＤＮＦＢ処置前、刺激１回目、２回目、３回目の各回の処置１時間後におけるＡＤモデルマウスのひっかき回数を目視で１０分間計測した。ひっかきは後ろ足で引っかいたものをひっかきとした。ＤＮＦＢ処置前と比較して、刺激１回目、２回目、３回目のいずれにおいてもスコアが有意に増加することが確認された。
【0046】
（４）耳の厚さ
結果は、図５に示す通りであった。ＡＤモデルマウスの耳の厚さはＡＢＳソーラー式デジマチックキャリパ（ミツトヨ）を使用して測定し、グラフの値はＤＮＦＢ処置前と各回の刺激の２４時間後の耳の厚さの差から算出した。
結果は、図５に示す通りであった。ＡＤモデルマウスの耳の厚さはＡＢＳソーラー式デジマチックキャリパ（ミツトヨ）を使用して測定し、グラフの値はＤＮＦＢ処置前と各回の刺激の２４時間後の耳の厚さの差から算出した。
【0047】
（５）水分蒸散量（ＴＥＷＬ ｇ／（ｍ２・ｈ））
結果は、図６に示す通りであった。ＡＤモデルマウスの背部の水分蒸散量はマルチディスプレイデバイスＭＤＤ４（Courage+Khazaka）を使用して測定した。
結果は、図６に示す通りであった。ＡＤモデルマウスの背部の水分蒸散量はマルチディスプレイデバイスＭＤＤ４（Courage+Khazaka）を使用して測定した。
【0048】
（６）統計処理
例２～例７において、測定値は平均値±標準誤差で表し、すべての実験は少なくとも３回行った。統計学的解析はＥｘｃｅｌ２０１５用のＢｅｌｌＣｕｒｖｅソフトウェア（社会情報サービス）を用いて行った。有意差検定は、２群比較はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔまたはＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔによって行った。また、多群比較はｏｎｅ－ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）とＴｕｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔの併用またはＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔとＳｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ ｔｅｓｔの併用により行った。統計学的有意差は＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１として定義した。
例２～例７において、測定値は平均値±標準誤差で表し、すべての実験は少なくとも３回行った。統計学的解析はＥｘｃｅｌ２０１５用のＢｅｌｌＣｕｒｖｅソフトウェア（社会情報サービス）を用いて行った。有意差検定は、２群比較はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔまたはＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔによって行った。また、多群比較はｏｎｅ－ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）とＴｕｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔの併用またはＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔとＳｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ ｔｅｓｔの併用により行った。統計学的有意差は＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１として定義した。
【0049】
例３：アトピー性皮膚炎の病理組織学的評価
例１で作製したＡＤモデルマウスの皮膚病変部の病理組織学的評価を行った。
（１）手順
切除した皮膚病変部は、４％パラホルムアルデヒドに２４時間固定し、パラフィンに包埋し、厚さ４μｍの組織切片を作製した。前記組織切片は、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）、クロロアセテート・エステラーゼ（ＣＡＥ）またはメイグリュンワルド・ギムザ（ＭＧＧ）にて常法に従い染色した。具体的な染色手順は、後記の通りである。染色した皮膚病変部組織をＢＺ－Ｘ７１０顕微鏡（キーエンス）を用いて観察、撮影した。ＣＡＥ陽性の肥満細胞、好中球およびＭＧＧ陽性の好酸球の数を、１視野あたり１０個の無作為に選択された区画内（倍率×４００）で計測した。
例１で作製したＡＤモデルマウスの皮膚病変部の病理組織学的評価を行った。
（１）手順
切除した皮膚病変部は、４％パラホルムアルデヒドに２４時間固定し、パラフィンに包埋し、厚さ４μｍの組織切片を作製した。前記組織切片は、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）、クロロアセテート・エステラーゼ（ＣＡＥ）またはメイグリュンワルド・ギムザ（ＭＧＧ）にて常法に従い染色した。具体的な染色手順は、後記の通りである。染色した皮膚病変部組織をＢＺ－Ｘ７１０顕微鏡（キーエンス）を用いて観察、撮影した。ＣＡＥ陽性の肥満細胞、好中球およびＭＧＧ陽性の好酸球の数を、１視野あたり１０個の無作為に選択された区画内（倍率×４００）で計測した。
【0050】
（２）クロロアセテート・エステラーゼ（ＣＡＥ）染色
ＣＡＥ染色は、ナフトールＡＳ－Ｄクロロアセテートを基質にして肥満細胞、好中球に特異的なエステラーゼを赤色に染める染色法である。上記（１）で作製した組織切片標本を脱パラフィン処理後、染色に用いた。４％の亜硝酸ナトリウム溶液とニューフクシン液を１：１で混合した後、この溶液とナフトール液を１：９の割合で混合した。この溶液とリン酸バッファー（０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４ ０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ７．６）を１：２０の割合で混合し、切片を１０分間浸漬した。切片を蒸留水で洗浄後、ヘマトキシリン溶液を用いて対比染色を行った。１ｍｍ２内の肥満細胞、好中球数を計測し、平均値および標準偏差を算出した。
ＣＡＥ染色は、ナフトールＡＳ－Ｄクロロアセテートを基質にして肥満細胞、好中球に特異的なエステラーゼを赤色に染める染色法である。上記（１）で作製した組織切片標本を脱パラフィン処理後、染色に用いた。４％の亜硝酸ナトリウム溶液とニューフクシン液を１：１で混合した後、この溶液とナフトール液を１：９の割合で混合した。この溶液とリン酸バッファー（０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４ ０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ７．６）を１：２０の割合で混合し、切片を１０分間浸漬した。切片を蒸留水で洗浄後、ヘマトキシリン溶液を用いて対比染色を行った。１ｍｍ２内の肥満細胞、好中球数を計測し、平均値および標準偏差を算出した。
【0051】
（３）メイグリュンワルド・ギムザ（ＭＧＧ）染色
メイグリュンワルド・ギムザ染色は、好酸球に特異的な好酸性顆粒を赤色に染色する。上記（１）で作製した組織切片標本を脱パラフィン処理後、メイグリュンワルド染色液に切片を６分間浸漬した。次いで、１／１５Ｍ－リン酸緩衝液（×１０）（０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４ ０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ６．４～６．８）で切片を洗浄後、ギムザ染色液と蒸留水を１：２０の割合で混合した溶液に切片を５分間浸漬した。１ｍｍ２内の好酸球数を計測し、平均値および標準偏差を算出した。
メイグリュンワルド・ギムザ染色は、好酸球に特異的な好酸性顆粒を赤色に染色する。上記（１）で作製した組織切片標本を脱パラフィン処理後、メイグリュンワルド染色液に切片を６分間浸漬した。次いで、１／１５Ｍ－リン酸緩衝液（×１０）（０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４ ０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ６．４～６．８）で切片を洗浄後、ギムザ染色液と蒸留水を１：２０の割合で混合した溶液に切片を５分間浸漬した。１ｍｍ２内の好酸球数を計測し、平均値および標準偏差を算出した。
【0052】
（４）結果
例１で作製したＡＤモデルマウスについて行った上記（２）および（３）の病理組織学的評価の結果は図７～１０に示される通りであった。
例１で作製したＡＤモデルマウスについて行った上記（２）および（３）の病理組織学的評価の結果は図７～１０に示される通りであった。
【0053】
【0054】
ＣＡＥ染色の画像は、図９（Ａ：肥満細胞、Ｂ：好中球）に示される通りであった。また、ＣＡＥ染色の画像から定量した肥満細胞数、好中球数の変化は、図１０（Ａ：肥満細胞数、Ｂ：好中球数）に示す通りであった（データは平均±標準誤差（ｎ＝５－７））。
【0055】
【0056】
例２および３の結果から、例１でアトピー性皮膚炎モデルマウスがアトピー性皮膚炎の症状を示すことが確認された。
【0057】
例４：ＡＤモデルマウスの尿中脂質メディエーターの解析
例１で作製したＡＤモデルマウス（ｎ＝８）の尿中脂質メディエーターの解析を行った。
例１で作製したＡＤモデルマウス（ｎ＝８）の尿中脂質メディエーターの解析を行った。
【0058】
（１）方法
ア 尿の採取
ＡＤモデルマウスの採尿は、ＤＮＦＢ処置前（０日目）、刺激１回目（５日目）および３回目（１１日目）において各日の２４時間分の尿を採取した（表１参照）。尿サンプルは解析まで－８０℃で保存した。
ア 尿の採取
ＡＤモデルマウスの採尿は、ＤＮＦＢ処置前（０日目）、刺激１回目（５日目）および３回目（１１日目）において各日の２４時間分の尿を採取した（表１参照）。尿サンプルは解析まで－８０℃で保存した。
【0059】
イ 尿の調整
上記アで調製した尿を１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清２００μＬに０．１％ギ酸水３００μＬおよび表２に示す内部標準溶液１０μＬを加え試料溶液を調製した。この試料溶液を固相抽出カートリッジ（ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ μＥｌｕｔｅ、Ｗａｔｅｒｓ社）に負荷し、カートリッジを蒸留水２００μＬ、ヘキサン２００μＬで洗浄した後、カートリッジに付着させた脂質メディエーターを１００％メタノール１００μＬで溶出した。
上記アで調製した尿を１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清２００μＬに０．１％ギ酸水３００μＬおよび表２に示す内部標準溶液１０μＬを加え試料溶液を調製した。この試料溶液を固相抽出カートリッジ（ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ μＥｌｕｔｅ、Ｗａｔｅｒｓ社）に負荷し、カートリッジを蒸留水２００μＬ、ヘキサン２００μＬで洗浄した後、カートリッジに付着させた脂質メディエーターを１００％メタノール１００μＬで溶出した。
【0060】
ウ 脂質メディエーターの測定
上記イで調製した溶出液をＬＣＭＳ－８０６０に注入し、下記の手順で脂質メディエーターの測定を行った。
上記イで調製した溶出液をＬＣＭＳ－８０６０に注入し、下記の手順で脂質メディエーターの測定を行った。
【0061】
＜ＬＣ条件＞
液体クロマトグラフィー質量分析に用いた条件は以下の通りである。
分析カラム：ＫｉｎｅｔｅｘＣ８（２．１ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ、２．６μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）
移動相Ａ：０．１％ギ酸
移動相Ｂ：アセトニトリル
流速：０．４ｍＬ／分
注入量：５μＬ
カラム温度：４０℃
グラジエントプログラム：表１に示される通りであった。
液体クロマトグラフィー質量分析に用いた条件は以下の通りである。
分析カラム：ＫｉｎｅｔｅｘＣ８（２．１ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ、２．６μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）
移動相Ａ：０．１％ギ酸
移動相Ｂ：アセトニトリル
流速：０．４ｍＬ／分
注入量：５μＬ
カラム温度：４０℃
グラジエントプログラム：表１に示される通りであった。
【0062】
【表1】
【0063】
＜ＭＳ条件＞
質量分析器：ＬＣＭＳ－８０６０（島津製作所）測定プログラム；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳメソッドパッケージ 脂質メディエーターｖｅｒ．２（島津製作所）
ネブライザーガス流量：３Ｌ／分
ヒ―ティングガス流量：１０Ｌ／分
インターフェイス温度：３００℃
ドライイングガス流量：１０Ｌ／分
ＤＬ温度：２５０℃
ヒートブロック温度：４００℃
イオン化モード：ＥＳＩ＋／－
内部標準溶液：組成は表２に示される通りであった。
質量分析器：ＬＣＭＳ－８０６０（島津製作所）測定プログラム；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳメソッドパッケージ 脂質メディエーターｖｅｒ．２（島津製作所）
ネブライザーガス流量：３Ｌ／分
ヒ―ティングガス流量：１０Ｌ／分
インターフェイス温度：３００℃
ドライイングガス流量：１０Ｌ／分
ＤＬ温度：２５０℃
ヒートブロック温度：４００℃
イオン化モード：ＥＳＩ＋／－
内部標準溶液：組成は表２に示される通りであった。
【0064】
【表2】
【0065】
エ データ処理
上記測定プログラムに従って、検出された脂質メディエーター（１５８種）を物性に基づいて１６種類のグループに分割し、各グループに対して内部標準物質を設定した（表２参照）。ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ ＬＣＭＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．６５、島津製作所）を用いて、各脂質メディエーターのクロマトグラムから算出したピーク面積値を、上記の対応する内部標準物質のピーク面積値で除することによって脂質抽出時に生じる定量誤差等を補正した。脂質メディエーターの濃度（図１３～１９および図２１～３０の縦軸）は、脂質メディエーターのピーク面積値を内部標準物質のピーク面積値で除した後に、各サンプルの尿中クレアチニンの値をさらに除した値として示した。尿中クレアチニンの濃度はラボアッセイクレアチニン（富士フイルム和光純薬）を使用して測定した。
上記測定プログラムに従って、検出された脂質メディエーター（１５８種）を物性に基づいて１６種類のグループに分割し、各グループに対して内部標準物質を設定した（表２参照）。ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ ＬＣＭＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．６５、島津製作所）を用いて、各脂質メディエーターのクロマトグラムから算出したピーク面積値を、上記の対応する内部標準物質のピーク面積値で除することによって脂質抽出時に生じる定量誤差等を補正した。脂質メディエーターの濃度（図１３～１９および図２１～３０の縦軸）は、脂質メディエーターのピーク面積値を内部標準物質のピーク面積値で除した後に、各サンプルの尿中クレアチニンの値をさらに除した値として示した。尿中クレアチニンの濃度はラボアッセイクレアチニン（富士フイルム和光純薬）を使用して測定した。
【0066】
（２）結果
＜ｎ－６系脂肪酸＞
ア ＣＯＸ下流の脂質メディエーター
図１３～１７に示す通り、ｎ－６系脂肪酸であるアラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ、本明細書中「ＡＡ」ということがある。）由来、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）下流の１０個の脂質メディエーターが有意に増加することが確認された。具体的には、プロスタグランジンＤ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｄ２、本明細書中「ＰＧＤ２」または「ＰＧＤ２」ということがある。）から代謝されるものは、１１β－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ２α（図１３Ａ）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＪ２（図１３Ｂ）およびプロスタグランジンＫ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｋ２、本明細書中「ＰＧＫ２」または「ＰＧＫ２」ということがある。）（図１３Ｃ）であった。プロスタグランジンＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２、本明細書中「ＰＧＥ２」または「ＰＧＥ２」ということがある。）から代謝されるものは、１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＥ２（図１４Ａ）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦ１β（図１４Ｂ）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＥ２（図１４Ｃ）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥ２（図１４Ｄ）およびＰＧＫ２（図１４Ｅ（図１３Ｃと同じ））であった。なお、ＰＧＫ２はＰＧＤ２またはＰＧＥ２のいずれかから代謝される。ＰＧＪ２はプロスタグランジンＪ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｊ２、本明細書中「ＰＧＪ２」ということがある。）、ＰＧＦ１βはプロスタグランジンＦ１β（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ１β、本明細書中「ＰＧＦ１β」ということがある。）である。プロスタグランジンＦ２α（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ２α、本明細書中「ＰＧＦ２α」ということがある。）から代謝されるものは、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦ１α（図１５）であった。プロスタグランジンＩ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｉ２、本明細書中「ＰＧＩ２」ということがある。）から代謝されるものは、６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α（図１６）であった。なお、ＰＧＦ１αはプロスタグランジンＦ１α（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ１α、本明細書中「ＰＧＦ１α」ということがある。）である。そして、トロンボキサンＢ２（ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ｂ２、本明細書中「ＴＸＢ２」ということがある。）（図１７）であった。ＣＯＸ下流の脂質メディエーターの代謝経路（ＡＡ由来）は表３に示す通りである。
＜ｎ－６系脂肪酸＞
ア ＣＯＸ下流の脂質メディエーター
図１３～１７に示す通り、ｎ－６系脂肪酸であるアラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ、本明細書中「ＡＡ」ということがある。）由来、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）下流の１０個の脂質メディエーターが有意に増加することが確認された。具体的には、プロスタグランジンＤ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｄ２、本明細書中「ＰＧＤ２」または「ＰＧＤ２」ということがある。）から代謝されるものは、１１β－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ２α（図１３Ａ）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＪ２（図１３Ｂ）およびプロスタグランジンＫ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｋ２、本明細書中「ＰＧＫ２」または「ＰＧＫ２」ということがある。）（図１３Ｃ）であった。プロスタグランジンＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２、本明細書中「ＰＧＥ２」または「ＰＧＥ２」ということがある。）から代謝されるものは、１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＥ２（図１４Ａ）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦ１β（図１４Ｂ）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＥ２（図１４Ｃ）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥ２（図１４Ｄ）およびＰＧＫ２（図１４Ｅ（図１３Ｃと同じ））であった。なお、ＰＧＫ２はＰＧＤ２またはＰＧＥ２のいずれかから代謝される。ＰＧＪ２はプロスタグランジンＪ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｊ２、本明細書中「ＰＧＪ２」ということがある。）、ＰＧＦ１βはプロスタグランジンＦ１β（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ１β、本明細書中「ＰＧＦ１β」ということがある。）である。プロスタグランジンＦ２α（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ２α、本明細書中「ＰＧＦ２α」ということがある。）から代謝されるものは、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦ１α（図１５）であった。プロスタグランジンＩ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｉ２、本明細書中「ＰＧＩ２」ということがある。）から代謝されるものは、６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α（図１６）であった。なお、ＰＧＦ１αはプロスタグランジンＦ１α（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ１α、本明細書中「ＰＧＦ１α」ということがある。）である。そして、トロンボキサンＢ２（ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ｂ２、本明細書中「ＴＸＢ２」ということがある。）（図１７）であった。ＣＯＸ下流の脂質メディエーターの代謝経路（ＡＡ由来）は表３に示す通りである。
【0067】
【表3】
【0068】
イ ＯＸ下流の脂質メディエーター
図１６に示す通り、ＡＡ由来、酵素非依存的酸化（ＯＸ）下流の脂質メディエーターであるイソプロスタグランジンＦ２α－ＩＶ（ｉｓｏ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ２α－ＩＶ、本明細書中「ｉＰＦ２α－ＩＶ」または「ｉＰＦ２α－ＩＶ」ということがある。）（図１８Ａ）および８－ｉｓｏ－１５（Ｒ）－ＰＧＦ２α（図１８Ｂ）が有意に増加することが確認された。
図１６に示す通り、ＡＡ由来、酵素非依存的酸化（ＯＸ）下流の脂質メディエーターであるイソプロスタグランジンＦ２α－ＩＶ（ｉｓｏ ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｆ２α－ＩＶ、本明細書中「ｉＰＦ２α－ＩＶ」または「ｉＰＦ２α－ＩＶ」ということがある。）（図１８Ａ）および８－ｉｓｏ－１５（Ｒ）－ＰＧＦ２α（図１８Ｂ）が有意に増加することが確認された。
【0069】
＜ｎ－３系脂肪酸＞
ウ ｎ－３系脂肪酸由来の脂質メディエーター
図１９に示す通り、ｎ－３系脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、本明細書中「ＥＰＡ」ということがある。）およびドコサヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、本明細書中「ＤＨＡ」ということがある。）由来で、それぞれのリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）下流の脂質メディエーターであるプロスタグランジンＤ３（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｄ３、本明細書中「ＰＧＤ３」または「ＰＧＤ３」ということがある。）（図１９Ａ）およびレゾルビンＤ１（図１９Ｂ）は１回目の刺激後に有意に減少することが確認された。
ウ ｎ－３系脂肪酸由来の脂質メディエーター
図１９に示す通り、ｎ－３系脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、本明細書中「ＥＰＡ」ということがある。）およびドコサヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、本明細書中「ＤＨＡ」ということがある。）由来で、それぞれのリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）下流の脂質メディエーターであるプロスタグランジンＤ３（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｄ３、本明細書中「ＰＧＤ３」または「ＰＧＤ３」ということがある。）（図１９Ａ）およびレゾルビンＤ１（図１９Ｂ）は１回目の刺激後に有意に減少することが確認された。
【0070】
これらの結果は、脂質メディエーターの産生に使用される脂肪酸の主要タイプが、ＡＤモデルマウスの尿ではｎ－６系脂肪酸であることを示唆するものであった。ＣＯＸ下流の脂質メディエーターでは、３つのＰＧＤ２由来の脂質メディエーター（１１β－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ２α、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＪ２およびＰＧＫ２）（図１３Ａ～Ｃ）、５つのＰＧＥ２由来の脂質メディエーター（１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＥ２、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦ１β、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＥ２、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥ２およびＰＧＫ２）（図１４Ａ～Ｅ）、１つのＰＧＦ２α由来の脂質メディエーター（１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦ１α）（図１５）、１つのＰＧＩ２由来の脂質メディエーター（６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ１α）（図１６）、およびＴＸＢ２（図１７）は、ＤＮＦＢで刺激した尿では有意に増加していた。なお、ＰＧＫ２（図１３Ｃおよび図１４Ｅは同じ図）はＰＧＤ２とＰＧＥ２の両いずれかから代謝される。
【0071】
例５：皮膚病変部における脂質代謝酵素および脂質合成酵素の遺伝子発現解析
例１で作製したＡＤモデルマウスの皮膚病変部における脂質代謝酵素および脂質合成酵素の遺伝子発現解析を行った。
例１で作製したＡＤモデルマウスの皮膚病変部における脂質代謝酵素および脂質合成酵素の遺伝子発現解析を行った。
【0072】
（１）定量的ＲＴ－ＰＣＲ
トータルＲＮＡは、トライゾル試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して皮膚から単離し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡）を使用してｃＤＮＡへの逆転写を行った。定量的ＲＴ－ＰＣＲはＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡）およびＡｒｉａＭｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて表３～５に記載の条件で行った。定量化はデルタデルタＣｔ法により行った。
トータルＲＮＡは、トライゾル試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して皮膚から単離し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（東洋紡）を使用してｃＤＮＡへの逆転写を行った。定量的ＲＴ－ＰＣＲはＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡）およびＡｒｉａＭｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて表３～５に記載の条件で行った。定量化はデルタデルタＣｔ法により行った。
【0073】
【表4】
【0074】
【表5】
【0075】
【表6】
【0076】
（２）結果
結果は、図２０に示す通りであった。ＰＧＤ２はＣＯＸ（ＣＯＸ－１、ＣＯＸ－２）およびＰＧＤ合成酵素（Ｈ－ＰＧＤＳ、Ｌ－ＰＧＤＳ）、ＰＧＥ２はＰＧＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ－１、ｍＰＧＥＳ－２およびｃＰＧＥＳ）、ＰＧＦ２αはＰＧＦ合成酵素（ＰＧＦＳ）、ＴＸＡ２はトロンボキサン合成酵素（ＴＸＳ）の活性により産生される。マウスのアルド－ケト還元酵素（ＡＫＲ）１Ｂ３はＰＧＦＳ活性と相関している。３回目の刺激後２４時間のＤＮＦＢ処置の皮膚におけるＣｏｘ－１（図２０Ａ）、Ｃｏｘ－２（図２０Ｂ）、ｍＰｇｅｓ－１（図２０Ｃ）、Ａｋｒ１Ｂ３（図２０Ｄ）、Ｔｘｓ（図２０Ｅ）、Ｈ－ｐｇｄｓ（図２０Ｆ）のｍＲＮＡが有意に増加した。一方で、ｍＰｇｅｓ－２（図２０Ｇ）、ｃＰｇｅｓ（図２０Ｈ）、Ｌ－ｐｇｄｓ（図２０Ｉ）のｍＲＮＡの発現レベルはＤＮＦＢ処置による影響を受けなかった。
結果は、図２０に示す通りであった。ＰＧＤ２はＣＯＸ（ＣＯＸ－１、ＣＯＸ－２）およびＰＧＤ合成酵素（Ｈ－ＰＧＤＳ、Ｌ－ＰＧＤＳ）、ＰＧＥ２はＰＧＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ－１、ｍＰＧＥＳ－２およびｃＰＧＥＳ）、ＰＧＦ２αはＰＧＦ合成酵素（ＰＧＦＳ）、ＴＸＡ２はトロンボキサン合成酵素（ＴＸＳ）の活性により産生される。マウスのアルド－ケト還元酵素（ＡＫＲ）１Ｂ３はＰＧＦＳ活性と相関している。３回目の刺激後２４時間のＤＮＦＢ処置の皮膚におけるＣｏｘ－１（図２０Ａ）、Ｃｏｘ－２（図２０Ｂ）、ｍＰｇｅｓ－１（図２０Ｃ）、Ａｋｒ１Ｂ３（図２０Ｄ）、Ｔｘｓ（図２０Ｅ）、Ｈ－ｐｇｄｓ（図２０Ｆ）のｍＲＮＡが有意に増加した。一方で、ｍＰｇｅｓ－２（図２０Ｇ）、ｃＰｇｅｓ（図２０Ｈ）、Ｌ－ｐｇｄｓ（図２０Ｉ）のｍＲＮＡの発現レベルはＤＮＦＢ処置による影響を受けなかった。
【0077】
例６：皮膚病変部の免疫組織化学的解析
例１で作製したＡＤモデルマウスから採取した皮膚病変部について免疫組織化学的な解析を行った。
例１で作製したＡＤモデルマウスから採取した皮膚病変部について免疫組織化学的な解析を行った。
【0078】
（１）免疫染色
解剖組織は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンまたはＯＣＴ化合物（サクラファインテックジャパン）で包埋した。厚さ４μｍの切片を０．３％過酸化水素水を含むメタノールで室温にて３０分間インキュベートした。ＣＯＸ－１、ＣＯＸ－２およびｍＰＧＥＳ－１の染色は、切片を０．１％のトリプシンと０．１％塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液に３７℃にて１５分間浸して行った。ＡＫＲ１Ｂ３およびＴＢＸＡＳ１の染色は、切片を抗原賦活化緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）で９５℃にて１０分間インキュベートした。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００と５％標準ヤギ血清を含むＰＢＳで室温にて３０分間インキュベートした後、ヤギ抗ｍＰＧＥＳ－１抗体（Santa Cruz Biotechnology）、ウサギ抗ＴＢＸＡＳ１抗体（アブカム）、ウサギ抗ＡＫＲ１Ｂ３抗体（大阪バイオサイエンス研究所）、ウサギ抗ＣＯＸ－１抗体（Cayman Chemical）、ウサギ抗ＣＯＸ－２抗体（Cayman Chemical）にそれぞれ１：２００の割合にて４℃で一晩浸した。ｍＰＧＥＳ－１はビオチン化したウマ抗ヤギ抗体（VECTOR）に、ＣＯＸ－１、ＣＯＸ－２、ＡＫＲ１Ｂ３、ＴＢＸＡＳ１はヤギ抗ウサギ抗体（VECTOR）にそれぞれ１：５００の割合にて室温で２時間インキュベートした。アビジン－ビオチン複合体（VECTASTAIN）で室温にて３０分間インキュベートした後、切片は２００μｇ／ｍｌＤＡＢと０．０３％過酸化水素水を含む５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液のインキュベーションにより染色した。画像はＢＺ－Ｘ７１０顕微鏡（キーエンス）を用いて捕捉した。
解剖組織は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンまたはＯＣＴ化合物（サクラファインテックジャパン）で包埋した。厚さ４μｍの切片を０．３％過酸化水素水を含むメタノールで室温にて３０分間インキュベートした。ＣＯＸ－１、ＣＯＸ－２およびｍＰＧＥＳ－１の染色は、切片を０．１％のトリプシンと０．１％塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液に３７℃にて１５分間浸して行った。ＡＫＲ１Ｂ３およびＴＢＸＡＳ１の染色は、切片を抗原賦活化緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）で９５℃にて１０分間インキュベートした。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００と５％標準ヤギ血清を含むＰＢＳで室温にて３０分間インキュベートした後、ヤギ抗ｍＰＧＥＳ－１抗体（Santa Cruz Biotechnology）、ウサギ抗ＴＢＸＡＳ１抗体（アブカム）、ウサギ抗ＡＫＲ１Ｂ３抗体（大阪バイオサイエンス研究所）、ウサギ抗ＣＯＸ－１抗体（Cayman Chemical）、ウサギ抗ＣＯＸ－２抗体（Cayman Chemical）にそれぞれ１：２００の割合にて４℃で一晩浸した。ｍＰＧＥＳ－１はビオチン化したウマ抗ヤギ抗体（VECTOR）に、ＣＯＸ－１、ＣＯＸ－２、ＡＫＲ１Ｂ３、ＴＢＸＡＳ１はヤギ抗ウサギ抗体（VECTOR）にそれぞれ１：５００の割合にて室温で２時間インキュベートした。アビジン－ビオチン複合体（VECTASTAIN）で室温にて３０分間インキュベートした後、切片は２００μｇ／ｍｌＤＡＢと０．０３％過酸化水素水を含む５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液のインキュベーションにより染色した。画像はＢＺ－Ｘ７１０顕微鏡（キーエンス）を用いて捕捉した。
【0079】
（２）結果
結果は、図２１に示す通りであった。免疫染色において、ＣＯＸ－２、ｍＰＧＥＳ－１、ＡＫＲ１Ｂ３、ＴＸＳの染色が表皮層において観察された（図２１）。ＣＯＸ－２、ｍＰＧＥＳ－１はいくつかの浸潤細胞においても観察された。ＣＯＸ－１は弱く染まった。正常血清、対照（溶媒）の皮膚では陽性染色を示さなかった（図２１）。これらの結果は、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α由来の脂質メディエーターがＡＤモデルマウスの尿における主要な脂質メディエーターであることを示唆している。
結果は、図２１に示す通りであった。免疫染色において、ＣＯＸ－２、ｍＰＧＥＳ－１、ＡＫＲ１Ｂ３、ＴＸＳの染色が表皮層において観察された（図２１）。ＣＯＸ－２、ｍＰＧＥＳ－１はいくつかの浸潤細胞においても観察された。ＣＯＸ－１は弱く染まった。正常血清、対照（溶媒）の皮膚では陽性染色を示さなかった（図２１）。これらの結果は、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α由来の脂質メディエーターがＡＤモデルマウスの尿における主要な脂質メディエーターであることを示唆している。
【0080】
例７：アトピー性皮膚炎患者の尿中脂質メディエーターの解析
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）患者群（１３名）と対照群（４名）から採取した尿中の脂質メディエーターについて解析を行った。
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）患者群（１３名）と対照群（４名）から採取した尿中の脂質メディエーターについて解析を行った。
【0081】
（１）方法
ア 尿検体
国立成育医療研究センターのアレルギー部門を定期的に受診している１７名のアレルギー患者から採取した尿検体を使用した。前記アレルギー患者のうちアトピー性皮膚炎と臨床的に診断されている患者１３名をＡＤ患者群、臨床的な症状のない患者（湿疹など）４名を対照群として分類した。被験者の臨床特性は表６に示す通りである。採取した尿は解析まで－８０℃で保存した。
ア 尿検体
国立成育医療研究センターのアレルギー部門を定期的に受診している１７名のアレルギー患者から採取した尿検体を使用した。前記アレルギー患者のうちアトピー性皮膚炎と臨床的に診断されている患者１３名をＡＤ患者群、臨床的な症状のない患者（湿疹など）４名を対照群として分類した。被験者の臨床特性は表６に示す通りである。採取した尿は解析まで－８０℃で保存した。
【0082】
【表7】
【0083】
すべての被験者はインフォームドコンセントに同意し、研究プロトコールは東京大学および国立成育医療研究センターの倫理委員会による承認を得た。すべての実験は承認されたガイドラインに従って実施された。
【0084】
イ 尿の調整
例４（１）イの記載と同様にして行った。
例４（１）イの記載と同様にして行った。
【0085】
ウ 脂質メディエーターの測定
例４（１）ウの記載と同様にして行った。
例４（１）ウの記載と同様にして行った。
【0086】
エ データ処理
例４（１）エの記載と同様にして行った。
例４（１）エの記載と同様にして行った。
【0087】
（２）結果
＜ｎ－６系脂肪酸＞
ア ＣＯＸ下流の脂質メディエーター
図２２～２５に示す通り、ＡＤ患者群において、ＡＡ由来、ＣＯＸ下流の７つの脂質メディエーターの産生量が対照群と比較して有意に高かった。具体的には、ＰＧＤ２から代謝されるものは、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＪ２（図２２Ａ）およびｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ（図２２Ｂ）であった。ＰＧＥ２から代謝されるものは、２０－ｈｙｄｒｏｘｙ－ＰＧＥ２（図２３Ａ）、１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＥ２（図２３Ｂ）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥ２（図２３Ｃ）およびｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ（図２３Ｄ）であった。ＰＧＦ２αから代謝されるものは、１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ２α（図２４Ａ）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦ１α（図２４Ｂ）およびｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ（図２４Ｃ）であった。ＰＧＩ２から代謝されるものは、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－ＰＧＦ１α（図２５）であった。ＣＯＸ下流の脂質メディエーターの代謝経路（ＡＡ由来）は表８に示す通りである。
＜ｎ－６系脂肪酸＞
ア ＣＯＸ下流の脂質メディエーター
図２２～２５に示す通り、ＡＤ患者群において、ＡＡ由来、ＣＯＸ下流の７つの脂質メディエーターの産生量が対照群と比較して有意に高かった。具体的には、ＰＧＤ２から代謝されるものは、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＪ２（図２２Ａ）およびｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＤＭ（図２２Ｂ）であった。ＰＧＥ２から代謝されるものは、２０－ｈｙｄｒｏｘｙ－ＰＧＥ２（図２３Ａ）、１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＥ２（図２３Ｂ）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥ２（図２３Ｃ）およびｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＥＭ（図２３Ｄ）であった。ＰＧＦ２αから代謝されるものは、１５－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ２α（図２４Ａ）、１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦ１α（図２４Ｂ）およびｔｅｔｒａｎｏｒ－ＰＧＦＭ（図２４Ｃ）であった。ＰＧＩ２から代謝されるものは、６，１５－ｄｉｋｅｔｏ－１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－ＰＧＦ１α（図２５）であった。ＣＯＸ下流の脂質メディエーターの代謝経路（ＡＡ由来）は表８に示す通りである。
【0088】
【表8】
【0089】
イ ＬＯＸ下流の脂質メディエーター
図２６に示す通り、ＡＤ患者群において、ＡＡ由来、ＬＯＸ下流の脂質メディエーターである５－ヒドロペルオキシイコサテトラエン酸（Ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、本明細書中「ＨｐＥＴＥ」ということがある。）（図２６Ａ）の産生量が対照群と比較して有意に高かったのに対し、その代謝物である５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸（ｈｙｄｒｏｘｙｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、本明細書中「ＨＥＴＥ」ということがある。）（図２６Ｂ）の産生量は有意に低かった。
図２６に示す通り、ＡＤ患者群において、ＡＡ由来、ＬＯＸ下流の脂質メディエーターである５－ヒドロペルオキシイコサテトラエン酸（Ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、本明細書中「ＨｐＥＴＥ」ということがある。）（図２６Ａ）の産生量が対照群と比較して有意に高かったのに対し、その代謝物である５－ヒドロキシエイコサテトラエン酸（ｈｙｄｒｏｘｙｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、本明細書中「ＨＥＴＥ」ということがある。）（図２６Ｂ）の産生量は有意に低かった。
【0090】
ウ ＣＹＰ下流の脂質メディエーター
図２７に示す通り、ＡＤ患者群において、ＡＡ由来、シトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）下流の脂質メディエーターである１７－ＨＥＴＥの産生量が対照群と比較して有意に高かった。
図２７に示す通り、ＡＤ患者群において、ＡＡ由来、シトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）下流の脂質メディエーターである１７－ＨＥＴＥの産生量が対照群と比較して有意に高かった。
【0091】
エ ＡＡおよびＡＡ由来ＯＸ下流の脂質メディエーター
図２６に示す通り、ＡＤ患者群において、ＡＡ（図２８Ａ）およびＡＡ由来で酵素非依存的酸化（ＯＸ）下流の脂質メディエーターであるｉＰＦ２α－ＩＶ（図２８Ｂ）の産生量が対照群と比較して有意に低かった。
図２６に示す通り、ＡＤ患者群において、ＡＡ（図２８Ａ）およびＡＡ由来で酵素非依存的酸化（ＯＸ）下流の脂質メディエーターであるｉＰＦ２α－ＩＶ（図２８Ｂ）の産生量が対照群と比較して有意に低かった。
【0092】
【0093】
カ ＤＨＡ由来脂質メディエーター
図３０に示す通り、ＡＤ患者群において、ＤＨＡ由来、ＬＯＸ下流の脂質メディエーターである４－ヒドロキシドコサヘキサエン酸（ｈｙｄｒｏｘｙ Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ Ａｃｉｄ、本明細書中「ＨＤｏＨＥ」ということがある。）（図３０Ａ）、１０，１７－ジヒドロキシドコサヘキサエン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、本明細書中「ＤｉＨＤｏＨＥ」ということがある。）（図３０Ｂ）の産生量が対照群と比較して有意に低かった。
図３０に示す通り、ＡＤ患者群において、ＤＨＡ由来、ＬＯＸ下流の脂質メディエーターである４－ヒドロキシドコサヘキサエン酸（ｈｙｄｒｏｘｙ Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ Ａｃｉｄ、本明細書中「ＨＤｏＨＥ」ということがある。）（図３０Ａ）、１０，１７－ジヒドロキシドコサヘキサエン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、本明細書中「ＤｉＨＤｏＨＥ」ということがある。）（図３０Ｂ）の産生量が対照群と比較して有意に低かった。
【0094】
例８：非アレルギー性皮膚炎モデルマウスによる検討
例８では、ＡＤモデルマウスにおける脂質代謝の特異性を検証するために、テープストリッピング（Ｔａｐｅ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）により非アレルギー性の皮膚炎を引き起こした非アレルギー性皮膚炎モデルマウスを用いて検討を行った。
例８では、ＡＤモデルマウスにおける脂質代謝の特異性を検証するために、テープストリッピング（Ｔａｐｅ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）により非アレルギー性の皮膚炎を引き起こした非アレルギー性皮膚炎モデルマウスを用いて検討を行った。
【0095】
（１）方法
ア テープストリッピング
ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウス（雄、７－８週齢）（日本クレア）を用いて、テープストリッピングを２０回行い非アレルギー性の皮膚炎を引き起こした（実験の時系列は図３１Ａ参照）。
ア テープストリッピング
ＢＡＬＢ／Ｃ系統マウス（雄、７－８週齢）（日本クレア）を用いて、テープストリッピングを２０回行い非アレルギー性の皮膚炎を引き起こした（実験の時系列は図３１Ａ参照）。
【0096】
イ ＨＥ染色
例３（１）の記載と同様にして行った。
例３（１）の記載と同様にして行った。
【0097】
ウ 好酸球、好中球および肥満細胞の計測
例３（２）の記載と同様にして行った。
例３（２）の記載と同様にして行った。
【0098】
エ 尿の採取および調整
尿をテープストリッピング処置した日（０日）、処置後１日目、処置後９日目に採取した以外は、例４（１）アおよびイの記載と同様にして行った。
尿をテープストリッピング処置した日（０日）、処置後１日目、処置後９日目に採取した以外は、例４（１）アおよびイの記載と同様にして行った。
【0099】
オ 脂質メディエーターの測定
例４（１）ウの記載と同様にして行った。
例４（１）ウの記載と同様にして行った。
【0100】
カ データ処理
例４（１）エの記載と同様にして行った。
例４（１）エの記載と同様にして行った。
【0101】
キ 定量的ＲＴ－ＰＣＲ
例５（１）の記載と同様にして行った。
例５（１）の記載と同様にして行った。
【0102】
ク 免疫染色
例６（１）の記載と同様にして行った。
例６（１）の記載と同様にして行った。
【0103】
（２）結果
結果は、図３１および図３２に示す通りであった。ＨＥ染色の画像（図３１Ｂ）から測定した表皮肥厚の変化から、テープストリッピング処置後９日目に表皮肥厚の増大が確認された（図３１Ｃ）。定量的ＲＴ－ＰＣＲでは、ＴｓｌｐのｍＲＮＡの発現レベルが増加傾向にあったのに対し、Ｔｈ２細胞が主に産生するサイトカインであるインターロイキン４（Ｉｌ－４）、インターロイキン１３（Ｉｌ－１３）およびＣｃｌ１７では増加傾向にないことが確認された（図３１Ｄ）。テープストリッピング処置の６時間後に、ＩＬ－１およびプロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ－２）の活性化によりＮＦ－κＢが活性化され、皮膚のＴＳＬＰレベルが上昇することが報告されていることから（Redhu D, et al., Br J Dermatol 2020; 182:119-29.）、テープストリッピング処置をした皮膚部では主にＩＬ－１によって媒介されるＴｈ１型の炎症を引き起こすと考えられた（Sanmiguel JC, et al., Cell Signal 2009; 21:685-94.）。好中球と肥満細胞は、テープストリッピングの９日後に真皮に浸潤したが、好酸球は浸潤しなかった（図３２Ａ）。
結果は、図３１および図３２に示す通りであった。ＨＥ染色の画像（図３１Ｂ）から測定した表皮肥厚の変化から、テープストリッピング処置後９日目に表皮肥厚の増大が確認された（図３１Ｃ）。定量的ＲＴ－ＰＣＲでは、ＴｓｌｐのｍＲＮＡの発現レベルが増加傾向にあったのに対し、Ｔｈ２細胞が主に産生するサイトカインであるインターロイキン４（Ｉｌ－４）、インターロイキン１３（Ｉｌ－１３）およびＣｃｌ１７では増加傾向にないことが確認された（図３１Ｄ）。テープストリッピング処置の６時間後に、ＩＬ－１およびプロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ－２）の活性化によりＮＦ－κＢが活性化され、皮膚のＴＳＬＰレベルが上昇することが報告されていることから（Redhu D, et al., Br J Dermatol 2020; 182:119-29.）、テープストリッピング処置をした皮膚部では主にＩＬ－１によって媒介されるＴｈ１型の炎症を引き起こすと考えられた（Sanmiguel JC, et al., Cell Signal 2009; 21:685-94.）。好中球と肥満細胞は、テープストリッピングの９日後に真皮に浸潤したが、好酸球は浸潤しなかった（図３２Ａ）。
【0104】
また、テープストリッピング処置後１日目と９日目の尿を分析した結果、テープストリッピング処置後１日目では、尿中のＰＧＥ２代謝物である１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１βと、ＰＧＦ２αが増加したのに対し（図３１Ｅ左、中））、テープストリッピング処置後９日目では、ＰＧＦ２αおよびＰＧＥ２の代謝物は増加しなかった（図３２Ｂ）。対照的に、ＥＰＡの代謝物であるＰＧＦ３αのレベルはストリッピング処置後９日目に大きく減少した（図３１Ｅ右）。また、テープストリッピング処置が、ｍＰｇｅｓ－１を除き、Ｃｏｘ－２、Ａｋｒ１ｂ３およびＨ－ｐｇｄｓのｍＲＮＡ発現を変化させないことが確認された（図３１Ｆ）。テープストリッピングにより、ＡＫＲ１Ｂ３タンパク質の発現レベルはわずかに増加したが（図３１Ｇ）、その程度はＤＮＦＢ刺激した皮膚の場合よりもはるかに小さかった。
【0105】
これらの結果は、非アレルギー性皮膚炎モデルマウスとは異なり、ＡＤモデルマウスではアレルギー性（Ｔｈ２型）の炎症を伴う肥厚したケラチノサイトがＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２αおよびＰＧＩ２を生成し、それらの代謝物がＡＤモデルマウスの尿中に排泄されることを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-09-13
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎の検出方法であって、前記脂質代謝物がアラキドン酸のＣＯＸ代謝物であり、前記ＣＯＸ代謝物が１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１α、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＥ２および１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＪ２からなる群から選択される１種または２種以上である、検出方法。
【請求項2】
前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程をさらに含む、請求項１に記載の検出方法。
【請求項3】
前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、対象がアトピー性皮膚炎に罹患していることが示される、請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項4】
前記生体試料が体液である、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項5】
対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度を測定する工程を含んでなる、アトピー性皮膚炎に対する治療効果の判定方法であって、前記脂質代謝物がアラキドン酸のＣＯＸ代謝物であり、前記ＣＯＸ代謝物が１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１α、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＥ２および１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＪ２からなる群から選択される１種または２種以上である、判定方法。
【請求項6】
前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度と健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度とを比較する工程をさらに含む、請求項５に記載の判定方法。
【請求項7】
前記対象の生体試料中の脂質代謝物の濃度が、治療前の対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度またはアトピー性皮膚炎に罹った対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異なる場合に、あるいは、健常な対象の生体試料中の当該脂質代謝物の濃度と有意に異ならない場合に、治療効果があることが示される、請求項５または６に記載の判定方法。
【請求項8】
アトピー性皮膚炎に対する治療が、薬物療法またはプロアクティブ療法である、請求項５～７のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項9】
前記生体試料が体液である、請求項５～８のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項10】
アトピー性皮膚炎に罹患した対象の生体試料中の前記脂質代謝物の濃度が健常な対象の生体試料中の前記脂質代謝物の濃度よりも高い傾向にあるものである、請求項２～４のいずれか一項に記載の検出方法または請求項６～９のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項11】
前記脂質代謝物の濃度を質量分析法により測定する、請求項１～４および１０のいずれか一項に記載の検出方法または請求項５～１０のいずれか一項に記載の判定方法。
【請求項12】
対象の生体試料中の脂質代謝物の定量手段を含んでなる、アトピー性皮膚炎の検出用キットであって、前記脂質代謝物がアラキドン酸のＣＯＸ代謝物であり、前記ＣＯＸ代謝物が１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＦ１α、１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－テトラノル－ＰＧＥ２および１３，１４－ジヒドロ－１５－ケト－ＰＧＪ２からなる群から選択される１種または２種以上である、キット。