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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024028176
(43)【公開日】2024-03-01
(54)【発明の名称】植物由来メラニン様物質及びその利用
(51)【国際特許分類】
C07G 99/00 20090101AFI20240222BHJP
C12P 1/00 20060101ALI20240222BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240222BHJP
A61K 8/9789 20170101ALI20240222BHJP
A61K 36/81 20060101ALI20240222BHJP
A61Q 17/04 20060101ALI20240222BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20240222BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20240222BHJP
【ＦＩ】
C07G99/00 C
C12P1/00 Z
A61K45/00
A61K8/9789
A61K36/81
A61Q17/04
A61P17/16
A61P39/06
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023130233
(22)【出願日】2023-08-09
(31)【優先権主張番号】P 2022130933
(32)【優先日】2022-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】北村 憲司
(72)【発明者】
【氏名】田中 伸和
【テーマコード（参考）】
4B064
4C083
4C084
4C088
【Ｆターム（参考）】
4B064AH19
4B064BB07
4B064BB12
4B064BB34
4B064BE01
4B064BE19
4B064BG06
4B064BG09
4B064CA11
4B064CC01
4B064CE03
4B064CE15
4B064DA01
4B064DA10
4C083AA111
4C083AA112
4C083CC19
4C083EE12
4C083EE17
4C083FF01
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA89
4C084ZC37
4C088AB49
4C088AC01
4C088BA21
4C088CA25
4C088NA14
4C088ZA89
4C088ZC37
(57)【要約】
【課題】植物の組織培養によって得られる新規なメラニン様物質及びその利用を提供する。
【解決手段】ナス科タバコ属の植物の培養細胞を当該細胞が褐色～黒色に変化するまで培養した後、培養物のアルカリ水溶液抽出物から分離されるメラニン様物質。
【選択図】なし
【解決手段】ナス科タバコ属の植物の培養細胞を当該細胞が褐色～黒色に変化するまで培養した後、培養物のアルカリ水溶液抽出物から分離されるメラニン様物質。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ナス科タバコ属の植物の培養細胞を当該細胞が褐色～黒色に変化するまで培養した後、培養物のアルカリ水溶液抽出液から分離されるメラニン様物質。
【請求項2】
培養が、細胞を植え継ぎ後１０日間以上行われる請求項１記載のメラニン様物質。
【請求項3】
培養細胞がタバコＢＹ－２細胞である、請求項１記載のメラニン様物質。
【請求項4】
アルカリ水溶液が水酸化ナトリウム水溶液である、請求項１記載のメラニン様物質。
【請求項5】
ナス科タバコ属の植物の培養細胞を当該細胞が褐色～黒色に変化するまで培養する工程、前記培養により得られた培養物をアルカリ水溶液で抽出する工程、及び前記抽出により得られた抽出液からメラニン様物質を分離する工程を含むメラニン様物質の製造方法。
【請求項6】
メラニン様物質の分離が前記抽出液に酸を添加することにより析出させた析出物を分離回収する、請求項５記載の方法。
【請求項7】
請求項１～４のいずれか１項記載のメラニン様物質を有効成分とする紫外線防御剤。
【請求項8】
請求項１～４のいずれか１項記載のメラニン様物質を有効成分とする抗酸化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は植物由来の新規メラニン様物質及びその利用に関する。
【背景技術】
【0002】
メラニンは動物、菌類、真正細菌などで形成される褐～黒色の色素で、ヒトの髪の毛や皮膚などに蓄積し、紫外線を吸収してＤＮＡ損傷を防ぐ有用物質として知られる。
【0003】
動物由来では黒褐色のユーメラニン（ｅｕｍｅｌａｎｉｎ）や橙赤色のフェオメラニン（ｐｈｅｏｍｅｌａｎｉｎ）があるが、脳に蓄積する暗黒色素としてニューロメラニン（ｎｅｕｒｏｍｅｌａｎｉｎ）が存在することも知られている。また、カビには窒素未含有メラニンであるアロメラニン（ａｌｌｏｍｅｌａｎｉｎ）がしばしばみられ、真正細菌の表面には同様に窒素未含有のピオメラニン（ｐｙｏｍｅｌａｎｉｎ）がみられ、酸化ストレスからの防護や電子伝達への関わりが報告されている。
【0004】
また、メラニン類は植物でも見られ、アスパラゲール類やキク科（ヒマワリなど）の種皮に蓄積するものはフィトメラニン（ｐｈｙｔｏｍｅｌａｎｉｎ）と呼ばれるが、スイカ、トマ卜、モクセイ、クリ、アサガオ、ゴマ、オートムギ、ニンニク、オオムギ、クロタネソウ（ニゲラ）の種皮や茶などの植物にも存在し、その多くがアロメラニンで、昆虫による食害や乾燥に対する耐性を提供すると推測されている。
【0005】
メラニンは紫外線からの保護作用のみならず、ラジカル補足機能、温度制御など、その特殊な物理化学的性状から、電子材料としての利用も期待されている（非特許文献１）。さらに、最近ではその生理活性から抗腫瘍、抗アレルギー作用が示されており、医薬品としての利用可能性も示唆されている（非特許文献２）。例えば、特許文献１には、イカスミ由来のメラニンがプリン体と結合し、血中の尿酸値低下作用を有することが開示されている。
【0006】
植物由来のメラニンを取得する場合、その抽出材料の多くは種皮であり、栽培や採取によるため取得時期が限られるだけでなく、天候や栽培場所などが異なれば質的な変化も生じる。その上、硬質な種皮から抽出材料を取得する手問もかかる。
したがって、取得時期や環境条件などに左右されることなく常時均質の抽出材料を入手できる方法が求められ、例えば、ニゲラ属植物の培養細胞からメラニンを産生させることが報告されている（特許文献２）。
したがって、取得時期や環境条件などに左右されることなく常時均質の抽出材料を入手できる方法が求められ、例えば、ニゲラ属植物の培養細胞からメラニンを産生させることが報告されている（特許文献２）。
【0007】
一方、タバコ（学名：Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）は、ナス科タバコ属の植物であり、葉の成分としてニコチンを含み、その葉は「葉たばこ」として喫煙用などに供される。
しかしながら、タバコ属の植物にメラニン様物質が含まれるとの報告はなく、タバコ属植物からメラニン様物質が単離されたという報告もない。
しかしながら、タバコ属の植物にメラニン様物質が含まれるとの報告はなく、タバコ属植物からメラニン様物質が単離されたという報告もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開２００９－１３７８９６号公報
【特許文献2】国際特許公開第２０１２／１２５０９１号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Paulin, J.V., Graeff, C.F.O., 2021. From nature to organic (bio)electronics: a review on melanin-inspired materials. J. Mater. Chem., 9, 14514-14531.
【非特許文献2】d'Ischia, M., Wakamatsu, K., Cicoira, F., Di Mauro, E., Garcia-Borron, J.C., Commo, S., Ghanem, G., Koike, K., Meredith, P., Pezzella, A., Santato, C., Sarna, T., Simon, J.D., Zecca, L., Zucca, F.A., Napolitano, A., Ito, S., 2015. Pigment Cell Melanoma Res. 28, 520-544.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、植物の組織培養によって得られる新規なメラニン様物質及びその利用を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、上記の課題に鑑み検討したところ、タバコの培養細胞を一定期間培養した場合に、細胞中に多くの植物でみられるアロメラニンとは異なるメラニン様物質が生産され、当該物質には、紫外線防御作用及び抗酸化作用があることを見出した。
【0012】
すなわち、本発明は以下の１）～８）に係るものである。
１）ナス科タバコ属の植物の培養細胞を当該細胞が褐色～黒色に変化するまで培養した後、培養物のアルカリ水溶液抽出液から分離されるメラニン様物質。
２）培養が細胞を植え継ぎ後２０日間以上行われる、１）のメラニン様物質。
３）培養細胞がタバコＢＹ－２細胞である、１）のメラニン様物質。
４）アルカリ水溶液が水酸化ナトリウム水溶液である、１）のメラニン様物質。
５）ナス科タバコ属の植物の培養細胞を当該細胞が褐色～黒色に変化するまで培養する工程、前記培養により得られた培養物をアルカリ水溶液で抽出する工程、及び前記抽出により得られた抽出液からメラニン様物質を分離する工程を含むメラニン様物質の製造方法。
６）メラニン様物質の分離が前記抽出液に酸を添加することにより析出させた析出物を分離回収する、５）の方法。
７）１）～４）のいずれかのメラニン様物質を有効成分とする紫外線防御剤。
８）１）～４）のいずれかのメラニン様物質を有効成分とする抗酸化剤。
１）ナス科タバコ属の植物の培養細胞を当該細胞が褐色～黒色に変化するまで培養した後、培養物のアルカリ水溶液抽出液から分離されるメラニン様物質。
２）培養が細胞を植え継ぎ後２０日間以上行われる、１）のメラニン様物質。
３）培養細胞がタバコＢＹ－２細胞である、１）のメラニン様物質。
４）アルカリ水溶液が水酸化ナトリウム水溶液である、１）のメラニン様物質。
５）ナス科タバコ属の植物の培養細胞を当該細胞が褐色～黒色に変化するまで培養する工程、前記培養により得られた培養物をアルカリ水溶液で抽出する工程、及び前記抽出により得られた抽出液からメラニン様物質を分離する工程を含むメラニン様物質の製造方法。
６）メラニン様物質の分離が前記抽出液に酸を添加することにより析出させた析出物を分離回収する、５）の方法。
７）１）～４）のいずれかのメラニン様物質を有効成分とする紫外線防御剤。
８）１）～４）のいずれかのメラニン様物質を有効成分とする抗酸化剤。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、時期や環境条件などに左右されることなく常時均質の天然由来のメラニン様物質を入手できる。得られたメラニン様物質は紫外線防御作用及び抗酸化作用を有することから、医薬品、化粧品、食品等の素材として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】培養細胞の着色変化の様子；ａ）０週、ｂ）１週、ｃ）２週、ｄ）３週。
【図2】抽出された乾燥状態のメラニン様物質。
【図3】メラニン様物質の紫外－可視吸収スペクトル。
【図4】メラニン様物質のフーリエ変換赤外スペクトル（ＦＴ－ＩＲ）
【図5】メラニン様物質の電子スピン共鳴分析（ＥＳＲ）。
【図6】メラニン様物質の溶解性（ＮａＯＨ）。
【図7】メラニン様物質の溶解性（ＫＯＨ）。
【図8】メラニン様物質の溶解性（ＮＨ4ＯＨ）。
【図9】メラニン様物質の溶解性（ＨＣｌ）。
【図10】メラニン様物質の溶解性（有機溶媒）。
【図11】メラニン様物質の溶解性（エチレングリコールモノエチルエーテル、Ｓｏｌｕｅｎｅ－３５０）。
【図12】メラニン様物質の溶解性（緩衝液）。
【図13】メラニン様物質の温度安定性。
【図14】メラニン様物質の光照射安定性。
【図15】メラニン様物質の酸化剤に対する反応性（ＫＭｎＯ4）。
【図16】メラニン様物質の酸化剤に対する反応性（ＮａＯＣｌ）。
【図17】メラニン様物質の酸化剤に対する反応性（Ｈ2Ｏ2）。
【図18】メラニン様物質の酸化剤に対する反応性（Ｋ2Ｃｒ2Ｏ7）。
【図19】メラニン様物質の還元剤に対する反応性（Ｎａ2ＳＯ3）。
【図20】メラニン様物質の金属イオンに対する反応性。
【図21】メラニン様物質の大腸菌細胞の増殖性に対する影響。
【図22】大腸菌細胞に対する紫外線照射の効果。
【図23】メラニン様物質の紫外線保護効果（メラニン様物質：１ｍｇ／ｍＬ）。
【図24】メラニン様物質の紫外線保護効果（メラニン様物質：０～２ｍｇ／ｍＬ）。
【図25】メラニン様物質のスーパーオキシドラジカル捕捉活性。
【図26】メラニン様物質のＤＰＰＨラジカル捕捉活性。
【図27】メラニン様物質のヒドロキシラジカル捕捉活性。
【図28】メラニン様物質の還元力。
【図29】メラニン様物質の鉄キレート活性。
【図30】４種のタバコ属植物の培養後の乾燥カルス。
【図31】３種のタバコ属植物の培養後の乾燥懸濁培養細胞。
【図32】４種のタバコ属植物由来乾燥カルス粉末の溶媒抽出液（左：メタノール抽出、右：水酸化ナトリウム水溶液抽出）。
【図33】３種のタバコ属植物由来乾燥懸濁培養細胞粉末の溶媒抽出液（左：メタノール抽出、右：水酸化ナトリウム水溶液抽出）。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明のメラニン様物質は、ナス科タバコ属植物の培養細胞を一定期間以上培養した場合に、細胞中に産生される褐色～黒色の物質である。
培養細胞は、ナス科タバコ属植物の葉、根、茎等の植物体の一部から定法により培養細胞を樹立することにより得ることができる。
培養細胞を樹立するための原材料となるナス科タバコ属植物は、３つの亜属（Ｒｕｓｔｉｃａ、Ｔａｂａｃｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅｓ）に分類され、何れの亜属のものでものよい。例えば、Ｒｕｓｔｉｃａ亜属であればＮ．ｇｌａｕｃａやＮ．ｋｎｉｇｈｔａｎａなど、Ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅｓ亜属であればＮ．ｒｕｓｔｉｃａやＮ．ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉなどでもよいが、好ましくはＴａｂａｃｕｍ亜属であり、Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａやＮ．ｏｔｏｐｈｏｒａなどがあるが、より好ましくはニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、別名：タバコ）である。さらに、タバコには黄色種、バーレー種、オリエント種など品種があるが、いずれの品種でもよい。
培養細胞は、ナス科タバコ属植物の葉、根、茎等の植物体の一部から定法により培養細胞を樹立することにより得ることができる。
培養細胞を樹立するための原材料となるナス科タバコ属植物は、３つの亜属（Ｒｕｓｔｉｃａ、Ｔａｂａｃｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅｓ）に分類され、何れの亜属のものでものよい。例えば、Ｒｕｓｔｉｃａ亜属であればＮ．ｇｌａｕｃａやＮ．ｋｎｉｇｈｔａｎａなど、Ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅｓ亜属であればＮ．ｒｕｓｔｉｃａやＮ．ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉなどでもよいが、好ましくはＴａｂａｃｕｍ亜属であり、Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａやＮ．ｏｔｏｐｈｏｒａなどがあるが、より好ましくはニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、別名：タバコ）である。さらに、タバコには黄色種、バーレー種、オリエント種など品種があるが、いずれの品種でもよい。
【0016】
培養細胞の樹立方法としては、例えばタバコ属植物の組織の一部（例えば子葉）を定法により殺菌および洗浄し、固体培地上で無菌的に培養することによりカルスを取得し、この中から増殖能が高く維持されたカルスを取得した後、液体培地に移植して、一定期間毎に継代培養を繰り返して安定した細胞増殖性が認められる細胞株を取得する方法が挙げられる。
タバコの培養細胞としては、ニコチアナ・タバカムの品種であるブライトイエロー２号から誘導されたタバコＢＹ－２細胞（Nagata et al., Int. Rev. Cytol. 1992, 132, 1-30；Nagata et al., In vitro Cell Dev.-Pl. 2004, 40, 163-166）やＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１から誘導された細胞を用いるのが好適である。タバコＢＹ－２細胞は、理化学研究所バイオリソースセンター実験植物開発室等より入手することができる。
タバコの培養細胞としては、ニコチアナ・タバカムの品種であるブライトイエロー２号から誘導されたタバコＢＹ－２細胞（Nagata et al., Int. Rev. Cytol. 1992, 132, 1-30；Nagata et al., In vitro Cell Dev.-Pl. 2004, 40, 163-166）やＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１から誘導された細胞を用いるのが好適である。タバコＢＹ－２細胞は、理化学研究所バイオリソースセンター実験植物開発室等より入手することができる。
【0017】
メラニン様物質の生産に用いる培地としては、タバコ属植物の培養細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有すれば特に限定されないが、液体培地を用いるのが好ましい。例えば、基本培地として、リンスマイア－スクーグ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ－Ｓｋｏｏｇ）培地（ＬＳ培地）、ムラシゲ－スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ－Ｓｋｏｏｇ）培地（ＭＳ培地）、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、オー．エル．ガンボーグ（Ｏ．Ｌ．Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５培地、ニッチェ（Ｎｉｔｓｃｈ）培地、ヘラー（Ｈｅｌｌｅｒ）培地、モーレル（Ｍｏｒｅｌ）培地等を用いることができ、これにショ糖、グルコース、フラクトース、マルトース等の糖類を適宜添加したものを用いることができる。
また、基本培地の培地成分の一部の類似成分への置換、ビタミン類（塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸、パントテン酸カルシウム、ビタミンＢ１２、ビオチン、パラアミノ安息香酸、葉酸等）、アミノ酸（グリシン、グルタミン酸、リジン等）の添加、糖類の濃度の変更等によって改変した培地を用いることもできる。また、培地にはオーキシン類（インドール酢酸、インドール酪酸、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸等）、サイトカイニン類（ゼアチン、カイネチン、ベンジルアデニン、チジアズロン等）、ジベレリン類（ジベレリンＡ１、ジベレリンＡ３等）等の植物ホルモンを添加しても良い。
前記タバコＢＹ－２細胞を培養する場合は、ＬＳ培地を基本とし、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸を０．２ｍｇ／Ｌもしくは無添加とし、固形培地の場合は０.８～１．２％の寒天あるいは０．２～０．３％のゲルライト（ゲランガム）を添加し、１２１℃１５～２０分オートクレーブで滅菌した培地を用いるとよい。
また、基本培地の培地成分の一部の類似成分への置換、ビタミン類（塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸、パントテン酸カルシウム、ビタミンＢ１２、ビオチン、パラアミノ安息香酸、葉酸等）、アミノ酸（グリシン、グルタミン酸、リジン等）の添加、糖類の濃度の変更等によって改変した培地を用いることもできる。また、培地にはオーキシン類（インドール酢酸、インドール酪酸、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸等）、サイトカイニン類（ゼアチン、カイネチン、ベンジルアデニン、チジアズロン等）、ジベレリン類（ジベレリンＡ１、ジベレリンＡ３等）等の植物ホルモンを添加しても良い。
前記タバコＢＹ－２細胞を培養する場合は、ＬＳ培地を基本とし、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸を０．２ｍｇ／Ｌもしくは無添加とし、固形培地の場合は０.８～１．２％の寒天あるいは０．２～０．３％のゲルライト（ゲランガム）を添加し、１２１℃１５～２０分オートクレーブで滅菌した培地を用いるとよい。
【0018】
培養条件は、植物細胞の種類に応じて適宜調整できるが、通常約２０℃～約３５℃で、暗黒下で培養することが挙げられる。
例えば、ＢＹ－２細胞の場合、上記のＬＳ培地を使用し、２０～３０℃、好ましくは２３～２７℃で、暗黒下、ロータリーシェーカー等の回転培養機で８０～１５０ｒｐｍで振とう培養することができる。
培養は細胞が黒変するまで行われる。タバコＢＹ－２細胞の場合、細胞を植え継ぎ後、１週間で継代培養するが、そのまま培養を続けると１０日前後で褐色～黒色への変化（「黒変」とも称する）が始まり、約２週間を過ぎると細胞は黒変が進み、約３週間後には完全に褐色～黒色へ変化する。従って、タバコＢＹ－２細胞の場合、細胞を植え継ぎ後２０日以上、好ましくは植え継ぎ後２０～３０日程度、より好ましくは２１～２４日程度行うことが挙げられる。
なお、細胞の褐色～黒色への変化は目視によって確認することができ、細胞の褐色～黒色への変化と培地への褐色～黒色物質の蓄積をもって、完全に褐色～黒色へ変化したことを確認することができる。なお、本発明において「褐色～黒色」には、褐色から黒色に至るまでの色調が包含され、好ましくは黒褐色（黒みがかった茶色）が挙げられる。
例えば、ＢＹ－２細胞の場合、上記のＬＳ培地を使用し、２０～３０℃、好ましくは２３～２７℃で、暗黒下、ロータリーシェーカー等の回転培養機で８０～１５０ｒｐｍで振とう培養することができる。
培養は細胞が黒変するまで行われる。タバコＢＹ－２細胞の場合、細胞を植え継ぎ後、１週間で継代培養するが、そのまま培養を続けると１０日前後で褐色～黒色への変化（「黒変」とも称する）が始まり、約２週間を過ぎると細胞は黒変が進み、約３週間後には完全に褐色～黒色へ変化する。従って、タバコＢＹ－２細胞の場合、細胞を植え継ぎ後２０日以上、好ましくは植え継ぎ後２０～３０日程度、より好ましくは２１～２４日程度行うことが挙げられる。
なお、細胞の褐色～黒色への変化は目視によって確認することができ、細胞の褐色～黒色への変化と培地への褐色～黒色物質の蓄積をもって、完全に褐色～黒色へ変化したことを確認することができる。なお、本発明において「褐色～黒色」には、褐色から黒色に至るまでの色調が包含され、好ましくは黒褐色（黒みがかった茶色）が挙げられる。
【0019】
メラニン様物質は、前記培養により褐色～黒色に変化した培養細胞を回収した後、当該細胞をアルカリ水溶液に懸濁して抽出し、抽出液に酸を添加して析出させることにより分離回収できる。
ここで、用いられるアルカリ水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等の無機塩基の水溶液；アンモニア水、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミンなどの有機アミンの水溶液等が挙げられる。このうち、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液またはアンモニア水が好ましく、メラニン様物質の抽出効率の点から、例えば０．１～５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液がより好適である。
ここで、用いられるアルカリ水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等の無機塩基の水溶液；アンモニア水、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミンなどの有機アミンの水溶液等が挙げられる。このうち、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液またはアンモニア水が好ましく、メラニン様物質の抽出効率の点から、例えば０．１～５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液がより好適である。
【0020】
抽出は、上記アルカリ水溶液の懸濁液を２５～７５℃で、１～２４時間で撹拌し、上清を遠心分離（６，０００～１０，０００ｇ、１０～３０分）し、残渣についてアルカリ水溶液を加えて撹拌する抽出操作を繰り返すことにより行うことができる。
上記アルカリ水溶液によって抽出されたメラニン様物質は、酸を用いて抽出液のｐＨを１～２に調整することにより不溶化される。ここで用いられる酸としては、ｐＨを酸性に調整できるものであれば特に限定されず、例えば塩酸、硫酸、酢酸等を挙げることができる。斯かる不溶化操作は、抽出液に酸を添加して１～２時間静置することにより行うのが好ましい。
上記アルカリ水溶液によって抽出されたメラニン様物質は、酸を用いて抽出液のｐＨを１～２に調整することにより不溶化される。ここで用いられる酸としては、ｐＨを酸性に調整できるものであれば特に限定されず、例えば塩酸、硫酸、酢酸等を挙げることができる。斯かる不溶化操作は、抽出液に酸を添加して１～２時間静置することにより行うのが好ましい。
【0021】
斯くして不溶化して分離されたメラニン様物質（粗メラニン様物質）は、適宜、炭水化物、タンパク質、脂質等を除去した後、回収される。斯かる精製操作は公知の手法により行うことができる。
炭水化物の除去は、粗メラニン様物質に１～５Ｍ塩酸溶液を加えてボルテックス攪拌すること等により行うことができるが、細胞壁の除去ではセルラーゼやペクチナーゼ、デンプンの除去ではアミラーゼなどの分解酵素による処理で行うことができる。タンパク質の除去は、例えば粗メラニン様物質に１～５Ｍ塩酸溶液を加えてボルテックス攪拌すること等により行うことができるが、フェノールによる変性やプロテアーゼなどのタンパク分解酵素による処理で行うことができる。脂質の除去は、例えば粗メラニン様物質に１００％エタノールやクロロホルムを加えて一定時間撹拌することにより行うことができるが、リパーゼなどの酵素の処理によって行うことができる。
また、メラニン様物質の単離においては、必要に応じて、濾過、洗浄、乾燥、各種クロマトグラフィー等による精製を適宜行うことができる。
炭水化物の除去は、粗メラニン様物質に１～５Ｍ塩酸溶液を加えてボルテックス攪拌すること等により行うことができるが、細胞壁の除去ではセルラーゼやペクチナーゼ、デンプンの除去ではアミラーゼなどの分解酵素による処理で行うことができる。タンパク質の除去は、例えば粗メラニン様物質に１～５Ｍ塩酸溶液を加えてボルテックス攪拌すること等により行うことができるが、フェノールによる変性やプロテアーゼなどのタンパク分解酵素による処理で行うことができる。脂質の除去は、例えば粗メラニン様物質に１００％エタノールやクロロホルムを加えて一定時間撹拌することにより行うことができるが、リパーゼなどの酵素の処理によって行うことができる。
また、メラニン様物質の単離においては、必要に応じて、濾過、洗浄、乾燥、各種クロマトグラフィー等による精製を適宜行うことができる。
【0022】
斯くして回収された、本発明のメラニン様物質は、後記試験例に示すとおり、吸光度解析（２００－６００ｎｍ）において、Ｓｅｐｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（ヨーロッパコウイカ）由来のＳｅｐｉａメラニン（イカスミメラニン、Ｍ２６４９；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）あるいは合成メラニン（ＣＡＳ番号：８０４９－９７－６）と類似した吸光度スペクトルを保有する。
また、ＦＴ－ＩＲ分析では、３７００－２５００ｃｍ－１と１８００－９００ｃｍ－１に広い吸収帯と８００－５００ｃｍ－１に少し小さめのやや広い吸収帯を持ち、他の既報のｍｅｌａｎｉｎとも似たＦＴ－ＩＲスペクトラムが示される。３２８６ｃｍ－１を中心とする３３６６－３１６７ｃｍ－１の広くて比較的強いピークはＯ－ＨとＮ－Ｈの伸縮振動を示し、３１２５－３０４６ｃｍ－１の広くて弱いピークは芳香族のＣ－Ｈ振動で、１６００ｃｍ－１と１５００ｃｍ－１辺りの芳香環のバンドの存在によって支持される。比較的強く２つの中心を持つ２９９０－２９０３ｃｍ－１および小さな２８７４ｃｍ－１のピークは脂肪族のＣ－Ｈ基の伸縮振動と考えられる。１６９２－１６０７ｃｍ－１の強い吸収は芳香族のＣ＝Ｃ伸縮，ＣＯＯ－の非対称伸縮で、１５６３－１５０３ｃｍ－１の強い吸収はＮ－Ｈの歪みとＣ－Ｎ伸縮（アミドＩＩ帯）と芳香族Ｃ＝Ｃ伸縮と考えられる。１４５６ｃｍ－１と１３９４ｃｍ－１の小さめのピークはそれぞれ脂肪族のＣ－Ｈの歪みとフェノールのＣ－Ｏ－Ｈ湾曲およびインドールとフェノールのＮ－Ｈ伸縮とみられる。１２９７－１２６０ｃｍ－１の小さめのピークはカルボキシル基の伸縮振動と思われる。１２２５－９００ｃｍ－１の吸収の傾斜にあるいくつかの小さなピークは芳香族Ｃ－Ｈ平面内湾曲と思われる。６９９ｃｍ－１に小さいが鋭いピークがみられ、８２２ｃｍ－１や７４２ｃｍ－１とともに芳香族Ｃ－Ｈの平面外歪みと思われる。以上のことからメラニン類似物質であると考えられるが、元素分析によりＮの含有が認められることから、植物で報告されている多くのアロメラニンとは異なる新規なメラニン様物質であると云える。
また、ＦＴ－ＩＲ分析では、３７００－２５００ｃｍ－１と１８００－９００ｃｍ－１に広い吸収帯と８００－５００ｃｍ－１に少し小さめのやや広い吸収帯を持ち、他の既報のｍｅｌａｎｉｎとも似たＦＴ－ＩＲスペクトラムが示される。３２８６ｃｍ－１を中心とする３３６６－３１６７ｃｍ－１の広くて比較的強いピークはＯ－ＨとＮ－Ｈの伸縮振動を示し、３１２５－３０４６ｃｍ－１の広くて弱いピークは芳香族のＣ－Ｈ振動で、１６００ｃｍ－１と１５００ｃｍ－１辺りの芳香環のバンドの存在によって支持される。比較的強く２つの中心を持つ２９９０－２９０３ｃｍ－１および小さな２８７４ｃｍ－１のピークは脂肪族のＣ－Ｈ基の伸縮振動と考えられる。１６９２－１６０７ｃｍ－１の強い吸収は芳香族のＣ＝Ｃ伸縮，ＣＯＯ－の非対称伸縮で、１５６３－１５０３ｃｍ－１の強い吸収はＮ－Ｈの歪みとＣ－Ｎ伸縮（アミドＩＩ帯）と芳香族Ｃ＝Ｃ伸縮と考えられる。１４５６ｃｍ－１と１３９４ｃｍ－１の小さめのピークはそれぞれ脂肪族のＣ－Ｈの歪みとフェノールのＣ－Ｏ－Ｈ湾曲およびインドールとフェノールのＮ－Ｈ伸縮とみられる。１２９７－１２６０ｃｍ－１の小さめのピークはカルボキシル基の伸縮振動と思われる。１２２５－９００ｃｍ－１の吸収の傾斜にあるいくつかの小さなピークは芳香族Ｃ－Ｈ平面内湾曲と思われる。６９９ｃｍ－１に小さいが鋭いピークがみられ、８２２ｃｍ－１や７４２ｃｍ－１とともに芳香族Ｃ－Ｈの平面外歪みと思われる。以上のことからメラニン類似物質であると考えられるが、元素分析によりＮの含有が認められることから、植物で報告されている多くのアロメラニンとは異なる新規なメラニン様物質であると云える。
【0023】
そして、本発明のメラニン様物質は、後記試験例に示すとおり、紫外線防御作用、抗酸化作用（活性酸素消去作用）を有する。したがって、本発明のメラニン様物質は紫外線防御剤、抗酸化剤となり得る。
本発明において、「紫外線防御」とは、紫外線を吸収或いは散乱することで、生体を紫外線から防御する作用を意味する。したがって、本発明の紫外線防御剤によれば、紫外線による肌のダメージ（例えば、紅斑やシミ、皮膚の黒化、シワ、炎症など）の発生を抑制すること、紫外線による皮膚や肌の老化を抑制することが可能となる。
本発明において、「紫外線防御」とは、紫外線を吸収或いは散乱することで、生体を紫外線から防御する作用を意味する。したがって、本発明の紫外線防御剤によれば、紫外線による肌のダメージ（例えば、紅斑やシミ、皮膚の黒化、シワ、炎症など）の発生を抑制すること、紫外線による皮膚や肌の老化を抑制することが可能となる。
【0024】
本発明において、「抗酸化」とは、活性酸素を消去して物質が酸化されるのを抑制することを意味し、より具体的には、活性酸素の過剰産生による細胞や組織傷害を減弱することを指す。したがって、本発明の抗酸化剤によれば、活性酸素の過剰産生によって誘発又は助長される症状若しくは疾患の予防、改善又は治療が可能となる。活性酸素の過剰産生によって誘発又は助長される疾患としては、例えば、循環器疾患（動脈硬化症、虚血性心疾患（不整脈、狭心症、心筋梗塞）、高血圧、脳血管疾患（脳梗塞、脳出血）等）、脳神経系疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病、能萎縮性側索硬化症状、外傷性てんかん、認知症等）、消化器系疾患（胃炎、胃潰瘍、小腸炎、潰瘍性大腸炎、過敏性大腸炎、クローン病、薬剤性大腸炎、膀胱炎、肝炎、胆嚢炎等）、腎疾患（糸球体腎炎、糖尿病性腎炎、腎不全、薬剤性腎障害等）、呼吸器疾患、代謝・内分泌疾患、アレルギー疾患、眼疾患、老化・老人性疾患等が挙げられる。
【0025】
本発明の紫外線防御剤、抗酸化剤は、紫外線防御又は抗酸化を目的とした、医薬品、医薬部外品、食品若しくは化粧品であり得、又は当該医薬品、医薬部外品、食品若しくは化粧品を製造するための原料又は素材であり得る。また、食品には、紫外線防御又は抗酸化をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、サプリメントが包含される。
【0026】
上記医薬品又は医薬部外品は、その投与形態は任意であり、経口投与、非経口投与の何れでもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形製剤、並びにエリキシル、シロップ及び懸濁液のような液体製剤が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、外用、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、貼付等の各製剤が挙げられる。
【0027】
上記化粧品の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアジェル、ヘアクリーム、トリートメント、ヘアスプレー、エアゾルムース、シャンプー、リンス等、化粧品に使用され得る任意の形態が挙げられる。
【0028】
上記食品の形態は、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、スープ類等、あらゆる飲料・食品形態とすることができる。
【0029】
上記医薬品、医薬部外品若しくは化粧品に係る製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、本発明のメラニン様物質を製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等と共に混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの製剤組成物には、本発明のメラニン様物質の他、それぞれ医薬品、医薬部外品、化粧品等の製剤の種類に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗菌剤、清涼剤等の薬効成分を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
【0030】
当該製剤組成物中の本発明のメラニン様物質の含有量は、一般的に好ましくは０．０００１～１０質量％、より好ましくは０．０００５～１質量％である。
また、上記製剤組成物による本発明のメラニン様物質の投与量は、本発明の効果を達成できる量であり得る。当該投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、例えば好ましくは０．００１～１０,０００ｍｇであり得る。
また、上記製剤組成物による本発明のメラニン様物質の投与量は、本発明の効果を達成できる量であり得る。当該投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、例えば好ましくは０．００１～１０,０００ｍｇであり得る。
【実施例0031】
実施例１ タバコＢＹ－２細胞を用いたメラニン様物質の生産
１．材料と方法
（１）細胞と培地
タバコ属植物の培養細胞として、タバコＢＹ－２細胞を用いた。ＢＹ－２細胞は、理化学研究所バイオリソースセンター実験植物開発室より、入手した。
この細胞の培養にはＬｉｎｓｍａｉｅｒ－Ｓｋｏｏｇ（ＬＳ）液体培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ， １９６５）を用いた。
ＵＶ保護作用試験では大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２株由来ＤＨ－５α株を用い、培養にはＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Ｂｅｒｔａｎｉ，１９５１）を用いた。
１．材料と方法
（１）細胞と培地
タバコ属植物の培養細胞として、タバコＢＹ－２細胞を用いた。ＢＹ－２細胞は、理化学研究所バイオリソースセンター実験植物開発室より、入手した。
この細胞の培養にはＬｉｎｓｍａｉｅｒ－Ｓｋｏｏｇ（ＬＳ）液体培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ， １９６５）を用いた。
ＵＶ保護作用試験では大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２株由来ＤＨ－５α株を用い、培養にはＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Ｂｅｒｔａｎｉ，１９５１）を用いた。
【0032】
（２）試薬類
試薬類は、特に断りがなければＮａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ（Ｋｙｏｔｏ， Ｊａｐａｎ）とＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）から購入した。
試薬類は、特に断りがなければＮａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ（Ｋｙｏｔｏ， Ｊａｐａｎ）とＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）から購入した。
【0033】
２．メラニン様物質の抽出
（１）ＢＹ－２細胞の培養
毎週、７５ｍＬのＬＳ液体培地を３００ｍｌのフラスコに３ｍｌのＢＹ－２細胞を植え継ぎ、２５℃の暗黒下でNew Brunswick Scientific Co. Inc.の回転培養機（Gyrotory Shaker Model G-10）で１３０ｒｐｍで培養した。
２０ｍｌのＬＳ液体培地を入れた１００ｍｌのフラスコに１週間培養したＢＹ－２細胞を１ｍｌ入れ、２５℃の暗黒下でNew Brunswick Scientific Co. Inc.の回転培養機（Gyrotory Shaker Model G-10）で１３０ｒｐｍで細胞が褐色～黒色に変化（「黒変」）するまで培養した。
植え継ぎ後１０日あたりから黒変がみられ、２週間後には黒変が進み、３週間後では黒褐色に変化した（図１ａ－ｅ）。また、培地も黒褐色に変化し（図１ｆ）、何らかの黒褐色の物質が蓄積し、細胞外に放出されていることが示唆された。
（１）ＢＹ－２細胞の培養
毎週、７５ｍＬのＬＳ液体培地を３００ｍｌのフラスコに３ｍｌのＢＹ－２細胞を植え継ぎ、２５℃の暗黒下でNew Brunswick Scientific Co. Inc.の回転培養機（Gyrotory Shaker Model G-10）で１３０ｒｐｍで培養した。
２０ｍｌのＬＳ液体培地を入れた１００ｍｌのフラスコに１週間培養したＢＹ－２細胞を１ｍｌ入れ、２５℃の暗黒下でNew Brunswick Scientific Co. Inc.の回転培養機（Gyrotory Shaker Model G-10）で１３０ｒｐｍで細胞が褐色～黒色に変化（「黒変」）するまで培養した。
植え継ぎ後１０日あたりから黒変がみられ、２週間後には黒変が進み、３週間後では黒褐色に変化した（図１ａ－ｅ）。また、培地も黒褐色に変化し（図１ｆ）、何らかの黒褐色の物質が蓄積し、細胞外に放出されていることが示唆された。
【0034】
（２）メラニン様物質の抽出
（２－１）３週間培養したＢＹ－２細胞をブフナーロートに定性ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を乗せ、吸引ろ過で回収した。７５℃で４８ｈｒ乾燥し、抽出材料とした。濾過後の培地は別途回収し、メラニン様物質の基質候補の分析用として－８０℃で保存した
５ｇの乾燥したＢＹ－２細胞を２００ｍｌの蓋付きガラスフラスコ中で１２０ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液に懸濁した。この懸濁液を７５℃で３時間静置し、１時間ごとに攪拌して抽出した。この懸濁液を１０，０００ｇ、２２℃で１０分間遠心し、黒褐色の上清を回収した。沈殿は４０ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液で懸濁し、再度、２００ｍｌの蓋付きガラスフラスコに入れて８０ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を加えて、１２０ｍｌとし、前述の方法で細胞から黒褐色物質がなくなるまであと３回抽出を繰り返した。回収した合計４８０ｍｌの黒褐色の上清を２枚重ねたろ紙を通してろ過した。
抽出した黒褐色溶液は６．０ＭのＨＣｌを加えてスターラーで攪拌しながらｐＨ２．０に調整し、その後室温に２時間静置することで黒褐色色素を不溶化させた。この液を１０，０００ｇ、２２℃で１０分間遠心し、黒褐色の沈殿を回収した。この沈殿を４０ｍｌの６．０Ｍ ＨＣｌにＶｏｒｔｅｘで懸濁し、１００℃に２時間静置し、炭水化物とタンパク質を分解した。この溶液を１０，０００ｇ、２２℃で１０分間遠心し、黒褐色の沈殿を回収した。この沈殿を４０ｍｌの蒸留水にＶｏｒｔｅｘで十分に懸濁して洗浄し、１０，０００ｇ、２２℃で１０分間遠心して、黒褐色の沈殿を回収した。
（２－１）３週間培養したＢＹ－２細胞をブフナーロートに定性ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を乗せ、吸引ろ過で回収した。７５℃で４８ｈｒ乾燥し、抽出材料とした。濾過後の培地は別途回収し、メラニン様物質の基質候補の分析用として－８０℃で保存した
５ｇの乾燥したＢＹ－２細胞を２００ｍｌの蓋付きガラスフラスコ中で１２０ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液に懸濁した。この懸濁液を７５℃で３時間静置し、１時間ごとに攪拌して抽出した。この懸濁液を１０，０００ｇ、２２℃で１０分間遠心し、黒褐色の上清を回収した。沈殿は４０ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液で懸濁し、再度、２００ｍｌの蓋付きガラスフラスコに入れて８０ｍｌの０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を加えて、１２０ｍｌとし、前述の方法で細胞から黒褐色物質がなくなるまであと３回抽出を繰り返した。回収した合計４８０ｍｌの黒褐色の上清を２枚重ねたろ紙を通してろ過した。
抽出した黒褐色溶液は６．０ＭのＨＣｌを加えてスターラーで攪拌しながらｐＨ２．０に調整し、その後室温に２時間静置することで黒褐色色素を不溶化させた。この液を１０，０００ｇ、２２℃で１０分間遠心し、黒褐色の沈殿を回収した。この沈殿を４０ｍｌの６．０Ｍ ＨＣｌにＶｏｒｔｅｘで懸濁し、１００℃に２時間静置し、炭水化物とタンパク質を分解した。この溶液を１０，０００ｇ、２２℃で１０分間遠心し、黒褐色の沈殿を回収した。この沈殿を４０ｍｌの蒸留水にＶｏｒｔｅｘで十分に懸濁して洗浄し、１０，０００ｇ、２２℃で１０分間遠心して、黒褐色の沈殿を回収した。
【0035】
脂質とその他の物質を除去するため、黒褐色沈殿を３０ｍｌの１００％ ＥｔＯＨにＶｏｒｔｅｘで十分に懸濁し、３０分間シェーカーで振とうした。この液を１０，０００ｇ、２２℃で１０分間遠心し、黒褐色の沈殿を回収した。この沈殿を４０ｍｌの蒸留水にＶｏｒｔｅｘで十分に懸濁して洗浄し、１０，０００ｇ、２２℃で１０分間遠心して、黒褐色の沈殿を回収した。同様な分解と洗浄を酢酸エチルとアセトンで繰り返した。最終的に黒褐色沈殿は２ｍｌの蓋つきプラスチックチューブに移し、凍結乾燥機（ＦＤ－１０００、Ｔｏｋｙｏ Ｒｉｋａｋｉｋａｉ Ｃｏ， Ｌｔｄ）で乾燥した。５ｇの乾燥したＢＹ－２細胞から１５０～１７０ｍｇの物質が抽出された。この物質は黒褐色を呈し、乾燥後はやや塊を形成したが、よくつぶすことで細かい粒子となった（図２）。抽出した物質をメラニン様物質と呼ぶ。
【0036】
＜試験例＞
以下の試験結果は３つのサンプルの平均値と標準偏差とし、各実験は少なくとも２回は繰り返した。統計学的有意差は実験によってＰ＜０．０５もしくはＰ＜０．０１で評価した。
試験例１ メラニン様物質の解析
（１）吸光度解析
実施例１で得られたメラニン様物質を０．０５ｍｇ／ｍｌで０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液に溶解し、紫外可視分光光度計（ＤＵ７３０，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で２００－６００ｎｍの波長で吸光度をスキャンした。
市販の合成メラニン（ＣＡＳ番号：８０４９－９７－６、Ｍ８６３１，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＳｅｐｉａメラニン（Ｓｅｐｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ由来，Ｍ２６４９，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の粉末を同じ濃度で０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液に溶解し、比較として用いた。
以下の試験結果は３つのサンプルの平均値と標準偏差とし、各実験は少なくとも２回は繰り返した。統計学的有意差は実験によってＰ＜０．０５もしくはＰ＜０．０１で評価した。
試験例１ メラニン様物質の解析
（１）吸光度解析
実施例１で得られたメラニン様物質を０．０５ｍｇ／ｍｌで０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液に溶解し、紫外可視分光光度計（ＤＵ７３０，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で２００－６００ｎｍの波長で吸光度をスキャンした。
市販の合成メラニン（ＣＡＳ番号：８０４９－９７－６、Ｍ８６３１，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＳｅｐｉａメラニン（Ｓｅｐｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ由来，Ｍ２６４９，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の粉末を同じ濃度で０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液に溶解し、比較として用いた。
【0037】
結果を図３に示す。
合成メラニンは６００ｎｍから徐々に吸光度が上昇し４００－２３０ｎｍでは直線的に、２３０ｎｍから急激に上昇後２１８ｎｍにピークがみられた。また、Ｓｅｐｉａメラニンは５００ｎｍ辺りから徐々に吸光度が上昇し４００－２８０ｎｍでは直線的に、その後やや急激に上昇し、２６５ｎｍあたりで低いピークがみられ、さらに、２３０ｎｍ辺りから急激な上昇の後、２１０ｎｍと２０６ｎｍにピークがみられた。
本発明のメラニン様物質では５００ｎｍ辺りから徐々に吸光度が上昇し４００－３００ｎｍでは直線的に、その後やや急に上昇し、２８０ｎｍあたりでショルダーがみられ、さらに、２６５ｎｍ辺りから急激な上昇の後、２１８ｎｍにピークがみられた。このことから、ピークの波長は少し異なるが、本発明のメラニン様物質は、これまで報告されている動物由来あるいは合成のメラニンと類似した吸光度スペクトルを持っていることが分かった。
合成メラニンは６００ｎｍから徐々に吸光度が上昇し４００－２３０ｎｍでは直線的に、２３０ｎｍから急激に上昇後２１８ｎｍにピークがみられた。また、Ｓｅｐｉａメラニンは５００ｎｍ辺りから徐々に吸光度が上昇し４００－２８０ｎｍでは直線的に、その後やや急激に上昇し、２６５ｎｍあたりで低いピークがみられ、さらに、２３０ｎｍ辺りから急激な上昇の後、２１０ｎｍと２０６ｎｍにピークがみられた。
本発明のメラニン様物質では５００ｎｍ辺りから徐々に吸光度が上昇し４００－３００ｎｍでは直線的に、その後やや急に上昇し、２８０ｎｍあたりでショルダーがみられ、さらに、２６５ｎｍ辺りから急激な上昇の後、２１８ｎｍにピークがみられた。このことから、ピークの波長は少し異なるが、本発明のメラニン様物質は、これまで報告されている動物由来あるいは合成のメラニンと類似した吸光度スペクトルを持っていることが分かった。
【0038】
（２）元素分析
乾燥した本発明のメラニン様物質を微量元素分析装置（ＣＨＮＳ／Ｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２４００ II，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．ＣＴ）で構成元素の分析を行った。結果を表１に示す。
乾燥した本発明のメラニン様物質を微量元素分析装置（ＣＨＮＳ／Ｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２４００ II，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．ＣＴ）で構成元素の分析を行った。結果を表１に示す。
【0039】
【表1】
【0040】
表１より、ロットの異なる抽出サンプルで得られた本発明のメラニン様物質の構成元素の比率はほぼ同一で、Ｃ，Ｈ．Ｎが含有されているがＳは含有されていない。なお、Ｎの含有から、植物で報告されている多くのａｌｌｏｍｅｌａｎｉｎとは異なるメラニン様物質であることが示唆された。
【0041】
（３）ＦＴ－ＩＲ分析
フーリエ変換赤外スペクトル（ＦＴ－ＩＲ）分析はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）を用いて行った。本発明のメラニン様物質を３ｍｇと１５０ｍｇのＫＢｒと混合し、約５０ｍｇを分析に供した。波長は４０００－５００ｃｍ-1のレンジで測定し、グラフ化した（図４）。
３７００－２５００ｃｍ－１と１８００－９００ｃｍ－１に広い吸収帯と８００－５００ｃｍ－１に少し小さめのやや広い吸収帯を持ち、他の既報のｍｅｌａｎｉｎとも似たＦＴ－ＩＲスペクトラムが示された。３２８６ｃｍ－１を中心とする３３６６－３１６７ｃｍ－１の広くて比較的強いピークはＯ－ＨとＮ－Ｈの伸縮振動を示し、３１２５－３０４６ｃｍ－１の広くて弱いピークは芳香族のＣ－Ｈ振動で、１６００ｃｍ－１と１５００ｃｍ－１辺りの芳香環のバンドの存在によって支持される。比較的強く２つの中心を持つ２９９０－２９０３ｃｍ－１および小さな２８７４ｃｍ－１のピークは脂肪族のＣ－Ｈ基の伸縮振動と考えらる。１６９２－１６０７ｃｍ－１の強い吸収は芳香族のＣ＝Ｃ伸縮，ＣＯＯ－の非対称伸縮で、１５６３－１５０３ｃｍ－１の強い吸収はＮ－Ｈの歪みとＣ－Ｎ伸縮（アミドＩＩ帯）と芳香族Ｃ＝Ｃ伸縮と考えられる。１４５６ｃｍ－１と１３９４ｃｍ－１の小さめのピークはそれぞれ脂肪族のＣ－Ｈの歪みとフェノールのＣ－Ｏ－Ｈ湾曲およびインドールとフェノールのＮ－Ｈ伸縮とみられる。１２９７－１２２１ｃｍ－１の小さめの２つのピークはカルボキシル基の伸縮振動と思われる。１２２５－９００ｃｍ－１の吸収の傾斜にあるいくつかの小さなピークは芳香族Ｃ－Ｈ平面内湾曲と思われる。６９９ｃｍ－１に小さいが鋭いピークがみられ、８２２ｃｍ－１や７４２ｃｍ－１とともに芳香族Ｃ－Ｈの平面外歪みと思われる。
フーリエ変換赤外スペクトル（ＦＴ－ＩＲ）分析はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｏｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ，Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）を用いて行った。本発明のメラニン様物質を３ｍｇと１５０ｍｇのＫＢｒと混合し、約５０ｍｇを分析に供した。波長は４０００－５００ｃｍ-1のレンジで測定し、グラフ化した（図４）。
３７００－２５００ｃｍ－１と１８００－９００ｃｍ－１に広い吸収帯と８００－５００ｃｍ－１に少し小さめのやや広い吸収帯を持ち、他の既報のｍｅｌａｎｉｎとも似たＦＴ－ＩＲスペクトラムが示された。３２８６ｃｍ－１を中心とする３３６６－３１６７ｃｍ－１の広くて比較的強いピークはＯ－ＨとＮ－Ｈの伸縮振動を示し、３１２５－３０４６ｃｍ－１の広くて弱いピークは芳香族のＣ－Ｈ振動で、１６００ｃｍ－１と１５００ｃｍ－１辺りの芳香環のバンドの存在によって支持される。比較的強く２つの中心を持つ２９９０－２９０３ｃｍ－１および小さな２８７４ｃｍ－１のピークは脂肪族のＣ－Ｈ基の伸縮振動と考えらる。１６９２－１６０７ｃｍ－１の強い吸収は芳香族のＣ＝Ｃ伸縮，ＣＯＯ－の非対称伸縮で、１５６３－１５０３ｃｍ－１の強い吸収はＮ－Ｈの歪みとＣ－Ｎ伸縮（アミドＩＩ帯）と芳香族Ｃ＝Ｃ伸縮と考えられる。１４５６ｃｍ－１と１３９４ｃｍ－１の小さめのピークはそれぞれ脂肪族のＣ－Ｈの歪みとフェノールのＣ－Ｏ－Ｈ湾曲およびインドールとフェノールのＮ－Ｈ伸縮とみられる。１２９７－１２２１ｃｍ－１の小さめの２つのピークはカルボキシル基の伸縮振動と思われる。１２２５－９００ｃｍ－１の吸収の傾斜にあるいくつかの小さなピークは芳香族Ｃ－Ｈ平面内湾曲と思われる。６９９ｃｍ－１に小さいが鋭いピークがみられ、８２２ｃｍ－１や７４２ｃｍ－１とともに芳香族Ｃ－Ｈの平面外歪みと思われる。
【0042】
（４）ＥＳＲ分析
電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分析はＢｒｕｋｅｒ Ｅ－５００を用いて行った。本発明のメラニン様物質、合成メラニン、Ｓｅｐｉａメラニンの粉末をそれぞれ５ｍｇとってガラス測定管に入れ、測定を行った（図５）。
電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分析はＢｒｕｋｅｒ Ｅ－５００を用いて行った。本発明のメラニン様物質、合成メラニン、Ｓｅｐｉａメラニンの粉末をそれぞれ５ｍｇとってガラス測定管に入れ、測定を行った（図５）。
【0043】
本発明のメラニン様物質は合成メラニン及びＳｅｐｉａメラニンと類似のＥＳＲスペクトルを示したが、電子スピンの周囲の環境を反映するｇ値からはＳｅｐｉａメラニンに近いことが示された。一方、信号強度はＳｅｐｉａ＞合成メラニン＞本発明のメラニン様物質の順で、およそ５０：５：１で、本発明のメラニン様物質のラジカル生成は強くないことが示唆された。
【0044】
（５）溶解性分析
溶媒はＨ2Ｏ、酸とアルカリとして０．０５－１．０Ｍの濃度のＨＣｌ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ4ＯＨを使用した。極性の異なる有機溶媒としてヘキサン、トルエン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、ピリジン、エタノール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、メタノール、溶解が報告されている有機溶媒であるエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｌｅａ，１９５２）とＳｏｌｕｅｎｅ－３５０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、Ｗａｋａｍａｔｓｕ ａｎｄ Ｉｔｏ，２００２）を使用した。
緩衝液として、いずれも０．５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２），クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０），ＭＯＰＳ－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０），ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５），Ｔｒｉｓ－酢酸緩衝液（ｐＨ７．９），Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた（Kawamoto et al., Biochem. Pharmacol. 2019,163, 178-193）。
溶媒はＨ2Ｏ、酸とアルカリとして０．０５－１．０Ｍの濃度のＨＣｌ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ4ＯＨを使用した。極性の異なる有機溶媒としてヘキサン、トルエン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、ピリジン、エタノール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、メタノール、溶解が報告されている有機溶媒であるエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｌｅａ，１９５２）とＳｏｌｕｅｎｅ－３５０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、Ｗａｋａｍａｔｓｕ ａｎｄ Ｉｔｏ，２００２）を使用した。
緩衝液として、いずれも０．５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２），クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０），ＭＯＰＳ－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０），ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５），Ｔｒｉｓ－酢酸緩衝液（ｐＨ７．９），Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた（Kawamoto et al., Biochem. Pharmacol. 2019,163, 178-193）。
【0045】
１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに１ｍｇの本発明のメラニン様物質を入れ、１００μｌの各種溶媒を添加し（最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）、Ｖｏｒｔｅｘによる懸濁し、室温で２４ｈ静置後の溶解状況を調べた。検定方法は、Ｋａｗａｍｏｔｏらによる方法を参考に少し修正を加えた。ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ ３ＭＭ ｃｈｒ）に１０ｍｍの格子を作り、本発明のメラニン様物質の懸濁液をｖｏｒｔｅｘで攪拌し１μｌをスポットした。
【0046】
次に、１００００ｇで１５ｍｉｎ遠心した上清を１μＬをスポットした。測定用としては、ろ紙に１μｌを３つずつスポットした。これを乾燥後、光学スキャナー（Ｖ７０００ ＰＨＯＴＯ，Ｅｐｓｏｎ，Ｎａｇａｎｏ，Ｊａｐａｎ）でスキャンし、Ｓｃａｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＥＰＳＯＮ Ｓｃａｎ）を用いてＣｏｌｏｒ（４８ ｂｉｔ）もしくはＧｒａｙ（１６ ｂｉｔ）でスポットの像を取り込んだ。この像をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で解析した。Ｇｒａｙの像の白黒を反転しにして、輝度をピクセルとしてカウントし、溶解した濃度を数値化した。
【0047】
（結果）
＜アルカリに対する溶解性＞（図６～図８）
０．０５－１．０ＭのＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ４ＯＨ溶液では試験したどの濃度でも１ｍｌの溶液で十分に１０ｍｇのメラニン様物質が溶解された。
＜酸に対する溶解性＞（図９）
１ｍｌのＨＣｌに１０ｍｇのメラニン様物質は完全に溶解できず、不溶物が残った。０．０５Ｍで４ｍｇ／ｍｌ、０．１Ｍで５ｍｇ／ｍｌ程度のメラニン様物質が溶解できるが、０．３Ｍでは１ｍｇ／ｍｌ程度となり、０．５Ｍ以上ではほぼ溶解できないことが分かった。
＜有機溶媒及び水に対する溶解性＞（図１０、図１１）
・ＤＭＳＯでわずかな溶解がみられた以外は、極性の高低に関わらず、調べたすべての有機溶媒には溶解しないことが分かった。
・また、水ではわずかに溶解することが分かった。
・また、毛髪メラニンの溶解の報告があるエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｅｔｈｙｌｃｅｌｌｏｓｏｌｖｅ）には溶解しないが、Ｓｏｌｕｅｎｅ－３５０（Wakamatsu K., Ito, S., 2002. Advanced chemical methods in melanin determination. Pigment Cell Res., 15, 174-183.）にはよく溶けたが、溶液は色も濃く変化するだけでなく強い粘性を持ち、各種実験の溶媒として使用できるものとは思われなかった。
＜緩衝液に対する溶解性＞（図１２）
・ｐＨの異なる６種の緩衝液による溶解性では、酸性の酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中性のクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にはメラニン様物質はほとんど溶解しなかったが、中性のＭＯＰＳ－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）はかなり溶け，弱アルカリ性のＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５），Ｔｒｉｓ－酢酸緩衝液（ｐＨ７．９），Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）には０．５Ｍ ＮａＯＨと同程度に溶解することが分かった。このことから、緩衝液の溶質は関係するが中性～弱アルカリ性の緩衝液には溶解するものがあること、特に、ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ緩衝液に溶解することから、本発明のメラニン様物質はｓｑｕｉｄ ｉｎｋ ｍｅｌａｎｉｎと同様に動物の細胞への投与も可能であることが示唆された（Kawamoto et al., Biochem. Pharmacol. 2019,163, 178-193）。
＜アルカリに対する溶解性＞（図６～図８）
０．０５－１．０ＭのＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ４ＯＨ溶液では試験したどの濃度でも１ｍｌの溶液で十分に１０ｍｇのメラニン様物質が溶解された。
＜酸に対する溶解性＞（図９）
１ｍｌのＨＣｌに１０ｍｇのメラニン様物質は完全に溶解できず、不溶物が残った。０．０５Ｍで４ｍｇ／ｍｌ、０．１Ｍで５ｍｇ／ｍｌ程度のメラニン様物質が溶解できるが、０．３Ｍでは１ｍｇ／ｍｌ程度となり、０．５Ｍ以上ではほぼ溶解できないことが分かった。
＜有機溶媒及び水に対する溶解性＞（図１０、図１１）
・ＤＭＳＯでわずかな溶解がみられた以外は、極性の高低に関わらず、調べたすべての有機溶媒には溶解しないことが分かった。
・また、水ではわずかに溶解することが分かった。
・また、毛髪メラニンの溶解の報告があるエチレングリコールモノエチルエーテル（Ｅｔｈｙｌｃｅｌｌｏｓｏｌｖｅ）には溶解しないが、Ｓｏｌｕｅｎｅ－３５０（Wakamatsu K., Ito, S., 2002. Advanced chemical methods in melanin determination. Pigment Cell Res., 15, 174-183.）にはよく溶けたが、溶液は色も濃く変化するだけでなく強い粘性を持ち、各種実験の溶媒として使用できるものとは思われなかった。
＜緩衝液に対する溶解性＞（図１２）
・ｐＨの異なる６種の緩衝液による溶解性では、酸性の酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）中性のクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にはメラニン様物質はほとんど溶解しなかったが、中性のＭＯＰＳ－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）はかなり溶け，弱アルカリ性のＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５），Ｔｒｉｓ－酢酸緩衝液（ｐＨ７．９），Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）には０．５Ｍ ＮａＯＨと同程度に溶解することが分かった。このことから、緩衝液の溶質は関係するが中性～弱アルカリ性の緩衝液には溶解するものがあること、特に、ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ緩衝液に溶解することから、本発明のメラニン様物質はｓｑｕｉｄ ｉｎｋ ｍｅｌａｎｉｎと同様に動物の細胞への投与も可能であることが示唆された（Kawamoto et al., Biochem. Pharmacol. 2019,163, 178-193）。
【0048】
（６）温度耐性
０．０５ｍｇ／ｍｌで０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液に溶解した本発明のメラニン様物質を１３．５ ｍｌの蓋つきガラスバイアル（Mighty vial、No, 4、マルエム）に３ｍｌ入れ、２５℃、５０℃、７５℃、１００℃に置き、１時間おきに２１８ｎｍの吸光度を測定した。
０．０５ｍｇ／ｍｌで０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液に溶解した本発明のメラニン様物質を１３．５ ｍｌの蓋つきガラスバイアル（Mighty vial、No, 4、マルエム）に３ｍｌ入れ、２５℃、５０℃、７５℃、１００℃に置き、１時間おきに２１８ｎｍの吸光度を測定した。
【0049】
結果を図１３に示す。
本発明のメラニン様物質を異なる温度で５時間インキュベートして、吸光度を計測して安定性を調べた。その結果、いずれの温度で５時間では、吸光度の低下はほとんどなく、少なくともこの時間では１００℃の高温でも安定であることが分かった。
本発明のメラニン様物質を異なる温度で５時間インキュベートして、吸光度を計測して安定性を調べた。その結果、いずれの温度で５時間では、吸光度の低下はほとんどなく、少なくともこの時間では１００℃の高温でも安定であることが分かった。
【0050】
（７）光耐性
０．０５ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液に溶解した本発明のメラニン様物質を直径３０ｍｍのガラスシャーレに２ｍｌ入れ、蒸発を防ぐためＵＶ透過フィルム（Ｔｉｔｅｒ Ｓｔｉｃｋ ＨＣ ｆｉｌｍ，ＵＶ－ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｔｙｐｅ，Ｆｕｋａｅ－Ｋａｓｅｉ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）でシールして、太陽光ランプ（ＳＵＮＬＡＭＰ ６０Ｗ，Ｒ－６２，Ｋｙｏｋｋｏ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．Ｔｏｋｙｏ Ｊａｐａｎ）、ＵＶランプ（ＧＬ１５、東芝ライテック、日本）および暗黒下に２５℃で静置した。光源からの距離は３０ｃｍとした。０‐５日に毎日λｍａｘ（２１２ｎｍ）の吸光度を測定した。
加えて、光による退色は、溶解性分析と同様にろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ ３ＭＭ Ｃｈｒ）に０．５Ｍ ＮａＯＨに溶解した１０ｍｇ／ｍｌの本発明のメラニン様物質の懸濁液を１μｌをスポットした。比較として、０．５Ｍ ＮａＯＨに溶解した１ｍｇ／ｍｌの合成メラニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１μｌスポットした。これを太陽光ランプ、ＵＶランプ、暗黒下で２５℃で静置し、０，１，３，５，１０日後に、光学スキャナー（Ｖ７００ ＰＨＯＴＯ， Ｅｐｓｏｎ）でスキャンしてスポットの像を取り込んだ。また、測定用として、ろ紙に１μｌを３つずつスポットし、同じ条件に置いた後、光学スキャナーでスポットの像を取り込み、ＩｍａｇｅＪで解析した。
０．０５ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液に溶解した本発明のメラニン様物質を直径３０ｍｍのガラスシャーレに２ｍｌ入れ、蒸発を防ぐためＵＶ透過フィルム（Ｔｉｔｅｒ Ｓｔｉｃｋ ＨＣ ｆｉｌｍ，ＵＶ－ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｔｙｐｅ，Ｆｕｋａｅ－Ｋａｓｅｉ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）でシールして、太陽光ランプ（ＳＵＮＬＡＭＰ ６０Ｗ，Ｒ－６２，Ｋｙｏｋｋｏ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．Ｔｏｋｙｏ Ｊａｐａｎ）、ＵＶランプ（ＧＬ１５、東芝ライテック、日本）および暗黒下に２５℃で静置した。光源からの距離は３０ｃｍとした。０‐５日に毎日λｍａｘ（２１２ｎｍ）の吸光度を測定した。
加えて、光による退色は、溶解性分析と同様にろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ ３ＭＭ Ｃｈｒ）に０．５Ｍ ＮａＯＨに溶解した１０ｍｇ／ｍｌの本発明のメラニン様物質の懸濁液を１μｌをスポットした。比較として、０．５Ｍ ＮａＯＨに溶解した１ｍｇ／ｍｌの合成メラニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１μｌスポットした。これを太陽光ランプ、ＵＶランプ、暗黒下で２５℃で静置し、０，１，３，５，１０日後に、光学スキャナー（Ｖ７００ ＰＨＯＴＯ， Ｅｐｓｏｎ）でスキャンしてスポットの像を取り込んだ。また、測定用として、ろ紙に１μｌを３つずつスポットし、同じ条件に置いた後、光学スキャナーでスポットの像を取り込み、ＩｍａｇｅＪで解析した。
【0051】
結果を図１４に示す。
暗黒下では双方のメラニンで退色はなく、太陽光ランプでも退色は見られなかった。一方、ＵＶ照射では双方のメラニンで退色がみられた。特に、本発明のメラニン様物質では、１日で約７０％、３日で約４０％と急激に退色し、その後はゆっくりと退色し、１０日後では約２０％程度でかすかな褐色がみられる程度に退色した。合成メラニンの退色はやや遅かったが、１０日後には本発明のメラニン様物質と同様に約２０％程度まで退色した。
また、溶液での本発明のメラニン様物質の分解を２１２ｎｍの吸光度で確認すると、ろ紙の実験と同様に５日間では暗黒下ではメラニン様物質で退色はなく、太陽光ランプでも退色はほとんど見られなかった。しかし、ＵＶ照射では、１日目で吸光度は少し下がり、その後も減少を続け、５日目では２割程度まで減少した。
暗黒下では双方のメラニンで退色はなく、太陽光ランプでも退色は見られなかった。一方、ＵＶ照射では双方のメラニンで退色がみられた。特に、本発明のメラニン様物質では、１日で約７０％、３日で約４０％と急激に退色し、その後はゆっくりと退色し、１０日後では約２０％程度でかすかな褐色がみられる程度に退色した。合成メラニンの退色はやや遅かったが、１０日後には本発明のメラニン様物質と同様に約２０％程度まで退色した。
また、溶液での本発明のメラニン様物質の分解を２１２ｎｍの吸光度で確認すると、ろ紙の実験と同様に５日間では暗黒下ではメラニン様物質で退色はなく、太陽光ランプでも退色はほとんど見られなかった。しかし、ＵＶ照射では、１日目で吸光度は少し下がり、その後も減少を続け、５日目では２割程度まで減少した。
【0052】
（８）各種化学物質の反応性
１）酸化剤と還元剤の反応
酸化剤による反応はＫＭｎＯ４，Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７，ＮａＯＣｌ，Ｈ２Ｏ２を用いて行った。目視でのテストはＫＭｎＯ４，ＮａＯＣｌ，Ｈ２Ｏ２で０．１Ｍ ＮａＯＨ中の本発明のメラニン様物質溶液で調べた。ＫＭｎＯ４では０及び０．１、０．５、１ｍＭとなるよう０．１ｍｇ／ｍｌのメラニン溶液に添加し、Ｖｏｒｔｅｘでよく混合後、室温、暗黒下で静置し、２４ｈ後の色の変化を調べた。ＮａＯＣｌでは、１ｍｇ／ｍＬの本発明のメラニン様物質に０、１．０、２．０、５．０％となるよう添加し、暗黒下、室温で静置し、２、１８、２４、４２時間後の脱色を調べた。Ｈ２Ｏ２では０．５ｍｇ／ｍｌのメラニン溶液に０、０．７５、３．７５、７．５％になるようＨ２Ｏ２を加えて混合し、暗黒下、室温で静置し、０，２、１６、２４時間後の脱色を調べた。
Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７による酸化は吸光度で調べた。０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液中の０．０５ｍｇ／ｍｌの本発明のメラニン様物質溶液にＫ２Ｃｒ２Ｏ７を０、０．１、０．５、１．０ｍＭになるように加え、２１８ｎｍで吸光度を測定し、２４ｈｒ後に再度測定し、変化を観察した。
還元剤の影響はＮａ２ＳＯ３を用いて吸光度測定および目視での観察を行った。０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液中の０．０５ｍｇ／ｍｌの本発明のメラニン様物質溶液にＮａ２ＳＯ３を０、０．１、０．５、１．０ｍＭになるように加え、２１８ｎｍで吸光度を測定し、２４時間後に再度測定し、変化を観察した。また、目視では、０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液中の１ｍｇ／ｍｌの本発明のメラニン様物質溶液にＮａ２ＳＯ３を０、１．０、２．０、５．０％になるように加え、１、２、１８、２４時間後に色の変化を観察した。
１）酸化剤と還元剤の反応
酸化剤による反応はＫＭｎＯ４，Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７，ＮａＯＣｌ，Ｈ２Ｏ２を用いて行った。目視でのテストはＫＭｎＯ４，ＮａＯＣｌ，Ｈ２Ｏ２で０．１Ｍ ＮａＯＨ中の本発明のメラニン様物質溶液で調べた。ＫＭｎＯ４では０及び０．１、０．５、１ｍＭとなるよう０．１ｍｇ／ｍｌのメラニン溶液に添加し、Ｖｏｒｔｅｘでよく混合後、室温、暗黒下で静置し、２４ｈ後の色の変化を調べた。ＮａＯＣｌでは、１ｍｇ／ｍＬの本発明のメラニン様物質に０、１．０、２．０、５．０％となるよう添加し、暗黒下、室温で静置し、２、１８、２４、４２時間後の脱色を調べた。Ｈ２Ｏ２では０．５ｍｇ／ｍｌのメラニン溶液に０、０．７５、３．７５、７．５％になるようＨ２Ｏ２を加えて混合し、暗黒下、室温で静置し、０，２、１６、２４時間後の脱色を調べた。
Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７による酸化は吸光度で調べた。０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液中の０．０５ｍｇ／ｍｌの本発明のメラニン様物質溶液にＫ２Ｃｒ２Ｏ７を０、０．１、０．５、１．０ｍＭになるように加え、２１８ｎｍで吸光度を測定し、２４ｈｒ後に再度測定し、変化を観察した。
還元剤の影響はＮａ２ＳＯ３を用いて吸光度測定および目視での観察を行った。０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液中の０．０５ｍｇ／ｍｌの本発明のメラニン様物質溶液にＮａ２ＳＯ３を０、０．１、０．５、１．０ｍＭになるように加え、２１８ｎｍで吸光度を測定し、２４時間後に再度測定し、変化を観察した。また、目視では、０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液中の１ｍｇ／ｍｌの本発明のメラニン様物質溶液にＮａ２ＳＯ３を０、１．０、２．０、５．０％になるように加え、１、２、１８、２４時間後に色の変化を観察した。
【0053】
結果を図１５～図１９に示す。
ＫＭｎＯ４は、目視での観察では２４時間後に本発明のメラニン様物質を含まないときは薄い赤色で変化はなかったが、メラニン様物質を含むときは還元による青色を呈した。このことから、本発明のメラニン様物質はＫＭｎＯ４によって酸化されることが分かった。ＮａＯＣｌでは添加して２時間後の目視での観察で濃度依存的に酸化によって退色が見られたが、その後はあまり変化しなかった。Ｈ２Ｏ２の添加では目視での観察で本発明のメラニン様物質の色は経時的にかつ濃度に依存的に薄くなったことから、酸化によって分解されることが示された。
吸光度によるＫ２Ｃｒ２Ｏ７の酸化の測定では、２４時間後での吸光度が０．１ｍＭでは１０％、０．５ｍＭでは８０％程度減少し、１．０ｍＭでは完全になくなったため、酸化による分解が示された。
還元反応では、本発明のメラニン様物質の溶液にＮａ２ＳＯ３を０，０．１，０．５．および１ｍＭになるように加え、２４時間後の吸光度を測定したが、変化は見られなかった。さらに、本発明のメラニン様物質は溶液にＮａ２ＳＯ３を０、１．０、２．０、５．０％になるように加え、１、２、１８、２４時間後に目視での観察で色の変化を観察した結果、各時間いずれの濃度でも退色などは見られなかった。よって、本発明のメラニン様物質は還元による変化は起こらないことが示された。
ＫＭｎＯ４は、目視での観察では２４時間後に本発明のメラニン様物質を含まないときは薄い赤色で変化はなかったが、メラニン様物質を含むときは還元による青色を呈した。このことから、本発明のメラニン様物質はＫＭｎＯ４によって酸化されることが分かった。ＮａＯＣｌでは添加して２時間後の目視での観察で濃度依存的に酸化によって退色が見られたが、その後はあまり変化しなかった。Ｈ２Ｏ２の添加では目視での観察で本発明のメラニン様物質の色は経時的にかつ濃度に依存的に薄くなったことから、酸化によって分解されることが示された。
吸光度によるＫ２Ｃｒ２Ｏ７の酸化の測定では、２４時間後での吸光度が０．１ｍＭでは１０％、０．５ｍＭでは８０％程度減少し、１．０ｍＭでは完全になくなったため、酸化による分解が示された。
還元反応では、本発明のメラニン様物質の溶液にＮａ２ＳＯ３を０，０．１，０．５．および１ｍＭになるように加え、２４時間後の吸光度を測定したが、変化は見られなかった。さらに、本発明のメラニン様物質は溶液にＮａ２ＳＯ３を０、１．０、２．０、５．０％になるように加え、１、２、１８、２４時間後に目視での観察で色の変化を観察した結果、各時間いずれの濃度でも退色などは見られなかった。よって、本発明のメラニン様物質は還元による変化は起こらないことが示された。
【0054】
２）金属イオンへの反応
金属イオンへの反応は、ＣｕＳＯ４，ＭｇＳＯ４，ＣａＣｌ２，Ｎａ２ＳＯ４，ＦｅＣｌ３，ＡｌＣｌ３，ＺｎＣｌ２で行った。０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液中の０．０５ｍｇ／ｍｌの本発明のメラニン様物質溶液に各化学物質を０もしくは１ｍＭになるように加え、２１８ｎｍで吸光度を測定、２４時間後に再度測定し、変化を観察した。
金属イオンへの反応は、ＣｕＳＯ４，ＭｇＳＯ４，ＣａＣｌ２，Ｎａ２ＳＯ４，ＦｅＣｌ３，ＡｌＣｌ３，ＺｎＣｌ２で行った。０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液中の０．０５ｍｇ／ｍｌの本発明のメラニン様物質溶液に各化学物質を０もしくは１ｍＭになるように加え、２１８ｎｍで吸光度を測定、２４時間後に再度測定し、変化を観察した。
【0055】
Ｃｕ２＋，Ｃａ２＋，Ｎａ＋，Ａｌ３＋，Ｚｎ２＋，では吸光度に変化は見られなかったが、Ｍｇ２＋，では５％、Ｆｅ２＋では１０％の減少がみられ、分解等の変化が生じている可能性が示唆された（図２０）。
【0056】
試験例２ ＵＶ照射保護作用（紫外線防御作用）
ＬＢ固形培地で培養したＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ－５α株を５ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１６時間振盪培養した。この培養液の１２５μＬを２５ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、１００ｒｐｍの往復振盪培養を行った。ＯＤ600が０．３前後になったら、５分間の氷冷後、４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を捨てて沈殿を０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）にＯＤ600＝０．３となるよう懸濁し、本発明のメラニン様物質によるＵＶ保護試験に供した。
２４ウェルの滅菌培養プレートのウェルに０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファーに懸濁した大腸菌を１ｍＬずつ入れ、本発明のメラニン様物質を０，０．１、０．２、０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、０，１分間、５分間、ＵＶ－Ａ（３５２ｎｍ）、ＵＶ－Ｂ（３０６ｎｍ）、ＵＶ－Ｃ（２５４ｎｍ）のいずれかを照射して回収した。また、同様に０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファーに懸濁した大腸菌を１ｍＬずつ入れ、本発明のメラニン様物質を１．０ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、０，３０秒、１、２、５、１０、２０分間、ＵＶ－Ａ（３５２ｎｍ）、ＵＶ－Ｂ（３０６ｎｍ）、ＵＶ－Ｃ（２５４ｎｍ）のいずれかを照射して回収した。これらのサンプルは、４℃、６０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を捨ててＬＢ液体培地で洗浄後、再遠心し、ＬＢ液体培地に再懸濁した。これらをＯＤ600＝０．０２となるよう希釈して懸濁後、それぞれ９６ウェル滅菌培養プレートの１列（８ウェル）に２００μＬずつ分注し、３７℃で静置培養し、１時間ごとに振盪して懸濁し、マイクロプレートリーダー（ｉＭＡＲＫ（商標），Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）を用い、ＯＤ595で増殖を測定した。
ＬＢ固形培地で培養したＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ－５α株を５ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１６時間振盪培養した。この培養液の１２５μＬを２５ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、１００ｒｐｍの往復振盪培養を行った。ＯＤ600が０．３前後になったら、５分間の氷冷後、４℃、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を捨てて沈殿を０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）にＯＤ600＝０．３となるよう懸濁し、本発明のメラニン様物質によるＵＶ保護試験に供した。
２４ウェルの滅菌培養プレートのウェルに０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファーに懸濁した大腸菌を１ｍＬずつ入れ、本発明のメラニン様物質を０，０．１、０．２、０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、０，１分間、５分間、ＵＶ－Ａ（３５２ｎｍ）、ＵＶ－Ｂ（３０６ｎｍ）、ＵＶ－Ｃ（２５４ｎｍ）のいずれかを照射して回収した。また、同様に０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファーに懸濁した大腸菌を１ｍＬずつ入れ、本発明のメラニン様物質を１．０ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、０，３０秒、１、２、５、１０、２０分間、ＵＶ－Ａ（３５２ｎｍ）、ＵＶ－Ｂ（３０６ｎｍ）、ＵＶ－Ｃ（２５４ｎｍ）のいずれかを照射して回収した。これらのサンプルは、４℃、６０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を捨ててＬＢ液体培地で洗浄後、再遠心し、ＬＢ液体培地に再懸濁した。これらをＯＤ600＝０．０２となるよう希釈して懸濁後、それぞれ９６ウェル滅菌培養プレートの１列（８ウェル）に２００μＬずつ分注し、３７℃で静置培養し、１時間ごとに振盪して懸濁し、マイクロプレートリーダー（ｉＭＡＲＫ（商標），Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）を用い、ＯＤ595で増殖を測定した。
【0057】
結果を図２１～図２４に示す。
大腸菌に本発明のメラニン様物質を投与して２０－３０分間程度静置しても特に増殖に影響はなく、短時間での投与では毒性は示さないことが示された（図２１）。次に、大腸菌に紫外線（ＵＶ－Ｃ、２５４ｎｍ）を３０秒以上照射すると増殖せず、死滅することが分かった（図２２）。また、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度であれば、２０分のＵＶ－Ｃ照射でも大腸菌は生き残ることが分かった（図２３）。そこで、本発明のメラニン様物質を０．１、０．２、０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｍＬを添加してＵＶ－Ｃを１分間および５分間照射すると、濃度依存的に大腸菌が生き残り、増殖することが分かった。ＵＶ－Ｂでも生存が確認された（図２４）。以上のことから、本発明のメラニン様物質はＵＶからの保護作用が見られた。
大腸菌に本発明のメラニン様物質を投与して２０－３０分間程度静置しても特に増殖に影響はなく、短時間での投与では毒性は示さないことが示された（図２１）。次に、大腸菌に紫外線（ＵＶ－Ｃ、２５４ｎｍ）を３０秒以上照射すると増殖せず、死滅することが分かった（図２２）。また、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度であれば、２０分のＵＶ－Ｃ照射でも大腸菌は生き残ることが分かった（図２３）。そこで、本発明のメラニン様物質を０．１、０．２、０．５、１．０、２．０ｍｇ／ｍＬを添加してＵＶ－Ｃを１分間および５分間照射すると、濃度依存的に大腸菌が生き残り、増殖することが分かった。ＵＶ－Ｂでも生存が確認された（図２４）。以上のことから、本発明のメラニン様物質はＵＶからの保護作用が見られた。
【0058】
試験例３ 抗酸化作用
（１）スーパーオキシドラジカル捕捉活性
１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）に溶かした３ｍＬの本発明のメラニン様物質に１０ｍＭ ＨＣｌに溶かした１０ｍＭピロガロール（焦性没食子酸）を２００μＬ加え、２５℃で３０秒おきに５分まで吸光度４２０ｎｍを測定した。
本発明のメラニン様物質によるスーパーオキシドラジカルの捕捉活性（％）は、ピロガロールによるスーパーオキシドラジカルの捕捉が阻害されることで示される。１．５－３．５分の間でピロガロールのみの吸光度の上昇を示すグラフの傾き（ｋｂcontrol）と本発明のメラニン様物質を加えた吸光度の上昇を示すグラフの傾き（ｋｂsample）で、以下の式で求めた。
（数１）
スーパーオキシドラジカル捕捉活性（％）＝（Ｋｂcontrol－Ｋｂsample）／Ｋｂcontrol×１００
（１）スーパーオキシドラジカル捕捉活性
１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）に溶かした３ｍＬの本発明のメラニン様物質に１０ｍＭ ＨＣｌに溶かした１０ｍＭピロガロール（焦性没食子酸）を２００μＬ加え、２５℃で３０秒おきに５分まで吸光度４２０ｎｍを測定した。
本発明のメラニン様物質によるスーパーオキシドラジカルの捕捉活性（％）は、ピロガロールによるスーパーオキシドラジカルの捕捉が阻害されることで示される。１．５－３．５分の間でピロガロールのみの吸光度の上昇を示すグラフの傾き（ｋｂcontrol）と本発明のメラニン様物質を加えた吸光度の上昇を示すグラフの傾き（ｋｂsample）で、以下の式で求めた。
（数１）
スーパーオキシドラジカル捕捉活性（％）＝（Ｋｂcontrol－Ｋｂsample）／Ｋｂcontrol×１００
【0059】
結果を図２５に示す。
本発明のメラニン様物質に添加によってピロガロールによるスーパーオキシドラジカル捕捉が阻害されたことから、本発明のメラニン様物質は濃度依存的にスーパーオキシドラジカルを捕捉できることが分かった。０．５ｍｇ／ｍＬでは１５％、１．０ｍｇ／ｍＬで１８％程度であった。
本発明のメラニン様物質に添加によってピロガロールによるスーパーオキシドラジカル捕捉が阻害されたことから、本発明のメラニン様物質は濃度依存的にスーパーオキシドラジカルを捕捉できることが分かった。０．５ｍｇ／ｍＬでは１５％、１．０ｍｇ／ｍＬで１８％程度であった。
【0060】
（２）ＤＰＰＨラジカル捕捉活性
０．２ｍＭとなるようＤＰＰＨ（２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル）をエタノールに溶解し、吸光度が安定するまで２５℃で２時間静置した。０－３ｍｇ／ｍＬの濃度で０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解した１．２ｍＬの本発明のメラニン様物質と１．５ｍＬのＤＰＰＨ溶液、３００μＬのエタノールを混合し、３０分間室温で遮光して静置後、５１７ｎｍの吸光度を測定し、ＤＰＰＨによるラジカル捕捉活性を調べた。サンプル添加の吸光度をＡｓ、サンプル無添加の吸光度をＡｃとし、ＤＰＰＨラジカル捕捉活性（％）は、以下の式で求めた。
（数２）
ＤＰＰＨラジカル捕捉活性（％）＝｛（Ａｃ－Ａｓ）／Ａｃ｝×１００
０．２ｍＭとなるようＤＰＰＨ（２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル）をエタノールに溶解し、吸光度が安定するまで２５℃で２時間静置した。０－３ｍｇ／ｍＬの濃度で０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解した１．２ｍＬの本発明のメラニン様物質と１．５ｍＬのＤＰＰＨ溶液、３００μＬのエタノールを混合し、３０分間室温で遮光して静置後、５１７ｎｍの吸光度を測定し、ＤＰＰＨによるラジカル捕捉活性を調べた。サンプル添加の吸光度をＡｓ、サンプル無添加の吸光度をＡｃとし、ＤＰＰＨラジカル捕捉活性（％）は、以下の式で求めた。
（数２）
ＤＰＰＨラジカル捕捉活性（％）＝｛（Ａｃ－Ａｓ）／Ａｃ｝×１００
【0061】
ラジカル捕捉の阻害物質として４０、６０、８０μｇ／ｍＬのＴｒｏｌｏｘ（６－ｈｙｄｒｏｘｙ－２，５，７，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ－２－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）を用い、本発明のメラニン様物質のＤＰＰＨラジカル捕捉活性をＴＥＡＣ（Ｔｒｏｌｏｘ等価抗酸化能）で算出した。それぞれのＤＰＰＨラジカル捕捉活性で５０％を示す濃度をＩＣ50とし、以下の式でＴＥＡＣを求めた。
（数３）
ＴＥＡＣ＝ＴｒｏｌｏｘのＩＣ50値（μｇ ｍＬ-1）／メラニン様物質のＩＣ50値（μ
ｇ ｍＬ-1）
（数３）
ＴＥＡＣ＝ＴｒｏｌｏｘのＩＣ50値（μｇ ｍＬ-1）／メラニン様物質のＩＣ50値（μ
ｇ ｍＬ-1）
【0062】
結果を図２６に示す。
本発明のメラニン様物質は濃度依存的にＤＰＰＨのラジカルを捕捉した。Ｔｒｏｌｏｘを指標としたＴＥＡＣは０．０３であった。
本発明のメラニン様物質は濃度依存的にＤＰＰＨのラジカルを捕捉した。Ｔｒｏｌｏｘを指標としたＴＥＡＣは０．０３であった。
【0063】
（３）ヒドロキシラジカル捕捉活性
１００μＬの１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）、２００μＬの１５ｍＭデオキシリボース溶液、２００μＬの０．５ｍＭ ＦｅＣｌ３溶液、１００μＬの１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μＬの１ｍＭのアスコルビン酸、１００μＬの蒸留水を混合した反応液に、０～１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した本発明のメラニン様物質を１００μＬ加え、１００μＬの１０ｍＭ 過酸化水素水を加えて１ｍＬとして混合し反応を開始させた。３７℃で４時間静置後、反応液に１ｍＬの１％チオバルビツール酸（ＴＢＡ）を加えて混合し、さらに１ｍＬの２．８％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えて混合した。この液を８０℃で２０分間静置後、２５００×ｇ、２２℃で１０分間遠心し、分光光度計を用い、５３２ｎｍで上清の吸光度を測定した。ヒドロキシラジカル捕捉活性がある標準物質としてはＴｒｏｌｏｘを用いた。
ヒドロキシラジカル捕捉活性は以下の式で算出した。
（数４）
ヒドロキシラジカル捕捉活性（％）＝（ＡＢｌａｎｋ-ＡＳａｍｐｌｅ）／ＡＢｌａｎｋ×１００
ＡＢｌａｎｋ：コントロール（サンプルなしのブランク）の吸光度
ＡＳａｍｐｌｅ：サンプルの吸光度
１００μＬの１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）、２００μＬの１５ｍＭデオキシリボース溶液、２００μＬの０．５ｍＭ ＦｅＣｌ３溶液、１００μＬの１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μＬの１ｍＭのアスコルビン酸、１００μＬの蒸留水を混合した反応液に、０～１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した本発明のメラニン様物質を１００μＬ加え、１００μＬの１０ｍＭ 過酸化水素水を加えて１ｍＬとして混合し反応を開始させた。３７℃で４時間静置後、反応液に１ｍＬの１％チオバルビツール酸（ＴＢＡ）を加えて混合し、さらに１ｍＬの２．８％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えて混合した。この液を８０℃で２０分間静置後、２５００×ｇ、２２℃で１０分間遠心し、分光光度計を用い、５３２ｎｍで上清の吸光度を測定した。ヒドロキシラジカル捕捉活性がある標準物質としてはＴｒｏｌｏｘを用いた。
ヒドロキシラジカル捕捉活性は以下の式で算出した。
（数４）
ヒドロキシラジカル捕捉活性（％）＝（ＡＢｌａｎｋ-ＡＳａｍｐｌｅ）／ＡＢｌａｎｋ×１００
ＡＢｌａｎｋ：コントロール（サンプルなしのブランク）の吸光度
ＡＳａｍｐｌｅ：サンプルの吸光度
【0064】
また、本発明のメラニン様物質のヒドロキシラジカル捕捉活性をＴＥＡＣ（Ｔｒｏｌｏｘ等価抗酸化能）で算出した。それぞれのヒドロキシラジカル捕捉活性で５０％を示す濃度をＩＣ５０とし、以下の式でＴＥＡＣ値を求めた。
（数５）
ＴＥＡＣ＝ＴｒｏｌｏｘのＩＣ５０値（μｇ ｍＬ－１）／メラニン様物質のＩＣ５０値（μｇ ｍＬ－１）
（数５）
ＴＥＡＣ＝ＴｒｏｌｏｘのＩＣ５０値（μｇ ｍＬ－１）／メラニン様物質のＩＣ５０値（μｇ ｍＬ－１）
【0065】
結果を図２７に示す。
本発明のメラニン様物質でヒドロキシラジカル捕捉活性が見られた。Ｔｒｏｌｏｘとの比較によるＴＥＡＣ値は０．００５６であった。
本発明のメラニン様物質でヒドロキシラジカル捕捉活性が見られた。Ｔｒｏｌｏｘとの比較によるＴＥＡＣ値は０．００５６であった。
【0066】
（４）還元力
２００μＬの０．２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に０～０．２ｍｇ／ｍＬで溶解した本発明のメラニン様物質、５００μＬの０．２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）、５００μＬの１％フェリシアン化カリウムを混合し、５０℃で２０分間静置した。さらに、５００μＬの１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えて混合し、２５００×ｇ、２２℃で１０分間遠心した。５００μＬの上清をとり、５００μＬの蒸留水と１００μＬの０．１％ ＦｅＣｌ３を加えて混合し、１０分間室温で静置後、分光光度計を用い、７００ｎｍの吸光度を測定した。還元力のある標準物質としてはアスコルビン酸を用いた。
２００μＬの０．２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に０～０．２ｍｇ／ｍＬで溶解した本発明のメラニン様物質、５００μＬの０．２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）、５００μＬの１％フェリシアン化カリウムを混合し、５０℃で２０分間静置した。さらに、５００μＬの１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えて混合し、２５００×ｇ、２２℃で１０分間遠心した。５００μＬの上清をとり、５００μＬの蒸留水と１００μＬの０．１％ ＦｅＣｌ３を加えて混合し、１０分間室温で静置後、分光光度計を用い、７００ｎｍの吸光度を測定した。還元力のある標準物質としてはアスコルビン酸を用いた。
【0067】
結果を図２８に示す。
本発明のメラニン様物質はフェリシアン化カリウム（Ｆｅ３＋）をフェロシアン化カリウム（Ｆｅ２＋）に還元する能力があった。その能力はアスコルビン酸と比較し、概ね１／２５～１／４０であった。
本発明のメラニン様物質はフェリシアン化カリウム（Ｆｅ３＋）をフェロシアン化カリウム（Ｆｅ２＋）に還元する能力があった。その能力はアスコルビン酸と比較し、概ね１／２５～１／４０であった。
【0068】
（５）鉄キレート活性
２５０μＬの０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に０～２．０ｍｇ／ｍＬで溶解した本発明のメラニン様物質、２５０μＬの０．１ｍＭ ＦｅＳＯ４溶液、５００μＬの０．２５ｍＭのフェロジン（３－（２－ピリジル）－５，６－ジフェニル－１，２，４－トリアジン－４′，４″－ジスルホン酸ナトリウム塩水和物）を混合し、１０分間室温で静置後、分光光度計を用い、５６２ｎｍの吸光度を測定した。２５０μＬの各種濃度の本発明のメラニン様物質の溶液に２５０μＬの０．１ｍＭ ＦｅＳＯ４溶液、５００μＬの蒸留水を加えて混合したものをブランクとして用いた。標準物質としてはＥＤＴＡを用いた。鉄キレート活性は以下の式で算出した。
（数６）
鉄キレート活性（％）＝（ＡＭａｘ－ＡＳａｍｐｌｅ）／ＡＭａｘ×１００
ＡＭａｘ：最大シグナルコントロール（ＥＤＴＡなし）の吸光度
ＡＳａｍｐｌｅ：サンプルの吸光度
２５０μＬの０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に０～２．０ｍｇ／ｍＬで溶解した本発明のメラニン様物質、２５０μＬの０．１ｍＭ ＦｅＳＯ４溶液、５００μＬの０．２５ｍＭのフェロジン（３－（２－ピリジル）－５，６－ジフェニル－１，２，４－トリアジン－４′，４″－ジスルホン酸ナトリウム塩水和物）を混合し、１０分間室温で静置後、分光光度計を用い、５６２ｎｍの吸光度を測定した。２５０μＬの各種濃度の本発明のメラニン様物質の溶液に２５０μＬの０．１ｍＭ ＦｅＳＯ４溶液、５００μＬの蒸留水を加えて混合したものをブランクとして用いた。標準物質としてはＥＤＴＡを用いた。鉄キレート活性は以下の式で算出した。
（数６）
鉄キレート活性（％）＝（ＡＭａｘ－ＡＳａｍｐｌｅ）／ＡＭａｘ×１００
ＡＭａｘ：最大シグナルコントロール（ＥＤＴＡなし）の吸光度
ＡＳａｍｐｌｅ：サンプルの吸光度
【0069】
結果を図２９に示す。
本発明のメラニン様物質は鉄（Ｆｅ２＋）をキレートし、フェロジンとの結合を阻害する活性があることが分かった。ＥＤＴＡと比較すると、キレート活性は概ね１／１００程度であった。
本発明のメラニン様物質は鉄（Ｆｅ２＋）をキレートし、フェロジンとの結合を阻害する活性があることが分かった。ＥＤＴＡと比較すると、キレート活性は概ね１／１００程度であった。
【0070】
実施例２ ４種のタバコ属植物を用いたメラニン様物質の生産
（１）タバコ属植物のカルス誘導
ムラシゲ・スクーグ培地に０．２％となるようゲルライトを加えてオートクレーブした後、直径９ｃｍの滅菌プラスチックシャーレに２０ｍＬずつ分注して、固化した。ブライトイエロー２号と同種のタバコ属植物としてＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１を、異種のタバコ属植物としてＮ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｇｌａｕｃａ及びＮ．ｏｔｏｐｈｏｒａの３種（日本たばこ産業株式会社葉たばこ研究所より分譲）を用いた。これらの種子を次亜塩素酸ナトリウム溶液処理で表面殺菌し、滅菌水で十分に洗浄した。この培地に上記の表面殺菌した種子を播種し、２５℃、暗黒下で２週間培養して発芽させた。次に、ムラシゲ・スクーグ培地に最終濃度２ｍｇ／Ｌになるように２．４－Ｄを、最終濃度０．２５ｍｇ／Ｌになるようにカイネチンを加え、０．２％となるようゲルライトを加えてオートクレーブした後、直径９ｃｍの滅菌プラスチックシャーレに２０ｍＬずつ分注して、固化した培地（ＭＳＫＤ固形培地）に、発芽した幼植物を置床し、２５℃、暗黒下で培養し、カルスを誘導した。これらのカルスを新しいＭＳＫＤ固形培地に植え継ぎ、カルスを増殖させた。さらに、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ及びＮ．ｇｌａｕｃａでは、１００ｍＬのフラスコに入れた２０ｍＬのＭＳＫＤ液体培地にそれぞれのカルスの一部を接種し、２５℃の暗黒下、回転培養機（Gyrotory Shaker Model G-10、New Brunswick Scientific Co. Inc.）で１３０ｒｐｍ、２～２．５ヵ月間、回転振盪培養した。
（１）タバコ属植物のカルス誘導
ムラシゲ・スクーグ培地に０．２％となるようゲルライトを加えてオートクレーブした後、直径９ｃｍの滅菌プラスチックシャーレに２０ｍＬずつ分注して、固化した。ブライトイエロー２号と同種のタバコ属植物としてＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１を、異種のタバコ属植物としてＮ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｇｌａｕｃａ及びＮ．ｏｔｏｐｈｏｒａの３種（日本たばこ産業株式会社葉たばこ研究所より分譲）を用いた。これらの種子を次亜塩素酸ナトリウム溶液処理で表面殺菌し、滅菌水で十分に洗浄した。この培地に上記の表面殺菌した種子を播種し、２５℃、暗黒下で２週間培養して発芽させた。次に、ムラシゲ・スクーグ培地に最終濃度２ｍｇ／Ｌになるように２．４－Ｄを、最終濃度０．２５ｍｇ／Ｌになるようにカイネチンを加え、０．２％となるようゲルライトを加えてオートクレーブした後、直径９ｃｍの滅菌プラスチックシャーレに２０ｍＬずつ分注して、固化した培地（ＭＳＫＤ固形培地）に、発芽した幼植物を置床し、２５℃、暗黒下で培養し、カルスを誘導した。これらのカルスを新しいＭＳＫＤ固形培地に植え継ぎ、カルスを増殖させた。さらに、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ及びＮ．ｇｌａｕｃａでは、１００ｍＬのフラスコに入れた２０ｍＬのＭＳＫＤ液体培地にそれぞれのカルスの一部を接種し、２５℃の暗黒下、回転培養機（Gyrotory Shaker Model G-10、New Brunswick Scientific Co. Inc.）で１３０ｒｐｍ、２～２．５ヵ月間、回転振盪培養した。
【0071】
（２）カルスのメラニン様物質の生産
いずれのタバコの種でも固形培地上で２か月程度培養したカルスは黒色化した。恒温乾燥機にいれて７５℃で３日間乾燥したＮ．ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１、異種のタバコ属植物のＮ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｇｌａｕｃａ及びＮ． ｏｔｏｐｈｏｒａの３種のカルスの黒色化の状態を図３０に示す。
液体培養では、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１では２．５ヵ月、異種のタバコ属植物のＮ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ及びＮ．ｇｌａｕｃａの２種では２ヵ月で増殖した細胞は黒色化した。恒温乾燥機にいれて７５℃で３日間乾燥したこれらの細胞を図３１に示す。
いずれのタバコの種でも固形培地上で２か月程度培養したカルスは黒色化した。恒温乾燥機にいれて７５℃で３日間乾燥したＮ．ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１、異種のタバコ属植物のＮ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｇｌａｕｃａ及びＮ． ｏｔｏｐｈｏｒａの３種のカルスの黒色化の状態を図３０に示す。
液体培養では、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１では２．５ヵ月、異種のタバコ属植物のＮ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ及びＮ．ｇｌａｕｃａの２種では２ヵ月で増殖した細胞は黒色化した。恒温乾燥機にいれて７５℃で３日間乾燥したこれらの細胞を図３１に示す。
【0072】
（３）カルスのメラニン様物質の抽出
乾燥したＮ．ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１、異種のタバコ属植物のＮ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｇｌａｕｃａ及びＮ．ｏｔｏｐｈｏｒａの３種のカルスを２ｍＬのフタ付遠心管（Ｗａｔｓｏｎ）に入れ、直径５ｍｍのステンレスビーズをそれぞれ３個ずつ入れ、ビーズ粉砕機（タイテックμＴ―１２）で２８００ｒｐｍで１分間破砕して粉状化した。これらを小型薬さじ（マイクロスプーン）で少量ずつ掻きとり、１０ｍＬの試験管に入れ、０．５ｍＬの１００％メタノールもしくは０．５ｍＬの０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を添加してＶｏｒｔｅｘミキサーで十分に撹拌した。２５℃で一晩静置すると、粉状化した細胞は試験管の底に沈み、上清と区別できた。１００％メタノール添加では、Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ以外のいずれのサンプルでも上清は透明で、粉状化細胞の沈殿はＮ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａを含めて黒色のままあった。一方、１Ｍ ＮａＯＨ溶液添加ではいずれのサンプルでも上清は抽出されたメラニン様物質で着色され、粉状化細胞の沈殿は脱色されていた。結果を図３２に示す。
乾燥したＮ．ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１、異種のタバコ属植物のＮ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｇｌａｕｃａ及びＮ．ｏｔｏｐｈｏｒａの３種のカルスを２ｍＬのフタ付遠心管（Ｗａｔｓｏｎ）に入れ、直径５ｍｍのステンレスビーズをそれぞれ３個ずつ入れ、ビーズ粉砕機（タイテックμＴ―１２）で２８００ｒｐｍで１分間破砕して粉状化した。これらを小型薬さじ（マイクロスプーン）で少量ずつ掻きとり、１０ｍＬの試験管に入れ、０．５ｍＬの１００％メタノールもしくは０．５ｍＬの０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を添加してＶｏｒｔｅｘミキサーで十分に撹拌した。２５℃で一晩静置すると、粉状化した細胞は試験管の底に沈み、上清と区別できた。１００％メタノール添加では、Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ以外のいずれのサンプルでも上清は透明で、粉状化細胞の沈殿はＮ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａを含めて黒色のままあった。一方、１Ｍ ＮａＯＨ溶液添加ではいずれのサンプルでも上清は抽出されたメラニン様物質で着色され、粉状化細胞の沈殿は脱色されていた。結果を図３２に示す。
【0073】
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ－１、異種のタバコ属植物のＮ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ及びＮ．ｇｌａｕｃａの２種の液体培養細胞の乾燥物でも同様の実験を行った。その結果、１００％メタノール添加では、いずれのサンプルでも上清は透明で、粉状化細胞の沈殿は黒色のままであったが、１Ｍ ＮａＯＨ溶液添加ではいずれのサンプルでも上清は抽出されたメラニン様物質で着色され、粉状化細胞の沈殿は脱色されていた。結果を図３３に示す。なお、いずれのタバコの種においても、上清の着色は乾燥カルスより乾燥液体培養細胞の方が濃く、メラニンの乾燥重量当たりのメラニンの蓄積量が高いことが分かる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
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【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
