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特開2024-2133ネポウイルス属ウイルスベクターを利用したゲノム編集植物の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024002133
(43)【公開日】2024-01-11
(54)【発明の名称】ネポウイルス属ウイルスベクターを利用したゲノム編集植物の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20231228BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20231228BHJP
C12N 15/82 20060101ALN20231228BHJP
C12N 15/40 20060101ALN20231228BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
A01H1/00 A
C12N15/82 Z ZNA
C12N15/40
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022101150
(22)【出願日】2022-06-23
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構、戦略的イノベーション創造プログラム（ＳＩＰ）「スマートバイオ産業・農業基盤技術」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】石橋 和大
(72)【発明者】
【氏名】吉田 哲也
【テーマコード（参考）】
2B030
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB04
2B030CA17
(57)【要約】
【課題】 組織培養を経ずにゲノム編集された植物を製造しうる方法を提供すること。
【解決手段】 植物内でＣａ９タンパク質とガイドＲＮＡを発現するウイルスベクターとして、ネポウイルス属ウイルスベクターを利用することで、組織培養を経ずに植物のゲノム編集を行うことが可能であることを見出した。
【選択図】 なし
【解決手段】 植物内でＣａ９タンパク質とガイドＲＮＡを発現するウイルスベクターとして、ネポウイルス属ウイルスベクターを利用することで、組織培養を経ずに植物のゲノム編集を行うことが可能であることを見出した。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム編集された植物の製造方法であって、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡをコードする核酸を保持するネポウイルス属ウイルスベクターを植物に導入することを含む方法。
【請求項2】
ネポウイルス属ウイルスベクターが、さらに、ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーをコードする核酸を保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーが、タバコ茎えそウイルス由来の１６Ｋタンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ネポウイルス属ウイルスベクターを導入する植物が、内因性のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現が抑制されている植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ネポウイルス属ウイルスベクターがタバコ輪点ウイルスベクターである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
ゲノム編集された植物を製造するためのキットであって、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡをコードする核酸を保持するネポウイルス属ウイルスベクターを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を搭載したネポウイルス属ウイルスベクターを利用して、ゲノム編集された植物を製造する方法、および当該方法に用いるキットに関する。
【背景技術】
【0002】
植物のゲノム編集は、多くの場合、組織培養を介した形質転換を利用して、ゲノム編集酵素を発現する遺伝子を導入することにより行われている。しかしながら、組織培養には、（ｉ）操作が煩雑である、（ｉｉ）時間を要する、（ｉｉｉ）培養による変異が生じる恐れがある、そして最も重要なことに、（ｉｖ）適用可能な植物種／品種が限られる、といった問題があり、植物のゲノム編集における技術的な制約となっている。これらの問題を回避するため、世界中で多くの試みがなされている。例えば、茎頂分裂組織に物理的にゲノム編集酵素を導入することにより、組織培養を経ずに変異を導入する技術として、インプランタ・パーティクルボンバードメント法が開発されている（非特許文献１）。しかしながら、この方法においても、適用可能な植物の範囲が限られるなどの問題がある。
【0003】
また、組織培養を経ない植物のゲノム編集を目的にウイルスベクターの利用が試みられているが（非特許文献２）、ウイルスベクターを利用する方法には、（ｉ）一般に植物の茎頂分裂組織がウイルスを排除する仕組みを備えている、（ｉｉ）ゲノム編集酵素遺伝子は、そのサイズの大きさからウイルスベクターゲノム中から脱落し易い、といった問題がある。
【0004】
いくつかのウイルスは例外的に茎頂分裂組織に侵入可能であることが知られている（非特許文献３）。このため、１つ目の問題の解決策として、これらウイルスをベクターとして利用する方法や、茎頂分裂組織への侵入を助ける配列をウイルスベクターに搭載する方法が開発されている。例えば、Ｃａｓ９を発現する形質転換植物にガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を発現するウイルスベクターを接種して組織培養を経ずにゲノム編集植物を得る方法が、タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ；非特許文献４～６）、ムギ斑葉モザイクウイルス（ＢＳＭＶ；非特許文献７）、コットン葉巻ウイルス（ＣＬＣｒＶ；非特許文献８）、およびタバコ輪点ウイルス（ＴＲＳＶ；特許文献１）で報告されている。一方、Ｃａｓ９タンパク質をウイルスベクターで発現させることは困難であり、接種葉ではジャガイモＸウイルス（非特許文献９）で、植物個体全身ではソンカスイエローネットウイルス（非特許文献１０）で報告されているものの、いずれの場合も生長点に変異を導入することはできず、子孫に変異が伝搬しないとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０２０／２３４４６８号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｈａｍａｄａ ｅｔ ａｌ． （２０１８） Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ８（１） １４４２２
【非特許文献2】Ｋｕｊｕｒ ｅｔ ａｌ． （２０２１） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ４０， ９３１－９３４
【非特許文献3】Ｂｒａｄａｍａｎｔｅ ｅｔ ａｌ． （２０２１） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３３（８）， ２５２３－２５３７
【非特許文献4】Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （２０２０） Ｎａｔｕｒｅ Ｐｌａｎｔｓ ６， ６２０－６２４
【非特許文献5】Ａｒａｇｏｎeｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｈｏｒｅａ． Ｏｃｔｏｂｅｒ ０１， ２０２１
【非特許文献6】Ｎａｇａｌａｋｓｈｍｉ ｅｔ ａｌ．， ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２２．０１．２０．４７７１４４
【非特許文献7】Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （２０２１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ １４（１１）， １７８７－１７９８
【非特許文献8】Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ． （２０２１） Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７， ２０
【非特許文献9】Ａｒｉｇａ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （２０２０） ６１（１１）， １９４６－１９５３
【非特許文献10】Ｍａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｐｌａｎｔｓ （２０２０） ６， ７７３－７７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、組織培養を経ずにゲノム編集された植物を製造しうる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、どのような植物ウイルスベクターであれば、Ｃａｓ９タンパク質などの大きなタンパク質を安定的に発現できるかについての知見がない状況下において、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、植物内でＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを発現するウイルスベクターとして、ネポウイルス属ウイルスベクターを利用することで、組織培養を経ずに植物のゲノム編集を行うことが可能であることを見出した。この方法でネポウイルス属ウイルスベクターを接種した植物体では、接種葉から離れた葉において、ウイルスベクター中のＣａｓ遺伝子が欠失しているにも拘わらず変異が導入されていた。この事から、茎頂分裂組織に変異が導入されたことにより、その後、変異細胞を含む組織が次々と発生し、変異が植物体全体に拡大したと考えられる。また、ネポウイルス属ウイルスベクターを接種した個体の次世代の植物においても変異の導入が認められた。
【0009】
ネポウイルス属ウイルスは、茎頂分裂組織に侵入可能であることが知られており（非特許文献３）、Ｃａｓタンパク質を発現している形質転換植物に対して、ガイドＲＮＡを発現するウイルスベクターを導入することで、ゲノム編集植物を得たことが報告されている（特許文献１）。しかしながら、Ｃａｓ遺伝子はサイズが大きくウイルスベクターゲノム中で不安定であるため、ウイルスベクターを利用して植物内でＣａｓタンパク質を発現させることは一般に困難である。ネポウイルス属ウイルスベクターにおいても、これまでＣａｓタンパク質の発現に成功したことは報告されていなかった。ジャガイモＸウイルスベクターやソンカスイエローネットウイルスベクターでは、植物内でのＣａｓタンパク質の発現の成功例が知られているが、これらの例では、子孫に変異が伝搬しないとされている。従って、本発明は、植物ウイルスベクターからＣａｓタンパク質を発現させ、当代の植物体のみならず、次世代の植物体までそのゲノムの編集に成功した世界で初めての例となる。
【0010】
また、本発明者らは、宿主植物のウイルス抵抗性に関与するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現を抑制すること、およびウイルスに対する宿主植物の抵抗性を阻害する様々なＲＮＡサイレンシングサプレッサーを発現させることにより、ネポウイルス属のウイルスベクターを利用した植物のゲノム編集効率が向上することを見出した。特に、ＲＮＡサイレンシングサプレッサーとして、タバコ茎えそウイルス由来の１６Ｋタンパク質を利用した場合には、最も顕著なゲノム編集効率の向上が認められた。これまで、１６Ｋタンパク質を分裂組織で機能させるためには、タバコ茎えそウイルスの他のコンポーネントも必要であると考えられてきたが（Ｍａｒｔｉｎ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ａｎｄ Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ， ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ， Ａｐｒ． ２００８， ４０６４－４０７１）、本発明において、タバコ茎えそウイルスの他のコンポーネントを利用せずに、ネポウイルス属ウイルスベクターのみで、１６Ｋタンパク質を機能させることができたことは、驚くべきことである。
【0011】
本発明は、これら知見に基づいてなされたものであり、以下の態様が含まれる。
【0012】
（１）ゲノム編集された植物の製造方法であって、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡをコードする核酸を保持するネポウイルス属ウイルスベクターを植物に導入することを含む方法。
【0013】
（２）ネポウイルス属ウイルスベクターが、さらに、ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーをコードする核酸を保持する、（１）に記載の方法。
【0014】
（３）ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーが、タバコ茎えそウイルス由来の１６Ｋタンパク質である、（２）に記載の方法。
【0015】
（４）ネポウイルス属ウイルスベクターを導入する植物が、内因性のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現が抑制されている植物である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
【0016】
（５）ネポウイルス属ウイルスベクターがタバコ輪点ウイルスベクターである、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
【0017】
（６）Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、（１）から（５）のいずれかに記載の方法。
【0018】
（７）ゲノム編集された植物を製造するためのキットであって、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡをコードする核酸を保持するネポウイルス属ウイルスベクターを含むキット。
【発明の効果】
【0019】
本発明によれば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を搭載したネポウイルス属ウイルスベクターを利用することにより、組織培養を経なくとも、効率的に植物ゲノムの編集を行うことが可能となる。また、当該ウイルスベクターの接種部位のみならず、植物体全体に渡ってゲノムを編集することも可能となる、さらに、編集されたゲノムを次世代の植物まで伝搬させることも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】図１は、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡ（標的はＰＤＳ遺伝子）を発現するタバコ輪点ウイルスベクターを接種したベンサミアナタバコにおけるゲノム編集の結果を示す。左は、ベンサミアナタバコへの当該ベクターの接種を示す略図である。右上は、ＣＡＰＳ法により、タバコ輪点ウイルスベクターを接種した葉よりも上位の葉におけるゲノム編集を検出した結果を示す電気泳動像である。矢印で示したバンドは、変異が導入されたことにより制限酵素で切断されなかったバンドを示す。右下は、ＲＴ－ＰＣＲにより、タバコ輪点ウイルスベクターを接種した葉よりも上位の葉における、タバコ輪点ウイルスベクター上のＣａｓ９遺伝子の存在を検出した結果を示す電気泳動像である。
【図2】図２は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６（ＲＤＲ６）遺伝子の発現抑制によるゲノム編集効率の向上を示す。上は、ＣＡＰＳ法によりゲノム編集を検出した結果を示す電気泳動像であり、対照として、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子を含まないベクター（ＡＬＳＶ－ｅｍｐｔｙ）を用いた。下は、ゲノム編集を行った植物体の葉の写真である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
＜ゲノム編集された植物の製造方法＞
本発明は、ゲノム編集された植物の製造方法であって、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡをコードする核酸を保持するネポウイルス属ウイルスベクターを植物に導入することを含む方法を提供する。
本発明は、ゲノム編集された植物の製造方法であって、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡをコードする核酸を保持するネポウイルス属ウイルスベクターを植物に導入することを含む方法を提供する。
【0022】
（Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ）
本発明においてネポウイルス属ウイルスベクターに搭載するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、構成要素として、少なくともＣａｓタンパク質およびそのガイドＲＮＡを含む。
本発明においてネポウイルス属ウイルスベクターに搭載するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、構成要素として、少なくともＣａｓタンパク質およびそのガイドＲＮＡを含む。
【0023】
本発明における「Ｃａｓタンパク質」は、クラス２システムのＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９などのＩＩ型のＣａｓタンパク質、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）およびＣａｓ１４などのＶ型のＣａｓタンパク質、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃなどのＶＩ型のＣａｓタンパク質）であってもよく、クラス１システムのＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ３などのＩ型のＣａｓタンパク質、その他、ＩＩＩ型やＩＶ型のＣａｓタンパク質）であってもよいが、好ましくはクラス２システムのＣａｓタンパク質であり、より好ましくはＩＩ型のＣａｓタンパク質であり、特に好ましくはＣａｓ９タンパク質である。
【0024】
Ｃａｓタンパク質の由来に、特に制限はない。Ｃａｓ９タンパク質においては、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）、フランシエダ・ノビシダ由来のＣａｓ９タンパク質（ＦｎＣａｓ９）、スタフィロコッカス・アウレウス由来のＣａｓ９タンパク質（ＳａＣａｓ９）、カンピロバクター・ジェジュニ由来のＣａｓ９タンパク質（ＣｊＣａｓ９）、ナイセリア・メニンジティディス由来のＣａｓ９タンパク質（ＮｍＣａｓ９）など、様々な由来のものを本発明において用いることができる。
【0025】
なお、Ｃａｓタンパク質の典型的なアミノ酸配列および塩基配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており、本発明においてはこれらを利用することができる。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来のＣａｓ９タンパク質の典型的なアミノ酸配列および塩基配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿２６９２１５およびＮＣ＿００２７３７に記載の各々の配列である。
【0026】
本発明における「Ｃａｓタンパク質」は、ガイドＲＮＡと複合体を形成して標的となる植物ゲノムを編集しうる限り、天然のＣａｓタンパク質の人工的な変異体であっても、ホモログであっても、部分ペプチドであってもよい。
【0027】
人工的な変異体は、参照される天然のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなる。ここで、「複数個」とは、例えば、２～１５０個、好ましくは２～１００個、より好ましくは２～５０個（例えば、２～３０個、２～１０個、２～５個、２～３個、２個）である。
【0028】
導入される変異としては、例えば、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性の一部または全部を喪失させる変異が挙げられる。Ｃａｓタンパク質においてヌクレアーゼ活性の一部を喪失させた変異体をｎＣａｓタンパク質と称し、ヌクレアーゼ活性の全部を喪失させた変異体をｄＣａｓタンパク質と称する。
【0029】
ＳｐＣａｓ９タンパク質においては、そのヌクレアーゼ活性を喪失させる変異として、例えば、Ｎ末端から１０番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（Ｄ１０Ａ：ＲｕｖＣドメイン内の変異）、Ｎ末端から８４０番目のアミノ酸（ヒスチジン）のアラニンへの変異（Ｈ８４０Ａ：ＨＮＨドメイン内の変異）、Ｎ末端から８６３番目のアミノ酸（アスパラギン）のアラニンへの変異（Ｎ８６３Ａ：ＨＮＨドメイン内の変異）、Ｎ末端から７６２番目のアミノ酸（グルタミン酸）のアラニンへの変異（Ｅ７６２Ａ：ＲｕｖＣＩＩドメイン内の変異）、Ｎ末端から９８６番目のアミノ酸（アスパラギン酸）のアラニンへの変異（Ｄ９８６Ａ：ＲｕｖＣＩＩＩドメイン内の変異）が知られている。
【0030】
ｎＣａｓタンパク質やｄＣａｓタンパク質を利用する場合には、他のエフェクタータンパク質と融合することで、当該エフェクタータンパク質の活性により、植物ゲノムを編集することもできる。本発明の「Ｃａｓタンパク質」には、このような融合タンパク質が含まれる。融合するエフェクタータンパク質の活性としては、例えば、デアミナーゼ活性（例えば、シチジンデアミナーゼ活性、アデノシンデアミナーゼ活性）、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、光回復酵素活性、およびグリコシラーゼ活性が含まれるが、これらに制限されない。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムへのデアミナーゼの適用の手法は公知であり（Ｎｉｓｈｉｄａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ＤＯＩ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９，（２０１６））、それを本発明に応用すればよい。
【0031】
Ｃａｓタンパク質に導入される変異としては、また、ＰＡＭ認識を改変するための変異が挙げられる（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ５２３， ４８１－４８５（２０１５）、Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ら、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６１， ８８６－８９４（２０１６））。このような変異を導入することにより、Ｃａｓタンパク質が認識するＰＡＭ配列の塩基数を減少させ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの標的となるゲノム上の領域を拡大することができる。
【0032】
本発明に用いられる天然のＣａｓタンパク質のホモログは、参照される天然のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列に対して、通常、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）のアミノ酸配列の同一性を有する。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときの数値で評価することができる。
【0033】
本発明で用いるＣａｓタンパク質には、目的に応じて、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリア移行シグナル、葉緑体移行シグナルなどのシグナル配列が付加されていてもよい。
【0034】
本発明における「ガイドＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質と相互作用する塩基配列と標的領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列とを含むＲＮＡである。ガイドＲＮＡの形態は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの種類により変動し、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの双方を含む形態と、ｃｒＲＮＡのみからなる形態が含まれる。ｃｒＲＮＡは、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列と隣接する領域を標的化するように選択される。
【0035】
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの双方を含む形態の場合、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を３’側に含み、一方、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部の塩基配列と相互作用（ハイブリダイズ）が可能な塩基配列を５’側に含む。これら塩基配列の相互作用により形成された二重鎖ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と相互作用する。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの双方を含む一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態であっても、それぞれの断片の組み合わせからなる二分子ガイドＲＮＡの形態であってもよい。
【0036】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いる場合、ｃｒＲＮＡ中の標的化塩基配列は、通常、１２～５０塩基、好ましくは、１７～３０塩基、より好ましくは１７～２５塩基からなる塩基配列である。
【0037】
（ネポウイルス属ウイルスベクター）
本発明においては、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡをコードする核酸を搭載するためのベクターとしてネポウイルス属ウイルスベクターを用いる。
本発明においては、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡをコードする核酸を搭載するためのベクターとしてネポウイルス属ウイルスベクターを用いる。
【0038】
ベクターの由来する「ネポウイルス属ウイルス」としては、例えば、タバコ輪点ウイルス（ＴＲＳＶ）、アラビスモザイクウイルス（ＡｒＭＶ）、ブルーベリー小球形潜在ウイルス（ＢＬＳＶ）、チェリー葉巻ウイルス（ＣＬＲＶ）、ソテツえそ萎縮ウイルス（ＣＮＳＶ）、ブドウファンリーフウイルス（ＧＦＬＶ）、メロン微斑ウイルス（ＭＭＭｏＶ）、クワ輪紋ウイルス（ＭＲＳＶ）、トマト黒色輪点ウイルス（ＴＢＲＶ）、トマト輪点ウイルス（ＴｏＲＳＶ）などが挙げられるが、好ましくは、タバコ輪点ウイルス（ＴＲＳＶ）である。
【0039】
ネポウイルス属ウイルスのゲノムは、＋鎖１本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ－１とＲＮＡ－２の２分節ゲノムを有する。ＲＮＡ１は、Ｐ１Ａ（または、Ｘ１、Ｘ２。以下、同様。）、Ｈｅｌ（ヘリカーゼ）、ＶＰｇ（ゲノム結合タンパク質）、Ｐｒｏ（プロテアーゼ）、およびＰｏｌ（ポリメラーゼ）をコードし、ＲＮＡ－２は、Ｐ２Ａ（または、Ｘ３、Ｘ４。以下、同様。）、ＭＰ（移行タンパク質）、およびＣＰ（外皮タンパク質）をコードする。ＲＮＡ－１にコードされる上記タンパク質とＲＮＡ－２にコードされる上記タンパク質は、それぞれポリプロテインとして翻訳され、プロテアーゼによって分解されて、機能的なタンパク質となる。
【0040】
本発明におけるネポウイルス属ウイルスベクターは、ウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡの形態、ウイルスゲノムＲＮＡの形態、ウイルスゲノムＲＮＡを含むウイルス粒子の形態であり得る。
【0041】
本発明のネポウイルス属ウイルスベクターが、ウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡの形態の場合、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡをコードする核酸は、いずれもＤＮＡの形態でネポウイルス属ウイルスベクターに保持されている。この場合、ウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは、植物細胞内での発現を保証する発現ベクターに挿入されていてもよい。発現ベクターにおいて、ウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つ以上の調節エレメントに作動可能に結合していることが好ましい。ここで、「作動可能に結合している」とは、ウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡが発現可能に結合していることを意味する。「調節エレメント」としては、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル（ポリアデニル化シグナル、ポリＵ配列等））が挙げられる。
【0042】
ネポウイルス属ウイルスベクターが、ウイルスゲノムＲＮＡの形態またはウイルスゲノムＲＮＡを含むウイルス粒子の形態の場合、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡをコードする核酸は、いずれもＲＮＡの形態でネポウイルス属ウイルスベクターに保持されている。ウイルスゲノムＲＮＡは、ウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡが挿入されたベクターからの試験管内転写により調製することができ、ウイルスゲノムＲＮＡを含むウイルス粒子は、ウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡが挿入されたベクターあるいはウイルスＲＮＡを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞内でウイルス粒子を増殖させ、これを回収することにより調製することができる。
【0043】
ネポウイルス属ウイルスベクターにおいて、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡは、ＲＮＡ１のＰ１Ａ遺伝子の５’側、各遺伝子の間、またはＰｏｌ遺伝子の３’側、あるいはＲＮＡ２のＰ２Ａ遺伝子の５’側、各遺伝子の間、またはＣＰ遺伝子の３’側のいずれに位置してもよいが、好ましくは、ＲＮＡ２のＭＰ遺伝子とＣＰ遺伝子の間に位置する。
【0044】
ネポウイルス属ウイルスベクターにおいて、ガイドＲＮＡは、Ｐ１Ａ遺伝子の５’側またはＰｏｌ遺伝子の３’側、あるいはＲＮＡ２のＰ２Ａ遺伝子の５’側またはＣＰ遺伝子の３’側のいずれかに位置するが、好ましくは、ＲＮＡ２のＣＰ遺伝子の３’側に位置する。
【0045】
本発明のネポウイルス属ウイルスベクターは、その形態に応じて、例えば、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、プラズマ法、アグロバクテリウム法、摩擦接種法など、当業者に公知の方法により、植物に導入することができる。
【0046】
（ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサー）
本発明の好ましい態様においては、ネポウイルス属ウイルスベクターは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸に加えて、ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーをコードする核酸を保持する。ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーの発現により、ネポウイルス属ウイルスに対する植物の抵抗性を抑制し、植物ゲノムの編集効率を向上させることができる。
本発明の好ましい態様においては、ネポウイルス属ウイルスベクターは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムをコードする核酸に加えて、ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーをコードする核酸を保持する。ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーの発現により、ネポウイルス属ウイルスに対する植物の抵抗性を抑制し、植物ゲノムの編集効率を向上させることができる。
【0047】
本発明における「ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサー」は、動植物のウイルス抵抗性に関与するＲＮＡサイレンシングを抑制する機能を有するウイルスのタンパク質である。ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーとしては、例えば、タバコ茎えそウイルス由来の１６Ｋタンパク質、フロックハウスウイルス由来のＢ２タンパク質、イネ黄葉ウイルス由来のｐ６タンパク質、キュウリモザイクウイルス由来の２ｂタンパク質、ジャガイモＸウイルス由来のｐ２５タンパク質が挙げられるが、タバコ茎えそウイルス由来の１６Ｋタンパク質が特に好ましい。
【0048】
本発明のネポウイルス属ウイルスベクターが、ウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡの形態の場合、ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーをコードする核酸は、ＤＮＡの形態でネポウイルス属ウイルスベクターに保持されている。一方、ネポウイルス属ウイルスベクターが、ウイルスゲノムＲＮＡの形態またはウイルスゲノムＲＮＡを含むウイルス粒子の形態の場合、ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーをコードする核酸は、ＲＮＡの形態でネポウイルス属ウイルスベクターに保持されている。
【0049】
ネポウイルス属ウイルスベクターにおいて、ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーをコードするＲＮＡは、ＲＮＡ１のＰ１Ａ遺伝子の５’側、各遺伝子の間、またはＰｏｌ遺伝子の３’側、あるいはＲＮＡ２のＰ２Ａ遺伝子の５’側、各遺伝子の間、またはＣＰ遺伝子の３’側のいずれに位置してもよいが、好ましくは、ＲＮＡ１のＰ１Ａ遺伝子の５’側に位置する。Ｐ１Ａ遺伝子の５’側に位置する場合、ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーをコードするＲＮＡは、２Ａ配列を介して、Ｐ１Ａ遺伝子と結合されていることが好ましい。
【0050】
（植物）
本発明において、ネポウイルス属ウイルスベクターを導入する「植物」としては、ネポウイルス属ウイルスが宿主としうる植物であれば、特に制限はない。このような植物としては、例えば、ナス科植物（例えば、タバコなどのタバコ属植物、ナスなどのナス属植物、ペチュニアなどのペチュニア属植物、ピーマンなどのトウガラシ属植物）、マメ科植物（例えば、ダイズなどのダイズ属植物、ルピナスなどのルピナス属植物）、ツツジ科植物（例えば、ブルーベリーなどのスノキ属植物）、バラ科植物（例えば、リンゴなどのリンゴ属植物、ブラックベリーなどのイチゴ属植物、セイヨウミザクラなどのサクラ属植物、モモなどのモモ属植物）、ブドウ科植物（例えば、ブドウなどのブドウ属植物）、ミズキ科植物（例えば、ハナミズキなどのミズキ属植物）、モクセイ科植物（例えば、セイヨウトネリコなどのトネリコ属植物、オリーブなどのオリーブ属植物）、アヤメ科植物（例えば、グラジオラスなどのグラジオラス属植物、アヤメなどのアヤメ属植物）、キンポウゲ科植物（例えば、アネモネなどのイチリンソウ属植物）、シソ科植物（例えば、ミントなどのメンタ属植物）、ヒガンバナ科植物（例えば、スイセンなどのスイセン属植物）、パパイア科植物（例えば、パパイアなどのパパイア属植物）、フウロソウ科植物（例えば、ゼラニウムなどのテンジクアオイ属植物）、レンプクソウ科植物（例えば、ニワトコなどのニワトコ属植物）、ウリ科植物（例えば、メロンなどのキュウリ属植物）、アブラナ科植物（例えば、アラビスなどのアラビス属植物）、クワ科植物（例えば、クワなどのクワ属植物）、トウダイグサ科植物（例えばキャッサバなどのイモノキ属植物）、ベンケイソウ科植物（例えば、アエオニウムなどのアエオニウム属植物）、セリ科植物（例えばアラカチャなどのアラカチャ属植物）、キク科植物（例えばアーティチョークなどのチョウセンアザミ属植物、チコリーなどのキクニガナ属植物）、ヒユ科植物（例えばテンサイなどのフダンソウ属植物）、スグリ科植物（例えばクロスグリなどのスグリ属植物）、アオイ科植物（例えばカカオなどのカカオ属植物、フヨウなどのフヨウ属植物）、ソテツ科植物（例えばソテツなどのソテツ属植物）が挙げられる。
本発明において、ネポウイルス属ウイルスベクターを導入する「植物」としては、ネポウイルス属ウイルスが宿主としうる植物であれば、特に制限はない。このような植物としては、例えば、ナス科植物（例えば、タバコなどのタバコ属植物、ナスなどのナス属植物、ペチュニアなどのペチュニア属植物、ピーマンなどのトウガラシ属植物）、マメ科植物（例えば、ダイズなどのダイズ属植物、ルピナスなどのルピナス属植物）、ツツジ科植物（例えば、ブルーベリーなどのスノキ属植物）、バラ科植物（例えば、リンゴなどのリンゴ属植物、ブラックベリーなどのイチゴ属植物、セイヨウミザクラなどのサクラ属植物、モモなどのモモ属植物）、ブドウ科植物（例えば、ブドウなどのブドウ属植物）、ミズキ科植物（例えば、ハナミズキなどのミズキ属植物）、モクセイ科植物（例えば、セイヨウトネリコなどのトネリコ属植物、オリーブなどのオリーブ属植物）、アヤメ科植物（例えば、グラジオラスなどのグラジオラス属植物、アヤメなどのアヤメ属植物）、キンポウゲ科植物（例えば、アネモネなどのイチリンソウ属植物）、シソ科植物（例えば、ミントなどのメンタ属植物）、ヒガンバナ科植物（例えば、スイセンなどのスイセン属植物）、パパイア科植物（例えば、パパイアなどのパパイア属植物）、フウロソウ科植物（例えば、ゼラニウムなどのテンジクアオイ属植物）、レンプクソウ科植物（例えば、ニワトコなどのニワトコ属植物）、ウリ科植物（例えば、メロンなどのキュウリ属植物）、アブラナ科植物（例えば、アラビスなどのアラビス属植物）、クワ科植物（例えば、クワなどのクワ属植物）、トウダイグサ科植物（例えばキャッサバなどのイモノキ属植物）、ベンケイソウ科植物（例えば、アエオニウムなどのアエオニウム属植物）、セリ科植物（例えばアラカチャなどのアラカチャ属植物）、キク科植物（例えばアーティチョークなどのチョウセンアザミ属植物、チコリーなどのキクニガナ属植物）、ヒユ科植物（例えばテンサイなどのフダンソウ属植物）、スグリ科植物（例えばクロスグリなどのスグリ属植物）、アオイ科植物（例えばカカオなどのカカオ属植物、フヨウなどのフヨウ属植物）、ソテツ科植物（例えばソテツなどのソテツ属植物）が挙げられる。
【0051】
（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現の抑制）
本発明の好ましい態様において、ネポウイルス属ウイルスベクターを導入する植物は、内因性のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現が抑制されている。
本発明の好ましい態様において、ネポウイルス属ウイルスベクターを導入する植物は、内因性のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現が抑制されている。
【0052】
本発明における「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６」は、植物のウイルス抵抗性を誘導するＲＮＡサイレンシングに関与するタンパク質として知られている。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現を抑制することにより、ネポウイルス属ウイルスに対する植物の抵抗性を抑制し、植物ゲノムの編集効率を向上させることができる。
【0053】
ここで「遺伝子の発現の抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制の双方が含まれる。また、「発現の抑制」には、発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【0054】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現の抑制には、当該遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）を利用することができる。標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するｄｓＲＮＡを細胞内に導入することにより、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）と呼ばれる現象を引き起こすことができる。実際、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現を抑制するＲＮＡｉヘアピン構築物（ＲＤＲ６ｉ）が報告されている（Ｓｃｈｗａｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （２００５） １３８（４）， １８４２－１８５２）。また、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現の抑制には、アンチセンスＲＮＡやリボザイム活性を有するＲＮＡを用いることもできる。
【0055】
本発明においては、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子を標的としたゲノム編集系（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮなど）を利用してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子またはその発現制御領域を編集することにより、機能的なタンパク質の発現を抑制したり、当該遺伝子の転写を抑制してもよい。
【0056】
（植物のゲノム編集）
本発明における「ゲノム編集」には、核ゲノムの編集の他、ミトコンドリアゲノムおよび葉緑体ゲノムの編集が含まれる。
本発明における「ゲノム編集」には、核ゲノムの編集の他、ミトコンドリアゲノムおよび葉緑体ゲノムの編集が含まれる。
【0057】
また、本発明において「ゲノムを編集する」とは、ゲノム上の標的部位におけるＤＮＡ鎖の塩基の欠失、挿入、置換もしくは修飾が含まれる。さらに、標的部位におけるＤＮＡ（遺伝子）の転写の調節も含まれる。ゲノムの編集の態様は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおける、Ｃａｓタンパク質の活性またはＣａｓタンパク質に融合する他のエフェクタータンパク質の活性に応じて、変動しうる。
【0058】
本発明によれば、ネポウイルス属ウイルスベクターを導入した植物の部位のみならず、植物の全体に渡ってゲノムを編集することができる。本実施例においては、ネポウイルス属ウイルスベクターを導入した植物の栽培を続けると、その脇芽において、ゲノム編集された細胞の割合が高まる現象が確認された。従って、このような脇芽を挿し木などで増殖させることにより、種子繁殖を経ずにゲノム編集個体を得ることも可能となる。また、当該脇芽から種子を得れば、次世代個体への編集されたゲノムの遺伝率を大幅に向上させることも可能である。
【0059】
なお、本発明のネポウイルス属ウイルスベクターを利用することにより、上記の通り、組織培養を経ずに、植物のゲノムを編集することが可能であるが、組織培養を経て植物のゲノムを編集することが可能であることは言うまでもない。この場合、本発明のネポウイルス属ウイルスベクターを植物細胞に導入し、当該植物細胞から植物体を再生させることができる。組織培養により植物の組織を再分化させて個体を得る方法としては、本技術分野において確立された方法を利用することができる（例えば、形質転換プロトコール［植物編］ 田部井豊・編 化学同人 ｐｐ．３４０－３４７（２０１２））。
【0060】
＜ゲノム編集された植物を製造するためのキット＞
本発明は、ゲノム編集された植物を製造するためのキットを提供する。
本発明は、ゲノム編集された植物を製造するためのキットを提供する。
【0061】
本発明のキットは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡをコードする核酸を保持するネポウイルス属ウイルスベクターを含む。ネポウイルス属ウイルスベクターは、上記の通り、さらに、ウイルスのＲＮＡサイレンシングサプレッサーをコードする核酸を含んでいてもよい。
【0062】
本発明のキットは、一つまたは複数の追加の要素をさらに含んでもよい。追加の要素としては、例えば、上記のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現を抑制するための分子が挙げられる。他の追加の要素としては、対象試薬（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含まないネポウイルス属ウイルスベクター）が挙げられる。
【0063】
本発明のキットは、さらに、使用説明書を含むことができる。
【実施例0064】
Ａ．材料と方法
（１）植物
ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）を、２５℃、１６時間明期・８時間暗期の条件で栽培した。
（１）植物
ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）を、２５℃、１６時間明期・８時間暗期の条件で栽培した。
【0065】
（２）使用したウイルスおよび部分配列
・ＴＲＳＶ ＲＮＡ１（配列番号：１、２）
・ＴＲＳＶ ＲＮＡ２－Ｃａｓ９（ＮｂＰＤＳ）（配列番号：３、４）
・ＴＲＳＶ ＲＮＡ１－タバコ茎えそウイルス １６Ｋ（配列番号：５、６）
・フロックハウスウイルス Ｂ２（配列番号：７、８）
・イネ黄葉ウイルス Ｐ６（配列番号：９、１０）
・キュウリモザイクウイルス ２ｂ（配列番号：１１、１２）
・ジャガイモＸウイルス ｐ２５（配列番号：１３、１４）
・ＡＬＳＶ ＲＮＡ１（配列番号：１５、１６）
・ＡＬＳＶ ＲＮＡ２－ＮｂＲＤＲ６（配列番号：１７、１８）。
・ＴＲＳＶ ＲＮＡ１（配列番号：１、２）
・ＴＲＳＶ ＲＮＡ２－Ｃａｓ９（ＮｂＰＤＳ）（配列番号：３、４）
・ＴＲＳＶ ＲＮＡ１－タバコ茎えそウイルス １６Ｋ（配列番号：５、６）
・フロックハウスウイルス Ｂ２（配列番号：７、８）
・イネ黄葉ウイルス Ｐ６（配列番号：９、１０）
・キュウリモザイクウイルス ２ｂ（配列番号：１１、１２）
・ジャガイモＸウイルス ｐ２５（配列番号：１３、１４）
・ＡＬＳＶ ＲＮＡ１（配列番号：１５、１６）
・ＡＬＳＶ ＲＮＡ２－ＮｂＲＤＲ６（配列番号：１７、１８）。
【0066】
（３）アグロインフェクション用ウイルス（ＴＲＳＶ、ＡＬＳＶ）ベクター
ｐＰＺＰ２０２８（Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５６：１１６－１２５）にＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターとノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーターを導入し、その間に各ウイルスｃＤＮＡをクローニングした。
ｐＰＺＰ２０２８（Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５６：１１６－１２５）にＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターとノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーターを導入し、その間に各ウイルスｃＤＮＡをクローニングした。
【0067】
（４）ウイルス接種
基本的にＡｒｉｇａ ｅｔ ａｌ．（Ａｒｉｇａ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （２０２０） ６１ （１１）， １９４６－１９５３）の方法に従い、各ウイルスｃＤＮＡプラスミドを保有するアグロバクテリウムとトマトブッシースタントウイルスｐ１９遺伝子を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウムを共接種した。タバコ輪点ウイルスベクター（ＴＲＳＶ）の接種は、播種後４週間前後のベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の第５～８本葉に行った。ＲＤＲ６遺伝子の発現抑制は、播種後１８日前後の第１～３本葉にＡＬＳＶベクターを接種することにより行った。
基本的にＡｒｉｇａ ｅｔ ａｌ．（Ａｒｉｇａ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ （２０２０） ６１ （１１）， １９４６－１９５３）の方法に従い、各ウイルスｃＤＮＡプラスミドを保有するアグロバクテリウムとトマトブッシースタントウイルスｐ１９遺伝子を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウムを共接種した。タバコ輪点ウイルスベクター（ＴＲＳＶ）の接種は、播種後４週間前後のベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の第５～８本葉に行った。ＲＤＲ６遺伝子の発現抑制は、播種後１８日前後の第１～３本葉にＡＬＳＶベクターを接種することにより行った。
【0068】
（５）ベンサミアナタバコのゲノムＤＮＡ抽出、ＣＡＰＳ解析
ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）あるいはカネカ簡易ＤＮＡ抽出キットＶｅｒｓｉｏｎ ２（カネカ）を用いてＤＮＡ抽出を行った。ＣＡＰＳ解析はプライマー（フォワードプライマー：ＴＴＡＧＧＴＴＣＡＣＡＡＧＴＧＧＧＡＣＡＡＴＣＴＴＣ／配列番号：１９、リバースプライマー：ＣＡＧＣＡＴＣＡＣＡＣＴＴＴＣＧＣＡＴＴＣＡＡＡＡＣ／配列番号：２０）でＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩで切断することにより行った。
ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）あるいはカネカ簡易ＤＮＡ抽出キットＶｅｒｓｉｏｎ ２（カネカ）を用いてＤＮＡ抽出を行った。ＣＡＰＳ解析はプライマー（フォワードプライマー：ＴＴＡＧＧＴＴＣＡＣＡＡＧＴＧＧＧＡＣＡＡＴＣＴＴＣ／配列番号：１９、リバースプライマー：ＣＡＧＣＡＴＣＡＣＡＣＴＴＴＣＧＣＡＴＴＣＡＡＡＡＣ／配列番号：２０）でＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩで切断することにより行った。
【0069】
Ｂ．結果
（１）ＣＲＩＰＲ－Ｃａｓ９システムを発現するＴＲＳＶベクターによるベンサミアナタバコのゲノム編集
「ＴＲＳＶ ＲＮＡ１」を発現するアグロインフェクション用ＴＲＳＶベクターと「ＴＲＳＶ ＲＮＡ２－Ｃａｓ９（ＮｂＰＤＳ）」を発現するアグロインフェクション用ＴＲＳＶベクターの組み合わせをアグロバクテリウム法によりベンサミアナタバコに接種した（図１）。その結果、接種葉より上位の葉で、ＰＤＳ遺伝子の変異が検出されたが（右上）、接種葉より８枚以上上位の葉ではＣａｓ９遺伝子が脱落したことを示す短いバンドが検出された（右下）。ベンサミアナタバコの茎頂分裂組織のＰＤＳ遺伝子に変異が導入されたことにより、変異細胞を含む組織が生じ続けていると考えられる。
（１）ＣＲＩＰＲ－Ｃａｓ９システムを発現するＴＲＳＶベクターによるベンサミアナタバコのゲノム編集
「ＴＲＳＶ ＲＮＡ１」を発現するアグロインフェクション用ＴＲＳＶベクターと「ＴＲＳＶ ＲＮＡ２－Ｃａｓ９（ＮｂＰＤＳ）」を発現するアグロインフェクション用ＴＲＳＶベクターの組み合わせをアグロバクテリウム法によりベンサミアナタバコに接種した（図１）。その結果、接種葉より上位の葉で、ＰＤＳ遺伝子の変異が検出されたが（右上）、接種葉より８枚以上上位の葉ではＣａｓ９遺伝子が脱落したことを示す短いバンドが検出された（右下）。ベンサミアナタバコの茎頂分裂組織のＰＤＳ遺伝子に変異が導入されたことにより、変異細胞を含む組織が生じ続けていると考えられる。
【0070】
なお、接種した植物体の栽培を続けると脇芽において変異が濃縮され、枝変わりの様な表現型を示す個体が出現することが判明した。このような個体を利用すれば、ほぼ変異細胞のみからなる脇芽を選抜することが可能である。
【0071】
（２）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６（ＲＤＲ６）遺伝子の発現抑制のゲノム編集効率への影響
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現をウイルス誘導性ジーンサイレンシングによって抑制するために、アグロバクテリウム法により、「ＡＬＳＶ ＲＮＡ２－ＮｂＲＤＲ６」を発現するアグロインフェクション用ＡＬＳＶベクターと「ＡＬＳＶ ＲＮＡ１」を発現するアグロインフェクション用ＡＬＳＶベクターの組み合わせを事前に接種したベンサミアナタバコ、およびコントロール（ＡＬＳＶ－ｅｍｐｔｙを事前に接種したベンサミアナタバコ）に、「ＴＲＳＶ ＲＮＡ１」を発現するアグロインフェクション用ＴＲＳＶベクターと「ＴＲＳＶ ＲＮＡ２－Ｃａｓ９（ＮｂＰＤＳ）」を発現するアグロインフェクション用ＴＲＳＶベクターの組み合わせを接種し、１０枚上位葉における変異の有無を調べた（図２）。
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現をウイルス誘導性ジーンサイレンシングによって抑制するために、アグロバクテリウム法により、「ＡＬＳＶ ＲＮＡ２－ＮｂＲＤＲ６」を発現するアグロインフェクション用ＡＬＳＶベクターと「ＡＬＳＶ ＲＮＡ１」を発現するアグロインフェクション用ＡＬＳＶベクターの組み合わせを事前に接種したベンサミアナタバコ、およびコントロール（ＡＬＳＶ－ｅｍｐｔｙを事前に接種したベンサミアナタバコ）に、「ＴＲＳＶ ＲＮＡ１」を発現するアグロインフェクション用ＴＲＳＶベクターと「ＴＲＳＶ ＲＮＡ２－Ｃａｓ９（ＮｂＰＤＳ）」を発現するアグロインフェクション用ＴＲＳＶベクターの組み合わせを接種し、１０枚上位葉における変異の有無を調べた（図２）。
【0072】
その結果、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６遺伝子の発現を抑制した場合、コントロールと比較して、ＰＤＳ遺伝子への変異導入効率が上昇した（上）。また、ＲＤＲ６遺伝子の発現を抑制した植物では、標的であるＰＤＳ遺伝子の破壊による葉面の白化が稀に見られた（下）。
【0073】
（３）ＲＮＡサイレンシングサプレッサー（ＶＳＲ）の発現のゲノム編集効率への影響
「ＴＲＳＶ ＲＮＡ１－各ＲＮＡサイレンシングサプレッサー」を発現するアグロインフェクション用ＴＲＳＶベクターと「ＴＲＳＶ ＲＮＡ２－Ｃａｓ９（ＮｂＰＤＳ）」を発現するアグロインフェクション用ＴＲＳＶベクターの組み合わせをアグロバクテリウム法によりベンサミアナタバコに接種し、１０枚上位葉における変異の有無を調べた（図３上）。その結果、ＲＮＡサイレンシングサプレッサーの発現により、全体として、ＰＤＳ遺伝子への変異導入効率が上昇したが、タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）由来の１６Ｋタンパク質を発現させた場合に、最も変異導入効率が高かった（図３下）。
「ＴＲＳＶ ＲＮＡ１－各ＲＮＡサイレンシングサプレッサー」を発現するアグロインフェクション用ＴＲＳＶベクターと「ＴＲＳＶ ＲＮＡ２－Ｃａｓ９（ＮｂＰＤＳ）」を発現するアグロインフェクション用ＴＲＳＶベクターの組み合わせをアグロバクテリウム法によりベンサミアナタバコに接種し、１０枚上位葉における変異の有無を調べた（図３上）。その結果、ＲＮＡサイレンシングサプレッサーの発現により、全体として、ＰＤＳ遺伝子への変異導入効率が上昇したが、タバコ茎えそウイルス（ＴＲＶ）由来の１６Ｋタンパク質を発現させた場合に、最も変異導入効率が高かった（図３下）。
【0074】
（４）次世代個体における変異の確認
上記（２）で得られた個体より得られた次世代個体について、複二倍体のため２個存在する標的遺伝子（ＮｂＰＤＳａ遺伝子とＮｂＰＤＳ１ｂ遺伝子）に導入された変異をそれぞれＣＡＰＳ法で検出した（図４）。その結果、一部の個体では変異が検出され、サンガーシークエンスにより確認したところ、いずれか片方の遺伝子に変異が入っていた個体は４２％（８／１９）、両方の遺伝子に変異が入っていた個体は２６％（５／１９）であった。
上記（２）で得られた個体より得られた次世代個体について、複二倍体のため２個存在する標的遺伝子（ＮｂＰＤＳａ遺伝子とＮｂＰＤＳ１ｂ遺伝子）に導入された変異をそれぞれＣＡＰＳ法で検出した（図４）。その結果、一部の個体では変異が検出され、サンガーシークエンスにより確認したところ、いずれか片方の遺伝子に変異が入っていた個体は４２％（８／１９）、両方の遺伝子に変異が入っていた個体は２６％（５／１９）であった。
【産業上の利用可能性】
【0075】
以上説明したように、本発明によれば、組織培養を経ることなく、植物ゲノムの編集を行うことが可能となる。これにより、ゲノム編集を行う遺伝子の種類に応じて、様々な形質を持つ幅広い植物を簡便かつ効率的に作出することが可能となる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】