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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024030078
(43)【公開日】2024-03-07
(54)【発明の名称】生物膜中のレジオネラ属菌の可視化方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6841 20180101AFI20240229BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240229BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6841 Z ZNA
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022132637
(22)【出願日】2022-08-23
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000001063
【氏名又は名称】栗田工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100086911
【弁理士】
【氏名又は名称】重野 剛
(74)【代理人】
【識別番号】100144967
【弁理士】
【氏名又は名称】重野 隆之
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 若子
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QR56
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】自家蛍光のある生物膜中のレジオネラ属菌を可視化する方法を提供する。
【解決手段】自家蛍光をもつ生物又は、生物膜中のレジオネラ属菌類を可視化する方法であって、ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ法を適用する、レジオネラ属菌の可視化方法。前記可視化方法は、サンプルの濃縮、洗浄を行う工程、サンプルの固定を行う工程、イニシエーターＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを行う工程、イニシエーターＤＮＡプローブの洗浄を行う工程、伸長プローブの反応を行う工程、及び伸長プローブの洗浄を行う工程を有する。
【選択図】図１
【解決手段】自家蛍光をもつ生物又は、生物膜中のレジオネラ属菌類を可視化する方法であって、ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ法を適用する、レジオネラ属菌の可視化方法。前記可視化方法は、サンプルの濃縮、洗浄を行う工程、サンプルの固定を行う工程、イニシエーターＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを行う工程、イニシエーターＤＮＡプローブの洗浄を行う工程、伸長プローブの反応を行う工程、及び伸長プローブの洗浄を行う工程を有する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
自家蛍光をもつ生物又は、生物膜中のレジオネラ属菌類を可視化する方法であって、ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ法を適用する、レジオネラ属菌の可視化方法。
【請求項2】
前記可視化方法は、
サンプルの濃縮、洗浄を行う工程、
前記サンプルの固定を行う工程、
イニシエーターＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを行う工程、
前記イニシエーターＤＮＡプローブの洗浄を行う工程、
伸長プローブの反応を行う工程、及び
前記伸長プローブの洗浄を行う工程
を有する請求項１のレジオネラ属菌の可視化方法。
サンプルの濃縮、洗浄を行う工程、
前記サンプルの固定を行う工程、
イニシエーターＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを行う工程、
前記イニシエーターＤＮＡプローブの洗浄を行う工程、
伸長プローブの反応を行う工程、及び
前記伸長プローブの洗浄を行う工程
を有する請求項１のレジオネラ属菌の可視化方法。
【請求項3】
前記伸長プローブの洗浄液が界面活性剤を含む、請求項２のレジオネラ属菌の可視化方法。
【請求項4】
前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項３のレジオネラ属菌の可視化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、冷却水系、環境水系、入浴水系、排水系、土壌、生体などの生物膜中に存在するレジオネラ属菌を可視化する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
レジオネラ属菌は生物膜中に存在し、細菌捕食性細胞中で増殖するといわれている。具体的にはアメーバやテトラヒメナ、人体ではマクロファージのなかでレジオネラ属菌が増殖した報告がある。
【0003】
それらの細胞中のレジオネラ属菌を観察するために、レジオネラ属菌のみを可視化する方法としてFluorescence in situ hybridization法（以下ＦＩＳＨ法）が用いられている。この方法は、検出対象とする菌に特異的に反応するＤＮＡプローブを用い、このプローブに蛍光色素を結合させ、検出対象とする菌のみを蛍光色素で染色する方法である。
【0004】
特許文献１には、ＤＮＡプローブを用いてレジオネラ属菌を検出する方法として、in situ hybridizationに言及している。しかし、特許文献１は飲料水、表層水中のレジオネラ属菌やL.pneumophila種の細菌を対象にしており、生物膜中のレジオネラ属菌を対象としていない。
【0005】
特許文献２～４には、蛍光染色により目的細胞を観察するにあたって、夾雑する蛍光を異なる色に変異させる、蛍光染色した微生物を含む試料に、微生物の輪郭を染色する液を用いる方法が記載されている。特許文献２，４では、親油性スリチル色素を希釈した溶液を用いる。特許文献３では、親油性カルボシアニン色素または親油性ナイルレッドを希釈した溶液を用いる。なお、本発明では、これらの物質は使用しない。
【0006】
特許文献５には、ＤＡＮプローブの蛍光を増幅させる方法として、in situ hybridization chain reaction法（ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ法）が記載されている。しかし、特許文献５には、ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ法をレジオネラ属菌に適用することは記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特表２００５－５１５７５６号公報
【特許文献2】特開２０１１－４５３２９号公報
【特許文献3】特開２０１１－１４７４０４号公報
【特許文献4】特開２０１１－１７２５０９号公報
【特許文献5】特表２０１９－５１８４３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
レジオネラ属菌はレジオネラ症肺炎やポンティアック熱の原因菌であり、ミスト中に含まれたレジオネラ属菌が吸引されたり、水中のレジオネラが誤飲されたりして人体に侵入し、感染、発症に至る。ミストの発生源は冷却塔、シャワー水、加湿器、修景用水などが報告されている。
【0009】
世界的にみて冷却水系は主要な感染源であり、冷却水系でのレジオネラの生態を明らかにすることは合理的なレジオネラ属菌防除を実施するために必須と考える。しかし、ＦＩＳＨ法によるレジオネラ属菌の実冷却水系での観察報告は、学術論文でも特許出願でも見出されていない。
【0010】
この理由は、従来技術であるＦＩＳＨでは、自家蛍光を持つ生物内、生物膜内のレジオネラを蛍光観察することができないためと考えられる。冷却水系の生物膜は、藻、細菌、土砂、スケールなどからなり、このうち、藻、スケールには自家蛍光があり、ＦＩＳＨ法ではＤＮＡプローブの蛍光を検出することができない。
【0011】
本発明は、自家蛍光のある生物膜中のレジオネラ属菌を可視化する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明のレジオネラ属菌の可視化方法は、自家蛍光をもつ生物又は、生物膜中のレジオネラ属菌類を可視化する方法であって、ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ法を適用する、レジオネラ属菌の可視化方法である。
【0013】
本発明の一態様では、前記可視化方法は、サンプルの濃縮、洗浄を行う工程、サンプルの固定を行う工程、イニシエーターＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを行う工程、イニシエーターＤＮＡプローブの洗浄を行う工程、伸長プローブの反応を行う工程、及び伸長プローブの洗浄を行う工程を有する。
【0014】
本発明の一態様では、前記伸長プローブの洗浄液が界面活性剤を含む。
【0015】
本発明の一態様では、前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである。
【発明の効果】
【0016】
ＤＮＡプローブの蛍光増幅法としてｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲを適用することにより、レジオネラ属菌の蛍光強度が、生物膜の自家蛍光と同等かそれ以上になる。その結果、ＦＩＳＨ法では自家蛍光のある生物膜内のレジオネラを可視化することができなかったが、本発明により、自家蛍光のある生物膜内のレジオネラを可視化することができる。
【0017】
本発明の一態様において、伸長プローブの洗浄液に界面活性剤を添加すると、伸長プローブの自家蛍光生物膜に対する非特異的蛍光が抑制される。これにより、特異的ＤＮＡプローブが反応した生物の蛍光のみを検出できる。これにより、生物膜中のレジオネラ属菌をより明瞭に可視化することができる。
【0018】
本発明方法によると、レジオネラ属菌の生態を解明することができ、藻と細菌からなる生物膜中でレジオネラがフィラメント化して共存しているという、新たな知見が得られた。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】蛍光顕微鏡の撮影画像である。
【図2】蛍光顕微鏡の撮影画像である。
【図3】蛍光顕微鏡の撮影画像である。
【図4】蛍光顕微鏡の撮影画像である。
【図5】蛍光顕微鏡の撮影画像である。
【図6】蛍光顕微鏡の撮影画像である。
【図7】蛍光顕微鏡の撮影画像である。
【図8】蛍光顕微鏡の撮影画像である。
【図9】蛍光顕微鏡の撮影画像である。
【図10】蛍光顕微鏡の撮影画像である。
【図11】蛍光顕微鏡の撮影画像である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明の生物膜中のレジオネラ属菌の可視化方法が対象とする生物膜としては、冷却水系、環境水系、入浴水系、排水系、土壌、生体などの生物膜が例示される。
【0021】
本発明の一態様では、これらから採取したサンプル（生物膜又は生物膜懸濁液）について、以下の第１～第８工程により、レジオネラ属菌の可視化処理を行う。
第１工程：サンプルの濃縮、洗浄
第２工程：サンプルの固定
第３工程：脱水
第４工程：イニシエーターＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション
第５工程：洗浄
第６工程：伸長プローブの反応
第７工程：洗浄
第８工程：蛍光観察
第１工程：サンプルの濃縮、洗浄
第２工程：サンプルの固定
第３工程：脱水
第４工程：イニシエーターＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション
第５工程：洗浄
第６工程：伸長プローブの反応
第７工程：洗浄
第８工程：蛍光観察
【0022】
第１工程では、採取したサンプル（生物膜、生物膜懸濁液）を遠心分離し、上清を分離（廃棄）した後、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳということがある。）を混合し、再度遠心分離し、必要に応じこれを繰り返すことにより生物膜の濃縮及び洗浄を行う。
【0023】
１回の遠心分離は４９００－５０００Ｇで５－１０ｍｉｎ程度行うのが好ましい。ＰＢＳの混合量は、被洗浄物の体積量の１００－１０００倍程度が好ましい。
【0024】
第２工程のサンプル固定工程では、第１工程からのサンプル液にＰＢＳを添加し、次いで、所定の終濃度（例えば４％）となるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加し、所定時間（例えば０．５－１８時間）保存した後、遠心分離する。次いで、上清を分離した後、再度ＰＢＳを添加し、遠心分離する。この上清の分離、ＰＢＳ添加及び遠心分離を２～３回程度繰り返す。その後、沈殿物１体積当りＰＢＳを１０－１００体積、エタノールをＰＢＳと等量体積添加して混合する。この液を、ＦＩＳＨ用スライドガラスのｗｅｌｌに、１ｗｅｌｌ当たり５－１０μＬ程度滴下する。その後、６０℃で１０－３０ｍｉｎ程度乾燥することにより、サンプルの固定を行う。
【0025】
第３工程の脱水工程では、第２工程からのスライドガラスをエタノール水溶液に浸漬した後、風乾燥する。エタノール水溶液への浸漬を行うには、エタノール濃度の異なる複数のエタノール水を用意し、エタノール濃度の低いエタノール水から順次にエタノール濃度の高いエタノール水に浸漬することが好ましい。
【0026】
風乾後、密閉容器内に収容し、４６－６０℃にて保管する。なお、この密閉容器内にはハイブリダイゼーションバッファーまたはＷａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを適量存在させておき、モイストチャンバーとする。
【0027】
第４工程（イニシエーターＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション）では、イニシエーターＤＮＡプローブをハイブリダイゼーションバッファーで、最終濃度０．４－０．５μＭとなるように希釈し、この希釈液をスライドガラスに滴下し、４６－６０℃の湿潤環境の暗所に２－１８ｈｒ静置する。
【0028】
第５工程（洗浄）は、４８－６０℃に加温した洗浄液に３０－６０分浸漬することにより行うことが好ましい。
【0029】
この洗浄液は、緩衝液であることが好ましく、ＮａＣｌ０．０２－０．９Ｍ及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．０１ｗｔ％を含むｐＨ約７．５の溶液がより好ましい。洗浄後は、よく水を切ってから風乾することが好ましい。
【0030】
第６工程（伸長プローブの反応）では、後述の実施例に記載の、蛍光色素を結合させたＨ１Ｈ２プローブを別々に増幅緩衝液で希釈し、それぞれインキュベートした後、等モル量にて混合し、各ウェルに添加し、モイストチャンバー内にて３５℃で１－１８ｈｒ反応させる。
【0031】
蛍光色素としては、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 488など各種のものを用いることができる。
【0032】
第７工程（洗浄工程）では、スライドガラスを、洗浄液に４℃、１０ｍｉｎ浸漬した後、超純水に浸漬し、次いでエタノールに浸漬した後、風乾する。
【0033】
この洗浄液は界面活性剤を含むことが好ましい。伸長プローブの洗浄液に界面活性剤を添加すると、伸長プローブの自家蛍光生物膜に対する非特異的蛍光が抑制される。これにより、特異的ＤＮＡプローブが反応した生物の蛍光のみを検出できる。これにより、生物膜中のレジオネラ属菌をより明瞭に可視化することができる。界面活性剤としてはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などを用いることができる。洗浄液は、界面活性剤を含む緩衝液であることがより好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．０１ｗｔ％を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）が特に好ましい。
【0034】
第８工程（蛍光観察）では、上記のようにして準備したスライドグラスを蛍光顕微鏡に装着し、観察する。蛍光顕微鏡としては落射型蛍光顕微鏡が好適である。
【実施例0035】
［実験例－１，比較実験例１－１，比較実験例１－２］
＜実験目的＞
ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲを適用したレジオネラ属菌単独の蛍光増幅と、ＦＩＳＨを適用したレジオネラ属菌単独の蛍光増幅と、冷却塔採取生物膜の自家蛍光レベルとの比較を行う。
＜実験目的＞
ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲを適用したレジオネラ属菌単独の蛍光増幅と、ＦＩＳＨを適用したレジオネラ属菌単独の蛍光増幅と、冷却塔採取生物膜の自家蛍光レベルとの比較を行う。
【0036】
［実験例１］（Ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ法によるレジオネラ属菌の可視化と輝度）
＜実験条件＞
以下の第１～第７工程により、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲによるレジオネラ属菌可視化を行った。
＜実験条件＞
以下の第１～第７工程により、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲによるレジオネラ属菌可視化を行った。
【0037】
《生物膜中のレジオネラを可視化するためのｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲプロトコール》
第１工程（サンプルの濃縮、洗浄）の手順は以下の通りである。
・生物膜、生物膜を含む懸濁液をエッペンドルフチューブに入れる
・１回目 遠心分離 ４９００Ｇ、５ｍｉｎ、室温
・上清の除去
・ＰＢＳ（Phosphate-buffered saline）１ｍＬ添加
・２回目 遠心分離 ４９００Ｇ、５ｍｉｎ、室温
・上清の除去
・ＰＢＳ １ｍＬ添加
・３回目 遠心分離 ４９００Ｇ、５ｍｉｎ、室温
・上清の除去
第１工程（サンプルの濃縮、洗浄）の手順は以下の通りである。
・生物膜、生物膜を含む懸濁液をエッペンドルフチューブに入れる
・１回目 遠心分離 ４９００Ｇ、５ｍｉｎ、室温
・上清の除去
・ＰＢＳ（Phosphate-buffered saline）１ｍＬ添加
・２回目 遠心分離 ４９００Ｇ、５ｍｉｎ、室温
・上清の除去
・ＰＢＳ １ｍＬ添加
・３回目 遠心分離 ４９００Ｇ、５ｍｉｎ、室温
・上清の除去
【0038】
第２工程（サンプルの固定）は次の手順で行った。
・第１工程からのサンプルにＰＢＳを２００μＬ添加する。
・１２％パラホルムアルデヒド １００μＬを添加し、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液とした後、室温にて３０ｍｉｎ静置
・遠心分離 ４９００Ｇ、５ｍｉｎ、室温
・上清の除去
・ＰＢＳ １ｍＬ添加
・遠心分離 ４９００Ｇ、５ｍｉｎ、室温
・上清の除去
・ＰＢＳ １ｍＬ添加
・遠心分離 ４９００Ｇ、５ｍｉｎ、室温
・上清の除去
・ＰＢＳ ５０μＬ添加
・９９．５％エタノール５０μＬ添加
・ＦＩＳＨ用スライドガラスを用意し、キムタオルの上に載せる
・１ｗｅｌｌ当たり１０μＬ程度のサンプルをｗｅｌｌに滴下する。
・６０℃、１０～１５分間乾燥
・第１工程からのサンプルにＰＢＳを２００μＬ添加する。
・１２％パラホルムアルデヒド １００μＬを添加し、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液とした後、室温にて３０ｍｉｎ静置
・遠心分離 ４９００Ｇ、５ｍｉｎ、室温
・上清の除去
・ＰＢＳ １ｍＬ添加
・遠心分離 ４９００Ｇ、５ｍｉｎ、室温
・上清の除去
・ＰＢＳ １ｍＬ添加
・遠心分離 ４９００Ｇ、５ｍｉｎ、室温
・上清の除去
・ＰＢＳ ５０μＬ添加
・９９．５％エタノール５０μＬ添加
・ＦＩＳＨ用スライドガラスを用意し、キムタオルの上に載せる
・１ｗｅｌｌ当たり１０μＬ程度のサンプルをｗｅｌｌに滴下する。
・６０℃、１０～１５分間乾燥
【0039】
第３工程（脱水工程）の手順は以下の通りである。
・第２工程で乾燥させたスライドグラスを５０％エタノールに３ｍｉｎ，室温で浸漬する。
・次いで、８０％エタノールに１ｍｉｎ，室温で浸漬する。
・次いで９６％エタノールに１ｍｉｎ，室温で浸漬する。
・風乾 （１ｍｉｎ）する。
・蓋のある密閉容器にＷａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを５ｍＬ程度加え（モイストチャンバー）に収納し、蓋をしっかり閉めて４６℃に設定されたインキュベーターで温めておく。Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒの組成は以下の通りである。
５ Ｍ ＮａＣｌ ７００μＬ（０．７ｍＬ）
１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１ｍＬ
超純水 ４８．３ｍＬ
１０％ ＳＤＳ ５０μＬ
・第２工程で乾燥させたスライドグラスを５０％エタノールに３ｍｉｎ，室温で浸漬する。
・次いで、８０％エタノールに１ｍｉｎ，室温で浸漬する。
・次いで９６％エタノールに１ｍｉｎ，室温で浸漬する。
・風乾 （１ｍｉｎ）する。
・蓋のある密閉容器にＷａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを５ｍＬ程度加え（モイストチャンバー）に収納し、蓋をしっかり閉めて４６℃に設定されたインキュベーターで温めておく。Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒの組成は以下の通りである。
５ Ｍ ＮａＣｌ ７００μＬ（０．７ｍＬ）
１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１ｍＬ
超純水 ４８．３ｍＬ
１０％ ＳＤＳ ５０μＬ
【0040】
第４工程（イニシエーターＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション）は以下の手順で行った。
・イニシエーターＤＮＡプローブをハイブリダイゼーションバッファーに最終濃度０．５μＭになるよう希釈する。
イニシエーターＤＮＡプローブとして、Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ Ｈ配列 ＣＣＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡが菌を検出するプローブの５’末端に結合されているＤＮＡプローブを用いた。また、ハイブリダイゼーションバッファーの組成（１ｍＬ当り）は次の通りである。
・イニシエーターＤＮＡプローブをハイブリダイゼーションバッファーに最終濃度０．５μＭになるよう希釈する。
イニシエーターＤＮＡプローブとして、Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ Ｈ配列 ＣＣＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡが菌を検出するプローブの５’末端に結合されているＤＮＡプローブを用いた。また、ハイブリダイゼーションバッファーの組成（１ｍＬ当り）は次の通りである。
【0041】
デキストラン硫酸 １００ｍｇ
超純水 ３５０μＬ
５Ｍ ＮａＣｌ １８０μＬ
１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２０μＬ
ホルムアミド（ＦＡ）終温度３５％ ３５０μＬ
ブロッキング試薬(10% Blocking Reagent in PBS pH 7.0
Blocking Reagent: Roche REF
No.11096176001
For nucleic acid hybridization
and detection) １００μＬ
１０％ ＳＤＳ １μＬ
スライドガラスにプローブを約８μＬ滴下する。
超純水 ３５０μＬ
５Ｍ ＮａＣｌ １８０μＬ
１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２０μＬ
ホルムアミド（ＦＡ）終温度３５％ ３５０μＬ
ブロッキング試薬(10% Blocking Reagent in PBS pH 7.0
Blocking Reagent: Roche REF
No.11096176001
For nucleic acid hybridization
and detection) １００μＬ
１０％ ＳＤＳ １μＬ
スライドガラスにプローブを約８μＬ滴下する。
【0042】
・４６℃ 湿潤環境で１６時間 暗所・静置
【0043】
第５工程（洗浄）は以下の手順で行った。
【0044】
・Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを４８℃に設定したウォーターバスで保温する。Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒの組成は以下の通りである。
【0045】
５ Ｍ ＮａＣｌ ７００μＬ（０．７ｍＬ）
１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１ｍＬ
超純水 ４８．３ｍＬ
１０％ ＳＤＳ ５０μＬ
・十分浸る量の４８℃ ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを一回通す
・４８℃ ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに３０ｍｉｎ遮光下で浸漬する
・よく水を切って、風乾（３ｍｉｎ）し、遮光状態とする。
１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１ｍＬ
超純水 ４８．３ｍＬ
１０％ ＳＤＳ ５０μＬ
・十分浸る量の４８℃ ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを一回通す
・４８℃ ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに３０ｍｉｎ遮光下で浸漬する
・よく水を切って、風乾（３ｍｉｎ）し、遮光状態とする。
【0046】
第６工程（伸長プローブ（Ｈ１Ｈ２プローブ）の反応）は、次の手順で行った。
【0047】
・Ｈ１Ｈ２プローブを別々に５μＭになるように増幅緩衝液（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）に希釈する。
Ｈ１プローブ配列は５’ＴＣＴＡＧＴＣＧＴＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣ３’（３’側に蛍光色素として Alexa Fluor 488を結合させる）であり；Ｈ２プローブ配列は、５’ＣＣＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＴＴＧＴＡＴＴＣＧＧＴＴＡＴＣＴＧＴＣＧ３’（５’側に蛍光色素としてAlexa Fluor 488を結合させる）である。また、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒの組成（１ｍＬ当り）は以下の通りである。
Ｈ１プローブ配列は５’ＴＣＴＡＧＴＣＧＴＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣ３’（３’側に蛍光色素として Alexa Fluor 488を結合させる）であり；Ｈ２プローブ配列は、５’ＣＣＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＴＴＧＴＡＴＴＣＧＧＴＴＡＴＣＴＧＴＣＧ３’（５’側に蛍光色素としてAlexa Fluor 488を結合させる）である。また、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒの組成（１ｍＬ当り）は以下の通りである。
【0048】
デキストリン硫酸 １００ｍｇ
超純水 ６２０μＬ
５Ｍ ＮａＣｌ １８０μＬ
５００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ １００μＬ
ブロッキング試薬(10% Blocking Reagent in PBS pH 7.0
Blocking Reagent: Roche REF
No.11096176001
For nucleic acid hybridization
and detection) １００μＬ
１０％ ＳＤＳ １μＬ
・Ｈ１，Ｈ２プローブを９５℃９０秒、２５℃３０分インキュベートする
・Ｈ１，Ｈ２プローブを等量混合する（終濃度：２．５μＭ）
・各ウェルに約１０μＬ滴下する
・モイストチャンパー内にて３５℃で１ｈ反応させる。
超純水 ６２０μＬ
５Ｍ ＮａＣｌ １８０μＬ
５００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ １００μＬ
ブロッキング試薬(10% Blocking Reagent in PBS pH 7.0
Blocking Reagent: Roche REF
No.11096176001
For nucleic acid hybridization
and detection) １００μＬ
１０％ ＳＤＳ １μＬ
・Ｈ１，Ｈ２プローブを９５℃９０秒、２５℃３０分インキュベートする
・Ｈ１，Ｈ２プローブを等量混合する（終濃度：２．５μＭ）
・各ウェルに約１０μＬ滴下する
・モイストチャンパー内にて３５℃で１ｈ反応させる。
【0049】
用いたＤＮＡプローブ、細菌の一覧とその組み合わせを表１に示す。
【0050】
レジオネラ属菌にはLegionella pneumophila ATCC33153を用いた。
【0051】
マイナスコントロール用の微生物にはPseudomonas aeruginosaATCC15692を用いた。
【0052】
レジオネラ属を検出するための特異的プローブはＬＥＧ７０５プローブ Wermer Manz, et.al. In situ identification of Leigonellaceae using 16s rRNA-targeted oligonucleotide probes and confocal laser scanning microscopy Microbiology (1995), 141. 29-39を用いた。
【0053】
マイナスコントロール用のプローブはａｎｔｉ ＥＵＢ３３８プローブを用いた。
【0054】
また、伸長プローブ（Amplification probe H1H2）の非特異的反応の有無を明らかにするためにＤＮＡプローブを添加せず伸長プローブのみを反応させる系を実施した。
【0055】
伸長プローブＨ１の３’側、Ｈ２プローブの５’側に、それぞれAlexa Fluor 488蛍光色素（励起光４９５ｎｍ、蛍光５１９ｎｍ）を共有結合させた。
それぞれのプローブの塩基配列を表２に示す。
それぞれのプローブの塩基配列を表２に示す。
【0056】
【表1】
【0057】
【表2】
【0058】
第７工程（洗浄）は以下の手順で行った。
・スライドグラスの液がのっている面を下にし、スライドグラスを指ではじいて液を落とす。
・５０ｍＬの０．０１％ＳＤＳを含む１×ＰＢＳ（伸長プローブ洗浄液）に浸し、４℃で１０分間洗浄した後、スライドグラスを洗浄液から取り出して、スライドグラスの表面の液が切れるまで静置する。
・超純水に３０秒浸漬する。
・９６％エタノールに３０秒間浸漬する。
・風乾し、４℃で保存する。
・スライドグラスの液がのっている面を下にし、スライドグラスを指ではじいて液を落とす。
・５０ｍＬの０．０１％ＳＤＳを含む１×ＰＢＳ（伸長プローブ洗浄液）に浸し、４℃で１０分間洗浄した後、スライドグラスを洗浄液から取り出して、スライドグラスの表面の液が切れるまで静置する。
・超純水に３０秒浸漬する。
・９６％エタノールに３０秒間浸漬する。
・風乾し、４℃で保存する。
【0059】
第８工程（蛍光観察）は、落射蛍光顕微鏡ＢＸ５２（オリンパス）で実施した。ダイクロイックミラーはＵ－ＭＷＩＢ３を用い、対物レンズは倍率６０倍を用いて観察した。
【0060】
撮影はアプリケーションｃｅｌｌｓｅｎｃｅを用いて行い、輝度の定量は同アプリケーション中のプロファイリング機能で定量した。
【0061】
［比較実験例１－１］
＜実験目的＞
ＦＩＳＨ法によるレジオネラ属菌の可視化と輝度測定を行った。
＜実験目的＞
ＦＩＳＨ法によるレジオネラ属菌の可視化と輝度測定を行った。
【0062】
＜実験条件＞
用いた細菌は実験例１と同じである。
用いた細菌は実験例１と同じである。
【0063】
ＤＮＡプローブには、実験例１と同じＬＥＧ７０５とａｎｔｉＥＵＢ３３８（それぞれ５’末端にAlexa Fluor 488を結合）を用いた。
【0064】
ＦＩＳＨ法によるハイブリダイゼーションのプロトコールは、以下のように、第１工程－第３工程は実験例－１と同一とし、以下の第４工程及び第５工程と第６工程（実験例－１の第８工程に相当）とを行った。
【0065】
《ＦＩＳＨによるレジオネラ可視化のプロトコール》
第１～第３工程は、実験例１の第１～第３工程と同一。
第１～第３工程は、実験例１の第１～第３工程と同一。
【0066】
第４工程（ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション）の手順は、以下の通りである。
・ＤＮＡプローブをハイブリダイゼーションバッファーに最終濃度５００ｎｇ／１００μＬになるよう希釈する。ＤＮＡプローブとしては、Alexa Fluor 488蛍光色素が５’末端に結合されているＤＮＡプローブを用いた。ハイブリダイゼーションバッファーの組成（最終濃度）は、以下の通りである。
・ＤＮＡプローブをハイブリダイゼーションバッファーに最終濃度５００ｎｇ／１００μＬになるよう希釈する。ＤＮＡプローブとしては、Alexa Fluor 488蛍光色素が５’末端に結合されているＤＮＡプローブを用いた。ハイブリダイゼーションバッファーの組成（最終濃度）は、以下の通りである。
【0067】
０．９Ｍ ＮａＣｌ
０．０１％ ＳＤＳ
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．６
・スライドガラスにプローブを約８μＬ滴下
・６０℃ 密閉容器にハイブリダイゼーションバッファーを１ｍＬ添加し、台の上にスライドグラスを置いて、湿潤環境で１６時間暗所に静置
０．０１％ ＳＤＳ
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．６
・スライドガラスにプローブを約８μＬ滴下
・６０℃ 密閉容器にハイブリダイゼーションバッファーを１ｍＬ添加し、台の上にスライドグラスを置いて、湿潤環境で１６時間暗所に静置
【0068】
第５工程（洗浄）の手順は、以下の通りである。
・洗浄用緩衝液を６０℃に設定したウォーターバスで保温する。洗浄用緩衝液の組成（最終濃度）は、以下の通りである。
・洗浄用緩衝液を６０℃に設定したウォーターバスで保温する。洗浄用緩衝液の組成（最終濃度）は、以下の通りである。
【0069】
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２
１８０ｍＭ ＮａＣｌ
０．０１％ ＳＤＳ
・６０℃の洗浄用緩衝液（十分浸る量）に一回通す
・６０℃の洗浄用緩衝液に１５ｍｉｎ浸す（遮光下）。
・５００ｍＬビーカーに超純水を入れて、スライドグラス全体を浸す。
・よく水を切って、そのあと風乾（３ｍｉｎ）する（遮光下）。
１８０ｍＭ ＮａＣｌ
０．０１％ ＳＤＳ
・６０℃の洗浄用緩衝液（十分浸る量）に一回通す
・６０℃の洗浄用緩衝液に１５ｍｉｎ浸す（遮光下）。
・５００ｍＬビーカーに超純水を入れて、スライドグラス全体を浸す。
・よく水を切って、そのあと風乾（３ｍｉｎ）する（遮光下）。
【0070】
第６工程（蛍光観察）は、実験例１の第８工程と同一条件で実施した。
【0071】
［比較実験例１－２］（冷却塔採取生物膜の自家蛍光の観察）
＜実験条件＞
冷却塔Ｄ２ＣＴ２から採取した生物膜を用いた。レジオネラ属菌検出用のプローブを添加せずに比較実験例１－１と同じ工程を行ったのち、蛍光観察を実施した。
＜実験条件＞
冷却塔Ｄ２ＣＴ２から採取した生物膜を用いた。レジオネラ属菌検出用のプローブを添加せずに比較実験例１－１と同じ工程を行ったのち、蛍光観察を実施した。
【0072】
＜実験例１、比較実験例１－１、比較実験例１－２の結果・考察＞
図１～３に蛍光画像を示す。図１は、実験例１（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの蛍光像 ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ）である。図２は、比較実験例１－１（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの蛍光像 ＦＩＳＨ）、図３は、比較実験例１－２（冷却塔から採取した藻と細菌の生物膜（Ｄ２ＣＴ２－２）の自家蛍光像である。
図１～３に蛍光画像を示す。図１は、実験例１（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの蛍光像 ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ）である。図２は、比較実験例１－１（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの蛍光像 ＦＩＳＨ）、図３は、比較実験例１－２（冷却塔から採取した藻と細菌の生物膜（Ｄ２ＣＴ２－２）の自家蛍光像である。
【0073】
蛍光画像の輝度の測定結果を表３に示す。表３の通り、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの蛍光はｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲを適用した実験例１では、ＦＩＳＨ法を採用した比較実験例１－１の約２倍になった。
【0074】
比較実験例１－２で測定した、冷却塔から採取した生物膜の自家蛍光は、比較実験例１－１でＦＩＳＨ法により蛍光染色されたＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの蛍光よりも強かった。
【0075】
ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲを適用した実験例１のＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａの輝度は生物膜の自家蛍光と同等以上であった。
【0076】
【表3】
【0077】
［実験例２，比較実験例２－１，２－２］
＜実験目的＞
冷却塔生物膜に対する伸長プローブの非特異的蛍光と、界面活性剤添加による非特異的蛍光の抑制効果を確認する。
＜実験目的＞
冷却塔生物膜に対する伸長プローブの非特異的蛍光と、界面活性剤添加による非特異的蛍光の抑制効果を確認する。
【0078】
［実験例２］
＜実験条件＞
比較実験例１－２と同じ冷却塔Ｄ２ＣＴ２から採取した生物膜について非特異的蛍光を測定した。実験条件は、プロトコールにおいてイニシエーターＤＮＡプローブを添加しなかったことを除いて、実験例１と同一とした。
＜実験条件＞
比較実験例１－２と同じ冷却塔Ｄ２ＣＴ２から採取した生物膜について非特異的蛍光を測定した。実験条件は、プロトコールにおいてイニシエーターＤＮＡプローブを添加しなかったことを除いて、実験例１と同一とした。
【0079】
［比較実施例２－１］（伸長プローブ（Ｈ１Ｈ２プローブ）洗浄液に界面活性剤が添加されていない場合）
＜実験条件＞
実験条件は、伸長プローブ洗浄液にＳＤＳを添加しなかったことを除いて、実験例２と同一とした。
＜実験条件＞
実験条件は、伸長プローブ洗浄液にＳＤＳを添加しなかったことを除いて、実験例２と同一とした。
【0080】
［比較実験例２－２］（冷却塔生物膜に対する伸長プローブの非特異的蛍光抑制における界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０の効果）
＜実験条件＞
実験条件は、伸長プローブ洗浄液に、界面活性剤として、ＳＤＳに替えてＴｗｅｅｎ２０を０．０１ｗｔ％添加したこと以外は実験例２と同一とした。
＜実験条件＞
実験条件は、伸長プローブ洗浄液に、界面活性剤として、ＳＤＳに替えてＴｗｅｅｎ２０を０．０１ｗｔ％添加したこと以外は実験例２と同一とした。
【0081】
【0082】
【0083】
また、図４（ｂ），５（ｂ），６（ｂ）に数字１～５、６～１０で示した地点の輝度を表４～６に示す。表４～６の通り、Ｈ１Ｈ２の非特異的反応から生ずる緑色蛍光の輝度は２００以上であった。ＳＤＳを添加したことによりあばた状の強い緑色蛍光は消失し、輝度は１００程度で、半減されたことが判る。
【0084】
ＳＤＳとＴｗｅｅｎ２０とについて非特異的反応抑制の効果を比較すると、Ｔｗｅｅｎ２０は、同濃度のＳＤＳと比較して、緑色の蛍光を示す藻が多く、また、細胞間にも緑色蛍光の沈着が認められた。その輝度を測定すると、ＳＤＳ添加による洗浄より露光時間が短いにもかかわらず、約２倍の値を示した。このことから、界面活性剤としては、ＳＤＳの方が非特異的反応抑制効果に優れていると考えられる。
【0085】
【表4】
【0086】
【表5】
【0087】
【表6】
【0088】
［実施例１～３、比較例１～３］
＜実験目的＞
レジオネラと共培養した生物膜に対するレジオネラ属特異的ＤＮＡプローブの反応について、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ法（実施例）の場合とＦＩＳＨ法（比較例）の場合で比較する。
＜実験目的＞
レジオネラと共培養した生物膜に対するレジオネラ属特異的ＤＮＡプローブの反応について、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ法（実施例）の場合とＦＩＳＨ法（比較例）の場合で比較する。
【0089】
［実施例１］（L. pneumophilaとD2CT2-2生物膜を共培養した生物膜に対するin situ HCR適用例）
＜実験条件＞
共培養に用いた培地は藻に用いるＭＡ培地（ＭＡ：Media for freshwater, terrestrial, hot spring and salt water algae）を用いた。組成を下記に示す。（Ichimura, T. 1979 2. Isolation and culture methods of algae. 2.5.B.
Freshwater algae [2. Sorui no bunri to baiyoho. 2.5.B. Tansui sorui]. In
Methods in Phycological Studies [Sorui Kenkyuho], Eds. by Nishizawa, K. and
Chihara, M., Kyoritsu Shuppan, Tokyo, p. 294-305 (in Japanese without English
title).）
＜ＭＡ培地組成＞
Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ ５ｍｇ
ＫＮＯ３ １０ｍｇ
ＮａＮＯ３ ５ｍｇ
Ｎａ２ＳＯ４ ４ｍｇ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ５ｍｇ
β－Na２glycerophosphate・５Ｈ２Ｏ １０ｍｇ
Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．０５ｍｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ
ＺｎＣｌ２ ０．０５ｍｇ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０８ｍｇ
Ｈ３ＢＯ３ ２ｍｇ
Ｂｉｃｉｎｅ ５０ｍｇ
蒸留水 １００ｍＬ
ｐＨ ８．６
＜実験条件＞
共培養に用いた培地は藻に用いるＭＡ培地（ＭＡ：Media for freshwater, terrestrial, hot spring and salt water algae）を用いた。組成を下記に示す。（Ichimura, T. 1979 2. Isolation and culture methods of algae. 2.5.B.
Freshwater algae [2. Sorui no bunri to baiyoho. 2.5.B. Tansui sorui]. In
Methods in Phycological Studies [Sorui Kenkyuho], Eds. by Nishizawa, K. and
Chihara, M., Kyoritsu Shuppan, Tokyo, p. 294-305 (in Japanese without English
title).）
＜ＭＡ培地組成＞
Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ ５ｍｇ
ＫＮＯ３ １０ｍｇ
ＮａＮＯ３ ５ｍｇ
Ｎａ２ＳＯ４ ４ｍｇ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ５ｍｇ
β－Na２glycerophosphate・５Ｈ２Ｏ １０ｍｇ
Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ０．０５ｍｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ
ＺｎＣｌ２ ０．０５ｍｇ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．５ｍｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０８ｍｇ
Ｈ３ＢＯ３ ２ｍｇ
Ｂｉｃｉｎｅ ５０ｍｇ
蒸留水 １００ｍＬ
ｐＨ ８．６
【0090】
上記のＭＡ培地５０ｍＬを１００ｍＬ容三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分オートクレーブ滅菌した。
【0091】
冷却塔から採取した、藻と細菌からなる生物膜Ｄ２ＣＴ２を、Ａ６６０ｎｍ吸光度１．０に合わせて、滅菌済みＭＡ培地に１／５０容量添加し、懸濁させた。
【0092】
レジオネラ属菌にはＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ３３１５１ を用い、ＢＣＹＥα寒天培地を用いて３０℃で培養し、Ａ６６０ｎｍ吸光度０．１の懸濁液を作成し、ＭＡ培地の１／１００容量を添加した。
【0093】
これを北向きの窓辺で約一ヶ月室温静置した。室温は２５－２８℃であった。
【0094】
この生物膜を１ｍＬ採取し、ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲに供した。ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲの実験方法は実験例１と同様に行った。
【0095】
［比較例１］（実施例１と同条件で共培養した生物膜に対するＦＩＳＨ法によるレジオネラ属菌のＤＮＡプローブの反応）
＜実験条件＞
共培養は実施例１と同様に行なった。サンプルをＦＩＳＨ法に供した。ＦＩＳＨ法は比較実験例１－１と同様に実施した。
＜実験条件＞
共培養は実施例１と同様に行なった。サンプルをＦＩＳＨ法に供した。ＦＩＳＨ法は比較実験例１－１と同様に実施した。
【0096】
【0097】
図７の通り、実施例（Ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ法を適用）の生物膜中にレジオネラ属特異的ＤＮＡプローブが反応したとみられる蛍光が観察された。これは大きさと、形からレジオネラ属菌と考えられる。
【0098】
レジオネラ属特異的ＤＮＡプローブが反応した微生物のなかには、図８，９の通り、フィラメント状のものも観察された。
【0099】
このように、ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲの適用により自家蛍光を示す藻の生物膜中のレジオネラ属菌を可視化することが可能になった。
【0100】
その結果、藻と細菌の生物膜内でレジオネラ属菌がフィラメント化していると考えられた。これは従来アメーバなどの細菌捕食性細胞内で報告されているレジオネラ属菌の形態が桿菌あるのに対して新しい知見である。
【0101】
一方、比較例１（ＦＩＳＨ法を適用）の生物膜では、図１０の通り、生物膜周辺にレジオネラ属特異的ＤＮＡプローブが反応した細菌と考えられる蛍光が観察されても、生物膜内の細菌類を判別することはできなかった。なお、図１０，１１において、〇すなわち円形（楕円形）の線分で囲まれた部分が、レジオネラ属検出用プローブ由来の緑色蛍光輝度測定部分である。
【0102】
また、図１１の通り、生物膜周辺であってもレジオネラ属特異的ＤＮＡプローブが反応した微生物の蛍光が弱く、フィラメント化した形態は判然としなかった。
ＤＮＡプローブ反応生物の輝度と周辺の生物膜の輝度の測定結果を表７に示す。
ＤＮＡプローブ反応生物の輝度と周辺の生物膜の輝度の測定結果を表７に示す。
【0103】
【表7】
【0104】
表７の通り、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ法を適用した実施例１の場合、レジオネラ属菌検出用プローブが反応した部分の輝度は生物膜部分の０．８－１．６倍の範囲であった。これは、生物膜と同等かそれ以上の輝度であることを示す。
【0105】
一方ＦＩＳＨ法を適用した比較例１の場合、レジオネラ検出用プローブが反応したと思われる輝度は０．４－０．５倍で、生物膜の輝度の半分程度であった。
【0106】
このような理由で、ＦＩＳＨ法では不可能な観察が、ｉｎ ｓｉｔｕ ＨＣＲ法を適用することにより可能になったと考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】