特開 2024-18130 微生物増殖検出方法、微生物取得方法、微生物増殖検出用キット、微生物取得用キット及び色素の微生物増殖レポーターとしての使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024018130

(43)【公開日】2024-02-08

(54)【発明の名称】微生物増殖検出方法、微生物取得方法、微生物増殖検出用キット、微生物取得用キット及び色素の微生物増殖レポーターとしての使用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/06 20060101AFI20240201BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20240201BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/06

C12N1/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022121246

(22)【出願日】2022-07-29

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「カーボンリサイクル実現を加速するバイオ由来製品生産技術の開発／カーボンリサイクル実現を加速するバイオ由来製品生産技術の開発／データ駆動型統合バイオ生産マネジメントシステム（Ｄａｔａ－ｄｒｉｖｅｎ ｉＢＭＳ）」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100168114

【弁理士】

【氏名又は名称】山中 生太

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100177149

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 浩義

(74)【代理人】

【識別番号】100197701

【弁理士】

【氏名又は名称】長野 正

(74)【代理人】

【識別番号】100222922

【弁理士】

【氏名又は名称】和田 朋子

(72)【発明者】

【氏名】佐々木 章

(72)【発明者】

【氏名】大田 悠里

(72)【発明者】

【氏名】野田 尚宏

(72)【発明者】

【氏名】横田 亜紀子

(72)【発明者】

【氏名】陶山 哲志

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ05

4B063QR58

4B063QS02

4B063QS36

4B063QX02

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA87X

4B065CA60

(57)【要約】

【課題】微生物が増殖したドロップレットを精度良く検出することができる微生物増殖検出方法、微生物取得方法、微生物増殖検出用キット、微生物取得用キット及び色素の微生物増殖レポーターとしての使用を提供する。
【解決手段】微生物増殖検出方法は、Ｗ／Ｏエマルションにおいて、微生物及び当該微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素を含むドロップレットを作製することと、ドロップレット内で微生物を培養することと、色素の蛍光強度に基づいて微生物の増殖を検出することと、を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｗ／Ｏエマルションにおいて、微生物及び前記微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素を含むドロップレットを作製することと、
前記ドロップレット内で前記微生物を培養することと、
前記色素の蛍光強度に基づいて前記微生物の増殖を検出することと、
を含む、微生物増殖検出方法。

【請求項2】

前記色素は、
前記微生物が有する細胞の外膜に挿入されることで蛍光強度が大きくなる色素である、
請求項１に記載の微生物増殖検出方法。

【請求項3】

前記色素は、
Ｎ－（３－トリエチルアンモニウムプロピル）－４－（４－（ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムジブロミド又は４－［６－［４－（ジエチルアミノ）フェニル］－１，３，５－ヘキサトリエン－１－イル］－１－［３－（トリエチルアンモニオ）プロピル］－ピリジニウムジブロミドである、
請求項２に記載の微生物増殖検出方法。

【請求項4】

前記微生物は、
複数種である、
請求項１から３のいずれか一項に記載の微生物増殖検出方法。

【請求項5】

Ｗ／Ｏエマルションにおいて、微生物及び前記微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素を含むドロップレットを作製することと、
前記ドロップレット内で前記微生物を培養することと、
前記色素の蛍光強度に基づいて前記微生物の増殖を検出することと、
前記微生物の増殖を検出したドロップレットを回収することと、
を含む、微生物取得方法。

【請求項6】

微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素を備える、
Ｗ／Ｏエマルションにおけるドロップレット内の微生物増殖検出用キット。

【請求項7】

微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素を備える、
Ｗ／Ｏエマルションにおけるドロップレット内の微生物取得用キット。

【請求項8】

微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素の、Ｗ／Ｏエマルションにおけるドロップレット内の微生物増殖レポーターとしての使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物増殖検出方法、微生物取得方法、微生物増殖検出用キット、微生物取得用キット及び色素の微生物増殖レポーターとしての使用に関する。

【背景技術】

【0002】

微生物の分離又は培養法として、Ｗａｔｅｒ－ｉｎ－Ｏｉｌ（Ｗ／Ｏ）エマルションを用いた方法が知られている。この方法では、油相中にドロップレット(培養培地)を分散させ、各ドロップレットを１つの培養場として微生物を培養する。当該ドロップレットの形成方法にマイクロ流路を用いることで、数分で数十万～数百万単位のドロップレットを形成することができ、ハイスループット化が可能となる。また、水相中に存在する微生物数とドロップレット数の調整により、微生物１細胞が封入されたドロップレットを形成すれば、１細胞からの培養が可能となる。

【0003】

ドロップレットを使用して微生物を培養する場合、１個のドロップレットあたりの細胞数はポアソン分布に従う。細胞が封入されたドロップレットのうち１細胞のみが封入されるドロップレットの割合を高くするに従って、微生物が存在しないドロップレットが生じる確率も高くなる。この場合、微生物の増殖が見られるドロップレットを選択的に回収することができれば各微生物の解析及びスケールアップ等に活用できる。

【0004】

微生物が存在するドロップレットの検出には、微生物細胞の自家蛍光を検出する方法及び細胞外分泌物と反応する試薬を介して検出する方法がとられている。例えば、特許文献１には、微生物が存在するドロップレットの検出に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）型蛍光修飾核酸プローブを使用することが開示されている。当該蛍光修飾核酸プローブは、５’末端及び３’末端それぞれに蛍光基及び消光基を有する。微生物が存在するドロップレット内では、微生物から分泌されたＲＮａｓｅによって当該蛍光修飾核酸プローブが切断されるとＦＲＥＴが解消され、蛍光強度が上昇する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２０１９／０７３９０２号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

細胞の自家蛍光を検出する方法では、感度が低いため、微生物が増殖したドロップレットを精度良く検出することが困難であった。上記特許文献１に開示された蛍光修飾核酸プローブを使用する方法では、環境試料の微生物を検出しようとした場合に環境中の夾雑物に含まれるＲＮａｓｅ及び培養培地中に含まれる僅かなＲＮａｓｅ等がバックグラウンドの蛍光値を増加させて偽陽性となり、ドロップレット内での微生物の増殖を正確に検出できない場合があった。また、実際の増殖とＲＮａｓｅによる分解にタイムラグが生じることに加え、ドロップレットに存在する細胞数と蛍光強度とが直接相関しないといった不都合があった。

【0007】

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、微生物が増殖したドロップレットを精度良く検出することができる微生物増殖検出方法、微生物取得方法、微生物増殖検出用キット、微生物取得用キット及び色素の微生物増殖レポーターとしての使用を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の第１の観点に係る微生物増殖検出方法は、
Ｗ／Ｏエマルションにおいて、微生物及び前記微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素を含むドロップレットを作製することと、
前記ドロップレット内で前記微生物を培養することと、
前記色素の蛍光強度に基づいて前記微生物の増殖を検出することと、
を含む。

【0009】

前記色素は、
前記微生物が有する細胞の外膜に挿入されることで蛍光強度が大きくなる色素である、
こととしてもよい。

【0010】

前記色素は、
Ｎ－（３－トリエチルアンモニウムプロピル）－４－（４－（ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムジブロミド又は４－［６－［４－（ジエチルアミノ）フェニル］－１，３，５－ヘキサトリエン－１－イル］－１－［３－（トリエチルアンモニオ）プロピル］－ピリジニウムジブロミドである、
こととしてもよい。

【0011】

前記微生物は、
複数種である、
こととしてもよい。

【0012】

本発明の第２の観点に係る微生物取得方法は、
Ｗ／Ｏエマルションにおいて、微生物及び前記微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素を含むドロップレットを作製することと、
前記ドロップレット内で前記微生物を培養することと、
前記色素の蛍光強度に基づいて前記微生物の増殖を検出することと、
前記微生物の増殖を検出したドロップレットを回収することと、
を含む。

【0013】

本発明の第３の観点に係るＷ／Ｏエマルションにおけるドロップレット内の微生物増殖検出用キットは、
微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素を備える。

【0014】

本発明の第４の観点に係るＷ／Ｏエマルションにおけるドロップレット内の微生物取得用キットは、
微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素を備える。

【0015】

本発明の第５の観点に係る色素のＷ／Ｏエマルションにおけるドロップレット内の微生物増殖レポーターとしての使用は、
微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素の、Ｗ／Ｏエマルションにおけるドロップレット内の微生物増殖レポーターとしての使用である。

【発明の効果】

【0016】

本発明によれば、微生物が増殖したドロップレットを精度良く検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】試験例１における培養後のドロップレットの顕微鏡画像を示す図である。図中のバーは１００μｍに相当する。

【図2】試験例２におけるドロップレットの蛍光強度を示す図である。（Ａ）は細胞膜染色試薬を含まないドロップレットの蛍光強度を示す。（Ｂ）及び（Ｃ）は細胞膜染色試薬を含むドロップレットの蛍光強度を示す。

【図3】試験例３における培養後のドロップレットの顕微鏡画像を示す図である。図中のバーは１００μｍに相当する。

【図4】試験例４における緑色蛍光を発色する色素を含むドロップレットの蛍光強度を示す図である。

【図5】試験例４における赤色蛍光を発色する色素を含むドロップレットの蛍光強度を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明に係る実施の形態について図面を参照しながら説明する。なお、本発明は下記の実施の形態によって限定されるものではない。

【0019】

（微生物増殖検出方法）
本実施の形態に係る微生物増殖検出方法は、Ｗ／Ｏエマルションにおいて、微生物及び当該微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素を含むドロップレットを作製すること（ステップ１）と、当該ドロップレット内で微生物を培養すること（ステップ２）と、色素の蛍光強度に基づいて微生物の増殖を検出すること（ステップ３）と、を含む。

【0020】

Ｗ／Ｏエマルションは、連続相である油相中に分散相として微粒子状のドロップレット（水滴)が存在している状態をいう。“ドロップレット”とは、エマルション中の区画化された水滴をいう。Ｗ／Ｏエマルションを構成する水相は、油相と混和しない親水性の液体であれば特に限定されない。水相に使用できる液体は、例えば水、湖沼水及び海水等であるが、ドロップレット内で微生物を培養するため、好ましくは、油相と混和しない培地、例えば、ＬＢ培地及びＲ２Ａ培地等である。

【0021】

ステップ１で作製するドロップレットのための水相は、微生物と、上記色素と、を含む。微生物は、ドロップレット内で増殖可能な微生物であれば特に限定されない。微生物は、原核生物でも真核生物でもよい。微生物として、例えば、大腸菌、枯草菌、放線菌及び酵母等が例示される。

【0022】

本実施の形態に係る微生物増殖検出方法は、大気、湖沼水、海水及び土壌等の環境試料に適用され得る。このため、ドロップレットに含まれる微生物は環境試料に含まれる微生物、すなわち複数種の微生物であってもよい。また、微生物は、遺伝子が導入された組換え微生物等、人工的に作製された微生物であってもよい。

【0023】

色素は、ドロップレット内の微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化、好ましくは増大する色素である。好適には、色素は、微生物が有する細胞の外膜に挿入されることで蛍光強度が大きくなる色素である。このような色素としてスチリル色素が挙げられる。スチリル色素はＦｅｉ Ｍａｏ色素とも言われ、例えば、Ｎ－（３－トリエチルアンモニウムプロピル）－４－（４－（ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムジブロミド（N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide；ＦＭ（商標、以下同じ）１－４３）、４－［２－［４－（ジペンチルアミノ）フェニル］エテニル］－１－［３－（トリエチルアミニオ）プロピル］ピリジニウムブロミド（4-[2-[4-(Dipentylamino)phenyl]ethenyl]-1-[3-(triethylaminio)propyl]pyridinium bromide；ＦＭ１－８４）、Ｎ－（３－トリエチルアンモニウムプロピル）－４－（４－（ジエチルアミノ）スチリル）ピリジニウムジブロミド（N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(diethylamino)styryl)pyridinium dibromide；ＦＭ２－１０）、４－［６－［４－（ジエチルアミノ）フェニル］－１，３，５－ヘキサトリエン－１－イル］－１－［３－（トリエチルアンモニオ）プロピル］－ピリジニウムジブロミド（4-[6-[4-(diethylamino)phenyl]-1,3,5-hexatrien-1-yl]-1-[3-(triethylammonio)propyl]-pyridinium dibromide、ＦＭ４－６４）及びＮ－（３－トリメチルアンモニウムプロピル）－４－（６－（４－（ジエチルアミノ）フェニル）ヘキサトリエニル）ピリジニウムジブロミド（N-(3-trimethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、ＦＭ５－９５）等が挙げられる。特に、色素として、Ｎ－（３－トリエチルアンモニウムプロピル）－４－（４－（ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムジブロミド及び４－［６－［４－（ジエチルアミノ）フェニル］－１，３，５－ヘキサトリエン－１－イル］－１－［３－（トリエチルアンモニオ）プロピル］－ピリジニウムジブロミドが好ましい。

【0024】

Ｗ／Ｏエマルションを構成する油相は、水相と混和しない疎水性の液体であれば特に限定されない。このような油相としては、例えば、ＦＣ４０、Ｎｏｖｅｃ（商標、以下同じ）７５００、ミネラルオイル及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。

【0025】

Ｗ／Ｏエマルションを安定化させるために、界面活性剤を水相及び油相の少なくとも一方に添加する。用いられる界面活性剤には、例えば、水相用の界面活性剤としてはＳｐａｎ（商標）８０及びＴｗｅｅｎ（商標）２０等がある。油相用の界面活性剤としては００８－ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔ、Ｐｉｃｏ－ｓｕｒｆ（商標）１及びＫｒｙｔｏｘ（商標）等が挙げられる。水相又は油相に添加される界面活性剤の濃度は、用いる界面活性剤の種類及びドロップレットの大きさ等の条件により適宜調整することができる。

【0026】

Ｗ／Ｏエマルションは、ドロップレット内で微生物が増殖でき、かつ、微生物の増殖を検出可能であれば任意のＷ／Ｏエマルションであってよい。ドロップレットの大きさは、微生物が増殖でき、かつ、微生物の増殖を検出可能である限り特に制限されない。ドロップレットの直径は、例えば、５～５００μｍ、１０～３００μｍ、１５～２００μｍ又は２０～１５０μｍである。

【0027】

Ｗ／Ｏエマルションの作製方法は公知であり、例えば、Ｏｎ－ｃｈｉｐ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（オンチップバイオテクノロジーズ社製）、Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）及びＱＸ１００（Ｂｉｏ－ＲＡＤ社製）等の市販の装置を用いて作成することができる。

【0028】

ステップ２において、Ｗ／Ｏエマルション中のドロップレット内で微生物を培養する方法は公知であり、マイクロ流路上等、培養に必要な装置を適宜選択して微生物を培養することができる。培養条件は、ドロップレットに含まれる微生物が増殖できる条件であればよく、培養の目的又は培養の対象となる微生物に応じて適宜好ましい培養条件が設定できる。培養の温度条件は、例えば、４～９５℃である。培養時間は、例えば数時間、数日又は数か月でもよいし、数日～数か月以上にわたってでもよい。

【0029】

ステップ３では、上述の色素の蛍光強度に基づいて微生物の増殖を検出する。色素の蛍光強度は、市販の装置で測定することができる。当該色素は微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化するため、培養開始前のドロップレット、又は微生物を含まないドロップレットの蛍光強度と比較することで、蛍光強度の変化を検出することができる。微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が増大する色素を用いる場合、増殖による微生物の増加に伴い、膜成分に暴露される色素が増え、膜成分と相互作用する色素が増える。このため、ドロップレット内の微生物の細胞数に比例して蛍光強度が増大する。

【0030】

本実施の形態に係る微生物増殖検出方法は、微生物が有する膜成分と相互作用することで蛍光強度が変化する色素の蛍光強度に基づいて微生物の増殖を検出する。この蛍光強度の変化は、当該色素を作用させていない細胞に比べて高感度で測定できるため、微生物が増殖したドロップレットを精度良く検出することができる。また、本実施の形態に係る微生物増殖検出方法は、膜成分と相互作用する色素の増加による蛍光強度の変化を検出するため、環境試料及び培養培地中に含まれる微生物以外の成分の影響を受けにくく、バックグラウンドの測定値の増大を避けることができる。これにより、微生物の増殖を正確に検出することができる。また、膜成分と相互作用する色素の増加による蛍光強度の変化は、微生物の実際の増殖と直接相関するため、微生物の増殖をタイムラグなしで検出することができる。

【0031】

本実施の形態に係る微生物増殖検出方法によれば、１個のドロップレット内に複数種の微生物を封入して培養することで、当該ドロップレット内に封入された微生物間の相互作用が増殖能に及ぼす影響について検証することが可能となる。

【0032】

また、ドロップレット１個あたりに１細胞の微生物を封入することで、異なる増殖能を示す微生物を含むドロップレットが得られる。特に、複数種の微生物を含む環境試料からの特定の微生物の単離を目的とする場合、ドロップレット内には１細胞ずつ微生物が含まれることが好ましい。なお、１個のドロップレット内に微生物が１細胞ずつ含まれるように、Ｗ／Ｏエマルションを作製する方法は公知である。例えば、ポアソン分布に従い、水相中に存在する微生物数とドロップレット数とを調整をすることで、微生物が１細胞ずつ封入されたドロップレットを作製することができる。

【0033】

また、各ドロップレットに複数個の細胞を封入した場合、検出可能な細胞数までの増殖に必要な培養時間を抑えることができる点で好ましい。また、共生関係を有する微生物同士が同一のドロップレットに封入された場合、微生物相互間作用等によって増殖が促進されるという効果も期待される。

【0034】

なお、ステップ３は、マイクロ流路上で行ってもよい。マイクロ流路と市販のセルソーター等とを組み合わせることで、ハイスループットに蛍光強度を測定できる。

【0035】

（微生物取得方法）
本実施の形態に係る微生物取得方法は、上述のステップ１、ステップ２及びステップ３に加えて、微生物の増殖を検出したドロップレットを回収すること（ステップ４）を含む。微生物の増殖が検出された、すなわち培養前後で色素の蛍光強度が変化したドロップレットを回収又は分取する方法は公知である。例えば、市販のチップ式セルソーターを利用して、蛍光強度が変化したドロップレットをソーティングすることができる。ステップ４をマイクロ流路上で行った場合は、マイクロ流路と市販のセルソーターとを組み合わせることで、ハイスループットに蛍光強度を測定し、検出結果に応じてドロップレットを分取することができる。

【0036】

本実施の形態に係る微生物取得方法によれば、微生物が増殖したドロップレットを精度良く検出することができるので、より確実に所望の微生物を取得することができる。また、複数種の微生物を含む環境試料について、ドロップレット１個あたりに１細胞の微生物を封入することで、各ドロップレットに含まれる微生物ごとの性質に応じた増殖を検出でき、異なる増殖能を示すドロップレットごとに単離又は分取することができる。異なる増殖能を示すドロップレットごとに選択的に分取することで、各微生物の解析及び培養のスケールアップが可能となる。

【0037】

（微生物増殖検出用キット及び微生物取得用キット）
別の実施の形態では、Ｗ／Ｏエマルションにおけるドロップレット内の微生物増殖検出用キットが提供される。当該微生物増殖検出用キットは、上述の色素を備える。さらに、微生物増殖検出用キットは、培地等のＷ／Ｏエマルションの水相と、Ｗ／Ｏエマルションの油相と、Ｗ／Ｏエマルションの安定化のための界面活性剤とを備えてもよい。なお、微生物増殖検出用キットは、培養等に用いるマイクロ流路及び培養皿等を備えてもよい。他の実施の形態では、当該微生物増殖検出用キットは、Ｗ／Ｏエマルションにおけるドロップレット内の微生物取得用キットとして使用される。

【0038】

（微生物増殖レポーター）
別の実施の形態では、上記色素のＷ／Ｏエマルションにおけるドロップレット内の微生物増殖レポーターとしての使用が提供される。微生物増殖レポーターは、ドロップレット内の微生物の増殖の指標である。色素として、微生物が有する細胞の外膜に挿入されることで蛍光強度が大きくなる色素を使用する場合、ドロップレット内の色素の蛍光強度が当該ドロップレット内の微生物の細胞数と相関する。

【実施例0039】

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

【0040】

（試験例１：Ｗ／Ｏドロップレット内の大腸菌の検出）
細胞膜染色試薬の蛍光を測定することでＷ／Ｏドロップレット内の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の増殖を検出できるか検討した。水相として次の試料１～３を使用した。
試料１：大腸菌を含むＬＢ培地
試料２：細胞膜染色試薬ＦＭ１－４３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） １０μＭと大腸菌とを含むＬＢ培地
試料３：細胞膜染色試薬ＦＭ４－６４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） １０μＭと大腸菌とを含むＬＢ培地

【0041】

油相として２％ ００８－ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔを含むＮｏｖｅｃ７５００（オンチップバイオテクノロジーズ社製）を使用した。Ｗ／Ｏドロップレット作製装置としてＯｎ－ｃｈｉｐ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒを用いて直径３０μｍ程度のドロップレットを作製した。水相における大腸菌の濃度を、１ドロップレットあたりに含まれる平均細胞数が０．１細胞（０．１細胞／ドロップレット）となるように調整した。作製したドロップレット内で大腸菌を３７℃で一晩静置培養した。

【0042】

（結果）
培養後のドロップレットを顕微鏡で観察すると、図１に示すように細胞膜染色試薬を含む試料２及び試料３では、大腸菌が増殖したドロップレットが強く蛍光を示す様子が観察された。細胞膜染色試薬の蛍光を測定することでＷ／Ｏドロップレット内の大腸菌の増殖を検出できることが示された。

【0043】

（試験例２：細胞膜染色試薬によって検出できる大腸菌細胞数の検討）
細胞膜染色試薬の強度と自家蛍光の強度とを比較し、細胞膜染色試薬を用いることにより検出感度が向上するかを検討した。水相として次の試料４～９を使用した。
試料４：ＬＢ培地
試料５：大腸菌を含むＬＢ培地
試料６：ＦＭ１－４３ １０μＭを含むＬＢ培地
試料７：ＦＭ１－４３ １０μＭと大腸菌とを含むＬＢ培地
試料８：ＦＭ４－６４ １０μＭを含むＬＢ培地
試料９：ＦＭ４－６４ １０μＭと大腸菌とを含むＬＢ培地

【0044】

油相として２％ ００８－ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔを含むＮｏｖｅｃ７５００を使用し、試験例１と同様に直径３０μｍ程度のドロップレットを作製した。試料５、７及び９における大腸菌の濃度は、１０細胞／ドロップレット、５０細胞／ドロップレット及び１００細胞／ドロップレットとなるようにした。作製したドロップレットを３７℃で一晩静置培養した。ドロップレット作製直後にＯｎ－ｃｈｉｐ Ｓｏｒｔ（オンチップバイオテクノロジーズ社製）を用いて蛍光強度を測定した。

【0045】

（結果）
図２（Ａ）に示すように、細胞膜染色試薬を含まないドロップレットでは、大腸菌の細胞数の違いを自家蛍光による蛍光強度で区別できなかった。一方、図２（Ｂ）及び図２（Ｃ）にそれぞれ示すＦＭ１－４３及びＦＭ４－６４を含むドロップレットでは、大腸菌の細胞数に応じて蛍光強度が強くなっており、１０細胞以上の大腸菌を含むドロップレットで、蛍光強度の細胞数に応じた上昇を検出できた。

【0046】

（試験例３：細胞膜染色試薬を用いた環境微生物の検出）
細胞膜染色試薬を用いて土壌に含まれる様々な種類の微生物を培養したときの細胞増殖を検出できるか検討した。水相としてＦＭ１－４３ １０μＭと土壌微生物とを含むＬＢ培地及びＦＭ４－６４ １０μＭと土壌微生物とを含むＬＢ培地を使用した。油相として２％ ００８－ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔを含むＮｏｖｅｃ７５００を使用した。Ｗａｔｅｒ－ｉｎ－ｏｉｌドロップレット作製装置としてＯｎ－ｃｈｉｐ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒを用いて直径１００μｍ程度のドロップレットを作製した。作製したドロップレット内で土壌微生物を２５℃で一晩静置培養した。

【0047】

（結果）
図３に顕微鏡で観察したドロップレットの画像を示す。両方の試料において、土壌微生物が増殖したドロップレットで蛍光が強くなった様子が顕微鏡下で観察された。

【0048】

（試験例４：細胞膜染色試薬を用いた油脂酵母の検出）
真核生物である油脂酵母（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ）の細胞増殖を検出できるか検討した。水相として油脂酵母（１００細胞／ドロップレット）と、各種染色試薬（ＦＭ１－４３ １０μＭ（色素＃１とする）、Ｃｅｌｌ Ｎａｖｉｇａｔｏｒ（商標、以下同じ） Ｇｒｅｅｎ（ＡＡＴ社製） ５００倍希釈（色素＃２とする）、ＰｌａｓＭｅｍ Ｂｒｉｇｈｔ Ｇｒｅｅｎ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製） ２００倍希釈（色素＃３とする）、ＦＭ４－６４ １０μＭ（色素＃４とする）、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標、以下同じ） Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製） １０００倍希釈（色素＃５とする）、ＭｅｍＧｌｏｗ（商標、以下同じ） ５６０（フナコシ社製） ２０μＭ（色素＃６とする））と、を含むＰＢＳ懸濁液を使用した。比較のために、油脂酵母を含まない試料を用いた。なお、色素＃６は、脂質二重膜への結合前は自己消光ナノ粒子の形成により蛍光が最小限に抑制されているが、脂質二重膜との相互作用によって蛍光強度が増大する色素である。

【0049】

油相として２％ ００８－ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔを含むＮｏｖｅｃ７５００を使用した。Ｗａｔｅｒ－ｉｎ－ｏｉｌドロップレット作製装置としてＤｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒを用いて直径１２０μｍ程度のドロップレットを作製した。ドロップレット作製直後にＯｎ－ｃｈｉｐ Ｓｏｒｔを用いて個々のドロップレットについて蛍光強度を測定した。

【0050】

（結果）
図４及び図５に、それぞれ緑色蛍光を発色する色素及び赤色蛍光を発色する色素の結果を示す。ＦＭ１－４３（色素＃１）及びＦＭ４－６４（色素＃４）を含むドロップレットにおいては、油脂酵母の存在に応じて蛍光強度が強くなっていた。一方、その他の色素＃２、＃３、＃５及び＃６ではドロップレット内における染色強度自体が十分でなかったり、バックグラウンドが高くなりすぎたりするなど、油脂酵母の存在を明瞭に判別することができなかった。

【0051】

上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

【産業上の利用可能性】

【0052】

本発明は、微生物の有無の検査及び微生物の分取並びに分析に好適である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】