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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024029609
(43)【公開日】2024-03-06
(54)【発明の名称】超開花性ムギの生産方法
(51)【国際特許分類】
A01H 6/46 20180101AFI20240228BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240228BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20240228BHJP
A01G 7/00 20060101ALI20240228BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20240228BHJP
【ＦＩ】
A01H6/46 ZNA
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6851 Z
A01G7/00 604A
C12N15/29
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022131955
(22)【出願日】2022-08-22
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、未来社会創造事業「超開花性遺伝子の単離と機能解明」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願 平成３０年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、未来社会創造事業「ムギ類超開花性相同遺伝子の解析」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願 平成３０年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、未来社会創造事業「オオムギ雑種強勢育種システムの開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(71)【出願人】
【識別番号】504147243
【氏名又は名称】国立大学法人 岡山大学
(71)【出願人】
【識別番号】504150461
【氏名又は名称】国立大学法人鳥取大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小松田 隆夫
(72)【発明者】
【氏名】大野 陽子
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 和広
(72)【発明者】
【氏名】久野 裕
(72)【発明者】
【氏名】佐久間 俊
【テーマコード（参考）】
2B030
4B063
【Ｆターム（参考）】
2B030AB03
2B030AD11
2B030AD20
2B030CA11
4B063QA13
4B063QQ04
4B063QQ42
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR58
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】 開花性が飛躍的に高められたムギを提供すること。
【解決手段】 Ｓｏｆ１遺伝子の機能を抑制することにより、ムギの開花性を向上させることが可能であり、また、Ｓｏｆ１遺伝子の機能の抑制を指標にムギの開花性を評価することが可能であることを見出した。
【選択図】 なし
【解決手段】 Ｓｏｆ１遺伝子の機能を抑制することにより、ムギの開花性を向上させることが可能であり、また、Ｓｏｆ１遺伝子の機能の抑制を指標にムギの開花性を評価することが可能であることを見出した。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
開花性が向上したムギの生産方法であって、ムギにおいて、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の機能を人為的に抑制することを含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
【請求項2】
下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の機能が人為的に抑制された、開花性が向上したムギ。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
【請求項3】
ムギの開花性を評価する方法であって、ムギにおける、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列を解析することを含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
【請求項4】
ムギの開花性を評価する方法であって、ムギにおける、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の発現を解析することを含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
【請求項5】
開花性が向上したムギを生産する方法であって、請求項２に記載のムギと他の任意のムギとを交配させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｓｏｆ１遺伝子を標的とした、開花性が向上したムギの生産方法および評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
世界の穀物の供給は、開発途上国を中心とした人口増加による食料の需要の増加に加え、異常気象の頻発や水資源の制約による生産量の減少などの諸要因によって逼迫するおそれがある。この問題の解決のための手段の一つとして、農業生産性を増大できる穀物の新品種の開発が求められている。
【0003】
雑種強勢は雑種第一代（Ｆ１）の個体の生産能力が両親の生産能力を上回る現象であり、様々な作物の新品種の開発に利用されてきた。しかしながら、遺伝的多様性の極めて高いオオムギでは雑種強勢効果が優れているにもかかわらず、元来自殖性で他家受粉による雑種種子の生産効率が低いという理由から雑種強勢技術が成熟してこなかった。
【0004】
そこで、他家受粉の効率を高めるために、穀物の開花性を制御する遺伝子の同定が試みられている。例えば、閉花性オオムギ品種の小さい鱗被は、染色体２Ｈの長腕にある単一の劣性遺伝子ｃｌｅｉｓｔｏｇａｍｙ １（ｃｌｙ１）によって制御されており（非特許文献１）、この遺伝子はシロイヌナズナＡＰ２転写因子のオルソログであることが報告されている（非特許文献２）。オオムギの開花型Ｃｌｙ１遺伝子（Ｃｌｙ１．ａ）は、鱗被の幅と厚みを拡大させ、小花の中から外頴と内頴を外へ押し出し、機械的に開花させる働きをもつ（非特許文献２）。閉花型ｃｌｙ１．ｂと開花型Ｃｌｙ１．ａの違いは、ｃｌｙ１の配列をコードするｍｉｃｒｏＲＮＡ１７２（ｍｉＲ１７２）の特異的結合部位内の一塩基置換により生じ、Ｃｌｙ１．ａをもつ野生種ではｍｉＲ１７２を介したｃｌｙ１転写産物の切断が減少する。その結果、翻訳されたＣＬＹ１タンパク質が高蓄積し、抑制されていた鱗被が正常に発達するようになる（非特許文献２、３）。
【0005】
開花型Ｃｌｙ１．ａを利用することにより、閉花性品種に開花性の形質を付与することが可能である。しかしながら、当該遺伝子によりもたらされる開花性のみでは他家受粉による雑種種子の生産効率を高めるには不十分であり、飛躍的な開花性の向上がいまなお求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｔｕｒｕｓｐｅｋｏｖ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １０９：４８０－４８７
【非特許文献2】Ｎａｉｒ， Ｓ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １０７（１）：４９０－４９５
【非特許文献3】Ａｎｗａｒ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， （２０１８） Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ， １２２（２）：２５１－２６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、開花性が飛躍的に高められたムギを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、まず、開花型の野生オオムギ系統（ＯＵＨ６０２）にガンマ線照射することにより開花性が向上した変異体のスクリーニングを行った。その結果、開花性が飛躍的に向上した超開花の形質を示す変異体を選抜することに成功した。次いで、選抜した突然変異体を開花型の栽培品種（Ｍｏｒｅｘ）と交配し、Ｆ２集団を用いたマップベースクローニングを行った。その結果、超開花の原因遺伝子は染色体７Ｈ上のマーカーＨＭ７Ｈ２３４２００とＨＭ７Ｈ２４６１００の間に存在し、この形質が単一の劣性遺伝子により支配されていることを見出した（この超開花の形質を支配する遺伝子を「ｓｏｆ１」と命名した）。この約３．１Ｍｂの候補領域内には、４３個のアノテーション付き遺伝子と５個のアノテーションなし偽遺伝子が存在することが判明した。
【0009】
次に、これら遺伝子の多型を調査するために、変異体の全ゲノムショットガン配列解析を行い、野生型オオムギ系統（ＯＵＨ６０２）のゲノム配列と比較した。その結果、この標的領域内では、３つのホモ接合多型が検出され、そのうち２つは遺伝子間領域に存在する１ｂｐ挿入であり、残りの一つはＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００遺伝子内に存在する２２ｂｐ欠失であった。
【0010】
この遺伝子が超開花の形質の原因となるｓｏｆ１であることを裏付けるために、閉花型の栽培品種（Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅ）のＳｏｆ１遺伝子（上記２２ｂｐ欠失の近傍領域）を標的として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法による変異の導入を行った。その結果、Ｓｏｆ１遺伝子内に５ｂｐの欠失を持つ変異（ｓｏｆ１－２）が得られ、Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅが持つ鱗被より有意に長い鱗被を形成したことから、変異の効果が確認された。しかしながら、この変異体は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅが持つ閉花型ｃｌｙ１．ｂ遺伝子の影響を受けて、超開花の形質を示す程度に十分な大きさの鱗被は形成しなかった。そこで、ｃｌｙ１．ｂ遺伝子の影響を排除することを目的に、この変異体を開花型Ｃｌｙ１．ａ遺伝子を持つオオムギ品種Ｓｖ７３５２８およびＡｄｏｒｒａと交配した。その結果、得られた個体の鱗被は、Ｓｖ７３５２８およびＡｄｏｒｒａよりも有意に長く、超開花の形質を示した。以上から、ｓｏｆ１遺伝子が超開花の形質の原因遺伝子であることが判明した。さらに、本発明者らは、他の植物における相同遺伝子の探索を行った結果、コムギにおいても、当該オオムギ遺伝子に対応する遺伝子の存在が判明し、超開花の形質を示す変異体の取得にも成功した。
【0011】
以上から、本発明者らは、Ｓｏｆ１遺伝子（変異体ｓｏｆ１遺伝子に対応する野生型遺伝子）の機能を抑制することにより、ムギの開花性を向上させることが可能であり、また、Ｓｏｆ１遺伝子の機能の抑制を指標にムギの開花性を評価することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
本発明は、より詳しくは、以下の態様を含む。
【0013】
［１］開花性が向上したムギの生産方法であって、ムギにおいて、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の機能を人為的に抑制することを含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
［２］下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の機能が人為的に抑制された、開花性が向上したムギ。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
［３］ムギの開花性を評価する方法であって、ムギにおける、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列を解析することを含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
［４］ムギの開花性を評価する方法であって、ムギにおける、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の発現を解析することを含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
［５］開花性が向上したムギを生産する方法であって、請求項２に記載のムギと他の任意のムギとを交配させることを含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
［２］下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の機能が人為的に抑制された、開花性が向上したムギ。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
［３］ムギの開花性を評価する方法であって、ムギにおける、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列を解析することを含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
［４］ムギの開花性を評価する方法であって、ムギにおける、下記（ａ）または（ｂ）の内因性遺伝子の発現を解析することを含む方法。
（ａ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
（ｂ）配列番号：２、５、８または１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする内因性遺伝子
［５］開花性が向上したムギを生産する方法であって、請求項２に記載のムギと他の任意のムギとを交配させることを含む方法。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、開花性が飛躍的に向上したムギを生産することが可能となる。当該ムギは、その鱗被が大きく膨張することにより、大きな開花角度を示す。この形質は、ムギの育種において花粉親に導入すれば花粉の飛散が容易となる一方、雄性不稔の種子親に導入すれば受粉が容易となる。これにより他家受粉による雑種種子の生産の効率を飛躍的に高めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】野生型ＯＵＨ６０２（ＷＴ）と突然変異体４４２０５（ＭＴ）の写真である。（Ａ）野生型ＯＵＨ６０２および（Ｂ）突然変異体４４２０５の小穂。（Ｃ）野生型ＯＵＨ６０２および（Ｄ）突然変異体４４２０５の開花直前の黄葯期の鱗被。（Ｅ）野生型ＯＵＨ６０２および（Ｆ）突然変異体４４２０５の小穂正面側から見た鱗被。（Ｇ）野生型ＯＵＨ６０２と（Ｈ）突然変異体４４２０５の小穂側面側から見た鱗被。
【図2】野生型ＯＵＨ６０２（ＷＴ）と突然変異体４４２０５（ＭＴ）のグラフ（図１の続き）である。（Ａ）開花角度、（Ｂ）鱗被の長さ、（Ｃ）鱗被の厚み、（Ｄ）鱗被の幅、（Ｅ）鱗被の細胞数、（Ｆ）鱗被の細胞の長さ。
【図3】ｓｏｆ１のマップベースクローニングを示す図である。（Ａ）ｓｏｆ１の高解像度遺伝地図。連鎖地図の線の上のマーカーの間の数字は、カバーされた組換え体の数を示す。（Ｂ）大規模なＦ２母集団を使用したｓｏｆ１のファインマッピング（ｎ＝１７５９）。（Ｃ）３．１Ｍｂの物理的領域で全ゲノムシーケンシングによって同定された変異を持つアノテーション付き遺伝子。矢印は、アノテーション付き遺伝子の転写の方向を示す。
【図4】ｓｏｆ１のマップベースクローニングを示す図（図３の続き）である。（Ａ）Ｓｏｆ１遺伝子の構造。両端のボックスは５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を表し、その間のボックスはコーディングエクソンを表し、細い線はイントロンを表す。ＡＴＧとＴＡＧは、それぞれ開始コドンと停止コドンを示す。破線は、変異体における２２ｂｐの欠失を示す。（Ｂ）ＳＯＦ１タンパク質の構造。各ボックス（１０４３－１３３４位、１３５９－１４７３位、１５８７－１６６１位）はＳＯＦ１のドメインを示す。
【図5】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した変異誘発によるＳｏｆ１機能の特性評価を示す図である。（Ａ）Ｓｏｆ１候補遺伝子（Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により生成された変異体の遺伝子構造の概略図。エクソンとイントロンは、それぞれボックスと線で示す。逆三角形は、遺伝子内のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の標的部位を示す。Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅ（ＧＰ）配列上の線は、ｇＲＮＡの標的部位とプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を示す。破線は、削除された塩基を示す。（Ｂ）編集されたＴ１系統と２つの非閉花型オオムギ栽培品種との間の交配に由来するＦ３植物における表現型同定のスキーム。括弧内は各世代の対象遺伝子型を示す。
【図6】野生型Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅ（ＧＰ）およびホモ接合Ｔ２変異系統の写真（上）および鱗被サイズのグラフ（下）である。グラフにおける各測定値は、統計分析用の９～１３個の鱗被の平均を表す。Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ。＊＊はＰ＜０．０１を、ｎｓは大きな違いはないことを示す。
【図7】２つの非閉花型栽培品種とそれらの対応するＦ３植物における、小花の開花角度の比較を示す写真（上）および鱗被サイズの比較を示す写真（下）である。
【図8】単子葉植物と双子葉植物のＳＯＦ１ホモログの系統発生分析を示す図である。ツリーは、ＳＯＦ１ホモログのポリペプチド配列のアラインメントに基づく近隣結合（ＮＪ）法によって構築した。枝に表示される数字は、ブートストラップの確率を示す。
【図9】野生型ＯＵＨ６０２（ＷＴ）と変異体４４２０５（ＭＴ）の間の栄養器官および生殖器官を伴う穂の発達におけるＳｏｆ１の転写産物量を示すグラフである。ＤＲ（二重隆起期／ｄｏｕｂｌｅ ｒｉｄｇｅ ｓｔａｇｅ）；ＴＭ（三重マウンド期／ｔｒｉｐｌｅ ｍｏｕｎｄ ｓｔａｇｅ）；ＧＰ（苞頴原基期／ｇｌｕｍｅ ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ ｓｔａｇｅ）；ＬＰ（護頴原基期／ｌｅｍｍａ ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ ｓｔａｇｅ）；ＳＰ（雄しべ原基期／ｓｔａｍｅｎ ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ ｓｔａｇｅ）；ＡＰ（芒原基期／ａｗｎ ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ ｓｔａｇｅ）；ＷＡ（白葯期／ｗｈｉｔｅ ａｎｔｈｅｒ ｓｔａｇｅ）；ＧＡ（緑葯期／Ｇｒｅｅｎ ａｎｔｈｅｒ ｓｔａｇｅ）；ＹＡ（黄葯期／ｙｅｌｌｏｗ ａｎｔｈｅｒ ｓｔａｇｅ）。ＤＡＧ（発芽後日数／ｄａｙ ａｆｔｅｒ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）。値は平均値±ＳＥ（ｎ＝３つの独立した生物学的複製）。統計的な有意の値は、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ検定によって計算した。＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１を、ｎｓは大きな違いがないことを示す。
【図10】野生型コムギ品種（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇ）におけるＳｏｆ１の転写産物量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0016】
＜開花性が向上したムギの生産方法＞
本発明において「開花性」とは、鱗被が膨張することにより開花角度が増加する形質を意味する。ムギ、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物の花序は、小穂と呼ばれる構造からなり、１つまたは複数の小花を含んでいる。それぞれの小花は生殖器（雄しべと雌しべ）で構成され、苞葉のような器官（外頴と内頴）のペアで覆われている。「鱗被」は、これら生殖器と穎の間に存在する。鱗被は一般に花びらに相当すると見なされており、鱗被は生殖器（雄しべと雌しべ）左右の基部に存在する。開花の直前に鱗被が急速に膨張すると、機械的に外頴と内頴を引き離し、裂けた葯から花粉が放出されやすくなり、その後柱頭が他家受粉をできるようになる（非閉花受粉性）。対照的に、鱗被が膨潤することができないと、花粉が閉じた小花の中に隠され、それによって自家受粉を引き起こす（閉花受粉性）。
本発明において「開花性」とは、鱗被が膨張することにより開花角度が増加する形質を意味する。ムギ、イネ、トウモロコシなどの単子葉植物の花序は、小穂と呼ばれる構造からなり、１つまたは複数の小花を含んでいる。それぞれの小花は生殖器（雄しべと雌しべ）で構成され、苞葉のような器官（外頴と内頴）のペアで覆われている。「鱗被」は、これら生殖器と穎の間に存在する。鱗被は一般に花びらに相当すると見なされており、鱗被は生殖器（雄しべと雌しべ）左右の基部に存在する。開花の直前に鱗被が急速に膨張すると、機械的に外頴と内頴を引き離し、裂けた葯から花粉が放出されやすくなり、その後柱頭が他家受粉をできるようになる（非閉花受粉性）。対照的に、鱗被が膨潤することができないと、花粉が閉じた小花の中に隠され、それによって自家受粉を引き起こす（閉花受粉性）。
【0017】
本発明において「開花性が向上する」とは、Ｓｏｆ１遺伝子の機能を人為的に抑制しない場合と比較して、開花角度が増加することを意味する。開花角度の増加は、好ましくは２°以上、さらに好ましくは５°以上、さらに好ましくは８°以上、特に好ましくは１０°以上である。開花角度は、穂の小花における外穎（穂軸から見て遠い側の穎）の縁に沿う線と内穎（穂軸から見て近い側の穎）の縁に沿う線が交わる角度として測定することができる。なお、開花角度は、ムギの種や品種により変動し得るが、例えば、野生型オオムギＯＵＨ６０２の開花角度は、通常、１０．２±２．２°である。
【0018】
本発明において開花性を向上させる対象となる「ムギ」とは、イネ科イチゴツナギ亜科に属するムギ類の植物全般を意味し、例えば、オオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバクが挙げられる。また野生種であってもよく、栽培種であってもよい。ムギが閉花型ｃｌｙ１遺伝子を保有している場合、Ｓｏｆ１遺伝子の機能の抑制の効果が生じ難くなることから、開花性を向上させる対象となる「ムギ」は、開花型ｃｌｙ１遺伝子を保有していることが好ましい。閉花型ｃｌｙ１遺伝子を保有しているムギを対象にＳｏｆ１遺伝子の機能を抑制した場合には、その後、開花型ｃｌｙ１遺伝子を保有しているムギとの交配やゲノム編集などによるｃｌｙ１遺伝子の閉花型から開花型への改変（例えば、ｍｉＲ１７２の特異的結合部位内の一塩基置換）などにより、閉花型ｃｌｙ１遺伝子による負の影響を排除することが可能である。
【0019】
本発明の方法は、Ｓｏｆ１遺伝子（ＳＯＦ１タンパク質をコードする内因性遺伝子）の機能を人為的に抑制することを含む。
【0020】
本発明における「Ｓｏｆ１遺伝子」は、ＳＷＩ／ＳＮＦサブファミリーに属し、クロマチンリモデリングＡＴＰａｓｅタンパク質をコードしていると推定される。変異タンパク質を発現するムギでは、鱗皮が膨張して開花性が向上することから、野生型タンパク質（ＳＯＦ１タンパク質）は、ムギの鱗皮の膨張を抑制する活性を有していると考えられる。
【0021】
オオムギのＳｏｆ１遺伝子の典型的なｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、ゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に、これらＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、コムギにおける典型的なｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：４、７、１０に、ゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：６、９、１２に、これらＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５、８、１１に示す。
【0022】
自然界においてはヌクレオチド配列に個体差が生じることがあり、また、現在の技術水準では、当業者は特定の遺伝子が得られた場合、その遺伝子のヌクレオチド配列情報を利用して、同種若しくは他の植物から、対応する遺伝子を同定することが可能である。従って、本発明におけるＳｏｆ１遺伝子には、その機能の抑制により開花性が向上する限り、これら相同遺伝子が含まれる。
【0023】
相同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、通常、前記特定の遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有する。ここで「高い相同性」とは、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
【0024】
配列の相同性は、ＢＬＡＳＴのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， （１９９０） ２１５：４０３－４１０）を利用して決定することができる。該プログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ． ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ．， （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：２２６４－２２６８、Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ． ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ．， （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：５８７３－５８７７）に基づいている。例えば、ＢＬＡＳＴによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ． ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５：３３８９－３４０２）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【0025】
これら相同遺伝子は、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｅ． Ｍ．， （１９７５） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ９８：５０３）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４、Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：４８７－４９１）を利用することにより取得することが可能である。
【0026】
本発明における「Ｓｏｆ１遺伝子の機能の抑制」には、その機能の完全な抑制（阻害）および部分的な抑制の双方が含まれる。また、ＳＯＦ１タンパク質の活性（例えば、鱗皮の膨張を抑制する活性）の抑制およびＳｏｆ１遺伝子の発現の抑制（転写の抑制および翻訳の抑制）の双方が含まれる。
【0027】
Ｓｏｆ１遺伝子の機能の抑制は、例えば、Ｓｏｆ１遺伝子やその発現制御領域（例えば、プロモーター領域）への変異の導入により行なうことができる。Ｓｏｆ１遺伝子に導入される変異としては、その機能を抑制する限り特に制限はなく、例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、および／または挿入が挙げられるが、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ヌル変異が好ましい。
【0028】
Ｓｏｆ１遺伝子に導入される変異の数は、その機能を抑制する限り特に制限はなく、１個でも複数個（例えば、２個、３個以下、５個以下、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下）でもよい。実際、本願実施例において、オオムギＳｏｆ１遺伝子におけるヌクレオチドの欠失（２２塩基の欠失［ｓｏｆ１変異体］、５塩基の欠失［ｓｏｆ１－２変異体］）がフレームシフトによりＣ末端側が短縮された変異タンパク質を生じさせ、その結果、オオムギの開花性が向上することが判明している。Ｓｏｆ１遺伝子がコードするＳＯＦ１タンパク質は、そのＮ末端側に２つの機能ドメイン（ＡＴＰａｓｅドメインおよびＳｎＡＣドメイン）が存在するが、これら機能ドメインが存在しないＣ末端側の変異によってもＳＯＦ１タンパク質の機能を喪失させることが可能である、したがって、Ｓｏｆ１遺伝子に導入される変異としては、当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列全部を失わせる必要はなく、その一部が失われるか変化するように当該遺伝子内に導入されてもよい。
【0029】
遺伝子の変異により発現するタンパク質の一部を欠失させる場合、ＳＯＦ１タンパク質の活性を抑制する観点から、好ましくは全体の５％以上、より好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上）の欠失である。
【0030】
Ｓｏｆ１遺伝子への変異の導入は、当業者であれば公知の方法により達成することができる。公知の方法としては、効率的に部位特異的な変異の導入が可能であることから、ゲノム編集法が好適である。
【0031】
ゲノム編集法は、部位特異的ヌクレアーゼを利用して、標的遺伝子を改変する方法である。部位特異的ヌクレアーゼとしては、例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成することにより部位特異性が付与されたＣａｓヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）などが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとしては、クラス２のＩＩ型のシステム（Ｃａｓとして、Ｃａｓ９を含む）、クラス２のＶ型のシステム（Ｃａｓとして、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１４などを含む）、クラス２のＶＩ型のシステム（Ｃａｓとして、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃなどを含む）、クラス１のＩ型のシステム（Ｃａｓとして、Ｃａｓ３を含む）など、様々なシステムを利用することができる。
【0032】
遺伝子への変異の導入を行うための他の方法としては、物理的変異導入法、化学的変異剤を用いる方法、トランスポゾンを利用する方法などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【0033】
物理的変異導入法としては、例えば、ガンマ線照射、重イオンビーム（ＨＩＢ）照射、速中性子線照射、紫外線照射が挙げられる（Ｈａｙａｓｈｉ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ， ２３７－２３９、Ｋａｚａｍａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２５：１１３－１１７）。
【0034】
化学的変異剤を用いる方法としては、例えば、化学変異剤によって種子などを処理する方法（ＺｗａｒおよびＣｈａｎｄｌｅｒ、Ｐｌａｎｔａ、１９９５年、１９７巻、３９～４８ページ）が挙げられる。化学変異剤としては特に制限はないが、例えば、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＭＮＵ）、エチルメタンスルホート（ＥＭＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＥＮＵ）、アジ化ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドリキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、蟻酸およびヌクレオチド類似体が挙げられる。
【0035】
トランスポゾンなどをゲノムＤＮＡに導入する方法としては、例えば、ＴＯＳ１７などのトランスポゾン、Ｔ－ＤＮＡなどを植物のゲノムＤＮＡに挿入する方法が挙げられる（Ｋｕｍａｒ， Ａ． ＆ Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ， Ｈ．， （２００１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．， ６（３）：１２７－１３４、Ｔａｍａｒａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ４（３）：９０－９６）。
【0036】
これらの方法を利用する場合は、通常、変異導入処理を行った個体群から、Ｓｏｆ１遺伝子に変異を有する個体を選抜する。
【0037】
Ｓｏｆ１遺伝子に変異が導入されたムギは、当該変異遺伝子のヘテロ接合体でありうる。この場合、ヘテロ接合体同士を交配してＦ１植物体を作成し、当該Ｆ１植物体から当該変異遺伝子のホモ接合体を選抜することができる。本発明において、超開花の形質の原因となるｓｏｆ１遺伝子（変異遺伝子）は、劣性遺伝子であることが判明している。従って、Ｓｏｆ１遺伝子への変異の導入によりムギの開花性を向上させるためには、ムギは、変異したＳｏｆ１遺伝子をホモで保持することが好ましい。なお、目的外の変異が導入されたムギは、例えば、野生型のムギを利用した戻し交配を行うことにより、目的外の変異を除去することができる。
【0038】
Ｓｏｆ１遺伝子の発現の抑制により当該遺伝子の機能を抑制する場合、Ｓｏｆ１遺伝子の発現制御領域への変異の導入の他、Ｓｏｆ１遺伝子の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ）をコードするＤＮＡを用いる方法、Ｓｏｆ１遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）を用いる方法、Ｓｏｆ１遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡを用いる方法（リボザイム法）など、Ｓｏｆ１遺伝子の転写産物を標的とする方法を利用することもできる。
【0039】
また、Ｓｏｆ１遺伝子の発現の抑制は、ヌクレオチドにおける変異を伴わない、エピジェネティック制御におけるヌクレオチドの修飾によっても行いうる。エピジェネティック制御としては、例えば、ＤＮＡのメチル化、ヒストンの化学的修飾（アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化など）が挙げられる。
【0040】
本発明において、Ｓｏｆ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための処理は、使用する技術の種類に応じて、ムギの植物体、器官、組織、または細胞に対して行うことができる。器官、組織、または細胞としては、例えば、種子、小胞子、花粉、未熟胚、葉の切片、懸濁培養細胞、プロトプラスト、カルス、生長点、幼穂などが挙げられる。
【0041】
Ｓｏｆ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための分子がＤＮＡにコードされる分子である場合（例えば、上記の部位特異的ヌクレアーゼをコードするＤＮＡ、トランスポゾンをコードするＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、リボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡなどである場合）、ベクターに挿入した形態でムギに導入してもよい。ベクターとしては、ムギの細胞内で挿入されたＤＮＡを発現させることが可能なものであれば特に制限はない。ベクターは、通常、前記ＤＮＡを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有する。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、オオムギのＵ３プロモーター、イネのユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーターなどが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、特定の化合物処理、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。
【0042】
Ｓｏｆ１遺伝子の機能を人為的に抑制するための分子のムギ細胞への導入には、例えば、アグロバクテリウムを介する方法（アグロバクテリウム法）、パーティクルボンバードメント法、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション）など、当業者に公知の方法を用いることができる。
【0043】
上記の方法によりＳｏｆ１遺伝子の機能が人為的に抑制された細胞が得られた場合、当該細胞からムギの植物体を再生することにより、開花性が向上したムギを得ることができる。ムギの形質転換植物体を作出する手法としては、Ｔｉｎｇａｙら（Ｔｉｎｇａｙ， Ｓ．ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １１：１３６９－１３７６）、Ｍｕｒｒａｙら（Ｍｕｒｒａｙ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ， ２２：３９７－４０２）、およびＴｒａｖａｌｌａら（Ｔｒａｖａｌｌａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ２３：７８０－７８９）に記載された方法を挙げることができる。また、Ｔａｂｅｉら（田部井豊 編、「形質転換プロトコール［植物編］」、株式会社化学同人、２０１２年９月２０日出版）に記載に方法を用いて、形質転換および植物体への再生を行なうことができる。
【0044】
一旦、Ｓｏｆ１遺伝子の機能が人為的に抑制されている植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。さらに、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に植物体を量産することも可能である。本発明は、こうして得られた、開花性が向上したムギの植物体、子孫、クローン、繁殖材料をも提供するものである。
【0045】
＜ムギの開花性を評価する方法＞
本発明の方法の一つの態様は、ムギにおけるＳｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列を解析することを含む。
本発明の方法の一つの態様は、ムギにおけるＳｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列を解析することを含む。
【0046】
Ｓｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列の解析に際しては、Ｓｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域をＰＣＲにより増幅した増幅産物を用いることができる。ＰＣＲを実施する場合において、用いられるプライマーは、Ｓｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域を特異的に増幅できるものである限り制限はなく、Ｓｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域の配列情報に基づいて適宜設計することができる。
【0047】
開花性の評価においては、「対照の塩基配列」と比較する工程を含むことができる。「対照の塩基配列」は、典型的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列（オオムギ）または配列番号：５、８、１１に記載のアミノ酸配列（コムギ）をコードする遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列である。
【0048】
決定した被検ムギにおけるＳｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列と、前記対照の塩基配列とを比較することにより、被検ムギにおいて開花性が向上する否かを評価することができる。例えば、前記対照の塩基配列と比較して、塩基配列において相違がある場合（特に、新たな終止コドンの出現やフレームシフトにより、コードするタンパク質の分子量やアミノ酸配列に大きな変化が生じる場合）、被検ムギは開花性が向上するムギである蓋然性が高いと評価される。
【0049】
塩基配列を解析するためのＤＮＡの調製は、常法、例えば、ＣＴＡＢ法により行うことができる。ＤＮＡを調製するためのムギとしては、成長した植物体のみならず、種子や幼植物体を用いることもできる。また、塩基配列の決定は、常法、例えば、ジデオキシ法やマキサム－ギルバート法などにより行なうことができる。塩基配列の決定においては、市販のシークエンスキットやシークエンサーを利用することができる。
【0050】
なお、被検ムギにおけるＳｏｆ１遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列が、対照の塩基配列と相違するか否かは、上記した直接的な塩基配列の決定以外に、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法などの公知の方法により間接的に解析することもできる。
【0051】
本発明の方法の他の一つの態様は、Ｓｏｆ１遺伝子の発現を解析することを含む。
【0052】
ここで「遺伝子の発現の解析」には、発現（転写、翻訳）の有無および程度の解析、並びに、発現産物の分子量の解析が含まれる。
【0053】
Ｓｏｆ１遺伝子の転写レベルにおける検出は、常法、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法、ＲＮＡ－ｓｅｑ法により実施することができる。前記ＰＣＲを実施する場合において用いられるプライマーは、本発明の検出対象ＤＮＡを特異的に増幅できるものである限り制限はなく、既に決定されたＳｏｆ１遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計することができる。また、翻訳レベルにおける検出は、常法、例えば、ウェスタンブロッティング法により実施することができる。ウェスタンブロッティングに用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これら抗体の調製方法は、当業者に周知である。
【0054】
遺伝子発現の検出の結果、被検ムギにおいて、Ｓｏｆ１遺伝子の発現量が、野生型Ｓｏｆ１遺伝子を保持する品種（例えば、オオムギではＯＵＨ６０２、コムギではＣｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇ）の発現量よりも有意に低ければ（例えば、Ｓｏｆ１遺伝子が実質的に発現していなければ）、開花性が向上するムギである蓋然性が高いと評価される。また、Ｓｏｆ１遺伝子の増幅産物または発現産物の分子量が、野生型Ｓｏｆ１遺伝子の発現産物の分子量と有意に異なれば、開花性が向上するムギである蓋然性が高いと評価される。
【0055】
＜開花性が向上したムギを生産する方法＞
本発明は、開花性が向上したムギを生産する方法を提供する。
本発明は、開花性が向上したムギを生産する方法を提供する。
【0056】
本発明の方法は、上記の開花性が向上したムギと他の任意のムギとを交配させることを含む。
【0057】
開花性が向上したムギと交配させる「他の任意のムギ」としては、例えば、Ｓｏｆ１遺伝子の機能が抑制されておらず超開花の形質を示さないムギの品種が挙げられるが、これに制限されない。交配により得られた個体の中から、上記の方法により、Ｓｏｆ１遺伝子の機能が抑制されたムギを選抜することができる。
【0058】
本発明の方法を利用すれば、開花性が向上したムギの品種を、種子や幼植物などの早期の段階で適宜選抜することが可能となり、当該形質を有する品種の育成を、短期間で行うことが可能となる。
【実施例0059】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0060】
Ａ．材料と方法
（１）植物材料
非閉花性野生オオムギ系統（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｕｂｓｐ． ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）のＯＵＨ６０２は、岡山大学植物科学資源研究所から入手した。ＯＵＨ６０２を幼苗から成長過程においてコバルト６０（６０Ｃｏ）ガンマ線の緩照射（１日あたり０．２４～０．７７Ｇｙ、１週間あたり５日間の照射）で処理した。超開花の表現型に基づいて、１６００のＭ２個体に由来するＭ３系統からＯＵＨ６０２突然変異体（系統番号：４４２０５）を選抜した。遺伝子解析のために、ＯＵＨ６０２突然変異体は栽培品種「Ｍｏｒｅｘ」と交配し、マッピング集団を作成した。植物育成は、網室（自然光かつ温度制御されていない）もしくは、空調温室（２４℃に維持された）の中で、１植物／４Ｌポットで実施した。
（１）植物材料
非閉花性野生オオムギ系統（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｕｂｓｐ． ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ）のＯＵＨ６０２は、岡山大学植物科学資源研究所から入手した。ＯＵＨ６０２を幼苗から成長過程においてコバルト６０（６０Ｃｏ）ガンマ線の緩照射（１日あたり０．２４～０．７７Ｇｙ、１週間あたり５日間の照射）で処理した。超開花の表現型に基づいて、１６００のＭ２個体に由来するＭ３系統からＯＵＨ６０２突然変異体（系統番号：４４２０５）を選抜した。遺伝子解析のために、ＯＵＨ６０２突然変異体は栽培品種「Ｍｏｒｅｘ」と交配し、マッピング集団を作成した。植物育成は、網室（自然光かつ温度制御されていない）もしくは、空調温室（２４℃に維持された）の中で、１植物／４Ｌポットで実施した。
【0061】
（２）鱗被サイズの表現型と開花角度の評価
１系統あたり３つのスパイク（止め葉がまだ花柄に付着している状態）をランダムに選択し、その中で各スパイクの中央部分から小花（開花直前の黄色い葯の段階）を採取した。小花から外頴をとり除いた後に、文献（上記非特許文献２）の記載に従って、顕微鏡Ａｘｉｏ Ｚｏｏｍ ｖ１６（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、東京、日本）で鱗被を撮影した。デジタル画像を基に、Ｍａｋｉｊａｋｕソフトウェアｖ１．１（ｈｔｔｐ：／／ｌｂｍ．ａｂ．ａ．ｕ－ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／～ｉｗａｔａ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｍａｋｉｊａｋｕ／）を使用し、鱗被の長さ、厚み、幅を測定した。
１系統あたり３つのスパイク（止め葉がまだ花柄に付着している状態）をランダムに選択し、その中で各スパイクの中央部分から小花（開花直前の黄色い葯の段階）を採取した。小花から外頴をとり除いた後に、文献（上記非特許文献２）の記載に従って、顕微鏡Ａｘｉｏ Ｚｏｏｍ ｖ１６（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、東京、日本）で鱗被を撮影した。デジタル画像を基に、Ｍａｋｉｊａｋｕソフトウェアｖ１．１（ｈｔｔｐ：／／ｌｂｍ．ａｂ．ａ．ｕ－ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／～ｉｗａｔａ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｍａｋｉｊａｋｕ／）を使用し、鱗被の長さ、厚み、幅を測定した。
【0062】
また、野生型と変異体についてランダムに選んだ穂の小花（開花直後：黄葯期）の写真を撮影し、外穎（穂軸から見て遠い側の穎）の縁に沿う線と内穎（穂軸から見て近い側の穎）の縁に沿う線が交わる角度を、Ｍａｋｉｊａｋｕ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．１（ｈｔｔｐ：／／ｌｂｍ．ａｂ．ａ．ｕ－ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／～ｉｗａｔａ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｍａｋｉｊａｋｕ／）を使用して測定し、これを開花角度とした。
【0063】
（３）鱗被細胞の測定
３０％アクリルアミドゲルに鱗被を包埋した後、Ｌｉｎｅａｒ Ｓｌｉｃｅｒ ＰＲＯ１０（Ｄｏｓａｋａ ＥＭ）を使用して１５０μｍの厚さに切断し、０．０１％の蛍光増白剤２８（Ｓｉｇｍａ）で染色した。画像は、ＺＥＮ ２００９ Ｌｉｇｈｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ ＣＬＳＭソフトウェアを搭載したレーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ７００、カールツァイス）を使用して撮影した。鱗被細胞の測定においては、鱗被の厚みに基づく細胞数を数え、鱗被の厚みを細胞数で割って細胞の大きさを算出した。遺伝子型ごとに平均１０個のサンプルを測定した。
３０％アクリルアミドゲルに鱗被を包埋した後、Ｌｉｎｅａｒ Ｓｌｉｃｅｒ ＰＲＯ１０（Ｄｏｓａｋａ ＥＭ）を使用して１５０μｍの厚さに切断し、０．０１％の蛍光増白剤２８（Ｓｉｇｍａ）で染色した。画像は、ＺＥＮ ２００９ Ｌｉｇｈｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ ＣＬＳＭソフトウェアを搭載したレーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ７００、カールツァイス）を使用して撮影した。鱗被細胞の測定においては、鱗被の厚みに基づく細胞数を数え、鱗被の厚みを細胞数で割って細胞の大きさを算出した。遺伝子型ごとに平均１０個のサンプルを測定した。
【0064】
（４）マーカー開発
ラフマッピングにおけるＳＮＰ遺伝子型決定のために、オオムギ栽培品種スカイゴールデンおよびオオムギ栽培品種とちのいぶきのゲノム配列の一塩基多型（ＳＮＰ）に基づいて、ｆｌｕｉｄｉｇｍマーカーを開発した。高解像度の遺伝子マッピングのために、ＲＡＤマーカーＦＢ０２７８およびＦＢ００８８の周囲で、同定したＳＮＰを識別するＣＡＰＳ（ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）マーカーを追加で開発した。これらの特定の多型部位はＰＣＲ分析によって検出し、さらにＰＣＲ産物は、文献（Ｓａｋｕｍａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １０：１２３－１３３）に従って配列決定し、制限酵素ベースのＣＡＰＳ解析によって同定した。ＤＤＢＪデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）から入手したＭｏｒｅｘ品種（アクセッション番号ＥＲＲ２７１７０５）とＯＵＨ６０２（アクセッション番号ＥＲＲ２７１７３７）の２つのエクソーム配列を比較することにより、合計１１のＣＡＰＳマーカーを開発した。加えて、ＩｎＤｅｌｓ（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ－ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）マーカーは、変異体４４２０５の全ゲノムシーケンスで識別した２２ｂｐの欠失に対して開発した。開発した全てのマーカーは、マッピング集団の系統をスクリーニングするために使用した。
ラフマッピングにおけるＳＮＰ遺伝子型決定のために、オオムギ栽培品種スカイゴールデンおよびオオムギ栽培品種とちのいぶきのゲノム配列の一塩基多型（ＳＮＰ）に基づいて、ｆｌｕｉｄｉｇｍマーカーを開発した。高解像度の遺伝子マッピングのために、ＲＡＤマーカーＦＢ０２７８およびＦＢ００８８の周囲で、同定したＳＮＰを識別するＣＡＰＳ（ｃｌｅａｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）マーカーを追加で開発した。これらの特定の多型部位はＰＣＲ分析によって検出し、さらにＰＣＲ産物は、文献（Ｓａｋｕｍａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １０：１２３－１３３）に従って配列決定し、制限酵素ベースのＣＡＰＳ解析によって同定した。ＤＤＢＪデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）から入手したＭｏｒｅｘ品種（アクセッション番号ＥＲＲ２７１７０５）とＯＵＨ６０２（アクセッション番号ＥＲＲ２７１７３７）の２つのエクソーム配列を比較することにより、合計１１のＣＡＰＳマーカーを開発した。加えて、ＩｎＤｅｌｓ（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ－ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）マーカーは、変異体４４２０５の全ゲノムシーケンスで識別した２２ｂｐの欠失に対して開発した。開発した全てのマーカーは、マッピング集団の系統をスクリーニングするために使用した。
【0065】
（５）ｓｏｆ１の遺伝地図
オオムギＦ２集団は、変異体４４２０５をＭｏｒｅｘと交配することによって開発した。
２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）で穂を処理する最大化スパイク培養法（Ｈｏｎｄａ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ， １２４：５２４－５３１）を適用して鱗被のサイズを調査した。非開花受粉性はその鱗被の大小（非閉花と閉花）と完全に一致することが知られており（Ｎａｉｒ， Ｓ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １０７（１）： ４９０－４９５）、閉花受粉型の全ての系統に２，４－Ｄ（３０ｐｐｍ）を添加しても開花が一切認められず、一方、開花受粉型の系統の鱗被は処理する前と比較して、平均して横幅が約１．５倍に、厚み（外頴に対し垂直方向）が約２．３倍に膨らんだ。
オオムギＦ２集団は、変異体４４２０５をＭｏｒｅｘと交配することによって開発した。
２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）で穂を処理する最大化スパイク培養法（Ｈｏｎｄａ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ， １２４：５２４－５３１）を適用して鱗被のサイズを調査した。非開花受粉性はその鱗被の大小（非閉花と閉花）と完全に一致することが知られており（Ｎａｉｒ， Ｓ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １０７（１）： ４９０－４９５）、閉花受粉型の全ての系統に２，４－Ｄ（３０ｐｐｍ）を添加しても開花が一切認められず、一方、開花受粉型の系統の鱗被は処理する前と比較して、平均して横幅が約１．５倍に、厚み（外頴に対し垂直方向）が約２．３倍に膨らんだ。
【0066】
最初のマッピングには、４０個の植物（２０のＷＴと２０の突然変異体タイプ）を選択した。４０個体のＦ２植物は、ｄｄＲＡＤ－ｓｅｑ（Ｄｏｕｂｌｅ Ｄｉｇｅｓｔ ＲＡＤ－ｓｅｑ）を使用して遺伝子型を決定した。ラフマッピングでは、９３個体のＦ２でｆｌｕｉｄｉｇｍマーカーを使用したジェノタイピングを行った。リンケージマップは、ＡｎｔＭａｐバージョン１．２（Ｉｗａｔａ， Ｈ． ＆ Ｎｉｎｏｍｉｙａ， Ｓ． （２００６） Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ５６ ：３７１－３７７）を使用して作成した。次に、９３個体のＦ２の開花表現型を決定し、前述のＣＡＰＳマーカーを使用して遺伝子型を決定した。ファインマッピングでは、変異体とＭｏｒｅｘの間のＦ２分離について、ＨＭ７Ｈ２２８７００とＨＭ７Ｈ２５４０００の２つの隣接マーカーで遺伝子型の決定を行った。これらの２つのマーカーで同定された組換え体の遺伝子型は、ＨＭ７Ｈ２２８７００－ＨＭ７Ｈ２５４０００のゲノム領域内で開発した他のＣＡＰＳマーカーによって決定した。ｓｏｆ１遺伝子座の正確な判定のため、鍵となるＦ２組換え体は、ＩｎＤｅｌマーカー（ＨＭ７Ｈ２３８１００－Ｉｎｄｅｌ）でさらに遺伝子型を決定し、それらの後代のＦ３組換え体（２０個体）もＩｎＤｅｌマーカーで遺伝子型を特定し、鱗被のサイズの表現型を確認した。
【0067】
（６）ｓｏｆ１候補を含むゲノム領域の変異部位の同定
ＤＮｅａｓｙ植物抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、突然変異体４４２０５のＭ３世代植物の新鮮な幼苗の葉からＤＮＡを抽出した。ペアエンドシーケンス（１５０ｂｐ）用のＤＮＡライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ ＰＣＲフリーのサンプル調製キット（イルミナ）を使用して構築した。ＤＮＡシーケンスは、イルミナＨｉＳｅｑＸＴｅｎプラットフォームで実行した。野生型ＯＵＨ６０２のデータ配列は、ＮＣＢＩ Ｓｈｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＳＲＡ）データベース（アクセッションＥＲＸ５４７１６７５；Ｓａｔｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， （２０２１） Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｗｉｌｄ ｂａｒｌｅｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ “ＯＵＨ６０２”． Ｇ３ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ）． ２７；１１（１０））からダウンロードした。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃバージョン０．３９（Ｂｏｌｇｅｒ， ＡＭ． ｅｔ ａｌ．， （２０１４） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １；３０（１５）：２１１４－２１２０）でトリミングした後、野生型と変異体の配列を、Ｂｏｗｔｉｅ２バージョン２．３．５．１（Ｌａｎｇｍｅａｄ Ｂ． ＆ Ｓａｌｚｂｅｒｇ ＳＬ．， （２０１２） Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ４；９（４）：３５７－３５９）を使用して、野生オオムギＯＵＨ６０２リファレンスゲノム（２００７２０＿ＯＵＨ６０２＿ｐｓｅｕｄｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＿ｖ１．ｆａｓｔａ；Ｓａｔｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， （２０２１） Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）， ２７；１１（１０））に対してそれぞれアラインメントした。ゲノム配列のバリアントコールは、ＳＡＭｔｏｏｌｓバージョン１．１０（Ｌｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １５；２５（１６）：２０７８－２０７９）を使用した（マッピングスコア３０、塩基スコア２０以上、ｐｈｒｅｄスコア閾値４０）。ガンマ線照射は、ヌクレオチドの欠失と置換の両方を誘発すると予想されるため、カバレッジ深度の分析を使用して、バリアント呼び出しでは検出されなかった欠失を特定した。各位置でのバリアントの読み取り深度は、ＢＣＦｔｏｏｌｓ（Ｌｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １；２７：２９８７－２９９３）によって計算した。読み取り深度に１０のしきい値を適用することにより、バリアントをさらにフィルタリングした。ｓｏｆ１候補領域で同定された変異体の位置は、Ｍｏｒｅｘゲノムの遺伝子アノテーション（Ｍｏｒｅｘ．ｇｆｆ．ｇｚ；Ｊａｙａｋｏｄｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０２０） Ｎａｔｕｒｅ， ５８８（７８３７）：２８４－２８９）と交差していた。バリアント効果は、ＳｎｐＥｆｆ（Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， （２０１２） Ｆｌｙ（Ａｕｓｔｉｎ）， ６（２）：８０－９２）を使用して予測した。
ＤＮｅａｓｙ植物抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、突然変異体４４２０５のＭ３世代植物の新鮮な幼苗の葉からＤＮＡを抽出した。ペアエンドシーケンス（１５０ｂｐ）用のＤＮＡライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ ＰＣＲフリーのサンプル調製キット（イルミナ）を使用して構築した。ＤＮＡシーケンスは、イルミナＨｉＳｅｑＸＴｅｎプラットフォームで実行した。野生型ＯＵＨ６０２のデータ配列は、ＮＣＢＩ Ｓｈｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＳＲＡ）データベース（アクセッションＥＲＸ５４７１６７５；Ｓａｔｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， （２０２１） Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｗｉｌｄ ｂａｒｌｅｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ “ＯＵＨ６０２”． Ｇ３ （Ｂｅｔｈｅｓｄａ）． ２７；１１（１０））からダウンロードした。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃバージョン０．３９（Ｂｏｌｇｅｒ， ＡＭ． ｅｔ ａｌ．， （２０１４） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １；３０（１５）：２１１４－２１２０）でトリミングした後、野生型と変異体の配列を、Ｂｏｗｔｉｅ２バージョン２．３．５．１（Ｌａｎｇｍｅａｄ Ｂ． ＆ Ｓａｌｚｂｅｒｇ ＳＬ．， （２０１２） Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ４；９（４）：３５７－３５９）を使用して、野生オオムギＯＵＨ６０２リファレンスゲノム（２００７２０＿ＯＵＨ６０２＿ｐｓｅｕｄｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＿ｖ１．ｆａｓｔａ；Ｓａｔｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， （２０２１） Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）， ２７；１１（１０））に対してそれぞれアラインメントした。ゲノム配列のバリアントコールは、ＳＡＭｔｏｏｌｓバージョン１．１０（Ｌｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １５；２５（１６）：２０７８－２０７９）を使用した（マッピングスコア３０、塩基スコア２０以上、ｐｈｒｅｄスコア閾値４０）。ガンマ線照射は、ヌクレオチドの欠失と置換の両方を誘発すると予想されるため、カバレッジ深度の分析を使用して、バリアント呼び出しでは検出されなかった欠失を特定した。各位置でのバリアントの読み取り深度は、ＢＣＦｔｏｏｌｓ（Ｌｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １；２７：２９８７－２９９３）によって計算した。読み取り深度に１０のしきい値を適用することにより、バリアントをさらにフィルタリングした。ｓｏｆ１候補領域で同定された変異体の位置は、Ｍｏｒｅｘゲノムの遺伝子アノテーション（Ｍｏｒｅｘ．ｇｆｆ．ｇｚ；Ｊａｙａｋｏｄｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０２０） Ｎａｔｕｒｅ， ５８８（７８３７）：２８４－２８９）と交差していた。バリアント効果は、ＳｎｐＥｆｆ（Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， （２０１２） Ｆｌｙ（Ａｕｓｔｉｎ）， ６（２）：８０－９２）を使用して予測した。
【0068】
（７）ｓｏｆ１遺伝子座のゲノム配列解読
２週間生育させた幼苗の葉からゲノムＤＮＡを抽出した。ｇＤＮＡの質と量は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して評価した。サンガーシーケンシングの場合、ＰＣＲ増幅およびシーケンシングに使用されるプライマーは、ＮＣＢＩ／Ｐｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ－ｂｌａｓｔ／）を使用して設計し、合成した。ｓｏｆ１遺伝子座の２０ｋｂのゲノム領域は、合計５つのアンプリコンに対する約５ｋｂのオーバーラップアンプリコンに分割し、アンプリコン当たり少なくとも２０のシーケンス反応を行った。各アンプリコンは、製造元の指示に従って、忠実度の高い酵素であるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を使用して増幅した。総量５０μｌの増幅反応は、１００ｎｇのゲノムＤＮＡテンプレート、１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬバッファー、２００μＭのｄＮＴＰ、０．３μＭの各プライマー、２．５ユニットのＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡポリメラーゼで構成した。ＰＣＲプログラムは、「９８℃／１０秒、５５または６０℃（プライマー依存）／１５秒、６８℃／４～５分」の３０サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１テクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用してサイクルシーケンスを行った。各シーケンシング反応は、９６℃／１分の初期変性と、それに続く、「９６℃／１０秒、５０℃／５秒、６０℃／４分」の２５サイクルで構成した。反応産物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＣｌｅａｎＳＥＱシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ）で精製し、ＡＢＩプリズム３１３０または３７３０ｘＬ遺伝子分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。ゲノム配列は、Ｓｅｑｍａｎバージョン７．１．０（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して整列した。
２週間生育させた幼苗の葉からゲノムＤＮＡを抽出した。ｇＤＮＡの質と量は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して評価した。サンガーシーケンシングの場合、ＰＣＲ増幅およびシーケンシングに使用されるプライマーは、ＮＣＢＩ／Ｐｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ－ｂｌａｓｔ／）を使用して設計し、合成した。ｓｏｆ１遺伝子座の２０ｋｂのゲノム領域は、合計５つのアンプリコンに対する約５ｋｂのオーバーラップアンプリコンに分割し、アンプリコン当たり少なくとも２０のシーケンス反応を行った。各アンプリコンは、製造元の指示に従って、忠実度の高い酵素であるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を使用して増幅した。総量５０μｌの増幅反応は、１００ｎｇのゲノムＤＮＡテンプレート、１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬバッファー、２００μＭのｄＮＴＰ、０．３μＭの各プライマー、２．５ユニットのＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡポリメラーゼで構成した。ＰＣＲプログラムは、「９８℃／１０秒、５５または６０℃（プライマー依存）／１５秒、６８℃／４～５分」の３０サイクルで実施した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１テクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用してサイクルシーケンスを行った。各シーケンシング反応は、９６℃／１分の初期変性と、それに続く、「９６℃／１０秒、５０℃／５秒、６０℃／４分」の２５サイクルで構成した。反応産物は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＣｌｅａｎＳＥＱシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ）で精製し、ＡＢＩプリズム３１３０または３７３０ｘＬ遺伝子分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。ゲノム配列は、Ｓｅｑｍａｎバージョン７．１．０（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して整列した。
【0069】
（８）ｓｏｆ１のコーディング領域のゲノム配列の決定
全ＲＮＡは、製造元のプロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、芒原基期の発達中のスパイクから抽出した。抽出したＲＮＡをＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ）で処理し、ゲノムＤＮＡのコンタミネーションを除去した。ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して定量した。ＤＮａｓｅ処理した、各サンプルの全ＲＮＡ １μｇを用いて逆転写を行い、オリゴｄＴでプライミングしたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ｓｏｆ１のコード配列を増幅し、設計したプライマーを使用して５つのアンプリコンとして配列決定した。５０μｌのＰＣＲ反応の各容量には、２０ｎｇのテンプレート、１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬバッファー、２００μＭのｄＮＴＰ、０．３μＭの各プライマー、２．５ユニットのＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡポリメラーゼが含まれた。ＰＣＲプログラムは、「９８℃／１０秒、５５または６０℃（プライマー依存）／５秒、６８℃／１～４分」の３０サイクルで構成した。反応生成物の精製、配列決定および整列は、上記の通りである。
全ＲＮＡは、製造元のプロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、芒原基期の発達中のスパイクから抽出した。抽出したＲＮＡをＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ）で処理し、ゲノムＤＮＡのコンタミネーションを除去した。ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して定量した。ＤＮａｓｅ処理した、各サンプルの全ＲＮＡ １μｇを用いて逆転写を行い、オリゴｄＴでプライミングしたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ｓｏｆ１のコード配列を増幅し、設計したプライマーを使用して５つのアンプリコンとして配列決定した。５０μｌのＰＣＲ反応の各容量には、２０ｎｇのテンプレート、１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬバッファー、２００μＭのｄＮＴＰ、０．３μＭの各プライマー、２．５ユニットのＰｒｉｍｅＳＴＡＲＧＸＬＤＮＡポリメラーゼが含まれた。ＰＣＲプログラムは、「９８℃／１０秒、５５または６０℃（プライマー依存）／５秒、６８℃／１～４分」の３０サイクルで構成した。反応生成物の精製、配列決定および整列は、上記の通りである。
【0070】
（９）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した方法によるゲノム編集
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、オオムギのＳｏｆ１遺伝子の標的変異誘発に使用した。３つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ１：５’－ＴＧＣＡＴＣＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧ－３’／配列番号：１３、ｇＲＮＡ２：５’－ＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＣＡＧ－３’／配列番号：１４およびｇＲＮＡ４：５’－ＡＣＣＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＡＧ－３’／配列番号：１５）は、ＷＵ－ＣＲＩＳＰＲ Ｗｅｂサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒｄｂ．ｏｒｇ／ｗｕ－ｃｒｉｓｐｒ／；Ｗｏｎｇ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， （２０１５） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １６：２１８）を用いて設計した。各ｇＲＮＡ配列の相補的オリゴＤＮＡのペアは、ｐＵ６ｇＲＮＡ－ｏｌｉｇｏ（Ａｂｅ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， （２０１９） Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２８：１３６２－１３６９）のイネＯｓＵ６プロモーターをオオムギＨｖＵ３に置き換えることによって構築したｐＨｖＵ３－１５およびｐＨｖＵ３－２１（それぞれＬＣ６７２６１４およびＬＣ６７２６１３）のＢｂｓＩ切断部位に挿入した。次に、ｇＲＮＡの発現カセットとｐＨｖＵ３－１５／２１のｓｃａｆｆｏｌｄ配列をＰａｃＩとＡｓｃＩで切り出した。同時に、Ｃａｓ９およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現カセットを含む目的のバイナリーベクターｐＺＨ＿ｇＹＳＡ＿ＰｕｂｉＭＭＣａｓ９を同じ制限酵素で消化して、ｇＲＮＡ発現カセットを導入した（Ｍｉｋａｍｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０１５） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｕｙ， ８８：５６１－５７２）。ｐＺＨ－ＨｖＵ３－１５：ｇＲＮＡ１、ｐＺＨ－ＨｖＵ３－１５：ｇＲＮＡ２、ｐＺＨ－ＨｖＵ３－１５：ｇＲＮＡ４、ｐＺＨ－ＨｖＵ３－２１：ｇＲＮＡ２と命名した４つの構築されたベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＧＬ１株に形質転換した。それらは、文献（Ｈｉｓａｎｏ， Ｈ． ＆ Ｓａｔｏ， Ｋ．， （２０１６） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ６：３７５０５）に記載の方法に従って、アグロバクテリウムを介してオオムギの形質転換に使用した。再生した植物におけるＳｏｆ１遺伝子の標的配列の変異を確認するために、特定のプライマーペアを使用してＰＣＲアンプリコンのサンガーシーケンシングを行った。５’－ＡＧＣＡＴＴＧＣＡＣＡＣＴＡＡＴＴＣＴＧＧ－３’／配列番号：１６および５’－ＡＧＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＧＧＧＡＡＧＡＧ－３’／配列番号：１７（ｇＲＮＡ１の場合）、ＣＧＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧ－３’／配列番号：１８および５’－ＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧ－３’／配列番号：１９（ｇＲＮＡ２の場合）、５’－ＡＣＴＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＣ－３’／配列番号：２０および５’－ＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧ－３’／配列番号：２１（ｇＲＮＡ４の場合）。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ、配列決定の条件は、文献（Ｈｉｓａｎｏ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （２０２２） Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０：３７－４６）に記載の方法に従った。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、オオムギのＳｏｆ１遺伝子の標的変異誘発に使用した。３つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ１：５’－ＴＧＣＡＴＣＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧ－３’／配列番号：１３、ｇＲＮＡ２：５’－ＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＣＡＧ－３’／配列番号：１４およびｇＲＮＡ４：５’－ＡＣＣＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＡＧ－３’／配列番号：１５）は、ＷＵ－ＣＲＩＳＰＲ Ｗｅｂサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒｄｂ．ｏｒｇ／ｗｕ－ｃｒｉｓｐｒ／；Ｗｏｎｇ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， （２０１５） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １６：２１８）を用いて設計した。各ｇＲＮＡ配列の相補的オリゴＤＮＡのペアは、ｐＵ６ｇＲＮＡ－ｏｌｉｇｏ（Ａｂｅ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， （２０１９） Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２８：１３６２－１３６９）のイネＯｓＵ６プロモーターをオオムギＨｖＵ３に置き換えることによって構築したｐＨｖＵ３－１５およびｐＨｖＵ３－２１（それぞれＬＣ６７２６１４およびＬＣ６７２６１３）のＢｂｓＩ切断部位に挿入した。次に、ｇＲＮＡの発現カセットとｐＨｖＵ３－１５／２１のｓｃａｆｆｏｌｄ配列をＰａｃＩとＡｓｃＩで切り出した。同時に、Ｃａｓ９およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現カセットを含む目的のバイナリーベクターｐＺＨ＿ｇＹＳＡ＿ＰｕｂｉＭＭＣａｓ９を同じ制限酵素で消化して、ｇＲＮＡ発現カセットを導入した（Ｍｉｋａｍｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０１５） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｕｙ， ８８：５６１－５７２）。ｐＺＨ－ＨｖＵ３－１５：ｇＲＮＡ１、ｐＺＨ－ＨｖＵ３－１５：ｇＲＮＡ２、ｐＺＨ－ＨｖＵ３－１５：ｇＲＮＡ４、ｐＺＨ－ＨｖＵ３－２１：ｇＲＮＡ２と命名した４つの構築されたベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＧＬ１株に形質転換した。それらは、文献（Ｈｉｓａｎｏ， Ｈ． ＆ Ｓａｔｏ， Ｋ．， （２０１６） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ６：３７５０５）に記載の方法に従って、アグロバクテリウムを介してオオムギの形質転換に使用した。再生した植物におけるＳｏｆ１遺伝子の標的配列の変異を確認するために、特定のプライマーペアを使用してＰＣＲアンプリコンのサンガーシーケンシングを行った。５’－ＡＧＣＡＴＴＧＣＡＣＡＣＴＡＡＴＴＣＴＧＧ－３’／配列番号：１６および５’－ＡＧＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＧＧＧＡＡＧＡＧ－３’／配列番号：１７（ｇＲＮＡ１の場合）、ＣＧＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧ－３’／配列番号：１８および５’－ＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧ－３’／配列番号：１９（ｇＲＮＡ２の場合）、５’－ＡＣＴＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＣ－３’／配列番号：２０および５’－ＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧ－３’／配列番号：２１（ｇＲＮＡ４の場合）。ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ、配列決定の条件は、文献（Ｈｉｓａｎｏ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （２０２２） Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０：３７－４６）に記載の方法に従った。
【0071】
（１０）系統発生分析
タンパク質のアミノ酸配列は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＥＧＡ）バージョン７．０ソフトウェアパッケージ（Ｋｕｍａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， （２０１６） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， ３３：１８７０－１８７４）に実装されているＣｌｕｓｔａｌＷプログラムのデフォルトパラメーターを使用して整列し、１０００回のブートストラップ複製でサポートされる近隣結合（ＮＪ）に基づいて系統樹を構築した。系統樹に示した、アラビドプシスおよび他の種の相同体の遺伝子ＩＤまたはシンボルは、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｐｌａｎｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｎｔｓ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｍｕｌｔｉ／Ｔｏｏｌｓ／Ｂｌａｓｔ／）から取得し、対応するタンパク質ＩＤは、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）ＢＬＡＳＴｐ検索に基づいた。
タンパク質のアミノ酸配列は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＥＧＡ）バージョン７．０ソフトウェアパッケージ（Ｋｕｍａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， （２０１６） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， ３３：１８７０－１８７４）に実装されているＣｌｕｓｔａｌＷプログラムのデフォルトパラメーターを使用して整列し、１０００回のブートストラップ複製でサポートされる近隣結合（ＮＪ）に基づいて系統樹を構築した。系統樹に示した、アラビドプシスおよび他の種の相同体の遺伝子ＩＤまたはシンボルは、Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｐｌａｎｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｎｔｓ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｍｕｌｔｉ／Ｔｏｏｌｓ／Ｂｌａｓｔ／）から取得し、対応するタンパク質ＩＤは、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）ＢＬＡＳＴｐ検索に基づいた。
【0072】
（１１）定量的ＰＣＲ解析による発現解析
幼穂は、文献（Ｋｉｒｂｙ， Ｅ． Ｊ． Ｍ． ＆ Ａｐｐｌｅｙａｒｄ， Ｍ．， （１９８１） Ｃｅｒｅａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｇｕｉｄｅ， Ｃｅｒｅａｌ Ｕｎｉｔ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｅｎｔｒｅ． Ｓｔｏｎｅｌｅｉｇｈ， Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ， Ｗａｒｗｉｃｋｓｈｉｒｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ．）のガイドラインに従って、実体顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｚｏｏｍ ｖ１．６、Ｚｅｉｓｓ）を使用して、二重隆起期（栄養成長期から生殖成長期へ相転換後の花序メリステムから形成される最初の構造で、小穂の隆起と葉の隆起から構成される）から開花までの１０の発達段階で収集した。幼穂、緑の葯の段階での花の器官（鱗被，外頴，内頴，葯，雌蕊，包頴，芒を含む）、発芽後７日での幼苗の根と葉、および芒原基期の葉鞘、葉身、節、節間について、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。
幼穂は、文献（Ｋｉｒｂｙ， Ｅ． Ｊ． Ｍ． ＆ Ａｐｐｌｅｙａｒｄ， Ｍ．， （１９８１） Ｃｅｒｅａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｇｕｉｄｅ， Ｃｅｒｅａｌ Ｕｎｉｔ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｅｎｔｒｅ． Ｓｔｏｎｅｌｅｉｇｈ， Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ， Ｗａｒｗｉｃｋｓｈｉｒｅ， Ｅｎｇｌａｎｄ．）のガイドラインに従って、実体顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｚｏｏｍ ｖ１．６、Ｚｅｉｓｓ）を使用して、二重隆起期（栄養成長期から生殖成長期へ相転換後の花序メリステムから形成される最初の構造で、小穂の隆起と葉の隆起から構成される）から開花までの１０の発達段階で収集した。幼穂、緑の葯の段階での花の器官（鱗被，外頴，内頴，葯，雌蕊，包頴，芒を含む）、発芽後７日での幼苗の根と葉、および芒原基期の葉鞘、葉身、節、節間について、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。
【0073】
ゲノムＤＮＡ切断、定量化、逆転写、およびｃＤＮＡ合成は、上記の通り実施した（ｓｏｆ１ｃＤＮＡのシーケンスの部分を参照）。１０ｎｇの全ＲＮＡに由来する第一鎖ｃＤＮＡを、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のテンプレートとして使用した。ｑＰＣＲは、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）とＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（東洋紡）を使用して、プロトコールに従って実行した。各ターゲット遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲデータは、それぞれ生物試料による３反復（１反復あたり３回）のＰＣＲ反応を行い、平均発現レベルを示した。オオムギアクチン遺伝子（アクセッション番号ＤＮ１８２５００）は、Ｓａｋｕｍａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， （２０１７） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １７５（４）：１７２０－１７３１）に記載された方法に従って、各サンプルの発現レベルを正規化するための内因性コントロールとして使用した。相対的な遺伝子発現は、２－ΔＣｔ法を使用して分析した。
【0074】
（１２）ＲＮＡ－ｓｅｑプロファイリング
ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）に使用される植物は、空調温室で育てた。幼穂組織は、野生型ＯＵＨ６０２と変異体４４２０５から、栄養生長期（ＶＥＧ期）、二重隆起期（ＤＲ期）、芒原基期（ＡＰ期）、緑葯期（ＧＡ期）の４つの穂の発達段階でそれぞれ収集した。４つの段階のそれぞれで、６つのバイオロジカルレプリケートサンプルを収集し、各レプリケートには、ＶＥＧ期の６つの植物からの１２のシュート、ＤＲ期の５つの植物からの１０のシュート、ＡＰ期の５つの植物からの５つの幼穂、ＧＡ期の３つの植物からの３つの幼穂、のバルクサンプルを含む。すべてのサンプルは直ちに液体窒素で凍結し、ＲＮＡ抽出まで保存するために－８０℃に移した。網室条件および空調温室下で収穫された芒原基期のサンプルのＲＮＡは、ＲＮＡ－ｓｅｑにも使用した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、続いてＲＮＡ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してゲノムＤＮＡのコンタミネーションを除去した。ＲＮＡサンプルの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して評価した。ＲＮＡ－ｓｅｑの場合、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡサンプル調製キットｖ２（イルミナ）を使用して、各サンプルの１μｇの全ＲＮＡから鎖特異的ＲＮＡライブラリーを構築し、イルミナＨｉＳｅｑ Ｘシーケンスプラットフォーム（イルミナ）２レーン（ペアエンド１５０ｂｐ）で解析した。
ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）に使用される植物は、空調温室で育てた。幼穂組織は、野生型ＯＵＨ６０２と変異体４４２０５から、栄養生長期（ＶＥＧ期）、二重隆起期（ＤＲ期）、芒原基期（ＡＰ期）、緑葯期（ＧＡ期）の４つの穂の発達段階でそれぞれ収集した。４つの段階のそれぞれで、６つのバイオロジカルレプリケートサンプルを収集し、各レプリケートには、ＶＥＧ期の６つの植物からの１２のシュート、ＤＲ期の５つの植物からの１０のシュート、ＡＰ期の５つの植物からの５つの幼穂、ＧＡ期の３つの植物からの３つの幼穂、のバルクサンプルを含む。すべてのサンプルは直ちに液体窒素で凍結し、ＲＮＡ抽出まで保存するために－８０℃に移した。網室条件および空調温室下で収穫された芒原基期のサンプルのＲＮＡは、ＲＮＡ－ｓｅｑにも使用した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、続いてＲＮＡ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してゲノムＤＮＡのコンタミネーションを除去した。ＲＮＡサンプルの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ機器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して評価した。ＲＮＡ－ｓｅｑの場合、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡサンプル調製キットｖ２（イルミナ）を使用して、各サンプルの１μｇの全ＲＮＡから鎖特異的ＲＮＡライブラリーを構築し、イルミナＨｉＳｅｑ Ｘシーケンスプラットフォーム（イルミナ）２レーン（ペアエンド１５０ｂｐ）で解析した。
【0075】
シーケンシング後、すべてのサンプルからのシークエンス配列の品質をＦａｓｔＱＣ ｖ０．１１．８（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）で評価し、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ｖ０．３８（Ｂｏｌｇｅｒ， ＡＭ． ｅｔ ａｌ．， （２０１４） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １；３０（１５）：２１１４－２１２０）でアダプターシーケンスと低品質のシークエンスを削除した。残ったリードを、ＨＩＳＡＴ２ ｖ２．１．０（Ｋｉｍ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， （２０１５） Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １２：３５７－３６０）を使用して、オオムギリファレンスゲノム（Ｍｏｒｅｘ＿ｐｓｅｕｄｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＿ｖ２．ｆａｓｔａ；Ｊａｙａｋｏｄｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０２０） Ｎａｔｕｒｅ， ５８８（７８３７）：２８４－２８９）にマッピングした。遺伝子のアノテーション（Ｍｏｒｅｘ．ｇｆｆ；Ｊａｙａｋｏｄｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０２０） Ｎａｔｕｒｅ， ５８８（７８３７）：２８４－２８９）に基づいて、遺伝子にマッピングしたリードは、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ ｖ１．６．３（Ｌｉａｏ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （２０１４） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ３０（７）：９２３－９３０）を使用して発現レベルとしてカウントされ、カウントされたリードはさらに１００万リードあたりの各遺伝子座の転写産物量（ＴＰＭ）に変換した。遺伝子発現差（ＤＥＧ）解析（空調温室と網室からの芒原基期のサンプル）は、Ｒ環境でＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージｅｄｇｅＲを使用して実施した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｍ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ２６（１）：１３９－１４０）。発現レベルは、Ｍ値のトリム平均（ＴＭＭ）法によって正規化し、Ｐ値を負の二項分布に基づく正確なテストによって計算し、遺伝子発現の変動は、ｅｄｇｅＲのｌｏｇ２倍の変化によって推定した。Ｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ， Ｙ． ＆ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ， Ｙ．， （１９９５） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ： Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ （Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ） ５７（１）：２８９－３００）を使用した偽発見率（ＦＤＲ）によって調整した。ＦＤＲ＜０．０５およびｌｏｇ２＞０．５の場合、ＤＥＧは有意であるとみなした。すべてのＤＥＧの注釈は、シロイヌナズナ（ＴＡＩＲ１０＿－４０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）およびイネ（ＩＲＧＳＰ－１．０＿ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ－ｐｒｏｔｅｉｎ＿２０２０－０９－０９；ｈｔｔｐｓ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）のタンパク質データベースに対するＲｅｃｉｐｒｏｃａｌ Ｂｅｓｔ Ｈｉｔｓ（ＲＢＨ）メソッドを使用したＢＬＡＳＴｐ検索結果（１０－８のＥ値カットオフ）に基づいた。
【0076】
遺伝子発現データのヒートマップは、Ｒパッケージｐｈｅａｔｍａｐ ｖ１．０．１２を使用して視覚化し、各段階での遺伝子発現レベルは、６つの生物学的複製からの平均ＴＰＭとして測定し、ｌｏｇ２（平均ＴＰＭ＋１）値に変換した。階層的クラスタリングは、それらの表現パターンに基づいてヒートマップ解析を実施した。
【0077】
（１３）スプライシングイベントの検出
二重隆起期、芒原基期、緑葯期のＲＮＡ－ｓｅｑデータからのマップされたリードが入ったＢＡＭファイルを、ＳＡＭｔｏｏｌｓ ｖｅｒｓｉｏｎ １．９．を使用して、野生型ＯＵＨ６０２と変異体４４２０５の各遺伝子型に対してマージした。野生型ＯＵＨ６０２と変異体４４２０５のマージされたリードを再カウントし、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅバージョン２．１．４（Ｐｅｒｔｅａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０１５） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ３３（３）：２９０－２９５）によりＯＵＨ６０２と４４２０５の新しい遺伝子モデルアノテーションのＧＴＦファイルを作成した。スプライスジャンクションは、１０を超えるマップされた読み取りでサポートされている場合にのみ有効とした。結果は、文献（Ｇａｒｒｉｄｏ－Ｍａｒｔｉｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， （２０１８） １９（１）：６７）に記載された方法に従い、Ｒ環境に組み込まれたｇｇｓａｓｈｉｍｉパッケージを使用して視覚化した。
二重隆起期、芒原基期、緑葯期のＲＮＡ－ｓｅｑデータからのマップされたリードが入ったＢＡＭファイルを、ＳＡＭｔｏｏｌｓ ｖｅｒｓｉｏｎ １．９．を使用して、野生型ＯＵＨ６０２と変異体４４２０５の各遺伝子型に対してマージした。野生型ＯＵＨ６０２と変異体４４２０５のマージされたリードを再カウントし、ＳｔｒｉｎｇＴｉｅバージョン２．１．４（Ｐｅｒｔｅａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０１５） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ３３（３）：２９０－２９５）によりＯＵＨ６０２と４４２０５の新しい遺伝子モデルアノテーションのＧＴＦファイルを作成した。スプライスジャンクションは、１０を超えるマップされた読み取りでサポートされている場合にのみ有効とした。結果は、文献（Ｇａｒｒｉｄｏ－Ｍａｒｔｉｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， （２０１８） １９（１）：６７）に記載された方法に従い、Ｒ環境に組み込まれたｇｇｓａｓｈｉｍｉパッケージを使用して視覚化した。
【0078】
（１４）統計分析
すべての実験データは、平均値±標準誤差（ＳＥ）として表示した。スチューデントのｔ検定を使用して、野生型とｓｏｆ１変異体の表現型の比較、およびサンプル間の遺伝子発現レベルの違いを調べた。サンプル間の有意な効果は、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔの大きさによって評価した（Ｐ値＜０．０５）。
すべての実験データは、平均値±標準誤差（ＳＥ）として表示した。スチューデントのｔ検定を使用して、野生型とｓｏｆ１変異体の表現型の比較、およびサンプル間の遺伝子発現レベルの違いを調べた。サンプル間の有意な効果は、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔの大きさによって評価した（Ｐ値＜０．０５）。
【0079】
Ｂ．結果
（１）突然変異体と野生型の表現型の解析
変異体４４２０５と野生型ＯＵＨ６０２を比較した場合、変異体では外穎と内穎の間がより引き離され、より広い開花角度をもつ「超開花」の表現型を示す（図１ＡおよびＢ）。中央の小穂を観察すると、鱗被がより大きく、変異体ではるかに活発な細胞分裂を示した（図１Ｃ～Ｆ）。小花の表現型の測定では、変異体は野生型と比較して明らかに大きな開花角度を示した。すなわち、鱗被のサイズが増大し、突然変異体の外穎と内穎が引き離された（図１ＧおよびＨ、図２ＡおよびＢ）（Ｐ＜０．０１、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）。変異体と野生型の最も重要な違いは、それらの鱗被のサイズであり（図１Ｈ）、鱗被の長さによってのみ、この表現型を野生型と変異体の間で区別できた（図２Ｂ～Ｄ）。鱗被の伸長は、突然変異体において、より広い開花角度をもたらすと考えられた。さらに、鱗被の細胞の測定により、細胞数は野生型よりも変異体で有意に低く（図２Ｅ）、変異体の細胞長の顕著な増加に対応することが明らかになった（図２Ｆ）。これらの表現型の結果は、伸長した鱗被が変異体の細胞増殖によって引き起こされる可能性を示唆した。
（１）突然変異体と野生型の表現型の解析
変異体４４２０５と野生型ＯＵＨ６０２を比較した場合、変異体では外穎と内穎の間がより引き離され、より広い開花角度をもつ「超開花」の表現型を示す（図１ＡおよびＢ）。中央の小穂を観察すると、鱗被がより大きく、変異体ではるかに活発な細胞分裂を示した（図１Ｃ～Ｆ）。小花の表現型の測定では、変異体は野生型と比較して明らかに大きな開花角度を示した。すなわち、鱗被のサイズが増大し、突然変異体の外穎と内穎が引き離された（図１ＧおよびＨ、図２ＡおよびＢ）（Ｐ＜０．０１、Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）。変異体と野生型の最も重要な違いは、それらの鱗被のサイズであり（図１Ｈ）、鱗被の長さによってのみ、この表現型を野生型と変異体の間で区別できた（図２Ｂ～Ｄ）。鱗被の伸長は、突然変異体において、より広い開花角度をもたらすと考えられた。さらに、鱗被の細胞の測定により、細胞数は野生型よりも変異体で有意に低く（図２Ｅ）、変異体の細胞長の顕著な増加に対応することが明らかになった（図２Ｆ）。これらの表現型の結果は、伸長した鱗被が変異体の細胞増殖によって引き起こされる可能性を示唆した。
【0080】
（２）ｓｏｆ１遺伝子座のマッピング
超開花の表現型の原因となる遺伝的要因を調査するために、突然変異体４４２０５とＭｏｒｅｘ（非閉花受粉）の交配により、９３個体のＦ２分離集団を構築した。Ｆ１植物は、その親株Ｍｏｒｅｘと同様に、通常の開花角度と鱗被サイズを示した。Ｆ２の分離比は、３：１のメンデルモデル（７２の通常の開花植物と２１の超開花植物；χ２＝０．２９、Ｐ値＞０．０５）に適合し、超開花が単一の劣性遺伝子により制御されていることが判明した。この遺伝子を「ｓｏｆ１（ｓｕｐｅｒ ｏｐｅｎ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ １）」と命名した。
超開花の表現型の原因となる遺伝的要因を調査するために、突然変異体４４２０５とＭｏｒｅｘ（非閉花受粉）の交配により、９３個体のＦ２分離集団を構築した。Ｆ１植物は、その親株Ｍｏｒｅｘと同様に、通常の開花角度と鱗被サイズを示した。Ｆ２の分離比は、３：１のメンデルモデル（７２の通常の開花植物と２１の超開花植物；χ２＝０．２９、Ｐ値＞０．０５）に適合し、超開花が単一の劣性遺伝子により制御されていることが判明した。この遺伝子を「ｓｏｆ１（ｓｕｐｅｒ ｏｐｅｎ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ １）」と命名した。
【0081】
ｓｏｆ１遺伝子をマッピングするために、４０個体のＦ２植物でＲＡＤ－ｓｅｑ分析を使用した。遺伝子は、最初、染色体７ＨのＣ７＿７７０５５＿９６８９１４０１とＣ７＿６７０１１＿１６５７６９００３の間に位置していた。次に、９３のＦ２個体を用いた大まかなマッピングにより、ｓｏｆ１遺伝子座が染色体７Ｈ上のｆｌｕｉｄｉｇｍマーカーＦＢ０２７８とＦＢ００８８の間の３．３ｃＭ間隔に位置していることが確認された。追加のＣＡＰＳマーカーによるさらなるジェノタイピングおよび上記の９３個体の表現型分析により、ｓｏｆ１遺伝子座は、マーカーＨＭ７Ｈ２３４２００とＨＭ７Ｈ２４６１００の間で遺伝距離１．１ｃＭの物理領域内に位置付けられた（図３Ａ）。最新のＭｏｒｅｘリファレンスゲノム（Ｊａｙａｋｏｄｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０２０） Ｎａｔｕｒｅ， ５８８：２８４－２８９）によると、この物理領域は約９．２Ｍｂであり、１１０個のアノテーション付き遺伝子と８個のアノテーションなしの偽遺伝子で構成される１１８個の遺伝子が存在した。
【0082】
ｓｏｆ１遺伝子の物理領域を絞り込むために、１７５９個体のｓｏｆ１変異体×Ｍｏｒｅｘを含む大規模なＦ２集団を使用して、組換えイベントをスクリーニングした。マーカーＨＭ７Ｈ２２８７００およびＨＭ７Ｈ２５４０００を使用して９９の組換え植物を同定した（図３Ｂ）。開花前に枯れた３つの植物と、矮性の表現型のために他の植物よりも小さい花器官を生成した１植物体を除いた、９５の組換え植物について鱗被の長さを測定した。鱗被の長さの分布は、３：１のメンデル分離に適合した（χ２＝０．０７、Ｐ値＞０．０５）。結果は、先のデータと一致しており、超開花が単一の劣性ｓｏｆ１遺伝子の下で制御されており、ｓｏｆ１がマーカーＨＭ７Ｈ２３４２００とＨＭ７Ｈ２４６１００の間にあることが確認された。１３の重要な組換え体の表現型のさらなる遺伝子型分析および評価は、ｓｏｆ１の存在領域をマーカーＨＭ７Ｈ２３４２００とＨＭ７Ｈ２３９１００の間の０．３７ｃＭ間隔に狭めた（図３Ｃ）。物理的距離は約３．１Ｍｂであり、文献（Ｊａｙａｋｏｄｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０２０） Ｎａｔｕｒｅ， ５８８：２８４－２８９）に記載されたＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３４２００とＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２４６１００の間の４３個のアノテーション付き遺伝子と５個のアノテーションなし偽遺伝子で構成されていた。
【0083】
（３）超開花表現型の遺伝的要因
野生型ＯＵＨ６０２と変異体４４２０５の間の３．１Ｍｂ間隔にある遺伝子の多型を調査するために、変異体の全ゲノムショットガン配列決定を行い、野生型のゲノム配列と比較した。この標的領域内では、２つの遺伝子型間で３つのホモ接合多型のみが検出され、そのうち２つの１ｂｐ挿入は遺伝子間領域にあり、２２ｂｐ欠失は遺伝子内領域にあった。２２ｂｐの欠失は、野生型Ｓｏｆ１遺伝子のゲノムの１８０８０位から１８１０１位（転写開始点を１とする）に位置し、変異体における遺伝子の翻訳フレームシフト（ｐ．Ａｓｐ２６４６ｆｓ）を生じさせた（図４Ａ、Ｂ）。Ｈｏｒｖｕ＿ＯＵＨ＿７Ｈ０１Ｇ２１１３００は、Ｍｏｒｅｘゲノムの高信頼度遺伝子としてＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００に対応し、クロマチンリモデリングタンパク質様としてアノテーションが付けられた（Ｊａｙａｋｏｄｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０２０） Ｎａｔｕｒｅ， ５８８：２８４－２８９）。候補遺伝子を検証するために、２２ｂｐの欠失に対して開発されたＩｎ－ｄｅｌマーカー（ＨＭ７Ｈ２３８１００－Ｉｎｄｅｌ）を使用して、１３の重要なＦ２組換え体の遺伝子型を決定し、続いて３つの組換え体のＦ３子孫の遺伝子型と表現型を分析した。その結果、Ｉｎ－ｄｅｌマーカーがｓｏｆ１と再結合しないことが示された。
野生型ＯＵＨ６０２と変異体４４２０５の間の３．１Ｍｂ間隔にある遺伝子の多型を調査するために、変異体の全ゲノムショットガン配列決定を行い、野生型のゲノム配列と比較した。この標的領域内では、２つの遺伝子型間で３つのホモ接合多型のみが検出され、そのうち２つの１ｂｐ挿入は遺伝子間領域にあり、２２ｂｐ欠失は遺伝子内領域にあった。２２ｂｐの欠失は、野生型Ｓｏｆ１遺伝子のゲノムの１８０８０位から１８１０１位（転写開始点を１とする）に位置し、変異体における遺伝子の翻訳フレームシフト（ｐ．Ａｓｐ２６４６ｆｓ）を生じさせた（図４Ａ、Ｂ）。Ｈｏｒｖｕ＿ＯＵＨ＿７Ｈ０１Ｇ２１１３００は、Ｍｏｒｅｘゲノムの高信頼度遺伝子としてＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００に対応し、クロマチンリモデリングタンパク質様としてアノテーションが付けられた（Ｊａｙａｋｏｄｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， （２０２０） Ｎａｔｕｒｅ， ５８８：２８４－２８９）。候補遺伝子を検証するために、２２ｂｐの欠失に対して開発されたＩｎ－ｄｅｌマーカー（ＨＭ７Ｈ２３８１００－Ｉｎｄｅｌ）を使用して、１３の重要なＦ２組換え体の遺伝子型を決定し、続いて３つの組換え体のＦ３子孫の遺伝子型と表現型を分析した。その結果、Ｉｎ－ｄｅｌマーカーがｓｏｆ１と再結合しないことが示された。
【0084】
（４）Ｓｏｆ１の標的突然変異誘発
Ｓｏｆ１に対応する遺伝子が、ＯＵＨ６０２ではＨｏｒｖｕ＿ＯＵＨ＿７Ｈ０１Ｇ２１１３００、ＭＯＲＥＸではＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００遺伝子であることを裏付けるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した突然変異誘発を使用して、オオムギ品種のＧｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅに追加の突然変異系統を作成した。ガイドＲＮＡの標的部位は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅゲノム内のＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００のオルソログであるＨｏｒｖｕ＿ＧＯＬＤＥＮ＿７Ｈ０１Ｇ１９９０００遺伝子（変異体における２２ｂｐ欠失の近傍）を標的とした（図５Ａ）。得られた突然変異は、トランスジェニック植物の遺伝子型と配列決定の後、５ｂｐの欠失を持つ独立した突然変異（ｓｏｆ１－２）が得られた。これは、翻訳の早期終了につながる終止コドンの導入となり機能喪失遺伝子変異対立遺伝子と見なすことができた（図５Ａ）。Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅはｃｌｙ１遺伝子座に閉花性対立遺伝子（ｃｌｙ１．ｂ）を保持し小さな鱗被を形成するが、作成したゲノム編集系統はこの栽培品種に由来して、この閉花性対立遺伝子対立遺伝子を保持するため、潜在的にｓｏｆ１変異の効果が妨げられている。そこで、鱗被の発達に対するｃｌｙ１．ｂによる潜在的な負の影響を排除するために、ｓｏｆ１－２ Ｔ０系統は、非閉花性オオムギＳｖ７３５２８およびＡｄｏｒｒａと交配し、遺伝子型がｓｏｆ１－２ｓｏｆ１－２Ｃｌｙ１＿のＦ３集団を作成して、その鱗被表現型を決定した（図５Ｂ）。その結果、Ｓｖ７３５２８およびＡｄｏｒｒａと比較して、ｓｏｆ１－２変異体（Ｔ２）の鱗被の長さは有意に長かった（図６）。
Ｓｏｆ１に対応する遺伝子が、ＯＵＨ６０２ではＨｏｒｖｕ＿ＯＵＨ＿７Ｈ０１Ｇ２１１３００、ＭＯＲＥＸではＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００遺伝子であることを裏付けるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した突然変異誘発を使用して、オオムギ品種のＧｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅに追加の突然変異系統を作成した。ガイドＲＮＡの標的部位は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅゲノム内のＨｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００のオルソログであるＨｏｒｖｕ＿ＧＯＬＤＥＮ＿７Ｈ０１Ｇ１９９０００遺伝子（変異体における２２ｂｐ欠失の近傍）を標的とした（図５Ａ）。得られた突然変異は、トランスジェニック植物の遺伝子型と配列決定の後、５ｂｐの欠失を持つ独立した突然変異（ｓｏｆ１－２）が得られた。これは、翻訳の早期終了につながる終止コドンの導入となり機能喪失遺伝子変異対立遺伝子と見なすことができた（図５Ａ）。Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅはｃｌｙ１遺伝子座に閉花性対立遺伝子（ｃｌｙ１．ｂ）を保持し小さな鱗被を形成するが、作成したゲノム編集系統はこの栽培品種に由来して、この閉花性対立遺伝子対立遺伝子を保持するため、潜在的にｓｏｆ１変異の効果が妨げられている。そこで、鱗被の発達に対するｃｌｙ１．ｂによる潜在的な負の影響を排除するために、ｓｏｆ１－２ Ｔ０系統は、非閉花性オオムギＳｖ７３５２８およびＡｄｏｒｒａと交配し、遺伝子型がｓｏｆ１－２ｓｏｆ１－２Ｃｌｙ１＿のＦ３集団を作成して、その鱗被表現型を決定した（図５Ｂ）。その結果、Ｓｖ７３５２８およびＡｄｏｒｒａと比較して、ｓｏｆ１－２変異体（Ｔ２）の鱗被の長さは有意に長かった（図６）。
【0085】
Ｓｖ７３５２８およびＡｄｏｒｒａと比較して、Ｆ３植物は、かなり長い鱗被を持ち開花角度の大きい小花を示したが（図７）、鱗被の深さと幅に大きな違いはなかった。これらの結果は、ｓｏｆ１－２変異体の伸長した鱗被が、Ｈｏｒｖｕ＿ＧＯＬＤＥＮ＿７Ｈ０１Ｇ１９９０００の切断によって引き起こされ、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００がＳｏｆ１の機能遺伝子と見なされることが示された。以上から、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ２３８１００の２２ｂｐの欠失がｓｏｆ１変異体の超開花の原因であると結論づけた。
【0086】
（５）Ｓｏｆ１遺伝子の構造的特徴
Ｓｏｆ１は、ｓｏｆ１の野生型対立遺伝子である。Ｓｏｆ１遺伝子は、開始コドンから停止コドンまでが２０７２０ｂｐ（配列番号：３）、全長ＣＤＳが１０３２６ｂｐ（配列番号：１）であり（図４Ａ）、２つのＳｎｆ２ファミリードメインを持つ予測される３４４１アミノ酸のタンパク質（ＳＯＦ１）をコードしていた（図４Ｂ）。１つは、ＳＮＦ２＿Ｎ（ＳＮＦ２ファミリーのＮ末端ドメイン）とＨｅｌｉｃａｓｅ＿Ｃ（ヘリカーゼ保存Ｃ末端ドメイン）で構成されＡＴＰａｓｅドメインであり、もう１つは、ＳｎＡＣ（Ｓｎｆ２ ＡＴＰカップリング）ドメインである（図４Ｂ）。ＡＴＰａｓｅドメインとＳｎＡＣドメインは、ＳＯＦ１のＮ末端に位置するが、Ｃ末端領域に保存されたドメインは見つからない。野生型と比較して、ｓｏｆ１変異体は２２ｂｐの欠失を含み（図４Ａ）、フレームシフト変異（Ｄ２６５９Ｅｆｓ）を引き起こし、Ｃ末端領域の２６７７番目のアミノ酸に対応する塩基にストップコドンを導入し、最後の７６５アミノ酸（完全なＳＯＦ１タンパク質の約２２％）を欠く２６７６アミノ酸の切断されたタンパク質が生じる（図４Ｂ）。切断されたタンパク質は変異体の生物学的機能を失うと考えられた。ＳＮＦ２はＡＴＰ依存性のクロマチンリモデリング因子であり、転写、複製、相同組換え、ＤＮＡ修復などのＤＮＡイベントの多くの側面を制御している。ＳＯＦ１の機能を調べるために、ＳＯＦ１ホモログの系統発生分析を行った。植物種でのＢＬＡＳＴｐ検索に基づいて、単子葉植物と双子葉植物でＳＯＦ１ホモログが見つかり、系統発生分析に使用するために、各分類群からＳＯＦ１との同一性が高い上位のホモログをさらに選択した。他の３つのシロイヌナズナＳＷＩ／ＳＮＦサブファミリーのメンバーは、相同タンパク質が属するクラスを推測するために含めた。系統樹は、すべてのＳＯＦ１ホモログがＳＷＩ／ＳＮＦサブファミリー内にクラスター化されていることを示し、ＳＯＦ１がこのＳＷＩ／ＳＮＦサブファミリー（ＳＷＩ／ＳＮＦ ＡＴＰａｓｅ）に属し、これらの配列がオーソロガスであることを示唆した（図８）。ＳＷＩ／ＳＮＦ ＡＴＰａｓｅはクロマチンを活性型状態にしてその遺伝子をＯＮする機能をもつ。このＳＷＩ／ＳＮＦのクラスターでは、ＳＯＦ１とＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＳＰＬＡＹＥＤ（ＳＹＤ）タンパク質は互いに密接に関連していた（図８）。ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＳＹＤは複数のＭＡＤＳボックス遺伝子を介してさらに下流のｂＨＬＨ遺伝子のいくつかに作用し、花弁の大型化を抑制している。そのためＳＹＤの突然変異では花弁が大型化する。花弁のイネ科相同器官は鱗被である。したがって、ＳＹＤから発する遺伝子制御系は、オオムギｓｏｆ１突然変異における鱗被肥大化（超開花）のモデルの一つとすることができる。一方、ホモログであるＨＯＲＶＵ＿ＭＯＲＥＸ＿６Ｈ０１Ｇ０４１６００．１は、ＭｏｒｅｘゲノムのＡＴＰ依存性ヘリカーゼファミリータンパク質としてアノテーションが付けられた。これは、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＢＲＡＨＭＡ（ＢＲＭ）と密接な関係を示し、ＮＣＢＩの保存ドメインデータベース（Ｍａｒｃｈｌｅｒ－Ｂａｕｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， （２０１７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ４；４５（Ｄ１）：Ｄ２００－Ｄ２０３）によってＣ末端に潜在的なブロモドメインを含むことが示された。ＨＯＲＶＵ＿ＭＯＲＥＸ＿６Ｈ０１Ｇ０４１６００．１がオオムギのＳＯＦ１パラログであることを示唆された。一方、ＯｓＳＹＤ（ＸＰ＿０１５６４２４５８．１）は、系統発生分析に基づいてＳＹＤオルソログの一つであり、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｓｐ ｊａｐｏｎｉｃａのＳＹＤオルソログと報告されている（Ｓｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ４６（４）：６８５－６９９、 Ｈｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （２０１３） Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ７０：３３－４２）。これらの結果は、ＳＯＦ１がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＳＹＤのオルソログであることを示唆する。ＳＯＦ１（およびＳＹＤ）は単子葉植物と双子葉植物の両方で保持されており、これらのＳＯＦ１オルソログは共通の祖先に由来し、進化的に保存されていることを示唆する（図８）。したがって、Ｓｏｆ１はクロマチンリモデリングＡＴＰａｓｅタンパク質をコードしており、その機能はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＳＹＤやＯｓＳＹＤに類似している可能性がある。
Ｓｏｆ１は、ｓｏｆ１の野生型対立遺伝子である。Ｓｏｆ１遺伝子は、開始コドンから停止コドンまでが２０７２０ｂｐ（配列番号：３）、全長ＣＤＳが１０３２６ｂｐ（配列番号：１）であり（図４Ａ）、２つのＳｎｆ２ファミリードメインを持つ予測される３４４１アミノ酸のタンパク質（ＳＯＦ１）をコードしていた（図４Ｂ）。１つは、ＳＮＦ２＿Ｎ（ＳＮＦ２ファミリーのＮ末端ドメイン）とＨｅｌｉｃａｓｅ＿Ｃ（ヘリカーゼ保存Ｃ末端ドメイン）で構成されＡＴＰａｓｅドメインであり、もう１つは、ＳｎＡＣ（Ｓｎｆ２ ＡＴＰカップリング）ドメインである（図４Ｂ）。ＡＴＰａｓｅドメインとＳｎＡＣドメインは、ＳＯＦ１のＮ末端に位置するが、Ｃ末端領域に保存されたドメインは見つからない。野生型と比較して、ｓｏｆ１変異体は２２ｂｐの欠失を含み（図４Ａ）、フレームシフト変異（Ｄ２６５９Ｅｆｓ）を引き起こし、Ｃ末端領域の２６７７番目のアミノ酸に対応する塩基にストップコドンを導入し、最後の７６５アミノ酸（完全なＳＯＦ１タンパク質の約２２％）を欠く２６７６アミノ酸の切断されたタンパク質が生じる（図４Ｂ）。切断されたタンパク質は変異体の生物学的機能を失うと考えられた。ＳＮＦ２はＡＴＰ依存性のクロマチンリモデリング因子であり、転写、複製、相同組換え、ＤＮＡ修復などのＤＮＡイベントの多くの側面を制御している。ＳＯＦ１の機能を調べるために、ＳＯＦ１ホモログの系統発生分析を行った。植物種でのＢＬＡＳＴｐ検索に基づいて、単子葉植物と双子葉植物でＳＯＦ１ホモログが見つかり、系統発生分析に使用するために、各分類群からＳＯＦ１との同一性が高い上位のホモログをさらに選択した。他の３つのシロイヌナズナＳＷＩ／ＳＮＦサブファミリーのメンバーは、相同タンパク質が属するクラスを推測するために含めた。系統樹は、すべてのＳＯＦ１ホモログがＳＷＩ／ＳＮＦサブファミリー内にクラスター化されていることを示し、ＳＯＦ１がこのＳＷＩ／ＳＮＦサブファミリー（ＳＷＩ／ＳＮＦ ＡＴＰａｓｅ）に属し、これらの配列がオーソロガスであることを示唆した（図８）。ＳＷＩ／ＳＮＦ ＡＴＰａｓｅはクロマチンを活性型状態にしてその遺伝子をＯＮする機能をもつ。このＳＷＩ／ＳＮＦのクラスターでは、ＳＯＦ１とＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＳＰＬＡＹＥＤ（ＳＹＤ）タンパク質は互いに密接に関連していた（図８）。ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＳＹＤは複数のＭＡＤＳボックス遺伝子を介してさらに下流のｂＨＬＨ遺伝子のいくつかに作用し、花弁の大型化を抑制している。そのためＳＹＤの突然変異では花弁が大型化する。花弁のイネ科相同器官は鱗被である。したがって、ＳＹＤから発する遺伝子制御系は、オオムギｓｏｆ１突然変異における鱗被肥大化（超開花）のモデルの一つとすることができる。一方、ホモログであるＨＯＲＶＵ＿ＭＯＲＥＸ＿６Ｈ０１Ｇ０４１６００．１は、ＭｏｒｅｘゲノムのＡＴＰ依存性ヘリカーゼファミリータンパク質としてアノテーションが付けられた。これは、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＢＲＡＨＭＡ（ＢＲＭ）と密接な関係を示し、ＮＣＢＩの保存ドメインデータベース（Ｍａｒｃｈｌｅｒ－Ｂａｕｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， （２０１７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ４；４５（Ｄ１）：Ｄ２００－Ｄ２０３）によってＣ末端に潜在的なブロモドメインを含むことが示された。ＨＯＲＶＵ＿ＭＯＲＥＸ＿６Ｈ０１Ｇ０４１６００．１がオオムギのＳＯＦ１パラログであることを示唆された。一方、ＯｓＳＹＤ（ＸＰ＿０１５６４２４５８．１）は、系統発生分析に基づいてＳＹＤオルソログの一つであり、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｓｐ ｊａｐｏｎｉｃａのＳＹＤオルソログと報告されている（Ｓｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ４６（４）：６８５－６９９、 Ｈｕ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （２０１３） Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ７０：３３－４２）。これらの結果は、ＳＯＦ１がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＳＹＤのオルソログであることを示唆する。ＳＯＦ１（およびＳＹＤ）は単子葉植物と双子葉植物の両方で保持されており、これらのＳＯＦ１オルソログは共通の祖先に由来し、進化的に保存されていることを示唆する（図８）。したがって、Ｓｏｆ１はクロマチンリモデリングＡＴＰａｓｅタンパク質をコードしており、その機能はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＳＹＤやＯｓＳＹＤに類似している可能性がある。
【0087】
（６）Ｓｏｆ１の転写産物量プロファイリング
Ｓｏｆ１の転写量を、穂全体または穂の発達段階にわたる個々の生殖器官、およびさまざまな栄養器官で調べた（図９）。ｑＲＴ－ＰＣＲプロファイリングにより、この遺伝子は野生型と変異体の両方で穂の発生段階全体で広く転写されることが明らかになった。野生型において、この遺伝子の転写は、緑の葯の段階で６つの花器官や葉鞘、葉身、節、節間の栄養器官で検出できたが、同じ芒原基期での幼穂も低かった。野生型より変異体の転写産物の量は、幼穂および生殖器官で有意に低かった（図９）。注目すべきことに、この遺伝子の転写レベルは、芒原基期から開花まで変異体で有意に減少し、鱗被でも明らかに減少した（Ｐ＜０．０１、図９）。転写産物量分析は、この遺伝子が栄養成長と生殖発達の間に機能を果たしている可能性があることを示唆した。
Ｓｏｆ１の転写量を、穂全体または穂の発達段階にわたる個々の生殖器官、およびさまざまな栄養器官で調べた（図９）。ｑＲＴ－ＰＣＲプロファイリングにより、この遺伝子は野生型と変異体の両方で穂の発生段階全体で広く転写されることが明らかになった。野生型において、この遺伝子の転写は、緑の葯の段階で６つの花器官や葉鞘、葉身、節、節間の栄養器官で検出できたが、同じ芒原基期での幼穂も低かった。野生型より変異体の転写産物の量は、幼穂および生殖器官で有意に低かった（図９）。注目すべきことに、この遺伝子の転写レベルは、芒原基期から開花まで変異体で有意に減少し、鱗被でも明らかに減少した（Ｐ＜０．０１、図９）。転写産物量分析は、この遺伝子が栄養成長と生殖発達の間に機能を果たしている可能性があることを示唆した。
【0088】
（７）Ｓｏｆ１による推定転写調節
Ｓｏｆ１の２２ｂｐの欠失の影響をトランスクリプトームで明らかにするために、野生型ＯＵＨ６０２と変異体４４２０５でＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した。空調温室（自然光で２２℃）と網室で育成した植物の未成熟の穂（ａｗｎ ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ ｓｔａｇｅ）を解析した結果、２つの成長条件下において遺伝子型間でそれぞれ合計２４１２および１３７１の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）（ＦＤＲ＜０．０５および｜ｌｏｇ２ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｜＞０．５）を明らかとした。さらに、６７４の共通のＤＥＧは、野生型と比較して変異体において３９１（５８％）の発現誘導された遺伝子と２８３（４２％）の発現抑制された遺伝子から構成された。変異体におけるＳｏｆ１発現の低下は、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析でも確認でき、ｑＲＴ－ＰＣＲによるＳｏｆ１の発現プロファイルの結果と一致していた。
Ｓｏｆ１の２２ｂｐの欠失の影響をトランスクリプトームで明らかにするために、野生型ＯＵＨ６０２と変異体４４２０５でＲＮＡ－ｓｅｑ解析を実施した。空調温室（自然光で２２℃）と網室で育成した植物の未成熟の穂（ａｗｎ ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ ｓｔａｇｅ）を解析した結果、２つの成長条件下において遺伝子型間でそれぞれ合計２４１２および１３７１の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）（ＦＤＲ＜０．０５および｜ｌｏｇ２ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｜＞０．５）を明らかとした。さらに、６７４の共通のＤＥＧは、野生型と比較して変異体において３９１（５８％）の発現誘導された遺伝子と２８３（４２％）の発現抑制された遺伝子から構成された。変異体におけるＳｏｆ１発現の低下は、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析でも確認でき、ｑＲＴ－ＰＣＲによるＳｏｆ１の発現プロファイルの結果と一致していた。
【0089】
有意に発現抑制された遺伝子の中で、６つの花のホメオシス遺伝子を検出した。それは、Ｂクラス遺伝子（ＡＰ３－ｌｉｋｅ、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ５３６５００およびＰＩ－ｌｉｋｅ、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿１Ｈ０１Ｇ４０２０００）、Ｃクラス遺伝子（ＡＧ－ｌｉｋｅ、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿３Ｈ０１Ｇ１７１３００）、Ｅクラス（ＡＧＬ６－ｌｉｋｅ、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿６Ｈ０１Ｇ３９５９００およびＳＥＰ－ｌｉｋｅ、Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿７Ｈ０１Ｇ３２８２００），ＳＶＰ－ｌｉｋｅ遺伝子（Ｈｏｒｖｕ＿ＭＯＲＥＸ＿４Ｈ０１Ｇ４５４７００）であり、これらの遺伝子はそれぞれイネのＯｓＭＡＤＳ１６、ＯｓＭＡＤＳ４、ＯｓＭＡＤＳ３、ＯｓＭＡＤＳ６、ＯｓＭＡＤＳ６とホモログであった。特に、ＯｓＭＡＤＳ１６（Ｎａｇａｓａｗａ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １３０（４）：７０５－１８、Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， ５（６）：８３５－８４６）、ＯｓＭＡＤＳ３（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １８（１）：１５－２８、Ｄｒｅｎｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２３（８）：２８５０－２８６３）、ＯｓＭＡＤＳ６（Ｌｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０（３）：２９９－３１３）およびＯｓＭＡＤＳ７の遺伝子（Ｃｕｉ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ６１（５）：７６７－７８１）は、イネの変異体を介して鱗被の発達について報告されている。
【0090】
（８）開花性の相違による受粉効率の推定
（１５）受粉効率の推定
受粉効果を推定するために、開花型２品種（Ａｄｏｒｒａ， Ｓｖ７３５２８）および閉花型１品種 （カワサイゴク）の細胞質雄性不稔系統を使用し、鉢植した植物体の開花期に物理的に開頴して、芒をテープで固定後、人工授粉して登熟し、着粒数によって受粉効果を推定した。その結果、開花型のＡｄｏｒｒａおよびＳｖ７３５１０８においては５倍以上の顕著な受粉効果（着粒数の増加）が認められ、閉花型の「カワサイゴク」においても、その効果は明らかであった（表１）。
（１５）受粉効率の推定
受粉効果を推定するために、開花型２品種（Ａｄｏｒｒａ， Ｓｖ７３５２８）および閉花型１品種 （カワサイゴク）の細胞質雄性不稔系統を使用し、鉢植した植物体の開花期に物理的に開頴して、芒をテープで固定後、人工授粉して登熟し、着粒数によって受粉効果を推定した。その結果、開花型のＡｄｏｒｒａおよびＳｖ７３５１０８においては５倍以上の顕著な受粉効果（着粒数の増加）が認められ、閉花型の「カワサイゴク」においても、その効果は明らかであった（表１）。
【0091】
【表1】
【0092】
なお、授粉しない雄性不稔系統の穂には着粒は認められず、授粉処理以外に他の個体の花粉などによって受精しなかったことが確認された。受粉する個体の開花型変異には受粉率の向上による着粒数の大幅な向上が認められた。
【0093】
（８）コムギ相同遺伝子の同定と解析
コムギ品種Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇのゲノム情報からコムギ相同遺伝子配列を取得した。同定した各コムギＳｏｆ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：４、７、１０に、ゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：６，９、１２に、これらＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５、８、１１に示す。オオムギＳｏｆ１と同様に、コムギでも根、葉、穂などのさまざまな器官で強く発現することが判明した（図１０）。さらに、ＴＩＬＬＩＮＧ法により、コムギ品種ＫｒｏｎｏｓおよびＣａｄｅｎｚａにおいて、コムギＳｏｆ１遺伝子の突然変異体を複数系統選抜することに成功した。
コムギ品種Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｐｒｉｎｇのゲノム情報からコムギ相同遺伝子配列を取得した。同定した各コムギＳｏｆ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：４、７、１０に、ゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号：６，９、１２に、これらＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５、８、１１に示す。オオムギＳｏｆ１と同様に、コムギでも根、葉、穂などのさまざまな器官で強く発現することが判明した（図１０）。さらに、ＴＩＬＬＩＮＧ法により、コムギ品種ＫｒｏｎｏｓおよびＣａｄｅｎｚａにおいて、コムギＳｏｆ１遺伝子の突然変異体を複数系統選抜することに成功した。
【産業上の利用可能性】
【0094】
以上説明した通り、本発明によれば、開花性が向上したムギを生産することが可能となる。本発明は、ムギ新品種の開発の効率を大きく高めることができることから、農業分野における穀物の生産性の向上に貢献する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】