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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024031190
(43)【公開日】2024-03-07
(54)【発明の名称】遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20240229BHJP
C12Q 1/26 20060101ALI20240229BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z
C12Q1/26
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022134594
(22)【出願日】2022-08-26
(71)【出願人】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】黒田 章夫
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 哲也
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ42
4B063QQ62
4B063QR32
4B063QR42
4B063QS25
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法の提供を目的とする。
【解決手段】本発明に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法は、検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物を検出する方法であって、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びマグネシウム化合物を含む容器内に、前記検査対象物から検体を採取するステップと、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ、前記マグネシウム化合物、前記検体に含まれる前記残留産物、及び酸素の反応により生じる発光の発光量を測定するステップと、前記発光量が基準値よりも高い場合に、前記残留産物が存在すると判定するステップとを含む。
【選択図】なし
【解決手段】本発明に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法は、検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物を検出する方法であって、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びマグネシウム化合物を含む容器内に、前記検査対象物から検体を採取するステップと、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ、前記マグネシウム化合物、前記検体に含まれる前記残留産物、及び酸素の反応により生じる発光の発光量を測定するステップと、前記発光量が基準値よりも高い場合に、前記残留産物が存在すると判定するステップとを含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物を検出する方法であって、
ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びマグネシウム化合物を含む容器内に、前記検査対象物から検体を採取するステップと、
前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ、前記マグネシウム化合物、前記検体に含まれる前記残留産物、及び酸素の反応により生じる発光の発光量を測定するステップと、
前記発光量が基準値よりも高い場合に、前記残留産物が存在すると判定するステップとを含む遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法。
ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びマグネシウム化合物を含む容器内に、前記検査対象物から検体を採取するステップと、
前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ、前記マグネシウム化合物、前記検体に含まれる前記残留産物、及び酸素の反応により生じる発光の発光量を測定するステップと、
前記発光量が基準値よりも高い場合に、前記残留産物が存在すると判定するステップとを含む遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法。
【請求項2】
前記ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ及びルシフェラーゼＦＭ ＰＬＵＳから選択される、請求項１に記載の遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法。
【請求項3】
前記検体を採取するステップにおいて、前記検体は、前記検査対象物を拭き取ることで採取される、請求項１に記載の遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法に関し、特に検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、刑事裁判において、客観的証拠が重要視されるようになり、犯罪捜査における科学鑑定の果たす役割が大きくなっている。中でもＤＮＡ型鑑定は、高い個人識別力を有するため、犯罪を立証する上で非常に有用である。しかし、ＤＮＡ型鑑定は高感度な鑑定法であることから、コンタミネーションの影響を受けやすく、その発生は誤認逮捕や冤罪といった人権問題に発展するおそれがある。そのため、ＤＮＡ型鑑定を行うにあたっては厳格な品質管理が求められている。
【0003】
現在、ＤＮＡ型鑑定施設では、クリーンルーム内での作業や作業エリアの区分け、使用器具の洗浄等コンタミネーションの発生防止策が講じられているが、例えばＰＣＲ後の試料を扱う区域（ポストＰＣＲエリア）における遺伝子増幅反応による残留産物の管理は重要とされている。例えばＰＣＲにより、ヒトＤＮＡは数億倍に増幅されるため、極めて微量の遺伝子増幅反応による残留産物でも試料に混入すれば、ＤＮＡ型として検出され得る。そのため、ポストＰＣＲエリアにおける作業台や使用器具等の洗浄は、コンタミネーションの発生を未然に防ぐ上で非常に重要である。
【0004】
従来、細菌等による汚染の検出については、例えばＡＴＰを指標として汚染の検出が行われている。例えば、特許文献１には、ルシフェリン・ルシフェラーゼ発光試薬を用いてＡＴＰを汚染指標とした清浄度検査法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開平１１－０６９９９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
遺伝子増幅反応後の試料を扱う区域における遺伝子増幅反応による残留産物の管理が重要視される一方で、その管理方法は、所定の方法で定期的に洗浄することにとどまっており、食品衛生等の現場で実施されているような例えば特許文献１の方法等を利用した残留物の検出に基づく洗浄法のバリデーションや汚染物のモニタリングは行われていない。その理由として、遺伝子増幅反応による残留産物の迅速、簡便、安価な検出法が確立されていないことが挙げられる。現行の方法では、ＤＮＡ型鑑定と同じプロセスで遺伝子増幅反応による残留産物の検出が行われているが、１検体あたり５千円を超えるコストがかかり、検出が完了するまでに半日程度を要することから、非常に高価で手間と時間がかかる。これらデメリットが障壁となり、遺伝子増幅反応による残留産物に対する洗浄法のバリデーションや当該残留産物のモニタリングが適時適切に行われていない。
【0007】
本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物を安価且つ簡便に検出できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウム化合物、検体から採取した遺伝子増幅反応による残留産物、及び酸素の反応により生じる発光の発光量を測定し、測定した発光量が基準値よりも高いか否かを比較することにより、検査対象物に存在する当該残留産物を迅速、簡便かつ安価に検出できることを見出して本発明を完成した。
【0009】
具体的に、本発明に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法は、検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物を検出する方法であって、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びマグネシウム化合物を含む容器内に、前記検査対象物から検体を採取するステップと、前記ルシフェリン、前記ルシフェラーゼ、前記マグネシウム化合物、前記検体に含まれる前記残留産物、及び酸素の反応により生じる発光の発光量を測定するステップと、前記発光量が基準値よりも高い場合に、前記残留産物が存在すると判定するステップとを含むことを特徴とする。
【0010】
本発明に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法は、該残留産物に含まれるｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）とルシフェリン、ルシフェラーゼ及びマグネシウム化合物との反応により生じる発光を検出することを原理とするものである。本発明に係る方法は、上記の通り、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用するものであり、簡便、安価且つ迅速に行うことができる。
【0011】
本発明に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法において、前記ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ及びルシフェラーゼＦＭ ＰＬＵＳから選択することができる。
【0012】
本発明に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法において、前記検体を採取するステップにおいて、前記検体は、前記検査対象物を拭き取ることで採取することができる。このため、検体を容易に採取することができ、検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物の検出を簡便に行うことができる。
【発明の効果】
【0013】
本発明に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法によると、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウム化合物、検体から採取した遺伝子増幅反応による残留産物、及び酸素の反応により生じる発光の発光量を測定し、測定した発光量が基準値よりも高い場合に、検査対象物に当該残留産物が存在すると判定できるため、検査対象物に存在する当該残留産物を迅速、簡便かつ安価に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明を実施するための形態を説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【0016】
≪実施形態１≫
本発明の一実施形態は、遺伝子増幅反応による残留産物に含まれるｄＡＴＰのルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する検出方法である。
本発明の一実施形態は、遺伝子増幅反応による残留産物に含まれるｄＡＴＰのルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する検出方法である。
【0017】
本実施形態は、検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物を検出する方法である。特に、本実施形態に係る方法は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びマグネシウム化合物を含む容器内に、検査対象物から検体を採取するステップと、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウム化合物、検体に含まれる遺伝子増幅反応による残留産物、及び酸素の反応により生じる発光の発光量を測定するステップと、測定した発光量が基準値よりも高い場合に、当該残留産物が存在すると判定するステップとを含む方法である。
【0018】
本実施形態において、検体は、例えば実験器具、分析機器及び作業台等実験施設の検査対象物から任意の方法で採取することができる。実験器具としては、例えば試験管、ピペット、ＰＣＲチューブリテーナー等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本実施形態において、検体は、特にポストＰＣＲエリア等の遺伝子増幅反応後の試料を扱う区域内の検査対象物から採取することができる。なお、ポストＰＣＲエリアとは、ＰＣＲ後の増幅産物を扱う区域を指し、本実施形態においては、作業者が手袋、マスク、白衣等の防護具を着用し、定期的なデコンタミネーションが行われているポストＰＣＲエリアであることが好ましい。
【0019】
本実施形態において、遺伝子増幅反応による残留産物とは、遺伝子増幅反応実験の取り扱いによって得られる物質が残留したものを指す。この遺伝子増幅反応による残留産物は、遺伝子増幅反応を実施した後の反応溶液のみを含むのではなく、遺伝子増幅反応を実施する前のＤＮＡ溶液又はＲＮＡ溶液を含むものである。本実施形態において、遺伝子増幅反応による残留産物としては、例えば他の実験における遺伝子増幅反応による残留産物等が挙げられる。例えば、実験操作中における遺伝子増幅反応による残留産物溶液の液はね、ピペット操作による飛散、又は微粒子として空気中に飛散する等により、検査対象物に当該残留産物が付着する。遺伝子増幅反応による残留産物中の物質の種類は特に制限されず、２種類以上の物質が混合したものであってもよい。このような遺伝子増幅反応による残留産物は、クロスコンタミネーションの要因となるため、迅速、簡便、安価に検出できるようにすることが望まれている。本実施形態において、遺伝子増幅反応による残留産物は、通常、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）を含み、特に、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）を含む。
【0020】
本実施形態において、遺伝子増幅反応は、例えばＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＴ－ＬＡＭＰ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＭＤＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及びＤＯＰ－ＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）等が挙げられる。これらの遺伝子増幅反応による残留産物は、通常、ｄＮＴＰを含み、特にｄＡＴＰを含む。
【0021】
本実施形態において、遺伝子増幅反応による残留産物に対する発光試薬として、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びマグネシウム化合物を少なくとも含む試薬を使用することができる。
【0022】
本実施形態において、ルシフェリンは、例えば以下の化学式で表されるホタルルシフェリン（Ｄ－ルシフェリン）を使用することができる。また、ホタルルシフェリンのみに限定されるものではなく、ホタルルシフェリン塩又はホタルルシフェリン誘導体を適宜使用することができるし、ホタルルシフェリン以外の既知のルシフェリンを使用することもできる。
【0023】
【化1】
【0024】
本実施形態において、マグネシウム化合物は、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含む化合物、例えば酢酸マグネシウム（Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２）等を使用することができる。また、酢酸マグネシウムに限定されるものではなく、その他の既知のマグネシウム化合物を使用することができる。
【0025】
本実施形態において、ルシフェラーゼは、例えばホタルルシフェラーゼを使用することができ、野生型ホタルルシフェラーゼ及び野生型ホタルルシフェラーゼの改変体等を使用することができる。野生型ホタルルシフェラーゼの改変体としては、例えばルシフェラーゼＦＭ ＰＬＵＳ（バイオエネックス社）等を使用することができる。また、当技術分野において野生型ホタルルシフェラーゼの改変体として既知のものは、全て使用することができる。
【0026】
本実施形態において、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）を基質とするルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びマグネシウム化合物の反応は、以下の式で表される。なお、ホタルルシフェラーゼを用いた場合、この反応により極大波長（λｍａｘ）が６０５ｎｍである発光が観察される。下記式において、ｄＡＭＰはデオキシアデノシン一リン酸を指し、ＰＰｉはＰ２Ｏ７
４－を指す。
【0027】
【化2】
【0028】
本実施形態において、容器は、例えば樹脂製容器及びガラス製容器等を使用することができるが、これに制限されるものではない。
【0029】
本実施形態において、容器は、抽出試薬をさらに含むことができる。抽出試薬は、検査対象物から採取した検体に含まれる物質を抽出するための試薬であり、例えば塩化ベンザルコニウム等の界面活性剤の他、滅菌水等を使用することができる。
【0030】
本実施形態において、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びマグネシウム化合物を含む容器内に、検査対象物から検体を採取するステップは、任意の方法で行うことができ、採取道具も適宜使用することができる。例えば採取道具として綿棒を使用する場合は、綿棒の先端部にある綿球部で検査対象物の表面をこすって検体を綿球部に吸着させ、綿球部を容器内に移した後に抽出試薬を添加し、綿球部から検体を抽出することによって採取することができる。また、あらかじめ容器内に含ませた抽出試薬に検体を吸着させた綿球部を浸漬させることで検体の抽出を行うこともできる。なお、綿棒は、乾燥した綿球部のものを使用することができるし、湿潤した綿球部のものを使用することもできる。また、乾燥した綿球部のものを使用する場合は、綿球部を湿らせて使用することもできる。
【0031】
本実施形態において、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウム化合物、検体に含まれる遺伝子増幅反応による残留産物、及び酸素の反応により生じる発光の発光量を測定するステップは、発光測定装置を用いて、上記反応により生じる発光の発光量を測定することで行うことができる。発光測定装置は、例えばルミテスターＣ－１０００（キッコーマンバイオケミファ社製）及びＳｙｓｔｅｍＳＵＲＥ Ｐｌｕｓ（Ｈｙｇｉｅｎａ社製）等が挙げられ、ＲＬＵを単位とする発光量として測定することができる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウム化合物、検体に含まれる遺伝子増幅反応による残留産物のｄＡＴＰ、及び酸素による発光は、６０５ｎｍを極大波長（λｍａｘ）とする発光として観測されるため、当該発光の発光量を測定することで、検体中に遺伝子増幅反応による残留産物が含まれているか否かを判定することができる。一方、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウム化合物、ＡＴＰ、及び酸素の反応により生じる発光は、５６０ｎｍを極大波長（λｍａｘ）とする発光として観測されるが（後述する）、作業者が手袋、マスク、白衣等の防護具を着用し、定期的にデコンタミネーションが行われているような遺伝子増幅反応後の試料を扱う区域内の検査対象物は、通常ＡＴＰを含まないため、この反応によって遺伝子増幅反応による残留産物の誤検出につながるおそれはない。なお、ＡＴＰは、例えば菌、微生物、肉、魚、野菜等の食物、ヒトの汗、唾液などの体液等に含まれている。
【0032】
また、本実施形態において、遺伝子増幅反応による残留産物の存在の有無の判定は、基準値と比較して行うことができる。基準値は適宜設定することができるため特に制限されないが、例えば、ｄＡＴＰを含まない溶液を陰性対照として、検体と同様に測定して得られた値を基準値とし、当該基準値よりも検体に対する測定値が大きければ、遺伝子増幅反応による残留産物が存在すると判定することができる。その他に、過去の測定値に基づいて基準値を予め定めることもできる。そのような場合、例えば１ＲＬＵを基準値とすることができる。例えば、測定される発光量が１ＲＬＵよりも大きい場合は、検体に遺伝子増幅反応による残留産物が含まれていると判定することができ、一方で、測定される発光量が１ＲＬＵ以下であれば、検体に当該残留産物が含まれていないと判定することができる。また、２つ以上の基準値を設定することもできる。
【0033】
本実施形態に係る遺伝子増幅反応による残留産物を検出する方法は、例えば検査キットを使用して行うことができる。検査キットは、例えばＵｌｔｒａＳｎａｐ（Ｈｙｇｉｅｎａ社製）等のＡＴＰふき取り検査キットを用いることができる。
【0034】
本実施形態に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法によると、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウム化合物、ｄＡＴＰを含む遺伝子増幅反応による残留産物、及び酸素の反応により生じる発光の発光量を測定し、測定した発光量が基準値よりも高い場合に、検査対象物に当該残留産物が存在すると判定できる。そのため、検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物を迅速、簡便かつ安価に検出することができる。
【0035】
≪実施形態２≫
本発明の他の一実施形態は、遺伝子増幅反応による残留産物に含まれるｄＡＴＰ及びＡＴＰのルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する検出方法である。それ以外の内容は上述した実施形態１と同様であり、本実施形態に組み込まれる。
本発明の他の一実施形態は、遺伝子増幅反応による残留産物に含まれるｄＡＴＰ及びＡＴＰのルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する検出方法である。それ以外の内容は上述した実施形態１と同様であり、本実施形態に組み込まれる。
【0036】
本実施形態において、遺伝子増幅反応による残留産物の定義等は上述の通りである。また、本実施形態において、遺伝子増幅反応は、例えばＲＰＡ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＤＡ（ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及びＴＲＣ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）等が挙げられる。これらの遺伝子増幅反応による残留産物は、通常、ｄＮＴＰ及びＮＴＰを含み、特にｄＡＴＰ及びＡＴＰを含む。
【0037】
本実施形態において、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を基質とするルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びマグネシウム化合物の反応は、以下の式で表される。なお、ホタルルシフェラーゼを用いた場合、この反応により極大波長（λｍａｘ）が５６０ｎｍである発光が観察される。下記式において、ＡＭＰはアデノシン一リン酸を指し、ＰＰｉはＰ２Ｏ７
４－を指す。
【0038】
【化3】
【0039】
本実施形態のように、遺伝子増幅反応による残留産物がｄＡＴＰ及びＡＴＰの両方を含む場合、ｄＡＴＰのルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による６０５ｎｍを極大波長（λｍａｘ）とする発光に加えて、ＡＴＰのルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による５６０ｎｍを極大波長（λｍａｘ）とする発光も観測される。このため、これらの発光量の合計値が検出される。一方で、作業者が手袋、マスク、白衣等の防護具を着用し、定期的にデコンタミネーションが行われているような遺伝子増幅反応後の試料を扱う区域内における検査対象物は、通常、当該区域外から混入するＡＴＰを含まない。このため、上記発光量の合計値と基準値を比較することにより、遺伝子増幅反応後の試料を扱う区域内において遺伝子増幅反応による残留産物が存在するか否かを判定することができる。なお、基準値の設定は適宜行うことができ、上述した通りである。
【0040】
本実施形態に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法によると、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウム化合物、ｄＡＴＰ及びＡＴＰを含む遺伝子増幅反応による残留産物、及び酸素の反応により生じる発光の発光量を測定し、測定した発光量が基準値よりも高い場合に、検査対象物に当該残留産物が存在すると判定できる。そのため、検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物を迅速、簡便かつ安価に検出することができる。
【実施例0041】
以下に、本発明に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法について詳細に説明するための実施例を示す。以下、その方法及び結果について説明する。
【0042】
＜材料＞
ルシフェラーゼ溶液としてルシフェールＨＳ（キッコーマンバイオケミファ社製）の発光試薬ＨＳを使用した。発光試薬ＨＳは、Ｄ－ルシフェリン、ホタルルシフェラーゼ、及び酢酸マグネシウムを含むルシフェラーゼ溶液である。また、高感度ルシフェラーゼ溶液としてルシフェラーゼＦＭ ＰＬＵＳ（バイオエネックス社製）のＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥ ＦＭ プラス凍結乾燥品を使用した。ＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥ ＦＭ プラス凍結乾燥品は、Ｄ－ルシフェリン、ルシフェラーゼＦＭ ＰＬＵＳ、及び酢酸マグネシウムを含む高感度ルシフェラーゼ溶液である。また、ＴＥバッファーは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のものを購入して使用した。
ルシフェラーゼ溶液としてルシフェールＨＳ（キッコーマンバイオケミファ社製）の発光試薬ＨＳを使用した。発光試薬ＨＳは、Ｄ－ルシフェリン、ホタルルシフェラーゼ、及び酢酸マグネシウムを含むルシフェラーゼ溶液である。また、高感度ルシフェラーゼ溶液としてルシフェラーゼＦＭ ＰＬＵＳ（バイオエネックス社製）のＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥ ＦＭ プラス凍結乾燥品を使用した。ＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥ ＦＭ プラス凍結乾燥品は、Ｄ－ルシフェリン、ルシフェラーゼＦＭ ＰＬＵＳ、及び酢酸マグネシウムを含む高感度ルシフェラーゼ溶液である。また、ＴＥバッファーは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のものを購入して使用した。
【0043】
＜キット＞
ＤＮＡ増幅キットとして、ＧｌｏｂａｌＦｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、以下「ＧＦキット」とも称する）、Ｙｆｉｌｅｒ Ｐｌｕｓ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、以下「ＹＦＰキット」とも称する）、及びＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製、以下「ＰＰＦキット」とも称する）を使用した。
ＤＮＡ増幅キットとして、ＧｌｏｂａｌＦｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、以下「ＧＦキット」とも称する）、Ｙｆｉｌｅｒ Ｐｌｕｓ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、以下「ＹＦＰキット」とも称する）、及びＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製、以下「ＰＰＦキット」とも称する）を使用した。
【0044】
＜ルシフェラーゼ溶液を用いる発光スペクトル測定＞
以下、ルシフェラーゼ溶液を用いる、各種核酸の発光スペクトル測定並びに各種キット使用によるＰＣＲ増幅産物及びアレリックラダー等の発光スペクトル測定を行った。
以下、ルシフェラーゼ溶液を用いる、各種核酸の発光スペクトル測定並びに各種キット使用によるＰＣＲ増幅産物及びアレリックラダー等の発光スペクトル測定を行った。
【0045】
（ルシフェラーゼ溶液を用いる各種核酸の発光スペクトル測定）
核酸試料としてＴＥバッファーで調製した５μＭ ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）、５μＭ ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）、５μＭ ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）・ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リン酸）・ｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸）混合溶液を、ネガティブコントロールとしてＴＥバッファーを使用し、各核酸試料１００μＬ及びＴＥバッファー１００μＬのそれぞれをルシフェラーゼ溶液１００μＬと混合し、マルチモードマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５、モレキュラーデバイス社製）を用いて、１０ｍｓ間隔・バンド幅５ｎｍの条件で４５０ｎｍから７００ｎｍの範囲でスペクトルスキャンを行った。測定結果は図１に示している。
核酸試料としてＴＥバッファーで調製した５μＭ ｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）、５μＭ ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）、５μＭ ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）・ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リン酸）・ｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸）混合溶液を、ネガティブコントロールとしてＴＥバッファーを使用し、各核酸試料１００μＬ及びＴＥバッファー１００μＬのそれぞれをルシフェラーゼ溶液１００μＬと混合し、マルチモードマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５、モレキュラーデバイス社製）を用いて、１０ｍｓ間隔・バンド幅５ｎｍの条件で４５０ｎｍから７００ｎｍの範囲でスペクトルスキャンを行った。測定結果は図１に示している。
【0046】
（ルシフェラーゼ溶液を用いる、各種キット使用によるＰＣＲ増幅産物及びアレリックラダーの発光スペクトル測定）
ＤＮＡ型鑑定で使用されるＧＦキット、ＹＦＰキット、及びＰＰＦキットの各増幅キットを用いてＰＣＲ増幅を行った。ＧＦキットでは、ユーザーガイドに従い、キット付属の１ｎｇのヒトＤＮＡ及び蒸留水をＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて２９サイクルでＰＣＲ増幅を行った。ＹＦＰキット及びＰＰＦキットでも、ユーザーガイドに従い、各増幅キット付属の１ｎｇのヒトＤＮＡをＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００でＰＣＲ増幅を行った。増幅回数は、ＹＦＰキットにおいて３０サイクル、ＰＰＦキットにおいて２８サイクルで行った。続いて、ＧＦキットのＰＣＲを行っていないＰＣＲ溶液５μＬ、ヒトＤＮＡ及び蒸留水のＰＣＲ反応液各１０μＬ、アレリックラダー３μＬ、ＹＦＰのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液１μＬ、アレリックラダー１μＬ、ＰＰＦのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液３μＬ、アレリックラダー１０μＬにそれぞれＴＥバッファーを加えて１００μＬとした溶液にルシフェラーゼ溶液１００μＬをそれぞれ加え、マルチモードマイクロプレートリーダーを用いて、１０ｍｓ間隔・バンド幅５ｎｍの条件で４５０ｎｍから７００ｎｍの範囲でスペクトルスキャンを行った。測定結果は図２～３に示している。
ＤＮＡ型鑑定で使用されるＧＦキット、ＹＦＰキット、及びＰＰＦキットの各増幅キットを用いてＰＣＲ増幅を行った。ＧＦキットでは、ユーザーガイドに従い、キット付属の１ｎｇのヒトＤＮＡ及び蒸留水をＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて２９サイクルでＰＣＲ増幅を行った。ＹＦＰキット及びＰＰＦキットでも、ユーザーガイドに従い、各増幅キット付属の１ｎｇのヒトＤＮＡをＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００でＰＣＲ増幅を行った。増幅回数は、ＹＦＰキットにおいて３０サイクル、ＰＰＦキットにおいて２８サイクルで行った。続いて、ＧＦキットのＰＣＲを行っていないＰＣＲ溶液５μＬ、ヒトＤＮＡ及び蒸留水のＰＣＲ反応液各１０μＬ、アレリックラダー３μＬ、ＹＦＰのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液１μＬ、アレリックラダー１μＬ、ＰＰＦのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液３μＬ、アレリックラダー１０μＬにそれぞれＴＥバッファーを加えて１００μＬとした溶液にルシフェラーゼ溶液１００μＬをそれぞれ加え、マルチモードマイクロプレートリーダーを用いて、１０ｍｓ間隔・バンド幅５ｎｍの条件で４５０ｎｍから７００ｎｍの範囲でスペクトルスキャンを行った。測定結果は図２～３に示している。
【0047】
＜ルシフェラーゼの検出限界の検討＞
以下、溶液反応型とふき取り検査用綿棒一体型の試験方法により、各種試料における発光値を測定した。
以下、溶液反応型とふき取り検査用綿棒一体型の試験方法により、各種試料における発光値を測定した。
【0048】
（溶液反応型）
ルシフェラーゼ溶液５０μＬに、ＴＥバッファーで調製した２００ｎＭから２ｆＭの１０倍連続希釈系列のｄＡＴＰ５０μＬ、５倍から６．４×１０９倍までの２０倍連続希釈系列のＧＦキットのＰＣＲを行っていないＰＣＲ溶液、ヒトＤＮＡ及び蒸留水のＰＣＲ反応液、アレリックラダー、ＹＦＰキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液、ＰＰＦキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液各５０μＬを加え、ルミテスターＣ－１０００（キッコーマンバイオケミファ社製）でそれぞれ発光値を測定した。測定は各サンプルについて３回実施し、平均値及び標準偏差を算出した。測定結果は表１～３に示している。
ルシフェラーゼ溶液５０μＬに、ＴＥバッファーで調製した２００ｎＭから２ｆＭの１０倍連続希釈系列のｄＡＴＰ５０μＬ、５倍から６．４×１０９倍までの２０倍連続希釈系列のＧＦキットのＰＣＲを行っていないＰＣＲ溶液、ヒトＤＮＡ及び蒸留水のＰＣＲ反応液、アレリックラダー、ＹＦＰキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液、ＰＰＦキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液各５０μＬを加え、ルミテスターＣ－１０００（キッコーマンバイオケミファ社製）でそれぞれ発光値を測定した。測定は各サンプルについて３回実施し、平均値及び標準偏差を算出した。測定結果は表１～３に示している。
【0049】
【表1】
【0050】
【表2】
【0051】
【表3】
【0052】
（検査用綿棒一体型）
ＵｌｔｒａＳｎａｐ（Ｈｙｇｉｅｎａ社製）の綿球部に、ＴＥバッファーで調製した１ｍＭから１０ｐＭの１０倍連続希釈系列のｄＡＴＰ１０μＬ、１０倍から１０７倍までの１０倍連続希釈系列のＧＦキットのＰＣＲを行っていないＰＣＲ溶液、ヒトＤＮＡ及び蒸留水のＰＣＲ反応液、アレリックラダー、ＹＦＰキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液、ＰＰＦキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液各１０μＬを付着させケースに戻し、綿棒上部のルシフェラーゼ溶液を綿球部に落としてＳｙｓｔｅｍＳＵＲＥ Ｐｌｕｓ（Ｈｙｇｉｅｎａ社製）で発光値を測定した。測定は各サンプルについて３回実施し、平均値及び標準偏差を算出した。測定結果は表４～６に示している。
ＵｌｔｒａＳｎａｐ（Ｈｙｇｉｅｎａ社製）の綿球部に、ＴＥバッファーで調製した１ｍＭから１０ｐＭの１０倍連続希釈系列のｄＡＴＰ１０μＬ、１０倍から１０７倍までの１０倍連続希釈系列のＧＦキットのＰＣＲを行っていないＰＣＲ溶液、ヒトＤＮＡ及び蒸留水のＰＣＲ反応液、アレリックラダー、ＹＦＰキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液、ＰＰＦキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液各１０μＬを付着させケースに戻し、綿棒上部のルシフェラーゼ溶液を綿球部に落としてＳｙｓｔｅｍＳＵＲＥ Ｐｌｕｓ（Ｈｙｇｉｅｎａ社製）で発光値を測定した。測定は各サンプルについて３回実施し、平均値及び標準偏差を算出した。測定結果は表４～６に示している。
【0053】
【表4】
【0054】
【表5】
【0055】
【表6】
【0056】
（ルシフェラーゼ溶液と高感度ルシフェラーゼ溶液のｄＡＴＰ検出限界比較）
ルシフェラーゼ溶液５０μＬと高感度ルシフェラーゼ溶液５０μＬに、ＴＥバッファーで調製した１０ｎＭから１００ｆＭの１０倍連続希釈系列のｄＡＴＰ溶液５０μＬを加え、ルミテスターＣ－１０００で発光値を測定した。測定は各サンプルについて３回実施し、平均値及び標準偏差を算出した。測定結果は表７に示している。
ルシフェラーゼ溶液５０μＬと高感度ルシフェラーゼ溶液５０μＬに、ＴＥバッファーで調製した１０ｎＭから１００ｆＭの１０倍連続希釈系列のｄＡＴＰ溶液５０μＬを加え、ルミテスターＣ－１０００で発光値を測定した。測定は各サンプルについて３回実施し、平均値及び標準偏差を算出した。測定結果は表７に示している。
【0057】
【表7】
【0058】
＜検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物の検出＞
まず、検査対象物を洗浄する前に、検査対象物から検体の採取を行った。具体的に、ＤＮＡ型鑑定室のポストＰＣＲエリア内の作業後の作業台４０×８０ｃｍ２の範囲、ピペットの持ち手部分、ＰＣＲチューブリテーナーの上面を、滅菌水で綿球部を湿らせた滅菌綿棒（栄研化学）及びＵｌｔｒａＳｎａｐでそれぞれ拭き取った。次に、検査対象物に対して洗浄を行い、検体の採取を行った。具体的に、作業台は２％（ｖ／ｖ）ハイター（花王社製）、ＤＮＡ ＡＷＡＹ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、７０％（ｖ／ｖ）エタノールを用いて表面を拭き取り洗浄し、ピペットはＤＮＡ ＡＷＡＹ、７０％（ｖ／ｖ）エタノールを用いて表面を拭き取り洗浄し、ＰＣＲチューブリテーナーは２％（ｖ／ｖ）ハイター（花王社製）に一晩浸漬し、水道水で洗い流し、７０％（ｖ／ｖ）エタノールに浸漬後、風乾させた。それぞれ洗浄した後の作業台４０×８０ｃｍ２の範囲、ピペットの持ち手部分、ＰＣＲチューブリテーナーの上面を、滅菌水で綿球部を湿らせた滅菌綿棒及びＵｌｔｒａＳｎａｐで再度それぞれ拭き取った。続いて、採取した各検体について遺伝子増幅反応による残留産物の検出を試みた。具体的に、滅菌綿棒は綿球部を切り取り、１００μＬの滅菌水で浸出させ、浸出液１０μＬをＧＦキットで増幅し、各増幅産物１μＬに、９．６μＬのＨｉ－Ｄｉホルムアミド及び０．４μＬのＧｅｎｅＳｃａｎ ６００ ＬＩＺ（登録商標）サイズスタンダードｖ２．０を加えて９５℃で３分間熱変性し、３５００ｘＬジェネティックアナライザーでＰＯＰ－４（登録商標）ポリマー及び３５００ｘＬジェネティックアナライザー、２４本キャピラリーアレイ３６ｃｍを用いて、１．２ｋＶ、２４秒の条件でサンプルインジェクションを行い、泳動電圧１３ｋＶで電気泳動を行った（図４～６における「従来法」）。ＵｌｔｒａＳｎａｐでは綿球部をケースに戻し、綿棒上部のルシフェラーゼ溶液を綿球部に落としてＳｙｓｔｅｍＳＵＲＥ Ｐｌｕｓで発光値を測定した（図４～６における「発光法」）。作業台の測定結果は図４、ピペットの測定結果は図５、及びＰＣＲチューブリテーナーの測定結果は図６に示している。
まず、検査対象物を洗浄する前に、検査対象物から検体の採取を行った。具体的に、ＤＮＡ型鑑定室のポストＰＣＲエリア内の作業後の作業台４０×８０ｃｍ２の範囲、ピペットの持ち手部分、ＰＣＲチューブリテーナーの上面を、滅菌水で綿球部を湿らせた滅菌綿棒（栄研化学）及びＵｌｔｒａＳｎａｐでそれぞれ拭き取った。次に、検査対象物に対して洗浄を行い、検体の採取を行った。具体的に、作業台は２％（ｖ／ｖ）ハイター（花王社製）、ＤＮＡ ＡＷＡＹ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、７０％（ｖ／ｖ）エタノールを用いて表面を拭き取り洗浄し、ピペットはＤＮＡ ＡＷＡＹ、７０％（ｖ／ｖ）エタノールを用いて表面を拭き取り洗浄し、ＰＣＲチューブリテーナーは２％（ｖ／ｖ）ハイター（花王社製）に一晩浸漬し、水道水で洗い流し、７０％（ｖ／ｖ）エタノールに浸漬後、風乾させた。それぞれ洗浄した後の作業台４０×８０ｃｍ２の範囲、ピペットの持ち手部分、ＰＣＲチューブリテーナーの上面を、滅菌水で綿球部を湿らせた滅菌綿棒及びＵｌｔｒａＳｎａｐで再度それぞれ拭き取った。続いて、採取した各検体について遺伝子増幅反応による残留産物の検出を試みた。具体的に、滅菌綿棒は綿球部を切り取り、１００μＬの滅菌水で浸出させ、浸出液１０μＬをＧＦキットで増幅し、各増幅産物１μＬに、９．６μＬのＨｉ－Ｄｉホルムアミド及び０．４μＬのＧｅｎｅＳｃａｎ ６００ ＬＩＺ（登録商標）サイズスタンダードｖ２．０を加えて９５℃で３分間熱変性し、３５００ｘＬジェネティックアナライザーでＰＯＰ－４（登録商標）ポリマー及び３５００ｘＬジェネティックアナライザー、２４本キャピラリーアレイ３６ｃｍを用いて、１．２ｋＶ、２４秒の条件でサンプルインジェクションを行い、泳動電圧１３ｋＶで電気泳動を行った（図４～６における「従来法」）。ＵｌｔｒａＳｎａｐでは綿球部をケースに戻し、綿棒上部のルシフェラーゼ溶液を綿球部に落としてＳｙｓｔｅｍＳＵＲＥ Ｐｌｕｓで発光値を測定した（図４～６における「発光法」）。作業台の測定結果は図４、ピペットの測定結果は図５、及びＰＣＲチューブリテーナーの測定結果は図６に示している。
【0059】
＜評価＞
上記試験で得られた測定結果をもとに、実施例に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法について評価を行った。
上記試験で得られた測定結果をもとに、実施例に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法について評価を行った。
【0060】
（ルシフェラーゼ溶液の各種核酸に対する発光スペクトルの評価）
図１に示すように、ルシフェラーゼ溶液を用いる各種核酸に対する発光スペクトルを測定したところ、ｄＡＴＰ（５μＭ ｄＡＴＰ）及びｄＮＴＰ（５μＭ ｄＮＴＰ）の発光スペクトルはλｍａｘが６０５ｎｍを有するピークとして観察された。一方で、ｄＣＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＴＴＰ混合溶液（５μＭ ｄＣＴＰ,ｄＧＴＰ,ｄＴＴＰ）及びネガティブコントロールのＴＥバッファー（ＮＣ（ＴＥ））ではピークが観察されなかった。これらの結果から、ルシフェラーゼ溶液を用いたときに発光する核酸の種類は、ｄＡＴＰ及びｄＮＴＰであることが分かった。また、ルシフェラーゼ溶液を用いたときのｄＮＴＰの発光は、ｄＡＴＰに起因していることも分かった。従って、遺伝子増幅反応による残留産物にｄＡＴＰが含まれている場合、このｄＡＴＰのルシフェリン・ルシフェラーゼ反応に起因する発光を利用することで、残留産物の検出が可能であることが示された。
図１に示すように、ルシフェラーゼ溶液を用いる各種核酸に対する発光スペクトルを測定したところ、ｄＡＴＰ（５μＭ ｄＡＴＰ）及びｄＮＴＰ（５μＭ ｄＮＴＰ）の発光スペクトルはλｍａｘが６０５ｎｍを有するピークとして観察された。一方で、ｄＣＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＴＴＰ混合溶液（５μＭ ｄＣＴＰ,ｄＧＴＰ,ｄＴＴＰ）及びネガティブコントロールのＴＥバッファー（ＮＣ（ＴＥ））ではピークが観察されなかった。これらの結果から、ルシフェラーゼ溶液を用いたときに発光する核酸の種類は、ｄＡＴＰ及びｄＮＴＰであることが分かった。また、ルシフェラーゼ溶液を用いたときのｄＮＴＰの発光は、ｄＡＴＰに起因していることも分かった。従って、遺伝子増幅反応による残留産物にｄＡＴＰが含まれている場合、このｄＡＴＰのルシフェリン・ルシフェラーゼ反応に起因する発光を利用することで、残留産物の検出が可能であることが示された。
【0061】
（ルシフェラーゼ溶液のＧＦキット、ＹＦＰキット、及びＰＰＦキット使用により得られる各種溶液に対する発光スペクトルの評価）
図２に示すように、ルシフェラーゼ溶液を用いて、ＧＦキットのＰＣＲ溶液（５μＬ ＧＦ ＰＣＲ－）、各種ＰＣＲ増幅産物（１０μＬ ＧＦ ＮＣ ＰＣＲ＋、１０μＬ ＧＦ ＰＣ ＰＣＲ＋）、アレリックラダー（３μＬ ＧＦ Ｌａｄｄｅｒ）に対する発光スペクトルを測定したところ、λｍａｘが６００ｎｍから６１０ｎｍであるピークが観察された。なお、ＮＣはネガティブコントロールを意味し、ＰＣはポジティブコントロールを意味する。また、参考のために、ルシフェラーゼ溶液を用いたときのｄＡＴＰ（５μＭ ｄＡＴＰ）の発光スペクトルも図２中に示している。続いて、図３に示すように、ルシフェラーゼ溶液のＹＦＰキット及びＰＰＦキットのＰＣＲ増幅産物（１μＬ ＹＦＰ ＰＣ ＰＣＲ＋、３μＬ ＰＰＦ ＰＣ ＰＣＲ＋）並びにアレリックラダー（１μＬ ＹＦＰ Ｌａｄｄｅｒ、１０μＬ ＰＰＦ Ｌａｄｄｅｒ）に対する発光スペクトルを測定したところ、ＹＦＰキットのＰＣＲ増幅産物（１μＬ ＹＦＰ ＰＣ ＰＣＲ＋）及びアレリックラダー（１μＬ ＹＦＰ Ｌａｄｄｅｒ）、並びにＰＰＦキットのＰＣＲ増幅産物（３μＬ ＰＰＦ ＰＣ ＰＣＲ＋）は、λｍａｘが６００ｎｍから６１０ｎｍであるピークが観察され、ＰＰＦキットのアレリックラダー（１０μＬ ＰＰＦ Ｌａｄｄｅｒ）ではピークが観察されなかった。なお、参考のために、ルシフェラーゼ溶液を用いたときのＧＦキットのＰＣＲ増幅産物（１０μＬ ＧＦ ＰＣ ＰＣＲ＋）及びアレリックラダー（３μＬ ＧＦ Ｌａｄｄｅｒ）の発光スペクトルも図３中に示している。これらの結果から、各種ＰＣＲ増幅キットにおいて、各ＰＣＲ反応液及びアレリックラダーは、ルシフェラーゼ溶液を用いることによって基本的に発光スペクトルが観察され、該発光スペクトルはルシフェラーゼ溶液、ｄＡＴＰ、及び酸素の反応により生じる発光スペクトルに起因することが推察された。
図２に示すように、ルシフェラーゼ溶液を用いて、ＧＦキットのＰＣＲ溶液（５μＬ ＧＦ ＰＣＲ－）、各種ＰＣＲ増幅産物（１０μＬ ＧＦ ＮＣ ＰＣＲ＋、１０μＬ ＧＦ ＰＣ ＰＣＲ＋）、アレリックラダー（３μＬ ＧＦ Ｌａｄｄｅｒ）に対する発光スペクトルを測定したところ、λｍａｘが６００ｎｍから６１０ｎｍであるピークが観察された。なお、ＮＣはネガティブコントロールを意味し、ＰＣはポジティブコントロールを意味する。また、参考のために、ルシフェラーゼ溶液を用いたときのｄＡＴＰ（５μＭ ｄＡＴＰ）の発光スペクトルも図２中に示している。続いて、図３に示すように、ルシフェラーゼ溶液のＹＦＰキット及びＰＰＦキットのＰＣＲ増幅産物（１μＬ ＹＦＰ ＰＣ ＰＣＲ＋、３μＬ ＰＰＦ ＰＣ ＰＣＲ＋）並びにアレリックラダー（１μＬ ＹＦＰ Ｌａｄｄｅｒ、１０μＬ ＰＰＦ Ｌａｄｄｅｒ）に対する発光スペクトルを測定したところ、ＹＦＰキットのＰＣＲ増幅産物（１μＬ ＹＦＰ ＰＣ ＰＣＲ＋）及びアレリックラダー（１μＬ ＹＦＰ Ｌａｄｄｅｒ）、並びにＰＰＦキットのＰＣＲ増幅産物（３μＬ ＰＰＦ ＰＣ ＰＣＲ＋）は、λｍａｘが６００ｎｍから６１０ｎｍであるピークが観察され、ＰＰＦキットのアレリックラダー（１０μＬ ＰＰＦ Ｌａｄｄｅｒ）ではピークが観察されなかった。なお、参考のために、ルシフェラーゼ溶液を用いたときのＧＦキットのＰＣＲ増幅産物（１０μＬ ＧＦ ＰＣ ＰＣＲ＋）及びアレリックラダー（３μＬ ＧＦ Ｌａｄｄｅｒ）の発光スペクトルも図３中に示している。これらの結果から、各種ＰＣＲ増幅キットにおいて、各ＰＣＲ反応液及びアレリックラダーは、ルシフェラーゼ溶液を用いることによって基本的に発光スペクトルが観察され、該発光スペクトルはルシフェラーゼ溶液、ｄＡＴＰ、及び酸素の反応により生じる発光スペクトルに起因することが推察された。
【0062】
（ホタルルシフェラーゼの検出限界の評価）
表１～３の結果に基づいて、溶液反応型についての検出限界の評価を行った。表１の結果から、ルシフェラーゼ溶液を用いた場合の溶液反応型では、１０ｆｍｏｌ以上のｄＡＴＰを検出可能であることが分かった。なお、検出限界はブランクの平均値に３ＳＤを加えたもの（平均値及びＳＤが共に０の場合は３）として算出している。また、表２の結果から、ルシフェラーゼ溶液は、６２．５ｐＬ以上のＧＦキットのＰＣＲを行っていないＰＣＲ溶液（ＰＣＲ混合物）、ヒトＤＮＡ及び蒸留水のＰＣＲ反応液（１ｎｇ ００７ ＤＮＡ、蒸留水）、並びにアレリックラダーを検出可能であることが分かった。また、表３の結果から、３．１ｐＬ以上のＹＦＰキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液（ＹＦＰ－１ｎｇ ００７ ＤＮＡ）及び６２．５ｐＬ以上のＰＰＦキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液（ＰＰＦ－１ｎｇ ２８００Ｍ ＤＮＡ）を検出可能であることが分かった。
表１～３の結果に基づいて、溶液反応型についての検出限界の評価を行った。表１の結果から、ルシフェラーゼ溶液を用いた場合の溶液反応型では、１０ｆｍｏｌ以上のｄＡＴＰを検出可能であることが分かった。なお、検出限界はブランクの平均値に３ＳＤを加えたもの（平均値及びＳＤが共に０の場合は３）として算出している。また、表２の結果から、ルシフェラーゼ溶液は、６２．５ｐＬ以上のＧＦキットのＰＣＲを行っていないＰＣＲ溶液（ＰＣＲ混合物）、ヒトＤＮＡ及び蒸留水のＰＣＲ反応液（１ｎｇ ００７ ＤＮＡ、蒸留水）、並びにアレリックラダーを検出可能であることが分かった。また、表３の結果から、３．１ｐＬ以上のＹＦＰキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液（ＹＦＰ－１ｎｇ ００７ ＤＮＡ）及び６２．５ｐＬ以上のＰＰＦキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液（ＰＰＦ－１ｎｇ ２８００Ｍ ＤＮＡ）を検出可能であることが分かった。
【0063】
表４～６の結果に基づいて、検査用綿棒一体型についての検出限界の評価を行った。表４の結果から、ルシフェラーゼ溶液を用いた場合の検査用綿棒一体型では、１ｐｍｏｌ以上のｄＡＴＰを検出可能であることが分かった。また、表５の結果から、ルシフェラーゼ溶液は、１ｎＬ以上のＧＦキットのＰＣＲを行っていないＰＣＲ溶液（ＰＣＲ混合物）、ヒトＤＮＡ及び蒸留水のＰＣＲ反応液（１ｎｇ ００７ ＤＮＡ、蒸留水）、並びにアレリックラダーを検出可能であることが分かった。また、表６の結果から、１ｎＬ以上のＹＦＰキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液（ＹＦＰ－１ｎｇ ００７ ＤＮＡ）及び１ｎＬ以上のＰＰＦキットのヒトＤＮＡのＰＣＲ反応液（ＰＰＦ－１ｎｇ ２８００Ｍ ＤＮＡ）を検出可能であることが分かった。
【0064】
（ルシフェラーゼ溶液と高感度ルシフェラーゼ溶液のｄＡＴＰ検出限界の評価）
表７の結果から、ルシフェラーゼ溶液は５ｆｍｏｌ以上のｄＡＴＰを検出可能であり（ルシフェラーゼ溶液－ｄＡＴＰ）、高感度ルシフェラーゼ溶液は５ａｍｏｌ以上のｄＡＴＰを検出可能であることが分かった（高感度ルシフェラーゼ溶液－ｄＡＴＰ）。なお、検出限界はブランクの平均値に３ＳＤを加えたものとして算出している。これらの結果から、高感度ルシフェラーゼ溶液のｄＡＴＰに対する検出限界は、ルシフェラーゼ溶液と比較して約１０００倍程度高いことが分かった。このため、より低濃度の遺伝子増幅反応による残留産物の検出を行いたい場合に特に有効であることが分かった。
表７の結果から、ルシフェラーゼ溶液は５ｆｍｏｌ以上のｄＡＴＰを検出可能であり（ルシフェラーゼ溶液－ｄＡＴＰ）、高感度ルシフェラーゼ溶液は５ａｍｏｌ以上のｄＡＴＰを検出可能であることが分かった（高感度ルシフェラーゼ溶液－ｄＡＴＰ）。なお、検出限界はブランクの平均値に３ＳＤを加えたものとして算出している。これらの結果から、高感度ルシフェラーゼ溶液のｄＡＴＰに対する検出限界は、ルシフェラーゼ溶液と比較して約１０００倍程度高いことが分かった。このため、より低濃度の遺伝子増幅反応による残留産物の検出を行いたい場合に特に有効であることが分かった。
【0065】
（検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法としての評価）
図４～６の結果に基づいて、検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法としての評価を行った。まず、従来法（検査対象物から検体採取、ＤＮＡ抽出・定量、ＰＣＲ、電気泳動、ピーク解析の順に操作）での遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法を評価した。まず、図４の左上に示すように、ポストＰＣＲエリア内における洗浄前の作業台から採取した検体は、複数のピークが検出されていることから、遺伝子増幅反応による残留産物を含んでいることが分かった。続いて、図４の左下に示すように、作業台を洗浄した後に採取した検体は、目立ったピークが検出されていないことから、遺伝子増幅反応による残留産物を含んでいないことが分かった。従って、上述した作業台の洗浄により、作業台における遺伝子増幅反応による残留産物の除去に成功していることが分かったのであるが、この従来法による検出は、検査対象物から採取した検体に対して、ＤＮＡ抽出・定量、ＰＣＲ、電気泳動、ピーク解析の順に操作を行う必要があり、検体に含まれる遺伝子増幅反応による残留産物の検出までに少なくとも半日程度の時間がかかり、手間とコストもかかることが分かった。
図４～６の結果に基づいて、検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法としての評価を行った。まず、従来法（検査対象物から検体採取、ＤＮＡ抽出・定量、ＰＣＲ、電気泳動、ピーク解析の順に操作）での遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法を評価した。まず、図４の左上に示すように、ポストＰＣＲエリア内における洗浄前の作業台から採取した検体は、複数のピークが検出されていることから、遺伝子増幅反応による残留産物を含んでいることが分かった。続いて、図４の左下に示すように、作業台を洗浄した後に採取した検体は、目立ったピークが検出されていないことから、遺伝子増幅反応による残留産物を含んでいないことが分かった。従って、上述した作業台の洗浄により、作業台における遺伝子増幅反応による残留産物の除去に成功していることが分かったのであるが、この従来法による検出は、検査対象物から採取した検体に対して、ＤＮＡ抽出・定量、ＰＣＲ、電気泳動、ピーク解析の順に操作を行う必要があり、検体に含まれる遺伝子増幅反応による残留産物の検出までに少なくとも半日程度の時間がかかり、手間とコストもかかることが分かった。
【0066】
次に、本実施例に係る検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法を評価した。図４の右側に示すように、本実施例に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法（発光法）は、検査対象物から採取した検体、ルシフェラーゼ溶液、及び酸素の反応により生じる発光の発光値を測定し、この発光値が基準値よりも高い場合に、検体中に遺伝子増幅反応による残留産物が存在すると判定できることが分かった。具体的に図４の右側の例で説明すると、洗浄前の作業台から採取した検体に起因する発光値は、１３ＲＬＵであり、ここでの基準値１ＲＬＵよりも数値が高いため、検体に遺伝子増幅反応による残留産物が存在すると判定した。また、洗浄後の作業台から採取した検体に起因する発光値は０ＲＬＵであり、基準値１ＲＬＵ以下であるため、検体に遺伝子増幅反応による残留産物は存在しないと判定した。この結果は、図４の左側の従来法による遺伝子増幅反応による残留産物の検出結果とも一致しており、本実施例に係る方法により、遺伝子増幅反応による残留産物の検出が可能であることが示された。また、図５～６の結果から、検査対象物としてピペット及びＰＣＲチューブリテーナーを用いた場合でも同様の結果が得られることが分かった。
【0067】
上記の例では、遺伝子増幅反応としてＰＣＲの場合を実証したが、ＰＣＲ以外の遺伝子増幅反応であるＲＴ－ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＲＴ－ＬＡＭＰ、ＭＤＡ、ＲＣＡ及びＤＯＰ－ＰＣＲの場合でも本実施例に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出が可能である。さらに、上記以外の他の遺伝子増幅反応であるＲＰＡ、ＨＤＡ、ＮＡＳＢＡ及びＴＲＣの場合でも本実施例に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出が可能であり、その点について説明する。以下に、各遺伝子増幅反応により得られるＤＮＡ溶液又はＲＮＡ溶液（反応溶液を含む）に含まれるｄＡＴＰ及びＡＴＰの関係を表８に示す。表８中、○は含有することを示し、－は含有しないことを示している。
【0068】
【表8】
【0069】
表８に示すように、ＰＣＲにおいて得られるＤＮＡ溶液及び反応溶液にｄＡＴＰが含まれることは上記実施例において実証した通りである。また、表８に示すように、あくまで一例を示すものであるが、ＲＴ－ＰＣＲのＲＮＡ溶液では２００μＭのｄＡＴＰを含むこと（非特許文献１）、ＬＡＭＰのＤＮＡ溶液では４００μＭのｄＮＴＰを含むこと（非特許文献２）、ＲＴ－ＬＡＭＰのＲＮＡ溶液では１．４ｍＭのｄＮＴＰを含むこと（非特許文献３）、ＭＤＡのＤＮＡ溶液では１ｍＭのｄＮＴＰを含むこと（非特許文献４）、ＲＣＡのＤＮＡ溶液では１ｍＭのｄＡＴＰを含むこと（非特許文献５）、及びＤＯＰ－ＰＣＲのＤＮＡ溶液では０．２ｍＭのｄＮＴＰを含むこと（非特許文献６）がそれぞれ記載されている。従って、遺伝子増幅反応としてＲＴ－ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＲＴ－ＬＡＭＰ、ＭＤＡ、ＲＣＡ及びＤＯＰ－ＰＣＲを用いる場合でも、上記実施例において実証したＰＣＲの場合と同様に、ｄＡＴＰを指標として遺伝子増幅反応による残留産物を検出できることはいうまでもない。
【0070】
さらに、表８に示すように、あくまで一例を示すものであるが、ＲＰＡのＤＮＡ溶液では２００μＭのｄＮＴＰ及び３ｍＭのＡＴＰを含むこと（非特許文献７）、ＨＤＡのＤＮＡ溶液では２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ及び１５０ｎｍｏｌのＡＴＰを含むこと（非特許文献８）、ＮＡＳＢＡのＲＮＡ溶液では１ｍＭのｄＮＴＰ及び４．１ｍＭのＮＴＰを含むこと（非特許文献９）、並びにＴＲＣのＲＮＡ溶液では０．３８ｍＭのｄＮＴＰ及び３．１ｍＭのＮＴＰを含むこと（非特許文献１０）がそれぞれ記載されている。従って、遺伝子増幅反応としてＲＰＡ、ＨＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＲＣを用いる場合でも、ｄＡＴＰ及びＡＴＰの両方を指標として遺伝子増幅反応による残留産物を検出することが可能である。
【0071】
非特許文献１：Wang C, Gao D, Vaglenov A, Kaltenboeck B. One-step real-time duplex reverse transcription PCRs simultaneously quantify analyte and housekeeping gene mRNAs. Biotechniques 2004, 36, 508-519.（５０９頁の右欄１－９行目）
非特許文献２：Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research 2000, 28(12), e63.（２頁の左欄２９－３５行目）
非特許文献３：Yoda T, Suzuki Y, Yamazaki K, Sakon N, Kanki M, Aoyama I, Tsukamoto T. Evaluation and application of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for detection of noroviruses. J. Med. Virol. 2007, 79, 326-334.（３２８頁の右欄２８行目－３３０頁の左欄４行目）
非特許文献４：Dean FB, Hosono S, Fang L, Wu X, Faruqi AF, Bray-Ward P, et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, 99, 5261-5266.（５２６１頁の右欄３０－３５行目）
非特許文献５：Liu D, Daubendiek SL, Zillman MA, Ryan K, Kool ET. Rolling circle DNA synthesis: small circular oligonucleotides as efficient templates for DNA polymerases. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 1587-1594.（１５８８頁の左欄５－１２行目）
非特許文献６：Telenius H, Carter NP, Bebb CE, Nordenskjold M, Ponder BA, Tunnacliffe A. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics 1992, 13, 718-725.（７１９頁の左欄２０－２１行目、７２０頁の表１）
非特許文献７：Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol. 2006, 4, e204.（１１１８頁の右欄５１－５６行目）
非特許文献８：Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004, 5, 795-800.（７９９頁の右欄５行目－８００頁の左欄４行目）
非特許文献９：Kievits T, van Gemen B, van Strijp D, Schkkink R, Dircks M, Adriaanse H, Malek L, Sooknanan R, Lens P. NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection. J Virol Methods. 1991, 35, 273-286.（２７６頁の３５－４０行目）
非特許文献１０：Sato A, Sueoka-Aragane N, Saitoh J, Komiya K, Hisatomi T, Tomimasu R, Hayashi S, Sueoka E. Establishment of a new method, transcription-reverse transcription concerted reaction, for detection of plasma hnRNP B1 mRNA, a biomarker of lung cancer. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2008, 134, 1191-1197.（１１９３頁の左欄２１－２６行目）
非特許文献２：Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research 2000, 28(12), e63.（２頁の左欄２９－３５行目）
非特許文献３：Yoda T, Suzuki Y, Yamazaki K, Sakon N, Kanki M, Aoyama I, Tsukamoto T. Evaluation and application of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for detection of noroviruses. J. Med. Virol. 2007, 79, 326-334.（３２８頁の右欄２８行目－３３０頁の左欄４行目）
非特許文献４：Dean FB, Hosono S, Fang L, Wu X, Faruqi AF, Bray-Ward P, et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, 99, 5261-5266.（５２６１頁の右欄３０－３５行目）
非特許文献５：Liu D, Daubendiek SL, Zillman MA, Ryan K, Kool ET. Rolling circle DNA synthesis: small circular oligonucleotides as efficient templates for DNA polymerases. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 1587-1594.（１５８８頁の左欄５－１２行目）
非特許文献６：Telenius H, Carter NP, Bebb CE, Nordenskjold M, Ponder BA, Tunnacliffe A. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics 1992, 13, 718-725.（７１９頁の左欄２０－２１行目、７２０頁の表１）
非特許文献７：Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol. 2006, 4, e204.（１１１８頁の右欄５１－５６行目）
非特許文献８：Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004, 5, 795-800.（７９９頁の右欄５行目－８００頁の左欄４行目）
非特許文献９：Kievits T, van Gemen B, van Strijp D, Schkkink R, Dircks M, Adriaanse H, Malek L, Sooknanan R, Lens P. NASBA isothermal enzymatic in vitro nucleic acid amplification optimized for the diagnosis of HIV-1 infection. J Virol Methods. 1991, 35, 273-286.（２７６頁の３５－４０行目）
非特許文献１０：Sato A, Sueoka-Aragane N, Saitoh J, Komiya K, Hisatomi T, Tomimasu R, Hayashi S, Sueoka E. Establishment of a new method, transcription-reverse transcription concerted reaction, for detection of plasma hnRNP B1 mRNA, a biomarker of lung cancer. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2008, 134, 1191-1197.（１１９３頁の左欄２１－２６行目）
【0072】
以上の結果から、本実施例に係る遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、マグネシウム化合物、検査対象物から採取した検体、及び酸素の反応により生じる発光の発光量を測定し、測定した発光量が基準値よりも高い場合に、検査対象物に遺伝子増幅反応による残留産物が存在すると判定できることが分かり、検査対象物に存在する当該残留産物を迅速、簡便かつ安価に検出できる方法として有用であることが明らかとなった。
【0073】
応用例
応用例は、上記実施例で説明した遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法を利用する、当該残留産物の連続モニタリングの検討を行った。以下、その方法及び結果について説明する。
応用例は、上記実施例で説明した遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法を利用する、当該残留産物の連続モニタリングの検討を行った。以下、その方法及び結果について説明する。
【0074】
＜遺伝子増幅反応による残留産物の連続モニタリング＞
ＤＮＡ型鑑定室のポストＰＣＲエリア内において、最初に、実施例で説明した方法と同様にして作業台、ピペット、及びＰＣＲチューブリテーナーの洗浄（デコンタミネーション）を行い、作業台４０×８０ｃｍ２の範囲、ピペットの持ち手部分、及びＰＣＲチューブリテーナーの上面を、ＵｌｔｒａＳｎａｐでそれぞれ拭き取った。続いて、同エリア内において、ＰＣＲサンプルを取り扱った後に、同じ箇所を再度ＵｌｔｒａＳｎａｐでそれぞれ拭き取った。この一連の操作を各作業日に１回行い、８日間に亘って繰り返し行った。続いて、採取した各検体について遺伝子増幅反応による残留産物の検出を試みた。具体的に、ＵｌｔｒａＳｎａｐは綿球部をケースに戻し、ルシフェラーゼ溶液を綿棒上部の綿球部に落としてＳｙｓｔｅｍＳＵＲＥ Ｐｌｕｓで発光値を測定した。また、各作業日で取り扱ったＰＣＲサンプル数の記録も行った。測定結果は図７に示している。図７のグラフ中の上部に記載した数値はその日に扱ったＰＣＲサンプル数を示しており、１日目で８１サンプル、２日目で１６１サンプル、３日目で１１５サンプル、４日目で７９サンプル、５日目で８サンプル、６日目で５８サンプル、７日目で９４サンプル、８日目で０サンプルであった。
ＤＮＡ型鑑定室のポストＰＣＲエリア内において、最初に、実施例で説明した方法と同様にして作業台、ピペット、及びＰＣＲチューブリテーナーの洗浄（デコンタミネーション）を行い、作業台４０×８０ｃｍ２の範囲、ピペットの持ち手部分、及びＰＣＲチューブリテーナーの上面を、ＵｌｔｒａＳｎａｐでそれぞれ拭き取った。続いて、同エリア内において、ＰＣＲサンプルを取り扱った後に、同じ箇所を再度ＵｌｔｒａＳｎａｐでそれぞれ拭き取った。この一連の操作を各作業日に１回行い、８日間に亘って繰り返し行った。続いて、採取した各検体について遺伝子増幅反応による残留産物の検出を試みた。具体的に、ＵｌｔｒａＳｎａｐは綿球部をケースに戻し、ルシフェラーゼ溶液を綿棒上部の綿球部に落としてＳｙｓｔｅｍＳＵＲＥ Ｐｌｕｓで発光値を測定した。また、各作業日で取り扱ったＰＣＲサンプル数の記録も行った。測定結果は図７に示している。図７のグラフ中の上部に記載した数値はその日に扱ったＰＣＲサンプル数を示しており、１日目で８１サンプル、２日目で１６１サンプル、３日目で１１５サンプル、４日目で７９サンプル、５日目で８サンプル、６日目で５８サンプル、７日目で９４サンプル、８日目で０サンプルであった。
【0075】
図７に示すように、ポストＰＣＲエリア内においてＰＣＲサンプルを取り扱うことにより、作業台、ピペット、及びＰＣＲチューブリテーナーから採取した検体に起因する発光値は上昇し、遺伝子増幅反応による残留産物の量が増加する傾向にあることが分かった。一方、各検査対象物に対して洗浄を行うことで、各検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物の量が大幅に低下することが分かった。また、取り扱ったＰＣＲサンプル数が多い作業日では、各検査対象物に存在する遺伝子増幅反応による残留産物の量が上昇する傾向にあることも分かった。
【0076】
以上の結果から、上記実施例で説明した遺伝子増幅反応による残留産物の検出方法を利用することで、検査対象物に存在する当該残留産物を連続モニタリングできることが分かり、当該残留産物の量を簡便かつ安価に連続モニタリングする方法として有用であることが明らかとなった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
