特開 2024-175939 細胞外小胞の解析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024175939

(43)【公開日】2024-12-19

(54)【発明の名称】細胞外小胞の解析方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/00 20060101AFI20241212BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20241212BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20241212BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/00 C ZNA

C07K14/435

C12N15/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023094053

(22)【出願日】2023-06-07

(71)【出願人】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】000173762

【氏名又は名称】公益財団法人相模中央化学研究所

(72)【発明者】

【氏名】穂谷 恵

(72)【発明者】

【氏名】井上 宗宣

(72)【発明者】

【氏名】荻原 望

(72)【発明者】

【氏名】松永 太一

【テーマコード（参考）】

4B063

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA05

4B063QQ08

4B063QR48

4B063QR82

4B063QS15

4B063QS31

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA50

4H045DA83

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】 細胞外小胞のオミックス解析を簡便かつ精度高く実施可能な方法を提供すること。
【解決手段】 試料中に含まれる細胞外小胞を不溶性担体と当該担体に固定化した、スフィンゴミエリン結合性タンパク質を含むスフィンゴミエリン認識分子とを含む吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した細胞外小胞に存在する分子を解析する工程とを含む方法で、細胞外小胞をオミックス解析することにより、前記課題を解決する
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中に含まれる細胞外小胞を、細胞外小胞を吸着可能な吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した細胞外小胞に存在する分子を解析する工程とを含む、細胞外小胞のオミックス解析方法であって、
前記吸着剤が、不溶性担体と、前記不溶性担体に固定化した、スフィンゴミエリン結合性タンパク質を含むスフィンゴミエリン認識分子とを含む吸着剤である、前記解析方法。

【請求項2】

スフィンゴミエリン認識分子が、スフィンゴミエリン結合性タンパク質、および不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質をさらに含む、請求項１に記載の解析方法。

【請求項3】

細胞外小胞に存在する分子が、細胞外小胞に存在するタンパク質である、請求項１に記載の解析方法。

【請求項4】

スフィンゴミエリン結合性タンパク質がイクイナトキシンである、請求項１から３のいずれかに記載の解析方法。

【請求項5】

イクイナトキシンが以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかから選択されるタンパク質である、請求項４に記載の解析方法：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含む、タンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし前記アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料中に含まれる細胞外小胞の解析方法に関する。特に本発明は、当該細胞外小胞のオミックス解析を精度高く実施可能な方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞外小胞は、その内部にマイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡなどの核酸やタンパク質などの物質を含んでおり、細胞間の情報伝達を担っていると考えられていることから、がんなどの各種疾患のバイオマーカーとして注目されるだけでなく、新規治療薬やドラックデリバリーシステムとしての応用も期待されている（非特許文献１）。

【0003】

前記目的で細胞外小胞を利用する場合、試料中に含まれる細胞外小胞を単離し、当該単離した細胞外小胞中に含まれるタンパク質や核酸などを解析（いわゆるオミックス［ｏｍｉｃｓ］解析）する必要がある。

【0004】

オミックス解析使用を目的とした細胞外小胞を単離する方法として、細胞外小胞表面に存在するホスファチジルセリンに対し結合性を有するアネキシンＶやＴｉｍ４を利用した方法が知られており（特許文献１および非特許文献２）、当該方法は細胞外小胞を簡便な操作で単離できる。しかしながら、当該方法によって単離された細胞外小胞の精製度は低く、オミックス解析用途には不十分であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】ＷＯ２０１６／０８８６８９号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１３年，１３巻，１６３７－１６５３頁

【非特許文献2】日本薬理学雑誌，２０１７年，１４９巻，１１９－１２２頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の課題は、細胞外小胞のオミックス解析を簡便かつ精度高く実施可能な方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者等は上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、試料中に含まれる細胞外小胞を、不溶性担体と当該担体に固定化したスフィンゴミエリン認識分子とを含む吸着剤を用いて単離することで、前記細胞外小胞を簡便、かつオミックス解析に利用可能な精製度で単離できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0009】

すなわち本発明は、以下の［１］から［５］に記載の態様を包含する。

【0010】

［１］試料中に含まれる細胞外小胞を、細胞外小胞を吸着可能な吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した細胞外小胞に存在する分子を解析する工程とを含む、前記細胞外小胞のオミックス解析方法であって、前記吸着剤が、不溶性担体と、前記不溶性担体に固定化したスフィンゴミエリン結合性タンパク質を含むスフィンゴミエリン認識分子とを含む吸着剤である、前記解析方法。

【0011】

［２］スフィンゴミエリン認識分子が、スフィンゴミエリン結合性タンパク質、および不溶性担体との結合能を有した固定化補助タンパク質をさらに含む、前記［１］に記載の解析方法。

【0012】

［３］細胞外小胞に存在する分子が、細胞外小胞に存在するタンパク質である、前記［１］または［２］に記載の解析方法。

【0013】

［４］スフィンゴミエリン結合性タンパク質がイクイナトキシンである、前記［１］から［３］のいずれかに記載の解析方法。

【0014】

［５］イクイナトキシンが以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかから選択されるタンパク質である、前記［４］に記載の解析方法：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含む、タンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし前記アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質。

【0015】

以下、本発明をさらに詳細に説明する。

【0016】

本発明において細胞外小胞とは、真核細胞から分泌された脂質二重膜で構成された２０ｎｍ以上数μｍ以下の粒子のことを指し、その大きさや由来により、エクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅ）、マイクロベシクル（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）、アポトーシス小胞（Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）に分類される。中でも、疾患診断や治療に有効性が認められている（例えば、Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂａｓｅｌ），２０２１年，１０巻，３５９頁）点で、粒径５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下のエクソソームおよびマイクロベシクルが好ましい。

【0017】

本発明は、試料中に含まれる細胞外小胞のオミックス解析をする際、不溶性担体と当該担体に固定化したスフィンゴミエリン結合性タンパク質を含むスフィンゴミエリン認識分子とを含む吸着剤（以下、「細胞外小胞吸着剤」とも表記）に吸着させることで前記小胞を単離してから解析することを特徴としている。

【0018】

不溶性担体は、水溶液に対して不溶性の担体であれば特に制限されない。一例として、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体、常磁性酸化鉄等を原料とした磁性微粒子が挙げられる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましく、具体的には、トヨパール（東ソー製）等のヒドロキシ基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（サイティバ製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。中でも、表面積が大きく、スフィンゴミエリン認識分子の固定化量を多くできる点で、粒状物が好ましい。また、その粒径は、細胞外小胞が不溶性担体の隙間を目詰まりすることなく通過でき、かつ入手が容易な点で、直径１μｍ以上１０μｍ以下が好ましい。

【0019】

スフィンゴミエリン認識分子は、少なくともスフィンゴミエリン特異的に結合能を有するタンパク質（以下、「スフィンゴミエリン結合性タンパク質」とも表記）を含んでいればよく、当該タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にスフィンゴミエリン結合能を有さないポリペプチドや分子が付加されていてもよい。前記付加してよい、ポリペプチドや分子の一例として、タンパク質タグであるＳｐｙＴａｇまたはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、可溶性の高いタンパク質であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＳｐＡ）のＺドメイン、ＧＳリンカー（グリシン４残基とセリン１残基の繰り返しからなるリンカー）などのリンカー配列、ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ認識配列などのプロテアーゼ認識配列、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグなどの分離精製用タグ、グルタチオン Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合性ドメイン（ＣＢＤ）などの不溶性担体への固定化用タンパク質が挙げられる。中でも、ＳｐＡのＺドメインが大腸菌による組換えスフィンゴミエリン結合性タンパク質の生産性を向上できる点で、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒがスフィンゴミエリン結合性タンパク質の分子密度や配向性を制御できる点で、それぞれ好ましい。

【0020】

スフィンゴミエリン結合性タンパク質の一例として、ウメボシイソギンチャク（Ａｃｔｉｎｉａ ｅｑｕｉｎａ）由来のイクイナトキシンＩＩ（Ｅｑｕｉｎａｔｏｘｉｎ ＩＩ、以下「ＥｑｔＩＩ」とも表記）、シマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｆｏｅｔｉｄａ）由来のライセニン（Ｌｙｓｅｎｉｎ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）由来のプルロトライシンＡ２（Ｐｌｅｕｒｏｔｏｌｙｓｉｎ Ａ２）やオストレオリシンＡ（Ｏｓｔｒｅｏｌｙｓｉｎ Ａ）が挙げられる。中でも、ＥｑｔＩＩは、大腸菌による組換えタンパク質の生産が容易な点で、スフィンゴミエリン結合性タンパク質の好ましい態様といえる。

【0021】

またスフィンゴミエリン結合性タンパク質は、天然に存在するスフィンゴミエリン結合性タンパク質（その部分領域も含む、以下同様）に限らず、スフィンゴミエリン結合能を有する限り、前記タンパク質においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上有してもよい。

【0022】

スフィンゴミエリン結合性タンパク質がＥｑｔＩＩである場合の好ましい態様として、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかから選択されるタンパク質があげられる。なお配列番号１は天然型（変異未導入の）ＥｑｔＩＩの部分配列であり、具体的にはＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ６１９１４の３６番目から２１４番目までのアミノ酸配列に相当する。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含む、タンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該アミノ酸残基において１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつスフィンゴミエリン結合能を有するタンパク質。

【0023】

前記（ｂ）において「１もしくは数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１個以上２０個以下、１個以上１０個以下、１個以上５個以下、１個以上３個以下のいずれかを意味する。また前記（ｂ）に記載の「置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上」には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いなどに基づく、天然にも生じ得る変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。

【0024】

（ｂ）に記載の「置換」の例として、配列番号１の８番目のバリンおよび６９番目のリジンのシステインへの置換があげられる（配列番号２）。なお当該置換は、膜孔形成毒素（Ｐｏｒｅ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｔｏｘｉｎ）である天然型のＥｑｔＩＩ（配列番号１）を無毒化し、安全性を高める置換である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年，２７９巻，４６５０９－４６５１７頁）。

【0025】

（ｃ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上であればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本発明において相同性とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。アミノ酸配列間の同一性とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列間の類似性とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。

【0026】

スフィンゴミエリン認識分子１分子当たりに含まれるスフィンゴミエリン結合性タンパク質の数に制限はないが、スフィンゴミエリンへの親和性が高く、かつ大腸菌での組換えタンパク質を用いた作製も容易な点で、３個以上９個以下が好ましい。また、細胞外小胞吸着剤に含まれるスフィンゴミエリン認識分子の種類に制限はなく、２種類以上のスフィンゴミエリン認識分子が固定化されていてもよい。

【0027】

スフィンゴミエリン結合性タンパク質の具体例として、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。なお配列番号３のうち、５番目のセリンから１８３番目のアラニンまでがＮＴ－ＥｑｔＩＩ（配列番号２）のアミノ酸配列であり、１８９番目のグリシンから２０２番目のグリシンまでがＧＳリンカー配列であり、２０７番目のグリシンから３２２番目のイソロイシンまでがタンパク質タグＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｎｏ．４ＭＬＩのＣｈａｉｎ ＡおよびＢ［１１６残基］、以下「ＳｐｙＣ」とも表記）のアミノ酸配列である。

【0028】

なお不溶性担体上には、スフィンゴミエリン結合性タンパク質が細胞外小胞に対する特異的な結合能を有している限り、スフィンゴミエリンを認識しない物質（以下、「スフィンゴミエリン非結合性物質」とも表記）を結合（固定化）させてもよい。スフィンゴミエリン非結合性物質として、固定化補助タンパク質、ウシ血清アルブミンなど不溶性担体表面の非特異的な吸着を防ぐタンパク質、デキストランなどの担体表面の親水性を向上させる非タンパク質成分、を例示できる。このうち固定化補助タンパク質は、スフィンゴミエリン結合性タンパク質との結合能を有し、かつスフィンゴミエリン結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際に当該タンパク質の密度や配向を制御する機能を有したタンパク質である。１つのスフィンゴミエリン認識分子固定化担体におけるスフィンゴミエリン非結合性物質の結合数や種類に制限はなく、２種類以上のスフィンゴミエリン非結合性物質が固定化（結合）されていてもよい。

【0029】

不溶性担体に固定化するスフィンゴミエリン非結合性物質としては、スフィンゴミエリン結合性タンパク質の密度や配向を制御しスフィンゴミエリン結合性タンパク質の細胞外小胞への結合性を最適化する点で、固定化補助タンパク質が好ましく、３量体構造を有した固定化補助タンパク質が、スフィンゴミエリン結合性タンパク質の多価効果による親和性向上が得られ、かつ作製も容易な点から、さらに好ましい。

【0030】

Ｃ末端側に前述したＳｐｙＣを付加したスフィンゴミエリン結合性タンパク質と、アビジンやストレプトアビジンなどのビオチン結合性タンパク質を固定化した不溶性担体とを用いた場合における、固定化補助タンパク質の具体例として、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。

【0031】

なお、配列番号４のうち５番目が前記不溶性担体へ固定化させる際のビオチン標識に用いるシステイン残基であり、１５番目のアスパラギン酸から７２番目のバリンまでがＳｐＡのＺドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ０５２７３０の４番目から６１番目まで）のアミノ酸配列であり、７８番目のグリシンから９２番目のセリンまで、１１２番目のグリシンから１２６番目のセリンまで、および１６２番目のグリシンから１７６番目のセリンまでがＧＳリンカー配列であり、１２９番目のアラニンから１４２番目のアラニンまで、および１７９番目のアラニンから１９２番目のアラニンまでがαヘリックスリンカー配列であり、９５番目のアラニンから１０７番目のリジンまで、１４５番目のアラニンから１５７番目のリジンまで、および２００番目のアラニンから２１２番目のリジンまでがタンパク質タグＳｐｙＴａｇ（以下「ＳｐｙＴ」とも表記）のアミノ酸配列である。

【0032】

スフィンゴミエリン認識分子の不溶性担体への固定化は、当業者が通常用いる一般的なものであれば特に制限はない。例えば、
不溶性担体にマレイミド基やカルボキシ基等の反応性官能基を導入後、当該官能基にスフィンゴミエリン認識分子を直接固定化してもよいし、
スフィンゴミエリン結合性タンパク質と固定化補助タンパク質とを例えばＳｐｙＴ／ＳｐｙＣのアミノ酸配列を含む多量体形成タンパク質を介して結合させスフィンゴミエリン認識分子を調製後、アビジン、ストレプトアビジンなどのビオチン結合性タンパク質を導入した不溶性担体に、前記認識分子が有するビオチンを介して固定化してもよいし、
反応性官能基を介して固定化補助タンパク質などのスフィンゴミエリン非結合性物質を不溶性担体に固定化後、スフィンゴミエリン結合性タンパク質をスフィンゴミエリン非結合性物質に結合させることで、前記不溶性担体に固定化してもよいし、
不溶性担体にスフィンゴミエリン認識分子を接触させ、当該認識分子を物理的吸着によって不溶性担体に固定化してもよい。

【0033】

中でもスフィンゴミエリン結合性タンパク質を固定化補助タンパク質を介して不溶性担体に固定化させることで、スフィンゴミエリン認識分子を不溶性担体に固定化させると、固定化工程時の反応が穏やかになりスフィンゴミエリン結合性タンパク質の変性が少なくなる点、およびスフィンゴミエリン結合性タンパク質の担体上での配向や密度を制御できる点で、好ましい。

【0034】

本発明において試料中に含まれる細胞外小胞を細胞外小胞吸着剤に吸着させる工程は、当業者が通常用いる一般的な方法であれば特に制限はない。細胞外小胞を含む試料は特に制限はなく、生体組織、培養した細胞などの生体に由来するものや、培地や緩衝液等の溶液に細胞外小胞を懸濁させたものであってもよい。前記細胞外小胞を含む試料を調製するための溶媒は、細胞外小胞を安定な状態で保持可能であり、かつ細胞外小胞吸着剤への細胞外小胞の吸着を阻害しなければ特に制限はないが、スフィンゴミエリン認識分子や溶液中に含まれる細胞外小胞の変性を防ぐ点で、ｐＨ６．０以上８．０以下に調製した緩衝液が好ましく、具体的にはＴＢＳ（Ｔｒｉｓ ［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ］ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ［４－（２－ＨｙｄｒｏｘｙＥｔｈｙｌ）－１－ＰｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ］ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）が例示できる。さらに前記溶媒は、スフィンゴミエリン認識分子と溶液中成分との非特異的吸着を防ぐために界面活性剤をさらに含んでもよく、具体的には、０．００００１％（ｗ／ｖ）以上０．５％（ｗ／ｖ）以下の非イオン性界面活性剤をさらに含んでもよい。非イオン性界面活性剤の好ましい例として、Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）があげられる。

【0035】

細胞外小胞吸着剤と細胞外小胞を含む試料とを接触させる温度は、細胞外小胞やスフィンゴミエリン認識分子の変性を防ぐ点で２℃以上４０℃以下が好ましい。また細胞外小胞吸着剤と細胞外小胞を含む試料との接触時間は、スフィンゴミエリン認識分子と細胞外小胞が接触する時間を確保し、かつ細胞外小胞の変性を防ぐ点で、３０分以上２４時間以下が好ましく、１時間以上１２時間以下がより好ましい。

【0036】

細胞外小胞吸着剤へは試料中に含まれる細胞外小胞とともに、夾雑物も非特異的に吸着する。したがって、当該夾雑物を除去する洗浄工程を追加するとよい。洗浄工程は、当業者が通常用いる方法から適宜選択すればよい。洗浄用の緩衝液やｐＨは、例えば、前記の細胞外小胞を含む溶液を調製するための溶媒と同様のものを用いればよい。温度についても、細胞外小胞吸着剤に細胞外小胞を吸着させる工程と同様に実施すればよい。

【0037】

細胞外小胞吸着剤に吸着した細胞外小胞のオミックス解析を行なう際は、当該細胞外小胞を吸着剤から解離させ解析してもよいし、当該細胞外小胞を吸着させたまま内包分子を抽出し解析してもよい。前記解離は当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、５０℃以上の高温処理によりスフィンゴミエリン認識分子を変性させ解離させる方法や、高濃度の塩、アミノ酸や界面活性剤などを添加し解離させてもよい。前記抽出も当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、細胞外小胞の膜を可溶化できる濃度の界面活性剤で処理し抽出する方法や、細胞外小胞の膜を超音波で破砕し抽出する方法があげられる。膜を可溶化するための界面活性剤も特に限定はなく、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＮＰ－４０（以上、商品名）、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）などの中から適宜選択すればよい。

【0038】

本発明においてオミックス解析とは、解析対象である細胞外小胞に存在する分子の解析であれば特に限定はない。一例として、前記小胞中に存在するタンパク質を解析するプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）解析、前記小胞中に存在する核酸を解析するゲノミクス（ｇｅｎｏｍｉｃｓ）解析やトランスクリプトミクス（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ）解析、前記小胞中に存在する代謝物質を解析するメタボロミクス（ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ）解析があげられる。中でも本発明は、プロテオミクス解析を行なう際、特に有用な方法である。

【0039】

解析方法も特に限定はなく、一例としてオミックス解析がプロテオミクス解析の場合、質量分析計を利用した方法があげられる。具体的には、Ｓ－Ｔｒａｐ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＰｒｏｔｉＦｉ社製）やＤｅｔｅｒｇｅｎｔ－ｆｒｅｅ Ｅｘｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（１０１ Ｂｉｏ社製）といった市販の前処理キットを利用し、細胞外小胞に存在するタンパク質の抽出、還元、アルキル化、およびトリプシン処理などを行なった後、質量分析計に供し、解析すればよい。

【発明の効果】

【0040】

本発明は、試料中に含まれる細胞外小胞のオミックス解析を行なう際、不溶性担体と当該担体に固定化した、スフィンゴミエリン結合性タンパク質を含むスフィンゴミエリン認識分子とを含む吸着剤に吸着させることで前記小胞を単離してから解析することを特徴としており、前記解析を簡便かつ精度高く実施できる。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】実施例で作製した、スフィンゴミエリン結合性タンパク質、固定化補助タンパク質、スフィンゴミエリン認識分子、および細胞外小胞吸着剤の模式図。

【実施例0042】

以下、実施例および比較例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

【0043】

実施例１ スフィンゴミエリン結合性タンパク質の作製
（１）無毒化イクイナトキシン（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ、配列番号２）とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｎｏ．４ＭＬＩのＣｈａｉｎ ＡおよびＢ［１１６残基］、以下「ＳｐｙＣ」とも表記）との融合タンパク質（（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣ、配列番号３）のＮ末端側にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡのＺドメイン（ＳｐＡ－Ｚ、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬ０５２７３０の４番目から６１番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチド）を付加したポリペプチド（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣ（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を、ｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣ（配列番号５）を大腸菌で発現可能なベクターｐＥＴ＿（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣを作製した。

【0044】

（２）（１）で作製した発現ベクターｐＥＴ＿（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、組換え大腸菌（形質転換体）を得た。

【0045】

（３）得られた形質転換体を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（１０ｇ／Ｌ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行なった。

【0046】

（４）（３）の前培養液を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）培地（２４ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４、２．２ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４および４ｍＬ／Ｌ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。

【0047】

（５）培養液の濁度（ＯＤ_{６００ｎｍ}）が約０．６になった時点で、培養温度を２０℃に切り替え、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を０．１ｍＭ添加した後、さらに一晩培養することで（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣを発現させた。

【0048】

（６）培養液から集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）を用いて、メーカープロトコルに従い、菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。

【0049】

（７）可溶性タンパク質抽出液中からの（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣの精製をニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行ない、限外ろ過フィルターを用いて保存用緩衝液（１５０ｍＭ 塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））に置換した。

【0050】

（８）（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣからヒスチジンタグおよびＳｐＡ－Ｚを除去するため、ヒスチジンタグペプチドを融合したＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ（メルク製）を用いてメーカープロトコルに従い（ＳｐＡ－Ｚ）－（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣを消化した。

【0051】

（９）消化液に５ｍＭのイミダゾールを添加後、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製することで、（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣ（配列番号３）溶液を得た。

【0052】

実施例２ 固定化補助タンパク質の作製
（１）Ｎ末端側にビオチン標識用システイン残基（Ｃｙｓ）を付加したＳｐＡ－Ｚと３コピーのＳｐｙＴａｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ Ｎｏ．４ＭＬＩのＣｈａｉｎ Ｂ［１３残基］、以下「ＳｐｙＴ」とも表記）との融合タンパク質（Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ、配列番号４）をコードするポリヌクレオチドを、ｐＧＥＸ（サイティバ製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、グルタチオン Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＣｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴとの融合タンパク質ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号７）を大腸菌で発現可能なベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを作製した（ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号８に示す）。

【0053】

（２）（１）で作製した発現ベクターｐＧＥＸ＿ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴで大腸菌ＢＬ２１株を形質転換し、組換え大腸菌（形質転換体）を得た。

【0054】

（３）得られた形質転換体を６０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加したＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養後、当該前培養液を６０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加したＬＢ培地に接種し、３７℃で振盪培養した。

【0055】

（４）培養液の濁度（ＯＤ_{６００ｎｍ}）が約０．６になった時点で、培養温度を３０℃に切り替え、ＩＰＴＧを０．５ｍＭ添加した後、さらに５時間培養することで、ＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを発現させた。

【0056】

（５）培養液から集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）を用いて、メーカープロトコルに従い菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。

【0057】

（６）可溶性タンパク質抽出液中からのＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴの精製を、グルタチオン固定化担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行なった。

【0058】

（７）前記固定化担体に結合したＧＳＴ－Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを、ＧＳＴ融合ＨＲＶ ３Ｃプロテアーゼ（メルク製）を用いてメーカープロトコルに従い消化し、上清を回収することで、Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号４）溶液を得た。

【0059】

実施例３ スフィンゴミエリン認識分子の作製
（１）実施例２で得た固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号４）溶液を、限外ろ過フィルターを用いてＤ－ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）に置換し、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ＰＥＧ２－Ｂｉｏｔｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用い、メーカープロトコルに従ってシステイン残基のスルフヒドリル基をビオチン標識した。

【0060】

（２）（１）でビオチン標識した固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号４）および実施例１で得たスフィンゴミエリン結合性タンパク質（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣ（配列番号３）を、それぞれ濃度０．３ｍｇ／ｍＬ以上となるよう、Ｄ－ＰＢＳ（＋）またはｐＨ７．０以上ｐＨ８．０以下のＴＢＳ－Ｔ（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）を含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２））に懸濁した。

【0061】

（３）ビオチン標識Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴに対し、（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣがモル比で４以上となるよう両懸濁液を混合後、４℃で一昼夜以上放置することでＳｐｙＴとＳｐｙＣとを結合させ、固定化補助タンパク質にスフィンゴミエリン結合性タンパク質を３つ結合したスフィンゴミエリン認識分子である、（（ＮＴ－ＥｑｔＩＩ）－ＳｐｙＣ）_３／Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴを作製した。

【0062】

実施例４ スフィンゴミエリン認識分子を含む細胞外小胞吸着剤の作製
（１）不溶性担体として、ストレプトアビジン固定化磁性微粒子であるＭａｇｎｏｓｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（粒径３μｍ）（ＪＳＲライフサイエンス製）を採用した。当該磁性微粒子のスラリー溶液（微粒子含有率１％（ｗ／ｖ））を２５０μＬ採取し、上清を除去後、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）を含むＤ－ＰＢＳ）で洗浄した。

【0063】

（２）実施例３で作製したスフィンゴミエリン認識分子を固定化補助タンパク質Ｃｙｓ－（ＳｐＡ－Ｚ）－３ＳｐｙＴ（配列番号４）の濃度に換算して０．１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度に調整した。

【0064】

（３）（１）で洗浄した磁性微粒子に、（２）で調製したスフィンゴミエリン認識分子溶液を、固定化補助タンパク質量に換算して２５μｇ添加し、室温で１５分間混和し、反応させた。

【0065】

（４）反応後の上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄することで、スフィンゴミエリン認識分子を含む細胞外小胞吸着剤を作製した。

【0066】

実施例５ スフィンゴミエリン認識分子を含む細胞外小胞吸着剤を用いた、試料中に含まれる細胞外小胞のオミックス解析
（１）細胞外小胞を含む試料の調製
（１－１）前立腺がん細胞株（ＰＣ３細胞）を、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（富士フイルム和光純薬製）を用いて３７℃で培養した。

【0067】

（１－２）培養したＰＣ３細胞を、１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（あらかじめ限外濾過膜処理により細胞外小胞を除去済）を含むＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地でさらに２日間培養後、培養上清１５０ｍＬを回収した。

【0068】

（１－３）回収した培養上清を３００×Ｇで１０分間、室温で遠心分離して浮遊細胞を除去後、上清を回収した。さらに０．２２μｍフィルターを通過させ、細胞デブリを除去した濾液を細胞培養上清とした。

【0069】

（１－４）（１－３）で得た細胞培養上清を、限外ろ過フィルターを用いて５００μＬに濃縮し、これを細胞外小胞を含む試料とした。

【0070】

（２）細胞外小胞吸着剤による、試料中に含まれる細胞外小胞の吸着
（２－１）実施例４で作製したスフィンゴミエリン認識分子を含む細胞外小胞吸着剤が入った容器に、（１）で調製した試料およびＰＢＳ－Ｔをそれぞれ５００μＬずつ添加後、当該容器を４℃で３時間、振とうした。

【0071】

（２－２）上清を除去後、５００μＬのＰＢＳ－Ｔで２回洗浄することで、試料中に含まれる細胞外小胞を吸着した吸着剤を得た。

【0072】

（３）吸着剤に吸着した細胞外小胞のオミックス解析
（３－１）（２）で得られた細胞外小胞を吸着した吸着剤が入った容器に、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）を含むＲＩＰＡバッファー（ナカライテスク製）５０μＬを添加することで、当該吸着した細胞外小胞を可溶化した。

【0073】

（３－２）遠心濃縮器で溶媒を一部除去後、Ｓ－Ｔｒａｐ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＰｒｏｔｉＦｉ製）を用いてメーカープロトコルに従い、タンパク質抽出、抽出したタンパク質の還元・アルキル化、および酵素（トリプシン／リシルエンドペプチダーゼ）処理を行なった。

【0074】

（３－３）（３－２）の処理で回収したペプチド断片を、１５μＬの０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸－５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液に溶解し、これを測定サンプルとした。当該サンプル中に含まれるタンパク質量は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いて定量した。

【0075】

（３－４）（３－３）で得られた測定サンプル１０μｇを、Ｅａｓｙ－ｎＬＣ １２００（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）に供し、液体クロマトグラフィー分析を行なった。なお、カラムは３μｍ Ｃ１８ ＮＡＮＯ ＨＰＬＣ ＣＡＰＩＬＬＡＲＹ ＣＯＬＵＭＮ（日京テクノス製）を、溶離液は０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸－蒸留水および０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸－８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを、それぞれ用いた。

【0076】

（３－５）液体クロマトグラフィー分析後のサンプルは引き続き、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）に供し、エレクトロスプレーイオン化ポジティブモードで質量分析した。

【0077】

（３－６）質量分析結果をＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．２（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用い、タンパク質を同定した。データベースはＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）を用いた。なお当該タンパク質に帰属したペプチドアミノ酸配列の全数が２つ以上同定されたものを同定タンパク質とした。

【0078】

比較例１ ホスファチジルセリン認識分子を含む細胞外小胞吸着剤の作製
（１）不溶性担体として、ストレプトアビジン固定化磁性微粒子であるＭａｇｎｏｓｈｅｒｅ ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（粒径３μｍ）（ＪＳＲライフサイエンス製）を採用した。当該磁性微粒子のスラリー溶液（微粒子含有率１％（ｗ／ｖ））を２５０μＬ採取し、上清を除去後、ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＰＳ Ｖｅｒ．２（富士フイルム和光純薬製、以下「ＦＷ製キット」とも表記）に添付のＥｘｏｓｏｍｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ／Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（１×）で洗浄した。

【0079】

（２）（１）で洗浄した磁性微粒子に、ホスファチジルセリン認識分子溶液（Ｂｉｏｔｉｎ－ｌａｂｅｌｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｃａｐｔｕｒｅ、ＦＷ製キットに添付）を４１．６５μＬ添加し、室温で１５分間混和し、反応させた。

【0080】

（３）反応後の上清を除去し、ＦＷ製キットに添付のＥｘｏｓｏｍｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ／Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（１×）で３回洗浄することで、ホスファチジルセリン認識分子を含む細胞外小胞吸着剤を作製した。

【0081】

比較例２ ホスファチジルセリン認識分子を含む細胞外小胞吸着剤を用いた、試料中に含まれる細胞外小胞のオミックス解析
（１）比較例１で作製したホスファチジルセリン認識分子を含む細胞外小胞吸着剤が入った容器に、実施例５（１）で調製した試料５００μＬ、ＴＢＳ－Ｔ ５００μＬおよびＦＷ製キットに添付のＥｘｏｓｏｍｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（５００×）２μＬを添加後、当該容器を４℃で３時間、振とうした。

【0082】

（２）上清を除去後、ＦＷ製キットに添付のＥｘｏｓｏｍｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ／Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（１×） ５００μＬで２回洗浄することで、試料中に含まれる細胞外小胞を吸着した吸着剤を得た。

【0083】

（３）実施例５（３）に記載の方法で、吸着剤に吸着した細胞外小胞のオミックス解析を行なった。

【0084】

実施例５および比較例２の解析で同定できたタンパク質を表１に示す。スフィンゴミエリン認識分子を含む吸着剤で吸着した細胞外小胞の解析結果（実施例５）からは、細胞外小胞に関連するタンパク質（具体的には、ＣＤ９、Ｓｙｎｔｅｎｉｎ－１、ＡｌｉｘおよびＨＳＰ６０の４種類）のみ同定できた。一方、ホスファチジルセリン認識分子を含む吸着剤で吸着した細胞外小胞の解析結果（比較例２）からは、前述した細胞外小胞に関連するタンパク質４種類の他に、小胞体に関連するタンパク質（具体的には、Ｃａｌｎｅｘｉｎ、Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ、ＤＮＡＪＡ１、ＧＡＮＡＢ、ＨＳＰＨ１、Ｐ４ＨＢ、ＰＤＩＡ６、ＰＲＫＣＳＨ、Ｒｐｎ１、Ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ－２およびＶＣＰ）も同定された。以上の結果より、細胞外小胞のオミックス解析をする際、試料中に含まれる細胞外小胞をスフィンゴミエリン認識分子を含む吸着剤で吸着させることで、ホスファチジルセリン認識分子を含む吸着剤で吸着させるよりも、精度高く解析可能なことがわかる。

【0085】

【表1】

【図1】

【配列表】

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