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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024029026
(43)【公開日】2024-03-05
(54)【発明の名称】抗－ＬＩＬＲＢ１抗体およびその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240227BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240227BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240227BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240227BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240227BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240227BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240227BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240227BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240227BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240227BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240227BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240227BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
C07K16/46
C07K16/28
C12N15/63 Z
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61P35/00
【審査請求】有
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023213950
(22)【出願日】2023-12-19
(62)【分割の表示】P 2022538832の分割
【原出願日】2020-12-22
(31)【優先権主張番号】10-2019-0173414
(32)【優先日】2019-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0061907
(32)【優先日】2020-05-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】500239823
【氏名又は名称】エルジー・ケム・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100122161
【弁理士】
【氏名又は名称】渡部 崇
(72)【発明者】
【氏名】ユン・ア・チェ
(72)【発明者】
【氏名】ジュン・ア・キム
(72)【発明者】
【氏名】セム・ジュン
(72)【発明者】
【氏名】ジ・ヒョン・イ
(72)【発明者】
【氏名】キュボン・ナ
(72)【発明者】
【氏名】ヨンチュル・キム
(72)【発明者】
【氏名】ハン・ビョル・キム
(57)【要約】
【課題】ＬＩＬＲＢ１に対する特異性が増進した抗－ＬＩＬＲＢ１抗体およびその用途に関し、具体的には、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片、およびその癌治療用途が提供される。
【解決手段】ＬＩＬＲＢ１に結合し、ＬＩＬＲＢ１を発現する免疫細胞に作用して免疫細胞の活性を調節して抗癌効能を示す抗体およびその癌治療用途が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】ＬＩＬＲＢ１に結合し、ＬＩＬＲＢ１を発現する免疫細胞に作用して免疫細胞の活性を調節して抗癌効能を示す抗体およびその癌治療用途が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲｓ）を含む、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片：
配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、
配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、
配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
（前記ＣＤＲはＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを基準にして定義される。）
配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、
配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、
配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３
（前記ＣＤＲはＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを基準にして定義される。）
【請求項2】
配列番号２３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および
配列番号２３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片。
配列番号２３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
前記抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である、請求項１に記載の抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
前記抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖが免疫グロブリンのＦｃと融合した融合ポリペプチド、またはｓｃＦｖが軽鎖の不変領域と融合した融合ポリペプチドである、請求項１に記載の抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片および薬学的に許容可能な担体を含む、癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項6】
前記癌は、ＭＨＣクラスＩが過剰発現された特性を有する、請求項５に記載の薬学組成物。
【請求項7】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸分子。
【請求項8】
請求項７に記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
【請求項9】
請求項７に記載の核酸分子またはこれを含む組換えベクターを含む、組換え細胞。
【請求項10】
請求項９に記載の組換え細胞を培養する段階を含む、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
[関連出願の相互参照]
本出願は、２０１９年１２月２３日付の韓国特許出願第１０－２０１９－０１７３４１４号および２０２０年５月２２日付の韓国特許出願第１０－２０２０－００６１９０７号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
本出願は、２０１９年１２月２３日付の韓国特許出願第１０－２０１９－０１７３４１４号および２０２０年５月２２日付の韓国特許出願第１０－２０２０－００６１９０７号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
【0002】
本発明は、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体およびその用途に関し、具体的には、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片、およびその癌治療用途に関する。
【背景技術】
【0003】
Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ １（ＬＩＬＲＢ１、またはＩＬＴ２、ＣＤ８５ｊ、ＬＩＲ－１）はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージおよびその他の免疫細胞などに発現する活性抑制受容体（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である。ＬＩＬＲＢ１は、ｃｌａｓｓｉｃａｌおよびｎｏｎ－ｃｌａｓｓｉｃａｌ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ－Ｉと結合して、免疫細胞の活性を抑制させるシグナル伝達機構に関与する。
【0004】
一方、多様な癌細胞は免疫回避のために、ＨＬＡ－ＧなどのＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ）を過剰発現することが知られている。ＬＩＬＲＢ１とＭＨＣクラスＩの結合を阻害する場合、抑制された免疫細胞の活性を回復させて抗癌効果を示すことが予想される。
【0005】
したがって、ＬＩＬＲＢ１に結合し、かつＬＩＬＲＢ１のＭＨＣクラスＩへの結合を阻害および／またはＬＩＬＲＢ１とＭＨＣクラスＩとの相互作用を阻害する新たな薬剤の開発が要求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ＬＩＬＲＢ１に結合し、ＬＩＬＲＢ１を発現する免疫細胞に作用して免疫細胞の活性を調節して抗癌効能を示す抗体およびその癌治療用途が提供される。
【0007】
一実施形態は、ＬＩＬＲＢ１に結合する抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を提供する。前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、ＬＩＬＲＢ１のＭＨＣクラスＩとの結合を阻害する活性および／またはＬＩＬＲＢ１とＭＨＣクラスＩとの相互作用を阻害する活性を有し得る。前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、癌細胞の免疫回避を阻害する活性を有し得る。また、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は優れた抗癌活性を有し得る。前記癌は、表面にＭＨＣクラスＩを発現または過剰発現するものであり得る。
【0008】
他の実施形態は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を含む、癌の治療および／または予防用薬学組成物を提供する。
【0009】
他の実施形態は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を含むＬＩＬＲＢ１のＭＨＣクラスＩとの結合阻害用薬学組成物および／またはＬＩＬＲＢ１とＭＨＣクラスＩとの相互作用阻害用薬学組成物を提供する。
【0010】
他の実施形態は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を含む癌細胞の免疫回避阻害用薬学組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明の一実施形態は、ＬＩＬＲＢ１に結合する抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を提供する。前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、ＬＩＬＲＢ１のＭＨＣクラスＩとの結合を阻害および／またはＬＩＬＲＢ１とＭＨＣクラスＩとの相互作用を阻害する活性を有するものであり得る。また、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、癌細胞の免疫回避を阻害する活性を有するものであり得る。また、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は優れた抗癌活性を有するものであり得る。
【0012】
前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むものであり得る：
（１）Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇによるＣＤＲ定義（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．ａｎｄ Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／）を基準にして、
配列番号１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１０９または１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号２、８、１４、２０、２６、３２、３８、４４、５０、５６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０または１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、
配列番号３、９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１または１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、
配列番号４、１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２または１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号５、１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３または１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
配列番号６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４または１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むか、
（２）ＩＭＧＴ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇによるＣＤＲ定義（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を基準にして、
配列番号１２１、１２６、１３１、１３６、１４１、１４６、１５１、１５６、１６１、１６６、１７１、１７６、１８１、１８６、１９１、１９６、２０１、２０６、２１１または２１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号１２２、１２７、１３２、１３７、１４２、１４７、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８２、１８７、１９２、１９７、２０２、２０７、２１２または２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、
配列番号３、９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１または１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、
配列番号１２３、１２８、１３３、１３８、１４３、１４８、１５３、１５８、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１３または２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号１２４、１２９、１３４、１３９、１４４、１４９、１５４、１５９、１６４、１６９、１７４、１７９、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
配列番号１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５または２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むものであり得る。
（１）Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇによるＣＤＲ定義（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．ａｎｄ Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／）を基準にして、
配列番号１、７、１３、１９、２５、３１、３７、４３、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１０９または１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号２、８、１４、２０、２６、３２、３８、４４、５０、５６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０または１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、
配列番号３、９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１または１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、
配列番号４、１０、１６、２２、２８、３４、４０、４６、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２または１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号５、１１、１７、２３、２９、３５、４１、４７、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３または１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
配列番号６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４または１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むか、
（２）ＩＭＧＴ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇによるＣＤＲ定義（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を基準にして、
配列番号１２１、１２６、１３１、１３６、１４１、１４６、１５１、１５６、１６１、１６６、１７１、１７６、１８１、１８６、１９１、１９６、２０１、２０６、２１１または２１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号１２２、１２７、１３２、１３７、１４２、１４７、１５２、１５７、１６２、１６７、１７２、１７７、１８２、１８７、１９２、１９７、２０２、２０７、２１２または２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、
配列番号３、９、１５、２１、２７、３３、３９、４５、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１または１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、
配列番号１２３、１２８、１３３、１３８、１４３、１４８、１５３、１５８、１６３、１６８、１７３、１７８、１８３、１８８、１９３、１９８、２０３、２０８、２１３または２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号１２４、１２９、１３４、１３９、１４４、１４９、１５４、１５９、１６４、１６９、１７４、１７９、１８４、１８９、１９４、１９９、２０４、２０９、２１４または２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および
配列番号１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５または２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むものであり得る。
【0013】
一実施形態において、本明細書で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片に含むことが可能な６個のＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３）の組み合わせを下記の表１に示す：
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【0014】
一例において、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、前記のような、
ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに
ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域を含むものであり得る。
ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、並びに
ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域を含むものであり得る。
【0015】
実施形態において、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９または３４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および
配列番号２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８または２６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むものであり得る。
配列番号２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９または３４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および
配列番号２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８または２６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むものであり得る。
【0016】
本明細書で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片に含むことが可能な軽鎖可変領域および重鎖可変領域の組み合わせを下記の表２に示す：
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0017】
本明細書において、抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＣＤＲ、可変領域、または重鎖／軽鎖）が「特定のアミノ酸配列を含むまたは特定のアミノ酸配列からなるか、または表現される」とは、前記アミノ酸配列を必ず含む場合、および前記アミノ酸配列に抗体活性に影響を与えない無意味な変異（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、および／または付加）が導入された場合を全て意味するものであり得る。
【0018】
本明細書で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、ＬＩＬＲＢ１（例えば、ヒトＬＩＬＲＢ１）に対する結合親和性（ＫＤ）は、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）で測定したものを基準にして、１０ｍＭ以下、５ｍＭ以下、１ｍＭ以下、０．５ｍＭ以下、０．２ｍＭ、または０．１５ｍＭ以下であり得、例えば、０．００１ｎＭ～１０ｍＭ、０．００５ｎＭ～１０ｍＭ、０．０１ｎＭ～１０ｍＭ、０．０５ｎＭ～１０ｍＭ、０．１ｎＭ～１０ｍＭ、０．５ｎＭ～１０ｍＭ、１ｎＭ～１０ｍＭ、０．００１ｎＭ～５ｍＭ、０．００５ｎＭ～５ｍＭ、０．０１ｎＭ～５ｍＭ、０．０５ｎＭ～５ｍＭ、０．１ｎＭ～５ｍＭ、０．５ｎＭ～５ｍＭ、１ｎＭ～５ｍＭ、０．００１ｎＭ～１ｍＭ、０．００５ｎＭ～１ｍＭ、０．０１ｎＭ～１ｍＭ、０．０５ｎＭ～１ｍＭ、０．１ｎＭ～１ｍＭ、０．５ｎＭ～１ｍＭ、１ｎＭ～１ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．５ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．５ｍＭ、０．１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．５ｎＭ～０．５ｍＭ、１ｎＭ～０．５ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．２ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．２ｍＭ、０．１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．５ｎＭ～０．２ｍＭ、１ｎＭ～０．２ｍＭ、０．００１ｎＭ～０．１５ｍＭ、０．００５ｎＭ～０．１５ｍＭ、０．０１ｎＭ～０．１５ｍＭ、０．０５ｎＭ～０．１５ｍＭ、０．１ｎＭ～０．１５ｍＭ、０．５ｎＭ～０．１５ｍＭ、または１ｎＭ～０．１５であり得る。
【0019】
他の例は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を有効性分として含む薬学組成物を提供する。例えば、前記薬学組成物は、癌の治療および／または予防のための薬学組成物であり得る。前記薬学組成物は、ＬＩＬＲＢ１のＭＨＣクラスＩとの結合および／またはＬＩＬＲＢ１とＭＨＣクラスＩとの相互作用を阻害する活性を有するものであり得る。前記癌は、ＬＩＬＲＢ１とＭＨＣクラスＩとの相互作用に関連する癌であり得る。一例において、前記薬学組成物は、癌細胞の免疫回避を阻害する活性を有するものであり得る。前記癌細胞は、表面にＭＨＣクラスＩを発現または過剰発現したものであり得る。
【0020】
他の例は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を有効性分として含むＬＩＬＲＢ１のＭＨＣクラスＩとの結合阻害用組成物および／またはＬＩＬＲＢ１とＭＨＣクラスＩとの相互作用阻害用組成物を提供する。
【0021】
他の例は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片を有効性分として含む癌細胞の免疫回避阻害用組成物を提供する。
【0022】
他の例は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌の治療および／または予防を必要とする対象（例えば、ヒトを含む哺乳類）に投与（経口または非経口投与）する段階を含む、癌を治療および／または予防する方法を提供する。
【0023】
他の例は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量をＬＩＬＲＢ１のＭＨＣクラスＩとの結合および／またはＬＩＬＲＢ１とＭＨＣクラスＩとの相互作用阻害を必要とする対象（例えば、ヒトを含む哺乳類）に投与（経口または非経口投与）する段階を含む、ＬＩＬＲＢ１のＭＨＣクラスＩとの結合を阻害する方法および／またはＬＩＬＲＢ１とＭＨＣクラスＩとの相互作用を阻害する方法を提供する。
【0024】
他の例は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の薬学的有効量を癌細胞の免疫回避阻害を必要とする対象（例えば、ヒトを含む哺乳類）に投与（経口または非経口投与）する段階を含む、癌細胞の免疫回避を阻害する方法を提供する。
【0025】
本明細書で提供される方法は、前記投与する段階前に、癌の治療および／または予防を必要とする対象、ＬＩＬＲＢ１のＭＨＣクラスＩとの結合阻害および／またはＬＩＬＲＢ１とＭＨＣクラスＩとの相互作用阻害を必要とする対象、および／または癌細胞の免疫回避阻害を必要とする対象を確認する段階をさらに含み得る。
【0026】
他の例は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体のＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、またはＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３の組み合わせ、またはＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３の組み合わせ）；ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域；ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域；前記軽鎖可変領域を含む軽鎖；および前記重鎖可変領域を含む重鎖からなる群より選択される１つ以上のポリペプチドをコードする核酸分子（ポリヌクレオチド）を提供する。
【0027】
他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。一例において、前記組換えベクターは、前記軽鎖可変領域または軽鎖コード核酸分子および前記重鎖可変領域または重鎖コード核酸分子を（例えば、２つのベクターに）をそれぞれ含むか、（例えば、１つのベクターに）共に含むものであり得る。前記組換えベクターは、発現ベクターとして用いることができる。
【0028】
他の例は、前記核酸分子または組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【0029】
他の例は、前記核酸分子を細胞で発現させる段階を含む抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。前記核酸分子を発現させる段階は、前記組換え細胞を培養する段階を含み得る。
【0030】
本明細書に記載された抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の抗原結合断片は、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体に由来し、抗原（ＬＩＬＲＢ１）に対する結合力を保有する断片を意味し、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の６個のＣＤＲを含む任意のポリペプチド、例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－Ｃｋ（カッパ不変領域）、ｓｃＦｖ－Ｃλ（ラムダ不変領域）、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であり得るが、これらに限定されるものではない。一例において、前記抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖが免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）のＦｃ部位と融合した融合ポリペプチド（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）または軽鎖不変領域（例えば、カッパまたはラムダ）と融合した融合ポリペプチド（ｓｃＦｖ－ＣｋまたはｓｃＦｖ－Ｃλ）であり得る。
【0031】
前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、ＬＩＬＲＢ１タンパク質に対して調節作用、例えば、拮抗作用（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）またはアゴニズム（ａｇｏｎｉｓｍ）するものであり得る。前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、ＬＩＬＲＢ１のＭＨＣクラスＩとの結合および／またはＬＩＬＲＢ１とＭＨＣクラスＩとの相互作用を阻害する活性を有するものであり得る。また、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、癌細胞の免疫回避を阻害する活性を有するものであり得る。また、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、優れた抗癌活性を有するものであり得る。
【0032】
本明細書で提供される抗体または抗原結合断片の抗原として作用するＬＩＬＲＢ１は哺乳類由来のものであり得、例えば、ヒト由来ＬＩＬＲＢ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ＡＡＨ１５７３１．１（配列番号３４８）、ＮＰ_００１２６５３２８．２、ＮＰ_００１２６５３２７．２、ＮＰ_００１０７５１０８．２、ＮＰ_００１０７５１０７．２、ＮＰ_００１０７５１０６．２、ＮＰ_００６６６０．４、ＮＭ_００１０８１６３７．２、ＮＭ_００１０８１６３８．３、ＮＭ_００１０８１６３９．３、ＮＭ_００１２７８３９８．２、ＮＭ_００１２７８３９９．２など）であり得るが、これらに限定されるものではない。
【0033】
本明細書に記載されたＭＨＣクラスＩは、ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＭＨＣ）分子の一分類である。一例において、前記ＭＨＣクラスＩはヒト由来のものであり得、ＨＬＡ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、およびＨＬＡ－Ｇからなる群より選択される１種以上であり得るが、これらに限定されるものではない。
【0034】
本明細書において「抗体」とは、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質の総称であって、免疫系で抗原刺激によって作られるタンパク質またはこれを組換えまたは化学的合成で製造したタンパク質であり得、その種類は特に限定されない。前記抗体は非自然に生成されたもの、例えば、組換えまたは合成的に生成されたものであり得る。前記抗体は、動物抗体（例えば、マウス抗体など）、キメリック抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。前記抗体は、単クローン抗体または多クローン抗体であり得る。
【0035】
本明細書で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片で先に定義した重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲ部位、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域を除いた残りの部位は、すべてのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）に由来するものであり得、例えば、前記すべてのサブタイプの免疫グロブリンのフレームワーク部位、および／または軽鎖不変領域および／または重鎖不変領域に由来するものであり得る。一例において、本明細書で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体はヒトＩｇＧ型抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４形態の抗体であり得るが、これらに限定されるものであはない。
【0036】
完全な抗体（例えば、ＩｇＧ型）は、２本の全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２本の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）またはアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【0037】
用語「重鎖（ｈｅａｖｙｃ ｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片を全て含む意味に解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片を全て含む意味に解釈される。
【0038】
用語「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の可変部位中で抗原との結合特異性を付与する部位を意味し、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲを含み得る（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するにあたって主な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語「特異的に結合」または「特異的に認識」は、当業者に通常知られている意味と同じであり、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的に反応することを意味する。
【0039】
本明細書において、抗体は、特別な言及がない限り、完全な抗体だけでなく、抗原結合能を持った抗体の抗原結合断片を含むものとして理解され得る。
【0040】
用語「抗原結合断片」は、抗原と結合できる部分（例えば、本明細書において定義された６個のＣＤＲ）を含むすべての形態のポリペプチドを意味する。例えば、抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖＦｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であり得るが、これらに限定されない。また、上述した通り、前記抗原結合断片はｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖが免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭなど）のＦｃ部位または軽鎖不変領域（例えば、カッパまたはラムダ）と融合した融合ポリペプチドであり得る。
【0041】
前記抗原結合断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造である。
【0042】
Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。
【0043】
Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片であり、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は当業界に幅広く知られている。
【0044】
二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されるか、またはＣ－末端で直接連結されているので、二重鎖Ｆｖと同様に、ダイマーのような構造をなすことができる。
【0045】
前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる。）、遺伝子組換え技術を用いて作られる。
【0046】
用語「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１とＣＨ２領域の間に存在し、抗体内抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能を果たす領域を意味する。
【0047】
前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体は、単クローン抗体であり得る。単クローン抗体は、当業界で公知の方法により製造することができる。例えば、ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ技法を利用して製造することができる。または、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体は、通常の方法によってマウス由来の単クローン抗体で製造することができる。
【0048】
一方、典型的なＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）フォーマットを利用してＬＩＬＲＢ１との結合能に基づいて個別の単クローン抗体をスクリーニングすることができる。結合体に対して分子的相互作用を検定するための競合ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ）のような機能性分析またはセルベースアッセイ（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）のような機能性分析により阻害活性に対して検定することができる。その後、強い阻害活性に基づいて選択された単クローン抗体メンバーに対してＬＩＬＲＢ１に対するそれぞれの親和性（Ｋｄ ｖａｌｕｅｓ）を検定することができる。
【0049】
本明細書で提供される薬学組成物は、有効成分（抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片）に加えて、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常利用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどからなる群より選択される１種以上であり得るが、これらに限定されるものではない。前記薬学組成物はまた、薬学組成物の製造に通常使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などからなる群より選択される１種以上をさらに含み得る。
【0050】
前記薬学組成物、または前記抗体またはその抗原結合断片の有効量は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与、または病変部位への局所投与などで投与可能である。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、前記組成物は、活性物質が標的の細胞（例えば、癌細胞）に移動できる任意の装置により投与することができる。
【0051】
前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、薬学的有効量で前記薬学組成物内に含まれるか、患者に投与することができる。本明細書において「薬学的有効量」は、前記有効成分（抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片）が目的とする効果（例えば、抗癌効果）を発揮できる有効成分の量を意味する。前記薬学的有効量は、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、排泄速度、反応感応性、製剤化方法、投与時間、投与間隔、投与経路、投与方式などの要因によって多様に処方可能である。例えば、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の１日投与量は、０．００５ｕｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｕｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｕｇ／ｋｇ～２５０ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｕｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｕｇ／ｋｇ～７５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｕｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｕｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｕｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｕｇ／ｋｇ～２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｕｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｕｇ／ｋｇ～７５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｕｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｕｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｕｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｕｇ／ｋｇ～２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｕｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｕｇ／ｋｇ～７５ｍｇ／ｋｇ、または０．０５ｕｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るが、これらに限定されるものではない。前記１日投与量は、単位容量形態で１つの製形で製剤化するか、または適切に分量して製剤化するか、または多用量容器内に入れ込んで製造することができる。
【0052】
前記薬学組成物は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤などの形態に剤形化されてもよいし、剤形化のために分散剤または安定化剤をさらに含み得る。
【0053】
本発明の適用対象患者は、ヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類であり得る。
【0054】
前記癌は、固形癌または血液癌であってもよく、これらに限定されないが、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌など）、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼内黒色腫、直膓癌、肛門部癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、白血病（例えば、慢性または急性白血病）、リンパ腫、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、膠芽腫、頸部癌、卵巣ガン、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎細胞癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌、胆道癌、胆嚢癌、骨肉腫などからなる群より選択される１種以上であり得る。前記癌は、原発性癌または転移性癌であり得る。前記癌は、表面にＭＨＣクラスＩが発現または過剰発現されたものであり得、例えば、大腸癌（ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ）、骨肉腫（ｂｏｎｅ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）、腎細胞癌（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）であり得る。前記ＭＨＣクラスＩの過剰発現は、正常細胞、または免疫治療、例えば、Ｔ－細胞（ｅ．ｇ．，ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ）媒介免疫治療で抗癌効果が現れない（前記免疫治療で反応性がないかまたは抵抗性がある）癌細胞と比較して、前記抗体適用対象癌細胞で過剰発現されたものを意味する。
【0055】
本明細書において癌の治療は、癌細胞増殖の抑制、癌細胞死滅、転移抑制などの癌の症状の悪化を防止するか緩和または好転させるか、または癌を部分的または全部を消滅させるすべての抗癌作用を意味する。
【0056】
本明細書で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は他の薬物、例えば、通常使用可能な免疫治療剤、抗癌剤、細胞毒性製剤などからなる群より選択される１種以上と併用することができる。したがって、一例として、（１）抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片、および（２）免疫治療剤、抗癌剤、細胞毒性製剤などからなる群より選択される１種以上の薬物を含む、癌の予防および／または治療のための併用投与用薬学組成物を提供する。他の例は、癌の予防および／または治療を必要とする患者に（１）抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片、および（２）免疫治療剤、抗癌剤、細胞毒性製剤などからなる群より選択される１種以上の薬物を投与する段階を含む、癌の予防および／または治療方法が提供される。前記免疫治療剤、抗癌剤および細胞毒性製剤は通常癌治療に使用されるか、および／または細胞毒性活性を有するすべての薬物を包括するもので、抗体などのタンパク質、ｓｉＲＮＡなどの核酸分子、および／またはパクリタキセル、ドセタキセルなどの小分子化合物の中から１種以上選択されるが、これらに限定されるものではない。
【0057】
他の例として、先に説明した抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、またはこれらの組み合わせ）、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、またはこれらの組み合わせ）、またはこれらの組み合わせ；または重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせを含むポリペプチド分子が提供される。前記ポリペプチド分子は、抗体の前駆体として抗体作製に用いられるだけでなく、抗体と類似した構造を有するタンパク質骨格（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ；例えば、ペプチボディ）、二重特異抗体、多重特異抗体の構成成分として含まれる。さらに他の例として、前記ポリペプチド分子は、ＣＡＲ－Ｔなどの標的細胞治療剤において標的（抗原）認識部、分泌される抗体、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体を分泌するように作製された細胞治療剤などとして使用可能である。
【0058】
他の例として、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、またはこれらの組み合わせ）、重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子を提供する。
【0059】
他の例として、抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、またはこれらの組み合わせ）、軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子を提供する。
【0060】
他の例として、前記抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の重鎖相補性決定領域、重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子および抗－ＬＩＬＲＢ１抗体の軽鎖相補性決定領域、軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子を１つのベクターに共に含むか、それぞれ別個のベクターに含む組換えベクターを提供する。
【0061】
他の例として、前記核酸分子または組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【0062】
用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための発現手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、およびバクテリオファージベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ－関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターを含む。前記組換えベクターに使用可能なベクターは、当業界で頻用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して作製することができる。
【0063】
前記組換えベクターで前記核酸分子は、プロモーターに作動的に連結され得る。用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」されることで他のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を調節することができる。
【0064】
前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築することができる。前記発現用ベクターは当業界において植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界に公知の多様な方法により構築することができる。
【0065】
前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築することができる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させる強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、翻訳の開始のためのリボゾーム結合サイトおよび転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点およびＢＢＶ複製起点などを含むが、これらに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター）、または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーターなど）が用いられ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【0066】
前記組換え細胞は、前記組換えベクターを適切な宿主細胞に導入させることによって得られたものであり得る。前記宿主細胞は、前記組換えベクターを安定的かつ連続的にクローニングまたは発現させる細胞であって当業界に公知されているいかなる宿主細胞も用いることができ、原核細胞としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９，Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１，Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１，Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０などの大腸菌、バチルスサブティリス、バチルスチューリンゲンシスなどのバチルス属菌株、そしてサルモネラチフィリウム、セラチアマルセッセンスおよび多様なシュードモナス種などの腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞、例えば、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ Ｓ、ＣＨＯ ＤＸＢ１１、ＣＨＯ ＧＳ－ＫＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株などが用いられるが、これらに限定されるものではない。
【0067】
前記核酸分子またはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への導入（トランスフェクション）は、当業界に広く知られた運搬方法を使用することができる。前記トランスフェクション方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞の場合、ＣａＣｌ２方法または電気穿孔方法などを使用することができ、宿主細胞が真核細胞の場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポゾーム－媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これらに限定されない。
【0068】
前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を用いて、当業界に広く知られた方法により容易に実施可能である。例えば、前記選択標識が特定の抗生剤耐性遺伝子の場合には、前記抗生剤が含有された培地で形質転換体を培養することによって、形質転換体を容易に選別することができる。
【0069】
他の例として、前記核酸分子またはこれを含む組換えベクターを宿主細胞で発現させる段階を含む抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。前記発現させる段階は、前記核酸分子（例えば、組換えベクターに含まれる）を含む組換え細胞を前記核酸分子の発現を許容する条件下で培養することによって行うことができる。前記製造方法は、前記発現させる段階または培養する段階後に、培養培地から抗体または抗原結合断片を分離および／または精製する段階を含むものであり得る。
【発明の効果】
【0070】
本発明で提供される抗－ＬＩＬＲＢ１抗体またはその抗原結合断片は、癌細胞の免疫回避基作を阻害し、免疫細胞の抗癌効能を阻害せずによく発揮できるようにすることによって優れた抗癌活性を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【0071】
【図1】一実施形態において精製された抗－ＬＩＬＲＢ１抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析結果を示す電気泳動写真である。
【図2】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｂ３に対するＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ結果を示す図である。
【図3】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｅ３に対するＳＰＲ ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ結果を示す図である。
【図4a】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ａ１０のヒトＮＫ細胞であるＫＨＹＧ－１細胞に対する結合力を示すグラフである。
【図4b】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｅ３のヒトＮＫ細胞であるＫＨＹＧ－１細胞に対する結合力を示すグラフである。
【図4c】ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体のヒトＮＫ細胞であるＫＨＹＧ－１細胞に対する結合力を示すグラフである。
【図5】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体およびｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体をそれぞれ処理時の組換えＬＩＬＲＢ１－Ｆｃタンパク質のＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞表面に対する結合程度をｉＱｕｅ ｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した結果を示すグラフである。
【図6】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｅ３およびＢ３のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図7a】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｅ３．１が多様なｈｕｍａｎ ＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙ過剰発現細胞に結合することを示すｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｄｉａｇｒａｍである。
【図7b】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｅ３．１が多様なｈｕｍａｎ ＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙ過剰発現細胞に結合することを示すｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｄｉａｇｒａｍである。
【図7c】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｅ３．１が多様なｈｕｍａｎ ＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙ過剰発現細胞に結合することを示すｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｄｉａｇｒａｍである。
【図7d】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｅ３．１が多様なｈｕｍａｎ ＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙ過剰発現細胞に結合することを示すｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｄｉａｇｒａｍである。
【図8a】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｈ１１が多様なｈｕｍａｎ ＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙ過剰発現細胞に結合することを示すｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｄｉａｇｒａｍである。
【図8b】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｈ１１が多様なｈｕｍａｎ ＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙ過剰発現細胞に結合することを示すｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｄｉａｇｒａｍである。
【図8c】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｈ１１が多様なｈｕｍａｎ ＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙ過剰発現細胞に結合することを示すｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｄｉａｇｒａｍである。
【図8d】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｈ１１が多様なｈｕｍａｎ ＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙ過剰発現細胞に結合することを示すｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｄｉａｇｒａｍである。
【図9】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｅ３．１またはＨ１１の処理時のヒトＮＫ細胞であるＫＨＹＧ－１細胞でのグランザイムＢ分泌量を対照抗体（ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ）と比較して示すグラフである。
【図10】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｅ３．１またはＨ１１の処理時のヒトＮＫ細胞であるＫＨＹＧ－１細胞でのパーフォリン分泌量を対照抗体（ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ）と比較して示すグラフである。
【図11】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｅ３．１またはＨ１１のＬＩＬＲＢ１シグナル伝達阻害能の評価のためのｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ結果を示すグラフである。
【図12】一実施形態による抗－ＬＩＬＲＢ１抗体Ｅ３．１またはＨ１１のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0072】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず本発明の範囲を制限しようとするものではない。以下に記載された実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できることは当業者にとって自明である。
【0073】
実施例１：ＬＩＬＲＢ１に対するヒト抗体の生産
１．１．ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）を用いたＬＩＬＲＢ１に対するヒト抗体の選別
ヒトＬＩＬＲＢ１を特異的に認識する抗体を選別するために、ヒトｓｃＦｖ抗体からなるライブラリーを用いてファージディスプレイ選別法を行った。抗原は、ＲｎＤ ｓｙｓｔｅｍｓ社製のｈｕｍａｎ ＬＩＬＲＢ１－Ｈｉｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．８９８９－Ｔ２）とｈｕｍａｎ ＬＩＬＲＢ１－Ｆｃ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２０１７－Ｔ２）をそれぞれ用いた。また、各抗原は、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｂｉｏｔｉｎをｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎした。
１．１．ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）を用いたＬＩＬＲＢ１に対するヒト抗体の選別
ヒトＬＩＬＲＢ１を特異的に認識する抗体を選別するために、ヒトｓｃＦｖ抗体からなるライブラリーを用いてファージディスプレイ選別法を行った。抗原は、ＲｎＤ ｓｙｓｔｅｍｓ社製のｈｕｍａｎ ＬＩＬＲＢ１－Ｈｉｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．８９８９－Ｔ２）とｈｕｍａｎ ＬＩＬＲＢ１－Ｆｃ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２０１７－Ｔ２）をそれぞれ用いた。また、各抗原は、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｂｉｏｔｉｎをｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎした。
【0074】
ファージディスプレイ選別は、固相（ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ）と液相（ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｐｈａｓｅ）選別法により総４つの形態のＬＩＬＲＢ１抗原（ＬＩＬＲＢ１－Ｈｉｓ、ＬＩＬＲＢ１－Ｆｃ、ＬＩＬＲＢ１－Ｈｉｓ－Ｂｉｏｔｉｎ、ＬＩＬＲＢ１－Ｆｃ－Ｂｉｏｔｉｎ）を用いて行った。追加的な選別は、使用する抗原濃度を漸次減らすか、ＬＩＬＲＢ１に対するｃｏｎｔｒｏｌ抗体を用いて競争的に溶出するか、ＬＩＬＲＢ１－Ｆｃが抗原として用いられた場合、Ｆｃに対する陰性選別を実施するなどの方法で行った。選別された産出物は、多クローンファージＥＬＩＳＡによって抗原に対する結合を確認した。
【0075】
１．２．単クローンｓｏｌｕｂｌｅ ｓｃＦｖスクリーニングおよび分析
前記実施例１．１で抗原に対する結合が確認されたｓｃＦｖをコーディングする遺伝子をＰＣＲで増幅して発現ベクターを作製した。各選別群に対するスクリーニングのために、一定数のｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔを９６ ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに移した。Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４１，２０７－３４）を用いてｓｃＦｖ形態の抗体を発現した後、ＤＥＬＦＩＡ ｉｍｍｕｎｅ ａｓｓａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を行い、抗原に対する結合を確認した。また、表面に一定量のｓｃＦｖ抗体がコーティングされるようにした後、抗原に対するＤＥＬＦＩＡを行い、抗原－抗体結合力に対する順位を決めた。
前記実施例１．１で抗原に対する結合が確認されたｓｃＦｖをコーディングする遺伝子をＰＣＲで増幅して発現ベクターを作製した。各選別群に対するスクリーニングのために、一定数のｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔを９６ ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに移した。Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４１，２０７－３４）を用いてｓｃＦｖ形態の抗体を発現した後、ＤＥＬＦＩＡ ｉｍｍｕｎｅ ａｓｓａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を行い、抗原に対する結合を確認した。また、表面に一定量のｓｃＦｖ抗体がコーティングされるようにした後、抗原に対するＤＥＬＦＩＡを行い、抗原－抗体結合力に対する順位を決めた。
【0076】
１．３．選別されたｓｃＦｖ抗体のＩｇＧ抗体への変換
前記実施例１．２で抗原に対する結合が確認されたクローンの中から総３７６個を選別し、前記選別されたｓｃＦｖをコーディングする遺伝子の核酸配列を一般的なＤＮＡ配列分析方法で分析して重複するクローンを除去した。また、前記実施例１．２で定められた抗原－抗体結合力に対する順位に基づいて総９３個のクローンを選別した。前記選別されたｓｃＦｖをコーディングする遺伝子からそれぞれの重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）に相当する配列をＰＣＲで増幅してＩｇＧ４形態のヒト抗体（ＩｇＧ４ Ｆｃ：配列番号３４１、Ｋａｐｐａ不変領域：配列番号３４２、Ｌａｍｂｄａ不変領域：配列番号３４３）をコーディングするように作製された発現ベクター（ｐＴＲＩＯＺ－ｈＩｇＧ４；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、その他にもＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、またはＣＭＶ／ＣＨＯ ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ融合プロモーター（ＫＲ１０－１０３８１２６Ｂ１）を有し、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４のｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎとｋａｐｐａまたはｌａｍｂｄａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎのｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ配列を含むベクターの中でどちらを用いても構わない）に挿入した。前記発現ベクターは、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによってそのＤＮＡ配列を確認した。
前記実施例１．２で抗原に対する結合が確認されたクローンの中から総３７６個を選別し、前記選別されたｓｃＦｖをコーディングする遺伝子の核酸配列を一般的なＤＮＡ配列分析方法で分析して重複するクローンを除去した。また、前記実施例１．２で定められた抗原－抗体結合力に対する順位に基づいて総９３個のクローンを選別した。前記選別されたｓｃＦｖをコーディングする遺伝子からそれぞれの重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）に相当する配列をＰＣＲで増幅してＩｇＧ４形態のヒト抗体（ＩｇＧ４ Ｆｃ：配列番号３４１、Ｋａｐｐａ不変領域：配列番号３４２、Ｌａｍｂｄａ不変領域：配列番号３４３）をコーディングするように作製された発現ベクター（ｐＴＲＩＯＺ－ｈＩｇＧ４；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、その他にもＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、またはＣＭＶ／ＣＨＯ ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ融合プロモーター（ＫＲ１０－１０３８１２６Ｂ１）を有し、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４のｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎとｋａｐｐａまたはｌａｍｂｄａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎのｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ配列を含むベクターの中でどちらを用いても構わない）に挿入した。前記発現ベクターは、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによってそのＤＮＡ配列を確認した。
【0077】
１．４．選別された抗体の製造
前記実施例１．３で構築されたベクターは、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。このように精製されたベクターを、ＥｘｐｉＣＨＯ－ＳＴＭ細胞またはＥｘｐｉ２９３ＴＭ細胞を用いて抗体発現に使用した。
前記実施例１．３で構築されたベクターは、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。このように精製されたベクターを、ＥｘｐｉＣＨＯ－ＳＴＭ細胞またはＥｘｐｉ２９３ＴＭ細胞を用いて抗体発現に使用した。
【0078】
具体的には、前記実施例１．３で構築されたベクターをＥｘｐｉＣＨＯ－ＳＴＭ細胞（Ｇｉｂｃｏ）（１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｖｏｌｕｍｅ２５ｍＬ）にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）８０ｕｌを添加してトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ１日後、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）１５０ｕｌとＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｆｅｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）４ｍＬを添加した。５日目にＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｆｅｅｄ ４ｍＬを添加した。トランスフェクションした細胞は３２℃、５％ＣＯ２の条件下で総７～１１日間培養した。
【0079】
また、前記実施例１．３で構築されたベクターをＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞（Ｇｉｂｃｏ）（３×１０８ｃｅｌｌｓ／Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｖｏｌｕｍｅ １００ｍＬ）にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）３２０ｕｌを添加して製造会社の説明書に従ってトランスフェクションした。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ１日後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をＣｕｌｔｕｒｅ Ｖｏｌｕｍｅ１００ｍＬ当たり０．６ｍＬ、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ Ｅｎｈａｎｃｅｒ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をＣｕｌｔｕｒｅ Ｖｏｌｕｍｅ１００ｍＬ当たり６ｍＬ、ｇｌｕｃｏｓｅを１リットル当たり３．６ｇずつ添加した。トランスフェクションした細胞は３６．５℃、５％ＣＯ２の条件下で総５日間培養した。
【0080】
前記培養した２つの細胞を４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、０．２２ｕｍのｂｏｔｔｌｅ－ｔｏｐ ｆｉｌｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いてろ過した。回収した培養液をＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ Ｌ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＬにＨｉｔｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ １ｍＬカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を装着し、培養液を１ｍＬ／ｍｉｎの流速で流した後、１Ｘ ＰＢＳで２０ ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ（ＣＶ）で洗浄した。溶出バッファー（０．１Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ３．４ ｂｕｆｆｅｒ）を流して目的タンパク質を溶出させた。溶出液はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（ＭＷＣＯ １０Ｋ、Ｍｅｒｃｋ）と遠心分離機を用いて濃縮を行った後、１ｘＰＢＳ緩衝溶液でバッファー交換を実施した。
【0081】
精製した抗体試料は、１Ｘ ＰＢＳで希釈して約１ｍｇ／ｍＬとなるように用意した。Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（３Ｘ）またはＮｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（３Ｘ）１０ｕｌと精製した抗体試料２０ｕｌを混合した後、９５℃のｈｅａｔｉｎｇ ｂａｔｈに２分間静置した後、取り出して冷却させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｇｅｌ（４～２０％または４～１２％）を電気泳動装置に装着した後、ｗｅｌｌ当たり１０μｇの試料を注入し、ｇｅｌを展開した。試料の分子量分析のためにＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ＰｒｏｔｅｉｎＴＭ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を別途のｗｅｌｌに注入した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎでｇｅｌをｓｔａｉｎｉｎｇし、ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇした後、ｇｅｌ写真を撮影した。
【0082】
【0083】
１．５．選別された抗体の結合親和性の分析
前記実施例１．３で選別された９３種の抗体のＬＩＬＲＢ１抗原に対する親和力をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１００５－３０）上にＡｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１０００－５０８）を用いてａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１００８－３９、最終濃度２５ｕｇ／ｍＬ）を５ｕｌ／ｍｉｎで３６０秒間流して約５０００～７０００ＲＵで固定させた。抗原であるヒトＬＩＬＲＢ１タンパク質（ＬＩＬＲＢ１－Ｈｉｓ、ＲｎＤ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．８９８９－Ｔ２）を３．１３ｎＭから１６００ｎＭまでの濃度範囲内で互いに異なる４～９個の濃度で３０ｕｌ／ｍｉｎの速度で注入して、下記の表の通りｋａとｋｄ値を求め、これからＫＤ値を計算した。
前記実施例１．３で選別された９３種の抗体のＬＩＬＲＢ１抗原に対する親和力をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１００５－３０）上にＡｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１０００－５０８）を用いてａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１００８－３９、最終濃度２５ｕｇ／ｍＬ）を５ｕｌ／ｍｉｎで３６０秒間流して約５０００～７０００ＲＵで固定させた。抗原であるヒトＬＩＬＲＢ１タンパク質（ＬＩＬＲＢ１－Ｈｉｓ、ＲｎＤ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．８９８９－Ｔ２）を３．１３ｎＭから１６００ｎＭまでの濃度範囲内で互いに異なる４～９個の濃度で３０ｕｌ／ｍｉｎの速度で注入して、下記の表の通りｋａとｋｄ値を求め、これからＫＤ値を計算した。
【0084】
前記９３種の抗体の中で優れた結合力（ＫＤ値）を示す２０種の抗体を選別して、その結果を下記の表３に記載し、その中でＬＩＬＲＢ１抗原に対して約９９．８ｎＭの結合力を示したＢ３およびＬＩＬＲＢ１抗原に対して約１０１．２ｎＭの結合力を示したＥ３のＳＰＲ ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍをそれぞれ図２および図３に示す（図２：Ｂ３に対するＳＰＲ ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ、図３：Ｅ３に対するＳＰＲ ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）。
【表3】
【0085】
１．６．選別された抗体の配列分析
前記実施例１．５で抗原に対する結合力が確認された２０種の抗体のＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに基づいたＣＤＲ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎにより定義されたＣＤＲと軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、および重鎖のアミノ酸配列と前記軽鎖可変領域および重鎖可変領域のコード遺伝子の核酸配列を一般的なアミノ酸配列分析およびＤＮＡ配列分析方法で分析して、下記表４～表２３に整理した：
前記実施例１．５で抗原に対する結合力が確認された２０種の抗体のＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇに基づいたＣＤＲ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎにより定義されたＣＤＲと軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、および重鎖のアミノ酸配列と前記軽鎖可変領域および重鎖可変領域のコード遺伝子の核酸配列を一般的なアミノ酸配列分析およびＤＮＡ配列分析方法で分析して、下記表４～表２３に整理した：
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【表16】
【表17】
【表18】
【表19】
【表20】
【表21】
【表22】
【表23】
【0086】
実施例２：選別された抗体のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）生物学的活性分析
２．１．ＮＫ細胞表面結合分析（ＮＫ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）
前記実施例１．４で選別された９３種抗体が免疫細胞表面に発現したＬＩＬＲＢ１とも結合するかどうかを確認するために、ＮＫ細胞表面結合分析（ＮＫ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った。ヒトＮＫ細胞であるＫＨＹＧ－１細胞（ＪＣＲＢ）を１０％（ｗ／ｖ）のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）と１００Ｕ／ｍＬ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ＫＨＹＧ－１細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＵ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に分注した。各ｗｅｌｌ当たりの最終濃度が５０μｇ／ｍＬの試験抗体を加え、４℃で１時間静置した。
２．１．ＮＫ細胞表面結合分析（ＮＫ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）
前記実施例１．４で選別された９３種抗体が免疫細胞表面に発現したＬＩＬＲＢ１とも結合するかどうかを確認するために、ＮＫ細胞表面結合分析（ＮＫ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った。ヒトＮＫ細胞であるＫＨＹＧ－１細胞（ＪＣＲＢ）を１０％（ｗ／ｖ）のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）と１００Ｕ／ｍＬ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ＫＨＹＧ－１細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＵ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に分注した。各ｗｅｌｌ当たりの最終濃度が５０μｇ／ｍＬの試験抗体を加え、４℃で１時間静置した。
【0087】
ＬＩＬＲＢ１に特異的な結合のために、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）も同様に処理した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、各ｗｅｌｌにａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ－ｂｉｏｔｉｎ抗体（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、４℃で１時間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、各ｗｅｌｌにｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を加え、４℃で３０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、懸濁してｉＱｕｅ ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で分析した。
【0088】
前記得られた結果のうち、代表的にＡ１０、Ｅ３、Ｅ４、Ｆ１２、Ｇ１、Ｇ９、Ｇ１１、Ｈ２、およびＨ１１の結果をｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して表２４に示し、Ａ１０、Ｅ３およびｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ（ｃｏｎｔｒｏｌ）のｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｄｉａｇｒａｍをそれぞれ図４ａ（Ａ１０）、図４ｂ（Ｅ３）、および図４ｃ（ｉｓｏｔｙｐｅＩｇ Ｇ４）に示す：
【表24】
【0089】
【0090】
２．２．選別された抗体のＬＩＬＲＢ１／ＨＬＡ－Ｇ結合阻害能分析
前記実施例１．５で選択した抗体がＬＩＬＲＢ１とそのリガンドであるＨＬＡ－Ｇの結合を阻害するかどうかを確認するために、ＬＩＬＲＢ１／ＨＬＡ－Ｇ結合阻害能分析を行った。
前記実施例１．５で選択した抗体がＬＩＬＲＢ１とそのリガンドであるＨＬＡ－Ｇの結合を阻害するかどうかを確認するために、ＬＩＬＲＢ１／ＨＬＡ－Ｇ結合阻害能分析を行った。
【0091】
そのためにＨＬＡ－Ｇを過剰発現するものとして知られているＪＥＧ－３（ＡＴＣＣ ｃａｔ＃ ＨＴＢ－３６）を用いた。ＪＥＧ－３は、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）および１％（ｖ／ｖ）のｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ＪＥＧ－３細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＵ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に分注した。前記ウォールプレートを１Ｘ ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ（１Ｘ ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）に前記実施例１．５で選別された試験抗体（Ａ１０、Ｅ３、Ｆ１２、Ｇ１、Ｇ９、Ｈ２、Ｈ１１）とＬＩＬＲＢ１－Ｆｃ（ＲｎＤ ｓｙｓｔｅｍｓ）をそれぞれ最終濃度が１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬとなるように混合してｗｅｌｌ当たり１００ｕｌを細胞に処理した後、ｉｃｅに２時間静置した。陽性対照群としてａｎｔｉ－ＬＩＬＲＢ１抗体（ｃｌｏｎｅ ＨＰ－Ｆ１、Ａｂｃａｍ）、陰性対照群としてａｎｔｉ－ｌｙｓｏｚｙｍｅ ＩｇＧ４抗体（ｃｌｏｎｅ Ｄ１．３）を前記と同様に処理して用意した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回ｗａｓｈｉｎｇした後、各ｗｅｌｌにＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕＩｇＧ－Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０μｇ／ｍＬ）を加え、ｉｃｅに１時間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回ｗａｓｈｉｎｇした後、同じｂｕｆｆｅｒ １００ｕｌに懸濁してｉＱｕｅ ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で分析した。
【0092】
前記得られた結果を図５に示す。図５からわかるように、試験抗体Ａ１０、Ｅ３、Ｆ１２、Ｇ１、Ｇ９、Ｈ２、およびＨ１１は、いずれもＬＩＬＲＢ１－ＦｃがＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞株に結合することを効果的に阻害した。
【0093】
２．３．ＮＫ細胞による癌細胞死滅能分析
選別された抗体がＮＫ細胞による癌細胞死滅能を増加させるかどうかを確認するために、ＮＫ細胞ＫＨＹＧ－１によるＨＬＡ－Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞の死滅率を分析した。ＫＨＹＧ－１細胞（ＪＣＲＢ）を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総体積５０ｕｌ）となるように９６－ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に分注した。試験抗体（表２５）を各ｗｅｌｌ当たりの最終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で１時間静置した。
選別された抗体がＮＫ細胞による癌細胞死滅能を増加させるかどうかを確認するために、ＮＫ細胞ＫＨＹＧ－１によるＨＬＡ－Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞の死滅率を分析した。ＫＨＹＧ－１細胞（ＪＣＲＢ）を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総体積５０ｕｌ）となるように９６－ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に分注した。試験抗体（表２５）を各ｗｅｌｌ当たりの最終濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で１時間静置した。
【0094】
陰性対照群としてｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）もそれぞれ同様に処理した。
【0095】
ＨＬＡ－Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）をＨＬＡ－Ｇ１を発現するように作製されたｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓでｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎしてＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞株を作製）をＩｎｃｕＣｙｔｅ ＣｙｔｏＬｉｇｈｔ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて製造会社の説明書に従って染色した。１時間後、ＨＬＡ－Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、総体積５０ｕｌ）となるように前記ｐｌａｔｅに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２培養器に設けられたＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に入れ、７２時間イメージを撮影し、生きているＨＬＡ－Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３の密集度を示すＲｅｄ ａｒｅａ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅを測定して、細胞生存率を求めた。細胞生存率を下記の表２５（対照抗体を１にして相対値で表す）に示す：
【数1】
【表25】
【0096】
表２５からわかるように、試験抗体Ａ１０、Ｂ９、Ｄ３、Ｅ１、Ｅ３、Ｆ１２、Ｇ１、Ｇ６、Ｇ９、Ｇ１１、Ｈ２、Ｈ１１は、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてＫＨＹＧ－１によるＨＬＡ－Ｇ過剰発現ＨＥＫ２９３細胞の死滅を増加させた。
【0097】
実施例３：選別された抗体の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での生物学的活性分析
前記実施例１．５で選別された抗体の中で２種の試験抗体（Ｅ３、Ｂ３）の抗癌効能の改善要否を生体内で確認した。そのために、Ｂｉｏｗａｒｅ Ｂｒｉｔｅ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＨＣＴ１１６ Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ大腸癌細胞（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）およびＴＨＰ－１由来マクロファージ（ＴＨＰ－１ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）と、抗体を投与した異種移植大腸癌マウス動物モデルを対象として生体内（ｉｎｖｉｖｏ）で前記２種の抗体投与によって腫瘍の大きさが減少するかどうかを確認した。陰性対照群としてｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＰ０２９７）を前記と同様に投与した異種移植大腸癌マウス動物モデルを用意した。以下、前記過程をより具体的に記載する：
前記実施例１．５で選別された抗体の中で２種の試験抗体（Ｅ３、Ｂ３）の抗癌効能の改善要否を生体内で確認した。そのために、Ｂｉｏｗａｒｅ Ｂｒｉｔｅ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＨＣＴ１１６ Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ大腸癌細胞（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）およびＴＨＰ－１由来マクロファージ（ＴＨＰ－１ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）と、抗体を投与した異種移植大腸癌マウス動物モデルを対象として生体内（ｉｎｖｉｖｏ）で前記２種の抗体投与によって腫瘍の大きさが減少するかどうかを確認した。陰性対照群としてｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＰ０２９７）を前記と同様に投与した異種移植大腸癌マウス動物モデルを用意した。以下、前記過程をより具体的に記載する：
【0098】
ＴＨＰ－１由来マクロファージ（ＴＨＰ－１ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の用意
【0099】
上記で使用されたＴＨＰ－１由来マクロファージは、ＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ）に１５０ｎＭ ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ）および２０ｎｇ／ｍＬ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１０ｐｇ／ｍＬ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ）を加えて分化させて用意した。
【0100】
マウス動物モデルでの抗癌効能分析
５週齢の雌性ＣＩＥＡ ＮＯＧ Ｍｏｕｓｅ［ＮＯＧ免疫不全マウス］（公益財団法人実験動物中央研究所）に３×１０６個のＨＣＴ１１６ Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ大腸癌細胞と３×１０６個のＴＨＰ－１由来マクロファージ、および２種の試験抗体（Ｅ３またはＢ３抗体；１匹当たり２０μｇを投与）それぞれの混合物を皮下注射して使用した。腫瘍移植後、４日目から、抗体を腹腔注射によって５ｍｇ／ｋｇの濃度に週２回投与し、移植された腫瘍の大きさ（ｍｍ３）を測定して、その結果を図６に示す。図６に示したように、ＨＣＴ１１６大腸癌およびＴＨＰ－１由来マクロファージを移植したマウス動物モデルで試験したすべての抗体、特に、Ｅ３抗体は統計学的に有意水準の明確な腫瘍成長抑制効能を示した。
５週齢の雌性ＣＩＥＡ ＮＯＧ Ｍｏｕｓｅ［ＮＯＧ免疫不全マウス］（公益財団法人実験動物中央研究所）に３×１０６個のＨＣＴ１１６ Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ大腸癌細胞と３×１０６個のＴＨＰ－１由来マクロファージ、および２種の試験抗体（Ｅ３またはＢ３抗体；１匹当たり２０μｇを投与）それぞれの混合物を皮下注射して使用した。腫瘍移植後、４日目から、抗体を腹腔注射によって５ｍｇ／ｋｇの濃度に週２回投与し、移植された腫瘍の大きさ（ｍｍ３）を測定して、その結果を図６に示す。図６に示したように、ＨＣＴ１１６大腸癌およびＴＨＰ－１由来マクロファージを移植したマウス動物モデルで試験したすべての抗体、特に、Ｅ３抗体は統計学的に有意水準の明確な腫瘍成長抑制効能を示した。
【0101】
実施例４：抗－ＬＩＬＲＢ１抗体（Ｅ３．１）の作製
前記実施例３で特に優れた効果が確認されたＥ３抗体の重鎖（配列番号３０２）に相当する全体核酸配列をＰＣＲ増幅し、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）（配列番号：２２１）のＳｅｒ１からＬｅｕ１１０に相当する核酸配列をＰＣＲ増幅した後、Ｌａｍｂｄａ不変領域（Ｌａｍｂｄａ ＣＬ．１、配列番号３４４）核酸配列と連結してＬａｍｂｄａ軽鎖領域コード核酸配列をＰＣＲ増幅した。増幅された配列は、ＩｇＧ４形態のヒト抗体をコーディングするように作製された発現ベクター（ｐＴＲＩＯＺ－ｈＩｇＧ４；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、それ以外にもＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、またはＣＭＶ／ＣＨＯ ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ融合プロモーター（ＫＲ１０－１０３８１２６Ｂ１）を有し、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４のｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎとｌａｍｂｄａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎのｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎをコードする配列を含むベクターの中でどれを使用しても構わない）に挿入した。前記発現ベクターは、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによってそのＤＮＡ配列を確認した。
前記実施例３で特に優れた効果が確認されたＥ３抗体の重鎖（配列番号３０２）に相当する全体核酸配列をＰＣＲ増幅し、Ｅ３抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）（配列番号：２２１）のＳｅｒ１からＬｅｕ１１０に相当する核酸配列をＰＣＲ増幅した後、Ｌａｍｂｄａ不変領域（Ｌａｍｂｄａ ＣＬ．１、配列番号３４４）核酸配列と連結してＬａｍｂｄａ軽鎖領域コード核酸配列をＰＣＲ増幅した。増幅された配列は、ＩｇＧ４形態のヒト抗体をコーディングするように作製された発現ベクター（ｐＴＲＩＯＺ－ｈＩｇＧ４；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、それ以外にもＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、またはＣＭＶ／ＣＨＯ ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ融合プロモーター（ＫＲ１０－１０３８１２６Ｂ１）を有し、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４のｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎとｌａｍｂｄａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎのｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎをコードする配列を含むベクターの中でどれを使用しても構わない）に挿入した。前記発現ベクターは、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによってそのＤＮＡ配列を確認した。
【0102】
前記構築された発現ベクターを用いて実施例１．４を参照して抗体（Ｅ３．１）を作製し、実施例１．６を参照して抗体配列を分析して、その結果を表２６に示す：
【表26】
【0103】
実施例５：Ｈｕｍａｎ ＬＩＬＲを過剰発現する細胞株の作製
ヒトＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙタンパク質の全体配列（下記の表２７参照）をコードする核酸配列をＰＣＲで増幅し、増幅された配列をコーディングするように作製された発現ベクター（ｐＴＲＩＯＺ－ｈＩｇＧ４；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、それ以外にもＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、またはＣＭＶ／ＣＨＯ ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ融合プロモーター（ＫＲ１０－１０３８１２６Ｂ１）を有し、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４のｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎとｌａｍｂｄａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎのｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ配列を含むベクターの中でどれを使用しても構わない）に挿入した。前記発現ベクターは、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによってその配列を確認した。構築されたベクターは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、各ＬＩＬＲタンパク質を細胞表面に過剰発現する１１種の安定した細胞株を作製した。
ヒトＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙタンパク質の全体配列（下記の表２７参照）をコードする核酸配列をＰＣＲで増幅し、増幅された配列をコーディングするように作製された発現ベクター（ｐＴＲＩＯＺ－ｈＩｇＧ４；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、それ以外にもＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、またはＣＭＶ／ＣＨＯ ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ融合プロモーター（ＫＲ１０－１０３８１２６Ｂ１）を有し、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４のｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎとｌａｍｂｄａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎのｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ配列を含むベクターの中でどれを使用しても構わない）に挿入した。前記発現ベクターは、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによってその配列を確認した。構築されたベクターは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、各ＬＩＬＲタンパク質を細胞表面に過剰発現する１１種の安定した細胞株を作製した。
【表27-1】
【表27-2】
【表27-3】
【表27-4】
【0104】
実施例６：選別された抗体のＬＩＬＲＢ１過剰発現細胞表面結合に対するＥＣ５０測定
前記実施例１および実施例４で用意した抗体のｈｕｍａｎ ＬＩＬＲＢ１過剰発現細胞株結合に対するＥＣ５０値を測定するために、細胞表面結合分析（ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った。前記用意された抗体を代表としてＥ３．１およびＨ１１抗体のＥＣ５０値を測定した。実施例５で用意したＬＩＬＲＢ１を細胞表面に過剰発現させたＣＨＯ細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＵ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に分注した。各ｗｅｌｌ当たりの最終濃度が、Ｅ３．１は６００ｕｇ／ｍＬから１／３ずつ、Ｈ１１は２７ｕｇ／ｍＬから１／３ずつ連続稀釈した後、細胞に処理して４℃で６０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ－ｂｉｏｔｉｎ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に処理して４℃で３０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、ＰＥ蛍光が標識されたｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を細胞に処理して４℃で３０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、細胞を懸濁してｉＱｕｅ ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で分析した。ＥＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅのｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ式を用いて計算し、得られた結果を表２８に示す：
前記実施例１および実施例４で用意した抗体のｈｕｍａｎ ＬＩＬＲＢ１過剰発現細胞株結合に対するＥＣ５０値を測定するために、細胞表面結合分析（ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った。前記用意された抗体を代表としてＥ３．１およびＨ１１抗体のＥＣ５０値を測定した。実施例５で用意したＬＩＬＲＢ１を細胞表面に過剰発現させたＣＨＯ細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＵ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に分注した。各ｗｅｌｌ当たりの最終濃度が、Ｅ３．１は６００ｕｇ／ｍＬから１／３ずつ、Ｈ１１は２７ｕｇ／ｍＬから１／３ずつ連続稀釈した後、細胞に処理して４℃で６０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ－ｂｉｏｔｉｎ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に処理して４℃で３０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、ＰＥ蛍光が標識されたｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を細胞に処理して４℃で３０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、細胞を懸濁してｉＱｕｅ ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で分析した。ＥＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅのｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ式を用いて計算し、得られた結果を表２８に示す：
【表28】
【0105】
実施例７：選別された抗体のＨｕｍａｎ ＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙ過剰発現細胞株に対するｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ評価
選別された抗体がＬＩＬＲＢ１以外の他のｈｕｍａｎ ＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙとも結合するかどうかを確認するために細胞表面結合分析（ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った。実施例５で用意した多様なＬＩＬＲ系タンパク質を細胞表面に過剰発現させたＣＨＯ細胞をそれぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＵ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に分注した。最終濃度２０ｕｇ／ｍＬの抗体を各ｗｅｌｌの細胞に処理して４℃で６０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ－ｂｉｏｔｉｎ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に処理して４℃で３０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、ＰＥまたはＦＩＴＣ蛍光が標識されたｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を細胞に処理して４℃で３０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、懸濁してｉＱｕｅ ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で分析した。各ＬＩＬＲタンパク質に特異的な抗体（表２７参照）を処理した細胞はｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を処理した細胞はｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いた。
選別された抗体がＬＩＬＲＢ１以外の他のｈｕｍａｎ ＬＩＬＲ ｆａｍｉｌｙとも結合するかどうかを確認するために細胞表面結合分析（ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った。実施例５で用意した多様なＬＩＬＲ系タンパク質を細胞表面に過剰発現させたＣＨＯ細胞をそれぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＵ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に分注した。最終濃度２０ｕｇ／ｍＬの抗体を各ｗｅｌｌの細胞に処理して４℃で６０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ－ｂｉｏｔｉｎ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に処理して４℃で３０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、ＰＥまたはＦＩＴＣ蛍光が標識されたｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を細胞に処理して４℃で３０分間静置した。ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒでｗａｓｈｉｎｇした後、懸濁してｉＱｕｅ ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で分析した。各ＬＩＬＲタンパク質に特異的な抗体（表２７参照）を処理した細胞はｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を処理した細胞はｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いた。
【0106】
Ｅ３．１抗体を使用して得られた結果を図７ａ～図７ｄに示し（Ｅ３．１：ｒｅｄ；ＬＩＬＲ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｂｌｕｅ；Ｉｓｏｔｙｐｅ（ｈＩｇＧ４）ｃｏｎｔｒｏｌ：ｇｒａｙ）、Ｈ１１抗体を使用して得られた結果を図８ａ～図８ｄに示す（Ｈ１１：ｒｅｄ；ＬＩＬＲ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｂｌｕｅ；Ｉｓｏｔｙｐｅ（ｈＩｇＧ４）ｃｏｎｔｒｏｌ：ｇｒａｙ）。図７ａ～図７ｄおよび図８ａ～図８ｄに示したように、試験したＥ３．１およびＨ１１抗体は全てＬＩＬＲＢ１以外の他のＬＩＬＲｓには全く結合しないか、ほとんど結合しないことを確認した。このような結果は、本実施形態で提供された抗体がＬＩＬＲＢ１に対して特異的な結合能を有することを示す。
【0107】
実施例８：固着化酵素抗体法（ＥＬＩＳＰＯＴ、ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ａｂｓｏｒｂｅｎｔ ｓｐｏｔ）によるグランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）およびパーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）分泌測定
Ｅ３．１とＨ１１抗体がＮＫ細胞の細胞毒性能を増加させるかどうかを確認するために固着化酵素抗体法（ＥＬＩＳＰＯＴ）を行った。前記細胞毒性能は、ＮＫ細胞での細胞毒性物質であるグランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）とパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）の発現量で確認した。
Ｅ３．１とＨ１１抗体がＮＫ細胞の細胞毒性能を増加させるかどうかを確認するために固着化酵素抗体法（ＥＬＩＳＰＯＴ）を行った。前記細胞毒性能は、ＮＫ細胞での細胞毒性物質であるグランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）とパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）の発現量で確認した。
【0108】
ＬＩＬＲＢ１を発現するＫＨＹＧ－１細胞株（ＪＣＲＢ）５×１０３個をＵ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに５×１０３個のＨＬＡ－Ｇを過剰発現させたＫ５６２細胞（Ｋ５６２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、ＨＬＡ－Ｇを発現するように作製されたｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓでｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎしてＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞株を作製）と同時培養した。このとき、各ｗｅｌｌ当たりの最終濃度が５０ｕｇ／ｍＬとなるようにＥ３．１、Ｈ１１、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体をそれぞれ加え、３７℃で３０分間培養した。Ａｎｔｉ－ｐｅｒｆｏｒｉｎ抗体およびａｎｔｉ－ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ抗体がそれぞれｃｏａｔｉｎｇされたＥＬＩＳＰＯＴ用９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ、Ｃａｔ．ＨＧＺＢＰＦＮ－２Ｍ）（ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に同時培養した細胞を移してさらに３７℃で８時間培養した。Ｗａｓｈｉｎｇ溶液（０．０５％ ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ）でＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅを洗浄した後、ａｎｔｉ－ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ－ＨＲＰとａｎｔｉ－ｐｅｒｆｏｒｉｎ－ｂｉｏｔｉｎを順次加え、その後、製造会社のマニュアルによってｄｅｔｅｃｔｉｏｎ過程を進行した。ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅを常温で２４時間乾燥させた後、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ社製のＥＬＩＳＰＯＴ ａｎａｌｙｚｅｒを用いてグランザイムＢとパーフォリンｓｐｏｔの個数を測定した。
【0109】
前記得られた結果を図９（ｇｒａｎｚｙｍｅ ｂ；Ｇｚｍｂ）および図１０（ｐｅｒｆｏｒｉｎ；Ｐｒｆ）にそれぞれ示した（Ｙ軸は総ｓｐｏｔ数を示す）。図９および図１０に示したように、グランザイムＢとパーフォリンの場合、いずれもｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体処理時に比べて、Ｅ３．１またはＨ１１抗体処理時に分泌量が統計学的に有意に増加したことを確認することができる。統計分析は、ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｔ－ｔｅｓｔで行い、実験の信頼性のためにすべての実験は同じ条件で３回行い、結果は平均値で表した。
【0110】
実施例９：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＧＨＩ／７５抗体の製造
本実施例で提供された抗体の既存抗体に対して優れた効能を確認するために、マウス由来ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＬＩＬＲＢ１抗体であるＧＨＩ／７５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ＃３３３７２１）の可変領域とヒト由来抗体不変領域を有するｃｈｉｍｅｒｉｃ ＧＨＩ／７５を作製した。
本実施例で提供された抗体の既存抗体に対して優れた効能を確認するために、マウス由来ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＬＩＬＲＢ１抗体であるＧＨＩ／７５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ＃３３３７２１）の可変領域とヒト由来抗体不変領域を有するｃｈｉｍｅｒｉｃ ＧＨＩ／７５を作製した。
【0111】
具体的には、Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｐｐｉｎｇによってＧＨＩ／７５抗体のアミノ酸配列を分析した後、マウスＧＨＩ／７５抗体可変領域（ＶＨ、ＶＬ ｄｏｍａｉｎ）に相当する核酸配列をヒトＩｇＧ４抗体の可変領域（ＶＨ、ＶＬ ｄｏｍａｉｎ）核酸配列に置換したベクターを作製した。ヒトＩｇＧ４のｕｐｐｅｒ ｈｉｎｇｅに相当する部分はヒトＩｇＧ１ ｕｐｐｅｒ ｈｉｎｇｅのアミノ酸配列（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ；配列番号３５９）に置換した。当該ベクターを実施例１．４と同様の過程によって発現、精製して得られた抗体を下記試験で比較抗体として使用した。
【0112】
実施例１０：ＩＬ－２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙを用いた選別された抗体のＬＩＬＲＢ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ阻害能測定
実施例１および実施例４で作製された抗体がＬＩＬＲＢ１によるシグナル伝達を阻害するかを確認するためにｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙを行った。実施例１および実施例４で作製された抗体の中で代表的にＥ３．１およびＨ１１抗体に対して試験を行い、比較抗体として実施例９で用意したｃｈｉｍｅｒｉｃ ＧＨＩ／７５抗体を使用した。ＬＩＬＲＢ１とｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２（ＩＬ－２）ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にＩＬ－２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を挿入した後、ＬＩＬＲＢ１を発現するように作製されたｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓをｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎして作製）とＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＫ５６２細胞株を用いた。９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加えた後、４℃で一晩コーティングした。翌日、Ｕ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＬＩＬＲＢ１とＩＬ－２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するＪｕｒｋａｔ細胞１×１０５個／ｗｅｌｌに加え、最終濃度が２０ｕｇ／ｍＬとなるようにＥ３．１、Ｈ１１、ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＧＨＩ／７５、およびｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ（対照群）抗体をそれぞれ処理した後、３７℃で１時間静置した。その後、該ｐｌａｔｅに１×１０５個のＨＬＡ－Ｇを過剰発現させたＫ５６２細胞を加え、３７℃で３０分間静置した。その後、該懸濁液をａｎｔｉ－ＣＤ３でｃｏａｔｉｎｇされたｐｌａｔｅに移し、ａｎｔｉ－ＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を最終濃度が１０ｕｇ／ｍＬとなるように加えた。該ｐｌａｔｅを３７℃で６時間静置した後、各ｗｅｌｌにＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）溶液を加えた後、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析した。
実施例１および実施例４で作製された抗体がＬＩＬＲＢ１によるシグナル伝達を阻害するかを確認するためにｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙを行った。実施例１および実施例４で作製された抗体の中で代表的にＥ３．１およびＨ１１抗体に対して試験を行い、比較抗体として実施例９で用意したｃｈｉｍｅｒｉｃ ＧＨＩ／７５抗体を使用した。ＬＩＬＲＢ１とｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２（ＩＬ－２）ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にＩＬ－２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を挿入した後、ＬＩＬＲＢ１を発現するように作製されたｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓをｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎして作製）とＨＬＡ－Ｇを過剰発現するＫ５６２細胞株を用いた。９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加えた後、４℃で一晩コーティングした。翌日、Ｕ－ｂｏｔｔｏｍ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにＬＩＬＲＢ１とＩＬ－２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するＪｕｒｋａｔ細胞１×１０５個／ｗｅｌｌに加え、最終濃度が２０ｕｇ／ｍＬとなるようにＥ３．１、Ｈ１１、ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＧＨＩ／７５、およびｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ（対照群）抗体をそれぞれ処理した後、３７℃で１時間静置した。その後、該ｐｌａｔｅに１×１０５個のＨＬＡ－Ｇを過剰発現させたＫ５６２細胞を加え、３７℃で３０分間静置した。その後、該懸濁液をａｎｔｉ－ＣＤ３でｃｏａｔｉｎｇされたｐｌａｔｅに移し、ａｎｔｉ－ＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を最終濃度が１０ｕｇ／ｍＬとなるように加えた。該ｐｌａｔｅを３７℃で６時間静置した後、各ｗｅｌｌにＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）溶液を加えた後、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析した。
【0113】
上記で得られた結果を図１１に示す。図１１に示したように、本実施例によるＥ３．１抗体とＨ１１抗体は、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体およびｃｈｉｍｅｒｉｃ ＧＨＩ／７５比較抗体に比べて、顕著に増加したＬＩＬＲＢ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ阻害活性を示した。
【0114】
実施例１１：選別された抗体のマウス動物モデルでの抗癌効能分析
選別された抗体の抗癌効能分析のために、実施例３を参照して５週齢の雌性ＣＩＥＡ ＮＯＧ Ｍｏｕｓｅ（ＮＯＧ免疫不全マウス、公益財団法人実験動物中央研究所）に３×１０６個のＨＣＴ１１６ Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ大腸癌細胞と３×１０６個のＴＨＰ－１由来マクロファージおよび２種の試験抗体（匹当たり２０ｕｇを投与）を皮下注射して、マウス動物モデルを用意した。使用された試験抗体はＥ３．１、Ｈ１１であり、比較のためにｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ対照抗体を使用した。腫瘍細胞移植後、４日目から前記抗体をそれぞれ５ｍｇ／ｋｇの容量で腹腔注射で週２回投与し、腫瘍体積を測定してその結果を図１２に示す。図１２に示したように、ＨＣＴ１１６大腸癌細胞およびＴＨＰ－１由来マクロファージを移植したマウス動物モデルでＥ３．１およびＨ１１抗体はいずれも対照抗体に対して優れた腫瘍成長抑制効能を示した。
選別された抗体の抗癌効能分析のために、実施例３を参照して５週齢の雌性ＣＩＥＡ ＮＯＧ Ｍｏｕｓｅ（ＮＯＧ免疫不全マウス、公益財団法人実験動物中央研究所）に３×１０６個のＨＣＴ１１６ Ｒｅｄ－Ｆｌｕｃ大腸癌細胞と３×１０６個のＴＨＰ－１由来マクロファージおよび２種の試験抗体（匹当たり２０ｕｇを投与）を皮下注射して、マウス動物モデルを用意した。使用された試験抗体はＥ３．１、Ｈ１１であり、比較のためにｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｉｓｏｔｙｐｅ対照抗体を使用した。腫瘍細胞移植後、４日目から前記抗体をそれぞれ５ｍｇ／ｋｇの容量で腹腔注射で週２回投与し、腫瘍体積を測定してその結果を図１２に示す。図１２に示したように、ＨＣＴ１１６大腸癌細胞およびＴＨＰ－１由来マクロファージを移植したマウス動物モデルでＥ３．１およびＨ１１抗体はいずれも対照抗体に対して優れた腫瘍成長抑制効能を示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【外国語明細書】