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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024037076
(43)【公開日】2024-03-18
(54)【発明の名称】重複遺伝子のゲノム編集方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240311BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240311BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/63 Z ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022141724
(22)【出願日】2022-09-06
(71)【出願人】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100123593
【弁理士】
【氏名又は名称】関根 宣夫
(74)【代理人】
【識別番号】100166165
【弁理士】
【氏名又は名称】津田 英直
(72)【発明者】
【氏名】菅野 茂夫
(72)【発明者】
【氏名】長谷川 玲花
(57)【要約】
【課題】少数のｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを用いて、機能重複している多数の遺伝子を同時に編集する技術を提供することを目的とする。
【解決手段】ヒュージファージ由来のＣａｓΦタンパク質が、１６以上のヌクレオチド長であるターゲット配列、及び当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列を切断可能であることを見出し、斯かるＣａｓΦタンパク質を用いた重複遺伝子のゲノム編集方法を提供する。
【選択図】図３
【解決手段】ヒュージファージ由来のＣａｓΦタンパク質が、１６以上のヌクレオチド長であるターゲット配列、及び当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列を切断可能であることを見出し、斯かるＣａｓΦタンパク質を用いた重複遺伝子のゲノム編集方法を提供する。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞の重複遺伝子のゲノム編集方法であって、前記重複遺伝子が、ゲノム編集の対象となる１６ヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いはゲノム編集の対象となる１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有し；ここで前記方法が、
（ａ）前記ターゲット配列及びミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を含むｃｒＲＮＡ；及び、
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質；
を、前記細胞内で発現させる工程を含む、重複遺伝子のゲノム編集方法。
（ａ）前記ターゲット配列及びミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を含むｃｒＲＮＡ；及び、
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質；
を、前記細胞内で発現させる工程を含む、重複遺伝子のゲノム編集方法。
【請求項2】
前記ＣａｓΦタンパク質が、ＣａｓΦ１、ＣａｓΦ２、ｖＣａｓΦ及びＣａｓΦ３からなる群から選ばれる少なくとも１のタンパク質である、請求項１に記載のゲノム編集方法。
【請求項3】
前記ＣａｓΦタンパク質が、配列番号１、２、３及び４からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のゲノム編集方法。
【請求項4】
前記重複遺伝子が、機能冗長性を有する重複配列である、請求項１に記載のゲノム編集方法。
【請求項5】
前記重複遺伝子が、ターゲット配列の近傍にＰＡＭ配列を含む、請求項１に記載のゲノム編集方法。
【請求項6】
前記スペーサー配列が、前記ターゲット配列と完全一致するように決定される、請求項１に記載のゲノム編集方法。
【請求項7】
前記重複遺伝子が、１６以上のヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いは１６以上のヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有する、請求項１に記載のゲノム編集方法。
【請求項8】
前記重複遺伝子が、１７以上のヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有する、請求項１に記載のゲノム編集方法。
【請求項9】
前記重複遺伝子が、前記細胞のゲノム中に２～１００コピー存在する、請求項１に記載のゲノム編集方法。
【請求項10】
前記細胞のゲノム中に含まれる重複遺伝子のうち、一部又は全ての重複遺伝子を編集する、請求項９に記載のゲノム編集方法。
【請求項11】
前記細胞が、植物細胞である、請求項１に記載のゲノム編集方法。
【請求項12】
前記ｃｒＲＮＡ及び／又は前記ＣａｓΦタンパク質を、発現ベクターにより前記細胞内に導入して発現させる、請求項１に記載のゲノム編集方法。
【請求項13】
前記発現ベクターが、一過性又は恒常性発現ベクターである、請求項１２に記載のゲノム編集方法。
【請求項14】
細胞の重複遺伝子のゲノム編集用キットであって、前記重複遺伝子が、ゲノム編集の対象となる１６ヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いは１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有し、前記キットが；
（ａ）前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を導入可能なｃｒＲＮＡの発現カセット；及び、
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質の発現カセット；
を含む、前記キット。
（ａ）前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を導入可能なｃｒＲＮＡの発現カセット；及び、
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質の発現カセット；
を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、重複遺伝子のゲノム編集に関する。
【背景技術】
【0002】
ゲノム編集は、対象生物のゲノムの狙った箇所に変異を導入する（編集する）技術である。そのため、放射線などの既存の変異導入方法に比べて圧倒的に少ない数の変異体から望みの株を取得できる効率性がメリットとなり、様々な用途に使用されている。
【0003】
典型的なゲノム編集技術であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９やＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａでは、編集対象の配列はおもにそれらを構成するｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡのスペーサー配列とよばれる部位によって規定される。ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡのスペーサー配列としては、通常、２０～２４塩基を任意に変更可能な標的配列として使用する。このスペーサー配列に加えて、ヌクレアーゼであるＣａｓ９やＣａｓ１２ａが機能するには、ＰＡＭ配列と呼ばれる２～４塩基程度の塩基配列が必要となる。したがって、ＰＡＭ配列とスペーサー配列を合わせた総計２２～２８塩基ほどの塩基配列を特異的に認識してゲノム編集が行われている。この認識長は、ヒトゲノムのうちの単一の領域を指定するのに十分な長さであるとされる。
【0004】
しかしながら、植物をはじめとした多くの生物では、ゲノム中に存在する相同遺伝子が機能を補償する現象（機能冗長性）が存在するため、ひとつの遺伝子を破壊しただけでは、目的とした表現型が現れないことがある。したがって、目的とした表現型を発現させるには、配列類似性がある複数の相同遺伝子を同時に編集する必要がある場合が多い。
【0005】
複数の遺伝子を同時に編集するために、多くの場合、ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを複数発現させて、それぞれのｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡで互いに異なる遺伝子を指定する、という方法がとられている。この方法では、編集対象の遺伝子が増えれば増えるほど、ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを多数発現させる必要があるためにベクター構築などに労力がかかるという問題がある。
【0006】
複数の遺伝子を同時に編集する他の方法として、ＣＲＩＳＰＲのオフターゲット効果を利用するという手段がある。この方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡがミスマッチ配列を切断する性質を利用する。すなわち、２０～２４塩基をターゲットするｇＲＮＡの配列を、異なる複数の遺伝子をそれぞれ１～２塩基ミスマッチで編集するように設計すれば、ひとつのｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡで複数の遺伝子を同時に編集できるというものである。こうしたオフターゲット効果を利用した方法には、ひとつの遺伝子にひとつのｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを使用する方法に比べて、少ないｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡで多数の遺伝子を編集できるために、ベクター構築に労力がかからないというメリットがある。
【0007】
一方で、オフターゲット効果を利用する方法には、制約もあることが知られている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ではスペーサー配列を短くするほどオフターゲット効果が少なくなることが報告されている。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のＣａｓ９（以下、SpyCas9と呼ぶ）においては、２０塩基認識のスペーサー配列をもつｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを使用すると、１－２ミスマッチの配列も切断するが、１７塩基認識のスペーサー配列をもつｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを使用するとミスマッチ配列を切断し、変異を入れる効率は劇的に低下する（非特許文献１：Nat Biotechnol. 2014 Mar; 32(3): 279-284）。したがって、現状では、ＰＡＭ配列＋２０塩基の認識でミスマッチ配列も同時に編集するか、ＰＡＭ配列＋１７塩基が完全に一致する相同遺伝子を同時に編集するか、どちらかの方法を選択せざるを得なかった。
【0008】
新たなＣａｓとして、ヒュージファージが有するＣａｓΦという小型のＣａｓファミリーが存在することが報告されており、その中のＣａｓΦ２が、試験管内の実験において、１６残基という短いターゲット配列を切断することが報告された（非特許文献２：Science (2020）369, 333-337、非特許文献３：Nature Communications (2021) volume 12, Article number: 4476）。さらにＣａｓΦについては、結晶構造解析に基づく研究が行われており、非標的鎖と相互作用することが予測されるヘリックスに対応する１５５位～１７６位を欠失させたｖＣａｓΦにおいて、反応速度が増大することが開示された（非特許文献４：Nature Structural & Molecular Biology (2021) vol.28, pp.652-661）。ＣａｓΦを用いた植物におけるゲノム編集についても報告されている（非特許文献５：Int. J. Mol. Sci. (2022), 23, 5755)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Nat Biotechnol. 2014 Mar; 32(3): 279-284
【非特許文献2】Science (2020）369, 333-337
【非特許文献3】Nature Communications (2021) volume 12, Article number: 4476
【非特許文献4】Nature Structural & Molecular Biology (2021) vol. 28, pp. 652-661
【非特許文献5】Int. J. Mol. Sci. (2022), 23, 5755
【非特許文献6】Plant Biotechnology (2016) 33, 235-243
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
上述した多数の遺伝子を同時に編集する技術、とくに、オフターゲットを活用する技術は、機能冗長性をもつ遺伝子同士がある程度の配列類似性を持つことを前提とする。しかしながら、実際には機能重複する遺伝子の配列類似度は十分に高くない、という問題があることが経験的に知られていた。
【0011】
発明者らは、とくに機能冗長性が問題となる植物の代表例であるシロイヌナズナのゲノム配列情報を解析し、機能冗長性を持つ遺伝子同士の配列がどの程度連続して一致しているかを解析した。その結果、塩基配列が連続して一致する長さが２４塩基未満であるような遺伝子が、過半数に近いことが分かった。したがって、機能冗長性を有する相同遺伝子群を破壊するためには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９やＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａでは認識長が長すぎるか、またはオフターゲット効果が少なすぎるという問題があることを見出した。
【0012】
そこで、本発明は、かかる問題を解決すべくなされたものであって、少数のｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを用いて、機能重複している多数の遺伝子を同時に編集する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明の上記目的を解決すべく鋭意研究を行ったところ、ヒュージファージ由来のＣａｓΦタンパク質が、１６以上のヌクレオチド長であり、０～２個のミスマッチを含むターゲット配列を、細胞内で切断可能であることを見出し、重複遺伝子のゲノム編集方法についての発明に至った。
そこで本発明は以下に関する：
［１］ 細胞の重複遺伝子のゲノム編集方法であって、前記重複遺伝子が、ゲノム編集の対象となる１６ヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いは１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有し；ここで前記方法が、
（ａ）前記ターゲット配列及びミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を含むｃｒＲＮＡ；及び、
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質；
を、前記細胞内で発現させる工程を含む、重複遺伝子のゲノム編集方法。
［２］前記ＣａｓΦタンパク質が、ＣａｓΦ１、ＣａｓΦ２、ｖＣａｓΦ及びＣａｓΦ３からなる群から選ばれる少なくとも１のタンパク質である、項目１に記載のゲノム編集方法。
［３］ 前記ＣａｓΦタンパク質が、配列番号１、２、３及び４からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のゲノム編集方法。
［４] 前記重複遺伝子が、機能冗長性を有する重複配列である、項目１～３に記載のゲノム編集方法。
［５］ 前記重複遺伝子が、ターゲット配列の近傍にＰＡＭ配列を含む、項目１～４のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［６］ 前記スペーサー配列が、前記ターゲット配列と、完全一致するように決定される、項目１～５のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［７］ 前記重複遺伝子が、１６以上のヌクレオチド長のターゲット配列と、場合により当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有する、項目１～６のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［８］ 前記重複遺伝子が、１７以上のヌクレオチド長のターゲット配列と当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有する、項目１～７のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［９］ 前記重複遺伝子が、前記細胞のゲノム中に２～１００コピー存在する、項目１～８のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［１０］ 前記細胞のゲノム中に含まれる重複遺伝子のうち、一部又は全ての重複遺伝子を編集する、項目１～９のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［１１］ 前記細胞が、植物細胞である、項目１～１０のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［１２］ 前記ｃｒＲＮＡ及び／又は前記ＣａｓΦタンパク質を、発現ベクターにより前記細胞内に導入して発現させる、項目１～１１のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［１３］ 前記発現ベクターが、一過性又は恒常性発現ベクターである、項目１２に記載のゲノム編集方法。
［１４］ 細胞の重複遺伝子のゲノム編集用キットであって、前記重複遺伝子が、ゲノム編集の対象となる１６ヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いは１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有し、前記キットが；
（ａ）前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を導入可能なｃｒＲＮＡの発現カセット；及び、
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質の発現カセット
を含む、前記キット。
そこで本発明は以下に関する：
［１］ 細胞の重複遺伝子のゲノム編集方法であって、前記重複遺伝子が、ゲノム編集の対象となる１６ヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いは１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有し；ここで前記方法が、
（ａ）前記ターゲット配列及びミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を含むｃｒＲＮＡ；及び、
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質；
を、前記細胞内で発現させる工程を含む、重複遺伝子のゲノム編集方法。
［２］前記ＣａｓΦタンパク質が、ＣａｓΦ１、ＣａｓΦ２、ｖＣａｓΦ及びＣａｓΦ３からなる群から選ばれる少なくとも１のタンパク質である、項目１に記載のゲノム編集方法。
［３］ 前記ＣａｓΦタンパク質が、配列番号１、２、３及び４からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のゲノム編集方法。
［４] 前記重複遺伝子が、機能冗長性を有する重複配列である、項目１～３に記載のゲノム編集方法。
［５］ 前記重複遺伝子が、ターゲット配列の近傍にＰＡＭ配列を含む、項目１～４のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［６］ 前記スペーサー配列が、前記ターゲット配列と、完全一致するように決定される、項目１～５のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［７］ 前記重複遺伝子が、１６以上のヌクレオチド長のターゲット配列と、場合により当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有する、項目１～６のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［８］ 前記重複遺伝子が、１７以上のヌクレオチド長のターゲット配列と当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有する、項目１～７のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［９］ 前記重複遺伝子が、前記細胞のゲノム中に２～１００コピー存在する、項目１～８のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［１０］ 前記細胞のゲノム中に含まれる重複遺伝子のうち、一部又は全ての重複遺伝子を編集する、項目１～９のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［１１］ 前記細胞が、植物細胞である、項目１～１０のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［１２］ 前記ｃｒＲＮＡ及び／又は前記ＣａｓΦタンパク質を、発現ベクターにより前記細胞内に導入して発現させる、項目１～１１のいずれか一項に記載のゲノム編集方法。
［１３］ 前記発現ベクターが、一過性又は恒常性発現ベクターである、項目１２に記載のゲノム編集方法。
［１４］ 細胞の重複遺伝子のゲノム編集用キットであって、前記重複遺伝子が、ゲノム編集の対象となる１６ヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いは１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有し、前記キットが；
（ａ）前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を導入可能なｃｒＲＮＡの発現カセット；及び、
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質の発現カセット
を含む、前記キット。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、少数のｃｒＲＮＡを用いて多数の相同な遺伝子を同時に編集することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図１Ａは、シロイヌナズナにおける重複遺伝子をグループ分けし、グループ内において一致する連続塩基配列の長さにより分類したグラフを示す。１３８３個の重複遺伝子群をPTGbaseより抽出した。横軸が一致する連続塩基配列の長さであり、縦軸がグループの数を表す。図１Ｂは、図１Ａにおける横軸の一致する連続塩基配列の長さについて、１～６０残基長を拡大して示したグラフを示す。連続一致が３０塩基未満の重複遺伝子群は、８１８群であり、ＰＡＭを含めた場合に、多くの重複遺伝子では同時ターゲットができる蓋然性が低い。
【図4A】図４は、タバコの葉に対して、アグロインフィルトレーションを行い、遺伝子導入された箇所におけるゲノム編集の結果の解析を示す。図４（Ａ）は、ＮｂＰＤＳ－１をターゲットとした場合の、導入された変異を示す。
【図4B】図４は、タバコの葉に対して、アグロインフィルトレーションを行い、遺伝子導入された箇所におけるゲノム編集の結果の解析を示す。図４（Ｂ）は、ＮｂＰＤＳ－２をターゲットとした場合の、導入された変異を示す。
【図4C】図４は、タバコの葉に対して、アグロインフィルトレーションを行い、遺伝子導入された箇所におけるゲノム編集の結果の解析を示す。図４（Ｃ）は、ＮｂＲＤＲ６－１をターゲットとした場合の、導入された変異を示す。
【図4D】図４は、タバコの葉に対して、アグロインフィルトレーションを行い、遺伝子導入された箇所におけるゲノム編集の結果の解析を示す。図４（Ｄ）は、ＮｂＲＤＲ６－２をターゲットとした場合の、導入された変異を示す。
【図4E】図４は、タバコの葉に対して、アグロインフィルトレーションを行い、遺伝子導入された箇所におけるゲノム編集の結果の解析を示す。図４（Ｅ）は、ＮｂＳＧＳ３－１をターゲットとした場合の、導入された変異を示す。
【図4F】図４は、タバコの葉に対して、アグロインフィルトレーションを行い、遺伝子導入された箇所におけるゲノム編集の結果の解析を示す。図４（Ｆ）は、ＮｂＳＧＳ３－２をターゲットとした場合の、導入された変異を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の一の態様は、重複遺伝子のゲノム編集方法に関する。より具体的に、本発明の重複遺伝子のゲノム編集方法において編集される重複遺伝子は、ゲノム編集の対象となる１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列、及び/又は当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列を有することにより特徴づけられる。本発明の重複遺伝子のゲノム編集方法は、かかる重複遺伝子を含む細胞に
（ａ）前記ターゲット配列及びミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を含むｃｒＲＮＡ；及び、
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質；
を、前記細胞内で発現させる工程を含む。本発明の方法により、ｃｒＲＮＡとＣａｓΦとが細胞内で発現することにより、重複遺伝子のターゲット配列が認識されて切断が可能になり、それによりゲノム編集が可能になる。本発明の方法は、重複遺伝子を多く含む生物の細胞に対して使用されることが好ましい。そのような生物として、植物、動物、菌類が挙げられる。植物の中でも特に、穀物、園芸作物、観賞用植物、又は飼料植物において用いられることが好ましく、特にイネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、サトウキビなどのイネ科植物、ダイズなどのマメ科植物、そばなどのタデ科植物、キュウリ、スイカ、カボチャ、ズッキーニなどのウリ科植物、ナス、トマト、ジャガイモ、トウガラシ、ピーマン、タバコなどのナス科植物、サツマイモなどのヒルガオ科植物、タロイモ、サトイモなどのサトイモ科植物、自然薯、ヤマイモ、ナガイモなどのヤマノイモ科植物、キャベツ、ハクサイ、カブ、ダイコン、シロイヌナズナなどのアブラナ科植物、シソ、バジル、ローズマリーなどのシソ科植物、サクラ、ウメ、モモ、イチゴ、リンゴ、ナシなどのバラ科植物、ニンジン、セロリ、クミン、ミツバ、パセリなどのセリ科植物、タマネギ、ネギ、ニンニクなどのヒガンバナ科植物、キャッサバなどのトウダイクサ科植物など、産業上有用な任意の植物が挙げられる。
（ａ）前記ターゲット配列及びミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を含むｃｒＲＮＡ；及び、
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質；
を、前記細胞内で発現させる工程を含む。本発明の方法により、ｃｒＲＮＡとＣａｓΦとが細胞内で発現することにより、重複遺伝子のターゲット配列が認識されて切断が可能になり、それによりゲノム編集が可能になる。本発明の方法は、重複遺伝子を多く含む生物の細胞に対して使用されることが好ましい。そのような生物として、植物、動物、菌類が挙げられる。植物の中でも特に、穀物、園芸作物、観賞用植物、又は飼料植物において用いられることが好ましく、特にイネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、サトウキビなどのイネ科植物、ダイズなどのマメ科植物、そばなどのタデ科植物、キュウリ、スイカ、カボチャ、ズッキーニなどのウリ科植物、ナス、トマト、ジャガイモ、トウガラシ、ピーマン、タバコなどのナス科植物、サツマイモなどのヒルガオ科植物、タロイモ、サトイモなどのサトイモ科植物、自然薯、ヤマイモ、ナガイモなどのヤマノイモ科植物、キャベツ、ハクサイ、カブ、ダイコン、シロイヌナズナなどのアブラナ科植物、シソ、バジル、ローズマリーなどのシソ科植物、サクラ、ウメ、モモ、イチゴ、リンゴ、ナシなどのバラ科植物、ニンジン、セロリ、クミン、ミツバ、パセリなどのセリ科植物、タマネギ、ネギ、ニンニクなどのヒガンバナ科植物、キャッサバなどのトウダイクサ科植物など、産業上有用な任意の植物が挙げられる。
【0017】
一態様によれば、重複遺伝子とは、１つのゲノム内に２つ以上含まれる相同遺伝子のことをいう。相同遺伝子とは、例えば、同一の祖先遺伝子に由来し、同じ構造・機能を持つ遺伝子のことをいう。一態様によれば、重複遺伝子は、互いに６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上の配列相同性（好ましくは配列同一性）を有する塩基配列を有する遺伝子として定義することができる。一態様によれば、重複遺伝子は、所定長以上の共通する塩基配列を含むか、及び／又は所定長以上の塩基配列に対し、１塩基又は２塩基のミスマッチを有する塩基配列を含む遺伝子として定義することもできる。ここでいう所定長は、適宜選択されてよいが、一例として１６塩基以上、１７塩基以上、又は１８塩基以上である。重複遺伝子は、好ましくは機能冗長性を有する遺伝子である。複数の相同遺伝子を含むグループを重複遺伝子群という。重複遺伝子は、主に１つの染色体上で繰り返し存在しているが、転座して異なる染色体上に存在していてもよい。ゲノム編集対象となる重複遺伝子群には、ターゲット配列、及び／又は当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列を共有する遺伝子が複数存在する。１回のゲノム編集でゲノム編集対象となる重複遺伝子群の全てにおいてゲノム編集を達成する観点からは、重複遺伝子群に含まれるすべての遺伝子において、ターゲット配列及び／又はミスマッチ配列が共有されていることが好ましい。ゲノム編集対象となる重複遺伝子群に含まれる重複遺伝子の数は、特に限定されないが、通常２～１００コピー存在しうる。ゲノム編集対象となる重複遺伝子群に含まれる重複遺伝子の数は、全ゲノム重複を起源として持つ重複遺伝子であれば、３コピー以上であってもよいし、５コピー以上であってもよく、かつ５０コピー以下であってもよいし、２０コピー以下であってもよいし、１０コピー以下がより好ましい。ターゲット配列を共有することにより、本発明のゲノム編集方法によって、重複遺伝子群内の複数の遺伝子のターゲット配列及び／又はミスマッチ配列の一部又は全てにおいて切断が生じ、ゲノム編集が可能になる。ゲノム編集対象となる重複遺伝子群に含まれる遺伝子は、互いに高い配列類似性を有することが望ましい。
【0018】
本発明において、ターゲット配列とは、本発明に係るゲノム編集方法におけるｃｒＲＮＡのスペーサー配列に対応する配列であり、本発明に係るゲノム編集方法より切断されて、ゲノム編集される配列に関する。ターゲット配列は、重複遺伝子群内の重複遺伝子に含まれる共通する配列であって、１６又は１７ヌクレオチド長の連続する配列から構成されうる。ターゲット配列は、重複遺伝子群内で完全に一致する配列である。一方、ターゲット配列に対して、１又は２個のミスマッチが含まれているミスマッチ配列も、本発明に係るゲノム編集方法より切断されて、ゲノム編集されうる。ｃｒＲＮＡにおけるスペーサー配列は、ターゲット配列の近傍、特に５’側に隣接してＰＡＭ配列が含まれるようにターゲット配列を設定することが必要となる。ＰＡＭ配列としては、ＣａｓΦが認識するＰＡＭ配列であればよく、一例としてＴＴＮ、ＮＴＮが挙げられる。
【0019】
１つのｃｒＲＮＡスペーサー配列により、ターゲット配列とミスマッチ配列とがゲノム編集方法により切断されて、ゲノム編集が可能になる。これにより、重複遺伝子群に含まれるターゲット配列とミスマッチ配列の全て又は一部について、ゲノム編集が可能になる。シロイヌナズナは１３８３個の重複遺伝子群を有しており、そのうち、３０塩基未満の連続一致を有する重複遺伝子群は８１８個である（図１Ａ）。したがって、従来のＣａｓ９を用いた場合には、多くの重複遺伝子では、１つのｃｒＲＮＡスペーサー配列でゲノム編集を行うことは困難である。一方、シロイヌナズナにおいて１６以上のヌクレオチド長の連続する共通配列を有する重複遺伝子群は、約７０％となる。さらに、１又は２個のミスマッチを許容することで、約８０％超の重複遺伝子群について、１つのｃｒＲＮＡのスペーサー配列によって、ゲノム編集が可能になる。シロイヌナズナにおいて１７以上のヌクレオチド長の連続する共通配列を有する重複遺伝子群は、約６５％となる。さらに、１又は２個のミスマッチを許容することで、約７５％超の重複遺伝子群について、１つのｃｒＲＮＡのスペーサー配列によって、ゲノム編集が可能になる。ターゲット配列のヌクレオチド長は、使用するＣａｓΦに応じて変化しうる。
【0020】
ターゲット配列が１６ヌクレオチド長の配列である場合、ゲノム編集対象となる重複遺伝子群には、ターゲット配列のみを含む遺伝子から構成されるように、ターゲット配列を設定してもよいし、ミスマッチ配列を含む遺伝子をさらに含むようにターゲット配列を設定してもよい。
【0021】
一方、ターゲット配列が１７ヌクレオチド長の配列である場合、ゲノム編集対象となる重複遺伝子群には、ターゲット配列を含む遺伝子と、ミスマッチ配列を含む遺伝子とが含まれるように、ターゲット配列を設定することができる。
【0022】
ｃｒＲＮＡは、ターゲット配列と同一の塩基配列からなるスペーサー配列を含むＲＮＡである。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、ゲノムＤＮＡのターゲット配列又はミスマッチ配列に誘導し、Ｃａｓタンパク質の作用によりターゲット配列又はミスマッチ配列とＰＡＭとの間でＤＮＡを切断することができる。ｃｒＲＮＡ配列は、利用するＣａｓタンパク質の種類に応じて選択して使用することができる。ＣａｓΦタンパク質に対するｃｒＲＮＡ配列は公知のものを使用することができるが、一例として、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４（ＲＮＡ配列として配列番号１６７、配列番号１６８、及び配列番号１６９）からなる配列から選ばれる配列をCasΦタンパク質の種類に応じて、使用することができる。一例として、CasΦ２及びｖCasを使用する場合には、配列番号１２の配列を用いることができる。CasΦ１を用いる場合には、配列番号１３の配列を用いることができる。CasΦ３を使用する場合には、配列番号１４の配列を用いることができる。ｃｒＲＮＡは、以下に説明する発現カセットを用いて、一過的又は恒常的で発現することができる。
【0023】
ＣａｓΦタンパク質とは、ヒュージファージ由来のＣａｓファミリーのタンパク質である。ＣａｓΦタンパク質は、１６以上のヌクレオチド長のターゲット配列を切断するとともに、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列を切断する活性を有する。ＣａｓΦタンパク質が切断するターゲット配列の長さの上限は、特に限定されないが、切断活性の観点から、通常２０以下、好ましくは１８以下、さらに好ましくは１７以下である。ＣａｓΦは、ＣａｓΦ１、ＣａｓΦ２、及びＣａｓΦ３からなる群から選ばれうるが、特にオフターゲット活性の観点から特にＣａｓΦ２（Ｃａｓ１２ｊ２とも呼ばれる）を使用することが好ましい。ＣａｓΦに対しては、活性を完全に損なわない限りにおいて、アミノ酸配列の変異（例えば、置換、欠失、付加など）を有していてもよい。この観点から、ＣａｓΦタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選ばれるアミノ酸配列、又は当該配列に対し、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列相同性（好ましくは配列同一性）を有する配列を有しうる。特にＣａｓΦ２において、非ターゲット鎖と相互作用するとされるヘリックス領域（配列番号１の１５５位～１７６位）を削除した変異型ＣａｓΦ２（ｖＣａｓΦとも呼ばれる：アミノ酸配列：配列番号４）において、切断反応の速度が向上することから、より好ましい（非特許文献３）。
【0024】
なお、本明細書において、２つのアミノ酸配列の「相同性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一又は類似のアミノ酸残基が現れる比率であり、２つのアミノ酸配列の「同一性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率である。なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10）等を用いて求めることが可能である。
【0025】
配列相同性又は同一性により特定された配列を有するＣａｓΦタンパク質は、さらに所望される切断活性により特定される。このような切断活性としては、インビトロ又はインビボにおける、１６ヌクレオチド長以上のターゲット配列及び当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列の切断活性により特定されうる。ＣａｓΦタンパク質の切断活性については、in vitroにおいて公知の方法に従い評価することができる。ＣａｓΦ２の骨格と、ＣａｓΦ３の骨格との間でＲＭＳＤ値は、ＰＤＢ＿ＩＤ：７ｏｄｆ（ＣａｓΦ３）、７ｌｙｓ（ＣａｓΦ２）を用いた場合に、ＰｙＭＯＬソフトウェアａｌｉｇｎにて計算すると１．１３５Ａ未満、核酸をさらに含めると０．９７であることから、ＣａｓΦ２と、ＣａｓΦ３との間の構造はかなり類似している。加えて、および、独自ソフトウェアにてTM-score=0.85以上であったことからも、構造が類似していることが支持される。したがって、変異体については、配列同一性又は相同性で特定に加えて、又は代えてＲＭＳＤ値により特定することができる。ＣａｓΦ１、ＣａｓΦ２、ＣａｓΦ３、ｖＣａｓΦからなる群から選ばれる、少なくとも１のＣａｓタンパク質の骨格と、変異体の骨格との間のCα平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）が２．５Ａ未満、好ましくは１．５Ａ未満、さらに好ましくは１Ａ未満である場合に、元のＣａｓタンパク質が奏する作用と同等の作用を生じる蓋然性が高いといえる。あるいは、TM-score値により特定することができる。ＣａｓΦ１、ＣａｓΦ２、ＣａｓΦ３、ｖＣａｓΦからなる群から選ばれる、少なくとも１のＣａｓタンパク質の骨格と、変異体の骨格との間のTM-scoreが０．８以上、好ましくは０．８５以上、さらに好ましくは０．９以上である場合に、元のＣａｓタンパク質が奏する作用と同等の作用を生じる蓋然性が高いといえる。
【0026】
ＣａｓΦタンパク質には、所望される活性が損なわれない限りにおいて、シグナル配列、タグ配列、レポーター配列などの追加の配列が含まれてもよい。発現されたタンパク質が、核内で作用することを担保する観点から、シグナル配列としては、核移行シグナルが付加されていることが望ましい。核移行シグナルは、１つ又は複数の核移行シグナルを直列に配置してもよい。核移行シグナルとしては、植物種に応じて適宜選択することができ、一例として、KRPAATKKAGQAKKKK（配列番号７）、及び／又はGSDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKPKKKRKV（配列番号８）を使用することができる。これにより細胞内で発現されたＣａｓΦタンパク質は、核内に移行し、核内にてｃｒＲＮＡと協働してターゲット配列を切断することができる。
【0027】
ｃｒＲＮＡ又は発現用カセットとしては、通常、プロモーター配列を含み、その制御下に、ｃｒＲＮＡをコードする配列を配置することで作成することができる。ｃｒＲＮＡ発現用カセットは、１のポリヌクレオチド上に含まれてもよいし、異なるポリヌクレオチド上に含まれてもよい。ｃｒＲＮＡとして、ｃｒＲＮＡと複数連結して一本鎖としたガイドＲＮＡをコードする配列をプロモーター配列の制御下に配置することで、ｃｒＲＮＡ発現用カセットとしてもよい。
【0028】
ＣａｓΦタンパク質についても、定法に従い、一過的又は恒常的に細胞内で発現させることができる。一例として、ＣａｓΦタンパク質をコードする配列のポリヌクレオチドを、一過的又は恒常的に発現を許容するプロモーター配列を含む発現カセット中に、プロモーターの制御下に配置してＣａｓΦ発現用カセットを調製することができる。プロモーターの制御下に配置するとは、プロモーターにより発現が制御されるように配置されることを言い、プロモーターの３’末端から、適切な塩基数、例えば１０ｂｐ～２００ｂｐの塩基数を空けて配置されてもよい。
【0029】
ｃｒＲＮＡ発現用カセットとＣａｓΦ発現用カセットは、１のポリヌクレオチド上に含まれてもよいし、異なるポリヌクレオチド上に含まれてもよい。これらの発現用カセットは、必要に応じて他の要素を含んでもよい。このような要素としては、ターミネーターなど発現に必要な要素や、マルチクローニングサイト、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子、複製起点など、プラスミド又はベクターの調製に必要な要素が含まれていてもよい。
【0030】
ｃｒＲＮＡ発現用カセット及びＣａｓΦ発現用カセットにおいて使用されるプロモーターとしては、発現させる生物種に応じて適宜選択することができる。植物において発現さ
せる場合、一例として、ｐｏｌＩＩ系プロモーターを使用することもできるが、比較的短いＲＮＡの転写をより正確に行わせるという観点から、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターが好ましい。ｐｏｌＩＩ系プロモーターとしては、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＲＰＳ５Ａプロモーター、ＵＢＱプロモーター、ＤＤ４５プロモーター、ＮＯＳプロモーター等が挙げられる。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、Ｕ６－ｓｎＲＮＡ（例えばＵ６．１－ｓｎＲＮＡ、Ｕ６．２６－ｓｎＲＮＡ等）プロモーター、Ｕ３－ｓｎＲＮＡプロモーター等が挙げられる。
せる場合、一例として、ｐｏｌＩＩ系プロモーターを使用することもできるが、比較的短いＲＮＡの転写をより正確に行わせるという観点から、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターが好ましい。ｐｏｌＩＩ系プロモーターとしては、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＲＰＳ５Ａプロモーター、ＵＢＱプロモーター、ＤＤ４５プロモーター、ＮＯＳプロモーター等が挙げられる。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、Ｕ６－ｓｎＲＮＡ（例えばＵ６．１－ｓｎＲＮＡ、Ｕ６．２６－ｓｎＲＮＡ等）プロモーター、Ｕ３－ｓｎＲＮＡプロモーター等が挙げられる。
【0031】
ｃｒＲＮＡ発現用カセット及びＣａｓΦ発現用カセットにおいて使用されるターミネーターとしては、Ｃａｓタンパク質コード配列からの転写を終結させ（好ましくは、さらにＣａｓタンパク質コード配列から転写されるｍＲＮＡにｐｏｌｙＡ配列を付加でき）ることができる塩基配列である限り特に制限されない。またガイドＲＮＡについては、ｐｏｌｙＴ配列を付加することもできる。終結シグナルとしては、例えば、ヒートショックタンパク質終結シグナル（HspT:Heat shock protein Terminator）、NosT(Noparin synhase Terminator)、３５ｓＴ(CaMV 35S Terminator)、Ｐｅａ３Ａ(Pea Rubisco subunit 3A)等が挙げられる。
【0032】
別の態様では、本発明はゲノム編集対象となる重複遺伝子群におけるターゲット配列を決定する工程を含む、ｃｒＲＮＡ発現用カセットの製造方法に関してもよい。重複遺伝子群におけるターゲット配列は、ゲノム情報から、ゲノム編集対象となる重複遺伝子群において、ＣａｓΦのＰＡＭ配列近傍に１６ヌクレオチド長の連続配列が、ミスマッチを含まないように選択されてもよいし、１又は２個のミスマッチを許容するように選択されてもよい。別の態様では、重複遺伝子群におけるターゲット配列は、ゲノム情報から、ゲノム編集対象となる重複遺伝子群において、ＣａｓΦのＰＡＭ配列近傍に１７ヌクレオチド長の連続配列が、ミスマッチを含まない配列と、１又は２個のミスマッチを含むミスマッチ配列とから構成されるように選択される。決定されたターゲット配列をスペーサー配列とし、その余の配列と連結することで、ｃｒＲＮＡ配列を設計することができる。こうして設計されたｃｒＲＮＡ配列からなるポリヌクレオチドを、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作成することができる。こうして作製されたｃｒＲＮＡ配列又はガイドＲＮＡ配列からなるポリヌクレオチドを、公知の遺伝子工学的手法、例えばＰＣＲ、制限酵素処理、ＤＮＡ連結、in vitro転写技術などを利用して、ｃｒＲＮＡ発現用カセットに組み込むことができる。
【0033】
本発明の別の態様では、細胞の重複遺伝子のゲノム編集用キットに関していてもよい。かかるキットにおいて、ゲノム編集される重複遺伝子は、１６ヌクレオチド長のターゲット配列のみを有するか、或いは１６又は１７ヌクレオチド長のターゲット配列と、当該ターゲット配列に対して１～２塩基のミスマッチを含むミスマッチ配列とを有することを特徴とする。かかるキットは以下の：
（ａ）前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を導入可能なｃｒＲＮＡの発現カセット；及び、
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質の発現カセット；
を含む。ｃｒＲＮＡの発現カセットとＣａｓΦタンパク質の発現カセットは、一例としてプラスミドやベクターなどに組み込み、細胞へと遺伝子導入される。本発明に係るゲノム編集用キットには、さらに、必要に応じて核酸導入試薬、緩衝液等、本発明のゲノム編集方法の実施に必要な他の材料、試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。本発明のゲノム編集方法の実施に必要な他の材料としては、ｃｒＲＮＡの発現カセット及び／又はＣａｓΦタンパク質の発現カセットに加えて、ドナーポリヌクレオチドが挙げられる。ドナーポリヌクレオチドを核内へと導入することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより生じた切断箇所に、ドナーポリヌクレオチドのノックインが可能となる。
（ａ）前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を標的とするスペーサー配列を導入可能なｃｒＲＮＡの発現カセット；及び、
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質の発現カセット；
を含む。ｃｒＲＮＡの発現カセットとＣａｓΦタンパク質の発現カセットは、一例としてプラスミドやベクターなどに組み込み、細胞へと遺伝子導入される。本発明に係るゲノム編集用キットには、さらに、必要に応じて核酸導入試薬、緩衝液等、本発明のゲノム編集方法の実施に必要な他の材料、試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。本発明のゲノム編集方法の実施に必要な他の材料としては、ｃｒＲＮＡの発現カセット及び／又はＣａｓΦタンパク質の発現カセットに加えて、ドナーポリヌクレオチドが挙げられる。ドナーポリヌクレオチドを核内へと導入することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより生じた切断箇所に、ドナーポリヌクレオチドのノックインが可能となる。
【0034】
本発明の別の態様では、以下の：
（ａ）ｃｒＲＮＡ発現用カセットの製造方法により製造されたｃｒＲＮＡ発現用カセットを細胞に導入する工程、及び
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質の発現カセットを切断可能なＣａｓΦタンパク質をコードする、ＣａｓΦ発現用カセットを細胞に導入する工程
を含む、細胞の重複遺伝子のゲノム編集方法に関してもよい。ｃｒＲＮＡ発現用カセット及びＣａｓΦ発現用カセットは、２つのポリヌクレオチド上で別個に又は同時に導入されてもよいし、１のポリヌクレオチド上で同時に導入されてもよい。ｃｒＲＮＡの発現カセット及び／又はＣａｓΦタンパク質の発現カセットの細胞への導入に加えて、ドナーポリヌクレオチドを導入することが挙げられる。ドナーポリヌクレオチドを核内へと導入することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより生じた切断箇所に、ドナーポリヌクレオチドのノックインが可能となる。
（ａ）ｃｒＲＮＡ発現用カセットの製造方法により製造されたｃｒＲＮＡ発現用カセットを細胞に導入する工程、及び
（ｂ）ヒュージファージ由来であり、前記ターゲット配列及び前記ミスマッチ配列を切断可能なＣａｓΦタンパク質の発現カセットを切断可能なＣａｓΦタンパク質をコードする、ＣａｓΦ発現用カセットを細胞に導入する工程
を含む、細胞の重複遺伝子のゲノム編集方法に関してもよい。ｃｒＲＮＡ発現用カセット及びＣａｓΦ発現用カセットは、２つのポリヌクレオチド上で別個に又は同時に導入されてもよいし、１のポリヌクレオチド上で同時に導入されてもよい。ｃｒＲＮＡの発現カセット及び／又はＣａｓΦタンパク質の発現カセットの細胞への導入に加えて、ドナーポリヌクレオチドを導入することが挙げられる。ドナーポリヌクレオチドを核内へと導入することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより生じた切断箇所に、ドナーポリヌクレオチドのノックインが可能となる。
【0035】
遺伝子導入は、本技術分野に公知の手法を用いて行うことができる。導入方法は、特に制限されず、導入する物の種類や導入対象に応じて、適宜選択することができる。導入方法としては、直接法とウイルスベクターを用いた方法とに大別される。直接法としては、植物細胞の細胞壁を取り除いたプロトプラストの貪食作用を利用するPEG法やエレクトロポレーション法、金粒子とともに打ち込むパーティクル・ガン法、ウイスカー法などが利用されうる。ウイルスベクターを用いた方法としては、宿主の植物種に応じて、アグロバクテリウム、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、カウピーモザイク ウイルス（ＣＰＭＶ）、ズッキーニイエローモザイクウイルス（ＺＹＭＶ）、ジェミニウイルスなどをベクターとして使用することができる。これらの中でも、簡便性や安全性等の観点から、好ましくはアグロバクテリウム法が挙げられる。また、上記のベクターのように、植物体又は植物細胞への導入に適したベクター以外にも、このようなベクターに本発明のポリヌクレオチドを移し替えるためのベクター（例えば、ゲートウェイ（登録商標）のエントリークローンベクター等）も一例として挙げることができる。
【0036】
導入される細胞は、インビトロで培養された細胞であってもよいし、植物体を構成する細胞であってもよい。植物体における導入部位としては、例えば花（特に、花の中の、卵細胞、花粉等）、葉、根、種子、胚等が挙げられる。ゲノム編集による変異を次世代に伝えるべく、生殖細胞においてより効率的にゲノム編集を行うという観点から、導入対象としては、好ましくは茎頂が挙げられる。また、好ましくは、遺伝子導入した細胞から再分化を行ってゲノム編集個体を得る方法、もしくは、体細胞から茎頂を誘導する遺伝子を活用してゲノム編集個体を得る方法を用いてもよい。
【0037】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【0038】
以下、本発明を実施例に則して更に詳細に説明するが、これらの実施例はあくまでも説明のために便宜的に示す例に過ぎず、本発明は如何なる意味でもこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例0039】
実施例１：ヒュージファージ（Huge phage）由来ＣａｓΦ２、ｖＣａｓΦのベクターの調製
（１）ヒュージファージ由来ＣａｓΦ２遺伝子の調製
ヒュージファージ由来のアミノ酸配列情報（配列番号１）を基に、シロイヌナズナにコドン最適化されたＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡ配列に、Ｃ末端核移行シグナル配列－ＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ配列を付加したものを人工合成した（配列番号９）。塩基配列の決定にはサンガー法あるいは次世代シーケンス法を用いた。配列番号１のアミノ酸配列はＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）のＧｅｎＢａｎｋなどのよく知られたデータベースにおいて見出すことができる。
（１）ヒュージファージ由来ＣａｓΦ２遺伝子の調製
ヒュージファージ由来のアミノ酸配列情報（配列番号１）を基に、シロイヌナズナにコドン最適化されたＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡ配列に、Ｃ末端核移行シグナル配列－ＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ配列を付加したものを人工合成した（配列番号９）。塩基配列の決定にはサンガー法あるいは次世代シーケンス法を用いた。配列番号１のアミノ酸配列はＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）のＧｅｎＢａｎｋなどのよく知られたデータベースにおいて見出すことができる。
【0040】
（２）植物における一過的ＣａｓΦ２発現用ベクターの構築
核移行シグナル－ＦＬＡＧタグを付与したシロイヌナズナコドン最適化ＣａｓΦ遺伝子（配列番号９）をｐＥＸ＿３５Ｓ＿ｖｅｃｔｏｒ（ユーロフィンジェノミクス株式会社にて遺伝子合成：図２Ａ）に組み込んだ。配列番号９の合成遺伝子断片と、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したリニア化ｐＥＸ＿３５Ｓ＿ｖｅｃｔｏｒを混合し、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixにより、ＤＮＡ断片を環状プラスミド化した。得られた環状プラスミドで大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の環状プラスミドを有するクローンを選択し、プラスミドを精製した。作製されたベクターのＣａｓΦコード配列の塩基配列（配列番号１０）、アミノ酸配列（配列番号５）をそれぞれ示す。次に、そのベクターについて、ＢｓａＩとＮｒｕＩで切断し、線状ＤＮＡを得た。同時に、以下の配列：
を有するオリゴヌクレオチドをアニーリングした２本鎖ＤＮＡを準備した。切断したベクターとアニーリングした２本鎖ＤＮＡを一種類ずつＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いて環状プラスミド化した。上記の手順で環状プラスミドを精製した。本ベクターはｐＥＸ＿３５Ｓ－ＣａｓΦ２＿ＨＰＴと表記する(図２Ｂ)。
核移行シグナル－ＦＬＡＧタグを付与したシロイヌナズナコドン最適化ＣａｓΦ遺伝子（配列番号９）をｐＥＸ＿３５Ｓ＿ｖｅｃｔｏｒ（ユーロフィンジェノミクス株式会社にて遺伝子合成：図２Ａ）に組み込んだ。配列番号９の合成遺伝子断片と、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したリニア化ｐＥＸ＿３５Ｓ＿ｖｅｃｔｏｒを混合し、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixにより、ＤＮＡ断片を環状プラスミド化した。得られた環状プラスミドで大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の環状プラスミドを有するクローンを選択し、プラスミドを精製した。作製されたベクターのＣａｓΦコード配列の塩基配列（配列番号１０）、アミノ酸配列（配列番号５）をそれぞれ示す。次に、そのベクターについて、ＢｓａＩとＮｒｕＩで切断し、線状ＤＮＡを得た。同時に、以下の配列：
【表1】
【0041】
（３）植物における一過的ｖＣａｓΦ発現用ベクターの構築
核移行シグナル－ＦＬＡＧタグを付与したシロイヌナズナコドン最適化ＣａｓΦ遺伝子（配列番号９）をＰＣＲにて分割した。
以下の配列：
それぞれのプライマーセットをもちいて、配列番号９の合成遺伝子断片を鋳型としてＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応により増幅できた２本のリニアＤＮＡと、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したリニア化ｐＥＸ＿Ｃａｓ９ベクターを混合し、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixにより、DNA断片を環状プラスミド化した。得られた環状プラスミドで大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の環状プラスミドを有するクローンを選択し、プラスミドを精製した。作製されたベクターのｖＣａｓΦコード配列の塩基配列（配列番号１１）、アミノ酸配列（配列番号６）をそれぞれ示す。本ベクターはｐＥＸ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴと表記する。
核移行シグナル－ＦＬＡＧタグを付与したシロイヌナズナコドン最適化ＣａｓΦ遺伝子（配列番号９）をＰＣＲにて分割した。
以下の配列：
【表2】
【0042】
（４）植物個体用ＣａｓΦ２，ｖＣａｓΦベクターの構築
ｐＣＡＭＢＩＡ１０５．１Ｒ（コスモバイオ）をＰｍｌＩとＡｓｅＩで切断して線状バイナリーベクターを取得した。同時に、ｐＥＸ＿３５Ｓ－ＣａｓΦ２＿ＨＰＴ、ｐＥＸ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴそれぞれをＰａｑＣＩで切断して線状ＤＮＡを取得した。それぞれのＤＮＡを線状バイナリーベクターと混合し、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixにより、DNA断片を環状プラスミド化した。得られた環状プラスミドで大腸菌DH5aを形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の環状プラスミドを有するクローンを選択し、プラスミドを精製した。本ベクターはｐＣＡ＿３５Ｓ－ＣａｓΦ２＿ＨＰＴ、ｐＣＡ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴと表記する。
ｐＣＡＭＢＩＡ１０５．１Ｒ（コスモバイオ）をＰｍｌＩとＡｓｅＩで切断して線状バイナリーベクターを取得した。同時に、ｐＥＸ＿３５Ｓ－ＣａｓΦ２＿ＨＰＴ、ｐＥＸ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴそれぞれをＰａｑＣＩで切断して線状ＤＮＡを取得した。それぞれのＤＮＡを線状バイナリーベクターと混合し、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mixにより、DNA断片を環状プラスミド化した。得られた環状プラスミドで大腸菌DH5aを形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の環状プラスミドを有するクローンを選択し、プラスミドを精製した。本ベクターはｐＣＡ＿３５Ｓ－ＣａｓΦ２＿ＨＰＴ、ｐＣＡ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴと表記する。
【0043】
実施例２：シロイヌナズナプロトプラスト細胞におけるＣａｓΦ２、ｖＣａｓΦによる変異導入
（１）シロイヌナズナ遺伝子のゲノム編集実験用のプラスミドの調整
ｐＥＸ＿３５Ｓ－ＣａｓΦ２＿ＨＰＴベクターもしくはｐＥＸ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴベクターをＢｓａＩ－ＨＦで切断した。まずは、これらのベクターによりゲノム編集が可能かを調べるために、シロイヌナズナ由来ＰＤＳ３遺伝子（シロイヌナズナゲノム中にシングルコピーの遺伝子）のゲノム編集実験用のＣａｓΦのｃｒＲＮＡのスペーサー配列をクローニングするために、以下の表３に記載の配列：
を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれのＳｅｔごとにアニーリングした２本鎖ＤＮＡを合計３種類準備した。ＰＤＳ３遺伝子は、カロテノイド生合成酵素である フィトエン不飽和化酵素（phytoene desaturase)３遺伝子であり、ノックアウトされると植物細胞が白化することが知られている。これにより、植物体でノックアウトされている箇所の特定が可能になる。切断したベクターとアニーリングした２本鎖ＤＮＡを一種類ずつＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いて環状プラスミド化した。得られた環状プラスミドで大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の環状プラスミドを有するクローンを選択し、プラスミドを精製した。
（１）シロイヌナズナ遺伝子のゲノム編集実験用のプラスミドの調整
ｐＥＸ＿３５Ｓ－ＣａｓΦ２＿ＨＰＴベクターもしくはｐＥＸ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴベクターをＢｓａＩ－ＨＦで切断した。まずは、これらのベクターによりゲノム編集が可能かを調べるために、シロイヌナズナ由来ＰＤＳ３遺伝子（シロイヌナズナゲノム中にシングルコピーの遺伝子）のゲノム編集実験用のＣａｓΦのｃｒＲＮＡのスペーサー配列をクローニングするために、以下の表３に記載の配列：
【表3】
【0044】
（２）シロイヌナズナプロトプラストの調製
約２０～３０日間生育させたシロイヌナズナの葉を、セロハンテープにより表皮を剥ぎとり葉肉細胞を露出させた後、その葉を適量の１．０％セルラーゼ－オノズカＲ１０（ヤクルト社製）、０．２５％マセロザイム Ｒ－１０（ヤクルト社製）、１０ｍＭメルカプトエタノール、４００ｍＭマンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）溶液に浸し、２２℃、５０ｒｐｍで振とうしながら、１時間インキュベートし、プロトプラストを遊離させた。プロトプラストは孔径７０μｍのナイロンフィルターで濾した後、５０ｍｌ容チューブに集め、１００×ｇ、１０分間遠心しプロトプラストを回収した後、上清を捨て、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）緩衝液（Ｗ５緩衝液）で再懸濁した。再懸濁したプロトプラストは１８％スクロース溶液に重層し、４００ｘｇ、５分遠心して、健全な細胞のみを濃縮した。濃縮した細胞は、Ｗ５緩衝液で再度懸濁した。Ｗ５緩衝液による洗浄を２度繰り返した後、４℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後のプロトプラストは、１００×ｇ、５分間遠心後、４００ｍＭマンニトール、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、４ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）緩衝液で再懸濁した。その後、１００×ｇ、５分間遠心することでプロトプラストを回収した後、２．０～３．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう同緩衝液で細胞濃度を調製し、形質転換用プロトプラスト懸濁液を得た。
約２０～３０日間生育させたシロイヌナズナの葉を、セロハンテープにより表皮を剥ぎとり葉肉細胞を露出させた後、その葉を適量の１．０％セルラーゼ－オノズカＲ１０（ヤクルト社製）、０．２５％マセロザイム Ｒ－１０（ヤクルト社製）、１０ｍＭメルカプトエタノール、４００ｍＭマンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）溶液に浸し、２２℃、５０ｒｐｍで振とうしながら、１時間インキュベートし、プロトプラストを遊離させた。プロトプラストは孔径７０μｍのナイロンフィルターで濾した後、５０ｍｌ容チューブに集め、１００×ｇ、１０分間遠心しプロトプラストを回収した後、上清を捨て、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）緩衝液（Ｗ５緩衝液）で再懸濁した。再懸濁したプロトプラストは１８％スクロース溶液に重層し、４００ｘｇ、５分遠心して、健全な細胞のみを濃縮した。濃縮した細胞は、Ｗ５緩衝液で再度懸濁した。Ｗ５緩衝液による洗浄を２度繰り返した後、４℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後のプロトプラストは、１００×ｇ、５分間遠心後、４００ｍＭマンニトール、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、４ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）緩衝液で再懸濁した。その後、１００×ｇ、５分間遠心することでプロトプラストを回収した後、２．０～３．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう同緩衝液で細胞濃度を調製し、形質転換用プロトプラスト懸濁液を得た。
【0045】
（３）シロイヌナズナプロトプラストへのプラスミドＤＮＡ導入
得られた形質転換用プロトプラスト懸濁液３５μＬと１０ｕＭのプラスミド溶液１０μＬを混合後、４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、２００ｍＭマンニトール、１００ｍＭＣａＣｌ2溶液を４５μＬずつ、それぞれ９６穴プレート（ヌンク社製、丸底）に入れ、９００ｒｐｍ、１５秒間振とうし、溶液を混合した。混合液は１０分間室温で静置した。静置後の混合液にＷ５緩衝液を２００μＬ勢いよく加えることでプロトプラストを懸濁させた後、１００×ｇ、５分間遠心し、プロトプラスト細胞をプレート底に集め、上清を２００μＬ捨てることで、プロトプラスト懸濁液を洗浄した。この作業を計４回行った後、各ウェルをパラフィルムでシールし、２２℃で３６時間静置した。
得られた形質転換用プロトプラスト懸濁液３５μＬと１０ｕＭのプラスミド溶液１０μＬを混合後、４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、２００ｍＭマンニトール、１００ｍＭＣａＣｌ2溶液を４５μＬずつ、それぞれ９６穴プレート（ヌンク社製、丸底）に入れ、９００ｒｐｍ、１５秒間振とうし、溶液を混合した。混合液は１０分間室温で静置した。静置後の混合液にＷ５緩衝液を２００μＬ勢いよく加えることでプロトプラストを懸濁させた後、１００×ｇ、５分間遠心し、プロトプラスト細胞をプレート底に集め、上清を２００μＬ捨てることで、プロトプラスト懸濁液を洗浄した。この作業を計４回行った後、各ウェルをパラフィルムでシールし、２２℃で３６時間静置した。
【0046】
（４）ゲノムＤＮＡのＡｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑ解析
プラスミドＤＮＡを導入後２２℃で３６時間静置したプロトプラスト懸濁液を２００μＬ容チューブに回収し、ゲノム抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）と混合後、９５℃で１０分間インキュベートした後、氷上で５分間静置した。熱処理後のプロトプラスト懸濁液からイソプロパノール沈殿によりゲノムＤＮＡを回収した。回収したゲノムＤＮＡは滅菌水で懸濁し、以下の表４に記載の配列のプライマーセットを使用して増幅した約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｉＳｅｑ１００システム（Ｉｌｌｍｉｎａ社）によりＡｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑを行い、ゲノム編集を検出した。ｖＣａｓΦを導入した場合の、標的配列長をそれぞれ１５、１６、１８と変化させた場合の編集の編集効率を、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトで分析した結果を図３に示す。Controlは、蛍光タンパク質GFP発現ベクターの導入区を対照として用いた。さらにｖＣａｓΦのさらなる対照として、ＳｐｙＣａｓ９を標的配列長１８に対して用いた場合の編集効率を調べた。図３のｖＣａｓΦを用いた場合、標的配列長が１６及び１８である場合に、遺伝子編集が可能であった一方で、標的配列長が１５になると、ゲノム編集が生じなかった。ＳｐｙＣａｓ９を用いた場合のゲノム編集効率は０．０２程度であったが、ｖＣａｓΦを用いた場合は最大で０．０９程度であった。
プラスミドＤＮＡを導入後２２℃で３６時間静置したプロトプラスト懸濁液を２００μＬ容チューブに回収し、ゲノム抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）と混合後、９５℃で１０分間インキュベートした後、氷上で５分間静置した。熱処理後のプロトプラスト懸濁液からイソプロパノール沈殿によりゲノムＤＮＡを回収した。回収したゲノムＤＮＡは滅菌水で懸濁し、以下の表４に記載の配列のプライマーセットを使用して増幅した約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｉＳｅｑ１００システム（Ｉｌｌｍｉｎａ社）によりＡｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑを行い、ゲノム編集を検出した。ｖＣａｓΦを導入した場合の、標的配列長をそれぞれ１５、１６、１８と変化させた場合の編集の編集効率を、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトで分析した結果を図３に示す。Controlは、蛍光タンパク質GFP発現ベクターの導入区を対照として用いた。さらにｖＣａｓΦのさらなる対照として、ＳｐｙＣａｓ９を標的配列長１８に対して用いた場合の編集効率を調べた。図３のｖＣａｓΦを用いた場合、標的配列長が１６及び１８である場合に、遺伝子編集が可能であった一方で、標的配列長が１５になると、ゲノム編集が生じなかった。ＳｐｙＣａｓ９を用いた場合のゲノム編集効率は０．０２程度であったが、ｖＣａｓΦを用いた場合は最大で０．０９程度であった。
【表4】
【0047】
実施例３： タバコ葉細胞におけるｖＣａｓΦによる変異導入
（１）タバコ遺伝子のゲノム編集実験用のプラスミドの調整
ｐＥＸ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴベクターをＢｓａＩ－ＨＦで切断した。タバコ由来ＰＤＳ、ＲＤＲ６、ＳＧＳ３遺伝子のゲノム編集実験用のＣａｓΦのｃｒＲＮＡを形成するためのスペーサー配列をクローニングするために、以下の表５に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれのＳｅｔごとにアニーリングした２本鎖ＤＮＡを合計２１種類準備した：
ＰＤＳ遺伝子は、カロテノイド生合成酵素であるフィトエン不飽和化酵素（phytoene desaturase）遺伝子であり、ノックアウトされると植物細胞が白化することが知られている。これにより、植物体でノックアウトされている箇所の特定が可能になる。タバコにおいて、ＰＤＳ遺伝子の重複遺伝子が２個存在することが知られている。ＲＤＲ６遺伝子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ６であり、外来ＲＮＡと正常なｍＲＮＡとの識別に関与しており、ノックアウトされることで、ウイルスへの抵抗性が減じるという作用が生じることが知られている。タバコにおいて、ＲＤＲ６遺伝子の重複遺伝子が２個存在することが知られている。ＳＧＳ３遺伝子は、遺伝子サイレンシングサプレッサー３であり、ＲＤＲ６と協働し、ウイルスに対する防御機能として機能する。SGS３遺伝子は、ノックアウトされると、ウイルスへの抵抗性が減じるという作用が生じることが知られている。タバコにおいて、ＳＧＳ３遺伝子の重複遺伝子が２個存在することが知られている。切断したベクターとアニーリングした２本鎖ＤＮＡを一種類ずつＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを用いて環状プラスミド化した。得られた環状プラスミドで大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、目的の環状プラスミドを有するクローンを選択し、プラスミドを精製した。精製したプラスミドを、アグロバクテリウムＧＶ３１０１株にエレクトロポレーション法で導入し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、５０μｇ／ｍＬゲンダマイシン、５０μｇ／ｍＬリファンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選抜した。
（１）タバコ遺伝子のゲノム編集実験用のプラスミドの調整
ｐＥＸ＿３５Ｓ－ｖＣａｓΦ＿ＨＰＴベクターをＢｓａＩ－ＨＦで切断した。タバコ由来ＰＤＳ、ＲＤＲ６、ＳＧＳ３遺伝子のゲノム編集実験用のＣａｓΦのｃｒＲＮＡを形成するためのスペーサー配列をクローニングするために、以下の表５に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれのＳｅｔごとにアニーリングした２本鎖ＤＮＡを合計２１種類準備した：
【表5-1】
【表5-2】
【0048】
（２）タバコの葉へのアグロインフィルトレーション実験
目的の環状プラスミドを有するアグロバクテリウムＧＶ３１０１株（非特許文献６：Plant Biotechnology 33, 235-243 (2016)のMaterials and Methods 参照）のコロニーを、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、５０μｇ／ｍＬゲンダマイシン、５０μｇ／ｍＬリファンピシリンを含む液体ＬＢ培地に植菌し、２８℃、２日間振盪培養した。導入後に赤色色素を発現するｐＤＥＳＴ＿３５Ｓ＿ＲＵＢＹ＿ＨＳＰ（Ａｂ２８） コンストラクトを有するＧＶ３１０１株を培養した。ｐＤＥＳＴ＿３５Ｓ＿ＲＵＢＹ＿ＨＳＰ（Ａｂ２８） コンストラクトを用いることで、アグロインフィルトレーションがされた植物体の領域が赤色に着色する。
培養した菌液を３０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ遠心して集菌し、インフィルトレーションバッファー（組成：１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭＥＳ、１００μＭアセトシリンゴン、ｐＨ５．７）５ｍｌ程度に懸濁し、ＯＤ６００＝１程度に調整した。目的ゲノム編集ベクターを含有するアグロバクテリア溶液２ｍｌ、Ａｂ２８含有アグロバクテリア溶液０．５ｍｌ、インフィルトレーションバッファー２ｍｌを混合し、アグロインフィルトレーション溶液とした。
目的の環状プラスミドを有するアグロバクテリウムＧＶ３１０１株（非特許文献６：Plant Biotechnology 33, 235-243 (2016)のMaterials and Methods 参照）のコロニーを、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、５０μｇ／ｍＬゲンダマイシン、５０μｇ／ｍＬリファンピシリンを含む液体ＬＢ培地に植菌し、２８℃、２日間振盪培養した。導入後に赤色色素を発現するｐＤＥＳＴ＿３５Ｓ＿ＲＵＢＹ＿ＨＳＰ（Ａｂ２８） コンストラクトを有するＧＶ３１０１株を培養した。ｐＤＥＳＴ＿３５Ｓ＿ＲＵＢＹ＿ＨＳＰ（Ａｂ２８） コンストラクトを用いることで、アグロインフィルトレーションがされた植物体の領域が赤色に着色する。
培養した菌液を３０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ遠心して集菌し、インフィルトレーションバッファー（組成：１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＭＥＳ、１００μＭアセトシリンゴン、ｐＨ５．７）５ｍｌ程度に懸濁し、ＯＤ６００＝１程度に調整した。目的ゲノム編集ベクターを含有するアグロバクテリア溶液２ｍｌ、Ａｂ２８含有アグロバクテリア溶液０．５ｍｌ、インフィルトレーションバッファー２ｍｌを混合し、アグロインフィルトレーション溶液とした。
【0049】
２７℃、長日条件で生育させた播種後３週間目のタバコ植物体を用意し、１ｍｌシリンジで、アグロインフィルトレーション溶液を吸い取り、葉の裏側に打ち込み、３日間ほど２７℃、長日条件でインキュベートし、目的のプラスミドを発現させた（結果の一部を図４に示す）。
【0050】
（３）ゲノムＤＮＡのＡｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑ解析
赤色色素が発現した領域から１ｃｍ角程度の切片を切り出して２ｍｌ容チューブに回収し、ゲノム抽出バッファー(２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）と混合して組織片を破砕したのち、９５℃で５分間インキュベートした後、イソプロパノール沈殿によりゲノムDNAを回収した。回収したゲノムDNAは滅菌水で懸濁し、以下の表６に記載の配列のプライマーセットを使用して増幅した約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｉＳｅｑ１００システム（Ｉｌｌｍｉｎａ社）によりＡｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑを行い、ゲノム編集を検出した。
ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトで分析した結果を図４に示す。それぞれの結果を、各標的毎にまとめたのが以下の表７である。
赤色色素が発現した領域から１ｃｍ角程度の切片を切り出して２ｍｌ容チューブに回収し、ゲノム抽出バッファー(２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）と混合して組織片を破砕したのち、９５℃で５分間インキュベートした後、イソプロパノール沈殿によりゲノムDNAを回収した。回収したゲノムDNAは滅菌水で懸濁し、以下の表６に記載の配列のプライマーセットを使用して増幅した約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｉＳｅｑ１００システム（Ｉｌｌｍｉｎａ社）によりＡｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑを行い、ゲノム編集を検出した。
【表6-1】
【表6-2】
【0051】
【表7】
【0052】
各標的遺伝子について、標的長１６又は１７のいずれでも編集がされており、またミスマッチを含んだ配列でも編集が生じることが示された。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A-C】
【図5D】
【図5E】
【図5F-G】
【図5H-L】
【配列表】