特開 2024-34277 質量分析イメージング法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024034277

(43)【公開日】2024-03-13

(54)【発明の名称】質量分析イメージング法

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20240306BHJP

   G01N 1/22 20060101ALI20240306BHJP

   G01N 1/44 20060101ALI20240306BHJP

   G01N 1/28 20060101ALI20240306BHJP

   H01J 49/16 20060101ALI20240306BHJP

   H01J 49/00 20060101ALI20240306BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 V

G01N1/22 T

G01N1/44

G01N1/28 J

H01J49/16 400

H01J49/00 040

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022138412

(22)【出願日】2022-08-31

(71)【出願人】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】三宅 ゆみ

(72)【発明者】

【氏名】豊田 岐聡

(72)【発明者】

【氏名】日下 祐江

(72)【発明者】

【氏名】村田 勲

【テーマコード（参考）】

2G041

2G052

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041DA04

2G041DA14

2G041DA16

2G041EA04

2G041FA02

2G041FA10

2G041GA06

2G052AA28

2G052AA40

2G052AB11

2G052AB16

2G052AB27

2G052AB28

2G052AD12

2G052AD32

2G052AD52

2G052EB01

2G052EB02

2G052EB11

2G052EC17

2G052EC18

2G052FD07

2G052GA24

2G052JA08

2G052JA11

(57)【要約】

【課題】生体試料から微量のホウ素剤を検出し、腫瘍部におけるミクロな分布と、腫瘍組織と正常組織とにおけるマクロな分布とを可視化できる、新規な質量分析イメージング法を提供する。
【解決手段】ホウ素剤を含む生体試料にマトリックスの溶液を塗布する工程と、前記マトリックスを塗布した試料の表面にレーザー光を照射することで、前記ホウ素剤に由来するイオンを生成する工程と、前記イオンを分離し、検出してマススペクトルを取得する工程と、前記マススペクトルから前記イオンの分布をイメージングする工程と、を包含している。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ホウ素剤を含む生体試料にマトリックスの溶液を塗布する工程と、
前記マトリックスを塗布した生体試料の表面にレーザー光を照射することで、前記ホウ素剤に由来するイオンを生成する工程と、
前記イオンを分離し、検出してマススペクトルを取得する工程と、
前記マススペクトルから前記イオンの分布をイメージングする工程と、を包含する、質量分析イメージング法。

【請求項2】

前記マススペクトルを取得する工程では、前記ホウ素剤に由来するイオンのピークと、前記生体試料又はマトリックスに由来するイオンであり、前記ホウ素剤に由来するイオン以外のイオンのピークとを分離する、請求項１に記載の質量分析イメージング法。

【請求項3】

前記マススペクトルを取得する工程では、前記ホウ素剤に由来するイオンのピークと、前記生体試料又はマトリックスに由来するイオンであり、前記ホウ素剤に由来するイオン以外のイオンのピークとをｍ/ｚ２００において質量分解能２００００以上で分離する、請求項２に記載の質量分析イメージング法。

【請求項4】

前記ホウ素剤が、４－ボロノ－Ｌ－フェニルアラニン、及びメルカプトウンデカヒドロドデカホウ酸（２）ナトリウムから選択される少なくとも１つのホウ素剤を含む、請求項１に記載の質量分析イメージング法。

【請求項5】

前記マトリックスとして、ジヒドロキシ安息香酸を含む、請求項１に記載の質量分析イメージング法。

【請求項6】

前記溶液に含まれる前記マトリックスの濃度が、１０～５０ｍｇ／ｍＬの範囲内である、請求項１に記載の質量分析イメージング法。

【請求項7】

前記マトリックスの溶液が、溶媒として、水、ニトリル類、アルコール類、エステル類、及びケトン類からなる群から選択される少なくとも１つの溶媒を含む、請求項６に記載の質量分析イメージング法。

【請求項8】

前記ホウ素剤に由来するイオンが、前記ホウ素剤と前記マトリックスとのクラスターイオンを含む、請求項１に記載の質量分析イメージング法。

【請求項9】

前記イメージングする工程では、正常細胞と腫瘍組織とを含む領域をイメージングする、請求項１に記載の質量分析イメージング法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、質量分析イメージング法に関する。

【背景技術】

【0002】

ホウ素中性子捕捉治療法（Boron Neutron Capture Therapy; BNCT）は、中性子と核反応を起こしやすいホウ素をあらかじめ腫瘍細胞のみに蓄積させておくことで、正常細胞をほとんど損傷することなく腫瘍細胞のみを選択的に破壊する放射線治療法である。

【0003】

ホウ素分布を可視化するために、様々なイメージング技術の開発が進められており、例えば、非特許文献１には、二次イオン質量分析法(ＳＩＭＳ法)によるホウ素イメージング法が報告されている。

【0004】

また、例えば、非特許文献２には、レーザー照射－高周波誘導結合プラズマ質量分析法(ＬＡ－ＩＣＰ－ＭＳ法)によるホウ素イメージング法が報告されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Aldossari, S.; Mcmahon, G.; Lockyer, N. P.; Moore, K.L.J.T.A. Microdistribution and quantification of the boron neutron capture therapy drug BPA in primary cell cultures of human glioblastoma tumour by NanoSIMS. Analyst 2019, 144, 6214-6224

【非特許文献2】Reifschneider, O.; Schutz, C.; Brochhausen, C.; Hampel, G.; Ross, T.; Sperling, M.; Karst, U. J. A. B. Quantitative bioimaging of p-boronophenylalanine in thin liver tissue sections as a tool for treatment planning in boron neutron capture therapy. Anal Bioanal Chem. 2015, 407, 2365- 2371.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ホウ素中性子捕捉治療法において、生体内でのホウ素の取り込み率（正常細胞内に対する腫瘍細胞内ホウ素存在比率；Ｔ／Ｎ比）はＢＮＣＴの治療効果および患者の被曝量に大きく影響する。このため、腫瘍組織とその周辺の正常組織を含む「マクロな領域（ｃｍオーダー）」における「ミクロ（数１０μｍオーダー）のホウ素分布」の評価はホウ素中性子捕捉治療法のキーポイントとなる。例えば、腫瘍内及びその周縁におけるミクロレベルのホウ素剤の分布をイメージングできれば、生体組織へのホウ素剤の取り込みメカニズムの解明にとって非常に重要な情報となり得る。

【0007】

しかしながら、ＬＡ－ＩＣＰ－ＭＳ法は元素を測定対象とするため有機物の分布情報は得られない。ＳＩＭＳ法も元素や分子量１００以下を主な測定対象とするため有機物の分布情報は限定的であり、空間分解能がサブμｍオーダーであることから測定領域もμｍサイズにすぎない。従って、これらの手法では、ホウ素取り込みメカニズムの解明に重要な役割を果たす生体化合物と、ホウ素剤両方を同時にイメージングすることは不可能である。このため、生体組織におけるＴ／Ｎ比の評価やホウ素取り込みメカニズムの解明といったＢＮＣＴのニーズを共に満たすイメージング技術が確立できていないという問題がある。

【0008】

本発明の一態様に係る発明は、上記の問題を鑑みなされたものであり、その目的は、高い質量分解能を達成する試料作製と質量分析法とによって生体試料から微量のホウ素剤を検出し、腫瘍部のミクロな分布と、腫瘍組織と正常組織とにおけるマクロな分布を可視化できる、新規な質量分析イメージング法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る質量分析イメージング法は、ホウ素剤を含む生体試料にマトリックスの溶液を塗布する工程と、前記マトリックスを塗布した生体試料の表面にレーザー光を照射することで、ホウ素剤に由来するイオンを生成する工程と、前記イオンのマススペクトルを取得する工程と、前記マススペクトルから前記イオンの分布をイメージングする工程と、を包含している。

【発明の効果】

【0010】

本発明の一態様によれば、ホウ素剤だけでなく生体化合物の脳内における動態も評価できると考えられる。ホウ素剤と生体化合物との相互作用を解明し、さらに腫瘍蓄積効率の高い新たなホウ素剤や新たなホウ素剤投与法の開発に有効な評価方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、脳腫瘍モデルラット及びその脳の試料の作製、マトリックスの塗布、及びＭＡＬＤＩ質量分析イメージング（ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ）の一連の操作の概略を説明するためのスキームである。

【図2】図２は、ＭＳイメージを描画するための対象のピーク（主に腫瘍部に分布）を選択するために指定した関心領域（ROI, region of interest）Ｒ１の概略を説明する図である。

【図3】図３は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法により得られた関心領域Ｒ１におけるマススペクトル及び［ＢＰＡ＋Ｈ］^＋に相当するｍ/ｚ ２１０付近のピーク群またはＤＨＢ由来イオンｍ/ｚ ２７３から得られるＭＳイメージである。マススペクトルの縦軸は１ピクセルあたりのイオン強度で示す。

【図4】図４は、ＢＰＡ標準品スポット（ＤＨＢ溶液滴下）のマススペクトルである。

【図5】図５は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法により得られた関心領域Ｒ１のマススペクトルのｍ/ｚ ３５０付近及びｍ/ｚ３６６付近の拡大図、［ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ_２Ｏ＋Ｎａ］^＋、［ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ_２Ｏ＋Ｋ］^＋及びＤＨＢ由来イオンに相当するピークのＭＳイメージ（ピーク質量選択幅０．０２ユニット）である。

【図6】図６は、脳脊髄液投与法によりモデルラットに投与したＢＰＡの分布を示す［ＢＰＡ＋Ｈ］^＋のＭＳイメージ（ピーク質量選択幅０．０２ユニット）及び［ＢＰＡ＋Ｈ］^＋ピーク付近のマススペクトル（腫瘍部を関心領域に指定）である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

＜質量分析イメージング法＞
本開示の一態様に係る質量分析イメージング（ＭＳＩ）法は、ホウ素剤を含む試料を走査しながら測定領域を分画する１ピクセルごとにソフトイオン化法によりイオン化し、ホウ素剤に由来するイオンを分離、検出してマススペクトルを測定する。測定領域から得られたマススペクトルにおいて、ホウ素剤に由来するピークを選択し、そのピーク強度の分布を質量分析イメージ（ＭＳイメージ）として描画する。

【0013】

ＭＳイメージを描画する対象たる生体試料（以下では単に試料とも言う）は、限定されるべきではないが、例えば、腫瘍が移植されたモデルラットの脳であり得る。

【0014】

本開示の一態様に係る質量分析イメージング（ＭＳＩ）法によれば、高い質量分解能で質量分析を行うことで、重なり合う大量かつ多種類の生体化合物に由来するピーク群からホウ素剤に由来するピークを分離、検出することができ、ホウ素剤の分布を表すＭＳイメージを描画できる。また、数１０μｍオーダーの空間分解能にて、ｃｍサイズの測定領域におけるＭＳイメージを描画できる。このため、単一の組織のみならず、例えば腫瘍組織及び正常組織（正常細胞）等の複数の組織を含む、試料に適用できる。このため、例えば、ＢＮＣＴの治療効果および患者の被曝量に大きく影響する生体内でのホウ素の取り込み率（正常細胞内に対する腫瘍細胞内ホウ素存在比率；Ｔ／Ｎ比）の経時的変化や腫瘍内のホウ素剤の局在化についても数１０μｍオーダーの空間分解能にて評価することができる。これにより脳内におけるホウ素剤の動態を解明するために有効な質量分析イメージング法を提供できる。

【0015】

質量分析イメージングにおいて観察の対象であるホウ素剤は、ＢＮＣＴ剤でありえ、例えば、４－ボロノ－Ｌ－フェニルアラニン（ＢＰＡ）、及びメルカプトウンデカヒドロドデカホウ酸（２）ナトリウム（ＢＳＨ）等が上げられるがこれに限定されない。例えば、ホウ素剤は、腫瘍への取り込み効率を上げるためにＢＳＨ等に修飾基を導入したものであってもよい。

【0016】

ホウ素剤の動態を観察するための対象である腫瘍には、例えば、メラノーマ等が挙げられる。腫瘍を移植する対象は、例えば、ラット等の小型実験動物であればよい。試料の腫瘍部に局在化するホウ素剤の量は、ＢＮＣＴに求められる２０～４０ｐｐｍであることが好ましい。このような観点から、例えば、モデルラットであれば、ホウ素剤の投与量は３５０～７００ｍｇ／ｋｇｂ.ｗ.であればよい。

【0017】

なお、本開示の一態様に係るＭＳＩ法は、ＢＮＣＴが適用できる生体組織であれば、観察対象である試料は脳組織に限定されない。本開示の一態様に係るＭＳＩ法は、例えば、肝臓腫瘍等へのＢＮＣＴにも好適に利用できる。

【0018】

本開示の一態様に係る質量分析イメージング（ＭＳＩ）法は、典型的には、マトリックス支援脱離イオン化―質量分析法を採用し得る。

【0019】

（マトリックス支援脱離イオン化－質量分析イメージング法）
マトリックス支援脱離イオン化質－量分析イメージング法（ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法）では、マトリックスを塗布した生体試料に対して規定した所定の測定領域をピクセル単位に分画し、１ピクセル（単位面積）ごとにレーザー光を照射しつつ、測定領域全体にレーザー光が照射されるように試料台ホルダーを走査させるとよい。これにより、測定領域を分画する１ピクセルごとにマススペクトルを取得する。得られたマススペクトルにおけるホウ素剤のピーク強度を１ピクセルごとに描画することで、ホウ素剤の分布を示すＭＳイメージを得ることができる。

【0020】

１ピクセルあたりの大きさにより、測定領域における空間分解能が決定され得る。例えば腫瘍内のホウ素剤分布、腫瘍と正常組織のホウ素剤の分布等の取得したい情報に応じて、１ピクセルあたりの大きさを選択すればよい。例えば、レーザー径及び試料台ホルダーの走査位置分解能に応じて、一辺１０～２００μｍ程度の範囲で１ピクセルあたりの大きさを選択すればよい。

【0021】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法に供する試料の切片のサイズは、試料を載置する試料台の大きさ（例えば、５００ｍｍ×８００ｍｍ（縦幅×横幅）以下）を考慮して設計すればよい。当該サイズによりラット等の小型実験動物の複数の組織を捕らえることができることも本開示の一態様に係る質量分析イメージング法の利点の一つである。試料の切片の厚さは、限定されるものではないが、２０μｍ以下であることが好ましい。

【0022】

試料の切片は、プレートに載置された状態にてマトリックスが塗布され、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供される。当該プレートには、例えば、導電性ガラスプレート、又はステンレスプレートが挙げられる。当該プレートのサイズは、試料の切片を載置でき、試料台に載置できればよく、限定されるべきではないが、例えば１０ｍｍ×１０ｍｍ（縦幅×横幅）程度であり得る。

【0023】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法に用いるマトリックスは、レーザー光によって励起され、測定対象化合物のイオン化を支援する役割を果たす化合物である。マトリックスには、正イオン生成用酸性マトリックス、負イオン生成用アルカリ性マトリックス、銀（Ａｇ）等の金属マトリックスを挙げることができる。なかでも、正イオン生成用酸性マトリックスであることが好ましく、正イオン生成用酸性マトリックスには、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ，沸点：４０６℃，蒸気圧０．０±１．０ｍｍＨｇ ａｔ２５℃）、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（α－ＣＨＣＡ）、５－メトキシサリチル酸、４－クロロ-桂皮酸、ジスラノール、ｔｒａｎｓ－２－［３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）－２－メチル－２－プロペニリデン］マロノニトリル、コーヒー酸（ＣＡ）、シナピン酸（ＳＡ）、ニコチン酸（ＮＡ）、ｔｒａｎｓ－フェルラ酸（ＦＡ）、２－（４－ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）、５－クロロ－２－ヒドロキシ安息香酸、３－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸（ＡＨＢＡ）３－インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）等が挙げられ、負イオン生成用アルカリ性マトリックスには、例えば、９－アミノアクリジン、１，５－ジアミノナフタレン、ノルハルマン、３，４－ジアミノフェノン（ＤＡＢＰ）、５－クロロ－２－メルカプトベンゾチアゾール（ＣＭＢＴ）等が挙げられる。なかでも、マトリックスは、正イオン生成用酸性マトリックスである、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（α－ＣＨＣＡ）であることがより好ましい。

【0024】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法に用いるマトリックスは腫瘍組織、及び正常組織（正常細胞）を含む、広い測定範囲においてマススペクトルを測定するという観点から、揮発性が低いマトリックスを選択することが好ましい。このような観点から、マトリックスは、蒸気圧０．０±０．８ｍｍＨｇ（２５℃）以上のものであることが好ましい。または、マトリックスは、揮発性が低いマトリックスを選択することが好ましいという観点から、沸点を参照して選択してもよい。この場合、マトリックスの沸点は、例えば３４０℃以上であればよい。

【0025】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法に供されるマトリックスは、観察対象たる試料の表面に結晶を形成するように塗布すればよい。一態様に係るＭＳＩ法では、マトリックス、及び溶媒を含むマトリックス溶液を調製し、当該マトリックス溶液を生体試料の表面に塗布すればよい（マトリックスの溶液を塗布する工程）。このとき、当該マトリックス溶液に含まれる溶媒を揮発させつつ、マトリックスを試料の表面に塗布するとよい。これにより、試料の表面に微細なマトリックスの結晶を堆積させることができる。

【0026】

マトリックス溶液は、溶媒を含み、さらに酸を含んでいてもよい。溶液に含まれるマトリックスの濃度は、限定されるべきではないが、溶媒に対し、１０～５０ｍｇ／ｍＬの範囲内であることがより好ましい。溶液に含まれるマトリックスの濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以上であることにより、ホウ素剤のイオン化を好適に支援できる。また、マトリックスの濃度が５０ｍｇ／以下であることにより、ホウ素剤に由来するイオンのマススペクトルのピークとマトリックス自身に由来するイオンのマススペクトルのピークとの重なりを低減し、ホウ素剤を検出しやすくすることができるという効果を奏する。

【0027】

溶媒はマトリックスを十分に溶解することができるものを選択すればよく、塗布時に揮発するものであることが好ましい。これにより、マトリックス溶液を塗布するときに、マトリックスが結晶化しつつ試料の表面に塗布される。溶媒は、揮発の観点から沸点が１００℃以下の溶媒を用いることが好ましい。当該溶媒には、例えば、水と有機溶媒とが挙げられ、有機溶媒には、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、メタノール、エタノール、ｉ－プロパノール等のアルコール類、酢酸エチル等のエステル類、及びアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類が挙げられる。例えば、マトリックスがＤＨＢである場合、溶媒には、ニトリル類、アルコール類をより好ましく用いることができ、ニトリル類であるアセトニトリルがさらに好ましく、アセトニトリルと水との混合溶媒であることが最も好ましい。

【0028】

マトリックス溶液に含まれる水は、例えば純水であればよい。

【0029】

マトリックス溶液は、２種以上の溶媒を含む混合溶媒にマトリックスを溶解し、これにより、塗布後の結晶の大きさを調整してもよい。より具体的には、例えば、マトリックス溶液に含まれる溶媒として、水と有機溶媒との混合溶媒（有機溶媒の水溶液）を用いる場合、有機溶媒と水との合計を１００体積％として、有機溶媒が２０～９０体積％の範囲内であることが好ましい。これにより、マトリックス溶液が試料上にて滲むことを抑え、マトリックスの結晶が肥大化することを抑えることができる。これによりＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法において高い空間分解能が得られるという効果を奏する。これにより、マトリックス溶液が試料上に長く留まって試料自身を溶かすことを防ぎ、マトリックスの結晶が肥大化することを抑えることができる。

【0030】

マトリックス溶液は、酸を含んでいることが好ましい。マトリックス溶液が含む酸は、揮発性があり、強酸であることが好ましい。このような観点から、酸には、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ギ酸等が挙げられ、不純物が少ないグレードを入手できることから、トリフルオロ酢酸を好ましく用いることができる。マトリックス溶液には、０．１～０．２体積％の酸が含まれていることが好ましい。マトリックス溶液に酸を添加することで、ホウ素剤に由来するイオンの中で代表的なイオンとなるプロトン付加分子の生成を促すという効果を奏する。

【0031】

マトリックス溶液は、例えば、エアブラシ等によって試料の表面に塗布すればよい。マトリックスが塗布された試料は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩに供される。ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩでは、まず、マトリックス溶液を塗布した生体試料にレーザー光を照射し、ホウ素剤に由来するイオンを生成するとよい（イオンを生成する工程）。

【0032】

空間分解能である１ピクセルの大きさは、走査型試料の位置分解能（例えば１０μｍ）、レーザー径（例えば、約２０μｍ）およびホウ素の局在化を観察すべき生体組織サイズのレベルにより決めればよい。例えば１ピクセルにおける１辺の大きさは２０～２００μｍであればよい。

【0033】

１ピクセルあたりのマススペクトルの積算数は、関心領域（ＲＯＩ）のマススペクトルにおいて、ホウ素剤に由来するイオンがピークとして検出できるイオン強度において、隣接するピークと分離できるようにすべく、Ｓ/Ｎ（signal to noise ratio）が１０以上になるように設定すればよい。

【0034】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩでは、質量分析計における測定対象であるイオンの質量分解能を高めるためにレーザー強度及びレーザー繰り返し速度を低く設定することが有効である。レーザー強度及びレーザー繰り返し速度は、上述したイオン強度を確保できる範囲において低く設定することで、レーザー照射時に生成するイオンの空間的広がりを抑えて高い質量分解能を得ることができ、また生体化合物やマトリックス由来のピークが過度に高くなり、目的とするホウ素剤に由来するピークと重複することを回避できる。

【0035】

続いて、質量分離部により、ホウ素剤に由来するイオンと、生体試料に由来するイオンであり、ホウ素剤に由来するイオン以外のイオンとを分離し、それぞれのイオンを検出してマススペクトルを取得するとよい（マススペクトルを取得する工程）。マススペクトルを取得する質量分析計において、測定対象であるイオンの質量分解能は、好ましくは１００００以上、より好ましくは１５０００以上あればよく、さらに好ましくは２００００以上であるとよい。また、質量分析計におけるイオンの質量分解能は、限定されるべきではないが、２０００００以下であってよく、５００００以下であってもよい。イオンの質量分解能が１００００以上であれば、生体化合物又はマトリックス由来のピークとホウ素剤のピークを分離し、試料中のホウ素剤ピークのｍ/ｚを特定できる。また、質量分解能は２００００以上（半値幅法、例えばｍ/ｚ２００において）であれば、後述するようにホウ素剤の関連イオンが検出されるｍ/ｚの範囲においてピーク質量選択幅０．０２ユニット以下でピークを抽出してＭＳイメージを描画することができ、これにより腫瘍組織の周縁におけるホウ素剤の分布、さらには、腫瘍組織の周縁のみならず、腫瘍組織内部におけるホウ素剤の分布を示すＭＳイメージを得ることができる。

【0036】

質量分析計において、測定対象であるイオンの質量分解能は、好ましくは１００００以上、より好ましくは１５０００以上、さらに好ましくは２００００以上を達成するように質量分析計の各パラメータを設定することで調整すればよい。このような観点から、質量分析計は、１５０００以上の質量分解能を有するものであれば限定されず、適宜選択すればよい。

【0037】

質量分解能を１５０００以上、好ましくは２００００以上にすることができる質量分析計には、例えば、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計、オービトラップ型質量分析計、飛行時間型質量分析計等を挙げることができ、飛行時間型質量分析計には、例えば、スパイラル軌道飛行時間型質量分析計を挙げることができる。本開示の一態様に係る質量分析イメージング（ＭＳＩ）法は、生体試料中の微量成分の質量分析イメージングにおいて、生体化合物との分離のために用いられる誘導体化法によらずとも、普及率の高い高分解能飛行時間型質量分析計を用いることができ、このため実施が容易で技術を水平展開しやすいということも利点の１つである。

【0038】

質量分解能は、上述のレーザー照射条件と共に質量分離部の種類に応じてパラメータを設定すればよく、例えば、スパイラル軌道飛行時間型等の飛行時間型質量分析計を用いる場合、遅延引き出し時間を調整することで質量分解能を調整すればよい。

【0039】

また、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩは、測定前においてはホウ素剤に由来するピークが検出されるｍ/ｚ範囲を外部標準法により質量較正し、測定後においては、後述するようにマトリックスに由来し、ｍ/ｚが既知であるマススペクトルのピークを用いた内部標準法により、関心領域のマススペクトルごとに較正することが好ましい。これによりホウ素剤に由来するピークに近接して検出される生体化合物に由来するピーク、及びマトリックスに由来するピークを含むピーク群の中からホウ素剤に由来するピークを、そのピークの計算精密質量（理論値のｍ/ｚ）に対して±５０ｐｐｍのずれ以下で特定できる。

【0040】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩの測定範囲は、上述したホウ素剤に由来する代表的イオンであるプロトン付加分子のみならず、ホウ素剤に由来する他のイオンも測定することができるように設定することが好ましい。例えば、ホウ素剤のプロトン付加分子のプロトンに代わり、（ｉ）ナトリウム又はカリウムが付加した分子のイオン、およびそれら分子から水が脱離した分子のイオン、並びに（ｉｉ）ホウ素剤にマトリックスが付加した分子のクラスターイオン、及びそれら分子から水が脱離した分子のクラスターイオンが挙げられる。これらイオンは、ｍ/ｚ値、及びホウ素の同位体パターンを示すことによりイオン種を推定することができる。例えば、ホウ素剤がＢＰＡであり、マトリックスがＤＨＢである場合、ｍ/ｚ３４０～３７０辺りにおける［ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ_２Ｏ＋Ｎａ］^＋等の二量体化物等も測定対象として含む範囲にて、ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩを行えばよい。このような、ホウ素剤のプロトン付加分子以外のホウ素剤に由来するイオン種のＭＳイメージはホウ素剤のプロトン付加分子のＭＳイメージで観測されたホウ素剤の分布や腫瘍へのホウ素剤の蓄積または排出の時間変化を検証するのに役立つ場合がある。

【0041】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩデータからのＭＳイメージの描画は以下の手順にて行うとよい（イメージングする工程）。

【0042】

（１）まず、主に腫瘍に分布しているホウ素剤に由来するピークを特定するため、測定領域全体から腫瘍を含むと考えられる領域を関心領域（ＲＯＩ）として指定し、当該関心領域のマススペクトルを抽出すればよい。（２）続いて、マトリックスに由来するｍ/ｚが既知のイオンを内部標準として採用し、ホウ素剤に由来するピーク、その付近に近接して検出される生体化合物に由来するピーク、及びマトリックスに由来するピークを含むピーク群に対してそれぞれのｍ/ｚを小数点以下3桁（精密質量）まで読み取りが可能な高分解能でそれぞれのピークを分離し、ホウ素剤に由来するピークを特定すればよい。（３）当該ホウ素剤に由来するピークのピーク強度を、測定領域を分画する１ピクセルごとに色調に変換して表示させることでＭＳイメージを描画することができる。

【0043】

ここで、ホウ素剤のピークと隣接する生体由来化合物またはマトリックス由来ピークを分離して、ホウ素剤のピークの位置を特定し、そのピークから抽出した画像を得ることが重要であり、それによりホウ素剤の分布や局在がより明確な画像を取得できる。より具体的には、ホウ素剤の関連イオンが検出されるｍ/ｚの範囲においてホウ素剤のピークと生体化合物またはマトリックス由来ピークを分離するための質量分解能（ピークのｍ/ｚ÷ピーク半値幅）は１５０００以上であることが好ましく、より好ましくは２００００以上である。

【0044】

以上の手順により、これにより生体組織内のホウ素剤の分布の評価が実用上可能となる。ホウ素剤に由来するピークが複数検出される場合は同様にホウ素剤のＭＳイメージを複数取得できる。さらに腫瘍部におけるミクロなホウ素剤の分布と、腫瘍組織と正常組織とにおけるマクロなホウ素剤の分布を可視化できる。また、ホウ素剤の脳内における動態も評価できると考えられる。よって、ホウ素剤と生体化合物との相互作用を解明し、さらに腫瘍蓄積効率の高い新たなホウ素剤や新たなホウ素剤投与法の開発に有効な評価方法を提供することができると期待される。

【0045】

〔まとめ〕
本発明の態様１に係る質量分析イメージング法は、ホウ素剤を含む生体試料にマトリックスの溶液を塗布する工程と、前記マトリックスを塗布した試料の表面にレーザー光を照射することで、前記ホウ素剤に由来するイオンを生成する工程と、前記イオンを分離し、検出してマススペクトルを取得する工程と、前記マススペクトルからイオンの分布をイメージングする工程と、を包含している。

【0046】

本発明の態様２に係る質量分析イメージング法は、上記態様１において、前記マススペクトルを取得する工程では、前記ホウ素剤に由来するイオンのピークと、前記生体試料又はマトリックスに由来するイオンであり、前記ホウ素剤に由来するイオン以外のピークとを分離するとよい。

【0047】

本発明の態様３に係る質量分析イメージング法は、上記態様１又は２において、前記マススペクトルを取得する工程では、ホウ素剤に由来するイオンのピークと、前記生体試料又はマトリックスに由来するイオンであり、前記ホウ素剤に由来するイオン以外のピークとをｍ/ｚ２００において質量分解能２００００以上で分離することが好ましい。

【0048】

本発明の態様４に係る質量分析イメージング法は、上記態様１～３の何れかにおいて、前記ホウ素剤が、４－ボロノ－Ｌ－フェニルアラニン、及びメルカプトウンデカヒドロドデカホウ酸（２）ナトリウムから選択される少なくとも１つのホウ素剤を含むことが好ましい。

【0049】

本発明の態様５に係る質量分析イメージング法は、上記態様１～４の何れかにおいて、前記マトリックスとして、ジヒドロキシ安息香酸を含んでいるとよい。

【0050】

本発明の態様６に係る質量分析イメージング法は、上記態様１～５の何れかにおいて、前記溶液が有機溶媒を含み、当該有機溶媒に含まれる前記マトリックスの濃度が、１０～５０ｍｇ／ｍＬの範囲内であるとよい。

【0051】

本発明の態様７に係る質量分析イメージング法は、上記態様１～６の何れかにおいて、前記マトリックスの溶液が、溶媒として、水、ニトリル類、アルコール類、エステル類、及びケトン類からなる群から選択される少なくとも１つの溶媒を含むことが好ましい。

【0052】

本発明の態様８に係る質量分析イメージング法は、上記態様１～７の何れかにおいて、前記ホウ素剤に由来するイオンが、前記ホウ素剤と前記マトリックスとのクラスターイオンを含み得る。

【0053】

本発明の態様９に係る質量分析イメージング法は、上記態様１～８の何れかにおいて、イメージングする工程では、正常細胞と腫瘍組織とを含む領域をイメージングするとよい。

【0054】

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

【実施例0055】

本発明の一実施例について以下に説明する。

【0056】

図１に示すスキームに沿って、脳腫瘍モデルラット及びその脳の試料の作製、マトリックスの塗布、及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化－質量分析イメージングを行なった。

【0057】

〔１〕試料作製
各試料を作製するために使用した試薬は以下の通りである。
４－ボロノ－Ｌ－フェニルアラニン（ＢＰＡ）
トリフルオロ酢酸，トリフルオロ酢酸ナトリウム
アセトニトリル（ＬＣ－ＭＳ測定用グレード）
標準ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００及びＰＥＧ６００）
以上のＢＰＡから標準ポリエチレングリコールまでは、富士フィルム和光純薬株式会社から購入した。２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）は、東京化成工業株式会社から購入した。

【0058】

〔１－１〕ＢＮＣＴ剤を投与した脳腫瘍モデルラットの脳の作製方法
図１の上段に示すように、悪性黒色腫瘍細胞（Ｂ１６Ｆ１０）を脳に移植した脳腫瘍モデルラットにＢＮＣＴ剤を投与した。脳腫瘍モデルラットに投与したＢＮＣＴ剤はＢＰＡ（４－ボロノ－Ｌ－フェニルアラニン）であり、投与条件は３５０ｍｇ／ｋｇ体重の量にて、２時間かけて血管投与した。その後、ＢＰＡを投与した脳腫瘍モデルラットから脳を摘出し、当該脳を液体窒素で冷却したイソペンタンが入った容器に移し、－８０℃で凍結した。脳腫瘍モデルラットの脳に蓄積したホウ素濃度は約２０μｇ／ｇであった。

【0059】

〔１－２〕試料切片の作製
質量分析イメージング用の試料として、凍結した脳腫瘍モデルラットの脳から１６μｍ厚さ程度の薄片切片を－１５℃のクライオミクロトームを用いて切り出した。切り出した試料切片を、厚さが５０μｍ、縦幅×横幅が２０ｍｍ×２０ｍｍ程度のステンレスプレートに載置した。

【0060】

〔１－３〕イメージング測定試料の作製
〔質量較正用試料の作製〕
トリフルオロ酢酸ナトリウムの濃度が２ｍｇ／ｍＬになるようにアセトニトリルに溶解して得た後、０．５μＬの当該溶液をステンレスプレートの試料切片が載置されていない箇所にスポットした。続いて、ＰＥＧ２００及びＰＥＧ６００のそれぞれの濃度が５ｍｇ／ｍＬになるようにアセトニトリルに溶解して得た後、１μＬの当該溶液を先のトリフルオロ酢酸ナトリウムを含むスポットの上にスポットした。

【0061】

〔ＢＰＡ標準試料〕
質量分解能の調整や装置感度の確認のための標準試料として、濃度が、それぞれ１００ｐｍｏｌ／μＬ、及び２０ｐｍｏｌ／μＬである２つのＢＰＡ標準液（水溶液）を準備した。ステンレスプレートの試料が載置されていない箇所に、１μＬずつ別個に各ＢＰＡ標準液をスポットした。

【0062】

〔マトリックス溶液〕
まず、アセトニトリルを８５体積％含むアセトニトリル水溶液に、トリフルオロ酢酸を０．１体積％になるように添加した。ついで、アセトニトリル水溶液に、４０ｍｇ／ｍＬになるようにＤＨＢを溶解し、ＤＨＢの溶液を得た。

【0063】

〔マトリックスの塗布〕
図１の下段左側に示すように、エアブラシ（ノズル内径:０．２ｍｍ）に１ｍＬのＤＨＢの溶液を採取し、ステンレスプレート上の試料及び各スポット上にスプレーし、１０分間室温にて乾燥させた。

【0064】

〔２〕マトリックス支援レーザー脱離イオン化－質量分析イメージング（ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ）
ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩには、装置としてＭＡＬＤＩ－spiralＴＯＦ／ＴＯＦ（日本電子株式会社製）を用いた。測定モードは正イオンモードとし、測定範囲は測定対象化合物が検出できる範囲、より具体的には、ＢＰＡのプロトン付加分子（ｍ/ｚ ２１０）を含む、ｍ/ｚ ２０５～５５０の範囲に設定した。なお、本機のレーザー径は約２０μｍ、発振波長は３４９ｎｍである。

【0065】

質量分析イメージング測定前に、まず、ステンレスプレート上のＢＰＡ標準試料にレーザー光を照射し、ＢＰＡのプロトン付加分子のピーク（ｍ/ｚ ２１０）の質量分解能が約２００００となるように遅延引き出し時間等の装置パラメータを調整した。また、レーザー繰り返し速度は２５０Ｈｚに設定し、レーザー光の出力（Laser power）は４２％、検出器電圧は５８％に設定した。

【0066】

ついで、ステンレスプレート上にスポットしたＰＥＧ２００及びＰＥＧ６００を用いて外部標準法による質量較正を行った。

【0067】

質量較正後、１ピクセルあたりの質量分析イメージングの設定を行った。１ピクセルのサイズを６０μｍ程度に設定し、１ピクセルあたりにおけるマススペクトル積算数は４～５とした。上述の遅延引き出し時間等の設定と合わせて、最終的にホウ素剤に由来するイオンの１ピクセルあたりの強度（Ｓ/Ｎ）が１０以上となるように設定した。

【0068】

図１の下段右側に示すように、ステンレスプレート上の試料に対するレーザー光の走査範囲として、イメージングの対象として選択した組織を含む四方を測定領域として指定し、レーザーを照射しながら試料を走査することで質量分析イメージング測定データの取り込みを実施した。

【0069】

〔４〕データ解析およびイメージング
質量分析イメージングにより取得したマススペクトルにおけるホウ素剤に由来するピークの選択およびＭＳイメージの描画は、質量分析イメージング解析用ソフトウェア（日本電子株式会社製msMicroImager Extract software）を用いて行った。まず、ホウ素剤に由来するピークの代表的なイオンである［ＢＰＡ＋Ｈ］^＋に相当するｍ/ｚ ２１０付近を広い質量選択幅０．１ユニットにて選択し、ＭＳイメージを表示した。当該ＭＳイメージから試料切片に映る腫瘍組織と考えられる形状を含む領域を大まかに把握し、当該領域を関心領域（ＲＯＩ）Ｒ１に指定した。図２に関心領域Ｒ１の位置を示す。関心領域Ｒ１のみから抽出したマススペクトル（縦軸は１ピクセルあたりのイオン強度である）を得た。

【0070】

次に、関心領域Ｒ１のマススペクトルを、ＤＨＢに由来するイオン（［ＤＨＢ－Ｈ＋２Ｋ］^＋；ｍ/ｚ ２３０．９４６）を内部標準として採用し、質量較正を行った。

【0071】

続いて、質量較正を行った関心領域Ｒ１のマススペクトルから質量較正されたｍ/ｚ値に基づいて、近接して検出される複数のピークの中からＢＰＡに由来するピークを特定した。そのピーク位置を指定し、ＭＳイメージを描画した。なお、ピークを特定する際のｍ/ｚ値の実測値理論値とのずれ（mass error）の許容値は、生体試料の質量分析イメージングにおける一般的な許容値である５０ｐｐｍ以下（ｍ/ｚ ２００の場合は２００±０．０１）とした。mass errorに伴い、ピークの質量選択幅は０．０２ユニットとした。

【0072】

続いて、質量分析イメージング解析用ソフトウェア（日本電子株式会社製msMicroImager view software）を用い、ＭＳイメージのカラー画像化及び色調調整等を行った。図３に、関心領域Ｒ１のマススペクトル及び［ＢＰＡ＋Ｈ］^＋に相当するｍ/ｚ２１０付近のピーク群を一点鎖線内において拡大して表示し、併せて、ＤＨＢ由来イオンｍ/ｚ ２７３のＭＳイメージ（ピーク質量選択幅０．０２ユニット）を表示している。ＢＰＡのプロトン付加分子ｍ/ｚ ２１０．０８５（［ＢＰＡ＋Ｈ］^＋）のＭＳイメージは隣接する他のピークのＭＳイメージと異なり腫瘍の形状を示すだけでなく、腫瘍内部のＢＰＡの存在を示し、ＢＰＡが蓄積された状態を示唆する画像であることが確認された。実測値ｍ/ｚ ２１０．０８５のmass errorは３８ｐｐｍと許容範囲内であった。なお、同一切片上にＢＰＡ標準液をスポットし、スポット及びその周辺を測定した場合にｍ/ｚ ２１０．０８５のピーク強度が有意に増加することを確認している。

【0073】

図４にイメージング測定とは別に測定したＢＰＡ標準品スポット（ＤＨＢ溶液を滴下）のマススペクトルを示す。ＢＰＡの場合、ＤＨＢの脱水複合体が検出されており、ｍ/ｚ ３２８にプロトン付加分子（［ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ_２Ｏ＋Ｈ］^＋）、ｍ/ｚ ３５０にナトリウム付加分子（[ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ_２Ｏ＋Ｎａ]^＋）、ｍ/ｚ ３６６にカリウム付加分子（[ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ_２Ｏ＋Ｋ]^＋）が検出された。ＢＰＡとＤＨＢとの脱水複合体もＭＳイメージを描画できるＢＰＡ由来イオンと考えられた。

【0074】

〔５〕ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩによって得られたＭＳイメージの評価
図３上部左に［２ＤＨＢ－２Ｈ_２Ｏ＋Ｈ]^＋に相当するｍ/ｚ ２７３のＭＳイメージを示す。切片外側の強度が強く、切片上のＤＨＢの分布はほぼ一様で、ＢＰＡのＭＳイメージに影響しないことが確認された。従って、[ＢＰＡ＋Ｈ]^＋のＭＳイメージは試料組織におけるＢＰＡの分布を可視化する有効な手段であることが確認された。

【0075】

図５に示すように［ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ_２Ｏ＋Ｎａ］^＋及び［ＢＰＡ＋ＤＨＢ－２Ｈ_２Ｏ＋Ｋ］^＋のＭＳイメージはプロトン付加分子と同様に腫瘍の形状と腫瘍内部のＢＰＡの分布を示した。図５右側に示した[２ＤＨＢ－Ｈ_２Ｏ＋Ｎａ]^＋は僅かに腫瘍の形状を示し、[２ＤＨＢ－Ｈ_２Ｏ＋Ｋ]^＋は明らかな腫瘍の形状と腫瘍内部での局在を示した。ナトリウム付加分子によるＭＳイメージはナトリウムの分布に大きく影響されることなくＢＰＡの分布を示していると考えられ、プロトン付加分子によるＭＳイメージで示される分布の検証に使用できると期待される。しかし、カリウム付加分子によるＭＳイメージはカリウムの分布に依存する可能性があるため、分布の評価ではなく、ＢＰＡの蓄積や排出（ＢＰＡの有無）の評価に有効な手段であると確認された。

【0076】

以上に説明する通り、本ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法が腫瘍モデルラットに投与したＢＰＡの脳組織内分布または蓄積の状態を可視化する方法として有効であることを確認した。

【0077】

図６に血管投与法と異なる脳脊髄液投与法にて腫瘍モデルラットに投与したＢＰＡの分布を示す［ＢＰＡ＋Ｈ］^＋のＭＳイメージ（ピーク質量選択幅０．０２ユニット）及び[ＢＰＡ＋Ｈ]^＋ピーク付近のマススペクトル（腫瘍部を関心領域に指定）を示す。図６に示すようにホウ素剤の投与方法によらず本ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ法によってＢＰＡの分布が可視化できることを確認した。

【0078】

以上では、マトリックスとして２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を用いたＭＡＬＤＩ－ＭＳによるイメージングを実施例にて説明した。マトリックスとしては、ＤＨＢと同様に、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を用いることができると期待される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】