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特開2024-175586酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法、還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法及び補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024175586
(43)【公開日】2024-12-18
(54)【発明の名称】酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法、還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法及び補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサ
(51)【国際特許分類】
G01N 27/333 20060101AFI20241211BHJP
G01N 27/416 20060101ALI20241211BHJP
【ＦＩ】
G01N27/333 331A
G01N27/333 331C
G01N27/416 336G
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023093484
(22)【出願日】2023-06-06
(71)【出願人】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110002620
【氏名又は名称】弁理士法人大谷特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】風呂田 郷史
(72)【発明者】
【氏名】金子 雅紀
(72)【発明者】
【氏名】辻村 清也
(72)【発明者】
【氏名】竹下 大二郎
(72)【発明者】
【氏名】五十嵐 健輔
(72)【発明者】
【氏名】ノブ マサル コニシ
(72)【発明者】
【氏名】吉川 美穂
(72)【発明者】
【氏名】中道 優介
(57)【要約】
【課題】補酵素Ｆ４２０の調製方法及び補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサの提供を課題とする。
【解決手段】下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、
還元型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、アノード電極上で反応させる工程を含む、酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法。
【選択図】なし
【解決手段】下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、
還元型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、アノード電極上で反応させる工程を含む、酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、
還元型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、アノード電極上で反応させる工程を含む、酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法。
還元型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、アノード電極上で反応させる工程を含む、酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法。
【化1】
【請求項2】
下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、
酸化型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、カソード電極上で反応させる工程を含む、還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法。
酸化型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、カソード電極上で反応させる工程を含む、還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法。
【化2】
【請求項3】
前記補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素が、メタン生成菌又は放線菌に由来する、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項4】
前記電子メディエータが、キノン系化合物、フェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェノキサジン系化合物、ビオロゲン系化合物及び中心金属イオンがオスミニウム、ルテニウム、鉄、コバルト、ニッケル、銅又は白金である金属錯体からなる群から選ばれる電子メディエータである、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項5】
前記アノード電極又はカソード電極が、前記補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素及び電子メディエータを含む反応層を備えた電極である、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項6】
下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と電子メディエータとを含む作用電極、及び対極を含む、補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサ。
【化3】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法、還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法及び補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサに関する。
【背景技術】
【0002】
補酵素Ｆ４２０は、メタン生成菌や放線菌等が電子キャリアとして利用する生体物質である。
補酵素Ｆ４２０のセンシングは、補酵素Ｆ４２０の蛍光強度を測定することで実施されている。例えば、特許文献１及び２には、メタン発酵槽に蛍光強度測定機を取り付けることでメタン生成菌の細胞数や活性を測定する技術が開示されている。
具体的には、特許文献１には、メタン発酵槽内のメタン菌の活性の測定が容易に行われ、同発酵槽の制御が可能となるため、同発酵槽の状態が悪化する前に予めその制御ができ、またスタートアップに要する期間も大幅に短縮されるメタン発酵槽の自動制御システムとして、蛍光物質Ｆ４２０の蛍光強度を測定することによってメタン菌の活性を測定し、原料の投入を調節すること、を特徴とするメタン発酵槽の自動制御方法が開示されている。
特許文献２には、オンサイトでリアルタイムに、メタン発酵中のメタン生成菌数を測定することができる技術として、メタン生成菌を用いてバイオマスを発酵し、メタンガスを生成するメタン発酵槽と、前記メタン発酵槽に接続され、前記メタン発酵槽内の消化液の一部を引き抜いてから、さらに前記メタン発酵槽に戻す循環導管と、非接触で前記循環導管を通る前記メタン生成菌の量を検出する検出部と、を備える、メタン発酵システムが開示されている。
補酵素Ｆ４２０のセンシングは、補酵素Ｆ４２０の蛍光強度を測定することで実施されている。例えば、特許文献１及び２には、メタン発酵槽に蛍光強度測定機を取り付けることでメタン生成菌の細胞数や活性を測定する技術が開示されている。
具体的には、特許文献１には、メタン発酵槽内のメタン菌の活性の測定が容易に行われ、同発酵槽の制御が可能となるため、同発酵槽の状態が悪化する前に予めその制御ができ、またスタートアップに要する期間も大幅に短縮されるメタン発酵槽の自動制御システムとして、蛍光物質Ｆ４２０の蛍光強度を測定することによってメタン菌の活性を測定し、原料の投入を調節すること、を特徴とするメタン発酵槽の自動制御方法が開示されている。
特許文献２には、オンサイトでリアルタイムに、メタン発酵中のメタン生成菌数を測定することができる技術として、メタン生成菌を用いてバイオマスを発酵し、メタンガスを生成するメタン発酵槽と、前記メタン発酵槽に接続され、前記メタン発酵槽内の消化液の一部を引き抜いてから、さらに前記メタン発酵槽に戻す循環導管と、非接触で前記循環導管を通る前記メタン生成菌の量を検出する検出部と、を備える、メタン発酵システムが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開平０８－１５４６６２号公報
【特許文献2】特開２０１９－００４７１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
光源と検出機、および光路の確保を必要とする測定技術である特許文献１及び２に記載の技術では、補酵素Ｆ４２０の検出機を設置するためには数ｃｍ以上のスペースが必要となる。
また、補酵素Ｆ４２０を酵素反応で利用するためには、その反応系に合わせて補酵素Ｆ４２０を酸化型又は還元型を調製する必要がある。補酵素Ｆ４２０の酸化還元反応は、従来補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と電子受容体／供与体を用いた反応系を利用して行われている。
また、補酵素Ｆ４２０を酵素反応で利用するためには、その反応系に合わせて補酵素Ｆ４２０を酸化型又は還元型を調製する必要がある。補酵素Ｆ４２０の酸化還元反応は、従来補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と電子受容体／供与体を用いた反応系を利用して行われている。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、補酵素Ｆ４２０を電極上で酸化還元反応させることが可能であることを見出した。本発明はかかる発見に基づき、更に検討を重ねて完成したものである。
本発明は、下記［１］～［６］の態様を含む。
［１］ 下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、
還元型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、アノード電極上で反応させる工程を含む、酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法。
本発明は、下記［１］～［６］の態様を含む。
［１］ 下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、
還元型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、アノード電極上で反応させる工程を含む、酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法。
【0006】
【化1】
【0007】
［２］ 下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、
酸化型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、カソード電極上で反応させる工程を含む、還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法。
酸化型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、カソード電極上で反応させる工程を含む、還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法。
【0008】
【化2】
【0009】
［３］ 前記補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素が、メタン生成菌又は放線菌に由来する、［１］又は［２］に記載の調製方法。
［４］ 前記電子メディエータが、キノン系化合物、フェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェノキサジン系化合物、ビオロゲン系化合物及び中心金属イオンがオスミニウム、ルテニウム、鉄、コバルト、ニッケル、銅又は白金である金属錯体からなる群から選ばれる電子メディエータである、［１］～［３］のいずれか１項に記載の調製方法。
［５］ 前記アノード電極又はカソード電極が、前記補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素及び電子メディエータを含む反応層を備えた電極である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の調製方法。
［６］ 下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と電子メディエータとを含む作用電極、及び対極を含む、補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサ。
［４］ 前記電子メディエータが、キノン系化合物、フェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェノキサジン系化合物、ビオロゲン系化合物及び中心金属イオンがオスミニウム、ルテニウム、鉄、コバルト、ニッケル、銅又は白金である金属錯体からなる群から選ばれる電子メディエータである、［１］～［３］のいずれか１項に記載の調製方法。
［５］ 前記アノード電極又はカソード電極が、前記補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素及び電子メディエータを含む反応層を備えた電極である、［１］～［４］のいずれか１項に記載の調製方法。
［６］ 下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と電子メディエータとを含む作用電極、及び対極を含む、補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサ。
【0010】
【化3】
【発明の効果】
【0011】
本発明により、酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法、還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法及び補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサが提供される。
具体的には、補酵素Ｆ４２０を電極上で酸化還元することで、電極を利用した還元型補酵素Ｆ４２０及び酸化型補酵素Ｆ４２０の調製が可能になる。また、補酵素Ｆ４２０を電極上で酸化還元し、その反応を電流値として検出することで、環境中の補酵素Ｆ４２０を測定するバイオセンサも提供される。
具体的には、補酵素Ｆ４２０を電極上で酸化還元することで、電極を利用した還元型補酵素Ｆ４２０及び酸化型補酵素Ｆ４２０の調製が可能になる。また、補酵素Ｆ４２０を電極上で酸化還元し、その反応を電流値として検出することで、環境中の補酵素Ｆ４２０を測定するバイオセンサも提供される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
［酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法］
本発明の酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法は、下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、
還元型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、アノード電極上で反応させる工程を含む。
本発明の酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法は、下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、
還元型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、アノード電極上で反応させる工程を含む。
【0014】
【化4】
【0015】
＜補酵素Ｆ４２０＞
補酵素Ｆ４２０はメタン生成菌、放線菌等の微生物が有する生体有機化合物である。メタン生成菌においては、メタン生成反応等の酸化還元反応において電子メディエータの補酵素として働く。
補酵素Ｆ４２０には、酸化型形態（酸化型補酵素Ｆ４２０、Ｆ４２０）と還元型形態（還元型補酵素Ｆ４２０、Ｆ４２０・Ｈ２）がある。
酸化型補酵素Ｆ４２０は、下記の構造を有する。
補酵素Ｆ４２０はメタン生成菌、放線菌等の微生物が有する生体有機化合物である。メタン生成菌においては、メタン生成反応等の酸化還元反応において電子メディエータの補酵素として働く。
補酵素Ｆ４２０には、酸化型形態（酸化型補酵素Ｆ４２０、Ｆ４２０）と還元型形態（還元型補酵素Ｆ４２０、Ｆ４２０・Ｈ２）がある。
酸化型補酵素Ｆ４２０は、下記の構造を有する。
【0016】
【化5】
【0017】
［式中、ｎは２～９の整数を示す。］
【0018】
還元型酵素Ｆ４２０は、下記の構造を有する。
【0019】
【化6】
【0020】
［式中、ｎは２～９の整数を示す。］
なお、ｎは補酵素Ｆ４２０が由来する生物種により異なる。
なお、ｎは補酵素Ｆ４２０が由来する生物種により異なる。
【0021】
補酵素Ｆ４２０の入手手段は当業者が適宜選択することができる。例えば、補酵素Ｆ４２０を有する生物を培養し、培養物から抽出及び精製して単離することができる。また、遺伝子組み換え技術を用いて、補酵素Ｆ４２０の合成酵素群を大腸菌等のホスト生物に異種発現させながら培養し、培養物から抽出及び精製して単離することもできる。培養物は、細胞体及び培地のいずれか又は両方である。
精製手段としては、例えばカラムクロマトグラフィが挙げられる。
単離した補酵素Ｆ４２０は、例えば乾燥状態で保存することができる。
精製手段としては、例えばカラムクロマトグラフィが挙げられる。
単離した補酵素Ｆ４２０は、例えば乾燥状態で保存することができる。
【0022】
＜補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素＞
補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素は、下記式（Ｉ）の反応を触媒する酸化還元酵素である。
補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素は、下記式（Ｉ）の反応を触媒する酸化還元酵素である。
【0023】
【化7】
【0024】
上記式（Ｉ）の反応は、酸化型補酵素Ｆ４２０がプロトンを２つ受け取り還元型補酵素Ｆ４２０が生成する還元反応、及びその逆反応である還元型補酵素Ｆ４２０がプロトンを２つ供与し酸化型補酵素Ｆ４２０が生成する酸化反応である。
酵素番号（ＥＣ番号）はＥＣ１．１２．９８．１である。
酵素番号（ＥＣ番号）はＥＣ１．１２．９８．１である。
【0025】
補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素が由来する生物は限定されない。補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素としては、例えば、メタン生成菌又は放線菌に由来する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素が挙げられる。補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素は天然型であっても、上記式（Ｉ）の反応を触媒する酸化還元酵素である限り改変体であってもよい。
【0026】
メタン生成菌としては、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｉ綱、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ綱、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａ綱、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｉ綱に属するメタン生成菌が挙げられる。
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｉ綱に属するメタン生成菌として、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｆｅｒｖｉｄｉｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属等のメタン生成菌が挙げられる。
Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ綱に属するメタン生成菌として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ属等のメタン生成菌が挙げられる。
Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａ綱に属するメタン生成菌として、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｒｉｘ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属等のメタン生成菌が挙げられる。
Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｉ綱に属するメタン生成菌として、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属等のメタン生成菌が挙げられる。
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｉ綱に属するメタン生成菌として、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｏｒｒｉｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｆｅｒｖｉｄｉｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属等のメタン生成菌が挙げられる。
Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ綱に属するメタン生成菌として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ属等のメタン生成菌が挙げられる。
Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａ綱に属するメタン生成菌として、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｒｉｘ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属等のメタン生成菌が挙げられる。
Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｉ綱に属するメタン生成菌として、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属等のメタン生成菌が挙げられる。
【0027】
放線菌としては、例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ綱に属する放線菌が挙げられる。Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ綱に属する放線菌としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｆｒａｎｋｉａ属等の放線菌が挙げられる。
【0028】
補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素の好ましい態様として、メタン生成菌Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ属、特にＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の補酵素Ｆ４２０依存亜硫酸レダクターゼ（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｆ４２０－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；Ｆｓｒ）が挙げられる。
Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が提供するＧｅｎＢａｎｋに、アクセッション番号ＷＰ＿０１０８７０３８５で登録されている（複数のリビジョン（ｒｅｖｉｓｉｏｎ）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。）
Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が提供するＧｅｎＢａｎｋに、アクセッション番号ＷＰ＿０１０８７０３８５で登録されている（複数のリビジョン（ｒｅｖｉｓｉｏｎ）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。）
【0029】
補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素の入手手段は当業者が適宜選択することができる。例えば、補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素の由来生物を培養し、培養物から抽出及び精製して単離することができる。また、遺伝子組み換え技術を用いて、補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素を大腸菌等のホスト生物に異種発現させながら培養し、培養物から抽出及び精製して単離することもできる。培養物は、細胞体及び培地のいずれであってもよい。
簡便性及び製造効率の観点から、遺伝子組み換え技術を用いた異種発現が好ましい。
単離した補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素は、例えば中性程度（ｐＨ６～８程度）であり、塩を含む溶液中で冷凍保存することができる。中性程度の溶液としては、例えばＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ等のｐＫａが６．０～８．０程度の緩衝剤を含む緩衝液（バッファー）が挙げられる。塩としては、例えばＮａＣｌが挙げられる。塩の濃度は、好ましくは１００～３００ｍＭ程度の低濃度である。
補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素を単離する工程は、嫌気的条件下で行うことが好ましい。嫌気的条件下は、通常酸素濃度が１ｐｐｍ以下の条件である。
簡便性及び製造効率の観点から、遺伝子組み換え技術を用いた異種発現が好ましい。
単離した補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素は、例えば中性程度（ｐＨ６～８程度）であり、塩を含む溶液中で冷凍保存することができる。中性程度の溶液としては、例えばＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ等のｐＫａが６．０～８．０程度の緩衝剤を含む緩衝液（バッファー）が挙げられる。塩としては、例えばＮａＣｌが挙げられる。塩の濃度は、好ましくは１００～３００ｍＭ程度の低濃度である。
補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素を単離する工程は、嫌気的条件下で行うことが好ましい。嫌気的条件下は、通常酸素濃度が１ｐｐｍ以下の条件である。
【0030】
＜電子メディエータ＞
電子メディエータは、本発明の酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法において、補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と作用電極との間の電子移動を媒介する酸化還元物質である。
電子メディエータ（電子受容体／電子供与体ともいう）としては、補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と電子を授受することができるとともに、作用電極とも電子を授受することができる物質であれば、特に限定されない。
電子メディエータは、本発明の酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法において、補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と作用電極との間の電子移動を媒介する酸化還元物質である。
電子メディエータ（電子受容体／電子供与体ともいう）としては、補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と電子を授受することができるとともに、作用電極とも電子を授受することができる物質であれば、特に限定されない。
【0031】
電子メディエータとしては、下記の酸化還元物質が例示される：
ナフトキノン、アントラキノン、ハイロドキノン、ピロロキノリンキノン等のキノン系化合物及びその誘導体；
５－メチルフェナジニウムメチルスルファート（フェナジンメトスルファート：ＰＭＳ）、５－エチルフェナジニウムメチルスルファート（フェナジンエトスルファート：ＰＥＳ）等のフェナジン系化合物及びその誘導体；
フェノチアジン系化合物及びその誘導体；
フェノキサジン系化合物及びその誘導体；
ベンジルビオロゲン、メチルビオロゲン等のビオロゲン系化合物及びその誘導体
中心金属がオスミニウム、ルテニウム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、白金等の金属イオンである金属錯体。
金属錯体において、配位子は、例えば、ピリジン、イミダゾール系化合物、ポリピリジン、ポリイミダゾール等の化合物である。
ナフトキノン、アントラキノン、ハイロドキノン、ピロロキノリンキノン等のキノン系化合物及びその誘導体；
５－メチルフェナジニウムメチルスルファート（フェナジンメトスルファート：ＰＭＳ）、５－エチルフェナジニウムメチルスルファート（フェナジンエトスルファート：ＰＥＳ）等のフェナジン系化合物及びその誘導体；
フェノチアジン系化合物及びその誘導体；
フェノキサジン系化合物及びその誘導体；
ベンジルビオロゲン、メチルビオロゲン等のビオロゲン系化合物及びその誘導体
中心金属がオスミニウム、ルテニウム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、白金等の金属イオンである金属錯体。
金属錯体において、配位子は、例えば、ピリジン、イミダゾール系化合物、ポリピリジン、ポリイミダゾール等の化合物である。
【0032】
本発明の酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法において、酸化反応を進行させる観点から、電子メディエータは酸化型補酵素Ｆ４２０の酸化還元電位（－５３５ｍＶ ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ溶液）よりも正側の酸化還元電位を有することが好ましい。酸化型補酵素Ｆ４２０の酸化還元電位と電子メディエータ酸化還元電位とはある程度近いことが好ましく、その差は好ましくは３００ｍＶ以下、より好ましくは１００ｍＶ以下である。
また、電子メディエータは、電子メディエータが酵素の活性部位に近接する際の立体障害等の分子形状、分子サイズ、分子間相互作用等を考慮して選択されることが好ましい。
このような観点から、電子メディエータは、好ましくはビオロゲン系化合物、より好ましくはベンジルビオロゲンである。
また、電子メディエータは、電子メディエータが酵素の活性部位に近接する際の立体障害等の分子形状、分子サイズ、分子間相互作用等を考慮して選択されることが好ましい。
このような観点から、電子メディエータは、好ましくはビオロゲン系化合物、より好ましくはベンジルビオロゲンである。
【0033】
＜電極＞
本発明の酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法に置おける作用電極であるアノード電極及び帯電局であるカソード電極としては、種々の素材からなる電極を使用することができる。具体的には、炭素電極、金電極、白金電極、パラジウム電極等を使用することができる。
本発明の酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法に置おける作用電極であるアノード電極及び帯電局であるカソード電極としては、種々の素材からなる電極を使用することができる。具体的には、炭素電極、金電極、白金電極、パラジウム電極等を使用することができる。
【0034】
本発明の好ましい態様の1つにおいて、作用電極が補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素及び電子メディエータを含む反応層を備えた電極である。
反応層の構成としては、例えば、ポリマーと、補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素及び電子メディエータは必要に応じてリンカー基を介して前記ポリマーと結合している構成の反応層が挙げられる。換言すると、補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素及び電子メディエータが、ポリマー及びリンカーを介して、電極上に担持されている態様である。
ポリマーとしては、（メタ）アクリレート系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ポリリジン等の親水性ポリマー及びこれらの共重合体ポリマーが挙げられる。
リンカー基としては、ヒドロキシエステル、エポキシ基又はグリシジル基含有化合物等のクロスリンカー化合物に由来するリンカー基が挙げられる。
電子メディエータを含むポリマーを、「レドックスポリマー」ともいう。
反応層の構成としては、例えば、ポリマーと、補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素及び電子メディエータは必要に応じてリンカー基を介して前記ポリマーと結合している構成の反応層が挙げられる。換言すると、補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素及び電子メディエータが、ポリマー及びリンカーを介して、電極上に担持されている態様である。
ポリマーとしては、（メタ）アクリレート系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ポリリジン等の親水性ポリマー及びこれらの共重合体ポリマーが挙げられる。
リンカー基としては、ヒドロキシエステル、エポキシ基又はグリシジル基含有化合物等のクロスリンカー化合物に由来するリンカー基が挙げられる。
電子メディエータを含むポリマーを、「レドックスポリマー」ともいう。
【0035】
＜反応条件＞
本発明の酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法は、酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、還元型補酵素Ｆ４２０と、電子メディエータとを、アノード電極上で反応させる工程を含む。
電極上の反応は、液体媒体中で行うことが好ましい。液体媒体としては、リン酸バッファー等が挙げられる。ｐＨは好ましくは６～８、より好ましくは７前後である。
反応は化学量論に従って進行する。
反応温度は、例えば０℃超１００℃未満、好ましくは２０℃～８５℃、より好ましくは２５℃～４０℃、更に好ましくは３０℃前後とすることができる。
印加条件は、例えば、－５３０～－４００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ溶液）とすることができる。
本発明の酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法は、酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、還元型補酵素Ｆ４２０と、電子メディエータとを、アノード電極上で反応させる工程を含む。
電極上の反応は、液体媒体中で行うことが好ましい。液体媒体としては、リン酸バッファー等が挙げられる。ｐＨは好ましくは６～８、より好ましくは７前後である。
反応は化学量論に従って進行する。
反応温度は、例えば０℃超１００℃未満、好ましくは２０℃～８５℃、より好ましくは２５℃～４０℃、更に好ましくは３０℃前後とすることができる。
印加条件は、例えば、－５３０～－４００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ溶液）とすることができる。
【0036】
かくして、酸化型補酵素Ｆ４２０が調製される。
【0037】
［還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法］
本発明の還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法は、下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、
酸化型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、カソード電極上で反応させる工程を含む。
本発明の還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法は、下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と、
酸化型補酵素Ｆ４２０と、
電子メディエータとを、カソード電極上で反応させる工程を含む。
【0038】
【化8】
【0039】
本発明の還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法は、原料物質の１つが酸化型補酵素Ｆ４２０であり、カソード電極上で反応させる以外は上記「酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法」と同様に行うことができる。
本発明の還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法において、還元反応を進行させる観点から、電子メディエータはＦ４２０の酸化還元電位（－５３５ｍＶ ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ溶液）よりも負側の酸化還元電位を有することが好ましい。還元型補酵素Ｆ４２０の酸化還元電位と電子メディエータ酸化還元電位とはある程度近いことが好ましく、その差は好ましくは３００ｍＶ以下、より好ましくは１００ｍＶ以下である。
本発明の還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法の反応条件において、印加条件は、例えば、－７５０～－５９０ｍＶ（ｖｓ. Ａｇ／ＡｇＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ溶液）とすることができる。
本発明の還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法において、還元反応を進行させる観点から、電子メディエータはＦ４２０の酸化還元電位（－５３５ｍＶ ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ溶液）よりも負側の酸化還元電位を有することが好ましい。還元型補酵素Ｆ４２０の酸化還元電位と電子メディエータ酸化還元電位とはある程度近いことが好ましく、その差は好ましくは３００ｍＶ以下、より好ましくは１００ｍＶ以下である。
本発明の還元型補酵素Ｆ４２０の調製方法の反応条件において、印加条件は、例えば、－７５０～－５９０ｍＶ（ｖｓ. Ａｇ／ＡｇＣｌ、３Ｍ ＮａＣｌ溶液）とすることができる。
【0040】
かくして、還元型補酵素Ｆ４２０が調製される。
【0041】
［補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサ］
本発明の補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサは、下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と電子メディエータとを含む作用電極、及び対極を含む。
本発明の補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサは、下記式（Ｉ）の反応を触媒する補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素と電子メディエータとを含む作用電極、及び対極を含む。
【0042】
【化9】
【0043】
作用電極は、上記「酸化型補酵素Ｆ４２０の調製方法」欄に記載の補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素及び電子メディエータを含む反応層を備えた電極を使用することができる。反応層において、補酵素Ｆ４２０酸化還元酵素及び電子メディエータがリンカー基を介してポリマーと結合している構成、多孔質膜で酵素とメディエータが覆われている構成、ポリマー以外の担体に酵素とメディエータとが結合している構成、酵素とメディエータが直接結合している構成等が挙げられる。
【0044】
本発明の補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサを用いた補酵素Ｆ４２０の測定は、例えば以下のようにして行うことができる。
作用電極が備える反応層に補酵素Ｆ４２０を含む試料を加えて反応させ、さらに電極に一定の電圧を印加する。電流をモニタリングし、電圧印加開始から一定時間に蓄積される電流を積算する、又は電圧印加開始から一定時間を経過したある時点での若しくはサイクリックボルタンメトリーで得られる電流値を測定する。得られた電流の積算値又は電流値に基づき、標準濃度の補酵素Ｆ４２０溶液により作成した検量曲線に従い、試料中の補酵素Ｆ４２０濃度を算出することができる。
作用電極が備える反応層に補酵素Ｆ４２０を含む試料を加えて反応させ、さらに電極に一定の電圧を印加する。電流をモニタリングし、電圧印加開始から一定時間に蓄積される電流を積算する、又は電圧印加開始から一定時間を経過したある時点での若しくはサイクリックボルタンメトリーで得られる電流値を測定する。得られた電流の積算値又は電流値に基づき、標準濃度の補酵素Ｆ４２０溶液により作成した検量曲線に従い、試料中の補酵素Ｆ４２０濃度を算出することができる。
【0045】
本発明の補酵素Ｆ４２０測定用バイオセンサは、補酵素Ｆ４２０に基づいたシグナル強度から濃度を算出するための演算装置及び算出された補酵素Ｆ４２０の濃度を表示するためのディスプレイをさらに備えていてもよい。
【実施例0046】
以下、実施例により本開示を更に詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0047】
調製例１：酵素Ｆｓｒの大腸菌発現と精製
メタン生成菌Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の補酵素Ｆ４２０依存亜硫酸レダクターゼ（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｆ４２０－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（以下、酵素Ｆｓｒと記載する）を大腸菌で異種発現した。大腸菌コドンに最適化したＦｓｒ人工遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ，Ｑ５８２８０）を合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社へ委託）し、ｐＥＴ－２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩサイト－ＸｈｏＩサイト間に導入した。このベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
形質転換した大腸菌を、カナマイシン添加Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ培地（カナマイシン終濃度３０μｇ／ｍＬ）を使って３７℃で培養した。
濁度ＯＤ６００が０．８～１．０の間に達した後、Ｆｓｒの発現誘導を文献（Ｖｉｔｔ ｅｌ ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４２６，２８１３－２８２６）に記述されたＦｒｈＢの発現誘導法に準じて実施した。
具体的には、システイン（０．１２ｇ／Ｌ）、硫化鉄（０．１ｇ／Ｌ）、クエン酸鉄（０．１ｇ／Ｌ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．１ｇ／Ｌ）、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を加えて２５℃で発現誘導した。１５時間培養後、遠心機を用いて集菌した。集菌した大腸菌をバイヤル瓶に入れゴム栓をした後、Ｎ２ガスで嫌気状態にパージした。Ｆｓｒの精製作業を行うまで－３０℃で冷凍保管した。
メタン生成菌Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の補酵素Ｆ４２０依存亜硫酸レダクターゼ（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｆ４２０－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（以下、酵素Ｆｓｒと記載する）を大腸菌で異種発現した。大腸菌コドンに最適化したＦｓｒ人工遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ，Ｑ５８２８０）を合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社へ委託）し、ｐＥＴ－２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩサイト－ＸｈｏＩサイト間に導入した。このベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
形質転換した大腸菌を、カナマイシン添加Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ培地（カナマイシン終濃度３０μｇ／ｍＬ）を使って３７℃で培養した。
濁度ＯＤ６００が０．８～１．０の間に達した後、Ｆｓｒの発現誘導を文献（Ｖｉｔｔ ｅｌ ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４２６，２８１３－２８２６）に記述されたＦｒｈＢの発現誘導法に準じて実施した。
具体的には、システイン（０．１２ｇ／Ｌ）、硫化鉄（０．１ｇ／Ｌ）、クエン酸鉄（０．１ｇ／Ｌ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．１ｇ／Ｌ）、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を加えて２５℃で発現誘導した。１５時間培養後、遠心機を用いて集菌した。集菌した大腸菌をバイヤル瓶に入れゴム栓をした後、Ｎ２ガスで嫌気状態にパージした。Ｆｓｒの精製作業を行うまで－３０℃で冷凍保管した。
【0048】
培養した大腸菌からＦｓｒの抽出と精製を実施した。Ｆｓｒの酸素曝露を回避するため、抽出から精製までの一連の作業は基本的にグローブボックス内の嫌気的な環境（酸素濃度＜１ｐｐｍ）で実施した。グローブボックス外へ取り出す際は密閉容器に入れた。使用した全てのバッファーは事前にＮ２ガスのパージで嫌気状態にした純水を溶媒として使用し、グローブボックス内の嫌気条件で作成した。
試料は常に４℃に冷やした状態で作業を実施した。
培養した大腸菌を５０ｍＬのＬｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１０μＭ ＦＡＤ（ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ：７．６）に溶かし、ホモジナイザーで破砕した。破砕液を遠沈管に移して密閉した後、グローブボックス外へ持ち出し、低温条件（４℃）で上清と沈殿物に遠心分離した。試料をグローブボックス内に戻した後、遠沈管の蓋を開けて上清を回収した。
試料は常に４℃に冷やした状態で作業を実施した。
培養した大腸菌を５０ｍＬのＬｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、１０μＭ ＦＡＤ（ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ：７．６）に溶かし、ホモジナイザーで破砕した。破砕液を遠沈管に移して密閉した後、グローブボックス外へ持ち出し、低温条件（４℃）で上清と沈殿物に遠心分離した。試料をグローブボックス内に戻した後、遠沈管の蓋を開けて上清を回収した。
【0049】
上清をＮｉ－ＮＴＡアガロースカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）に注入して、Ｆｓｒをカラム上に吸着させた。カラム上の夾雑物をＷａｓｈバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＦＡＤ、ｐＨ：７．６、２０ｍＭ イミダゾール）で除去した。カラム上に吸着させたＦｓｒをＥｌｕｔｉｏｎバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＦＡＤ、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ：７．６）で溶出して回収した。
回収した試料の一部に対してポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、クマシンブリリアントブルー染色）を実施し、Ｆｓｒの回収を確認した。
回収したＦｓｒを限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５，３０ｋＤａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮した。濃縮試料をＳｔｏｃｋバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＦＡＤ、ｐＨ：７．６）を用いて希釈した。試料の一部を回収してＵＶ２８０の吸光度測定により濃度を求め、終濃度を調整した。
回収した試料の一部に対してポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、クマシンブリリアントブルー染色）を実施し、Ｆｓｒの回収を確認した。
回収したＦｓｒを限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５，３０ｋＤａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて濃縮した。濃縮試料をＳｔｏｃｋバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０μＭ ＦＡＤ、ｐＨ：７．６）を用いて希釈した。試料の一部を回収してＵＶ２８０の吸光度測定により濃度を求め、終濃度を調整した。
【0050】
調製例２：補酵素Ｆ４２０の精製
補酵素Ｆ４２０を、ジャーファメンターを用いて大量培養されたメタン生成菌試料から抽出し、文献（Ｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｔｈａｕｅｒ，２００１，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３３１，３１７－３５３）を参考に精製した。
具体的には、ジャーファメンターから回収された菌体を含む培養液を超音波ホモジナイザーで破砕し、溶液中に補酵素Ｆ４２０を溶出した。遠心分離機を用いて菌体片と溶液を分離し、補酵素Ｆ４２０が含まれる上清を回収した。回収した上清中の成分をバッファーＡ（水：ギ酸＝１：６９、ｐＨ３．０、１０Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ メルカプトエタノール）で調整したＳｅｒｄｏｌｉｔ ＰＡＤ Ｉカラム（Ｓｅｒｖａ社製）に注入し、補酵素Ｆ４２０をカラム上に吸着した。カラム上に吸着しにくい夾雑成分をバッファーＡ及びバッファー緩衝液Ａにメタノールを加えた溶液（１５％）で洗浄した。カラム上に吸着している補酵素Ｆ４２０をメタノールで回収した。
回収した溶液を遠心エバポレーターで低温乾燥（４℃）し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ 緩衝液（ｐＨ７．６）に再溶解させた。再溶解した試料を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ 緩衝液（ｐＨ７．６）でコンディショニングしたＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５カラム（Ｃｙｔｉｖａ社製）に注入し、補酵素Ｆ４２０をカラム上に吸着した。カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで洗浄し、一部の共雑成分を除去した。カラム上に吸着した成分を下記に示す溶液を順番に使用して段階的に溶出を行い、７つの画分を得た。
（１） １０ｍＭ ギ酸、
（２） ２０ｍＭ ギ酸、
（３） ３０ｍＭ ギ酸、
（４） １００ｍＭ ギ酸、
（５） ２００ｍＭ ギ酸、
（６） ３００ｍＭ ギ酸、
（７） １００ｍＭ 塩酸
補酵素Ｆ４２０が含まれる（７）１００ｍＭ塩酸溶出画分を回収し、ロータリーエバポレーターで乾固した。乾固した試料の一部を高速液体クロマトグラフィー／ダイオードアレイ検出器（ＨＰＬＣ／ＤＡＤ）で測定し、補酵素Ｆ４２０が回収されかつ精製されたことを確認した。
補酵素Ｆ４２０を、ジャーファメンターを用いて大量培養されたメタン生成菌試料から抽出し、文献（Ｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｔｈａｕｅｒ，２００１，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３３１，３１７－３５３）を参考に精製した。
具体的には、ジャーファメンターから回収された菌体を含む培養液を超音波ホモジナイザーで破砕し、溶液中に補酵素Ｆ４２０を溶出した。遠心分離機を用いて菌体片と溶液を分離し、補酵素Ｆ４２０が含まれる上清を回収した。回収した上清中の成分をバッファーＡ（水：ギ酸＝１：６９、ｐＨ３．０、１０Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ メルカプトエタノール）で調整したＳｅｒｄｏｌｉｔ ＰＡＤ Ｉカラム（Ｓｅｒｖａ社製）に注入し、補酵素Ｆ４２０をカラム上に吸着した。カラム上に吸着しにくい夾雑成分をバッファーＡ及びバッファー緩衝液Ａにメタノールを加えた溶液（１５％）で洗浄した。カラム上に吸着している補酵素Ｆ４２０をメタノールで回収した。
回収した溶液を遠心エバポレーターで低温乾燥（４℃）し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ 緩衝液（ｐＨ７．６）に再溶解させた。再溶解した試料を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ 緩衝液（ｐＨ７．６）でコンディショニングしたＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５カラム（Ｃｙｔｉｖａ社製）に注入し、補酵素Ｆ４２０をカラム上に吸着した。カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで洗浄し、一部の共雑成分を除去した。カラム上に吸着した成分を下記に示す溶液を順番に使用して段階的に溶出を行い、７つの画分を得た。
（１） １０ｍＭ ギ酸、
（２） ２０ｍＭ ギ酸、
（３） ３０ｍＭ ギ酸、
（４） １００ｍＭ ギ酸、
（５） ２００ｍＭ ギ酸、
（６） ３００ｍＭ ギ酸、
（７） １００ｍＭ 塩酸
補酵素Ｆ４２０が含まれる（７）１００ｍＭ塩酸溶出画分を回収し、ロータリーエバポレーターで乾固した。乾固した試料の一部を高速液体クロマトグラフィー／ダイオードアレイ検出器（ＨＰＬＣ／ＤＡＤ）で測定し、補酵素Ｆ４２０が回収されかつ精製されたことを確認した。
【0051】
実施例１：補酵素Ｆ４２０の電極反応実験（１）
補酵素Ｆ４２０の電極反応実験はグローブボックス内の嫌気的環境下（酸素濃度＜１ｐｐｍ、３０℃）で実施した。作用電極は炭素ディスク電極（径３ｍｍ、ビー・エー・エス株式会社製）、対電極はＰｔ線（ビー・エー・エス株式会社製）、参照電極はＡｇ／ＡｇＣｌ電極（３Ｍ ＮａＣｌ溶液、１９５ｍＶ ｖｓ．ＲＨＥ、ビー・エー・エス株式会社製）を使用した。
溶媒として、０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ＝７．０）を使用した。バッファーは事前に脱気した純水を溶媒として用いてグローブボックス内で作製した。
基質として、精製したＦｓｒ、補酵素Ｆ４２０とベンジルビオロゲンを使用した。
基質を緩衝液に溶解し、下記表１に示す試料を調製した。なお、表中には、炭素ディスク電極を作用極に用いた実施時における各基質の濃度を示す。
補酵素Ｆ４２０の電極反応実験はグローブボックス内の嫌気的環境下（酸素濃度＜１ｐｐｍ、３０℃）で実施した。作用電極は炭素ディスク電極（径３ｍｍ、ビー・エー・エス株式会社製）、対電極はＰｔ線（ビー・エー・エス株式会社製）、参照電極はＡｇ／ＡｇＣｌ電極（３Ｍ ＮａＣｌ溶液、１９５ｍＶ ｖｓ．ＲＨＥ、ビー・エー・エス株式会社製）を使用した。
溶媒として、０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ＝７．０）を使用した。バッファーは事前に脱気した純水を溶媒として用いてグローブボックス内で作製した。
基質として、精製したＦｓｒ、補酵素Ｆ４２０とベンジルビオロゲンを使用した。
基質を緩衝液に溶解し、下記表１に示す試料を調製した。なお、表中には、炭素ディスク電極を作用極に用いた実施時における各基質の濃度を示す。
【0052】
【表1】
【0053】
調製した試料のサイクリックボルタンメトリーを、初期電位：－４００ｍＶ、高電位：－４００ｍＶ、低電位：－６５０ｍＶ、初期スキャン極性：Ｎｅｇａｔｉｖｅ、掃引速度：１０ｍＶ／ｓｅｃ、最終電位：０ｍＶの条件で実施した。
結果を図１に示す。図１は、試料１－１～１－４のそれぞれにおける、補酵素Ｆ４２０のサイクリックボルタモグラムを示す。
結果を図１に示す。図１は、試料１－１～１－４のそれぞれにおける、補酵素Ｆ４２０のサイクリックボルタモグラムを示す。
【0054】
測定の結果、全ての基質を加えた系でのみで現れるサイクリックボルタモグラムの形状と、最も高い電流の極大値が確認できた。これにより、Ｆｓｒとベンジルビオロゲンを加えた条件で補酵素Ｆ４２０の電極反応が生じることが確認できた。
【0055】
実施例２：補酵素Ｆ４２０電極反応の電極反応実験（２）
補酵素Ｆ４２０電極反応をさらに検証するために、サイクリックボルタンメトリーにおける４２０ｎｍ光の吸光度変化を測定した。補酵素Ｆ４２０は酸化体ではピーク波長４２０ｎｍの吸光特性を示すが、還元体では示さない。そのため、４２０ｎｍの吸光度変化を観測することで電極上での補酵素Ｆ４２０の酸化還元反応を確認することができる。
実験装置として、石英ガラス製光電気化学セル（ビー・エー・エス株式会社製）を使用した。作用電極には金メッシュ電極（ビー・エー・エス株式会社製）、対電極にはＰｔ線（ビー・エー・エス株式会社製）、参照電極にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極（３Ｍ ＮａＣｌ溶液、１９５ｍＶ ｖｓ．ＲＨＥ、ビー・エー・エス株式会社製）を使用した。
溶媒として、０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ：７．０）を使用した。バッファーと基質は、事前に脱気した純水を溶媒として用いてグローブボックス内で作製した。基質には精製したＦｓｒ、補酵素Ｆ４２０とベンジルビオロゲンを使用した。
電気化学セルを分光器内のセルホルダーに設置し、そこへ密閉容器に保存したバッファーを注入した。この時、緩衝液の上面にＧ１グレードの高純度Ｎ２ガスを流速３ｍＬ／ｍｉｎで継続して流すことで溶液の嫌気状態を維持した。それぞれの基質を緩衝液に溶かし、下記表２に示す試料を調製した。なお、表中には、金メッシュ電極を作用極に用いた実施時における各基質の濃度を示す。
補酵素Ｆ４２０電極反応をさらに検証するために、サイクリックボルタンメトリーにおける４２０ｎｍ光の吸光度変化を測定した。補酵素Ｆ４２０は酸化体ではピーク波長４２０ｎｍの吸光特性を示すが、還元体では示さない。そのため、４２０ｎｍの吸光度変化を観測することで電極上での補酵素Ｆ４２０の酸化還元反応を確認することができる。
実験装置として、石英ガラス製光電気化学セル（ビー・エー・エス株式会社製）を使用した。作用電極には金メッシュ電極（ビー・エー・エス株式会社製）、対電極にはＰｔ線（ビー・エー・エス株式会社製）、参照電極にはＡｇ／ＡｇＣｌ電極（３Ｍ ＮａＣｌ溶液、１９５ｍＶ ｖｓ．ＲＨＥ、ビー・エー・エス株式会社製）を使用した。
溶媒として、０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４バッファー（ｐＨ：７．０）を使用した。バッファーと基質は、事前に脱気した純水を溶媒として用いてグローブボックス内で作製した。基質には精製したＦｓｒ、補酵素Ｆ４２０とベンジルビオロゲンを使用した。
電気化学セルを分光器内のセルホルダーに設置し、そこへ密閉容器に保存したバッファーを注入した。この時、緩衝液の上面にＧ１グレードの高純度Ｎ２ガスを流速３ｍＬ／ｍｉｎで継続して流すことで溶液の嫌気状態を維持した。それぞれの基質を緩衝液に溶かし、下記表２に示す試料を調製した。なお、表中には、金メッシュ電極を作用極に用いた実施時における各基質の濃度を示す。
【0056】
【表2】
【0057】
全ての基質は事前にバッファーに溶かして密閉容器で保管し、シリンジ針を用いて嫌気状態を維持したままセルに注入した。調製した試料に対してサイクリックボルタンメトリーを行い、同時に金メッシュ電極を透過する４２０ｎｍ光量の変化を観測した。測定条件は初期電位：－４００ｍＶ、高電位：－４００ｍＶ、低電位：－６５０ｍＶ、初期スキャン極性：Ｎｅｇａｔｉｖｅ、掃引速度：１０ｍＶ／ｓｅｃ、最終電位：０ｍＶの条件で実施した。
吸光度測定は実験開始時の値を基準（０値）として測定を行った。
結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。図２Ａは、試料２－１及び２－２のそれぞれにおける、補酵素Ｆ４２０のサイクリックボルタモグラムを示す。図２Ｂは、試料２－１及び２－２のそれぞれにおける、４２０ｎｍ吸光度の経時的変化を示す。
吸光度測定は実験開始時の値を基準（０値）として測定を行った。
結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。図２Ａは、試料２－１及び２－２のそれぞれにおける、補酵素Ｆ４２０のサイクリックボルタモグラムを示す。図２Ｂは、試料２－１及び２－２のそれぞれにおける、４２０ｎｍ吸光度の経時的変化を示す。
【0058】
測定の結果、Ｆｓｒを加えた系におけるサイクリックボルタンメトリーで４２０ｎｍの吸光度に変化が生じることが確認できた。
【0059】
以上実施例１及び２の結果より、Ｆｓｒの作用によって補酵素Ｆ４２０の電極反応が進行していることが確認できた。
【図1】
【図2A】
【図2B】
