特開 2024-176854 植物のＫＯＤＡ蓄積量を増加させるための方法、ＫＯＤＡ製造システム、およびストレス耐性が増大した植物の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024176854

(43)【公開日】2024-12-19

(54)【発明の名称】植物のＫＯＤＡ蓄積量を増加させるための方法、ＫＯＤＡ製造システム、およびストレス耐性が増大した植物の製造方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 1/00 20060101AFI20241212BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241212BHJP

   A01H 3/00 20060101ALI20241212BHJP

   C12P 7/6409 20220101ALI20241212BHJP

   C12N 15/61 20060101ALN20241212BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20241212BHJP

   C12N 15/29 20060101ALN20241212BHJP

【ＦＩ】

A01H1/00 A

C12N5/10

A01H3/00

C12P7/6409

C12N15/61

C12N15/53

C12N15/29

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023095691

(22)【出願日】2023-06-09

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】000004226

【氏名又は名称】日本電信電話株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】304021417

【氏名又は名称】国立大学法人東京科学大学

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100129230

【弁理士】

【氏名又は名称】工藤 理恵

(72)【発明者】

【氏名】今村 壮輔

(72)【発明者】

【氏名】高谷 和宏

(72)【発明者】

【氏名】下嶋 美恵

(72)【発明者】

【氏名】川東 真理子

(72)【発明者】

【氏名】若松 孝幸

【テーマコード（参考）】

2B030

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

2B030AD04

2B030AD20

2B030CA17

4B064AD88

4B064AD89

4B064CA11

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA11

4B065AA88X

4B065AA88Y

4B065AA89X

4B065AA89Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065BB31

4B065CA10

4B065CA53

(57)【要約】

【課題】植物の個体、組織、または細胞におけるＫＯＤＡの蓄積量を増加させるための方法、ＫＯＤＡを製造するためのシステム、および、ストレス耐性が増大した植物の製造方法を提供する。
【解決手段】植物の個体、組織、または細胞をリン欠乏条件の培地に維持する工程を含む、ＫＯＤＡの蓄積量を増加させるための方法が提供される。溶存リン濃度が１ｍＭ未満である培地に維持された９－ＬＯＸ遺伝子および／またはＡＯＳ遺伝子を含む植物の個体、組織、または細胞を含む、ＫＯＤＡを製造するためのシステムも提供される。植物に９－ＬＯＸ遺伝子および／またはＡＯＳ遺伝子を導入する工程と、該植物をリン欠乏条件の培地で栽培する工程を含む、ストレス耐性が増大した植物の製造方法も提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

植物の個体、組織、または細胞における９，１０－α－ケトールリノレン酸の蓄積量を増加させるための方法であって、
前記植物の個体、組織、または細胞をリン欠乏条件の培地に維持する工程（ａ）を含む、方法。

【請求項2】

前記リン欠乏条件の培地は、溶存リン濃度が１ｍＭ未満である培地である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記植物の個体、組織、または細胞が、９－ＬＯＸをコードする遺伝子、および／または、ＡＯＳをコードする遺伝子を含む植物の個体、組織、または細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記維持する工程（ａ）の後に、蓄積された９，１０－α－ケトールリノレン酸を前記植物の個体、組織、または細胞から抽出する工程（ｂ）をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

溶存リン濃度が１ｍＭ未満である培地に維持された、９－ＬＯＸをコードする遺伝子、および／または、ＡＯＳをコードする遺伝子を含む植物の個体、組織、または細胞を含む、９，１０－α－ケトールリノレン酸を製造するためのシステム。

【請求項6】

ストレス耐性が増大した植物の製造方法であって、
植物に９－ＬＯＸをコードする遺伝子およびＡＯＳをコードする遺伝子から選択される少なくとも１個の遺伝子を導入する工程と、
前記遺伝子が導入された植物をリン欠乏条件の培地で栽培する工程とを含む、
方法。

【請求項7】

前記リン欠乏条件の培地は、溶存リン濃度が１ｍＭ未満である培地である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ストレス耐性が高温耐性である、請求項６または７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、植物の９，１０－α－ケトールリノレン酸（ＫＯＤＡ）の蓄積量を増加させるための方法およびシステムに関する。また本開示はストレス耐性が増大した植物の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

９，１０－α－ケトールリノレン酸（9-hydroxy-10-oxo-12(Z),15(Z)-octadecadienoic acid、または9,10-ketol-octadecadienoic acidとも表記され、ＫＯＤＡと略称される）は、植物で生合成される生理活性物質であり、植物に環境ストレス耐性（乾燥、病害など）を付与し、植物の成長を促進させることが知られている。このような特筆すべき性質から、ＫＯＤＡを農業分野で実用化することが強く期待されている。非特許文献１はＫＯＤＡを化学的に合成する方法を報告している（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Yokokawa et al., “Total Synthesis of α-Ketol Derivative of Linolenic Acid (KODA), a Flower-inducing Factor in Lemna paucicostata”, Chemistry Letters, Vol.32, No.9, pp.844-845. (2003)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、一般に植物におけるＫＯＤＡの生合成量（細胞内蓄積量）は極めて少なく、また、植物を用いたＫＯＤＡ大量生産系の構築はなされていない。非特許文献１の化学合成法は非常に多くの反応ステップを経る必要があり、最終的な収率が０．８１％と非常に低いため、ＫＯＤＡ生産のコストが高いという問題があった。遺伝子組み換え大腸菌などから抽出した９－ＬＯＸおよびＡＯＳ酵素タンパク質を用いてインビトロでＫＯＤＡを生産することも可能である。しかしながら、基質原料として高価なα－リノレン酸を添加する必要があるため、コストが大きくなってしまうという問題があった。

【0005】

本開示は上記のような問題を解決するためになされたものであり、その実施形態は、植物の個体、組織、または細胞におけるＫＯＤＡの蓄積量を増加させるための方法、ＫＯＤＡを製造するためのシステム、および、ストレス耐性が増大した植物の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を達成するため、本開示の一態様は、植物の個体、組織、または細胞における９，１０－α－ケトールリノレン酸の蓄積量を増加させるための方法であって、前記植物の個体、組織、または細胞をリン欠乏条件の培地に維持する工程（ａ）を含む方法である。

【0007】

本開示の一態様は、溶存リン濃度が１ｍＭ未満である培地に維持された、９－ＬＯＸをコードする遺伝子、および／または、ＡＯＳをコードする遺伝子を含む植物の個体、組織、または細胞を含む、９，１０－α－ケトールリノレン酸を製造するためのシステムである。

【0008】

本開示の一態様は、ストレス耐性が増大した植物の製造方法であって、植物に９－ＬＯＸをコードする遺伝子およびＡＯＳをコードする遺伝子から選択される少なくとも１個の遺伝子を導入する工程と、前記遺伝子が導入された植物をリン欠乏条件の培地で栽培する工程とを含む方法である。

【発明の効果】

【0009】

本開示によれば、植物の個体、組織、または細胞におけるＫＯＤＡの蓄積量を増加させるための方法、ＫＯＤＡを製造するためのシステム、および、ストレス耐性が増大した植物の製造方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】リン酸十分条件（＋Ｐｉ）またはリン酸欠乏条件（－Ｐｉ）の培地で栽培された、野生株（ＷＴ）、ベクターコントロール株（ＶＣ）、および形質転換株のＫＯＤＡ含有量（μｇ／ｇ新鮮重量）を示す。各株について、左側のグラフが＋Ｐｉであり右側のグラフが－Piである。

【図2】リン酸十分条件（＋Ｐｉ）またはリン酸欠乏条件（－Ｐｉ）での培地で栽培され、高温ストレス（３７℃、４日または５日）にさらされた、野生株（ＷＴ）、ベクターコントロール株（ＶＣ）、および形質転換株の写真を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本開示の非限定的な実施形態を説明する。本開示は以下の実施形態における例示に限定されない。

【0012】

［ＫＯＤＡの蓄積量を増加させるための方法］
一態様において、植物の個体、組織、または細胞における９，１０－α－ケトールリノレン酸の蓄積量を増加させるための方法が提供される。この方法は、植物の個体、組織、または細胞をリン欠乏条件の培地に維持する工程（ａ）を含む。

【0013】

実施形態において、植物は特に限定されず、陸上植物、水中植物、着生植物、および岩生植物を含み得る。実施形態の植物は、アオイ科、アカザ科、アカネ科、アブラナ科、イネ科、ウリ科、キク科、クワ科、ゴマ科、サトイモ科、ナス科、パパイア科、バラ科、マメ科、ミカン科、モクセイ科、ユリ科の植物を含むが、これらに限定されない。実施形態の植物のより具体的な例としては、キウイフルーツ（Actinidia deliciosa）、セロリ（Apium graveolens var. dulce）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ビート（Beta vulgaris subsp. Vulgaris）、カリフラワー（Brassica oleracea var. botrytis）、キャベツ（Brassica oleracea var. capitata）、ブロッコリー（Brassica oleracea var. italica）、ナタネ（Brassica rapa）、チンゲン菜（Brassica rapa var. chinensis）、チャノキ（Camellia sinensis）、ピーマン（Capsicum annuum）、パプリカ（Capsicum annuum）、ベニバナ（Carthamus tinctorius）、ライム（Citrus aurantifolia）、レモン（Citrus limon）、オレンジ（Citrus sinensis）、グレープフルーツ（Citrus x paradisi）、ココヤシ（Cocos nucifera）、コーヒーノキ（Coffea arabica）、タロイモ（Colocasia esculenta）、キュウリ（Cucumis sativus）、カボチャ（Cucurbita maxima）、カキ（Diospyros kaki）、ソバ（Fagopyrum esculentum）、イヌビエ（Echinochloa crus-galli）イチジク（Ficus carica）、イチゴ（Fragaria × ananassa）、ダイズ（Glycine max）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、オオムギ（Hordeum vulgare）、レタス（Lactuca sativa）、アオウキクサ（Lemna aoukikusa）、リンゴ（Malus domestica）、バナナ（Musa spp.）、タバコ（Nicotiana tabacum）、バジル（Ocimum basilicum）、オリーブ（Olea europaea）、イネ（Oryza sativa）、アボカド（Persea americana）、パセリ（Petroselinum crispum）、インゲン豆（Phaseolus vulgaris）、エンドウ豆（Pisum sativum）、ナシ（Pyrus pyrifolia）、ローズマリー（Rosmarinus officinalis）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、トマト（Solanum lycopersicum）、ナス（Solanum melongena）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、タイム（Thymus vulgaris）、コムギ（Triticum aestivum）、ブドウ（Vitis spp.）、トウモロコシ（Zea mays）を挙げることができるが、これらに限定されない。このうち、シロイヌナズナ、アオウキクサ、トマト、ナタネ、イヌビエ、またはタバコがより好ましい。アブラナ科が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。

【0014】

実施形態の方法において、植物の個体を用いることもできるし、植物の個体の一部、例えば組織または細胞を用いることもできる。当業者に知られるように、植物の組織または細胞は培養組織または培養細胞として維持され得る。

【0015】

上記実施形態の植物の個体、組織、または細胞は、リン欠乏条件の培地で維持することによって、ＫＯＤＡの蓄積量を増加させることができる。ＫＯＤＡの蓄積が生じる部位は、典型的には細胞内であるが、細胞外での蓄積の可能性も排除されない。またＫＯＤＡの蓄積する部位は、花、茎、根、果実、種子、胚、もしくはこれらの組合せ（例えば地上部）、またはカルスであり得るが、これらに限定されない。

【0016】

実施形態において、９，１０－α－ケトールリノレン酸（9,10-α-ketol linolenic acid）はKODA、9-hydroxy-10-oxo-12(Z),15(Z)-octadecadienoic acid、または9,10-ketol-octadecadienoic acidとも称される化合物を意味する。本開示では９，１０－α－ケトールリノレン酸を単に「ＫＯＤＡ」と記載する場合がある。以下にＫＯＤＡの構造を示す。

【0017】

【化1】

【0018】

ＫＯＤＡは個々の水溶液環境における平衡状態に応じて自発的にイオン形態または塩形態としても存在し得ることが当業者に理解される。従って本開示におけるＫＯＤＡはそのイオン形態および塩形態も包含するものと解されるべきである。ＫＯＤＡの塩は例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、その他一価カチオン塩であり得る。

【0019】

植物の個体、組織、または細胞を培地に維持するとは、当業者によく知られているように、個体をその培地で栽培すること、および組織または細胞をその培地中で培養することを含む。植物の個体、組織、または細胞をそれぞれ生存状態で維持することに適した培地は当業者に知られており、例えば土壌、水溶液、寒天培地等であり得る。植物の個体、組織、または細胞をリン欠乏条件の培地に維持することは、植物の個体、組織、または細胞がそれまで維持されてきた培地を、それらのＫＯＤＡ蓄積量の有意な増加が起こる程度までリン濃度が低下された培地に変更することを含み得る。リン欠乏条件の培地に維持するための適切な期間は、植物、組織、または細胞の種類に応じて異なり得る。その期間は例えば少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも１０日間、または少なくとも１カ月であり得る。またその期間は例えば１年以下、１カ月以下、１０日間以下、３日間以下、２日間以下、または２４時間以下であり得る。

【0020】

本開示におけるリンは、例えばリン酸（またはそのイオン）の状態で存在し得る。従って例えば「リン濃度」という用語は、リンが単体として存在していることは必ずしも意味せず、リン原子換算濃度として理解されるべきである。例えば本願実施例のように培地にリンをリン酸形態でのみ添加する実験を記述する文脈では、「リン欠乏」という用語と「リン酸欠乏」という用語は同義になり得る。

【0021】

リン欠乏条件の培地は、植物の個体、組織、または細胞のＫＯＤＡ蓄積量の有意な増加が起こる程度までリン濃度が低下された培地である。本開示において、培地のリン濃度は、培地の水性成分中の溶存リンのリン原子換算濃度として表すことができる。例えば培地が土壌であれば、遠心分離、濾過等で土壌中の固形物から水性液を分離してその水性液の溶存リン濃度を測定することができる。培地が寒天培地であれば、寒天を加える前の水溶液の溶存リン濃度を測定することができる。リン欠乏条件の培地の溶存リン濃度は具体的には例えば１ｍＭ未満であり得、好ましくは０．１ｍＭ以下であり、より好ましくは０．０１ｍＭ以下であり、０ｍＭであってもよい。

【0022】

表１に植物の生育に用いられる培地の一つの組成を例示する。

【0023】

【表1】

【0024】

例えば表１の培地の組成において、ＫＨ_２ＰＯ_４濃度を０ｍＭに変更した培地は、リン欠乏条件の培地である。

【0025】

上記実施形態の方法は、培地中のリン酸濃度変更という安価で容易に行うことができる操作によって、植物体中のＫＯＤＡの蓄積量が増大するという驚くべき効果を有する。

【0026】

実施形態の植物の個体、組織、または細胞は、９－ＬＯＸをコードする遺伝子、および／または、ＡＯＳをコードする遺伝子を含み得、これら両方の遺伝子を含むことがより好ましい。これらの遺伝子は、内在性の遺伝子であってもよいし、外在性の遺伝子であってもよい。外在性の遺伝子は、植物の個体、組織、または細胞に人為的に導入されたものでもよく、例えば形質転換によって導入されたものでもよい。

【0027】

本開示における形質転換とは、外在性の遺伝子を導入することにより、対応する非形質転換の個体、組織、または細胞と比べて当該遺伝子の発現を増加させることを含む。形質転換は、アグロバクテリウム法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、ＰＥＧ法、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９法を含む種々のゲノム編集技術、を含む、当業者に知られた様々な手法によって行うことができる。

【0028】

実施形態の、９－ＬＯＸをコードする遺伝子（９－ＬＯＸ遺伝子ともいう）は、９－リポキシゲナーゼ（９－ＬＯＸ）をコードする遺伝子である。９－ＬＯＸはリノレン酸の９位にヒドロペルオキシ基を導入する活性を有する酵素である。好ましくは、９－ＬＯＸをコードする遺伝子がコードする９－ＬＯＸは、植物由来の９－ＬＯＸであり、より好ましくはアオウキクサ由来の９－ＬＯＸである。９－ＬＯＸをコードする遺伝子によってコードされる９－ＬＯＸは、上記の活性を有する限り、アミノ酸の置換、欠失、および追加のうちの１つ以上を含み得る。より具体的には、９－ＬＯＸはアオウキクサ由来の９－ＬＯＸに対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する酵素であり得る。

【0029】

実施形態の、ＡＯＳをコードする遺伝子（ＡＯＳ遺伝子ともいう）は、アレンオキシドシンターゼ（ＡＯＳ）をコードする遺伝子である。ＡＯＳは、ヒドロペルオキシ化した脂肪酸からアレンオキシドを合成するアレンオキシドシンターゼ活性を有する酵素である。好ましくは、ＡＯＳをコードする遺伝子がコードするＡＯＳは、植物由来のＡＯＳであり、より好ましくはアオウキクサ由来のＡＯＳである。ＡＯＳをコードする遺伝子によってコードされるＡＯＳは、上記の活性を有する限り、アミノ酸の置換、欠失、および追加のうちの１つ以上を含み得る。より具体的には、ＡＯＳはアオウキクサ由来のＡＯＳに対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する酵素であり得る。

【0030】

実施形態の、９－ＬＯＸおよびＡＯＳをそれぞれコードする遺伝子は、機能性のプロモーターと作動可能に連結した遺伝子でありうる。機能性のプロモーターは、植物の個体、組織、または細胞において９－ＬＯＸまたはＡＯＳの発現を誘導しうるものであれば特に限定されず、好適な例として、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターおよびその改変体を含む。機能性のプロモーターに連結された９－ＬＯＸ遺伝子および／またはＡＯＳ遺伝子は、形質転換に好適な任意のベクターの中に含まれ得る。また９－ＬＯＸおよびＡＯＳ遺伝子は、コーディング領域に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含みうる。

【0031】

本開示において、植物の個体、組織、または細胞が遺伝子を含むとは、当該遺伝子が植物の個体、組織、または細胞のゲノムに内在性の遺伝子として存在するか、または外来遺伝子として組み込まれていることを意味し得る。また植物の個体、組織、または細胞が遺伝子を含むとは、当該遺伝子が、エピソームとして染色体外に存在することを意味する場合もある。

【0032】

一実施形態によれば、本方法は、植物の個体、組織、または細胞をリン欠乏条件の培地に維持する工程（ａ）の後に、蓄積されたＫＯＤＡを当該植物の個体、組織、または細胞から抽出する工程（ｂ）をさらに含む。本実施形態の方法は、ＫＯＤＡの蓄積量を増加させた後にＫＯＤＡを抽出するため、ＫＯＤＡの製造方法と捉えることもできる。

【0033】

抽出の具体的な手順は、植物の個体、組織、または細胞を破砕することを含み得る。破砕は、例えば乳鉢と乳棒、凍結処理、ホモジナイザー、ビーズミルを含む、当業者に知られた器具や方法を用いて行うことができる。破砕物中でＫＯＤＡの合成を継続させることによって、試料中のＫＯＤＡの含有量を増大させてもよい。また、実施形態の破砕物にα－リノレン酸を添加することによってＫＯＤＡの含有量を増大させることもできる。

【0034】

破砕した、または破砕していない植物の個体、組織、または細胞の試料から、種々の溶媒を用いてＫＯＤＡを抽出することができる。溶媒としては、水、ギ酸、酢酸などの酸、メタノール、エタノールを含むアルコール類、クロロホルム、その他有機溶媒並びにこれらの混合物が挙げられる。好ましい抽出溶媒の具体例は、水、２％（ｖ／ｖ）ギ酸／メタノール、およびこれらの混合物である。

【0035】

抽出処理によって得られた抽出液から、ろ過によって固形物を除くことができる。ろ過は、当業者によって知られた方法で行うことができ、例えば各種のスピンカラムと遠心機を用いて適宜行うことができる。当業者に知られるように、抽出液をクロマトグラフィーで分画することにより、ＫＯＤＡを含む画分を分離してもよい。

【0036】

［ＫＯＤＡを製造するためのシステム］
一態様において、ＫＯＤＡを製造するためのシステムが提供される。このシステムは、溶存リン濃度が１ｍＭ未満である培地に維持された、９－ＬＯＸをコードする遺伝子、および／または、ＡＯＳをコードする遺伝子を含む植物の個体、組織、または細胞を含む。このシステムを用いて、上述したＫＯＤＡの蓄積量を増加させるための方法の一実施形態を実施できることが理解される。このシステムの諸要素（植物、遺伝子、培地、およびリン濃度を含む）については、上記方法の実施形態に関連して提供された説明を適用することができる。

【0037】

［ストレス耐性が増大した植物の製造方法］
一態様において、ストレス耐性が増大した植物（特に、植物の個体）の製造方法が提供され、この方法は、植物に９－ＬＯＸをコードする遺伝子およびＡＯＳをコードする遺伝子から選択される少なくとも１個の遺伝子を導入する工程と、該遺伝子が導入された植物をリン欠乏条件の培地で栽培する工程とを含む。９－ＬＯＸ遺伝子とＡＯＳ遺伝子の両方が導入（例えば形質転換）されることが好ましい。

【0038】

実施形態において、ストレス耐性とは、高温ストレス、乾燥ストレス、浸透圧ストレス、飢餓ストレス、病害によるストレスを含む、多様な環境ストレスを意味し得る。ＫＯＤＡはこれら多様なストレスに対する植物の耐性に関与することが知られている。上記植物をリン欠乏条件の培地で栽培する工程によって、植物におけるＫＯＤＡの含有量が増大することから、本実施形態において製造された植物はこれら多様なストレスに耐性を示すと考えられる。一実施形態において、ストレス耐性は高温ストレス耐性である。

【0039】

本実施形態の製造方法の諸要素（植物、培地、遺伝子およびその導入、ならびにリン欠乏条件を含む）については、上記方ＫＯＤＡの蓄積量を増加させるための方法の実施形態に関連して提供された説明を適用することができる。例えば、リン欠乏条件の培地は、溶存リン濃度が１ｍＭ未満である培地であり得る。

【実施例0040】

以下に本開示の実施例を記載するが、本開示は以下に記載する実施例に限定されない。

【0041】

（実施例１）形質転換植物および非形質転換植物のリン欠乏条件下でのＫＯＤＡ蓄積

【0042】

材料と方法
１．形質転換植物
特開２０２２－１１４２７１号公報に記載の方法に従って、アオウキクサの９－ＬＯＸ遺伝子およびＡＯＳ遺伝子を植物シロイヌナズナで発現させた形質転換株を作出した。これら遺伝子を有さない対照ベクターを用いて形質転換操作を行ったベクターコントロール株も同様にして作出した。

【0043】

具体的には、花序浸し法により、シロイヌナズナの形質転換を行った。すなわち、花芽が形成されるまで生育したシロイヌナズナを、目的遺伝子を導入したアグロバクテリウムの懸濁液に３分間浸した。その後、シロイヌナズナの花序をラップに包んで、弱光下で一晩静置し、翌日から通常の条件で生育させ、種子の回収を行った。薬剤入りのＭＳ培地に種子を播種し、ベクター上の薬剤耐性マーカー遺伝子により選択を行って、目的の形質転換体を得た。

【0044】

２．植物の生育条件
野生株（ＷＴ）、ベクターコントロール株（ＶＣ）、および形質転換株の種子を、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、２０％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌処理をし、滅菌したイオン交換水で５回すすいだ。滅菌した種子は、通常生育条件として、１％（ｗ／ｖ）スクロース、０．８％（ｗ／ｖ）ＩＮＡ Ａｇａｒを含むＭＳ培地（表２）のプレートに１粒ずつ播種し、２～４日間４℃に遮光保存して春化処理を行った後、連続光照射下で２３℃において生育させた。通常生育培地（２３℃、連続光）で１０日間生育後、リン十分（＋Ｐｉ）またはリン欠乏（－Ｐｉ）生育培地（表３）で１０日間、２３℃、連続光下で生育させた。

【0045】

【表2】

【0046】

【表3】

【0047】

３．植物葉の粗抽出液のＫＯＤＡ含有量測定
液体窒素で凍結させた３個体の植物地上部のサンプルを乳鉢と乳棒で素早く破砕した。氷冷しながら、新鮮重量１ｍｇあたり２５０μＬの滅菌したイオン交換水を加えて破砕物を懸濁し、速やかに微量高速遠心機を用いて２０℃において１３，０００ｒｐｍで２分間遠心して、上澄み１００μＬを採取した。この上澄みに２％（ｖ／ｖ）ギ酸／メタノールを１００μＬ加えてよく撹拌した。混合液を、酸化チタンおよび酸化ジルコニウム結合型シリカモノリスのスピンカラム（MonoSpin（登録商標）Phospholipid、ジーエルサイエンス株式会社）に滴下し、微量高速遠心機を用いて２０℃において５，０００ｒｐｍで２分間遠心し、ろ液を回収した。ろ液を、さらに０．２２μｍ親水性ポリビニリデンフルオライドのメンブレンフィルター（4 mm Millex（登録商標）Syringe Filters、Merck）でろ過した。得られた溶液をＫＯＤＡサンプルとし、これをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析に使用した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析装置は、高速液体クロマトグラフＬＣ－２０４０Ｃ ３Ｄと質量分析計ＬＣＭＳ－８０５０を組み合わせたＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ（島津製作所）を用いた。装置の操作は、装置に付属のLabSolutionで行った。

【0048】

結果
リン酸十分条件下において、野生株およびベクターコントロール株の試料からはＫＯＤＡを検出することができなかった。これに対して、形質転換株ではＫＯＤＡの蓄積が見られた（図1）。驚くべきことに、リン酸欠乏条件の培地でこれらの植物を生育すると、野生株とベクターコントロール株でも少量のＫＯＤＡ蓄積が得られた。また形質転換株ではＫＯＤＡ産生量の大幅な増加がみられた。すなわち、リン酸十分条件下の野生株およびベクターコントロール株では検出可能なＫＯＤＡ蓄積が無いにも関わらず、それをリン酸欠乏条件に移すと検出可能なＫＯＤＡ蓄積が起こり、形質転換株ではさらにその約30倍の量のＫＯＤＡ蓄積が起こった。

【0049】

上記の結果は、形質転換株のみならず、野生型やベクターコントロール株においても、リン欠乏条件の培地で維持することによってＫＯＤＡの蓄積量を増加させることができることを示唆している。従来ＫＯＤＡ生産の際には、収量を増加させるために、形質転換株においても、葉の破砕とその後の室温でのインキュベーションが必要とされていた。本実施例の結果は、植物体内のＫＯＤＡ濃度を上昇させることが、形質転換自体を省略しても達成し得ること、および、形質転換と非形質転換株のいずれについても、葉破砕物のインキュベーションをするまでもなくリン欠乏条件の培地で維持するだけで達成できることを示している。

【0050】

（実施例２）９－ＬＯＸ遺伝子およびＡＯＳ遺伝子で形質転換された植物のリン欠乏条件下での高温ストレス耐性向上

【0051】

材料と方法
１．形質転換植物
実施例１で用いたものと同じ野生株、ベクターコントロール株、および形質転換株を用いた。

【0052】

２．植物の生育条件
通常生育培地での生育期間を９日間とし、その後の、リン十分（＋Ｐｉ）またはリン欠乏（－Ｐｉ）生育培地での生育期間を７日間としたほかは、実施例１と同様に植物を生育させた後、通常生育培地（２３℃、連続光）でさらに４日間生育させた。その後、高温（３７℃）条件に切り替えて、連続光下で４日、５日、または６日間の栽培を行った。この高温ストレス処理の後、高温ストレスからの回復を観察するために、通常生育培地、通常生育温度（２３℃）、連続光下でさらに生育と観察を続けて、ストレス耐性評価を行った。

【0053】

結果
図２の写真において白く映っている葉が枯れた葉を示す。野生株とベクターコントロール株（実施例１で示したように、これらの株は、リン欠乏条件下でＫＯＤＡ量の増加が控えめな程度にとどまっていた）は、リンの有無にかかわらずストレス処理中に枯れ始めストレス処理後に枯死した。形質転換株もリン十分条件下では５日間の高温ストレス処理後に枯死した。それに対し、リン欠乏条件の培地で維持された形質転換株のみ枯死を回避してストレス処理に生育し続けることができ、ストレス耐性が付与されていたことが示された。

【0054】

上記いくつかの実施形態を参照して本開示を説明したが、本開示は上記いくつかの実施形態によって限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本開示の範囲内で様々な変更をすることができる。

【0055】

＜付記＞
（付記１）
植物の個体、組織、または細胞における９，１０－α－ケトールリノレン酸の蓄積量を増加させるための方法であって、前記植物の個体、組織、または細胞をリン欠乏条件の培地に維持する工程（ａ）を含む。
（付記２）
付記１記載の方法であって、前記リン欠乏条件の培地は、溶存リン濃度が１ｍＭ未満である培地である。
（付記３）
付記１または２に記載の方法であって、前記植物の個体、組織、または細胞が、９－ＬＯＸをコードする遺伝子、および／または、ＡＯＳをコードする遺伝子を含む植物の個体、組織、または細胞である。
（付記４）
付記１～３のいずれか一項に記載の方法であって、前記維持する工程（ａ）の後に、蓄積された９，１０－α－ケトールリノレン酸を前記植物の個体、組織、または細胞から抽出する工程（ｂ）をさらに含む。
（付記５）
溶存リン濃度が１ｍＭ未満である培地に維持された、９－ＬＯＸをコードする遺伝子、および／または、ＡＯＳをコードする遺伝子を含む植物の個体、組織、または細胞を含む、９，１０－α－ケトールリノレン酸を製造するためのシステムである。
（付記６）
ストレス耐性が増大した植物の製造方法であって、植物に９－ＬＯＸをコードする遺伝子およびＡＯＳをコードする遺伝子から選択される少なくとも１個の遺伝子を導入する工程と、前記遺伝子が導入された植物をリン欠乏条件の培地で栽培する工程とを含む。
（付記７）
付記６に記載の方法であって、前記リン欠乏条件の培地は、溶存リン濃度が１ｍＭ未満である培地である。
（付記８）
付記６または７に記載の方法であって、前記ストレス耐性が高温耐性である。

【図1】

【図2】