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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024033624
(43)【公開日】2024-03-13
(54)【発明の名称】耐熱性が向上した配列制御型ポリエステル合成酵素
(51)【国際特許分類】
C12N 9/10 20060101AFI20240306BHJP
C12P 7/625 20220101ALI20240306BHJP
C12P 7/62 20220101ALI20240306BHJP
【ＦＩ】
C12N9/10 ZNA
C12P7/625
C12P7/62
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022137309
(22)【出願日】2022-08-30
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和元年度 国立研究開発法人科学技術振興機構、未来社会創造事業「配列制御技術に基づく生分解性エラストマーの生合成」、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504173471
【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学
(71)【出願人】
【識別番号】507219686
【氏名又は名称】静岡県公立大学法人
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】松本 謙一郎
(72)【発明者】
【氏名】冨田 宏矢
(72)【発明者】
【氏名】中野 祥吾
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 創平
(72)【発明者】
【氏名】小塚 康平
(72)【発明者】
【氏名】古川 翔子
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050CC04
4B050DD01
4B050LL05
4B064AD83
4B064CA02
4B064CA19
4B064DA16
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＰｈａＣＡＲと同等の幅広い基質認識能と配列制御性を有し、かつ、耐熱性を有している新規なポリエステル合成酵素を提供すること。
【解決手段】複数のアミノ酸配列から選ばれた特定のアミノ酸配列、または前記複数のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、耐熱性のポリエステル合成酵素等が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】複数のアミノ酸配列から選ばれた特定のアミノ酸配列、または前記複数のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、耐熱性のポリエステル合成酵素等が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示されるアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、耐熱性のポリエステル合成酵素。
【請求項2】
２種以上のヒドロキシカルボン酸のモノマーを共重合することができる、請求項１記載のポリエステル合成酵素。
【請求項3】
前記２種以上のヒドロキシカルボン酸のモノマーが、２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸および２位以外の位置にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含む場合に、ブロック共重合体を合成する、請求項２記載のポリエステル合成酵素。
【請求項4】
請求項１記載のポリエステル合成酵素、およびＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素を発現する微生物を、少なくとも１種のヒドロキシカルボン酸および／またはその代謝前駆体を含む培地中で培養することを含む、ポリエステルの製造方法。
【請求項5】
前記培地が２種以上のヒドロキシカルボン酸および／またはその代謝前駆体を含み、前記２種以上のヒドロキシカルボン酸をモノマーユニットとして含む共重合体が製造される、請求項４記載の製造方法。
【請求項6】
前記２種以上のヒドロキシカルボン酸が、２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸および２位以外の位置にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含み、前記共重合体が、前記２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸をモノマーユニットとして含むセグメントと、前記２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含まないセグメントとを含むブロック共重合体である、請求項５記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、耐熱性が向上した新規な配列制御型ポリエステル合成酵素に関する。
【背景技術】
【0002】
ポリヒドロキシアルカン酸（polyhydroxyalkanoate，ＰＨＡ）は、産業利用されている微生物産生ポリエステルである。現在使用されているＰＨＡは、３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ吉草酸、３－ヒドロキシヘキサン酸、および４－ヒドロキシ酪酸の単独重合体またはランダム共重合体である。
【0003】
近年の研究において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ６１－３由来クラス２型のＰＨＡ合成酵素の進化工学的改変により得られたＰｈａＣ１ＰｓＳＴＱＫを用いて、２－ヒドロキシ酪酸などの２位に水酸基を有する非天然ユニットの重合が可能となった（非特許文献１）。さらに、２つのクラス１型のＰＨＡ合成酵素 Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のＰｈａＣＡｃおよびＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰｈａＣＲｅをキメラ化させて作成したＰｈａＣＡＲを用いることにより、２－ヒドロキシ酪酸などの２位に水酸基を有する非天然ユニットが重合体中に取り込み可能であることが分かった（非特許文献２）。さらにＰｈａＣＡＲは、モノマー配列を制御する機能を有し、該酵素を発現する組換え大腸菌を用いて、２－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシ酪酸の混合物から、これら二種のモノマーのブロック共重合体を自発的に合成できることが報告された（非特許文献２）。ＰｈａＣＡＲの基質特異性の探索により、本酵素がグリコール酸や６－ヒドロキシヘキサン酸などの長主鎖モノマーを取り込み可能な極めて幅広い基質認識能を持つことが明らかとなった（特許文献１、非特許文献３）。またさらに、配列制御性の研究から、ＰｈａＣＡＲによりブロック共重合体が合成されるのは、モノマーの片方が２位に水酸基を有する構造を持つ場合であることが明らかとなった（非特許文献３）。
【0004】
しかしながら、ほとんどのＰＨＡ合成酵素は熱安定性に乏しく、ＰｈａＣＡＲも３０℃を超えると著しくポリマー生産性が低下する。耐熱性ＰＨＡ合成酵素としては、５５℃までの耐熱性を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＳＧ４５０２由来のクラス２型酵素が知られており、該酵素にＰｈａＣ１ＰｓＳＴＱＫと同じ変異を導入した変異酵素を用いて、乳酸と３－ヒドロキシ酪酸とのブロック共重合体がｉｎ ｖｉｔｒｏ合成により得られたとの報告がある（非特許文献４）。しかしながら、ブロック共重合体の合成量はわずかであり、ブロック構造が十分検証されておらず、また、ｉｎ ｖｉｖｏ合成については検証されていない。
【0005】
したがって、現在のところ、ＰｈａＣＡＲがブロック共重合体を生合成可能な唯一の酵素である。今までに、ＰｈａＣＡＲと同等の幅広い基質認識能と配列制御性を有し、かつ、耐熱性を有しているＰＨＡ合成酵素は取得されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第ＷＯ２０２１／１７２５５９号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Taguchi et al. PNAS 2008 105:17323
【非特許文献2】Matsumoto et al. Biomacromol 2018 19:662
【非特許文献3】Satoh et al. Microb Cell Fact (2022) 21：84
【非特許文献4】Tajima et al. Appl Microbiol Biotechnol 2012 94:365-376
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、ＰｈａＣＡＲと同等の幅広い基質認識能と配列制御性を有し、かつ、耐熱性を有している新規なポリエステル合成酵素を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ合成酵素ＰｈａＣＡｃと、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）由来のＰＨＡ合成酵素ＰｈａＣＲｅの２つのクラス１型酵素をキメラ化（それぞれ一部分を融合）させて作成されたＰｈａＣＡＲが、ＰＨＡ合成酵素の中で例外的に幅広い基質特異性と配列制御性を持つ有用な酵素であることに着目し、ＰｈａＣＡｃとＰｈａＣＲｅの中間的構造を持つ（すなわち、両酵素に相同性を有する）酵素であれば、ＰｈａＣＡＲと同様の機能を発揮できるのではないか、と着想した。そこで、鋭意研究した結果、本発明者らは、ＰｈａＣＡＲと同等の幅広い基質認識能と配列制御性を有し、かつ、４０℃以上でも活性を保持する耐熱性を有する人工ポリエステル合成酵素を取得することに成功した。
【0010】
すなわち、本発明は以下の態様を提供する。
［１］配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示されるアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、耐熱性のポリエステル合成酵素；
［２］２種以上のヒドロキシカルボン酸のモノマーを共重合することができる、［１］記載のポリエステル合成酵素；
［３］前記２種以上のヒドロキシカルボン酸のモノマーが、２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸および２位以外の位置にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含む場合に、ブロック共重合体を合成する、［２］記載のポリエステル合成酵素；
［４］［１］記載のポリエステル合成酵素、およびＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素を発現する微生物を、少なくとも１種のヒドロキシカルボン酸および／またはその代謝前駆体を含む培地中で培養することを含む、ポリエステルの製造方法；
［５］前記培地が２種以上のヒドロキシカルボン酸および／またはその代謝前駆体を含み、前記２種以上のヒドロキシカルボン酸をモノマーユニットとして含む共重合体が製造される、［４］記載の製造方法；
［６］前記２種以上のヒドロキシカルボン酸が、２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸および２位以外の位置にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含み、前記共重合体が、前記２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸をモノマーユニットとして含むセグメントと、前記２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含まないセグメントとを含むブロック共重合体である、［５］記載の製造方法。
［１］配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示されるアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、耐熱性のポリエステル合成酵素；
［２］２種以上のヒドロキシカルボン酸のモノマーを共重合することができる、［１］記載のポリエステル合成酵素；
［３］前記２種以上のヒドロキシカルボン酸のモノマーが、２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸および２位以外の位置にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含む場合に、ブロック共重合体を合成する、［２］記載のポリエステル合成酵素；
［４］［１］記載のポリエステル合成酵素、およびＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素を発現する微生物を、少なくとも１種のヒドロキシカルボン酸および／またはその代謝前駆体を含む培地中で培養することを含む、ポリエステルの製造方法；
［５］前記培地が２種以上のヒドロキシカルボン酸および／またはその代謝前駆体を含み、前記２種以上のヒドロキシカルボン酸をモノマーユニットとして含む共重合体が製造される、［４］記載の製造方法；
［６］前記２種以上のヒドロキシカルボン酸が、２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸および２位以外の位置にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含み、前記共重合体が、前記２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸をモノマーユニットとして含むセグメントと、前記２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含まないセグメントとを含むブロック共重合体である、［５］記載の製造方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、ＰｈａＣＡＲと同等の幅広い基質特異性と配列制御性とを有し、かつ、４０℃以上でも活性を保持する耐熱性の人工ポリエステル合成酵素が提供される。本発明のポリエステル合成酵素は、熱安定性に優れており、培養温度４０℃においても良好なポリマー生産を示す。また、本発明のポリエステル合成酵素は、ＰｈａＣＡＲと同様に、ホモポリマーはもちろん、２種以上のヒドロキシカルボン酸を基質として用いることにより共重合体を製造することができ、特に、２位にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸と２位以外にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含む２種以上のヒドロキシカルボン酸を基質として用いることによりブロック共重合体を製造することができる。したがって、本発明によれば、従来弱点とされていた乏しい熱安定性を改善した、新たな配列制御型ポリエステル合成酵素が提供される。
【0012】
２位にヒドロキシ基を有するモノマーから構成されるポリマーは、例えばポリ乳酸やポリグリコール酸のように、ガラス転移温度が室温よりも高いポリマーが多い（ポリ乳酸およびポリグリコール酸の場合、それぞれ６０℃および４６℃）。これはポリエステルの分子鎖の運動性が低い（分子が固い）ことを意味しており、３０℃付近の温度で効率よく重合することは困難である。原理的には、合成温度を上昇されれば重合効率が改善すると予想されるが、今まで知られていたほとんどのＰＨＡ合成酵素は熱安定性に乏しかった。本発明のポリエステル合成酵素は、熱安定性であるため、高温での重合が可能であり、２位にヒドロキシ基を有するモノマーを含むポリマーでも効率よく合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】人工設計ポリエステル合成酵素の系統樹を示す。
【図2】人工設計ポリエステル合成酵素によるＰ（３ＨＢ）合成結果を示す。図中、「ＮＣ」は、ポリエステル合成系遺伝子群を含まないプラスミドを導入した株を示す。
【図3】人工設計ポリエステル合成酵素によるＰ（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ）合成結果を示す。図中、「ＮＣ」は、ポリエステル合成系遺伝子群を含まないプラスミドを導入した株を示す。
【図4】人工設計ポリエステル合成酵素によるＰ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）合成結果を示す。図中、「ＮＣ」は、ポリエステル合成系遺伝子群を含まないプラスミドを導入した株を示す。
【図5】人工設計ポリエステル合成酵素によるＰ（２ＨＢ－ｃｏ－３ＨＢ）合成結果を示す。図中、「ｐＵＣ１８」は、ポリエステル合成系遺伝子群を含まないプラスミドを導入した株を示す。
【図6】人工設計ポリエステル合成酵素ＦｃＰｈａＣ４によって合成されたＰ（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ）のＮＭＲスペクトルを示す。
【図7】人工設計ポリエステル合成酵素ＦｃＰｈａ５ＷＰによって合成されたＰ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）のＮＭＲスペクトルを示す。
【図8】人工設計ポリエステル合成酵素ＦｃＰｈａＣ５Ｒｅによって合成されたＰ（２ＨＢ－ｃｏ－３ＨＢ）のＮＭＲスペクトルを示す。
【図9】人工設計ポリエステル合成酵素によるＰ（６ＨＨｘ－ｃｏ－３ＨＢ）合成結果を示す。図中、「ｐＵＣ１８」は、ポリエステル合成系遺伝子群を含まないプラスミドを導入した株を示す。
【図10】人工設計ポリエステル合成酵素によるＰ（３ＨＨｘ－ｃｏ－３ＨＢ）合成結果を示す。図中、「ｐＵＣ１８」は、ポリエステル合成系遺伝子群を含まないプラスミドを導入した株を示す。
【図11】人工設計ポリエステル合成酵素ＦｃＰｈａＣ４によって合成されたＰ（６ＨＨｘ－ｃｏ－３ＨＢ）のＮＭＲスペクトルを示す。
【図12】人工設計ポリエステル合成酵素ＦｃＰｈａＣ５ＷＰによって合成されたＰ（３ＨＨｘ－ｃｏ－３ＨＢ）のＮＭＲスペクトルを示す。
【図13】人工設計ポリエステル合成酵素の熱処理後の相対活性を示す。横軸は処理温度を示す。
【図14】高温培養によるＰ（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ）の生合成の結果を示す。
【図15】高温培養によって合成されたＰ（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ）におけるＧＬ分率の結果を示す。
【図16】高温培養後の菌体乾燥重量を示す。横軸は培養温度を示す。各温度につき、左から、ＦｃＰｈａＣ１、ＦｃＰｈａＣ２、ＦｃＰｈａＣ３、ＦｃＰｈａＣ４、ＦｃＰｈａＣ５Ｒｅ、ＦｃＰｈａＣ５ＷＰ、ＰｈａＣＡＲ、ＯＹＶ、ＮＣを導入した株を示す。なお、「ＮＣ」は、ポリエステル合成系遺伝子群を含まないプラスミドを導入した株を示す。
【図17】高温培養後の乾燥菌体重量あたりのポリマー生産量を示す。各酵素遺伝子を導入した株のバーは、左から、培養温度３０℃、３５℃、３７℃、４０℃、４５℃の生産量を示す。なお、「ＮＣ」は、ＰＨＡ合成系遺伝子群を含まないプラスミドを導入した株を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
１．用語
当該分野において、ポリヒドロキシアルカン酸（polyhydroxyalkanoate，ＰＨＡ）とは、慣例的に、ヒドロキシカルボン酸（hydroxycarboxylate）をモノマーユニットとして含む脂肪族ポリエステルを言う。本願明細書において使用される場合も、「ＰＨＡ」なる語は慣例にしたがった意味を有する。したがって、本願明細書において用いる場合、ＰＨＡ（ポリマーまたはポリエステルと称する場合もある）を構成するヒドロキシカルボン酸は、脂肪族鎖式飽和のヒドロキシアルカン酸に限定されず、その主鎖または側鎖に不飽和結合や環状構造を含んでいてもよい。
当該分野において、ポリヒドロキシアルカン酸（polyhydroxyalkanoate，ＰＨＡ）とは、慣例的に、ヒドロキシカルボン酸（hydroxycarboxylate）をモノマーユニットとして含む脂肪族ポリエステルを言う。本願明細書において使用される場合も、「ＰＨＡ」なる語は慣例にしたがった意味を有する。したがって、本願明細書において用いる場合、ＰＨＡ（ポリマーまたはポリエステルと称する場合もある）を構成するヒドロキシカルボン酸は、脂肪族鎖式飽和のヒドロキシアルカン酸に限定されず、その主鎖または側鎖に不飽和結合や環状構造を含んでいてもよい。
【0015】
２．ポリエステル合成酵素
本発明者らは、データベース上に存在する多数のＰＨＡ合成酵素ＰｈａＣのアミノ酸配列情報から、天然型ＰｈａＣＲｅに相同性を有する配列を探索し、フルコンセンサス設計法と総称される人工タンパク質配列設計法（例えば、Hayashi et al. J Biosci Bioeng 2022 133(4):309-315参照）を用いて、ＰｈａＣＲｅと配列相同性を有する多数の酵素のコンセンサス配列を計算し、かつ天然型ＰｈａＣＡｃ配列とも相同性を有するアミノ酸配列を設計した。モチーフ検索と構造安定化を取り入れた独自のアルゴリズムにより、機能性の人工タンパク質配列が得られる可能性を高めた。このようにして設計されたタンパク質をコードする遺伝子を作成し、大腸菌内で発現させてポリマー合成能を調べた。その結果、設計した人工タンパク質の中から、ＰｈａＣＡＲと同等の幅広い基質特異性と配列制御性を示す、６種の新規な人工ポリエステル合成酵素が得られた。さらに熱安定性を調べたところ、これら６種の人工ポリエステル合成酵素は、熱安定性に優れており、培養温度４０℃においても良好なポリマー生産することが分かった。
本発明者らは、データベース上に存在する多数のＰＨＡ合成酵素ＰｈａＣのアミノ酸配列情報から、天然型ＰｈａＣＲｅに相同性を有する配列を探索し、フルコンセンサス設計法と総称される人工タンパク質配列設計法（例えば、Hayashi et al. J Biosci Bioeng 2022 133(4):309-315参照）を用いて、ＰｈａＣＲｅと配列相同性を有する多数の酵素のコンセンサス配列を計算し、かつ天然型ＰｈａＣＡｃ配列とも相同性を有するアミノ酸配列を設計した。モチーフ検索と構造安定化を取り入れた独自のアルゴリズムにより、機能性の人工タンパク質配列が得られる可能性を高めた。このようにして設計されたタンパク質をコードする遺伝子を作成し、大腸菌内で発現させてポリマー合成能を調べた。その結果、設計した人工タンパク質の中から、ＰｈａＣＡＲと同等の幅広い基質特異性と配列制御性を示す、６種の新規な人工ポリエステル合成酵素が得られた。さらに熱安定性を調べたところ、これら６種の人工ポリエステル合成酵素は、熱安定性に優れており、培養温度４０℃においても良好なポリマー生産することが分かった。
【0016】
本願明細書において、上記６種の人工ポリエステル合成酵素をそれぞれ、ＦｃＰｈａＣ１、ＦｃＰｈａＣ２、ＦｃＰｈａＣ３、ＦｃＰｈａＣ４、ＦｃＰｈａＣ５ＷＰ、およびＦｃＰｈａＣ５Ｒｅと称する。ＦｃＰｈａＣ１、ＦｃＰｈａＣ２、ＦｃＰｈａＣ３、ＦｃＰｈａＣ４、ＦｃＰｈａＣ５ＷＰ、およびＦｃＰｈａＣ５Ｒｅのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６に示される。したがって、本発明の一の態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＰＨＡ合成酵素を提供する。好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリエステル合成酵素が提供される。
【0017】
ＦｃＰｈａＣ１、ＦｃＰｈａＣ２、ＦｃＰｈａＣ３、ＦｃＰｈａＣ４、ＦｃＰｈａＣ５ＷＰ、およびＦｃＰｈａＣ５Ｒｅはさらに、それぞれ、ポリエステル合成活性を保持する範囲において、上記のアミノ酸配列中に１以上の変異を有していてもよい。かかる変異体酵素の例として、限定するものではないが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。上記変異体酵素のさらなる例として、限定するものではないが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示されるアミノ酸配列において、１～数個、例えば１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、あるいは１個または２個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示されるアミノ酸配列において、１～１５個、例えば１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、あるいは１個または２個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドが提供される。上記「変異」には、１以上のアミノ酸残基の置換、挿入、付加、および／または欠失が含まれる。また、アミノ酸配列の同一性は、当該分野においていずれかの既知の方法によって配列アライメントすることによって決定すればよい。例えば、限定するものではないが、ＢＬＡＳＴプログラムなどの既知の方法を用いることができる。
【0018】
ＦｃＰｈａＣ１の上記変異体酵素は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列において、「Ｔ２１０、Ｉ２２１、Ｌ２５３、Ｉ２６４」を保持する。ＦｃＰｈａＣ２の上記変異体酵素は、例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、「Ｓ１８１、Ｌ１９２、Ｌ２２４、Ｉ２３５」を保持する。ＦｃＰｈａＣ３の上記変異体酵素は、例えば、配列番号３のアミノ酸配列において、「Ｓ１８４、Ｖ１９５、Ｌ２２７、Ｉ２３８」を保持する。ＦｃＰｈａＣ４の上記変異体酵素は、例えば、配列番号４のアミノ酸配列において、「Ｔ１９３、Ｌ２０４、Ｌ２３６、Ｉ２４７」を保持する。ＦｃＰｈａＣ５ＷＰの上記変異体酵素は、例えば、配列番号５のアミノ酸配列において、「Ｔ２０１、Ｖ２１２、Ｌ２４３、Ｉ２５５」を保持する。ＦｃＰｈａＣ５Ｒｅの上記変異体酵素は、例えば、配列番号６のアミノ酸配列において、「Ｔ１９８、Ｖ２０９、Ｌ２４０、Ｉ２５２」を保持する。上記の４つの位置のアミノ酸残基からなる５種類のアミノ酸モチーフは、本発明における人工タンパク質アミノ酸配列の設計において重要なモチーフである。したがって、上記変異体酵素において、これらのアミノ酸モチーフ配列が維持されることが好ましい。上記の４つのアミノ酸位置は、上記６種のアミノ酸配列間での対応する位置である。対応するアミノ酸位置は、例えば、配列アライメントなどにより、当業者であれば容易に決定することができる。
【0019】
上記変異体酵素は、例えば、ＰｈａＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号７）の１２１位、１４９位、３１４位、３２３位、４３０位、４５４位、および５０９位からなる群から選択される１以上の位置に対応するアミノ酸位置に変異を有していてもよい。ＰｈａＣＡＲにおける上記のアミノ酸位置は、ＰｈａＣＡＲにおいて「優良変異点」として知られている位置であり、当該位置に変異を有することにより酵素の機能が上がることが知られている。したがって、本発明のポリエステル合成酵素においても、上記ＰｈａＣＡＲにおける「優良変異点」に対応する位置に変異を有することにより、酵素機能が向上することが予測される。対応するアミノ酸位置は、例えば、配列アライメントなどにより、当業者であれば容易に決定することができる。ＦｃＰｈａＣ１、ＦｃＰｈａＣ２、ＦｃＰｈａＣ３、ＦｃＰｈａＣ４、ＦｃＰｈａＣ５ＷＰ、およびＦｃＰｈａＣ５Ｒｅのアミノ酸配列上における、ＰｈａＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号７）の１２１位、１４９位、３１４位、３２３位、４３０位、４５４位、および５０９位に対応する位置は、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列における１０９位、１６１位、３３０位、３３９位、４４１位、４６５位、および５２０位、配列番号２のアミノ酸配列における１０９位、１３６位、３０１位、３１０位、４１２位、４３６位、および４９５位、配列番号３のアミノ酸配列における１１２位、１３０位、３０４位、３１３位、４１６位、４４０位、および４９８位、配列番号４のアミノ酸配列における１２１位、１４８位、３１３位、３２２位、４２４位、４４８位、および５０３位、配列番号５のアミノ酸配列における１２９位、１５６位、３２１位、３３０位、４３２位、４５６位、および５１１位、ならびに配列番号６のアミノ酸配列における１２６位、１５３位、３１８位、３２７位、４２９位、４５３位、および５０８位である。上記変異は、好ましくは置換である。したがって、ＰｈａＣＡＲのアミノ酸配列（配列番号７）の１２１位、１４９位、３１４位、３２３位、４３０位、４５４位、および５０９位に対応する位置における変異の好ましい例として、それぞれ、上記１２１位に対応する位置におけるアミノ酸残基のヒスチジン以外のアミノ酸残基への置換、例えばチロシンへの置換、上記１４９位に対応する位置におけるアミノ酸残基のアスパラギン以外のアミノ酸残基への置換、例えばアスパラギン酸への置換、上記３１４位に対応する位置におけるアミノ酸残基のフェニルアラニン以外のアミノ酸残基への置換、例えばロイシンへの置換、上記３２３位に対応する位置におけるアミノ酸残基のスレオニン以外のアミノ酸残基への置換、例えばイソロイシンへの置換、上記４３０位に対応する位置におけるアミノ酸残基のグリシン以外のアミノ酸残基への置換、例えばセリンへの置換、上記４５４位に対応する位置におけるアミノ酸残基のバリン以外のアミノ酸残基への置換、例えばアスパラギン酸への置換、および上記５０９位に対応する位置におけるアミノ酸残基のイソロイシン以外のアミノ酸残基への置換、例えばバリンへの置換が挙げられる。
【0020】
上記の６種の新規人工ポリエステル合成酵素およびその変異体を総称して、本願明細書においては「本発明のポリエステル合成酵素」または「本発明の酵素」という。
【0021】
本発明のポリエステル合成酵素は、耐熱性である。本願明細書において、「耐熱性」とは、酵素が３０℃を超える温度下においてもポリエステル合成活性を保持する程度をいう。ここで、「ポリエステル合成活性を保持する」とは、既知のＰＨＡ合成酵素の一般的な至適温度、例えば３０℃での本発明の酵素のポリエステル合成活性と比べて、約３０％以上、好ましくは約４０％以上、より好ましくは約５０％以上、さらに好ましくは約６０％以上、またさらに好ましくは約７０％以上、またさらに好ましくは約８０％以上、またさらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは１００％以上のポリエステル合成活性を有することをいう。より高温でより長時間より高い割合で活性が保持される酵素の方が、耐熱性が高いと言える。本発明のポリエステル合成酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性試験において４０℃以上でも３０分間以上ポリエステル合成活性を保持する。また、組換え大腸菌を用いたポリマー生合成条件では、本発明のポリエステル合成酵素は、むしろ高温培養条件で、３０℃と同等またはより高いポリマー生産性を示した。
【0022】
ポリエステル合成活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのどちらで測定してもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する場合、ポリエステル合成活性は試験するポリエステル合成酵素が基質と反応する速度により決定される。反応速度の測定は常法により行えばよい。例えば、粗酵素抽出液を各種温度で一定時間（例えば、１０～３０分間）維持した後、ＣｏＡチオエステル化させた基質ヒドロキシカルボン酸と３０℃で一定時間（例えば、１０～３０分間）反応させ、生成した遊離ＣｏＡをエルマン試薬を用いて黄色色素に変換し、この色素の量を４１２ｎｍの吸光度で定量することにより、反応速度を測定する。ｉｎ ｖｉｖｏで測定する場合、例えば、酵素をコードする遺伝子を人為的に発現させた微生物（例えば、大腸菌）を作製し、基質となるヒドロキシカルボン酸またはその代謝前駆体を含有する培地中、各種温度で一定時間（例えば、２４～４８時間）培養後、生産したポリエステルを抽出し、その量を測定する。ポリエステルの合成量は活性と完全に比例しないものの、ポリエステル合成活性が著しく低い場合はポリエステルの合成量も少なくなることから、ポリエステル合成酵素の活性を大まかに評価することができる。本目的のためには、多くのＰＨＡ合成酵素の至適反応温度である３０℃で微生物が培養される。ポリエステル合成酵素が高温で活性を保持する場合は、より高い温度で培養することが可能となる。
【0023】
生産されたポリエステル量の測定は、例えば、得られたポリエステルを硫酸・メタノールで処理してモノマーのメチルエステル体に変換した後、このメチルエステルをガスクロマトグラフィーで定量することによって行うことができる。
【0024】
本発明のポリエステル合成酵素は、１種または２種以上のヒドロキシカルボン酸を基質とする。本発明のポリエステル合成酵素の基質となるヒドロキシカルボン酸は、２位または２位以外の位置にヒドロキシ基を有する。前記ヒドロキシカルボン酸は、２個以上のヒドロキシ基を有していてもよい。前記「２位以外の位置」としては、ヒドロキシカルボン酸の鎖長にもよるが、例えば、３位、４位、５位、６位などが挙げられる。前記ヒドロキシカルボン酸が２個以上のヒドロキシ基を有する場合、２位および２位以外の位置にヒドロキシ基を有していてもよく、または２位以外の複数の位置にヒドロキシ基を有していてもよい。
【0025】
本発明のポリエステル合成酵素の基質となるヒドロキシカルボン酸の例として、限定するものではないが、炭素数２～１４個のヒドロキシカルボン酸、好ましくは炭素数２～１２個のヒドロキシカルボン酸、例えば、炭素数２～５個のヒドロキシカルボン酸、または炭素数６～１２個のヒドロキシカルボン酸等が挙げられる。ヒドロキシカルボン酸は、側鎖を有していてもよく、主鎖または側鎖に不飽和結合を含んでいてもよい。ヒドロキシカルボン酸はまた、主鎖の末端または側鎖に環状構造を含んでいてもよい。ヒドロキシカルボン酸はまた、主鎖の末端または側鎖にいずれかの官能基を有していてもよい。
【0026】
本発明のポリエステル合成酵素の基質となるヒドロキシカルボン酸のさらなる例として、限定するものではないが、炭素数２～１２個の２－ヒドロキシカルボン酸、炭素数３～１２個の３－ヒドロキシカルボン酸、炭素数４～１２個の４－ヒドロキシカルボン酸、炭素数５～１２個の５－ヒドロキシカルボン酸、炭素数６～１２個の６－ヒドロキシカルボン酸等が挙げられ、例えば、炭素数２～１２個の２－ヒドロキシアルカン酸、炭素数３～１２個の３－ヒドロキシアルカン酸、炭素数４～１２個の４－ヒドロキシアルカン酸、炭素数５～１２個の５－ヒドロキシアルカン酸、炭素数６～１２個の６－ヒドロキシアルカン酸等が挙げられる。また、さらなる具体例として、限定するものではないが、２－ヒドロキシ酢酸（グリコール酸、ＧＬ）、２－ヒドロキシプロピオン酸（乳酸、ＬＡ）、２－ヒドロキシ酪酸（２ＨＢ）、２－ヒドロキシペンタン酸（２－ヒドロキシ吉草酸）、２－ヒドロキシヘキサン酸、３－ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）、３－ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）、３－ヒドロキシペンタン酸（３－ヒドロキシ吉草酸、３ＨＶ）、３－ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）、４－ヒドロキシ－２－メチル酪酸（４Ｈ２ＭＢ）、４－ヒドロキシ酪酸、２，４－ジヒドロキシ酪酸（２４ＤＨＢ）、５－ヒドロキシペンタン酸（５－ヒドロキシ吉草酸、５ＨＶ）、６－ヒドロキシヘキサン酸（６ＨＨｘ）等が挙げられる。２－ヒドロキシカルボン酸の具体例として、さらに、アミノ酸から誘導される、すなわち、アミノ酸のアミノ基がヒドロキシ基に置換されて得られる２－ヒドロキシカルボン酸が挙げられる。かかるアミノ酸から誘導される２－ヒドロキシカルボン酸の例として、限定するものではないが、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはフェニルアラニンにおいてアミノ基がヒドロキシ基に置換された２－ヒドロキシカルボン酸が挙げられる。
【0027】
本発明のポリエステル合成酵素は、選択される基質の種類およびその組み合わせによって様々なポリエステルを合成することができる。例えば、１種類のヒドロキシカルボン酸を基質とする場合、単独重合体が合成される。また、例えば、２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸および２位以外の位置にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含む２種以上のヒドロキシカルボン酸を基質とする場合、本発明のポリエステル合成酵素により、ブロック共重合体が合成される。２位以外の位置にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含む２種以上のヒドロキシカルボン酸を基質とする場合、本発明のポリエステル合成酵素により、ランダム共重合体が合成される。前記２位以外の位置にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸には、２位と２位以外の１以上の位置にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸も包含される。かくして、本発明の酵素は、配列制御性のポリエステル合成酵素である。
【0028】
３．ポリエステル
本発明のポリエステル合成酵素は、１種または２種以上のヒドロキシカルボン酸を基質とすることができ、モノマーユニットとして２個以上のヒドロキシカルボン酸がエステル結合によって重合された、単独重合体(ホモポリマー）または共重合体(コポリマー）が合成される。上記したように、選択される基質の種類およびその組み合わせによって様々なポリエステルが合成される。
本発明のポリエステル合成酵素は、１種または２種以上のヒドロキシカルボン酸を基質とすることができ、モノマーユニットとして２個以上のヒドロキシカルボン酸がエステル結合によって重合された、単独重合体(ホモポリマー）または共重合体(コポリマー）が合成される。上記したように、選択される基質の種類およびその組み合わせによって様々なポリエステルが合成される。
【0029】
共重合体には、ランダム共重合体、ブロック共重合体、およびグラジエント共重合体が包含される。共重合体は、２種類以上モノマーユニットを含み、例えば、２種、３種、または４種以上のモノマーユニットを含んでいてもよい。ランダム共重合体は、２位以外の位置にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸である２種以上のモノマーユニットから構成される。ブロック共重合体を構成するモノマーユニットの少なくとも１種は、２位にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸である。
【0030】
ブロック共重合体には、１種のモノマーからなるホモ重合セグメントと別の１種のモノマーからなるホモ重合セグメントを含む共重合体、ホモ重合セグメントと共重合セグメントを含む共重合体、２種以上の共重合セグメントからなる共重合体がある。前記共重合セグメントは、ランダム構造、ブロック構造、またはグラジエント構造を有していてもよく、それぞれ、ランダム共重合セグメント、ブロック共重合セグメント、またはグラジエント共重合セグメントと呼ぶ。したがって、ブロック共重合体は、ランダム共重合セグメント、ブロック共重合セグメント、およびグラジエント共重合セグメントから選ばれる１種または２種以上のセグメントを含んでいてもよい。本願明細書において、「セグメント」とは、ブロック共重合体における各ブロックを構成する構成単位である。１種類のモノマーから構成される単位を「ホモ重合セグメント」、２種類以上のモノマーから構成される単位を「共重合セグメント」と呼ぶ。ランダム共重合セグメントに含まれる全てのモノマーは、２位以外の位置にヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸であり、ランダム共重合セグメントは２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸を含まない。ブロック共重合セグメントに含まれる少なくとも１種のモノマーは、２位のみにヒドロキシ基を有するヒドロキシカルボン酸である。ブロック共重合体におけるモノマーの配列は、選択される基質の種類およびその組み合わせ、ポリエステル合成酵素の種類によって決定される。
【0031】
前記重合体の重合度は、基質の種類等の様々な因子に依存し、限定されないが、モノマーユニット数として、例えば１０００以上、好ましくは５０００以上、さらに好ましくは１００００以上が挙げられる。重合度は高ければ高いほど好ましいが、一例として、１０００～１００００程度であってもよい。
【0032】
合成された重合体の構造、モノマー組成および配列、平均分子量等は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、ガスクロマトグラフィー、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析することができる。
【0033】
４．ポリエステルの製造方法
本発明のポリエステル合成酵素、およびＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素を発現している微生物を、前記ヒドロキシカルボン酸またはその代謝前駆体を含む培地中で培養することにより、前記微生物においてポリエステルを製造させることができる。
本発明のポリエステル合成酵素、およびＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素を発現している微生物を、前記ヒドロキシカルボン酸またはその代謝前駆体を含む培地中で培養することにより、前記微生物においてポリエステルを製造させることができる。
【0034】
本願明細書において、「ＣｏＡ転移酵素」とは、前記ヒドロキシカルボン酸にＣｏＡ（補酵素Ａ）を転移させる反応を触媒する酵素である。例えば、限定するものではないが、プロピオニル－ＣｏＡ転移酵素（ＰＣＴ、propionyl-CoA transferase）、２Ｈ４ＭＶ－ＣｏＡ転移酵素（ＨａｄＡ）等が挙げられる。ＰＣＴは一般に、炭素数５個以下の短鎖ヒドロキシカルボン酸を対応するＣｏＡチオエステルに変換することが知られている。本願明細書において、「ＣｏＡ化酵素」とは、前記ヒドロキシカルボン酸にＣｏＡ（補酵素Ａ）を結合させる反応を触媒する酵素である。例えば、限定するものではないが、炭素数６～１２個の中鎖３－ヒドロキシアルカン酸ＣｏＡライゲース（ＡｌｋＫ）が挙げられる。ＡｌｋＫは、中鎖３－ヒドロキシカルボン酸または４個以上の炭素からなる主鎖を有するヒドロキシカルボン酸と、ＣｏＡとの縮合を触媒することが知られている。したがって、例えば、炭素数５個以下のヒドロキシカルボン酸を基質とする場合は、好ましくはＰＣＴが用いられる。例えば、炭素数６個以上のヒドロキシカルボン酸または炭素数４個以上の主鎖を有するヒドロキシカルボン酸を基質とする場合は、好ましくはＡｌｋＫが用いられる。
【0035】
ＰＣＴは、ＥＣ：２．８．３．１に分類される酵素である。本願明細書において使用される場合、ＰＣＴの由来はいずれであってもよい。例えば、大腸菌での発現を容易にするという観点から、メガスフェラ（Megasphaera）属、ラルストニア（Ralstonia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、または大腸菌（Escherichia）属細菌由来のＰＣＴが好ましく、メガスフェラ属細菌由来のＰＣＴがより好ましく、Megasphaera elsdenii由来のＰＣＴがさらに好ましい。当業者であれば、公知のデータベース等における遺伝子（ヌクレオチド配列）情報を利用して、当該分野における既知の方法により、同種若しくは他の細菌等からその相同遺伝子を同定することが可能である。かかる相同遺伝子によってコードされるポリペプチドも、ＰＣＴとして利用することができる。ＰＣＴはまた、その触媒活性を保持する限り、野生型アミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸変異を含む変異型酵素であってもよい。アミノ酸変異には、１以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、および／または挿入が包含される。アミノ酸変異の数は、限定するものではないが、好ましくは１～１５個、例えば１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、あるいは１個または２個であってもよい。前記ＰＣＴの変異型酵素はまた、その触媒活性を保持する限り、野生型アミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。ＰＣＴの変異体または相同体が触媒活性を有するか否かは、例えば、当該分野で既知の方法によってそれらの触媒活性を測定して判定することができる。
【0036】
ＡｌｋＫは、ＥＣ：６．２．１．３に分類される酵素である。本願明細書において使用される場合、ＡｌｋＫの由来はいずれであってもよい。例えば、限定するものではないが、シュードモナス細菌、例えば、Pseudomonas oleovoransまたはPseudomonas putida由来のものが挙げられる。当業者であれば、公知のデータベース等における遺伝子（ヌクレオチド配列）情報を利用して、当該分野における既知の方法により、同種若しくは他の細菌等からその相同遺伝子を同定することが可能である。かかる相同遺伝子によってコードされるポリペプチドも、ＡｌｋＫとして利用することができる。ＡｌｋＫはまた、その触媒活性を有する限り、野生型アミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸変異を含む変異型酵素であってもよい。アミノ酸変異には、１以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、および／または挿入が包含される。アミノ酸変異の数は、限定するものではないが、好ましくは１～１５個、例えば１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、あるいは１個または２個であってもよい。前記ＡｌｋＫの変異型酵素はまた、その触媒活性を保持する限り、野生型アミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。ＡｌｋＫの変異体または相同体が触媒活性を有するか否かは、当該分野で既知の方法により確認することができる。例えば、当該酵素の反応によって生じたアシルＣｏＡを、アシルＣｏＡオキシダーゼによって特異的に酸化し、ここで生じた過酸化水素を、ペルオキシダーゼの存在下で、４－アミノアンチピリンと、３－メチル－Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アニリン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ－ジエチルアニリン又はフェノールとにより発色させて検出する方法を用いて判定してもよい。
【0037】
本発明のポリエステル合成酵素、およびＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素を発現する微生物は、前記酵素をコードする核酸、例えばＤＮＡを宿主微生物に導入して発現させることによって得ることができる。２種以上のポリエステル合成酵素または２種以上のＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素を１の宿主微生物中で発現させてもよい。前記酵素をコードする核酸の宿主微生物への導入は、当該分野で既知の方法によって行えばよく、例えば、相同組換えによる宿主染色体への導入であってもよい。
【0038】
前記宿主微生物としては、ポリエステル合成酵素、およびＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素を機能的に発現できる微生物であればいずれであってもよく、特に限定されない。生来的にＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素を発現している微生物であってもよい。ＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素を生来的に発現している微生物を宿主として用いる場合は、ポリエステル合成酵素をコードする核酸のみを宿主微生物に導入することもできるが、通常は、ポリエステル合成酵素をコードする核酸、およびＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素をコードする核酸を微生物に導入することが好ましい。
【0039】
宿主微生物の例としては、限定するものではないが、大腸菌（Escherichia coli）、水素細菌（Cupriavidus necator）、コリネ型細菌、酵母、ラルストニア属細菌、シュードモナス属細菌等が挙げられる。これら微生物の中で、ポリマー生産性とその生産安定性の観点からは水素細菌が好ましく、糖質原料の効率的利用と多様な構造のポリマー合成の観点からは大腸菌がより好ましく使用される。大腸菌の菌株は特に限定されないが、一例として、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株が挙げられる。
【0040】
前記微生物において目的の酵素を発現させるために、前記酵素をコードする核酸（例えばＤＮＡ）は、ベクターに組み込まれた形態で宿主微生物中に導入してもよい。前記酵素をコードする核酸のベクターへの挿入は、遺伝子工学の分野で慣用されている公知の技術を用いて行うことができる。
【0041】
前記ベクターは、自己複製ベクターであってもよく（すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない）、または宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。かかるベクターとしては、当該分野で既知のベクターを用いることができ、例えば、限定するものではないが、プラスミドベクター、ファージベクター等が挙げられる。宿主に適したベクターを使用すればよく、各宿主に適した多くのベクターが知られており、市販のベクターまたは既知のベクター、またはこれらを改変したベクターを用いるこができる。
【0042】
前記酵素をコードする核酸は、好ましくは、ベクター中において、各タンパク質の転写翻訳を調節することのできるプロモーターの下流に挿入される。プロモーターとしては、宿主中で遺伝子の転写を調節できるものであればいずれであってもよく、好ましくは、宿主細胞と同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するものが用いられる。大腸菌を宿主として用いる場合のプロモーターの例として、限定するものではないが、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター、カプリアビダス・ネカトールのｐｈｂオペロンのプロモーター領域等が挙げられる。水素細菌を宿主として用いる場合のプロモーターの例として、限定するものではないが、当該細菌由来のｐｈａＣ１遺伝子プロモーター、当該細菌由来のｐｈａＰ１遺伝子プロモーター等が挙げられる。コリネ型細菌を宿主として用いる場合のプロモーターの例として、限定するものではないが、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の細胞表層タンパク質遺伝子プロモーターが挙げられる。酵母を宿主として用いる場合のプロモーターの例として、限定するものではないが、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーターが挙げられる。シュードモナス属細菌を宿主として用いる場合、例えば、ｐｈａＣ１Ｐｓ遺伝子上流またはｐｈｂＣＡＢＲｅオペロン上流のプロモーターを含む領域を用いることができる。
【0043】
ベクターはさらに、ターミネーター配列、エンハンサー配列、スプライシングシグナル配列、ポリＡ付加シグナル配列、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）等の発現制御配列、または発現を誘導する配列を含んでいてもよい。発現誘導配列の例としては、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。
【0044】
ベクターはさらに、選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。選択マーカー遺伝子は、形質転換された微生物細胞の選択の方法に応じて適宜選択されてよく、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、アミノ酸や核酸等の栄養素の細胞内生合成に関与する遺伝子（栄養要求性を相補する遺伝子）、ルシフェラーゼ等の化学発光に関する遺伝子、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【0045】
本発明のポリエステル合成酵素をコードする核酸、およびＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素をコードする核酸は、１のベクター中に挿入されていてもよく、または別個のベクター中に挿入されていてもよい。また、２種以上の本発明のポリエステル合成酵素を用いる場合、当該２種以上の酵素をコードする核酸は１のベクター中に挿入されていてもよく、１種ずつ別々のベクター中に挿入されていてもよい。２種以上のＣｏＡ転移酵素を用いる場合、当該２種以上の酵素をコードする核酸は１のベクター中に挿入されていてもよく、１種ずつ別々のベクター中に挿入されていてもよい。２種以上のＣｏＡ転移酵素を用いる場合、当該２種以上の酵素をコードする核酸は１のベクター中に挿入されていてもよく、１種ずつ別々のベクター中に挿入されていてもよい。ＣｏＡ転移酵素およびＣｏＡ化酵素の両方を用いる場合、当該２種の酵素をコードするそれぞれの核酸は１のベクター中に挿入されていてもよく、１種ずつ別々のベクター中に挿入されていてもよい。一つのベクターに複数種の核酸が挿入される場合、これらの核酸はオペロンを形成することが好ましい。ここで「オペロン」とは、同一のプロモーターの制御下に転写される１又は複数の遺伝子から構成される核酸配列単位である。
【0046】
前記酵素をコードする核酸、または当該核酸が挿入されているベクターは、公知の手法によって前記宿主微生物中に導入すればよい。かかる導入方法としては、例えば、限定するものではないが、塩化カルシウム法、ヒートショック法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、接合伝達法、カルシウムイオンを用いる方法等が挙げられる。
【0047】
かくして得られた本発明のポリエステル合成酵素、およびＣｏＡ転移酵素および／またはＣｏＡ化酵素を発現する微生物を、前記ヒドロキシカルボン酸またはその代謝前駆体を含む培地中で培養する。前記培地（以下、「ポリエステル生産用培地」という）は、前記ヒドロキシカルボン酸またはその代謝前駆体のほかに、炭素源をはじめ、微生物の生育に必要な栄養源を含む。炭素源以外の栄養源としては、例えば、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源が挙げられる。
【0048】
前記栄養源は、前記微生物が資化可能であればいずれであってもよい。例えば、炭素源として、限定するものではないが、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖類；パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油等の油脂やその分画油類；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸等の脂肪酸やそれらの誘導体等が挙げられる。窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。ポリエステル生産用培地中における各栄養源の濃度は、前記微生物が十分に生育または維持される濃度であればよく、当業者によって適宜決定される。
【0049】
前記栄養源を含む培地として、前記宿主微生物の生育または維持に適した既知組成の培地または市販の培地を用いることができ、かかる培地に前記ヒドロキシカルボン酸またはその代謝前駆体を加えることにより、ポリエステル生産用培地を調製してもよい。前記宿主微生物の生育に適した既知組成の培地または市販の培地としては、例えば、限定するものではないが、大腸菌等の培養のために、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウムを含有）、水素細菌、Pseudomonas putidaの培養のために、窒素源制限無機塩培地（例えば、９ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４，１．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，０．５ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ，０．２ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４，微量元素を含有）、リン源制限無機塩培地（例えば、グルコース １ｇ／Ｌ，ＫＮＯ３ ０．５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４（７Ｈ２Ｏ） ０．２ｇ／Ｌ，ＣａＣ１２ ０．１ｇ／Ｌ，ＮａＣ１ ０．１ｇ／Ｌ、８．０ｍｇ Ｋ２ＨＰＯ４、２．０ｍｇ ＫＨ２ＰＯ４を含有、ｐＨ７）等が挙げられる。
【0050】
ポリエステル生産用培地に含まれるヒドロキシカルボン酸は、Ｒ体であってもよく、またはラセミ体であってもよい。好ましくはＲ体のヒドロキシカルボン酸が使用される。ヒドロキシカルボン酸は、これ以外の成分を含む培地のｐＨを調整（中和等）した後で加えてもよい。また、ヒドロキシカルボン酸は、塩の形態であってもよい。かかる塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。ポリエステル生産用培地中におけるヒドロキシカルボン酸の濃度は、所望のポリエステルの合成に適した濃度であればよく、当業者によって適宜決定すればよい。例えば、限定するものではないが、１～２０ｇ／Ｌ程度、例えば１～１０ｇ／Ｌ程度であってもよい。
【0051】
ヒドロキシカルボン酸を生合成することができる微生物を前記宿主微生物として使用する場合は、ヒドロキシカルボン酸の代わりに、それらの代謝前駆体（代謝の出発物質等）を用いることができる。かかる代謝前駆体としては、微生物における代謝経路によって所望のヒドロキシカルボン酸に最終的に変換され得る物質であればよく、特に限定されない。例えば、２－ヒドロキシ酪酸に変換するために、グルコース、スレオニン、２－ケト酪酸等を使用することができる。例えば、３－ヒドロキシ酪酸に変換するために、グルコース、ピルビン酸等を使用することができる。例えば、３－ヒドロキシ吉草酸に変換するために、２－ヒドロキシ酪酸、２－オキソ酪酸、スレオニン、プロピオン酸等を使用することができる。
【0052】
培養温度は、前記微生物が生育可能な範囲、かつ、各酵素活性が発揮される範囲であればよく、特に限定されない。例えば、２５～５０℃、好ましくは３０～４８℃、特に好ましくは３０℃～４５℃、例えば３０℃超～４３℃、３２℃～４２℃、または３５℃～４０℃、例えば３７℃または４０℃付近で培養してもよい。また、前記微生物の種類によって、好気的条件または嫌気的条件は適宜選択し得るが、重合体合成がより促進され易いという観点から、好気的条件が好ましい。培養時間は、所望の重合体の生産量等に応じて適宜調整することができる。例えば、１２時間～１週間、好ましくは１～３日培養してもよい。前記微生物を高温で培養すれば、ガラス転移温度が高いポリエステルの効率のよい生産が可能になると考えられる。
【0053】
前記微生物を培養して得られる培養物から、合成された重合体を回収する。本願明細書において、「培養物」には、微生物を培地で培養することによって得られる、増殖した当該微生物、該微生物の分泌産物および代謝産物等を含有する培地、それらの希釈物、濃縮物が包含される。培養物からの重合体の回収方法としては、特に限定されないが、例えば、当該分野で既知の方法を用いることができる。例えば、培養終了後、培地から遠心分離処理等で微生物を分離し、微生物を蒸留水及びメタノール等により洗浄し、乾燥（例えば、凍結乾燥）させ、得られた乾燥菌体を、クロロホルム等の有機溶剤を用いて加熱処理することによって、重合体を抽出してもよい。かくして、重合体を含有する有機溶剤溶液が得られ、該溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、ろ液にメタノールまたはヘキサン等の貧溶媒を加えて重合体を沈殿させてもよい。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させて重合体を回収することができる。
【0054】
５．ｉｎ ｖｉｔｒｏでのポリエステル製造方法
前記ヒドロキシカルボン酸のＣｏＡチオエステルを用いて、本発明のポリエステル合成酵素により前記ヒドロキシカルボン酸の重合体を製造することができる。したがって、少なくとも１種のヒドロキシアルカン酸ＣｏＡチオエステルを本発明のポリエステル合成酵素の存在下で反応させることを含む、ポリエステルの製造方法が提供される。
前記ヒドロキシカルボン酸のＣｏＡチオエステルを用いて、本発明のポリエステル合成酵素により前記ヒドロキシカルボン酸の重合体を製造することができる。したがって、少なくとも１種のヒドロキシアルカン酸ＣｏＡチオエステルを本発明のポリエステル合成酵素の存在下で反応させることを含む、ポリエステルの製造方法が提供される。
【0055】
前記ヒドロキシカルボン酸のＣｏＡチオエステルと本発明のポリエステル合成酵素の反応は、例えば、２５～５０℃、好ましくは３０～４８℃、特に好ましくは３０℃～４５℃、例えば３０℃超～４３℃、３２℃～４２℃、または３５℃～４０℃、例えば３７℃または４０℃付近の温度で行うことができる。反応時間は、所望の重合体の生産量等を考慮して、当業者が適宜決定すればよい。例えば、３０分～１時間であってもよい。使用するポリエステル合成酵素およびヒドロキシカルボン酸ＣｏＡチオエステルの量もまた、同様に、当業者が適宜決定することができる。
【実施例0056】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0057】
実施例１：ポリエステル合成酵素の設計
データベース上に存在する多数のＰＨＡ合成酵素ＰｈａＣのアミノ酸配列情報から、天然型ＰｈａＣＲｅに相同性を有する配列を探索し、フルコンセンサス設計法により、ＰｈａＣＲｅと配列相同性を有する多数の酵素のコンセンサス配列を計算し、かつ天然型ＰｈａＣＡｃ配列とも相同性を有するアミノ酸配列を設計した。設計は以下の手順で実施した。まず、ＰｈａＣＲｅ（天然型）を鋳型配列とし、Ｂｌａｓｔｐを用いてデータベースよりホモログ配列を４９５６個（相同性４０％以上）取得した。取得した配列の中で９０％以上の相同性があるもの、ＰｈａＣＲｅと比べて３％以上長い、あるいは短い配列を除去して、２０９３配列を配列ライブラリとした。配列ライブラリを独自のソフトウェアで解析し、分類に重要なアミノ酸残基として１９８位、２０９位、２４１位、および２５２位を同定した。このアミノ酸残基の組み合わせがＴＩＬＩ、ＳＬＬＩ、ＳＶＬＩ、ＴＬＬＩ、およびＴＶＬＩとなっている配列をライブラリから分類したところ、それぞれ４９配列（分類１）、２４配列（分類２）、２５配列（分類３）、５４配列（分類４）、および８０配列（分類５）を取得できた。分類後の配列をマルチプルシーケンスアラインメントソフトウェア「ＭＡＦＦＴ」を用いて解析した後、その出力結果を用いて完全コンセンサス設計を行なった。Ｎ末端の相同性が低く設計が不可能であった。独自のソフトウェアで解析し、分類１から５までの配列データの中から、最もコンセンサス残基に近い天然由来の配列をそれぞれ選抜し、Ｎ末端の代表配列とした。前記設計した完全コンセンサス配列に対し、分類群１から５の代表配列におけるＮ末端１００残基を移植して、それぞれ、ＦｃＰｈａＣ１、ＦｃＰｈａＣ２、ＦｃＰｈａＣ３、ＦｃＰｈａＣ４、ＦｃＰｈａＣ５ＷＰと命名した。さらに、ＦｃＰｈａＣ５のＮ末端にＰｈａＣＲｅのＮ末１００残基を移植した、ＦｃＰｈａＣ５Ｒｅを設計した。設計した各ポリエステル合成酵素のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１～６に示す。系統樹解析から分かるように、設計された６種の配列は、ＰｈａＣＡｃとＰｈａＣＲｅの両方に相同性を有する（図１）。
データベース上に存在する多数のＰＨＡ合成酵素ＰｈａＣのアミノ酸配列情報から、天然型ＰｈａＣＲｅに相同性を有する配列を探索し、フルコンセンサス設計法により、ＰｈａＣＲｅと配列相同性を有する多数の酵素のコンセンサス配列を計算し、かつ天然型ＰｈａＣＡｃ配列とも相同性を有するアミノ酸配列を設計した。設計は以下の手順で実施した。まず、ＰｈａＣＲｅ（天然型）を鋳型配列とし、Ｂｌａｓｔｐを用いてデータベースよりホモログ配列を４９５６個（相同性４０％以上）取得した。取得した配列の中で９０％以上の相同性があるもの、ＰｈａＣＲｅと比べて３％以上長い、あるいは短い配列を除去して、２０９３配列を配列ライブラリとした。配列ライブラリを独自のソフトウェアで解析し、分類に重要なアミノ酸残基として１９８位、２０９位、２４１位、および２５２位を同定した。このアミノ酸残基の組み合わせがＴＩＬＩ、ＳＬＬＩ、ＳＶＬＩ、ＴＬＬＩ、およびＴＶＬＩとなっている配列をライブラリから分類したところ、それぞれ４９配列（分類１）、２４配列（分類２）、２５配列（分類３）、５４配列（分類４）、および８０配列（分類５）を取得できた。分類後の配列をマルチプルシーケンスアラインメントソフトウェア「ＭＡＦＦＴ」を用いて解析した後、その出力結果を用いて完全コンセンサス設計を行なった。Ｎ末端の相同性が低く設計が不可能であった。独自のソフトウェアで解析し、分類１から５までの配列データの中から、最もコンセンサス残基に近い天然由来の配列をそれぞれ選抜し、Ｎ末端の代表配列とした。前記設計した完全コンセンサス配列に対し、分類群１から５の代表配列におけるＮ末端１００残基を移植して、それぞれ、ＦｃＰｈａＣ１、ＦｃＰｈａＣ２、ＦｃＰｈａＣ３、ＦｃＰｈａＣ４、ＦｃＰｈａＣ５ＷＰと命名した。さらに、ＦｃＰｈａＣ５のＮ末端にＰｈａＣＲｅのＮ末１００残基を移植した、ＦｃＰｈａＣ５Ｒｅを設計した。設計した各ポリエステル合成酵素のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１～６に示す。系統樹解析から分かるように、設計された６種の配列は、ＰｈａＣＡｃとＰｈａＣＲｅの両方に相同性を有する（図１）。
【0058】
【表1-1】
【0059】
【表1-2】
【0060】
実施例２：ポリエステル合成酵素を用いるポリマーＰ（３ＨＢ）の合成
実施例１で設計した６種のポリペプチド（以下、「ＦｃＰｈａＣシリーズ」ともいう）のポリマー合成能を調べた。簡単に言うと、実施例１で設計されたアミノ酸配列に基づいてＤＮＡを化学合成し（配列番号８～１３）、各設計タンパク質をコードする遺伝子を構築した。これを、モノマー供給系酵素であるＰＣＴ遺伝子（配列番号１４）およびＡｌｋＫ遺伝子（配列番号１５）と共に、プラスミドベクターを用いて塩化カルシウム法により大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。プラスミドベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋に由来するｐＢＳ ＰＲｅｐｈａＣＡＲｐｃｔ ａｌｋＫ（H. Tomita et al., Bioscience Biotechnology and Biochemistry, Vol.86, Issue 2, February 2022, pp. 217-223; DOI : 10.1093/bbb/zbab198）のｐｈａＣＡＲを各種ＦｃＰｈａＣで置き換えることによって調製した。ｐＢＳ ＰＲｅｐｈａＣＡＲｐｃｔ ａｌｋＫは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ由来ｐｈｂオペロンプロモータの下流に、ＰｈａＣＡＲ、ｐｃｔ、ＡｌｋＫ遺伝子が挿入されている。対照として、前記新規酵素遺伝子の代わりに、天然のＰＨＡ合成酵素ＯＹＶの遺伝子（NCBI Accession No. OYV33691.1の配列に基づき設計）または既知のキメラＰＨＡ合成酵素ＰｈａＣＡＲの遺伝子を上記プラスミドベクターに挿入して、またはｐＢＳ ＰＲｅｐｈａＣＡＲｐｃｔ ａｌｋＫを用いて、塩化カルシウム法により大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。得られた形質転換株を、ポリマー前駆体として２．５ｇ／Ｌの３－ヒドロキシ酪酸ナトリウムおよび２％グルコースを含むＬＢ培地１００ｍＬ中、３０℃で４８時間振盪培養してポリマー生産を行った。培養後の菌体を凍結乾燥し、蓄積されたポリマーをクロロホルム抽出した。ポリマーの重量を電子天秤によって測定した。
実施例１で設計した６種のポリペプチド（以下、「ＦｃＰｈａＣシリーズ」ともいう）のポリマー合成能を調べた。簡単に言うと、実施例１で設計されたアミノ酸配列に基づいてＤＮＡを化学合成し（配列番号８～１３）、各設計タンパク質をコードする遺伝子を構築した。これを、モノマー供給系酵素であるＰＣＴ遺伝子（配列番号１４）およびＡｌｋＫ遺伝子（配列番号１５）と共に、プラスミドベクターを用いて塩化カルシウム法により大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。プラスミドベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋に由来するｐＢＳ ＰＲｅｐｈａＣＡＲｐｃｔ ａｌｋＫ（H. Tomita et al., Bioscience Biotechnology and Biochemistry, Vol.86, Issue 2, February 2022, pp. 217-223; DOI : 10.1093/bbb/zbab198）のｐｈａＣＡＲを各種ＦｃＰｈａＣで置き換えることによって調製した。ｐＢＳ ＰＲｅｐｈａＣＡＲｐｃｔ ａｌｋＫは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ由来ｐｈｂオペロンプロモータの下流に、ＰｈａＣＡＲ、ｐｃｔ、ＡｌｋＫ遺伝子が挿入されている。対照として、前記新規酵素遺伝子の代わりに、天然のＰＨＡ合成酵素ＯＹＶの遺伝子（NCBI Accession No. OYV33691.1の配列に基づき設計）または既知のキメラＰＨＡ合成酵素ＰｈａＣＡＲの遺伝子を上記プラスミドベクターに挿入して、またはｐＢＳ ＰＲｅｐｈａＣＡＲｐｃｔ ａｌｋＫを用いて、塩化カルシウム法により大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。得られた形質転換株を、ポリマー前駆体として２．５ｇ／Ｌの３－ヒドロキシ酪酸ナトリウムおよび２％グルコースを含むＬＢ培地１００ｍＬ中、３０℃で４８時間振盪培養してポリマー生産を行った。培養後の菌体を凍結乾燥し、蓄積されたポリマーをクロロホルム抽出した。ポリマーの重量を電子天秤によって測定した。
【0061】
得られた重合体ポリ（３－ヒドロキシ酪酸）［以下、Ｐ（３ＨＢ）ともいう］の重量に基づいて、ポリマー生産性を求めた。ポリマー生産性は、菌体培養液１Ｌあたりのポリマー生産量（ｇ／Ｌ）として表す。結果を図２に示す。図２から明らかなように、試験した全てにおいてポリマーが合成されたことから、実施例１で設計した６種全てのポリペプチドが高い頻度で機能的であることが示された。
【0062】
【表2-1】
【0063】
【表2-2】
【0064】
【表2-3】
【0065】
【表2-4】
【0066】
【表2-5】
【0067】
【表2-6】
【0068】
実施例３：ポリエステル合成酵素を用いるポリマーＰ（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ）、Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）、Ｐ（２ＨＢ－ｃｏ－３ＨＢ）の合成
実施例１で設計した６種の酵素の基質特異性を評価するため、２位のみにヒドロキシ基を有するグリコール酸（ＧＬ）、乳酸（ＬＡ）、および２－ヒドロキシ酪酸（２ＨＢ）について、それぞれを培地に添加して３ＨＢとの共重合体を合成した。簡単に言うと、実施例２と同様にして、各種ポリエステル合成酵素を発現させた大腸菌ＪＭ１０９株を作製し、グリコール酸（ＧＬ）ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、乳酸（ＬＡ）ナトリウム１０ｇ／Ｌ、および２－ヒドロキシ酪酸（２ＨＢ）ナトリウム２．５ｇ／Ｌのいずれかと、２．５ｇ／Ｌの３ＨＢとを含むＬＢ培地１００ｍＬ中、３０℃で４８時間振盪培養した。実施例２と同様にして、合成されたポリマーを回収し、重量を測定した。さらに、１Ｈ ＮＭＲ分析に付して、各ポリマー中のＧＬ分率、ＬＡ分率、および２ＨＢ分率を求めた。
実施例１で設計した６種の酵素の基質特異性を評価するため、２位のみにヒドロキシ基を有するグリコール酸（ＧＬ）、乳酸（ＬＡ）、および２－ヒドロキシ酪酸（２ＨＢ）について、それぞれを培地に添加して３ＨＢとの共重合体を合成した。簡単に言うと、実施例２と同様にして、各種ポリエステル合成酵素を発現させた大腸菌ＪＭ１０９株を作製し、グリコール酸（ＧＬ）ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、乳酸（ＬＡ）ナトリウム１０ｇ／Ｌ、および２－ヒドロキシ酪酸（２ＨＢ）ナトリウム２．５ｇ／Ｌのいずれかと、２．５ｇ／Ｌの３ＨＢとを含むＬＢ培地１００ｍＬ中、３０℃で４８時間振盪培養した。実施例２と同様にして、合成されたポリマーを回収し、重量を測定した。さらに、１Ｈ ＮＭＲ分析に付して、各ポリマー中のＧＬ分率、ＬＡ分率、および２ＨＢ分率を求めた。
【0069】
【0070】
【表3】
【0071】
【表4】
ＬＡ分率＝０の条件では、得られたポリマーはＰ（３ＨＢ）である。
【0072】
【表5】
２ＨＢ分率＝０の条件では、得られたポリマーはＰ（３ＨＢ）である。
【0073】
いずれの条件でも、人工設計ポリエステル合成酵素はＰｈａＣＡＲと同様に共重合体を合成可能であった（図３～５）。とくにＦｃＰｈａＣ４は、ＰｈａＣＡＲよりもＧＬ分率が高く（表３）、２ＨＢ分率も高かった（表５）。さらに、得られたポリマーの１Ｈ ＮＭＲ解析から、ＦｃＰｈａＣシリーズにより合成されたＰ（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ）、Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）、およびＰ（２ＨＢ－ｃｏ－３ＨＢ）は、ＰｈａＣＡＲ同様に、ブロック構造を有していることが分かった（例えば、図６～８）。Ｐ（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ）は、３ＨＢのホモ重合セグメントと、３ＨＢとＧＬとのランダム共重合セグメントとから構成されるブロック共重合体［Ｐ（３ＨＢ）－ｂｌｏｃｋ－Ｐ（３ＨＢ－ｒａｎ－ＧＬ）］であった。Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）は、ＬＡのホモ重合セグメントと３ＨＢのホモ重合セグメントとから構成されるブロック共重合体であった。Ｐ（２ＨＢ－ｃｏ－３ＨＢ）は、２ＨＢのホモ重合セグメントと３ＨＢのホモ重合セグメントとから構成されるブロック共重合体であった。以上より、ＦｃＰｈａＣシリーズは、基質特異性および配列制御性については、ＰｈａＣＡＲと似た機能を有することが明らかとなった。
【0074】
実施例４：ポリエステル合成酵素を用いるポリマーＰ（６ＨＨｘ－ｃｏ－３ＨＢ）、Ｐ（３ＨＨｘ－ｃｏ－３ＨＢ）の合成
実施例３と同じ方法で、大腸菌ＪＭ１０９株形質転換体を用いてポリマー合成を行った。但し、培地中には、２．５ｇ／Ｌの６－ヒドロキシヘキサン酸（６ＨＨｘ）または１．０ｇ／Ｌの３－ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）のナトリウム塩と、２．５ｇ／Ｌの３ＨＢのナトリウム塩とを加えた。
実施例３と同じ方法で、大腸菌ＪＭ１０９株形質転換体を用いてポリマー合成を行った。但し、培地中には、２．５ｇ／Ｌの６－ヒドロキシヘキサン酸（６ＨＨｘ）または１．０ｇ／Ｌの３－ヒドロキシヘキサン酸（３ＨＨｘ）のナトリウム塩と、２．５ｇ／Ｌの３ＨＢのナトリウム塩とを加えた。
【0075】
【0076】
【表6】
【0077】
【表7】
【0078】
いずれの条件でも、人工設計ポリエステル合成酵素はＰｈａＣＡＲと同様に共重合体を合成可能であった（図９および１０）。特に、ＦｃＰｈａＣ１、ＦｃＰｈａＣ２、ＦｃＰｈａＣ４、ＦｃＰｈａＣ５Ｒｅ、ＦｃＰｈａＣ５ＷＰは、ＰｈａＣＡＲよりも６ＨＨｘ分率が高く（表６）、３ＨＨｘ分率も高かった（表７）。さらに、得られたポリマーの１Ｈ ＮＭＲ解析から、ＦｃＰｈａＣシリーズにより合成されたＰ（６ＨＨｘ－ｃｏ－３ＨＢ）、およびＰ（３ＨＨｘ－ｃｏ－３ＨＢ）は、ＰｈａＣＡＲ同様に、ランダム構造を有していることが分かった（例えば図１１および１２）。以上より、ＦｃＰｈａＣシリーズは、基質特異性および配列制御性については、ＰｈａＣＡＲと似た機能を有することが明らかとなった。
【0079】
実施例５：ポリエステル合成酵素のｉｎ ｖｉｔｒｏでの耐熱性試験
実施例１で設計されたＦｃＰｈａＣシリーズ酵素の熱安定性を調べた。実施例２で作製した各酵素を発現する組換え大腸菌から粗抽出液を得、所定の温度（３０℃、４０℃、５０℃、または６０℃）で３０分保持した後、３ＨＢ－ＣｏＡに対する活性を測定し、３０℃で処理した場合の活性を１として相対活性を求めた。活性の評価方法として、一定時間後の反応生成物である遊離ＣｏＡの濃度を、１ｍＭ エルマン試薬による発色と、４１２ｎｍによる吸光度測定により計測した。
実施例１で設計されたＦｃＰｈａＣシリーズ酵素の熱安定性を調べた。実施例２で作製した各酵素を発現する組換え大腸菌から粗抽出液を得、所定の温度（３０℃、４０℃、５０℃、または６０℃）で３０分保持した後、３ＨＢ－ＣｏＡに対する活性を測定し、３０℃で処理した場合の活性を１として相対活性を求めた。活性の評価方法として、一定時間後の反応生成物である遊離ＣｏＡの濃度を、１ｍＭ エルマン試薬による発色と、４１２ｎｍによる吸光度測定により計測した。
【0080】
結果を図１３に示す。ＰｈａＣＡＲが５０℃の熱処理で完全に失活したのに対し、ＦｃＰｈａＣ３を除く本発明のＰＨＡ合成酵素は５０℃以上の熱処理後でも活性を保持し、なかでもＦｃＰｈａＣ１、ＦｃＰｈａＣ４、ＦｃＰｈａＣ５Ｒｅ、およびＦｃＰｈａＣ５ＷＰは６０℃で処理後も活性を保持していた。したがって、本発明のＰＨＡ合成酵素では耐熱性が上昇していることが明確に示された。
【0081】
実施例６：ポリエステル合成酵素のｉｎ ｖｉｖｏでの耐熱性試験
実施例１で設計されたＦｃＰｈａＣシリーズ酵素の熱安定性を、ｉｎ ｖｉｖｏポリマー合成系において調べた。簡単に言うと、実施例３と同じ方法でＰ（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ）の生合成を行った。但し、培養温度条件は、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃、４５℃とした。さらに、培養後の菌体の乾燥重量を求め、乾燥重量（ＣＤＷ）あたりのポリマー合成量を求めた。
実施例１で設計されたＦｃＰｈａＣシリーズ酵素の熱安定性を、ｉｎ ｖｉｖｏポリマー合成系において調べた。簡単に言うと、実施例３と同じ方法でＰ（ＧＬ－ｃｏ－３ＨＢ）の生合成を行った。但し、培養温度条件は、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃、４５℃とした。さらに、培養後の菌体の乾燥重量を求め、乾燥重量（ＣＤＷ）あたりのポリマー合成量を求めた。
【0082】
【配列表フリーテキスト】
【0083】
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】