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特開2024-34975プローブ複合体、特定微生物の検出剤、特定微生物の検出方法、前記プローブ複合体の使用、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブの使用、及び特定微生物の分離方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024034975
(43)【公開日】2024-03-13
(54)【発明の名称】プローブ複合体、特定微生物の検出剤、特定微生物の検出方法、前記プローブ複合体の使用、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブの使用、及び特定微生物の分離方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20240306BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20240306BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240306BHJP
C12N 1/02 20060101ALI20240306BHJP
C07K 4/00 20060101ALI20240306BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20240306BHJP
C12Q 1/6841 20180101ALN20240306BHJP
C12Q 1/6818 20180101ALN20240306BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z ZNA
C12Q1/04
C12N15/11 Z
C12N1/02
C07K4/00
C12Q1/6888 Z
C12Q1/6841 Z
C12Q1/6818 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022139584
(22)【出願日】2022-09-01
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、創発的研究支援事業「難培養微生物の完全利用に向けた生細胞特異的識別・培養基盤技術の開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504132881
【氏名又は名称】国立大学法人東京農工大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】モリ テツシ
(72)【発明者】
【氏名】村岡 貴博
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR56
4B063QR75
4B063QS03
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX02
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065BA25
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA15
4H045BA17
4H045BA54
4H045EA50
4H045EA65
4H045FA33
(57)【要約】
【課題】生きている微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を検出する新しいプローブ複合体を提供すること。
【解決手段】（ｉ）ペプチド核酸及び標識物質を含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び前記標識物質に対するクエンチャーを含む第二のプローブとを含み、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、又は、（ｉｉ）ペプチド核酸及びクエンチャーを含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び標識物質を含む第二のプローブとを含み、前記クエンチャーは前記標識物質に対するクエンチャーであり、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、プローブ複合体。
【選択図】なし
【解決手段】（ｉ）ペプチド核酸及び標識物質を含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び前記標識物質に対するクエンチャーを含む第二のプローブとを含み、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、又は、（ｉｉ）ペプチド核酸及びクエンチャーを含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び標識物質を含む第二のプローブとを含み、前記クエンチャーは前記標識物質に対するクエンチャーであり、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、プローブ複合体。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）ペプチド核酸及び標識物質を含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び前記標識物質に対するクエンチャーを含む第二のプローブとを含み、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、又は、
（ｉｉ）ペプチド核酸及びクエンチャーを含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び標識物質を含む第二のプローブとを含み、前記クエンチャーは前記標識物質に対するクエンチャーであり、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、プローブ複合体。
（ｉｉ）ペプチド核酸及びクエンチャーを含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び標識物質を含む第二のプローブとを含み、前記クエンチャーは前記標識物質に対するクエンチャーであり、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、プローブ複合体。
【請求項2】
前記第一のプローブは、膜透過性ペプチドと、ペプチド核酸と、標識物質とを含み、
前記第二のプローブは、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸と、クエンチャーとを含む、請求項１に記載のプローブ複合体。
前記第二のプローブは、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸と、クエンチャーとを含む、請求項１に記載のプローブ複合体。
【請求項3】
前記膜透過性ペプチドは、
４個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含む第一の膜透過性ペプチド、及び、式（ＩＩ）のアミノ酸残基を含む第二の膜透過性ペプチドの少なくとも一方を含む、請求項１に記載のプローブ複合体。
〔前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、ｎは独立して１～４の整数であり、アミノ酸残基は（Ｒ）体又は（Ｓ）体のいずれであってもよい。式（ＩＩ）中、ｍは１～５の整数、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に疎水性置換基を表す。式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、＊で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。〕
４個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含む第一の膜透過性ペプチド、及び、式（ＩＩ）のアミノ酸残基を含む第二の膜透過性ペプチドの少なくとも一方を含む、請求項１に記載のプローブ複合体。
【化1】
〔前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、ｎは独立して１～４の整数であり、アミノ酸残基は（Ｒ）体又は（Ｓ）体のいずれであってもよい。式（ＩＩ）中、ｍは１～５の整数、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に疎水性置換基を表す。式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、＊で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。〕
【請求項4】
前記第一の膜透過性ペプチドは、
４個～２６個の連続したジアミノプロピオン酸残基である、
４個～２６個の連続したジアミノブタン酸残基である、又は、
４個～２６個の連続したジアミノペンタン酸残基である、
請求項３に記載のプローブ複合体。
４個～２６個の連続したジアミノプロピオン酸残基である、
４個～２６個の連続したジアミノブタン酸残基である、又は、
４個～２６個の連続したジアミノペンタン酸残基である、
請求項３に記載のプローブ複合体。
【請求項5】
前記第二の膜透過性ペプチドは、（Ｘａ－Ｘｂ－Ｘｃ）ｍで表される繰り返し単位を含む、請求項３に記載のプローブ複合体。
〔Ｘａは、ジアミノプロピオン酸残基、ジアミノブタン酸残基、ジアミノペンタン酸残基、又はリジン残基を表す。Ｘｂ及びＸｃはそれぞれ独立して、グリシン残基、トリプトファン残基、メチオニン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、又はイソロイシン残基を表す。ｍは１～５の整数を表す。〕
〔Ｘａは、ジアミノプロピオン酸残基、ジアミノブタン酸残基、ジアミノペンタン酸残基、又はリジン残基を表す。Ｘｂ及びＸｃはそれぞれ独立して、グリシン残基、トリプトファン残基、メチオニン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、又はイソロイシン残基を表す。ｍは１～５の整数を表す。〕
【請求項6】
前記ペプチド核酸は、微生物内に存在する核酸の塩基配列とハイブリダイズする塩基配列を有し、前記ペプチド核酸の長さは５ｍｅｒ～３０ｍｅｒである、請求項１に記載のプローブ複合体。
【請求項7】
前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸の長さは５ｍｅｒ～２０ｍｅｒであり、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸の塩基配列中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ａは、前記ペプチド核酸の塩基配列中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ｂと８０％以上の配列相補性を有する、請求項１に記載のプローブ複合体。
【請求項8】
請求項１～請求項７のいずれか１項に記載のプローブ複合体を含む、特定微生物の検出剤。
【請求項9】
前記特定微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８に記載の検出剤。
【請求項10】
前記特定微生物が、エンテロバクター属の細菌、シトロバクター属の細菌、パントエア属の細菌、アシネトバクター属の細菌、及びエスケリキア属の細菌、並びにハプト藻綱の微生物からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８に記載の検出剤。
【請求項11】
請求項１～請求項７のいずれか１項に記載のプローブ複合体を、微生物内に導入することと、微生物内に導入された前記標識物質が発するシグナルを検出することとを含む、前記ペプチド核酸とハイブリダイズする核酸塩基配列を有する特定微生物の検出方法。
【請求項12】
前記特定微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項13】
特定微生物を検出するための、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載のプローブ複合体、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブの使用。
【請求項14】
前記特定微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１３に記載のプローブ複合体、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブの使用。
【請求項15】
請求項１～請求項７のいずれか１項に記載のプローブ複合体を用いて２種以上の微生物を含む微生物群から特定微生物を検出することと、
前記特定微生物を前記微生物群から分離することと、
を含む、特定微生物の分離方法。
前記特定微生物を前記微生物群から分離することと、
を含む、特定微生物の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、プローブ複合体、特定微生物の検出剤、特定微生物の検出方法、前記プローブ複合体の使用、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブの使用、及び特定微生物の分離方法に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、新規な微生物を発見するには、微生物を種レベルで選別できる単離培養法が優先的に利用されてきた。しかし単離培養法は、各微生物の特徴に合わせた煩雑な培養条件の調整及び最適化が必要である。つまり、最適化された微生物の培養条件が見つからない限り、環境中に存在する有用な難培養微生物を入手することはできない。
【0003】
微生物を種特異的に染色及び標識できる手法として、Fluorescence in situ Hybridization法（FISH法）が知られている。FISH法は、目的の微生物種の16S rRNAにハイブリダイズできる特異的ＤＮＡプローブ又は特異的ＲＮＡプローブを、測定用ウェル等に固定化された微生物叢と混合して、微生物内に導入する。前記特異的プローブには蛍光物質が修飾されているため、微生物叢における目的の微生物種の有無を、蛍光の有無によって確認することができる。FISH法は微生物を単離培養する工程を含まないことから、最適な培養条件が分からない微生物を発見することができる。
【0004】
上記FISH法を原理として改良された手法として、例えば、Live-FISH法、PNA-FISH法、及びQuickFISH法が挙げられる。
Live-FISH法は、特異的ＤＮＡに蛍光物質を標識したプローブを用いる。Live-FISH法は、微生物を測定ウェル等に固定化する工程が無い代わりに、ケミカルトランスフォメーション、つまり塩化カルシウム中で微生物にヒートショックを与えることで、16S rRNAにハイブリダイズできる特異的ＤＮＡプローブを、微生物内に導入する。例えば、非特許文献１では、Bacillus属細菌、Ruegeria属細菌、又はPseudovibrio属細菌などに対して、16S rRNAにハイブリダイズする特異的ＤＮＡプローブをLive-FISH法により導入している。
Live-FISH法は、特異的ＤＮＡに蛍光物質を標識したプローブを用いる。Live-FISH法は、微生物を測定ウェル等に固定化する工程が無い代わりに、ケミカルトランスフォメーション、つまり塩化カルシウム中で微生物にヒートショックを与えることで、16S rRNAにハイブリダイズできる特異的ＤＮＡプローブを、微生物内に導入する。例えば、非特許文献１では、Bacillus属細菌、Ruegeria属細菌、又はPseudovibrio属細菌などに対して、16S rRNAにハイブリダイズする特異的ＤＮＡプローブをLive-FISH法により導入している。
【0005】
PNA-FISH法は、特異的なペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid；ＰＮＡ）に蛍光物質を標識させたプローブを用いることで、FISH法と同様、固定化された微生物の染色法として応用されている。PNA-FISH法は、主に血中病原菌の同定方法として知られている。
【0006】
QuickFISH法は、上記PNA-FISH法を改良したものである。QuickFISH法は、特異的ＰＮＡに蛍光物質を標識したプローブと、前記特異的ＰＮＡと相補的な配列を有する核酸及び前記蛍光物質を消光できるクエンチャーを有するプローブとが形成する複合体を用いる方法である。複合体形成時、つまり、前記特異的ＰＮＡが前記核酸とハイブリダイズしている時は、クエンチャーと蛍光物質が近接するので蛍光は発しない。前記複合体を５５℃で熱処理することで、前記特異的ＰＮＡとクエンチャーを有するプローブを解離させる。そして、前記複合体を室温（２０℃～２５℃）に戻すが、この際に、前記特異的ＰＮＡが目的の固定化された微生物種内に存在する核酸とハイブリダイズし、クエンチャーと蛍光物質が離隔することにより蛍光を発する。
【0007】
また、非特許文献２では、Ｎ末端側から、リジン残基－フェニルアラニン残基－フェニルアラニン残基、の繰り返し単位を連続して３個含み、さらに、前記連続した繰り返し単位のＣ末端側に１個のリジン残基が付加されたペプチド(ＫＦＦ)３Ｋを用いている。そして、ｌａｃＺのアンチセンスとなるように設計したＰＮＡに、前記ペプチドを付加させたプローブを大腸菌内に導入することで、ｌａｃＺの遺伝子発現を抑制できたことを確認している。
【0008】
非特許文献３では、膜透過性ペプチド、標的核酸とハイブリダイズするＤＮＡ、標識物質及びクエンチャーを組み込んだ一分子プローブを用いた標的核酸の検出方法が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Batani, G., Bayer, K., Boge, J., Hentschel, U., and Thomas, T. (2019). Fluorescence in situ hybridization (FISH) and cell sorting of living bacteria. Sci Rep 9, 18618.
【非特許文献2】Good, L., Awasthi, S.K., Dryselius, R., Larsson, O., and Nielsen, P.E. (2001). Bactericidal antisense effects of peptide-PNA conjugates. Nature Biotechnology 19, 360-364.
【非特許文献3】Rachel L. H., Maggie C. Y. L. V., Esta van H., Errol C., Jan-G V., Anjali T., Thomas L. K., Christina J. D., Gary S. L., Tullis C. O., (2020). Microbial Ecology 84, 182-197.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
上記した先行技術文献によると、FISH法、PNA-FISH法及びQuickFISH法では、測定前に測定用ウェル等に微生物を固定化する工程を含む。Live-FISH法では、ケミカルトランスフォメーションにより６０％以上が死菌となり、生菌かつ特異的ＤＮＡプローブを導入できた細菌の割合は１％未満であり、微生物に対するダメージが非常に大きい。また、ケミカルトランスフォメーションは一部の微生物種のみにしか利用できないため、微生物種に対する汎用性は低い。
【0011】
上述の通り、上記非特許文献１及び非特許文献２に記載の発明では、生きている微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を特異的に検出することができていない。
【0012】
また、非特許文献３に記載の発明では、１分子中に多数の分子設計が必要であり、且つ、標的核酸とハイブリダイズする力が低い等の観点から、新たなプローブの開発が期待される。
【0013】
本開示は、上記に鑑みなされたものであり、生きている微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を検出する新しいプローブ複合体とその使用、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブの使用、特定微生物の検出剤、特定微生物の検出方法、及び特定微生物の分離方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞ （ｉ）ペプチド核酸及び標識物質を含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び前記標識物質に対するクエンチャーを含む第二のプローブとを含み、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、又は、（ｉｉ）ペプチド核酸及びクエンチャーを含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び標識物質を含む第二のプローブとを含み、前記クエンチャーは前記標識物質に対するクエンチャーであり、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、プローブ複合体。
＜２＞ 前記第一のプローブは、膜透過性ペプチドと、ペプチド核酸と、標識物質とを含み、前記第二のプローブは、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸と、クエンチャーとを含む、上記＜１＞に記載のプローブ複合体。
＜３＞ 前記膜透過性ペプチドは、４個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含む第一の膜透過性ペプチド、及び、式（ＩＩ）のアミノ酸残基を含む第二の膜透過性ペプチドの少なくとも一方を含む、上記＜１＞又は＜２＞に記載のプローブ複合体。
〔前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、ｎは独立して１～４の整数であり、アミノ酸残基は（Ｒ）体又は（Ｓ）体のいずれであってもよい。式（ＩＩ）中、ｍは１～５の整数、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に疎水性置換基を表す。式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、＊で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。〕
＜４＞ 前記第一の膜透過性ペプチドは、４個～２６個の連続したジアミノプロピオン酸残基である、４個～２６個の連続したジアミノブタン酸残基である、又は、４個～２６個の連続したジアミノペンタン酸残基である、上記＜３＞に記載のプローブ複合体。
＜５＞ 前記第二の膜透過性ペプチドは、（Ｘａ－Ｘｂ－Ｘｃ）ｍで表される繰り返し単位を含む、上記＜３＞に記載のプローブ複合体。
〔Ｘａは、ジアミノプロピオン酸残基、ジアミノブタン酸残基、ジアミノペンタン酸残基、又はリジン残基を表す。Ｘｂ及びＸｃはそれぞれ独立して、グリシン残基、トリプトファン残基、メチオニン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、又はイソロイシン残基を表す。ｍは１～５の整数を表す。〕
＜６＞ 前記ペプチド核酸は、微生物内に存在する核酸の塩基配列とハイブリダイズする塩基配列を有し、前記ペプチド核酸の長さは５ｍｅｒ～３０ｍｅｒである、上記＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載のプローブ複合体。
＜７＞ 前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸の長さは５ｍｅｒ～２０ｍｅｒであり、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸の塩基配列中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ａは、前記ペプチド核酸の塩基配列中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ｂと８０％以上の配列相補性を有する、上記＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載のプローブ複合体。
＜８＞ 上記＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載のプローブ複合体を含む、特定微生物の検出剤。
＜９＞ 前記特定微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物からなる群より選択される少なくとも１種である、上記＜８＞に記載の検出剤。
＜１０＞ 前記特定微生物が、エンテロバクター属の細菌、シトロバクター属の細菌、パントエア属の細菌、アシネトバクター属の細菌、及びエスケリキア属の細菌、並びにハプト藻綱の微生物からなる群より選択される少なくとも１種である、上記＜８＞に記載の検出剤。
＜１１＞ 上記＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載のプローブ複合体を、微生物内に導入することと、微生物内に導入された前記標識物質が発するシグナルを検出することとを含む、前記ペプチド核酸とハイブリダイズする核酸塩基配列を有する特定微生物の検出方法。
＜１２＞ 前記特定微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物からなる群より選択される少なくとも１種である、上記＜１１＞に記載の検出方法。
＜１３＞ 特定微生物を検出するための、上記＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載のプローブ複合体、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブの使用。
＜１４＞ 前記特定微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物からなる群より選択される少なくとも１種である、上記＜１３＞に記載のプローブ複合体、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブの使用。
＜１５＞ 上記＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載のプローブ複合体を用いて２種以上の微生物を含む微生物群から特定微生物を検出することと、前記特定微生物を前記微生物群から分離することと、を含む、特定微生物の分離方法。
＜１＞ （ｉ）ペプチド核酸及び標識物質を含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び前記標識物質に対するクエンチャーを含む第二のプローブとを含み、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、又は、（ｉｉ）ペプチド核酸及びクエンチャーを含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び標識物質を含む第二のプローブとを含み、前記クエンチャーは前記標識物質に対するクエンチャーであり、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、プローブ複合体。
＜２＞ 前記第一のプローブは、膜透過性ペプチドと、ペプチド核酸と、標識物質とを含み、前記第二のプローブは、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸と、クエンチャーとを含む、上記＜１＞に記載のプローブ複合体。
＜３＞ 前記膜透過性ペプチドは、４個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含む第一の膜透過性ペプチド、及び、式（ＩＩ）のアミノ酸残基を含む第二の膜透過性ペプチドの少なくとも一方を含む、上記＜１＞又は＜２＞に記載のプローブ複合体。
【化1】
〔前記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、ｎは独立して１～４の整数であり、アミノ酸残基は（Ｒ）体又は（Ｓ）体のいずれであってもよい。式（ＩＩ）中、ｍは１～５の整数、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に疎水性置換基を表す。式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、＊で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。〕
＜４＞ 前記第一の膜透過性ペプチドは、４個～２６個の連続したジアミノプロピオン酸残基である、４個～２６個の連続したジアミノブタン酸残基である、又は、４個～２６個の連続したジアミノペンタン酸残基である、上記＜３＞に記載のプローブ複合体。
＜５＞ 前記第二の膜透過性ペプチドは、（Ｘａ－Ｘｂ－Ｘｃ）ｍで表される繰り返し単位を含む、上記＜３＞に記載のプローブ複合体。
〔Ｘａは、ジアミノプロピオン酸残基、ジアミノブタン酸残基、ジアミノペンタン酸残基、又はリジン残基を表す。Ｘｂ及びＸｃはそれぞれ独立して、グリシン残基、トリプトファン残基、メチオニン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、又はイソロイシン残基を表す。ｍは１～５の整数を表す。〕
＜６＞ 前記ペプチド核酸は、微生物内に存在する核酸の塩基配列とハイブリダイズする塩基配列を有し、前記ペプチド核酸の長さは５ｍｅｒ～３０ｍｅｒである、上記＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載のプローブ複合体。
＜７＞ 前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸の長さは５ｍｅｒ～２０ｍｅｒであり、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸の塩基配列中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ａは、前記ペプチド核酸の塩基配列中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ｂと８０％以上の配列相補性を有する、上記＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載のプローブ複合体。
＜８＞ 上記＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載のプローブ複合体を含む、特定微生物の検出剤。
＜９＞ 前記特定微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物からなる群より選択される少なくとも１種である、上記＜８＞に記載の検出剤。
＜１０＞ 前記特定微生物が、エンテロバクター属の細菌、シトロバクター属の細菌、パントエア属の細菌、アシネトバクター属の細菌、及びエスケリキア属の細菌、並びにハプト藻綱の微生物からなる群より選択される少なくとも１種である、上記＜８＞に記載の検出剤。
＜１１＞ 上記＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載のプローブ複合体を、微生物内に導入することと、微生物内に導入された前記標識物質が発するシグナルを検出することとを含む、前記ペプチド核酸とハイブリダイズする核酸塩基配列を有する特定微生物の検出方法。
＜１２＞ 前記特定微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物からなる群より選択される少なくとも１種である、上記＜１１＞に記載の検出方法。
＜１３＞ 特定微生物を検出するための、上記＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載のプローブ複合体、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブの使用。
＜１４＞ 前記特定微生物が、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物からなる群より選択される少なくとも１種である、上記＜１３＞に記載のプローブ複合体、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブの使用。
＜１５＞ 上記＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載のプローブ複合体を用いて２種以上の微生物を含む微生物群から特定微生物を検出することと、前記特定微生物を前記微生物群から分離することと、を含む、特定微生物の分離方法。
【発明の効果】
【0015】
本開示によれば、生きている微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を検出する新しいプローブ複合体とその使用、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブの使用、特定微生物の検出剤、特定微生物の検出方法、及び特定微生物の分離方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】本開示のSPLASH法の原理図である。
【図2】プローブ複合体（ｉ）の第一のプローブの一態様である(KFF)3K-eg1-PNA-K-FAMの模式図である。
【図3】プローブ複合体（ｉ）の第一のプローブの一態様である(DabFF)3Dab-システイン残基-PNA-K-FAMの模式図である。
【図4】プローブ複合体（ｉ）の第二のプローブの一態様の模式図である。
【図5】プローブ複合体１の模式図である。
【図6】プローブ複合体２の模式図である。
【図7】種々の長さのＤＮＡオリゴマーを含むプローブ複合体１の熱安定性の測定結果を示すグラフである。
【図8】ＤＮＡオリゴマーのミスマッチ塩基数がプローブ複合体１の熱安定性に与える影響の測定結果を示すグラフである。
【図9】プローブ複合体２の熱安定性の測定結果を示すグラフである。
【図10】プローブ複合体１と種々の由来のＲＮＡとを混合した際の蛍光強度を測定した結果を示すグラフである。
【図11】プローブ複合体１を用いた微生物の特異的検出を示す顕微鏡写真である。
【図12】プローブ複合体２を用いた微生物の特異的検出を示す顕微鏡写真である。
【図13】プローブ複合体２導入時の微生物の生死割合を示す顕微鏡写真である。なお生死判別はトリパンブルーを用い、矢印は死菌を示す。
【図14-1】ＣＰＰのみ又はＣＰＰ無しのプローブを用いたEscherichia coliへの導入を確認した顕微鏡写真である。
【図14-2】ＣＰＰのみ又はＣＰＰ無しのプローブを用いたAcinetobacter radioresistensへの導入を確認した顕微鏡写真である。
【図14-3】ＣＰＰのみ又はＣＰＰ無しのプローブを用いたPantoea agglomeransへの導入を確認した顕微鏡写真である。
【図15】微細藻類への蛍光標識されたＣＰＰの導入を確認した顕微鏡写真である。
【図16】実施例１０における複数の微生物を含む混合物下での顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、本開示を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本開示は以下の形態に限定されるものではない。以下の開示において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本開示を制限するものではない。
本開示において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本文中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において組成物中の各成分の含有率は、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計の含有率を意味する。
本開示において「デオキシリボ核酸」をＤＮＡとも称す。
本開示において「リボ核酸」をＲＮＡとも称す。
本開示において「ペプチド核酸」をＰＮＡとも称す。
本開示において「生きている微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を検出すること」を、便宜上、「生きている微生物を検出する」ともいう。
本開示において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本文中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において組成物中の各成分の含有率は、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計の含有率を意味する。
本開示において「デオキシリボ核酸」をＤＮＡとも称す。
本開示において「リボ核酸」をＲＮＡとも称す。
本開示において「ペプチド核酸」をＰＮＡとも称す。
本開示において「生きている微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を検出すること」を、便宜上、「生きている微生物を検出する」ともいう。
【0018】
本開示において、ペプチドは、特に記載のない限り、記載されたペプチドの左側がアミノ酸残基のＮ末端側を示し、記載されたペプチドの右側がアミノ酸残基のＣ末端側を示す。
本開示において、例えば「Dab9-K-FAM」と「(Dab)9K-FAM」は同一の分子である。また、「Dab9-K-FAM」を「Dab9(FAM)」と略称する場合がある。
本開示において、「Orn9-K-FAM」と「(Orn)9K-FAM」は同一の分子である。また、「Orn9-K-FAM」を「Orn9(FAM)」と略称する場合がある。
本開示において、「Dap9-K-FAM」と「(Dap)9K-FAM」は同一の分子である。また、「Dap9-K-FAM」を「Dap9(FAM)」と略称する場合がある。
本開示においてアミノ酸又はアミノ酸残基の表示は、当業者で通常用いられているとおりに、和名、１文字の略号、又は３文字の略号で表すことがある。そのほか、本開示において、２，３－ジアミノプロピオン酸は、Ｄａｐ又はＤｐｒと略することがある。本開示において、２，４－ジアミノブタン酸は、Ｄａｂ又はＤｂｕと略することがある。本開示において、２，５－ジアミノペンタン酸は、Ｏｒｎと略することがある。本開示において、リジンは、Ｋと略することがある。本開示において、フェニルアラニンは、Ｆと略することがある。
本開示において、例えば「Dab9-K-FAM」と「(Dab)9K-FAM」は同一の分子である。また、「Dab9-K-FAM」を「Dab9(FAM)」と略称する場合がある。
本開示において、「Orn9-K-FAM」と「(Orn)9K-FAM」は同一の分子である。また、「Orn9-K-FAM」を「Orn9(FAM)」と略称する場合がある。
本開示において、「Dap9-K-FAM」と「(Dap)9K-FAM」は同一の分子である。また、「Dap9-K-FAM」を「Dap9(FAM)」と略称する場合がある。
本開示においてアミノ酸又はアミノ酸残基の表示は、当業者で通常用いられているとおりに、和名、１文字の略号、又は３文字の略号で表すことがある。そのほか、本開示において、２，３－ジアミノプロピオン酸は、Ｄａｐ又はＤｐｒと略することがある。本開示において、２，４－ジアミノブタン酸は、Ｄａｂ又はＤｂｕと略することがある。本開示において、２，５－ジアミノペンタン酸は、Ｏｒｎと略することがある。本開示において、リジンは、Ｋと略することがある。本開示において、フェニルアラニンは、Ｆと略することがある。
【0019】
≪プローブ複合体≫
本開示のプローブ複合体は、（ｉ）ペプチド核酸及び標識物質を含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び前記標識物質に対するクエンチャーを含む第二のプローブとを含み、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、又は、本開示のプローブ複合体は、（ｉｉ）ペプチド核酸及びクエンチャーを含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び標識物質を含む第二のプローブとを含み、前記クエンチャーは前記標識物質に対するクエンチャーであり、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む。
本開示のプローブ複合体は、（ｉ）ペプチド核酸及び標識物質を含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び前記標識物質に対するクエンチャーを含む第二のプローブとを含み、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、又は、本開示のプローブ複合体は、（ｉｉ）ペプチド核酸及びクエンチャーを含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び標識物質を含む第二のプローブとを含み、前記クエンチャーは前記標識物質に対するクエンチャーであり、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む。
【0020】
本開示に係るプローブ複合体は、上記構成を有することにより、生きている微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を検出することができる。
【0021】
ペプチド核酸は、通常、同じ配列相補性を有するデオキシリボ核酸に比べて、特定の微生物内に含まれるリボ核酸に対する結合安定性が高い。そのため、微生物内に含まれる種々の塩基配列の中でもリボ核酸に対してより高い結合安定性でハイブリダイズする。また、ペプチド核酸は、デオキシリボ核酸に比べて、微生物内に導入された後も分解されにくい。また、ペプチド核酸とリボ核酸とがハイブリダイズした複合体は、デオキシリボ核酸とリボ核酸とがハイブリダイズした複合体に比べて、熱安定性が高い傾向にある。
【0022】
本開示のプローブ複合体は、さらに、検出精度に優れるという副次的効果も有する。例えば、従来の非特許文献３等に記載の手法では、プローブに含まれるデオキシリボ核酸が長いと高次構造を持つ塩基配列（例えば16S rRNA）へ結合しにくいと予想される。そのため、微生物種の特異的な識別という点で改善の余地がある。
一方、本開示に係るプローブ複合体は、微生物内に存在する任意の塩基配列とハイブリダイズする因子として、デオキシリボ核酸よりもリボ核酸に対する結合安定性の高いペプチド核酸を用いている。そのため、微生物内に存在する任意の塩基配列とハイブリダイズするデオキシリボ核酸のみを用いているプローブに比べて、プローブの長さが比較的短くて済み、高次構造を持つ塩基配列（例えば16S rRNA）に対しても立体障害の影響を受けにくく、相互作用しやすい。また、微生物内に導入したときに、ペプチド核酸と微生物内に存在する任意の塩基配列とがハイブリダイズした複合体がより安定に存在でき、プローブ由来の標識のシグナルがより正確に検出されやすい。
一方、本開示に係るプローブ複合体は、微生物内に存在する任意の塩基配列とハイブリダイズする因子として、デオキシリボ核酸よりもリボ核酸に対する結合安定性の高いペプチド核酸を用いている。そのため、微生物内に存在する任意の塩基配列とハイブリダイズするデオキシリボ核酸のみを用いているプローブに比べて、プローブの長さが比較的短くて済み、高次構造を持つ塩基配列（例えば16S rRNA）に対しても立体障害の影響を受けにくく、相互作用しやすい。また、微生物内に導入したときに、ペプチド核酸と微生物内に存在する任意の塩基配列とがハイブリダイズした複合体がより安定に存在でき、プローブ由来の標識のシグナルがより正確に検出されやすい。
【0023】
本開示のプローブ複合体は、さらに、生きている微生物を検出した後に、生きて検出された微生物をそのまま分離できるという副次的効果も有する。従来の上記非特許文献１～２に記載の手法では、測定の過程にて微生物が固定化や化学処理等により死菌化される確率が高い。一方で、本開示に係るプローブ複合体を用いると、検出した後の微生物も生存率が高い傾向にあり、特定微生物を生きている状態で分離できる。
【0024】
本開示のプローブ複合体を用いた、微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を、微生物を生きた状態に維持したまま高効率で特異的に検出する方法を、SPecific Live ASsortment Hybridization法（以下、SPLASH法ともいう。）と名付けた。
図１は、SPLASH法による検出原理の一例を示す模式図である。
図１に示す例示的なプローブ複合体は、膜透過性ペプチド（以下、ＣＰＰともいう。）、ＰＮＡ、及び蛍光物質（標識物質の一例）を含む特異的プローブと、前記ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡオリゴマー及びクエンチャーを含むクエンチャープローブから構成されている。
図示はしないが、図１における微生物は、「前記プローブ複合体に含まれるＰＮＡの塩基配列」とハイブリダイズする塩基配列を含む。
図示はしないが、図１における微生物内に存在する「前記プローブ複合体に含まれるＰＮＡの塩基配列」とハイブリダイズする塩基配列は、ＲＮＡである。
図１は、SPLASH法による検出原理の一例を示す模式図である。
図１に示す例示的なプローブ複合体は、膜透過性ペプチド（以下、ＣＰＰともいう。）、ＰＮＡ、及び蛍光物質（標識物質の一例）を含む特異的プローブと、前記ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡオリゴマー及びクエンチャーを含むクエンチャープローブから構成されている。
図示はしないが、図１における微生物は、「前記プローブ複合体に含まれるＰＮＡの塩基配列」とハイブリダイズする塩基配列を含む。
図示はしないが、図１における微生物内に存在する「前記プローブ複合体に含まれるＰＮＡの塩基配列」とハイブリダイズする塩基配列は、ＲＮＡである。
【0025】
図１では、予め、特異的プローブとクエンチャープローブとを混合し、特異的プローブにおけるＰＮＡとクエンチャープローブにおけるＤＮＡオリゴマーとをハイブリダイズさせることで、プローブ複合体を形成している。プローブ複合体の状態では、蛍光物質とクエンチャーが近接しているため、蛍光物質は消光（つまり、クエンチ）されている。
【0026】
図１では、プローブ複合体と微生物とを混合する。すると、プローブ複合体は、微生物の細胞膜を透過する膜透過性ペプチドを介して微生物内に導入される。
前記膜透過性ペプチドはほとんど全ての微生物に対して膜透過性に優れるため、プローブ複合体の導入時に、プローブ複合体を膜透過させるために微生物を加熱する又は固定することを必要としない。さらにＰＮＡは電荷を有さないため、微生物膜を透過しやすい。
図示はしないが、プローブ複合体と微生物とを混合したときのインキュベート時間は、特に制限されず、３０分～数時間でよい。また、混合温度は、対象とする微生物の最適温度に応じて調整してよい。
前記膜透過性ペプチドはほとんど全ての微生物に対して膜透過性に優れるため、プローブ複合体の導入時に、プローブ複合体を膜透過させるために微生物を加熱する又は固定することを必要としない。さらにＰＮＡは電荷を有さないため、微生物膜を透過しやすい。
図示はしないが、プローブ複合体と微生物とを混合したときのインキュベート時間は、特に制限されず、３０分～数時間でよい。また、混合温度は、対象とする微生物の最適温度に応じて調整してよい。
【0027】
プローブ複合体が導入された微生物は、通常、ＰＮＡに対する結合安定性がＤＮＡよりも、微生物内に存在するＲＮＡの方が高いことから、特異的プローブのＰＮＡは、クエンチャープローブのＤＮＡオリゴマーとのハイブリダイズを解消し、前記微生物内に存在するＲＮＡに対して新たにハイブリダイズする。つまり、競合的ハイブリダイゼーション（Probe Displacement Hybridization）が起こる。特異的プローブとクエンチャープローブが解離すると、特異的プローブに含まれる蛍光物質からクエンチャープローブに含まれるクエンチャーが遠ざかることから、クエンチャーによる標識阻害が解消され、蛍光物質が蛍光を発する。
【0028】
図１では、微生物内に存在する「前記プローブ複合体に含まれるＰＮＡの塩基配列」とハイブリダイズする塩基配列がＲＮＡであるが、少なくとも一部のプローブ複合体において特異的プローブと微生物内の核酸とのハイブリダイズが起こればよいことから、本開示はこれに限定されず、前記塩基配列はＤＮＡであってもよい。
【0029】
なお、プローブ複合体に含まれるＰＮＡとハイブリダイズする塩基配列が微生物内に存在しない場合は、プローブ複合体におけるＰＮＡとＤＮＡオリゴマーとのハイブリダイズは維持される。つまり、蛍光物質とクエンチャーが近接した状態が維持されるため、蛍光物質は消光された状態を保つ。
【0030】
上記のように、図１に示すプローブ複合体では、生きている微生物内に存在する任意の塩基配列を有する核酸の有無を検出することができる。
なお本開示において、微生物内に存在する任意の塩基配列とは、ＤＮＡの塩基配列であってもよく、ＲＮＡの塩基配列であってもよい。
なお本開示において、微生物内に存在する任意の塩基配列とは、ＤＮＡの塩基配列であってもよく、ＲＮＡの塩基配列であってもよい。
【0031】
上述の通り、本開示のプローブ複合体を用いた検出は、予め微生物を酸処理等で死菌化せずに、生きている微生物を用いて測定することができるが、具体的には、試料中の総微生物細胞数のうち生細胞の割合が、Live-FISH法、PNA-FISH法、又はQuickFISH法を用いて核酸検出を行った場合の割合（生細胞数／総微生物細胞数）よりも有意に高いことが好ましい。前記割合の具体的な値は、微生物の種類によって異なるが、１０％以上の数の微生物細胞が生きていることがより好ましく、５０％以上の数の微生物細胞が生きていることがさらに好ましく、８０％以上の数の微生物細胞が生きていることがいっそう好ましく、９０％の数の微生物細胞が生きていることがよりいっそう好ましい。本開示において微生物叢とは、微生物の集団をいい、一種の微生物のみが含まれていてもよく、複数種の微生物が含まれていてもよい。本開示において微生物が生きているとは、微生物膜が破れておらず、微生物を至適条件に供したときに微生物が増殖又は増大できることをいい、仮死状態及び休眠状態を含む。
【0032】
本開示のプローブ複合体を用いた上記検出は高効率なものであるが、具体的には、プローブ複合体においてＣＰＰを用いない場合の検出効率よりも高いことが好ましい。微生物細胞への導入効率は微生物の種類によって異なるが、試料中の総微生物細胞数のうち１０％以上の数の微生物細胞内にプローブ複合体を導入できることが好ましく、５０％以上の数の微生物細胞内にプローブ複合体を導入できることがより好ましく、８０％以上の数の微生物細胞内にプローブ複合体を導入できることがさらに好ましく、９０％の数の微生物内にプローブ複合体を導入できることが特に好ましい。
微生物細胞への導入効率は、例えば、フローサイトメーターにより確認できる。
微生物細胞への導入効率は、例えば、フローサイトメーターにより確認できる。
【0033】
また、微生物細胞内に目的の塩基配列が存在した場合に、１０％以上の確率で当該微生物細胞内の標識を検出できることが好ましく、５０％以上の確率で当該微生物細胞内の標識を検出できることがより好ましく、８０％以上の確率で当該微生物細胞内の標識を検出できることがさらに好ましく、９０％の確率で当該微生物細胞内の標識を検出できることが特に好ましい。
微生物細胞内の標識の検出割合は、例えば、フローサイトメーターにより確認できる。
微生物細胞内の標識の検出割合は、例えば、フローサイトメーターにより確認できる。
【0034】
上述のとおり、本開示のSPLASH法について図１に沿って説明したが、上記説明はSPLASH法の一つの利用例であって、SPLASH法の利用例はこれに限定されるものではない。さらに上記メカニズムは推察であり、本開示は上記メカニズムに拘束されるものではない。
【0035】
本開示のプローブ複合体は、下記（ｉ）又は（ｉｉ）である：
（ｉ）ペプチド核酸及び標識物質を含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び前記標識物質に対するクエンチャーを含む第二のプローブとを含み、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、
（ｉｉ）ペプチド核酸及びクエンチャーを含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び標識物質を含む第二のプローブとを含み、前記クエンチャーは前記標識物質に対するクエンチャーであり、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む。
（ｉ）ペプチド核酸及び標識物質を含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び前記標識物質に対するクエンチャーを含む第二のプローブとを含み、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、
（ｉｉ）ペプチド核酸及びクエンチャーを含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び標識物質を含む第二のプローブとを含み、前記クエンチャーは前記標識物質に対するクエンチャーであり、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む。
【0036】
一態様として、本開示のプローブ複合体は、上記（ｉ）であることが好ましく、
第一のプローブは、膜透過性ペプチドと、ペプチド核酸と、標識物質とを含み、第二のプローブは、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸と、クエンチャーとを含む構成であることがより好ましい。
上記（ｉ）の構成であると、微生物内に存在する任意の塩基配列とペプチド核酸とがハイブリダイズしたときに、標識のシグナルがＯＮになることから、検出容易性により優れる。
第一のプローブは、膜透過性ペプチドと、ペプチド核酸と、標識物質とを含み、第二のプローブは、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸と、クエンチャーとを含む構成であることがより好ましい。
上記（ｉ）の構成であると、微生物内に存在する任意の塩基配列とペプチド核酸とがハイブリダイズしたときに、標識のシグナルがＯＮになることから、検出容易性により優れる。
【0037】
＜膜透過性ペプチド＞
本開示において、膜透過性ペプチド（以下、ＣＰＰともいう。）とは、微生物細胞の細胞膜を透過して微生物細胞内に侵入する能力を有するペプチドを意味する。
本開示において、膜透過性ペプチド（以下、ＣＰＰともいう。）とは、微生物細胞の細胞膜を透過して微生物細胞内に侵入する能力を有するペプチドを意味する。
【0038】
膜透過性ペプチドが細胞膜を透過する微生物の種類は特に制限されず、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物（つまり、真核微生物）等の公知の微生物が挙げられる。
【0039】
前記膜透過性ペプチドは、微生物の細胞膜透過性により優れる観点から、４個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含む第一の膜透過性ペプチド、及び、式（ＩＩ）のアミノ酸残基を含む第二の膜透過性ペプチドの少なくとも一方を含むことができる。
【0040】
【化2】
【0041】
上記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、ｎは独立して１～４の整数であり、アミノ酸残基は（Ｒ）体又は（Ｓ）体のいずれであってもよい。式（ＩＩ）中、ｍは１～５の整数、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に疎水性置換基を表す。式（Ｉ）及び式（ＩＩ）中、＊で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。
【0042】
以下、「４個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含む膜透過性ペプチド」を「第一の膜透過性ペプチド」とも称す。
以下、「式（ＩＩ）のアミノ酸残基を含む膜透過性ペプチド」を「第二の膜透過性ペプチド」とも称す。
以下、「式（ＩＩ）のアミノ酸残基を含む膜透過性ペプチド」を「第二の膜透過性ペプチド」とも称す。
【0043】
（第一の膜透過性ペプチド）
第一の膜透過性ペプチドは、４個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含むことができる。
式（Ｉ）中、ｎは独立して１～４の整数であり、アミノ酸残基は（Ｒ）体又は（Ｓ）体のいずれであってもよい。
式（Ｉ）中、＊で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。なお、隣接する部位とは、隣接するアミノ酸残基、末端保護基、Ｎ末端の水素原子、Ｃ末端のヒドロキシ基、又は、後述するリンカー等の式（Ｉ）のアミノ酸残基に隣接する構造を表す。
第一の膜透過性ペプチドは、４個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含むことができる。
式（Ｉ）中、ｎは独立して１～４の整数であり、アミノ酸残基は（Ｒ）体又は（Ｓ）体のいずれであってもよい。
式（Ｉ）中、＊で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。なお、隣接する部位とは、隣接するアミノ酸残基、末端保護基、Ｎ末端の水素原子、Ｃ末端のヒドロキシ基、又は、後述するリンカー等の式（Ｉ）のアミノ酸残基に隣接する構造を表す。
【0044】
【化3】
【0045】
例えば、ｎ＝１である場合、式（Ｉ）のアミノ酸残基は、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）の（Ｒ）体又は（Ｓ）体となる。
例えば、ｎ＝２である場合、式（Ｉ）のアミノ酸残基は、２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）の（Ｒ）体又は（Ｓ）体となる。
例えば、ｎ＝３である場合、式（Ｉ）のアミノ酸残基は、２，５－ジアミノペンタン酸（Ｏｒｎ）の（Ｒ）体又は（Ｓ）体となる。
例えば、ｎ＝４である場合、式（Ｉ）のアミノ酸残基は、リジン（Ｋ）の（Ｒ）体又は（Ｓ）体となる。
例えば、ｎ＝２である場合、式（Ｉ）のアミノ酸残基は、２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）の（Ｒ）体又は（Ｓ）体となる。
例えば、ｎ＝３である場合、式（Ｉ）のアミノ酸残基は、２，５－ジアミノペンタン酸（Ｏｒｎ）の（Ｒ）体又は（Ｓ）体となる。
例えば、ｎ＝４である場合、式（Ｉ）のアミノ酸残基は、リジン（Ｋ）の（Ｒ）体又は（Ｓ）体となる。
【0046】
第一の膜透過性ペプチドは、微生物の細胞膜をより高い効率及び低い毒性で膜透過する観点からは、（Ｓ）－２，５－ジアミノペンタン酸（Ｏｒｎ）、（Ｒ）－２，５－ジアミノペンタン酸（Ｏｒｎ）、（Ｓ）－２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、（Ｒ）－２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、（Ｓ）－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、（Ｒ）－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、（Ｓ）－リジン（Ｋ）、及び（Ｒ）－リジン（Ｋ）からなる群より独立して選択される４個～２６個の連続したアミノ酸残基からなることが好ましい。
【0047】
本開示において、複数の選択肢から選択されるアミノ酸残基が、所定の個数連続することが記載されている場合、連続するアミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基は、前記複数の選択肢から選択される限りは、互いに同じであっても異なっていてもよく、その一例として、同じアミノ酸残基が所定の個数連続している場合も含まれる。
【0048】
第一の膜透過性ペプチドのアミノ酸配列は、例えば、下記の配列であってもよい。
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｘ２２－Ｘ２３－Ｘ２４－Ｘ２５－Ｘ２６
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２－Ｘ１３－Ｘ１４－Ｘ１５－Ｘ１６－Ｘ１７－Ｘ１８－Ｘ１９－Ｘ２０－Ｘ２１－Ｘ２２－Ｘ２３－Ｘ２４－Ｘ２５－Ｘ２６
【0049】
上記配列中、
Ｘ１～Ｘ３は、それぞれ独立して、（Ｓ）－リジン（Ｋ）、（Ｒ）－リジン（Ｋ）、（Ｓ）－２，５－ジアミノペンタン酸（Ｏｒｎ）、（Ｒ）－２，５－ジアミノペンタン酸（Ｏｒｎ）、（Ｓ）－２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、（Ｒ）－２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、（Ｓ）－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）もしくは（Ｒ）－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）であり、
Ｘ４～Ｘ２６は、それぞれ独立して、存在しないか、又は、（Ｓ）－リジン（Ｋ）、（Ｒ）－リジン（Ｋ）、（Ｓ）－２，５－ジアミノペンタン酸（Ｏｒｎ）、（Ｒ）－２，５－ジアミノペンタン酸（Ｏｒｎ）、（Ｓ）－２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、（Ｒ）－２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、（Ｓ）－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）もしくは（Ｒ）－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）である。
Ｘ１～Ｘ３は、それぞれ独立して、（Ｓ）－リジン（Ｋ）、（Ｒ）－リジン（Ｋ）、（Ｓ）－２，５－ジアミノペンタン酸（Ｏｒｎ）、（Ｒ）－２，５－ジアミノペンタン酸（Ｏｒｎ）、（Ｓ）－２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、（Ｒ）－２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、（Ｓ）－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）もしくは（Ｒ）－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）であり、
Ｘ４～Ｘ２６は、それぞれ独立して、存在しないか、又は、（Ｓ）－リジン（Ｋ）、（Ｒ）－リジン（Ｋ）、（Ｓ）－２，５－ジアミノペンタン酸（Ｏｒｎ）、（Ｒ）－２，５－ジアミノペンタン酸（Ｏｒｎ）、（Ｓ）－２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、（Ｒ）－２，４－ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、（Ｓ）－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）もしくは（Ｒ）－２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）である。
【0050】
第一の膜透過性ペプチドは、４個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含むペプチドであれば、特に制限されるものではないが、膜透過性をより向上させる観点からは、
５個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含むペプチドであることが好ましく、
６個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含むペプチドであることがより好ましく、
６個～２０個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含むペプチドであることがさらに好ましい。
５個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含むペプチドであることが好ましく、
６個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含むペプチドであることがより好ましく、
６個～２０個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基を連続して含むペプチドであることがさらに好ましい。
【0051】
第一の膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸残基の立体異性体は、特に制限されるものではなく、膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸残基の全てが（Ｒ）体若しくは（Ｓ）体であってもよいし、又は（Ｒ）体と（Ｓ）体とが混在していてもよい。
【0052】
第一の膜透過性ペプチドは、膜透過性をより向上させる観点からは、４個～２６個の連続したアミノ酸残基からなるものであることが好ましく、５個～２６個の連続した同じアミノ酸残基からなるものであることがより好ましく、６個～２６個の連続した同じアミノ酸残基からなるものであることがさらに好ましく、６個～１５個の連続した同じアミノ酸残基からなるものであることが特に好ましい。
【0053】
第一の膜透過性ペプチドは、上記式（Ｉ）のアミノ酸残基を含み、且つ、微生物膜透過性を保持するものであれば、任意のアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。
【0054】
第一の膜透過性ペプチドは、膜透過性をより向上させる観点からは、
少なくとも４個の連続したＯｒｎ、Ｄａｂ又はＤａｐを含むことが好ましく、
少なくとも４個の連続したＯｒｎ又はＤａｂを含むことがより好ましく、
５個～２６個の連続したＯｒｎ又はＤａｂを含むことがさらに好ましく、
６個～２６個の連続したＯｒｎ又はＤａｂを含むことが特に好ましく、
６個～１５個の連続したＯｒｎ又はＤａｂを含むことが顕著に好ましい。
少なくとも４個の連続したＯｒｎ、Ｄａｂ又はＤａｐを含むことが好ましく、
少なくとも４個の連続したＯｒｎ又はＤａｂを含むことがより好ましく、
５個～２６個の連続したＯｒｎ又はＤａｂを含むことがさらに好ましく、
６個～２６個の連続したＯｒｎ又はＤａｂを含むことが特に好ましく、
６個～１５個の連続したＯｒｎ又はＤａｂを含むことが顕著に好ましい。
【0055】
第一の膜透過性ペプチドは、膜透過性をより向上させる観点からは、
４個～２６個の連続したジアミノプロピオン酸残基であることが好ましく、
４個～２６個の連続したジアミノブタン酸残基であることが好ましく、又は、
４個～２６個の連続したジアミノペンタン酸残基であることが好ましい。
４個～２６個の連続したジアミノプロピオン酸残基であることが好ましく、
４個～２６個の連続したジアミノブタン酸残基であることが好ましく、又は、
４個～２６個の連続したジアミノペンタン酸残基であることが好ましい。
【0056】
第一の膜透過性ペプチドは、膜透過性をより向上させる観点からは、
５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２個の連続した（Ｓ）－Ｏｒｎからなるもの、
５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２個の連続した（Ｓ）－Ｄａｂからなるもの、
又は、９個の連続した（Ｓ）－Ｄａｐからなるものであることが好ましい。
５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２個の連続した（Ｓ）－Ｏｒｎからなるもの、
５、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２個の連続した（Ｓ）－Ｄａｂからなるもの、
又は、９個の連続した（Ｓ）－Ｄａｐからなるものであることが好ましい。
【0057】
第一の膜透過性ペプチドは、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２個の連続した（Ｓ）－Ｏｒｎからなるもの、又は、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２個の連続した（Ｓ）－Ｄａｂからなるものであることがより好ましい。
【0058】
第一の膜透過性ペプチドは、８、９、１０、１１若しくは１２個の連続した（Ｓ）－Ｏｒｎからなるもの、又は、６、７、８、９、１０、１１若しくは１２個の連続した（Ｓ）－Ｄａｂからなるものであることがさらに好ましい。
【0059】
第一の膜透過性ペプチドの例として、Ｄａｂ９量体（Ｄａｂ９又は（Ｄａｂ）９ともいう）及びＯｒｎ９量体（Ｏｒｎ９又は（Ｏｒｎ）９ともいう）のアミノ酸配列、並びに、他の第一の膜透過性ペプチドの例として、Ｏｒｎ６量体～１２量体、Ｄａｂ４量体～１２量体、１５量体、１９量体及びＤａｐ９量体のアミノ酸配列を以下に示す。
【0060】
Ｄａｐ９ ：Dap-Dap-Dap-Dap-Dap-Dap-Dap-Dap-Dap
【0061】
Ｄａｂ４ ：Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ５ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ６ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ７ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ８ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ９ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ１０ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ１１ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ１２ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ１５ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ１９ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ５ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ６ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ７ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ８ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ９ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ１０ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ１１ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ１２ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ１５ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
Ｄａｂ１９ ：Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab-Dab
【0062】
Ｏｒｎ６ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
Ｏｒｎ７ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
Ｏｒｎ８ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
Ｏｒｎ９ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
Ｏｒｎ１０ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
Ｏｒｎ１１ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
Ｏｒｎ１２ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
Ｏｒｎ７ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
Ｏｒｎ８ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
Ｏｒｎ９ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
Ｏｒｎ１０ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
Ｏｒｎ１１ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
Ｏｒｎ１２ ：Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn
【0063】
上記の第一の膜透過性ペプチドの具体例における立体異性体は、Ｏｒｎ、Ｄａｂ及びＤａｐの全てが（Ｒ）体若しくは（Ｓ）体であってもよいし、又は（Ｒ）体と（Ｓ）体とが混在していてもよいが、Ｏｒｎ、Ｄａｂ及びＤａｐの全てが（Ｓ）体であることが好ましい。
【0064】
第一の膜透過性ペプチドは、膜透過性をより向上させる観点からは、９個の連続した（Ｓ）－Ｏｒｎからなるもの、又は、９個の連続した（Ｓ）－Ｄａｂからなるものであることが特に好ましい。
【0065】
一態様として、第一の膜透過性ペプチドは、前記４個～２６個のそれぞれ独立して選択される式（Ｉ）のアミノ酸残基からなるブロックを複数有し、前記複数のブロックの間の少なくとも１カ所に、前記式（Ｉ）のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を１個又は２個以上連続して含む態様であってもよい。この場合、前記式（Ｉ）のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基は、アルギニン（Ａｒｇ）残基を含んでいてもよく、後述する疎水性アミノ酸残基を含んでいてもよい。
【0066】
（第二の膜透過性ペプチド）
第二の膜透過性ペプチドは、式（ＩＩ）のアミノ酸残基を含む。
式（ＩＩ）中、ｎは独立して１～４の整数であり、アミノ酸残基は（Ｒ）体又は（Ｓ）体のいずれであってもよい。
式（ＩＩ）中、ｍは１～５の整数、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に疎水性置換基を表す。
式（ＩＩ）中、＊で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。なお、隣接する部位とは、隣接するアミノ酸残基、末端保護基、Ｎ末端の水素原子、Ｃ末端のヒドロキシ基、又は、後述するリンカー等の式（ＩＩ）のアミノ酸残基に隣接する構造を表す。
第二の膜透過性ペプチドは、式（ＩＩ）のアミノ酸残基を含む。
式（ＩＩ）中、ｎは独立して１～４の整数であり、アミノ酸残基は（Ｒ）体又は（Ｓ）体のいずれであってもよい。
式（ＩＩ）中、ｍは１～５の整数、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に疎水性置換基を表す。
式（ＩＩ）中、＊で表される部位は、隣接する部位との結合部位を表す。なお、隣接する部位とは、隣接するアミノ酸残基、末端保護基、Ｎ末端の水素原子、Ｃ末端のヒドロキシ基、又は、後述するリンカー等の式（ＩＩ）のアミノ酸残基に隣接する構造を表す。
【0067】
【化4】
【0068】
式（ＩＩ）中、ｎは独立して１～４の整数であり、膜透過性をより向上させる観点からは、２～４の整数であることが好ましく、２であることがより好ましい。
式（ＩＩ）中、ｍは１～５の整数であり、膜透過性をより向上させる観点からは、２～４の整数であることが好ましく、２～３の整数であることがより好ましい。
式（ＩＩ）中、ｍは１～５の整数であり、膜透過性をより向上させる観点からは、２～４の整数であることが好ましく、２～３の整数であることがより好ましい。
【0069】
式（ＩＩ）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に疎水性置換基を表す。
【0070】
Ｒ１で表される疎水性置換基とは、Ｒ１が置換する炭素原子の両端に位置するＮＨ及びＣ＝Ｏを含むアミノ酸残基（ＮＨ－Ｃ（Ｒ１）－Ｃ（＝Ｏ））が、疎水性アミノ酸に由来するアミノ酸残基であることを意味する。
Ｒ２で表される疎水性置換基とは、Ｒ２が置換する炭素原子の両端に位置するＮＨ及びＣ＝Ｏを含むアミノ酸残基（ＮＨ－Ｃ（Ｒ２）－Ｃ（＝Ｏ））が、疎水性アミノ酸に由来するアミノ酸残基であることを意味する。
Ｒ２で表される疎水性置換基とは、Ｒ２が置換する炭素原子の両端に位置するＮＨ及びＣ＝Ｏを含むアミノ酸残基（ＮＨ－Ｃ（Ｒ２）－Ｃ（＝Ｏ））が、疎水性アミノ酸に由来するアミノ酸残基であることを意味する。
【0071】
疎水性アミノ酸とは、疎水性インデックス（ｈｉ）が－２以上のアミノ酸を意味する。本開示に係る疎水性アミノ酸は、疎水性インデックス（ｈｉ）が－２以上のアミノ酸であれば特に限定されないが、具体的な疎水性アミノ酸としては、グリシン（ｈｉ＝－０．４）、トリプトファン（ｈｉ＝０．９）、メチオニン（ｈｉ＝１．９）、プロリン（ｈｉ＝－１．６）、フェニルアラニン（ｈｉ＝２．８）、アラニン（ｈｉ＝１．８）、バリン（ｈｉ＝４．２）、ロイシン（ｈｉ＝３．８）、イソロイシン（ｈｉ＝４．５）等が挙げられる。上記の中でも、疎水性アミノ酸は、フェニルアラニンであってもよいが、他の疎水性アミノ酸でもよい。なお疎水性インデックスとは、Kyte&Doolittleによるインデックス（Kyte J & Doolittle R F, 1982. J Mol Biol, 157:105-132）である。
【0072】
第二の膜透過性ペプチドは、（Ｘａ－Ｘｂ－Ｘｃ）ｍで表される繰り返し単位を含むことが好ましい。ここで、Ｘａは、ジアミノプロピオン酸残基、ジアミノブタン酸残基、ジアミノペンタン酸残基、又はリジン残基を表す。Ｘｂ及びＸｃはそれぞれ独立して、グリシン残基、トリプトファン残基、メチオニン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、又はイソロイシン残基を表す。ｍは１～５の整数を表す。
【0073】
第二の膜透過性ペプチドは、膜透過性をより向上させる観点からは、（Ｘａ－Ｘｂ－Ｘｃ）ｍで表される繰り返し単位を含み、Ｘａは、ジアミノプロピオン酸残基、ジアミノブタン酸残基、ジアミノペンタン酸残基、又はリジン残基を表し、Ｘｂ及びＸｃは、フェニルアラニン残基を表し、かつ、ｍは３を表すことが好ましい。
第二の膜透過性ペプチドは、（Ｘａ－Ｘｂ－Ｘｃ）ｍで表される繰り返し単位のＣ末端側に、さらに、ジアミノプロピオン酸残基、ジアミノブタン酸残基、ジアミノペンタン酸残基、アルギニン残基、又はリジン残基を１個含んでいてもよい。
第二の膜透過性ペプチドは、（Ｘａ－Ｘｂ－Ｘｃ）ｍで表される繰り返し単位のＣ末端側に、さらに、ジアミノプロピオン酸残基、ジアミノブタン酸残基、ジアミノペンタン酸残基、アルギニン残基、又はリジン残基を１個含んでいてもよい。
【0074】
第二の膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸残基の立体異性体は、特に制限されるものではなく、膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸残基の全てが（Ｒ）体若しくは（Ｓ）体であってもよいし、又は（Ｒ）体と（Ｓ）体とが混在していてもよい。
【0075】
第二の膜透過性ペプチドの例として、Ｄａｐ１量体とフェニルアラニン２量体とからなる繰り返し単位が３回連続してなる配列（ＤａｐＦＦ）３、前記配列（ＤａｐＦＦ）３のＣ末端側にさらにＤａｐ１量体が付加された配列（ＤａｐＦＦ）３Ｄａｐ、Ｄａｂ１量体とフェニルアラニン２量体とからなる繰り返し単位が３回連続してなる配列（ＤａｂＦＦ）３、前記配列（ＤａｂＦＦ）３のＣ末端側にさらにＤａｂ１量体が付加された配列（ＤａｂＦＦ）３Ｄａｂ、Ｏｒｎ１量体とフェニルアラニン２量体とからなる繰り返し単位が３回連続してなる配列（ＯｒｎＦＦ）３、前記配列（ＯｒｎＦＦ）３のＣ末端側にさらにＯｒｎ１量体が付加された配列（ＯｒｎＦＦ）３Ｏｒｎ、Ｋ１量体とフェニルアラニン２量体とからなる繰り返し単位が３回連続してなる配列（ＫＦＦ）３、及び、前記配列（ＫＦＦ）３のＣ末端側にさらにＫ１量体が付加された配列（ＫＦＦ）３Ｋの、各アミノ酸配列を以下に示す。そのほか、繰り返し単位の回数が２回及び４回の各アミノ酸配列についても以下に示す。
【0076】
(DapFF)2 ：Dap-F-F-Dap-F-F（配列番号１）
(DapFF)3 ：Dap-F-F-Dap-F-F-Dap-F-F（配列番号２）
(DapFF)4 ：Dap-F-F-Dap-F-F-Dap-F-F-Dap-F-F（配列番号３）
(DapFF)2Dap ：Dap-F-F-Dap-F-F-Dap（配列番号４）
(DapFF)3Dap ：Dap-F-F-Dap-F-F-Dap-F-F-Dap（配列番号５）
(DapFF)4Dap ：Dap-F-F-Dap-F-F-Dap-F-F-Dap-F-F-Dap（配列番号６）
(DabFF)2 ：Dab-F-F-Dab-F-F（配列番号７）
(DabFF)3 ：Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F（配列番号８）
(DabFF)4 ：Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F（配列番号９）
(DabFF)2Dab ：Dab-F-F-Dab-F-F-Dab（配列番号１０）
(DabFF)3Dab ：Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F-Dab（配列番号１１）
(DabFF)4Dab ：Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F-Dab（配列番号１２）
(OrnFF)2 ：Orn-F-F-Orn-F-F（配列番号１３）
(OrnFF)3 ：Orn-F-F-Orn-F-F-Orn-F-F（配列番号１４）
(OrnFF)4 ：Orn-F-F-Orn-F-F-Orn-F-F-Orn-F-F（配列番号１５）
(OrnFF)2Orn ：Orn-F-F-Orn-F-F-Orn（配列番号１６）
(OrnFF)3Orn ：Orn-F-F-Orn-F-F-Orn-F-F-Orn（配列番号１７）
(OrnFF)4Orn ：Orn-F-F-Orn-F-F-Orn-F-F-Orn-F-F-Orn（配列番号１８）
(KFF)2 ：K-F-F-K-F-F（配列番号１９）
(KFF)3 ：K-F-F-K-F-F-K-F-F（配列番号２０）
(KFF)4 ：K-F-F-K-F-F-K-F-F-K-F-F（配列番号２１）
(KFF)2K ：K-F-F-K-F-F-K（配列番号２２）
(KFF)3K ：K-F-F-K-F-F-K-F-F-K（配列番号２３）
(KFF)4K ：K-F-F-K-F-F-K-F-F-K-F-F-K（配列番号２４）
(DapFF)3 ：Dap-F-F-Dap-F-F-Dap-F-F（配列番号２）
(DapFF)4 ：Dap-F-F-Dap-F-F-Dap-F-F-Dap-F-F（配列番号３）
(DapFF)2Dap ：Dap-F-F-Dap-F-F-Dap（配列番号４）
(DapFF)3Dap ：Dap-F-F-Dap-F-F-Dap-F-F-Dap（配列番号５）
(DapFF)4Dap ：Dap-F-F-Dap-F-F-Dap-F-F-Dap-F-F-Dap（配列番号６）
(DabFF)2 ：Dab-F-F-Dab-F-F（配列番号７）
(DabFF)3 ：Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F（配列番号８）
(DabFF)4 ：Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F（配列番号９）
(DabFF)2Dab ：Dab-F-F-Dab-F-F-Dab（配列番号１０）
(DabFF)3Dab ：Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F-Dab（配列番号１１）
(DabFF)4Dab ：Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F-Dab-F-F-Dab（配列番号１２）
(OrnFF)2 ：Orn-F-F-Orn-F-F（配列番号１３）
(OrnFF)3 ：Orn-F-F-Orn-F-F-Orn-F-F（配列番号１４）
(OrnFF)4 ：Orn-F-F-Orn-F-F-Orn-F-F-Orn-F-F（配列番号１５）
(OrnFF)2Orn ：Orn-F-F-Orn-F-F-Orn（配列番号１６）
(OrnFF)3Orn ：Orn-F-F-Orn-F-F-Orn-F-F-Orn（配列番号１７）
(OrnFF)4Orn ：Orn-F-F-Orn-F-F-Orn-F-F-Orn-F-F-Orn（配列番号１８）
(KFF)2 ：K-F-F-K-F-F（配列番号１９）
(KFF)3 ：K-F-F-K-F-F-K-F-F（配列番号２０）
(KFF)4 ：K-F-F-K-F-F-K-F-F-K-F-F（配列番号２１）
(KFF)2K ：K-F-F-K-F-F-K（配列番号２２）
(KFF)3K ：K-F-F-K-F-F-K-F-F-K（配列番号２３）
(KFF)4K ：K-F-F-K-F-F-K-F-F-K-F-F-K（配列番号２４）
【0077】
上記の第二の膜透過性ペプチドにおける立体異性体は、Ｆ、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ及びＤａｐのうち存在するものに相当するアミノ酸残基の全てが（Ｒ）体若しくは（Ｓ）体であってもよいし、又は（Ｒ）体と（Ｓ）体とが混在していてもよいが、Ｆ、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ及びＤａｐのうち存在するものに相当するアミノ酸残基の全てが（Ｓ）体であることが好ましい。
【0078】
第二の膜透過性ペプチドは、全てのアミノ酸残基が（Ｓ）体である（ＤａｂＦＦ）３Ｄａｂであってもよく、全てのアミノ酸残基が（Ｓ）体である（ＫＦＦ）３Ｋであってもよく、全てのアミノ酸残基が（Ｓ）体である（ＤａｂＦＦ）３Ｋであってもよく、又は、全てのアミノ酸残基が（Ｓ）体である（ＫＦＦ）３Ｄａｂであってもよい。
【0079】
第二の膜透過性ペプチドは、上記式（ＩＩ）のアミノ酸残基を含み、且つ、微生物膜透過性を保持するものであれば、任意のアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。
【0080】
一態様として、第二の膜透過性ペプチドは、式（ＩＩ）のアミノ酸残基からなるブロックを複数有し、前記複数のブロックの間の少なくとも１カ所に、前記式（ＩＩ）のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を１個又は２個以上連続して含む態様であってもよい。この場合、前記式（ＩＩ）のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基は、リジン（Ｌｙｓ）残基又はアルギニン（Ａｒｇ）残基を含んでいてもよく、前述した疎水性アミノ酸残基を含んでいてもよい。
【0081】
本開示のＣＰＰは、第一の膜透過性ペプチド及び第二の膜透過性ペプチドの少なくとも一方のみを含んでいてもよく、第一の膜透過性ペプチド及び第二の膜透過性ペプチドの両方を含んでいてもよい。ＣＰＰが第一の膜透過性ペプチド及び第二の膜透過性ペプチドの両方を含む場合、両者は、後述するその他のアミノ酸残基を介していてもよい。
【0082】
本開示のＣＰＰは、微生物膜透過性に影響がない限り、式（Ｉ）のアミノ酸残基及び式（ＩＩ）のアミノ酸残基以外のその他のアミノ酸残基が含まれていてもよい。
前記その他のアミノ酸残基を含む場合、前記その他のアミノ酸残基は、特に制限されるものではないが、１個～５個の任意のアミノ酸残基であることが好ましい。
前記その他のアミノ酸残基は、例えば、リジン（Ｌｙｓ）残基又はアルギニン（Ａｒｇ）残基であってもよく、前述した疎水性アミノ酸残基であってもよい。
前記その他のアミノ酸残基の存在位置は、膜透過性ペプチドの末端、複数の式（Ｉ）のアミノ酸残基の間、複数の式（ＩＩ）のアミノ酸残基の間、及び、式（Ｉ）のアミノ酸残基と式（ＩＩ）のアミノ酸残基との間のいずれであってもよい。その他のアミノ酸残基は、置換基として標識分子等を有していてもよい。
前記その他のアミノ酸残基を含む場合、前記その他のアミノ酸残基は、特に制限されるものではないが、１個～５個の任意のアミノ酸残基であることが好ましい。
前記その他のアミノ酸残基は、例えば、リジン（Ｌｙｓ）残基又はアルギニン（Ａｒｇ）残基であってもよく、前述した疎水性アミノ酸残基であってもよい。
前記その他のアミノ酸残基の存在位置は、膜透過性ペプチドの末端、複数の式（Ｉ）のアミノ酸残基の間、複数の式（ＩＩ）のアミノ酸残基の間、及び、式（Ｉ）のアミノ酸残基と式（ＩＩ）のアミノ酸残基との間のいずれであってもよい。その他のアミノ酸残基は、置換基として標識分子等を有していてもよい。
【0083】
本開示のＣＰＰは、当技術分野で公知の方法により調製することができる。例えば、固相ペプチド合成法、又は、非天然アミノ酸をポリペプチドに導入するための遺伝子組換え法（例えば、Taira, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 374, 304-308、Noren, C.J. et al., Science 244:182-188, 1989、特許第4917044号など）を利用できる。Ｋ、Ｆ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ及びＤａｐは、市販品として入手可能である。
【0084】
本開示のＣＰＰは、通常の固相合成法により高い収率で容易に合成でき、大量生産も可能である。
【0085】
本開示に係るＣＰＰは、導入対象の化合物（例えば、ＰＮＡ、標識物質、ＤＮＡ及びクエンチャーから選ばれる分子）と連結して微生物と接触させることにより、その化合物を微生物内に導入することができる。すなわち、ＣＰＰは、微生物内へ様々な物質を運ぶベクター又はキャリアとして機能する。なお、導入対象の化合物とは、前記ＣＰＰ以外の化合物である。
【0086】
以上、本開示のＣＰＰについて好ましい態様を挙げたが、本開示のプローブ複合体に用いるＣＰＰは、上記で例示したＣＰＰに限定されず、微生物膜透過性に影響がない限り、既知のＣＰＰを用いることもできる。
【0087】
＜ペプチド核酸＞
本開示において、ペプチド核酸（以下、ＰＮＡともいう。）とは、Ｎ－（２－アミノエチル）グリシン分子同士が、カルボキシ基とエチル基上のアミノ基とのアミド結合で結合して主鎖を構成したペプチド構造を有し、主鎖上のもう一方の窒素原子に、メチレンカルボニル結合を介して、側鎖としてプリン環又はピリミジン環が結合しているものをいう。以降、特に断りがない限り、ＰＮＡの主鎖におけるＮ末端側が、側鎖の塩基配列における５’末端側であり、ＰＮＡの主鎖におけるＣ末端側が、側鎖の塩基配列における３’末端側である。
本開示において、ペプチド核酸（以下、ＰＮＡともいう。）とは、Ｎ－（２－アミノエチル）グリシン分子同士が、カルボキシ基とエチル基上のアミノ基とのアミド結合で結合して主鎖を構成したペプチド構造を有し、主鎖上のもう一方の窒素原子に、メチレンカルボニル結合を介して、側鎖としてプリン環又はピリミジン環が結合しているものをいう。以降、特に断りがない限り、ＰＮＡの主鎖におけるＮ末端側が、側鎖の塩基配列における５’末端側であり、ＰＮＡの主鎖におけるＣ末端側が、側鎖の塩基配列における３’末端側である。
【0088】
ペプチド核酸は、微生物内に存在する核酸の塩基配列とハイブリダイズする塩基配列を有することが好ましく、微生物内に存在する核酸の塩基配列とより安定にハイブリダイズする観点から、前記ペプチド核酸の長さは５ｍｅｒ～３０ｍｅｒであることが好ましい。
【0089】
微生物は、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物（真核微生物）を含む。
【0090】
検出対象となる微生物内に存在する核酸とは、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよいが、ＲＮＡであることが好ましい。核酸同士がハイブリダイズする結合の強さは、ＰＮＡとＤＮＡとの結合よりも、ＰＮＡとＲＮＡとの結合の方が強いためである。
【0091】
検出対象となる前記ＤＮＡは、遺伝子のコード領域、遺伝子の非コード領域、又は調節領域等のいずれであってもよいが、種特異的な微生物の検出を行う観点からはｒＤＮＡ又はＩＴＳ領域であることが好ましく、ある目的の遺伝子を発現する微生物の検出を行う観点からはコード領域のＤＮＡであることが好ましい。
なおｒＤＮＡとは、リボソームＲＮＡ（rRNA）をコードしているＤＮＡである。検出対象となる前記ｒＤＮＡの種類は、種特異的な微生物の検出を行う観点から、原核生物及び古細菌の16S rDNA、又は真核微生物の18S rDNAであることが好ましい。
なおＩＴＳ領域（Internal Transcribed Spacer；内部転写領域）とは、種間での多型性が高く、近縁種を識別可能な同定マーカー遺伝子として有用な領域である。検出対象となる前記ＩＴＳ領域の種類は、真核生物のリボソームＤＮＡにおいて、18S rDNAと5.8S rDNAの間に存在するＩＴＳ１領域又は5.8S rDNAと26S rDNAの間に存在するＩＴＳ２領域のいずれであってもよく両方であってもよい。
なおｒＤＮＡとは、リボソームＲＮＡ（rRNA）をコードしているＤＮＡである。検出対象となる前記ｒＤＮＡの種類は、種特異的な微生物の検出を行う観点から、原核生物及び古細菌の16S rDNA、又は真核微生物の18S rDNAであることが好ましい。
なおＩＴＳ領域（Internal Transcribed Spacer；内部転写領域）とは、種間での多型性が高く、近縁種を識別可能な同定マーカー遺伝子として有用な領域である。検出対象となる前記ＩＴＳ領域の種類は、真核生物のリボソームＤＮＡにおいて、18S rDNAと5.8S rDNAの間に存在するＩＴＳ１領域又は5.8S rDNAと26S rDNAの間に存在するＩＴＳ２領域のいずれであってもよく両方であってもよい。
【0092】
検出対象となる前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、又はｎｃＲＮＡ等のいずれであってもよいが、種特異的な微生物の検出を行う観点からは、ｒＲＮＡ又はＩＴＳ領域から転写されたＲＮＡ等の微生物種特異的なＲＮＡ配列であることが好ましく、又は、ある目的の遺伝子を発現する微生物の検出を行う観点からはｍＲＮＡであることが好ましい。検出対象となる前記ｒＲＮＡの種類は、種特異的な微生物の検出を行う観点から、原核生物及び古細菌の16S rRNA、又は真核微生物の18S rRNAであることが好ましい。
【0093】
本開示において、「核酸Ｘと核酸Ｙとがハイブリダイズする」とは、核酸Ｘと核酸Ｙとが、相補的塩基対形成により結合することを意味する。核酸Ｘと核酸Ｙとは、細胞への導入操作を行う際の条件においてハイブリダイゼーションするものであればよい。つまり、ハイブリダイゼーションのときの温度、時間、又は溶媒等の条件は、導入操作の対象となる細胞が死滅しない条件であって、核酸Ｘと核酸Ｙとがハイブリダイゼーションできれば特に限定されない。ハイブリダイゼーションは、例えば０℃～８０℃の温度条件下で評価してもよく、５０℃～６０℃の温度条件下で評価してもよく、１０℃～５０℃の条件下で評価してもよく室温で評価してもよい。より具体的には実施例に記載の条件（０．５×ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ中で、４時間、３０℃の条件）で評価することができる。より安定的なハイブリダイゼーションをする核酸を探索する目的では、既知のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件から選定してもよく、例えば、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムが共存する条件下でハイブリダイズ可能な条件を用いてもよい。
【0094】
本開示において、「ハイブリダイズする」核酸Ｘと核酸Ｙの組み合わせにおいては、核酸Ｘ中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ａと、核酸Ｙ中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ｂとが、８０％以上の配列相補性を有することが好ましい。つまり、核酸Ｘ中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ａに含まれる塩基数のうち、８０％以上の数の塩基が、核酸Ｙ中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ｂに含まれる塩基と、相補的塩基対を形成することが好ましい。前記配列相補性（言い換えると、相補鎖との配列同一性）は、ハイブリダイズのしやすさの観点から、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。このような配列相補性条件を満たす核酸Ｘ中の連続領域Ａは、５ｍｅｒ～核酸Ｘの塩基数であってもよく、５ｍｅｒ～２０ｍｅｒであってもよい。核酸Ｙ中の連続領域Ｂは、５ｍｅｒ～核酸Ｙの塩基数であってもよく、５ｍｅｒ～２０ｍｅｒであってもよい。核酸Ｘ中の連続領域Ａ及び核酸Ｙ中の連続領域Ｂの長さの下限値は５ｍｅｒであってもよく、６ｍｅｒであってもよく、７ｍｅｒであってもよく、８ｍｅｒであってもよく、９ｍｅｒであってもよく、１０ｍｅｒであってもよい。核酸Ｘ中の連続領域Ａ及び核酸Ｙ中の連続領域Ｂの長さの上限値は、核酸Ｘの長さ及び核酸Ｙの長さのうち短い方の塩基数であってもよく、２０ｍｅｒであってもよく、１８ｍｅｒであってもよく、１５ｍｅｒであってもよく、１３ｍｅｒであってもよく、１０ｍｅｒであってもよい。これらの上限値と下限値は、自由な組み合わせで組み合わせることができる。
ＰＮＡと、検出対象となる微生物内に存在する核酸とは、上記のようなハイブリダイゼーション特性を有することが好ましく、また、上記のような配列相補性条件を満たす連続領域を有していることが好ましい。
ＰＮＡと、検出対象となる微生物内に存在する核酸とは、上記のようなハイブリダイゼーション特性を有することが好ましく、また、上記のような配列相補性条件を満たす連続領域を有していることが好ましい。
【0095】
本開示において、塩基の配列相補性の算出は、Biomatter社が提供している配列情報マルチ解析ソフトウエアGeneious Primeを用いて行うことができる。
【0096】
本開示において、ＰＮＡの長さは、微生物内に存在する核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズする観点からは長いほうが好ましく、微生物内に導入されやすい観点からは短いほうが好ましい。本開示において、ＰＮＡの長さは、５ｍｅｒ～３０ｍｅｒが好ましく、５ｍｅｒ～２５ｍｅｒがより好ましく、５ｍｅｒ～２０ｍｅｒがさらに好ましく、８ｍｅｒ～１５ｍｅｒが特に好ましく、１０ｍｅｒ～１２ｍｅｒがより一層好ましい。微生物内へ高効率で導入できる（ＤａｂＦＦ）３ＤａｂなどのＣＰＰが付加されたＰＮＡである場合は、ＰＮＡの長さは、５ｍｅｒ～３０ｍｅｒが好ましく、５ｍｅｒ～２５ｍｅｒがより好ましく、５ｍｅｒ～２０ｍｅｒがさらに好ましく、１０ｍｅｒ～１５ｍｅｒが特に好ましく、より塩基長が長いＰＮＡ（つまり、より特異性を有するＰＮＡ）を設計することができる。ＰＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡと比較して、高い配列特異性を有しているため、短い長さのＰＮＡでも十分に特異性を有し、より長いＰＮＡにすることで、さらに特異性を上げることができる。
【0097】
＜標識物質＞
標識物質の種類は特に制限されず、蛍光分子等の公知の標識物質を適用できる。
標識物質の種類は特に制限されず、蛍光分子等の公知の標識物質を適用できる。
【0098】
標識物質は、例えば、検出感度、材料設計容易性、及び後述するクエンチャーとの標識能のＯＮ／ＯＦＦ調整のしやすさ等の観点から、蛍光分子を含むことが好ましい。
蛍光分子は、励起光で照射されることにより蛍光を発する分子であれば何でもよく、例えば、Cy3、Cy5、FITC、TRITC、Rhodamine、TAMRA、Alexa Fluor、Texas Red、FAM、APC、PE、ATTO、DyLightなど公知の蛍光分子を用いることができる。
蛍光分子は、励起光で照射されることにより蛍光を発する分子であれば何でもよく、例えば、Cy3、Cy5、FITC、TRITC、Rhodamine、TAMRA、Alexa Fluor、Texas Red、FAM、APC、PE、ATTO、DyLightなど公知の蛍光分子を用いることができる。
【0099】
標識物質は、蛍光分子を任意の位置に付加しやすい観点から、アミノ酸残基の側鎖又は末端アミノ酸残基のアミノ基若しくはカルボキシ基に、蛍光分子が結合しているものが好ましい。具体的には、前記標識物質としては、リジン残基の側鎖上のアミノ基に置換した５（６）－カルボキシフルオレセイン、又は、アルギニン残基の側鎖上のアミノ基に置換した５（６）－カルボキシフルオレセインが好ましく、５（６）－カルボキシフルオレセインが側鎖上のアミノ基に置換したリジン残基がより好ましい。なお５（６）－カルボキシフルオレセインが側鎖上のアミノ基に置換したリジン残基がペプチド鎖末端のアミノ酸残基である場合、前記リジン残基は末端保護基（例えばＣ末端へのアミノ保護基、Ｎ末端へのアセチル保護基等）を有していてもよい。つまり、前記リジン残基がプローブのＣ末端のアミノ酸残基の場合、さらにリジン残基のＣ末端側に、アミノ基などの末端保護基を有していてもよい。なお以下に、側鎖上のアミノ基が５（６）－カルボキシフルオレセインに置換され、さらにＣ末端側に末端保護基としてアミノ基を有するリジン残基の構造式を示す。なお式中、＊は、隣接する化学構造との結合部位を示す。本開示において、５（６）－カルボキシフルオレセインは、５（６）－ＦＡＭ又はＦＡＭともいう。以下の構造式に示すような、側鎖上のアミノ基が５（６）－カルボキシフルオレセインに置換されたリジンを、Ｋ-ＦＡＭ又はＫ（ＦＡＭ）とも表す。標識物質が置換したアミノ酸残基は、例えば、ＰＮＡのＮ末端側又はＣ末端側に付加することができる。
【0100】
【化5】
【0101】
＜ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸＞
ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸は、ペプチド核酸と少なくとも１つ以上の塩基でハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。
ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸は、ペプチド核酸と少なくとも１つ以上の塩基でハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。
【0102】
ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸の長さは、ハイブリダイズのしやすさの観点から、５ｍｅｒ～２０ｍｅｒであることが好ましい。
ペプチド核酸と前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸は、上記のようなハイブリダイゼーション特性を有することが好ましく、また、上記のような配列相補性条件を満たす連続領域を有していることが好ましい。
例えば、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸の塩基配列中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ａは、前記ペプチド核酸の塩基配列中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ｂと８０％以上の配列相補性を有することが好ましい。
ペプチド核酸と前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸は、上記のようなハイブリダイゼーション特性を有することが好ましく、また、上記のような配列相補性条件を満たす連続領域を有していることが好ましい。
例えば、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸の塩基配列中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ａは、前記ペプチド核酸の塩基配列中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ｂと８０％以上の配列相補性を有することが好ましい。
【0103】
ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸は、ＰＮＡ中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ａと、前記ＤＮＡ中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ｂとが、８０％以上の配列相補性を有することが好ましい。つまり、前記ＰＮＡ中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ａに含まれる塩基数のうち、８０％以上の数の塩基が、前記ＤＮＡ中の５ｍｅｒ以上の連続領域Ｂに含まれる塩基と、相補的塩基対を形成することが好ましい。前記配列相補性は、ハイブリダイズのしやすさの観点から、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
【0104】
本開示における塩基の配列相補性の算出は、Biomatter社が提供している配列情報マルチ解析ソフトウエアGeneious Primeを用いて行うことができる。
【0105】
本開示のＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡの長さは、ＰＮＡとのハイブリダイズ状態を維持してプローブ複合体として安定できる観点から、長いほうが好ましく、微生物内に存在する任意の塩基配列とのハイブリダイズへ移行しやすい観点からは、ある程度短いほうが好ましい。本開示のＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡの長さは、５ｍｅｒ～２０ｍｅｒが好ましく、６ｍｅｒ～１５ｍｅｒがより好ましく、７ｍｅｒ～１２ｍｅｒがさらに好ましい。本開示のＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡの長さは、前記ＰＮＡの長さを上限とするのがよい。
【0106】
本開示のＰＮＡと、前記ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとは、上記相補性条件を満たす連続領域を含んでいればよく、上記相補性条件を満たさない余分な塩基配列が含まれていてもよい。
【0107】
本開示のＰＮＡと、前記ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとのミスマッチ塩基数は、プローブ複合体として安定できる観点から、１ｍｅｒ～３ｍｅｒが好ましく、１ｍｅｒ又は２ｍｅｒがより好ましく、１ｍｅｒがさらに好ましい。
【0108】
＜クエンチャー＞
本開示において、クエンチャーとは、前記標識物質の標識効果を、抑制又は消去することができる物質をいう。
本開示において、標識物質に対するクエンチャーとは、前記標識物質の標識効果を、抑制又は消去することができるクエンチャーをいう。
本開示においてクエンチャーは、標識物質が蛍光物質である場合、前記蛍光分子から発される蛍光を、抑制又は消光できる物質である。
本開示において、クエンチャーとは、前記標識物質の標識効果を、抑制又は消去することができる物質をいう。
本開示において、標識物質に対するクエンチャーとは、前記標識物質の標識効果を、抑制又は消去することができるクエンチャーをいう。
本開示においてクエンチャーは、標識物質が蛍光物質である場合、前記蛍光分子から発される蛍光を、抑制又は消光できる物質である。
【0109】
本開示における標識物質が蛍光物質である場合、クエンチャーは、前記標識物質の標識効果を、抑制又は消去することができる物質であれば特に限定されず、例えば、Black Hole Quencher-1（BHQ-1）又はBlack Hole Quencher-2（BHQ-2）などの公知の市販されているものを用いることができる。なかでも、標識物質がＦＡＭである場合、クエンチャーはBHQ-1が好ましい。標識物質がＴＡＭＲＡ（５（６）－カルボキシテトラメチルローダミン）である場合、クエンチャーはBHQ-2が好ましい。
以下、クエンチャーを「Ｑ」と示し、クエンチャープローブを「Ｑ１」と示すことがある。
以下、クエンチャーを「Ｑ」と示し、クエンチャープローブを「Ｑ１」と示すことがある。
【0110】
＜プローブ複合体（ｉ）＞
本開示のプローブ複合体は、
（ｉ）ペプチド核酸及び標識物質を含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び前記標識物質に対するクエンチャーを含む第二のプローブとを含み、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含むプローブ複合体（プローブ複合体（ｉ））であってもよい。
本開示のプローブ複合体は、
（ｉ）ペプチド核酸及び標識物質を含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び前記標識物質に対するクエンチャーを含む第二のプローブとを含み、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含むプローブ複合体（プローブ複合体（ｉ））であってもよい。
【0111】
本開示のプローブ複合体（ｉ）は、
第一のプローブと第二のプローブとを含む複合体であって、前記第一のプローブが、膜透過性ペプチドと、ペプチド核酸と、標識物質とを含み、前記第二のプローブが、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸と、クエンチャーとを含む複合体（プローブ複合体（ｉ－ａ））であってもよい。
また、本開示のプローブ複合体（ｉ）は、
第一のプローブと第二のプローブとを含む複合体であって、前記第一のプローブが、ペプチド核酸と、標識物質とを含み、前記第二のプローブが、膜透過性ペプチドと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸と、クエンチャ―とを含む複合体（プローブ複合体（ｉ－ｂ））であってもよい。
第一のプローブと第二のプローブとを含む複合体であって、前記第一のプローブが、膜透過性ペプチドと、ペプチド核酸と、標識物質とを含み、前記第二のプローブが、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸と、クエンチャーとを含む複合体（プローブ複合体（ｉ－ａ））であってもよい。
また、本開示のプローブ複合体（ｉ）は、
第一のプローブと第二のプローブとを含む複合体であって、前記第一のプローブが、ペプチド核酸と、標識物質とを含み、前記第二のプローブが、膜透過性ペプチドと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸と、クエンチャ―とを含む複合体（プローブ複合体（ｉ－ｂ））であってもよい。
【0112】
（第一のプローブ）
プローブ複合体（ｉ）において、第一のプローブは、ＰＮＡと、標識物質と、を少なくとも含み、さらに、プローブ複合体（１－ａ）の場合にはＣＰＰを含む。プローブ複合体（ｉ）の第一のプローブにおいて、ＣＰＰと、ＰＮＡと、標識物質との連結順は特に限定されないが、第一のプローブのＮ末端側から、ＣＰＰ、ＰＮＡ、標識物質の順で連結されていることが好ましい。
プローブ複合体（ｉ）において、第一のプローブは、ＰＮＡと、標識物質と、を少なくとも含み、さらに、プローブ複合体（１－ａ）の場合にはＣＰＰを含む。プローブ複合体（ｉ）の第一のプローブにおいて、ＣＰＰと、ＰＮＡと、標識物質との連結順は特に限定されないが、第一のプローブのＮ末端側から、ＣＰＰ、ＰＮＡ、標識物質の順で連結されていることが好ましい。
【0113】
プローブ複合体（ｉ）の第一のプローブは、上記のＣＰＰ、ＰＮＡ、及び標識物質に加えて、リンカーを有していてもよい。リンカーは、ＣＰＰとＰＮＡの間、又はＰＮＡと標識物質の間を連結していてもよい。プローブ複合体（ｉ）の第一のプローブにおけるリンカーとしては、エチレングリコール１（ｅｇ１又はｏリンカーともいう。）、又は、システイン残基が挙げられるがこれらに限定されない。なおｅｇ１リンカーの構造式を以下に示す。なお式中、＊は、隣接する化学構造との結合部位を示す。下記の構造式中、左側が他のペプチド鎖のＣ末端側と結合する側を示し、右側が他のペプチド鎖のＮ末端側と結合する側を示す。
【0114】
【化6】
【0115】
プローブ複合体（ｉ）の第一のプローブにおいては、Ｎ末端側から、ＣＰＰ-ｅｇ１-ＰＮＡ-標識物質、又は、ＣＰＰ-システイン残基-ＰＮＡ-標識物質、の順で連結されていることが好ましい。
【0116】
プローブ複合体（ｉ）の第一のプローブにおいては、図２に示すように、Ｎ末端側から、(KFF)3K-eg1-PNA-K-FAMであることが、微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を、微生物を生きた状態に維持したまま高効率で特異的に検出することができる観点から、好ましい。なお図中、Ｏは、ｅｇ１であることを示す。又は、プローブ複合体（ｉ）の第一のプローブにおいては、図３に示すように、Ｎ末端側から、(DabFF)3Dab-システイン残基-PNA-K-FAMであることが、微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を、微生物を生きた状態に維持したまま高効率で特異的に検出することができる観点から、好ましい。
【0117】
（第二のプローブ）
プローブ複合体（ｉ）の第二のプローブは、ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸と、クエンチャーとを含む。プローブ複合体（ｉ）の第二のプローブにおいて、ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡと、クエンチャーとの連結順は特に限定されないが、第二のプローブの５’末端側から、クエンチャー、ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、の順で連結されていることが好ましい。
プローブ複合体（ｉ）の第二のプローブは、ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸と、クエンチャーとを含む。プローブ複合体（ｉ）の第二のプローブにおいて、ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡと、クエンチャーとの連結順は特に限定されないが、第二のプローブの５’末端側から、クエンチャー、ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、の順で連結されていることが好ましい。
【0118】
プローブ複合体（ｉ）の第二のプローブは、上記のＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、及びクエンチャーに加えて、リンカーを有していてもよい。リンカーは、ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡと、クエンチャーと、の間を連結していてもよい。
本開示において、第二のプローブは、図４に示すように、５’末端側から、クエンチャー－ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、の順で連結されていることが好ましい。なお図中、Ｑは、クエンチャーを示す。
本開示において、第二のプローブは、図４に示すように、５’末端側から、クエンチャー－ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、の順で連結されていることが好ましい。なお図中、Ｑは、クエンチャーを示す。
【0119】
＜プローブ複合体（ｉｉ）＞
本開示のプローブ複合体は、
（ｉｉ）ペプチド核酸及びクエンチャーを含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び標識物質を含む第二のプローブとを含み、前記クエンチャーは前記標識物質に対するクエンチャーであり、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、プローブ複合体（プローブ複合体（ｉｉ））であってもよい。
本開示のプローブ複合体は、
（ｉｉ）ペプチド核酸及びクエンチャーを含む第一のプローブと、前記ペプチド核酸とハイブリダイズするデオキシリボ核酸及び標識物質を含む第二のプローブとを含み、前記クエンチャーは前記標識物質に対するクエンチャーであり、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの少なくとも一方は膜透過性ペプチドを含む、プローブ複合体（プローブ複合体（ｉｉ））であってもよい。
【0120】
本開示のプローブ複合体（ｉｉ）は、
第一のプローブと第二のプローブとを含む複合体であって、前記第一のプローブが、ＣＰＰと、ＰＮＡと、クエンチャーとを含み、前記第二のプローブが、前記ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡと、標識物質とを含む複合体（プローブ複合体（ｉｉ－ａ））であってもよい。
また、本開示のプローブ複合体（ｉｉ）は、
第一のプローブと第二のプローブとを含む複合体であって、前記第一のプローブが、ＰＮＡと、クエンチャーとを含み、前記第二のプローブが、ＣＰＰと、前記ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡと、標識物質とを含む複合体（プローブ複合体（ｉｉ－ｂ））であってもよい。
第一のプローブと第二のプローブとを含む複合体であって、前記第一のプローブが、ＣＰＰと、ＰＮＡと、クエンチャーとを含み、前記第二のプローブが、前記ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡと、標識物質とを含む複合体（プローブ複合体（ｉｉ－ａ））であってもよい。
また、本開示のプローブ複合体（ｉｉ）は、
第一のプローブと第二のプローブとを含む複合体であって、前記第一のプローブが、ＰＮＡと、クエンチャーとを含み、前記第二のプローブが、ＣＰＰと、前記ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡと、標識物質とを含む複合体（プローブ複合体（ｉｉ－ｂ））であってもよい。
【0121】
プローブ複合体（ｉｉ）において、第一のプローブにおける各構成要素の連結順、及び第二のプローブにおける各構成要素の連結順は、上記プローブ複合体（ｉ）の場合と同様、特に限定されない。第一のプローブにおいては、第一のプローブのＮ末端側から、ＣＰＰ、ＰＮＡ、クエンチャー、の順で連結されていることが好ましい。第二のプローブにおいては、第二のプローブの５’末端側から、標識物質、ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、の順で連結されていることが好ましい。
プローブ複合体（ｉｉ）の第一のプローブ及び第二のプローブにおいては、上記のＣＰＰ、ＰＮＡ、クエンチャー、ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、標識物質に加えて、これらの構成要素同士を連結するリンカーを有していてもよい。リンカーの例も、上記プローブ複合体（ｉ）におけるリンカーと同様に、エチレングリコール１（ｅｇ１又はｏリンカーともいう。）、又は、システイン残基が挙げられるがこれらに限定されない。
プローブ複合体（ｉｉ）の第一のプローブ及び第二のプローブにおいては、上記のＣＰＰ、ＰＮＡ、クエンチャー、ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ、標識物質に加えて、これらの構成要素同士を連結するリンカーを有していてもよい。リンカーの例も、上記プローブ複合体（ｉ）におけるリンカーと同様に、エチレングリコール１（ｅｇ１又はｏリンカーともいう。）、又は、システイン残基が挙げられるがこれらに限定されない。
【0122】
（その他）
本開示の第一のプローブ及び第二のプローブがプローブ複合体を形成する時に、前記第一のプローブ又は前記第二のプローブに含まれる標識物質及びクエンチャーが近接するように、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブを設計されていることが好ましい。これにより、本開示の第一のプローブ又は第二のプローブがプローブ複合体を形成しているときに、クエンチャーによって標識物質の標識効果を抑制又は消去することができる。
本開示の第一のプローブ及び第二のプローブがプローブ複合体を形成する時に、前記第一のプローブ又は前記第二のプローブに含まれる標識物質及びクエンチャーが近接するように、前記第一のプローブ及び前記第二のプローブを設計されていることが好ましい。これにより、本開示の第一のプローブ又は第二のプローブがプローブ複合体を形成しているときに、クエンチャーによって標識物質の標識効果を抑制又は消去することができる。
【0123】
本開示の第一のプローブ又は第二のプローブには、さらに、タンパク質、ＣＰＰ、ペプチド、アミノ酸、核酸、ペプチド核酸、無機物、有機金属化合物、有機化合物、高分子、ナノ粒子、糖若しくは標識物質、又は、ミセル若しくはリポソームの一方を含む分子集合体等が付加されていてもよい。例えば、本開示のプローブ複合体（ｉ）の第一のプローブ、又は本開示のプローブ複合体（ｉｉ）の第一のプローブにおいて、Ｎ末端側及びＣ末端側の両方にＣＰＰを有していてもよい。例えば、本開示のプローブ複合体（ｉ）の第一のプローブ、又は本開示のプローブ複合体（ｉｉ）の第二のプローブにおいて、Ｎ末端側及びＣ末端側の両方に標識物質を有していてもよい。
【0124】
本開示の第一のプローブ又は第二のプローブのＮ末端側又はＣ末端側には、さらに、保護基が付加されていてもよい。保護基は、例えば、アセチル基、カルボキシ基、又はアミノ基であってもよい。なお本開示のプローブの配列の表記において、保護基を省略して記載する場合がある。例えば、側鎖上のアミノ基が５（６）－カルボキシフルオレセインに置換され、さらにＣ末端側に末端保護基としてアミノ基を有するリジン残基を、[K-FAM]又は [K-FAM]-NH2と表記することがある。
【0125】
本開示のプローブ複合体は、公知の技術を組み合わせることで作製することができる。ＣＰＰは、通常のペプチド合成方法を利用することができる。ＰＮＡは、通常のペプチド核酸合成方法を利用することができる。標識物質は、市販のものを利用することができる。ＰＮＡとハイブリダイズするＤＮＡは、通常の核酸合成方法を利用して作製することができる。クエンチャーは、市販のものを利用することができる。
例えば、ＣＰＰ及びＰＮＡは、ｅｇ１を介して連結することができ、又は、あらかじめＣＰＰのＣ末端側をチオエステル化して、ＰＮＡのＮ末端側にシステイン残基を付加して、これらをトランスチオエステル化することで、ＣＰＰとＰＮＡを結合することができる。
例えば、ＣＰＰ及びＰＮＡは、ｅｇ１を介して連結することができ、又は、あらかじめＣＰＰのＣ末端側をチオエステル化して、ＰＮＡのＮ末端側にシステイン残基を付加して、これらをトランスチオエステル化することで、ＣＰＰとＰＮＡを結合することができる。
【0126】
≪特定微生物の検出剤≫
本開示に係る特定微生物の検出剤は、本開示に係るプローブ複合体を含む。
本開示に係る特定微生物の検出剤は、本開示に係るプローブ複合体を含む。
【0127】
本開示に係る特定微生物の検出剤によれば、本開示のプローブ複合体が微生物内に導入され、微生物内に目的の塩基配列がある場合に、プローブ複合体は自発的に第一のプローブと第二のプローブに解離して標識物質の標識が発するシグナルが検出される。その結果、生きている微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を検出することができる。
【0128】
本開示に係る特定微生物の検出剤におけるプローブ複合体の好ましい態様は、本開示に係るプローブ複合体における好ましい態様と同様である。
【0129】
特定微生物は、検出容易性の観点から、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【0130】
細菌（真正細菌）は、細胞膜の外側に外膜を有するか否かで、グラム陰性細菌とグラム陽性細菌とに分類されるが、本開示に係るプローブ複合体は、グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の両方の細菌に対して、検出剤として適用できる。
【0131】
細菌としては、特に限定されないが、例えば、パントエア属、エンテロバクター科、シトロバクター属、シネコシスティス属、シュードモナス属、アシネトバクター属又はバチラス属等の細菌が挙げられるがこれらに限定されない。
エンテロバクター科の細菌としては、例えば、エスケリキア属、エルシニア属、セラチア属、トラブルシエラ属、エンテロバクター属又はプロテウス属等に属する細菌が挙げられる。
パントエア属に属する細菌としては、特に限定されないが、例えば、パントエア・アグロメランス等が挙げられる。アシネトバクター属に属する細菌としては、特に限定されないが、例えば、アシネトバクター・ラジオレジステンス等が挙げられる。エスケリキア属に属する細菌としては、特に限定されないが、例えば、エスケリキア・コリ等が挙げられる。
エンテロバクター科の細菌としては、例えば、エスケリキア属、エルシニア属、セラチア属、トラブルシエラ属、エンテロバクター属又はプロテウス属等に属する細菌が挙げられる。
パントエア属に属する細菌としては、特に限定されないが、例えば、パントエア・アグロメランス等が挙げられる。アシネトバクター属に属する細菌としては、特に限定されないが、例えば、アシネトバクター・ラジオレジステンス等が挙げられる。エスケリキア属に属する細菌としては、特に限定されないが、例えば、エスケリキア・コリ等が挙げられる。
【0132】
古細菌としては、特に限定されないが、例えば、好熱好酸菌などが含まれるクレン古細菌門、亜硝酸古細菌などが含まれるタウム古細菌門、高度好塩菌、メタン菌、超好熱菌、及び好熱好酸菌などが含まれるユーリ古細菌門等が挙げられる。古細菌としては、特に、メタノバクテリウム属又はハロコックス属が好ましい。
【0133】
微細藻類としては、特に限定されないが、例えば、藍色植物門、灰色植物門、紅色植物門、緑色植物門、クリプト植物門、ハプト植物門、不等毛植物門、渦鞭毛植物門、ユーグレナ植物門、又はクロララクニオン植物門等が挙げられる。微細藻類としては、特に、ハプト藻綱又はボトリオコッカス属が好ましい。ハプト藻綱としては、イソクリシス属が好ましい。
【0134】
菌類（真菌）としては、特に限定されないが、例えば、キノコ・カビ、単細胞性の酵母、鞭毛を持った遊走子などの多様な形態を示す真核の微生物等が挙げられる。
【0135】
酵母としては、特に限定されないが、例えば、分裂酵母、出芽酵母等が挙げられる。
【0136】
粘菌としては、特に制限されないが、例えば、細胞性粘菌、真正粘菌、原性粘菌等が挙げられる。
【0137】
上記の中でも、前記特定微生物は、エンテロバクター属の細菌、シトロバクター属の細菌、パントエア属の細菌、アシネトバクター属の細菌、エスケリキア属の細菌、微生物有用性化合物を産生する細菌、及び腸内細菌に病原性細菌の細菌、並びに、ハプト藻綱の微生物であることが好ましく、エンテロバクター属の細菌、シトロバクター属の細菌、パントエア属の細菌、アシネトバクター属の細菌、及びエスケリキア属の細菌、並びに、ハプト藻綱の微生物からなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
【0138】
本開示の検出剤は、本開示に係るプローブ複合体を１種用いていればよく、本開示に係るプローブ複合体を２種以上併用していてもよい。本開示に係るプローブ複合体以外のその他のプローブを含んでいてもよい。
例えば、ＰＮＡの塩基配列が異なるもの、又は、異なる波長で発光する蛍光分子など、複数種類のプローブ複合体を組み合わせることで、複数種の微生物を同時に検出する検出剤としてもよい。
また、多数の種類の微生物が存在する試料の中から、特定微生物を検出する場合には、プローブ複合体を２種以上併用することが好ましい。多数の種類の微生物を含む試料の中には、特定微生物を検出するための目的となる塩基配列と類似した塩基配列を有する他の微生物が混在している可能性があることから、その場合には、１種類のプローブ複合体を用いただけでは、特定微生物でない微生物も誤って検出してしまう可能性がある。そのため、特定微生物を検出するための目的となる塩基配列を２か所以上設定し、それらの塩基配列に相補性のある配列を有する２種以上のプローブ複合体を用いることで、より高い精度で特定微生物を検出することが可能となる。
例えば、ＰＮＡの塩基配列が異なるもの、又は、異なる波長で発光する蛍光分子など、複数種類のプローブ複合体を組み合わせることで、複数種の微生物を同時に検出する検出剤としてもよい。
また、多数の種類の微生物が存在する試料の中から、特定微生物を検出する場合には、プローブ複合体を２種以上併用することが好ましい。多数の種類の微生物を含む試料の中には、特定微生物を検出するための目的となる塩基配列と類似した塩基配列を有する他の微生物が混在している可能性があることから、その場合には、１種類のプローブ複合体を用いただけでは、特定微生物でない微生物も誤って検出してしまう可能性がある。そのため、特定微生物を検出するための目的となる塩基配列を２か所以上設定し、それらの塩基配列に相補性のある配列を有する２種以上のプローブ複合体を用いることで、より高い精度で特定微生物を検出することが可能となる。
【0139】
本開示の検出剤は、本開示に係るプローブ複合体以外にも、さらに、溶媒、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、無機物、有機金属化合物、有機化合物、高分子、ナノ粒子、糖若しくは標識物質、又は、ミセル若しくはリポソームの一方を含む分子集合体等と一緒に用いられてもよい。
【0140】
≪特定微生物の検出方法≫
本開示に係る特定微生物の検出方法は、本開示に係るプローブ複合体を、微生物内に導入することと、微生物内に導入された前記標識物質が発するシグナルを検出することとを含む、前記ペプチド核酸とハイブリダイズする核酸塩基配列を有する特定微生物の検出方法である。
本開示に係る特定微生物の検出方法は、本開示に係るプローブ複合体を、微生物内に導入することと、微生物内に導入された前記標識物質が発するシグナルを検出することとを含む、前記ペプチド核酸とハイブリダイズする核酸塩基配列を有する特定微生物の検出方法である。
【0141】
本開示に係る特定微生物の検出方法によれば、本開示のプローブ複合体が微生物内に導入され、微生物内に目的の塩基配列がある場合に、プローブ複合体は自発的に第一のプローブと第二のプローブに解離して標識物質の標識が発するシグナルが検出される。その結果、生きている微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を検出することができる。
【0142】
特定微生物は、検出容易性の観点から、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【0143】
本開示において、プローブ複合体を微生物内に導入する手法とは、プローブ複合体を微生物内に導入することができれば、特に限定されない。
本開示において、プローブ複合体を微生物内に導入する手法は、本開示のプローブ複合体を微生物と接触させることができれば、特に限定されない。
本開示において、プローブ複合体を微生物内に導入する手法は、本開示のプローブ複合体を微生物と接触させることができれば、特に限定されない。
【0144】
本開示において「接触」は、微生物とプローブ複合体とが接触する条件に置くことを指し、当業者であれば明確に理解することができる。
プローブ複合体と微生物とを接触させる手段は、特に制限されず、使用する微生物の種類、プローブ複合体に含まれる化合物の種類などに応じて、当業者であれば適当な条件で実施することができる。例えば、プローブ複合体と微生物とを接触させる手段としては、下記（１）～（３）等の手法が挙げられる。
（１）微生物を、プローブ複合体を添加した培地中で培養する手法。
（２）微生物を、プローブ複合体を含む溶液中に添加若しくは浸漬する手法。
（３）微生物上に、プローブ複合体を積層させる手法。
プローブ複合体と微生物とを接触させる手段は、特に制限されず、使用する微生物の種類、プローブ複合体に含まれる化合物の種類などに応じて、当業者であれば適当な条件で実施することができる。例えば、プローブ複合体と微生物とを接触させる手段としては、下記（１）～（３）等の手法が挙げられる。
（１）微生物を、プローブ複合体を添加した培地中で培養する手法。
（２）微生物を、プローブ複合体を含む溶液中に添加若しくは浸漬する手法。
（３）微生物上に、プローブ複合体を積層させる手法。
【0145】
プローブ複合体と微生物とを接触させる際の具体的な条件、つまり、微生物とプローブ複合体との接触時間、量、回数、温度、ｐＨ、光、塩濃度、添加物濃度等は、公知の条件に基づいて適宜設計してよい。
【0146】
プローブ複合体と微生物とを接触させる際の温度等の条件としては、対象となる微生物が死滅しない条件であって、プローブ複合体が前記微生物に導入される条件が好ましい。プローブ複合体と微生物とを接触させる際の条件は、例えば０℃～８０℃の温度条件下で接触させてもよく、５０℃～６０℃の温度条件下で接触させてもよく、１０℃～５０℃の条件下で接触させてもよい。なお微生物が生きた状態に維持したまま本開示のプローブ複合体を導入する観点から、プローブ複合体と微生物とを、室温で接触させることが好ましい。本開示における室温としては、１０℃～４０℃が好ましく、１５℃～３５℃がより好ましく、２０℃～３０℃がさらに好ましい。ただし、本開示のプローブ複合体を微生物内に導入する手法において、任意の塩基配列を有する微生物の至適温度が上記のような室温ではない場合、前記微生物の至適温度を勘案して、プローブ複合体の導入時の温度を適宜決定することができる。
【0147】
接触させるプローブ複合体は、１種類でもよいし、又は複数種類を組み合わせてもよい。複数種類のプローブ複合体を組み合わせることで、例えば、複数種の微生物を同時に検出する、又は、より精度の高い特定微生物の検出方法とすることができる。
【0148】
本開示において、微生物内に導入された前記標識物質が発するシグナルを検出する手法とは、微生物内に導入された前記標識物質が発するシグナルを検出することができれば、その方法は特に限定されない。例えば、標識物質が蛍光分子である場合、透過型蛍光顕微鏡又は落射型蛍光顕微鏡を用いて、特定波長の励起光を照射し、蛍光を検出することができる。その他、フローサイトメトリーを用いて蛍光を検出してもよい。
【0149】
本開示の検出方法における特定微生物とは、本開示の前記検出剤に記載の特定微生物と同様のものをいう。
≪プローブ複合体の用途≫
本開示のプローブ複合体、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブは、それぞれ特定微生物を検出するために使用することができる。
≪プローブ複合体の用途≫
本開示のプローブ複合体、前記プローブ複合体に含まれる第一のプローブ又は第二のプローブは、それぞれ特定微生物を検出するために使用することができる。
【0150】
本開示に係るプローブ複合体の使用における特定微生物とは、本開示に係る検出剤に記載の特定微生物と同様のものをいう。
【0151】
特定微生物は、検出容易性の観点から、真正細菌及び古細菌を含む原核生物、並びに微細藻類、原生生物、菌類、真菌、酵母、及び粘菌を含む真核の微生物からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【0152】
≪特定微生物の分離方法≫
本開示の特定微生物の分離方法は、本開示のプローブ複合体を用いて２種以上の微生物を含む微生物群から特定微生物を検出することと、前記特定微生物を前記微生物群から分離することと、含む、分離方法である。
本開示の特定微生物の分離方法によれば、生きている特定微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を検出した後に、前記生きている特定微生物を分離することができる。
本開示の特定微生物の分離方法は、本開示のプローブ複合体を用いて２種以上の微生物を含む微生物群から特定微生物を検出することと、前記特定微生物を前記微生物群から分離することと、含む、分離方法である。
本開示の特定微生物の分離方法によれば、生きている特定微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を検出した後に、前記生きている特定微生物を分離することができる。
【0153】
本開示に係る特定微生物の分離方法におけるプローブ複合体の好ましい態様は、本開示に係るプローブ複合体における好ましい態様と同様である。
本開示に係る特定微生物の分離方法における特定微生物の好ましい態様は、本開示に係る検出剤における特定微生物の好ましい態様と同様である。
本開示に係る特定微生物の分離方法における特定微生物の好ましい態様は、本開示に係る検出剤における特定微生物の好ましい態様と同様である。
【0154】
特定微生物を前記微生物群から分離する方法は、特に制限されず、フローサイトメトリー法、限界希釈法、マイクロマニピュレーション法、マイクロ流体デバイスによる自動分離法等の公知の分離方法が適用できる。上記の中でも、分離方法としては、特定微生物の検出と分離を同じ装置で行える効率性、特定微生物の細胞生存率の低下を小さく抑える観点などから、フローサイトメトリー法が好ましい。
【実施例0155】
以下に実施例を例示し、本開示を具体的に説明するが、この実施例は単に本開示の説明のために提供するものであり、本出願において開示する発明の範囲を制限したりするものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。
【0156】
［実施例１］特異的プローブの合成
下記２種類の配列の膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）をそれぞれ準備した。
（ＫＦＦ）３Ｋ ：ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ（配列番号２３）
（ＤａｂＦＦ）３Ｄａｂ：ＤａｂＦＦＤａｂＦＦＤａｂＦＦＤａｂ（配列番号１１）
下記２種類の配列の膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）をそれぞれ準備した。
（ＫＦＦ）３Ｋ ：ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ（配列番号２３）
（ＤａｂＦＦ）３Ｄａｂ：ＤａｂＦＦＤａｂＦＦＤａｂＦＦＤａｂ（配列番号１１）
【0157】
ＰＮＡの塩基配列は、Pantoea agglomerans NBRC102470の塩基配列とハイブリダイズするようにGeneious Primeを用いてデザインし、オンラインデータベース（SILVA rRNAデータベース内のTest Probe機能）を参考に選定し、１０ｍｅｒのＰＮＡである5'-ccccatcgcc-3'（配列番号２５）を採用した。
【0158】
（特異的プローブ１の合成）
前記ＰＮＡのＮ末端側（つまり５’末端側）に、エチレングリコール１（ｅｇ１）リンカーを付加させ、さらに前記ｅｇ１リンカーの先のＮ末端側にＣＰＰを付加させた。続いて、ＰＮＡのＣ末端側（つまり３’末端側）に、５（６）－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）が側鎖に付加されたリジン（Ｋ-ＦＡＭ）を結合させたものを、ペプチド固相合成法にて得た。なお、合成はPanagene社に委託した。
上記操作により、以下に示す特異的プローブ１を得た。なお以下に示す特異的プローブ１において、左側がＮ末端側（つまり５’末端側）である。
特異的プローブ１：5'-[(KFF)3K]―[eg1]―[PNA]―[K-FAM]-3'
前記ＰＮＡのＮ末端側（つまり５’末端側）に、エチレングリコール１（ｅｇ１）リンカーを付加させ、さらに前記ｅｇ１リンカーの先のＮ末端側にＣＰＰを付加させた。続いて、ＰＮＡのＣ末端側（つまり３’末端側）に、５（６）－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）が側鎖に付加されたリジン（Ｋ-ＦＡＭ）を結合させたものを、ペプチド固相合成法にて得た。なお、合成はPanagene社に委託した。
上記操作により、以下に示す特異的プローブ１を得た。なお以下に示す特異的プローブ１において、左側がＮ末端側（つまり５’末端側）である。
特異的プローブ１：5'-[(KFF)3K]―[eg1]―[PNA]―[K-FAM]-3'
【0159】
（特異的プローブ２の合成）
前記ＰＮＡのＮ末端側（つまり５’末端側）に、システインを付加させ、さらに前記システインのＮ末端側にＣＰＰを付加させた。続いて、ＰＮＡのＣ末端側（つまり３’末端側）に、５（６）－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）が側鎖に付加されたリジン（Ｋ-ＦＡＭ）を結合させたものを、ペプチド固相合成法にて得た。なお、合成はPanagene社に委託した。
上記操作により、以下に示す特異的プローブ２を得た。なお以下に示す特異的プローブ２において、左側がＮ末端側である。
特異的プローブ２：5'-[(DabFF)3Dab]―[システイン残基]―[PNA]―[K-FAM]-3'
前記ＰＮＡのＮ末端側（つまり５’末端側）に、システインを付加させ、さらに前記システインのＮ末端側にＣＰＰを付加させた。続いて、ＰＮＡのＣ末端側（つまり３’末端側）に、５（６）－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）が側鎖に付加されたリジン（Ｋ-ＦＡＭ）を結合させたものを、ペプチド固相合成法にて得た。なお、合成はPanagene社に委託した。
上記操作により、以下に示す特異的プローブ２を得た。なお以下に示す特異的プローブ２において、左側がＮ末端側である。
特異的プローブ２：5'-[(DabFF)3Dab]―[システイン残基]―[PNA]―[K-FAM]-3'
【0160】
［実施例２］クエンチャープローブ１の合成
実施例１で得られた特異的プローブ１及び特異的プローブ２中で使用されているＰＮＡにハイブリダイズするＤＮＡオリゴマーとして、８ｍｅｒの5'-ggcgatgg-3'をデザインした。そして、前記ＤＮＡオリゴマーの５’末端側に前記ＦＡＭを消光できるＢＨＱ－１クエンチャー（ファスマック社製）を結合させた。なおクエンチャープローブ１の合成はファスマック社に委託した。上記操作により、以下に示すクエンチャープローブ１を得た。なお以下に示すクエンチャープローブ１は、左側が３’末端側である。
クエンチャープローブ１：[3'-ggtagcgg-5']―[ＢＨＱ－１]
実施例１で得られた特異的プローブ１及び特異的プローブ２中で使用されているＰＮＡにハイブリダイズするＤＮＡオリゴマーとして、８ｍｅｒの5'-ggcgatgg-3'をデザインした。そして、前記ＤＮＡオリゴマーの５’末端側に前記ＦＡＭを消光できるＢＨＱ－１クエンチャー（ファスマック社製）を結合させた。なおクエンチャープローブ１の合成はファスマック社に委託した。上記操作により、以下に示すクエンチャープローブ１を得た。なお以下に示すクエンチャープローブ１は、左側が３’末端側である。
クエンチャープローブ１：[3'-ggtagcgg-5']―[ＢＨＱ－１]
【0161】
［実施例３］プローブ複合体１及びプローブ複合体２の作製
特異的プローブ１及びクエンチャープローブ１を、モル比１：１の割合で、５０％リン酸バッファー溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中、室温、及び２０分間の条件で混合し、プローブ複合体１を作製した。また、特異的プローブ２及びクエンチャープローブ１を、モル比１：１の割合で、５０％リン酸バッファー溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中、室温、及び２０分間の条件で混合し、プローブ複合体２を作製した。作製したプローブ複合体１の模式図を図５に示し、プローブ複合体２の模式図を図６に示す。なお図５及び図６中、Ｋはリジン残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｄａｂはジアミノブタン酸残基を表す。５’は、塩基配列の５’末端側を表し（つまりＰＮＡにおいて、塩基配列の５’末端側はペプチドのＮ末端側となる。）、３’は、塩基配列の３’末端側を表す（つまりＰＮＡにおいて、塩基配列の３’末端側はペプチドのＣ末端側となる。）。図５中、Ｏはｅｇ１リンカーを表す。
特異的プローブ１及びクエンチャープローブ１を、モル比１：１の割合で、５０％リン酸バッファー溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中、室温、及び２０分間の条件で混合し、プローブ複合体１を作製した。また、特異的プローブ２及びクエンチャープローブ１を、モル比１：１の割合で、５０％リン酸バッファー溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中、室温、及び２０分間の条件で混合し、プローブ複合体２を作製した。作製したプローブ複合体１の模式図を図５に示し、プローブ複合体２の模式図を図６に示す。なお図５及び図６中、Ｋはリジン残基を表し、Ｆはフェニルアラニン残基を表し、Ｄａｂはジアミノブタン酸残基を表す。５’は、塩基配列の５’末端側を表し（つまりＰＮＡにおいて、塩基配列の５’末端側はペプチドのＮ末端側となる。）、３’は、塩基配列の３’末端側を表す（つまりＰＮＡにおいて、塩基配列の３’末端側はペプチドのＣ末端側となる。）。図５中、Ｏはｅｇ１リンカーを表す。
【0162】
［実施例４］特異的プローブ及びクエンチャープローブが形成するプローブ複合体の熱安定性の検証
（種々の長さのＤＮＡオリゴマーを含むプローブ複合体１の熱安定性の評価）
クエンチャープローブ１が有する８ｍｅｒの5'-ggcgatgg-3'の塩基配列のうち、８塩基（5'-ggcgatgg-3'）、７塩基（5'-ggcgatg-3'）、６塩基（5'-ggcgat-3'）、又は４塩基（5'-ggcg-3'）をＤＮＡオリゴマーとしたクエンチャープローブを用いて熱解離曲線を作成した。特異的プローブ１及び各クエンチャープローブをそれぞれ等量混合し、最終濃度が０．２μＭになるように、塩基長が異なるＤＮＡオリゴマーについてそれぞれ（計４種類）のプローブ複合体１を調整した。各プローブ複合体を含むそれぞれの５０％ＰＢＳ溶解液を、ＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓＲＴ－ＰＣＲ（Applied Biosystems社）にセットし、２５℃から約８５℃まで温度を上昇させ、０．３℃毎に相対蛍光強度（％）を測定した。ＦＡＭからの蛍光を測定するために、蛍光の測定はＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓに搭載されている４色フィルタのうち、５００ｎｍ～５２０ｎｍの蛍光を読み取るフィルタを使用した。評価数値として蛍光が最も明るい数値を１００％の蛍光強度と設定した。
（種々の長さのＤＮＡオリゴマーを含むプローブ複合体１の熱安定性の評価）
クエンチャープローブ１が有する８ｍｅｒの5'-ggcgatgg-3'の塩基配列のうち、８塩基（5'-ggcgatgg-3'）、７塩基（5'-ggcgatg-3'）、６塩基（5'-ggcgat-3'）、又は４塩基（5'-ggcg-3'）をＤＮＡオリゴマーとしたクエンチャープローブを用いて熱解離曲線を作成した。特異的プローブ１及び各クエンチャープローブをそれぞれ等量混合し、最終濃度が０．２μＭになるように、塩基長が異なるＤＮＡオリゴマーについてそれぞれ（計４種類）のプローブ複合体１を調整した。各プローブ複合体を含むそれぞれの５０％ＰＢＳ溶解液を、ＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓＲＴ－ＰＣＲ（Applied Biosystems社）にセットし、２５℃から約８５℃まで温度を上昇させ、０．３℃毎に相対蛍光強度（％）を測定した。ＦＡＭからの蛍光を測定するために、蛍光の測定はＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓに搭載されている４色フィルタのうち、５００ｎｍ～５２０ｎｍの蛍光を読み取るフィルタを使用した。評価数値として蛍光が最も明るい数値を１００％の蛍光強度と設定した。
【0163】
種々の長さのＤＮＡオリゴマーについての各プローブ複合体１の熱安定性の測定結果を示すグラフを、図７に示す。クエンチャープローブ中のＤＮＡオリゴマーの塩基長が短くなるに従って、２５℃におけるバックグラウンドの相対蛍光強度に増加が見られ、つまり熱安定性が低下していた。一方でＰＮＡと相補的な６塩基～８塩基のＤＮＡオリゴマーを有するクエンチャープローブは、特異的プローブ１との結合力が高く、２５℃～８５℃において、プローブ複合体１の形成及び解離が確認できた（解離曲線が得られた）。
【0164】
（ＤＮＡオリゴマーのミスマッチ塩基数がプローブ複合体１の熱安定性に与える影響の評価）
ＰＮＡの塩基配列に相補的である８塩基のうち、１塩基ミスマッチを含む塩基配列（5'-gacgatgg-3'）、２塩基ミスマッチを含む塩基配列（5'-gatgatgg-3'）、３塩基ミスマッチを含む塩基配列（5'-gataatgg-3'）、若しくは４塩基ミスマッチを含む塩基配列（5'-gataatag-3'）をＤＮＡオリゴマーとしたクエンチャープローブを用いて熱解離曲線を作成した。特異的プローブ１及び各クエンチャープローブをそれぞれ等量混合し、最終濃度が０．２μＭになるように、ミスマッチ塩基数が異なるＤＮＡオリゴマーについてそれぞれ（計４種類）のプローブ複合体１を調整した。各プローブ複合体を含むそれぞれの５０％ＰＢＳ溶解液を、ＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓＲＴ－ＰＣＲ（Applied Biosystems社）にセットし、２５℃から約８５℃まで温度を上昇させ、０．３℃毎に相対蛍光強度（％）を測定した。ＦＡＭからの蛍光を測定するために、蛍光の測定はＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓに搭載されている４色フィルタのうち、５００ｎｍ～５２０ｎｍの蛍光を読み取るフィルタを使用した。評価数値として蛍光が最も明るい数値を１００％の蛍光強度と設定した。
ＰＮＡの塩基配列に相補的である８塩基のうち、１塩基ミスマッチを含む塩基配列（5'-gacgatgg-3'）、２塩基ミスマッチを含む塩基配列（5'-gatgatgg-3'）、３塩基ミスマッチを含む塩基配列（5'-gataatgg-3'）、若しくは４塩基ミスマッチを含む塩基配列（5'-gataatag-3'）をＤＮＡオリゴマーとしたクエンチャープローブを用いて熱解離曲線を作成した。特異的プローブ１及び各クエンチャープローブをそれぞれ等量混合し、最終濃度が０．２μＭになるように、ミスマッチ塩基数が異なるＤＮＡオリゴマーについてそれぞれ（計４種類）のプローブ複合体１を調整した。各プローブ複合体を含むそれぞれの５０％ＰＢＳ溶解液を、ＳｔｅｐＯｎｅ ＰｌｕｓＲＴ－ＰＣＲ（Applied Biosystems社）にセットし、２５℃から約８５℃まで温度を上昇させ、０．３℃毎に相対蛍光強度（％）を測定した。ＦＡＭからの蛍光を測定するために、蛍光の測定はＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓに搭載されている４色フィルタのうち、５００ｎｍ～５２０ｎｍの蛍光を読み取るフィルタを使用した。評価数値として蛍光が最も明るい数値を１００％の蛍光強度と設定した。
【0165】
ＤＮＡオリゴマーのミスマッチ塩基数がプローブ複合体１の熱安定性に与える影響の測定結果を示すグラフを、図８に示す。各クエンチャープローブと特異的プローブ１とのミスマッチの数が２つ以上存在した場合、熱安定性が大きく失われた。一方で１塩基ミスマッチのクエンチャープローブは、特異的プローブ１との結合力を有しており、２５℃～８５℃において、プローブ複合体１の形成及び解離が確認できた（解離曲線が得られた）。
【0166】
（プローブ複合体２の熱安定性の評価）
特異的プローブ２及びクエンチャープローブ１が形成するプローブ複合体２の熱安定性の評価においては、特異的プローブ２及び5'-ggcgatgg-3'で示される８ｍｅｒの塩基配列を有するクエンチャープローブを等量混合し、最終濃度が０．５μＭになるようにプローブ複合体２を調整した以外は、前記したプローブ複合体１の熱安定性の評価と同様に相対蛍光強度（ａ．ｕ．）を測定した。なお相対蛍光強度（ａ．ｕ．）は、最も高く得られた蛍光強度を１としたときの相対的な数値として示した。プローブ複合体２の熱安定性の測定結果を示すグラフを図９に示す。図中、Ｑはクエンチャーを表す。なお前記したプローブ複合体１の熱安定性の評価と本評価とでは、特異的プローブの最終濃度が異なるが、解離曲線の形状に影響はない。クエンチャープローブは、特異的プローブ２との結合力を有していたため、２５℃～８５℃において、プローブ複合体２の形成及び解離が確認できた（解離曲線が得られた）。
特異的プローブ２及びクエンチャープローブ１が形成するプローブ複合体２の熱安定性の評価においては、特異的プローブ２及び5'-ggcgatgg-3'で示される８ｍｅｒの塩基配列を有するクエンチャープローブを等量混合し、最終濃度が０．５μＭになるようにプローブ複合体２を調整した以外は、前記したプローブ複合体１の熱安定性の評価と同様に相対蛍光強度（ａ．ｕ．）を測定した。なお相対蛍光強度（ａ．ｕ．）は、最も高く得られた蛍光強度を１としたときの相対的な数値として示した。プローブ複合体２の熱安定性の測定結果を示すグラフを図９に示す。図中、Ｑはクエンチャーを表す。なお前記したプローブ複合体１の熱安定性の評価と本評価とでは、特異的プローブの最終濃度が異なるが、解離曲線の形状に影響はない。クエンチャープローブは、特異的プローブ２との結合力を有していたため、２５℃～８５℃において、プローブ複合体２の形成及び解離が確認できた（解離曲線が得られた）。
【0167】
［実施例５］プローブ複合体１とＲＮＡとの置換反応の評価
プローブ複合体１とＲＮＡとの置換反応を評価するため、ＲＮＡとして、Pantoea agglomerans NBRC102470の16S rRNA塩基配列を基にした４０塩基の人工ＲＮＡ（配列番号２６）、Lactobacillus plantarum EW-pの16S rRNA塩基配列を基にした人工ＲＮＡ（配列番号２７）、Escherichia coli ATCC10798の16S rRNA塩基配列を基にした人工ＲＮＡ（配列番号２８）、Proteus hauseri NBRC3851の16S rRNA塩基配列を基にした人工ＲＮＡ（配列番号２９）、Yersinia bercovieri NBRC105717の16S rRNA塩基配列を基にした人工ＲＮＡ（配列番号３０）、及びEdwardsiella ictaluri NBRC105724の16S rRNA塩基配列を基にした人工ＲＮＡ（配列番号３１）を合成した。５０％ＰＢＳで希釈した０．４μＭの特異的プローブ１及び5'-ggcgatgg-3'で示される８ｍｅｒの塩基配列を有するクエンチャープローブの等量混合液に対して、０．４μＭの上記合成ＲＮＡをそれぞれ等量添加して２５℃で１時間静置した後、上記したＲＴ－ＰＣＲを利用して相対蛍光強度（ａ．ｕ．）を測定した。
プローブ複合体１とＲＮＡとの置換反応を評価するため、ＲＮＡとして、Pantoea agglomerans NBRC102470の16S rRNA塩基配列を基にした４０塩基の人工ＲＮＡ（配列番号２６）、Lactobacillus plantarum EW-pの16S rRNA塩基配列を基にした人工ＲＮＡ（配列番号２７）、Escherichia coli ATCC10798の16S rRNA塩基配列を基にした人工ＲＮＡ（配列番号２８）、Proteus hauseri NBRC3851の16S rRNA塩基配列を基にした人工ＲＮＡ（配列番号２９）、Yersinia bercovieri NBRC105717の16S rRNA塩基配列を基にした人工ＲＮＡ（配列番号３０）、及びEdwardsiella ictaluri NBRC105724の16S rRNA塩基配列を基にした人工ＲＮＡ（配列番号３１）を合成した。５０％ＰＢＳで希釈した０．４μＭの特異的プローブ１及び5'-ggcgatgg-3'で示される８ｍｅｒの塩基配列を有するクエンチャープローブの等量混合液に対して、０．４μＭの上記合成ＲＮＡをそれぞれ等量添加して２５℃で１時間静置した後、上記したＲＴ－ＰＣＲを利用して相対蛍光強度（ａ．ｕ．）を測定した。
【0168】
配列番号２６：5'-ggggaggaaggcgaugggguuaauaaccuuaucgauugac-3'
配列番号２７：5'-ucuguuguuaaagaagaacauaucugagaguaacuguuca-3'
配列番号２８：5'-ggggaggaagggaguaaaguuaauaccuuugcucauugac-3'
配列番号２９：5'-ggggaggaagguguuaagauuaauacucuuagcaauugac-3'
配列番号３０：5'-gaggaggaaggcagucguguuaauagcacgauugauugac-3'
配列番号３１：5'-agggaggaaggugugagcguuaauagcguucacaauugac-3'
配列番号２７：5'-ucuguuguuaaagaagaacauaucugagaguaacuguuca-3'
配列番号２８：5'-ggggaggaagggaguaaaguuaauaccuuugcucauugac-3'
配列番号２９：5'-ggggaggaagguguuaagauuaauacucuuagcaauugac-3'
配列番号３０：5'-gaggaggaaggcagucguguuaauagcacgauugauugac-3'
配列番号３１：5'-agggaggaaggugugagcguuaauagcguucacaauugac-3'
【0169】
プローブ複合体１とＲＮＡとを混合した際の蛍光強度を測定した結果を示すグラフを図１０に示す。図中、Ｎｏ ＲＮＡは合成ＲＮＡを添加していないネガティブコントロールであることを表す。図中、各合成ＲＮＡにおける相対蛍光強度（ａ．ｕ．）は、ネガティブコントロールにおける蛍光強度を１としたときの相対的な数値として示した。プローブ複合体１にP. agglomeransの合成ＲＮＡを添加した場合は、ネガティブコントロールに対して３．８倍の相対蛍光強度であった。一方で、プローブ複合体１にその他の合成ＲＮＡを添加した場合は、ネガティブコントロールに対して０．６倍～１．２倍の相対蛍光強度であった。よって、作製したプローブ複合体１は、ターゲットとするP. agglomeransの16S rRNA塩基配列と置換反応を起こし、つまりP. agglomeransを特異的に検出することができた。
【0170】
［実施例６］蛍光顕微鏡によるプローブ複合体１を用いた微生物の特異的検出の確認
（プローブ複合体１の微生物への導入）
以下３種類の菌体、Pantoea agglomerans（NBRC102470）、Acinetobacter radioresistens（NBRC102413）、又はEscherichia coli K-12（ATCC10798）それぞれに対して、Pantoea agglomeransに特異的である特異的プローブ１（CPP-PNA10Panto-FAM）、又はプローブ複合体１（CPP-PNA10Panto-FAM＋Q1）を個別に導入した。なお実施例６においてＣＰＰは(KFF)3Kを用いている。特異的プローブ１（CPP-PNA10Panto-FAM）の詳細な構造は、NH2-(KFF)3K-eg1-ccccatcgcc-K(FAM)-NH2であり、つまり(KFF)3KのＮ末端側には保護基を有さず、K(FAM)のＣ末端側には保護基としてアミノ基を有する。なおＱ１はクエンチャープローブを示す。
具体的な導入方法は以下のとおりである。３ｍＬのルリアベルターニ（ＬＢ）培養液中で１６時間～１８時間３０℃で振とう培養したそれぞれ３種の菌体培養液から、各２００μＬずつ菌体培養液を分取した。前記分取した菌体培養液を、７５００ｇ、２０℃、及び５分の条件で遠心分離した後、上清を除き、２００μＬの０．５×ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒを用いて菌体を３回洗浄した。５０μＬの前記特異的プローブ５μＭ又は前記プローブ複合体５μＭを、４時間３０℃の条件で前記３種の菌体にそれぞれ添加した。なおネガティブコントロールは、前記３種の菌体に０．５×ＰＢＳのみを添加した。
（プローブ複合体１の微生物への導入）
以下３種類の菌体、Pantoea agglomerans（NBRC102470）、Acinetobacter radioresistens（NBRC102413）、又はEscherichia coli K-12（ATCC10798）それぞれに対して、Pantoea agglomeransに特異的である特異的プローブ１（CPP-PNA10Panto-FAM）、又はプローブ複合体１（CPP-PNA10Panto-FAM＋Q1）を個別に導入した。なお実施例６においてＣＰＰは(KFF)3Kを用いている。特異的プローブ１（CPP-PNA10Panto-FAM）の詳細な構造は、NH2-(KFF)3K-eg1-ccccatcgcc-K(FAM)-NH2であり、つまり(KFF)3KのＮ末端側には保護基を有さず、K(FAM)のＣ末端側には保護基としてアミノ基を有する。なおＱ１はクエンチャープローブを示す。
具体的な導入方法は以下のとおりである。３ｍＬのルリアベルターニ（ＬＢ）培養液中で１６時間～１８時間３０℃で振とう培養したそれぞれ３種の菌体培養液から、各２００μＬずつ菌体培養液を分取した。前記分取した菌体培養液を、７５００ｇ、２０℃、及び５分の条件で遠心分離した後、上清を除き、２００μＬの０．５×ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒを用いて菌体を３回洗浄した。５０μＬの前記特異的プローブ５μＭ又は前記プローブ複合体５μＭを、４時間３０℃の条件で前記３種の菌体にそれぞれ添加した。なおネガティブコントロールは、前記３種の菌体に０．５×ＰＢＳのみを添加した。
【0171】
（微生物の特異的検出）
蛍光顕微鏡によるプローブ複合体１を用いた微生物の特異的検出を行った。なお蛍光の観察は以下のとおりに行った。蛍光顕微鏡は、ＯＬＹＭＰＵＳ社のＢＸ５３正立顕微鏡を使用し、蛍光顕微鏡の光源装置は、ＯＬＹＭＰＵＳ社のＵ－ＨＧＬＧＰＳを使用した。顕微鏡観察で用いた励起／吸収フィルタは、ＯＬＹＭＰＵＳ社の蛍光ミラーユニットで、ＦＡＭからの蛍光を測定するためのＵ－ＦＢＷＡ（緑色蛍光専用）とトリパンブルーの存在を検出するためのＵ－ＦＧＷ（赤色蛍光専用）の２種類を使用した。画像の撮影はＰＣ上で行い、比較対象となるサンプルの露出時間は揃えて撮影した。
蛍光顕微鏡によるプローブ複合体１を用いた微生物の特異的検出を行った。なお蛍光の観察は以下のとおりに行った。蛍光顕微鏡は、ＯＬＹＭＰＵＳ社のＢＸ５３正立顕微鏡を使用し、蛍光顕微鏡の光源装置は、ＯＬＹＭＰＵＳ社のＵ－ＨＧＬＧＰＳを使用した。顕微鏡観察で用いた励起／吸収フィルタは、ＯＬＹＭＰＵＳ社の蛍光ミラーユニットで、ＦＡＭからの蛍光を測定するためのＵ－ＦＢＷＡ（緑色蛍光専用）とトリパンブルーの存在を検出するためのＵ－ＦＧＷ（赤色蛍光専用）の２種類を使用した。画像の撮影はＰＣ上で行い、比較対象となるサンプルの露出時間は揃えて撮影した。
【0172】
プローブ複合体１を用いた微生物の特異的検出を示す顕微鏡写真を図１１に示す。なお図中、各菌種の左側図は蛍光の観察であることを表し、右側図は明視野における観察であることを表す。
ネガティブコントロールにおいては、P. agglomerans、A. radioresistens、及びE. coliのいずれの菌種も蛍光を発さず、つまり自家蛍光を示さなかった。特異的プローブ１（CPP-PNA10Panto-FAM）のみを導入したサンプルにおいては、全ての菌種からＦＡＭからの蛍光が確認された。つまり特異的プローブ１は全ての菌種内に導入されたが、微生物種特異的な検出は出来なかったことが確認できた。プローブ複合体１（CPP-PNA10Panto-FAM+Q1）を導入したサンプルにおいては、A. radioresistens及びE. coliではＦＡＭからの蛍光を示さなかったものの、P. agglomeransのみがＦＡＭからの蛍光を発した。つまり、プローブ複合体１は微生物種特異的に染色したことが確認できた。
ネガティブコントロールにおいては、P. agglomerans、A. radioresistens、及びE. coliのいずれの菌種も蛍光を発さず、つまり自家蛍光を示さなかった。特異的プローブ１（CPP-PNA10Panto-FAM）のみを導入したサンプルにおいては、全ての菌種からＦＡＭからの蛍光が確認された。つまり特異的プローブ１は全ての菌種内に導入されたが、微生物種特異的な検出は出来なかったことが確認できた。プローブ複合体１（CPP-PNA10Panto-FAM+Q1）を導入したサンプルにおいては、A. radioresistens及びE. coliではＦＡＭからの蛍光を示さなかったものの、P. agglomeransのみがＦＡＭからの蛍光を発した。つまり、プローブ複合体１は微生物種特異的に染色したことが確認できた。
【0173】
なおネガティブコントロール又は特異的プローブ１を導入したサンプルにおいてはトリパンブルー染色を行ったが、赤色蛍光は確認できなかった。つまり、特異的プローブ１の導入による微生物の死は確認できなかった。
【0174】
［実施例７］蛍光顕微鏡によるプローブ複合体２を用いた微生物の特異的検出の確認
（プローブ複合体２の微生物への導入）
以下３種類の菌体、Pantoea agglomerans（NBRC102470）、Acinetobacter radioresistens（NBRC102413）、又はEscherichia coli K-12（ATCC10798）に対して、Pantoea agglomeransに特異的である特異的プローブ２（CPP-PNA10Panto-FAM）、又は前記特異的プローブを含むプローブ複合体２（CPP-PNA10Panto-FAM＋Q1）を導入した。なお実施例７においてＣＰＰは(DabFF)3Dabを用いている。
詳細な導入方法は、実施例６に記載の導入方法と同様である。なおネガティブコントロールは、前記３種の菌体に０．５×ＰＢＳのみを添加した。
（プローブ複合体２の微生物への導入）
以下３種類の菌体、Pantoea agglomerans（NBRC102470）、Acinetobacter radioresistens（NBRC102413）、又はEscherichia coli K-12（ATCC10798）に対して、Pantoea agglomeransに特異的である特異的プローブ２（CPP-PNA10Panto-FAM）、又は前記特異的プローブを含むプローブ複合体２（CPP-PNA10Panto-FAM＋Q1）を導入した。なお実施例７においてＣＰＰは(DabFF)3Dabを用いている。
詳細な導入方法は、実施例６に記載の導入方法と同様である。なおネガティブコントロールは、前記３種の菌体に０．５×ＰＢＳのみを添加した。
【0175】
（微生物の特異的検出）
蛍光顕微鏡によるプローブ複合体２を用いた微生物の特異的検出を行った。蛍光の観察方法は、緑色蛍光及び赤色蛍光のうち緑色蛍光のみを測定したこと以外は実施例６に記載の方法と同様である。
蛍光顕微鏡によるプローブ複合体２を用いた微生物の特異的検出を行った。蛍光の観察方法は、緑色蛍光及び赤色蛍光のうち緑色蛍光のみを測定したこと以外は実施例６に記載の方法と同様である。
【0176】
プローブ複合体２を用いた微生物の特異的検出を示す顕微鏡写真を図１２に示す。なお図中、ＢＦは明視野における観察であることを表し、Ｇｒｅｅｎは緑色蛍光の観察であることを表す。
ネガティブコントロールにおいては、P. agglomerans、A. radioresistens、及びE. coliのいずれの菌種も蛍光を発さず、自家蛍光を示さなかった。特異的プローブ２（CPP-PNA10Panto-FAM、図中のSpecific Probe）のみを導入したサンプルにおいては、全ての菌種から蛍光が確認された。つまり特異的プローブ２は全ての菌種内に導入されたことが確認できたが、微生物種特異的な検出は出来なかったことが確認できた。プローブ複合体２（CPP-PNA10Panto-FAM+Q1、図中のProbe Complex）を導入したサンプルにおいては、A. radioresistens及びE. coliでは蛍光を示さなかったものの、P. agglomeransのみが蛍光を発した。つまり、プローブ複合体２は微生物種特異的に染色したことが確認できた。
ネガティブコントロールにおいては、P. agglomerans、A. radioresistens、及びE. coliのいずれの菌種も蛍光を発さず、自家蛍光を示さなかった。特異的プローブ２（CPP-PNA10Panto-FAM、図中のSpecific Probe）のみを導入したサンプルにおいては、全ての菌種から蛍光が確認された。つまり特異的プローブ２は全ての菌種内に導入されたことが確認できたが、微生物種特異的な検出は出来なかったことが確認できた。プローブ複合体２（CPP-PNA10Panto-FAM+Q1、図中のProbe Complex）を導入したサンプルにおいては、A. radioresistens及びE. coliでは蛍光を示さなかったものの、P. agglomeransのみが蛍光を発した。つまり、プローブ複合体２は微生物種特異的に染色したことが確認できた。
【0177】
［実施例８］プローブ複合体２導入時の微生物の生死割合の判定
（微生物のトリパンブルー染色）
プローブ複合体２導入時の微生物の生死割合の判定は、トリパンブルーを用いて行った。実施例７においてプローブ複合体２を導入したP. agglomeransに対して、０．４％のトリパンブルーを添加して最終濃度０．１％になるように調整し、蛍光顕微鏡にて微生物を観察した。蛍光の観察方法は、実施例６に記載の方法と同様である。
（微生物のトリパンブルー染色）
プローブ複合体２導入時の微生物の生死割合の判定は、トリパンブルーを用いて行った。実施例７においてプローブ複合体２を導入したP. agglomeransに対して、０．４％のトリパンブルーを添加して最終濃度０．１％になるように調整し、蛍光顕微鏡にて微生物を観察した。蛍光の観察方法は、実施例６に記載の方法と同様である。
【0178】
プローブ複合体２導入時の微生物の生死割合を示す顕微鏡写真を図１３に示す。なお図中、白い矢印で示された細胞はトリパンブルー染色により赤色蛍光を発した細胞であり、死細胞であることを意味する。図中、矢印で示されていない細胞は緑色蛍光を発した細胞であり、生細胞であることを意味する。つまり、複合体プローブ２を導入されたP. agglomeransのうち約９０％程度は生きていることを確認できた。
【0179】
［比較例１］ＣＰＰのみ又はＣＰＰ無しのプローブを用いた微生物への導入の確認
（微生物への導入）
以下３種類の菌体、Pantoea agglomerans（NBRC102470）、Acinetobacter radioresistens（NBRC102413）、又はEscherichia coli K-12（ATCC10798）に対して、Pantoea agglomeransに特異的であるＰＮＡ及び標識物質を有するC-PNA-K-FAM、ＣＰＰを有する(DabFF)3Dab-NH2、又は、ＣＰＰ、Pantoea agglomeransに特異的であるＰＮＡ、及び標識物質を有する(DabFF)3Dab-PNA-K-FAMを導入した。なおC-PNA-K-FAMの表記のうちC-はＮ末端のアミノ酸残基（システイン）を意味し、(DabFF)3Dab-NH2の表記のうち-NH2はＣ末端側の保護基（アミノ基）を意味する。
詳細な導入方法は、実施例６に記載の導入方法と同様である。なおネガティブコントロールは、前記３種の菌体に０．５×ＰＢＳのみを添加した。
（微生物への導入）
以下３種類の菌体、Pantoea agglomerans（NBRC102470）、Acinetobacter radioresistens（NBRC102413）、又はEscherichia coli K-12（ATCC10798）に対して、Pantoea agglomeransに特異的であるＰＮＡ及び標識物質を有するC-PNA-K-FAM、ＣＰＰを有する(DabFF)3Dab-NH2、又は、ＣＰＰ、Pantoea agglomeransに特異的であるＰＮＡ、及び標識物質を有する(DabFF)3Dab-PNA-K-FAMを導入した。なおC-PNA-K-FAMの表記のうちC-はＮ末端のアミノ酸残基（システイン）を意味し、(DabFF)3Dab-NH2の表記のうち-NH2はＣ末端側の保護基（アミノ基）を意味する。
詳細な導入方法は、実施例６に記載の導入方法と同様である。なおネガティブコントロールは、前記３種の菌体に０．５×ＰＢＳのみを添加した。
【0180】
（微生物の検出）
蛍光顕微鏡による微生物の検出を行った。蛍光の観察方法は、緑色蛍光及び赤色蛍光のうち緑色蛍光のみを測定したこと以外は実施例６に記載の方法と同様である。
ＣＰＰのみ又はＣＰＰ無しのプローブを用いた微生物への導入を確認した顕微鏡写真を図１４－１～図１４－３に示す。図１４－１は、Escherichia coliへの導入を確認した顕微鏡写真である。図１４－２は、Acinetobacter radioresistensへの導入を確認した顕微鏡写真である。図１４－３は、Pantoea agglomeransへの導入を確認した顕微鏡写真である。なお図１４－１～図１４－３中、ＢＦは明視野における観察であることを表し、Ｇｒｅｅｎは緑色蛍光の観察であることを表す。
ネガティブコントロールにおいては、P. agglomerans、A. radioresistens、及びE. coliのいずれの菌種も蛍光を発さず、つまり自家蛍光を示さなかった。P. agglomeransに特異的であるＰＮＡ及びＣＰＰを有する(DabFF)3Dab-PNA-K-FAMを導入したサンプルにおいては、全ての菌種から蛍光が確認された。つまり(DabFF)3Dab-PNA-K-FAMが全ての菌種内に導入されたことが確認できた。一方で、P. agglomeransに特異的であるＰＮＡを有するPNA-K-FAM、及びＣＰＰを有する(DabFF)3Dab-NH2を導入したサンプルにおいては、蛍光を発しなかった。
蛍光顕微鏡による微生物の検出を行った。蛍光の観察方法は、緑色蛍光及び赤色蛍光のうち緑色蛍光のみを測定したこと以外は実施例６に記載の方法と同様である。
ＣＰＰのみ又はＣＰＰ無しのプローブを用いた微生物への導入を確認した顕微鏡写真を図１４－１～図１４－３に示す。図１４－１は、Escherichia coliへの導入を確認した顕微鏡写真である。図１４－２は、Acinetobacter radioresistensへの導入を確認した顕微鏡写真である。図１４－３は、Pantoea agglomeransへの導入を確認した顕微鏡写真である。なお図１４－１～図１４－３中、ＢＦは明視野における観察であることを表し、Ｇｒｅｅｎは緑色蛍光の観察であることを表す。
ネガティブコントロールにおいては、P. agglomerans、A. radioresistens、及びE. coliのいずれの菌種も蛍光を発さず、つまり自家蛍光を示さなかった。P. agglomeransに特異的であるＰＮＡ及びＣＰＰを有する(DabFF)3Dab-PNA-K-FAMを導入したサンプルにおいては、全ての菌種から蛍光が確認された。つまり(DabFF)3Dab-PNA-K-FAMが全ての菌種内に導入されたことが確認できた。一方で、P. agglomeransに特異的であるＰＮＡを有するPNA-K-FAM、及びＣＰＰを有する(DabFF)3Dab-NH2を導入したサンプルにおいては、蛍光を発しなかった。
【0181】
［実施例９］微細藻類への蛍光標識されたＣＰＰの導入の確認
（微生物への導入）
Tisochrysis luteaに対して、蛍光標識されたＣＰＰである (DabFF)3K-FAM（ファスマック社製）を導入した。なおTisochrysis luteaは、真核の微生物であって、さらに微細藻類のうちハプト藻綱に分類される。
詳細な導入方法は、微細藻類の培養のための液をMA-ESM培地としたこと、微細藻類培養液の遠心分離を１００ｇ、２０℃、及び５分の条件としたこと、及び遠心分離後の菌体洗浄においてMA-ESM培地を用いたこと以外は、実施例６に記載の導入方法と同様である。なおネガティブコントロールは、前記微細藻類に対してMA-ESM培地のみを添加した。MA-ESM培地とは、人工海水（Marine Art SF-1,大阪薬研,大阪）と海産藻類用培地であるＥＳＭ培地とを混合した微量栄養素富化培地である。
（微生物への導入）
Tisochrysis luteaに対して、蛍光標識されたＣＰＰである (DabFF)3K-FAM（ファスマック社製）を導入した。なおTisochrysis luteaは、真核の微生物であって、さらに微細藻類のうちハプト藻綱に分類される。
詳細な導入方法は、微細藻類の培養のための液をMA-ESM培地としたこと、微細藻類培養液の遠心分離を１００ｇ、２０℃、及び５分の条件としたこと、及び遠心分離後の菌体洗浄においてMA-ESM培地を用いたこと以外は、実施例６に記載の導入方法と同様である。なおネガティブコントロールは、前記微細藻類に対してMA-ESM培地のみを添加した。MA-ESM培地とは、人工海水（Marine Art SF-1,大阪薬研,大阪）と海産藻類用培地であるＥＳＭ培地とを混合した微量栄養素富化培地である。
【0182】
（微生物の検出）
蛍光顕微鏡による微生物の検出を行った。蛍光の観察方法は、実施例６に記載の方法と同様である。
微細藻類への蛍光標識されたＣＰＰの導入を確認した顕微鏡写真を図１５に示す。なお図１５中、ＢＦは明視野における観察であることを表し、Ｒｅｄは赤色蛍光の観察であることを表し、Ｇｒｅｅｎは緑色蛍光の観察であることを表す。
ネガティブコントロールにおいては、Tisochrysis luteaは赤色蛍光（つまり自家蛍光）を示したが、緑色蛍光を示さなかった。一方で、(DabFF)3K-FAMを導入したTisochrysis luteaにおいては、赤色蛍光（つまり自家蛍光）及びＦＡＭによる緑色蛍光が確認された。つまり(DabFF)3K-FAMがTisochrysis lutea内に導入されたことが確認できた。
蛍光顕微鏡による微生物の検出を行った。蛍光の観察方法は、実施例６に記載の方法と同様である。
微細藻類への蛍光標識されたＣＰＰの導入を確認した顕微鏡写真を図１５に示す。なお図１５中、ＢＦは明視野における観察であることを表し、Ｒｅｄは赤色蛍光の観察であることを表し、Ｇｒｅｅｎは緑色蛍光の観察であることを表す。
ネガティブコントロールにおいては、Tisochrysis luteaは赤色蛍光（つまり自家蛍光）を示したが、緑色蛍光を示さなかった。一方で、(DabFF)3K-FAMを導入したTisochrysis luteaにおいては、赤色蛍光（つまり自家蛍光）及びＦＡＭによる緑色蛍光が確認された。つまり(DabFF)3K-FAMがTisochrysis lutea内に導入されたことが確認できた。
【0183】
［実施例１０］
（特異的プローブ３の合成）
ＰＮＡの塩基配列を、Enterobacter hormaecheiのITS配列とハイブリダイズするようにGeneious Primeを用いてデザインした、１０ｍｅｒのＰＮＡである5'-tagtcacctc-3'を採用した以外は、特異的プローブ１と同様の手法により、特異的プローブ３を得た。
特異的プローブ３：5'-[(KFF)3K]―[eg1]―[PNA]―[K-FAM]-3'
（特異的プローブ３の合成）
ＰＮＡの塩基配列を、Enterobacter hormaecheiのITS配列とハイブリダイズするようにGeneious Primeを用いてデザインした、１０ｍｅｒのＰＮＡである5'-tagtcacctc-3'を採用した以外は、特異的プローブ１と同様の手法により、特異的プローブ３を得た。
特異的プローブ３：5'-[(KFF)3K]―[eg1]―[PNA]―[K-FAM]-3'
【0184】
（クエンチャープローブ２の合成）
上記特異的プローブ３に含まれるＰＮＡにハイブリダイズするＤＮＡオリゴマーとして、９ｍｅｒの5'-gaggtgact-3’を用いた以外は、クエンチャープローブ１と同様の手法として、クエンチャープローブ２を得た。
クエンチャープローブ２：[5'-gaggtgact-3']―[ＢＨＱ－１]
上記特異的プローブ３に含まれるＰＮＡにハイブリダイズするＤＮＡオリゴマーとして、９ｍｅｒの5'-gaggtgact-3’を用いた以外は、クエンチャープローブ１と同様の手法として、クエンチャープローブ２を得た。
クエンチャープローブ２：[5'-gaggtgact-3']―[ＢＨＱ－１]
【0185】
（プローブ複合体３の作製）
特異的プローブ１とクエンチャープローブ１の代わりに、特異的プローブ３とクエンチャープローブ２をそれぞれ用いた以外は、プローブ複合体１と同様の手法として、プローブ複合体３を得た。
特異的プローブ１とクエンチャープローブ１の代わりに、特異的プローブ３とクエンチャープローブ２をそれぞれ用いた以外は、プローブ複合体１と同様の手法として、プローブ複合体３を得た。
【0186】
（複数の微生物を含む混合物下におけるプローブ複合体３の特定微生物への導入）
以下３種類の菌体、Enterobacter hormaechei（NBRC105718）、Citrobacter werkmanii（NBRC105721）、又はEscherichia coli K-12（ATCC10798）を混合した菌体混合物に対して、Enterobacter hormaecheiに特異的である特異的プローブ３を導入した。
以下３種類の菌体、Enterobacter hormaechei（NBRC105718）、Citrobacter werkmanii（NBRC105721）、又はEscherichia coli K-12（ATCC10798）を混合した菌体混合物に対して、Enterobacter hormaecheiに特異的である特異的プローブ３を導入した。
【0187】
具体的な導入方法は以下のとおりである。
ルリアベルターニ（ＬＢ）培養液中でそれぞれ一晩培養した上記３種類の菌体を、100 μL/sampleを使用することを目安にして、各サンプルを別々のエッペンチューブに分注し遠心分離（７，５００ｇ、２０℃、１０分）を行い、菌体を回収した。次に、回収した菌体を、ＰＢＳに懸濁させ、遠心分離（７，５００ｇ、２０℃、５分）を３回繰り返し行い、菌体を洗浄した。洗浄後、ペレット状の各３種の菌体を１：１：１（溶液ボリューム）で混合し、３菌種の混合菌体サンプルを得た。得られた混合菌体サンプルを、特異的プローブ３のみの溶液(５μＭ、０．５×ＰＢＳ溶液)５０μＬ、プローブ複合体３の溶液（５μＭ、０．５×ＰＢＳ溶液）５０μＬ、又は、０．５×ＰＢＳ溶液単体（ネガティブコントロール）５０μＬと混合し、懸濁液を３０℃で４時間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳを用いた洗浄工程を３回繰り返し行い、菌体組成物を得た。
ルリアベルターニ（ＬＢ）培養液中でそれぞれ一晩培養した上記３種類の菌体を、100 μL/sampleを使用することを目安にして、各サンプルを別々のエッペンチューブに分注し遠心分離（７，５００ｇ、２０℃、１０分）を行い、菌体を回収した。次に、回収した菌体を、ＰＢＳに懸濁させ、遠心分離（７，５００ｇ、２０℃、５分）を３回繰り返し行い、菌体を洗浄した。洗浄後、ペレット状の各３種の菌体を１：１：１（溶液ボリューム）で混合し、３菌種の混合菌体サンプルを得た。得られた混合菌体サンプルを、特異的プローブ３のみの溶液(５μＭ、０．５×ＰＢＳ溶液)５０μＬ、プローブ複合体３の溶液（５μＭ、０．５×ＰＢＳ溶液）５０μＬ、又は、０．５×ＰＢＳ溶液単体（ネガティブコントロール）５０μＬと混合し、懸濁液を３０℃で４時間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳを用いた洗浄工程を３回繰り返し行い、菌体組成物を得た。
【0188】
上記で得られたプローブ複合体３を導入した菌体組成物について、蛍光顕微鏡による特定微生物の特異的検出を行った。なお蛍光の観察は以下のとおりに行った。蛍光顕微鏡は、ＯＬＹＭＰＵＳ社のＢＸ５３正立顕微鏡を使用し、蛍光顕微鏡の光源装置は、ＯＬＹＭＰＵＳ社のＵ－ＨＧＬＧＰＳを使用した。顕微鏡観察で用いた励起／吸収フィルタは、ＯＬＹＭＰＵＳ社の蛍光ミラーユニットで、ＦＡＭからの蛍光を測定するためのＵ－ＦＢＷＡ（緑色蛍光専用）とトリパンブルーの存在を検出するためのＵ－ＦＧＷ（赤色蛍光専用）の２種類を使用した。画像の撮影はＰＣ上で行い、比較対象となるサンプルの露出時間は揃えて撮影した。結果を図１６に示す。
なお、上記プローブ複合体３の微生物への導入における、プローブ複合体３の部分を、特異的プローブ３の溶液（５μＭ、０．５×ＰＢＳ溶液）、又は、０．５×ＰＢＳ溶液単体（ネガティブコントロール）に置き換えて、得られた菌体組成物についても、蛍光顕微鏡観察の結果を合わせて図１６に示す。
なお、上記プローブ複合体３の微生物への導入における、プローブ複合体３の部分を、特異的プローブ３の溶液（５μＭ、０．５×ＰＢＳ溶液）、又は、０．５×ＰＢＳ溶液単体（ネガティブコントロール）に置き換えて、得られた菌体組成物についても、蛍光顕微鏡観察の結果を合わせて図１６に示す。
【0189】
図１６は、実施例１０における複数の微生物を含む混合物下での顕微鏡写真である。図中、各菌種の右側図は蛍光の観察であることを表し、左側図は明視野における観察であることを表す。
図１６に示すように、ネガティブコントロールの場合は、緑蛍光の細菌が確認されなかった。特異的プローブ３のみが導入された場合は、細菌種問わず、緑蛍光を示す細菌が多数認められた。プローブ複合体３が導入された場合は、一部の細菌のみが緑蛍光を示すことが認められた。
図１６に示すように、ネガティブコントロールの場合は、緑蛍光の細菌が確認されなかった。特異的プローブ３のみが導入された場合は、細菌種問わず、緑蛍光を示す細菌が多数認められた。プローブ複合体３が導入された場合は、一部の細菌のみが緑蛍光を示すことが認められた。
【0190】
［実施例１１］
（複数の微生物を含む混合物下における特定微生物の検出と分離）
前記特異的プローブ３が導入された３種類の菌体の混合組成物から、Enterobacter hormaecheiを分離した。具体的な分離方法は以下のとおりである。
前記プローブ複合体３が導入された菌体組成物について、菌体組成物内の緑蛍光を示す微生物の分布を、フローサイトメーターで分析した。フローサイトメーターはオンチップ・バイオテクノロジーズ社のものを利用した。
なお、上記プローブ複合体３の特定微生物への導入における、プローブ複合体３の部分を、特異的プローブ３の溶液（５μＭ、０．５×ＰＢＳ溶液）、又は、０．５×ＰＢＳ溶液単体（ネガティブコントロール）に置き換えて、得られた菌体組成物についても、同様にフローサイトメーターで分析した。
（複数の微生物を含む混合物下における特定微生物の検出と分離）
前記特異的プローブ３が導入された３種類の菌体の混合組成物から、Enterobacter hormaecheiを分離した。具体的な分離方法は以下のとおりである。
前記プローブ複合体３が導入された菌体組成物について、菌体組成物内の緑蛍光を示す微生物の分布を、フローサイトメーターで分析した。フローサイトメーターはオンチップ・バイオテクノロジーズ社のものを利用した。
なお、上記プローブ複合体３の特定微生物への導入における、プローブ複合体３の部分を、特異的プローブ３の溶液（５μＭ、０．５×ＰＢＳ溶液）、又は、０．５×ＰＢＳ溶液単体（ネガティブコントロール）に置き換えて、得られた菌体組成物についても、同様にフローサイトメーターで分析した。
【0191】
図示はしないが、蛍光顕微鏡観察の結果と同様に、フローサイトメーターによる分析においても、ネガティブコントロールの場合は、緑蛍光の細菌が確認されなかった。特異的プローブ３のみが導入された場合は、細菌種問わず、緑蛍光を示す細菌が多数認められた。プローブ複合体３が導入された場合は、一部の細菌のみが緑蛍光を示すことが認められた。
【0192】
プローブ複合体３が導入された３種類の菌体の混合組成物から、フローサイトメーターにより、緑蛍光を示す細菌を選出して分離し、これをＬＢアガープレートに播種した。播種した菌体を、３０℃で３日間培養した。得られたコロニーから、ランダムに２７個のコロニーを選出し、16S rRNA解析により微生物種の同定を行った。その結果、前記選出したコロニーに、特定微生物であるEnterobacter hormaecheiが含まれており、特定微生物が分離できたことを確認した。
上記結果から、複数の微生物を含む混合物下においても、本開示のプローブ複合体を用いることで、特定微生物の検出に加えて、分離と同定が可能であることが示唆された。
上記結果から、複数の微生物を含む混合物下においても、本開示のプローブ複合体を用いることで、特定微生物の検出に加えて、分離と同定が可能であることが示唆された。
【0193】
上述の通り、実施例のプローブ複合体は、生きている微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を検出することができた。また、実施例のプローブ複合体は、検出した微生物を、生きている状態で単離することができた。
【産業上の利用可能性】
【0194】
本開示のプローブ複合体は、生きている微生物内に存在する任意の塩基配列の有無を検出することができる。そのため、例えば、難培養微生物に含まれる16S rRNAを基にＰＮＡを設計したプローブ複合体とすることにより、前記難培養微生物を培養せずとも生きた状態で検出したり、検出後に分離したりすることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図15】
【図16】
【配列表】