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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024038345
(43)【公開日】2024-03-19
(54)【発明の名称】抗原性ＯＳＰＡポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20240312BHJP
C07K 14/20 20060101ALI20240312BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240312BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20240312BHJP
A61K 39/02 20060101ALI20240312BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240312BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20240312BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240312BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31
C07K14/20 ZNA
C07K14/47
C12N9/00
A61K39/02
A61P31/04
A61K39/39
A61K47/42
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024002941
(22)【出願日】2024-01-12
(62)【分割の表示】P 2020554527の分割
【原出願日】2019-04-02
(31)【優先権主張番号】62/652,210
(32)【優先日】2018-04-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504456798
【氏名又は名称】サノフイ
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ゲイリー・ジェイ・ナーベル
(72)【発明者】
【氏名】チィ－ジェン・ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ヘザー・カンプ
(72)【発明者】
【氏名】ロニー・ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】カート・スワンソン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ライムボレリア症に関連する、抗原性ＯｓｐＡポリペプチド、およびＯｓｐＡに対する抗体を誘発するためのその使用を提供する。
【解決手段】ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の、ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドであって、特定の配列を含まない、前記抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを提供する。さらに、前記ＯｓｐＡポリペプチド、およびフェリチンタンパク質を含む、抗原性ポリペプチドを提供する。
【選択図】図１Ｄ
【解決手段】ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の、ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドであって、特定の配列を含まない、前記抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを提供する。さらに、前記ＯｓｐＡポリペプチド、およびフェリチンタンパク質を含む、抗原性ポリペプチドを提供する。
【選択図】図１Ｄ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチドであって、配列番号７７の配列を含まない前記抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項2】
膜貫通ドメインまたは膜貫通ドメインの一部を欠如する、請求項１に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項3】
脂質付加されていない、請求項１または２のいずれかに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項4】
配列番号７７の配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換が存在し、該置換が、配列番号７８との同一性を低減させるか、または非保存的で配列番号７８とのより高い同一性をもたらさない、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項5】
置換が、配列番号７８との同一性を低減させる、請求項４に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項6】
配列番号７７のアミノ酸の１つまたはそれ以上が、非血清型１ ＯｓｐＡの対応するアミノ酸に置き換えられている、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項7】
非血清型１ ＯｓｐＡが血清型２、３、４、５、６、または７ ＯｓｐＡである、請求項６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項8】
配列番号７７のアミノ酸の各々が、血清型２、３、４、５、６、または７ ＯｓｐＡの対応するアミノ酸に置き換えられている、請求項６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項9】
グリコシル化を低減または除去する改変をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項10】
改変が、少なくとも１つのアスパラギンの置換を含む、請求項９に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項11】
少なくとも１つのアスパラギンが、ＯｓｐＡ血清型１のＮ７１、Ｎ１９０、Ｎ２０２、およびＮ２５１の任意の１つ、２つ、３つ、またはそれより多くを含む、請求項１０に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項12】
少なくとも１つのアスパラギンが、ＯｓｐＡ血清型１のＮ７１、Ｎ１９０、Ｎ２０２、およびＮ２５１を含む、請求項１１に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項13】
１つまたはそれ以上のアスパラギンがグルタミンで置換されている、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項14】
Ｎ－グリコシル化部位を欠如する、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項15】
ＯｓｐＡが、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｉ）、ボレリア・マヨニイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｍａｙｏｎｉｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ）、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）、またはボレリア・ババリエンシス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）に由来する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
ｉ）、ボレリア・マヨニイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｍａｙｏｎｉｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ）、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）、またはボレリア・ババリエンシス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）に由来する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項16】
配列番号１、３、４、または５３のいずれか１つの配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項17】
配列番号１～１０または１２～７６のいずれか１つの配列を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項18】
ＯｓｐＡエクトドメインを含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項19】
配列番号９４～１０２のいずれか１つの配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項20】
フェリチンタンパク質をさらに含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項21】
フェリチンが、表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含む、請求項２０に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項22】
ＯｓｐＡポリペプチドおよびフェリチンを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチドであって、該フェリチンが、表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含む、前記抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項23】
フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２Ｃ、Ｓ２６Ｃ、Ｓ７２Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｋ７９Ｃ、Ｓ１００Ｃ、およびＳ１１１Ｃ変異の１つもしくはそれ以上、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける１つもしくはそれ以上の対応する変異を含む、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項24】
表面に露出したアミノ酸を介してフェリチンに連結された１つまたはそれ以上の免疫刺激性部分を含み、場合により表面に露出した該アミノ酸が、変異によりもたらされるシステインである、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項25】
フェリチンが、表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異を含み、場合により該アスパラギンが、Ｈ．ピロリフェリチンの１９位にあるか、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける類似の位置にある、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項26】
フェリチンが、内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異を含み、場合により該内部システインが、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位にあるか、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置にある、請求項２０～２５のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド
。
。
【請求項27】
フェリチン粒子であって、請求項２０～２６のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含む前記フェリチン粒子。
【請求項28】
ルマジンシンターゼタンパク質をさらに含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【請求項29】
ルマジンシンターゼ粒子であって、請求項２８に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含む前記ルマジンシンターゼ粒子。
【請求項30】
組成物であって、請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド、フェリチン粒子、またはルマジンシンターゼ粒子を含み、薬学的に許容される担体をさらに含む前記組成物。
【請求項31】
アジュバントをさらに含み、場合により該アジュバントがＡＦ０３である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項32】
第１および第２の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含み、該第１および第２の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドが、異なる血清型のＯｓｐＡポリペプチドを含む、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項33】
ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型２ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型３ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型４ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型５ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型６ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型７ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド
から選択される１、２、３、４、５、６、または７つの抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含む、請求項３２に記載の組成物。
ＯｓｐＡ血清型２ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型３ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型４ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型５ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型６ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型７ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド
から選択される１、２、３、４、５、６、または７つの抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項34】
ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型２ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型３ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型４ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型５ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型６ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型７ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド
を含む、請求項３３に記載の組成物。
ＯｓｐＡ血清型２ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型３ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型４ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型５ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型６ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；
ＯｓｐＡ血清型７ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド
を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項35】
ボレリアに対する免疫応答を誘発する方法またはライム病に対する対象の保護において使用するための、請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド、フェリチン粒子、ルマジンシンターゼ粒子、または組成物。
【請求項36】
ボレリアに対する免疫応答を誘発する、またはライム病に対して対象を保護する方法であって、請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド、フェリチン粒子、ルマジンシンターゼ粒子、または組成物の任意の１つまたはそれ以上を対象に投与する工程を含む前記方法。
【請求項37】
対象がヒトである、請求項３５または３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド、フェリチン粒子、ルマジンシンターゼ粒子、組成物、または方法。
【請求項38】
場合により核酸がｍＲＮＡである、請求項１～２６のいずれか１項に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、その全内容が参照によって本明細書に組み入れられる、２０１８年４月３日に提出された米国仮特許出願第６２／６５２，２１０号の優先権の利益を主張する。
【0002】
本出願は、配列表を含有し、それらはＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年３月１８日に作成され、名称は２０１９－０３－１８＿０１１２１－００３３－００ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは３７０，８６２バイトである。
【背景技術】
【0003】
ワクチン学の分野での多くの成功にも関わらず、生命を脅かす多くの感染疾患からヒトを保護するために、新規打開策が必要である。現在認可されている多くのワクチンは、何十年も前の技術に依存して生弱毒化または不活化死菌ワクチンを産生しているが、これらは固有の安全性の懸念を有し、多くの場合、ごく短命な弱い免疫応答を刺激するに過ぎず、複数回用量の投与を必要とする。遺伝子工学および生化学工学の進歩により、難題である疾患標的に対する治療薬を開発することが可能となっているが、ワクチン学の分野へのこれらの応用は、まだ十分に実現されていない。組換えタンパク質技術により、現在では最適な抗原の設計が可能となっている。加えて、ナノ粒子は、最適な抗原提示および標的化薬物送達に関する潜在性をますます証明している。複数の抗原が結合したナノ粒子は、その分子積み荷を多価で呈示することによって与えられる結合アビディティの増加、およびその微視的サイズにより生物学的障壁をより効率的に通過する能力を有することが示されている。インフルエンザウイルス血液凝集素（ＨＡ）タンパク質に融合したヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））フェリチンナノ粒子は、マウスインフルエンザモデルにおいて抗原安定性の改善および免疫原性の増加を可能にした（非特許文献１を参照されたい）。この融合タンパク質は、８面体の対称性ナノ粒子へと自己集合して８個の３量体ＨＡスパイク構造を提示し、アジュバントと共に使用する場合、様々な前臨床モデルにおいて強力な免疫応答を与える。
【0004】
ライムボレリア症は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属の一部の細菌種によって引き起こされる人獣共通疾患であり、感染したマダニ（Ｉｘｏｄｅｓ）種のダニに噛まれることによってヒトおよびイヌに伝播する。ライム病は、世界全体の公衆衛生問題であり、症例は、ヨーロッパ、北米、およびアジアに及ぶ温暖な気候で報告されている。ボレリアの外部表面タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）は、免疫応答を誘発する主要な抗原である。世界中でボレリアにおいて見出されるＯｓｐＡの少なくとも７つの異なる血清型（アイソタイプ１～７）が存在する。ボレリアの異なる遺伝子種は世界中に存在し、そのため、１つの遺伝子種に対する免疫は、同様にライムボレリア症を引き起こし得る他の細菌に対する免疫を付与しない。さらに、ボレリアを有するダニの範囲が地域に限定されることは、１つの地理的地域における患者のライム病に関連するＯｓｐＡ血清型が、別の地理的地域における患者のライム病には関連しないことを意味する。
【0005】
本明細書において、ＯｓｐＡポリペプチドを伴う１組の新規ポリペプチド、ナノ粒子、組成物、方法、および使用を提示する。改変ＯｓｐＡポリペプチドは、自己免疫反応を刺激するリスクが低減された、ボレリアによる感染症からの保護を提供するために開発された。さらに、アジュバントのような免疫刺激性部分が抗原性ポリペプチドに直接化学結合しているＯｓｐＡポリペプチドおよびフェリチンを含む自己アジュバント性抗原性ポリペプチドを開発した。直接免疫刺激性部分を、抗原性ポリペプチドと直接コンジュゲートすると、免疫刺激性部分とＯｓｐＡポリペプチドとを単一の高分子実体として標的化同時送
達することが可能となり、これによって抗原およびアジュバントのような免疫刺激性部分を個別の分子として含む従来のワクチンに関して懸念される全身毒性の可能性を大きく減少させることができる。免疫刺激性部分をＯｓｐＡポリペプチドと共に高分子実体として同時送達すること、およびそれが多価で提示されることもまた、保護を誘発するのに必要な全体的な用量を低減させ、製造負荷およびコストを低減させることができる。
達することが可能となり、これによって抗原およびアジュバントのような免疫刺激性部分を個別の分子として含む従来のワクチンに関して懸念される全身毒性の可能性を大きく減少させることができる。免疫刺激性部分をＯｓｐＡポリペプチドと共に高分子実体として同時送達すること、およびそれが多価で提示されることもまた、保護を誘発するのに必要な全体的な用量を低減させ、製造負荷およびコストを低減させることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｎａｔｕｒｅ ４９９：１０２～１０６頁（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本開示の目的は、上記の利点の１つまたはそれ以上を提供することができる、または有用な選択を公共に少なくとも提供する組成物、キット、方法、および使用を提供することである。したがって、以下の実施形態が本明細書において提供される。
【課題を解決するための手段】
【0008】
実施形態１は、ボレリアのＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチドであって、配列番号７７の配列を含まない、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0009】
実施形態２は、膜貫通ドメインまたは膜貫通ドメインの一部を欠如する、実施形態１に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0010】
実施形態３は、脂質付加されていない、実施形態１または２のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0011】
実施形態４は、配列番号７７の配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換が存在し、置換が配列番号７８との同一性を低減させるか、または非保存的で配列番号７８とのより高い同一性をもたらさない、実施形態１～３のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0012】
実施形態５は、置換が配列番号７８との同一性を低減させる、実施形態４に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0013】
実施形態６は、配列番号７７のアミノ酸の１つまたはそれ以上が、非血清型１ ＯｓｐＡの対応するアミノ酸に置き換えられている、実施形態１～５のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0014】
実施形態７は、非血清型１ ＯｓｐＡが、血清型２、３、４、５、６、または７ ＯｓｐＡである、実施形態６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0015】
実施形態８は、配列番号７７のアミノ酸の各々が、血清型２、３、４、５、６、または７ ＯｓｐＡの対応するアミノ酸に置き換えられている、実施形態６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0016】
実施形態９は、グリコシル化を低減または除去する改変をさらに含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0017】
実施形態１０は、改変が、少なくとも１つのアスパラギンの置換を含む、実施形態９に
記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0018】
実施形態１１は、少なくとも１つのアスパラギンが、ＯｓｐＡ血清型１のＮ７１、Ｎ１９０、Ｎ２０２、およびＮ２５１のいずれか１つ、２つ、３つ、またはそれより多くを含む、実施形態１０に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0019】
実施形態１２は、少なくとも１つのアスパラギンが、ＯｓｐＡ血清型１のＮ７１、Ｎ１９０、Ｎ２０２、およびＮ２５１を含む、実施形態１１に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0020】
実施形態１３は、１つまたはそれ以上のアスパラギンがグルタミンで置換される、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0021】
実施形態１４は、Ｎ－グリコシル化部位を欠如する、実施形態１０～１３のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0022】
実施形態１５は、ＯｓｐＡがボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・マヨニイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｍａｙｏｎｉｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ）、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）、またはボレリア・ババリエンシス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）に由来する、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0023】
実施形態１６は、配列番号１、３、４、または５３のいずれか１つの配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0024】
実施形態１７は、配列番号１～１０または１２～７６のいずれか１つの配列を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0025】
実施形態１８は、ＯｓｐＡエクトドメインを含む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0026】
実施形態１９は、配列番号９４～１０２のいずれか１つに記載の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0027】
実施形態２０は、フェリチンタンパク質をさらに含む、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0028】
実施形態２１は、フェリチンが表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含む、実施形態２０に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0029】
実施形態２２は、ＯｓｐＡポリペプチドおよびフェリチンを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチドであって、フェリチンが表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含む、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0030】
実施形態２３は、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２Ｃ、Ｓ２６Ｃ、Ｓ７２
Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｋ７９Ｃ、Ｓ１００Ｃ、およびＳ１１１Ｃ変異の１つもしくはそれ以上、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける１つもしくはそれ以上の対応する変異を含む、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
Ｃ、Ａ７５Ｃ、Ｋ７９Ｃ、Ｓ１００Ｃ、およびＳ１１１Ｃ変異の１つもしくはそれ以上、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける１つもしくはそれ以上の対応する変異を含む、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0031】
実施形態２４は、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0032】
実施形態２５は、フェリチンがＨ．ピロリフェリチンのＳ２６Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0033】
実施形態２６は、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＳ７２Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0034】
実施形態２７は、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＡ７５Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0035】
実施形態２８は、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＫ７９Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0036】
実施形態２９は、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＳ１００Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0037】
実施形態３０は、フェリチンが、Ｈ．ピロリフェリチンのＳ１１１Ｃ変異、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンにおける対応する変異を含む、実施形態２０～２２のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0038】
実施形態３１は、表面に露出したアミノ酸を介してフェリチンに連結された１つまたはそれ以上の免疫刺激性部分を含み、場合により表面に露出したアミノ酸が、変異によりもたらされるシステインである、実施形態２０～３０のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0039】
実施形態３１ａは、免疫刺激性部分が、ＴＬＲ２のアゴニストであり、場合によりアゴニストがＰＡＭ２ＣＳＫ４、ＦＳＬ－１、またはＰＡＭ３ＣＳＫ４である、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0040】
実施形態３１ｂは、免疫刺激性部分がＴＬＲ７／８のアゴニストであり、場合によりア
ゴニストが一本鎖ＲＮＡ、イミダゾキノリン、ヌクレオシドアナログ、３Ｍ－０１２、またはＳＭ７／８ａである、実施形態３１に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
ゴニストが一本鎖ＲＮＡ、イミダゾキノリン、ヌクレオシドアナログ、３Ｍ－０１２、またはＳＭ７／８ａである、実施形態３１に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0041】
実施形態３１ｃは、免疫刺激性部分がＴＬＲ９のアゴニストであり、場合によりアゴニストが、ＣｐＨオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、５’プリン（Ｐｕ）－ピリミジン（Ｐｙ）－Ｃ－Ｇ－Ｐｙ－Ｐｕ３’を含む１つまたはそれ以上の６量体ＣｐＧモチーフを含むＯＤＮ、配列番号２１０の配列を含むＯＤＮ、またはＩＳＳ－１０１８である、実施形態３１に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0042】
実施形態３１ｄは、ＴＬＲ９のアゴニストが、ホスホロチオエート結合を含む骨格を含む、実施形態３１ｃに記載のフェリチンタンパク質である。
【0043】
実施形態３１ｅは、免疫刺激性部分がＳＴＩＮＧのアゴニストであり、場合によりアゴニストが、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ｃｄＡ、ｃｄＧ、ｃＡＭＰ－ｃＧＭＰ、および２’－５’，３’－５’ｃＧＡＭＰ、またはＤＭＸＡＡである、実施形態３１に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0044】
実施形態３２は、フェリチンが表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異を含み、アスパラギンがＨ．ピロリフェリチンの１９位、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの類似の位置にある、実施形態２０～３１ｅのいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0045】
実施形態３３は、フェリチンが、内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異を含み、場合により内部システインが、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置にある、実施形態２０～３２のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0046】
実施形態３４は、ＯｓｐＡポリペプチドおよびフェリチンの間にペプチドリンカーを含む、実施形態２０～３３のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0047】
実施形態３５は、ペプチドリンカーがフェリチンのＮ末端側である、実施形態３４に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0048】
実施形態３５ａは、ペプチドリンカーがフェリチンのＣ末端側である、実施形態３４に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0049】
実施形態３６は、フェリチンが配列番号２０１～２０７または２１１～２１５のいずれか１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～３５ａのいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0050】
実施形態３６ａは、配列番号２０１と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0051】
実施形態３６ｂは、配列番号２０２と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0052】
実施形態３６ｃは、配列番号２０３と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0053】
実施形態３６ｄは、配列番号２１５と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0054】
実施形態３６ｅは、配列番号２０４と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0055】
実施形態３６ｆは、配列番号２０５と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0056】
実施形態３６ｇは、配列番号２０６と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0057】
実施形態３６ｈは、配列番号２０７と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0058】
実施形態３６ｉは、配列番号２１１と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0059】
実施形態３６ｊは、配列番号２１２と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0060】
実施形態３６ｋは、配列番号２１３と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0061】
実施形態３６ｌは、配列番号２１４と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３６に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0062】
実施形態３７は、実施形態２０～３６ｌのいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含むフェリチン粒子である。
【0063】
実施形態３８は、ルマジンシンターゼタンパク質をさらに含む、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドである。
【0064】
実施形態３９は、実施形態３８に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含むルマジンシンターゼ粒子である。
【0065】
実施形態４０は、抗原性ＯｓｐＡポリペプチド、フェリチン粒子、または実施形態１～３９のいずれか１つに記載のルマジンシンターゼ粒子を含み、薬学的に許容される担体をさらに含む組成物である。
【0066】
実施形態４１は、アジュバントをさらに含み、場合によりアジュバントがＡＦ０３である、実施形態４０に記載の組成物である。
【0067】
実施形態４２は、第１および第２の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含み、第１および第２の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドが、異なる血清型のＯｓｐＡポリペプチドを含む、実施形態４０または４１に記載の組成物である。
【0068】
実施形態４３は、ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；ＯｓｐＡ血清型２ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；ＯｓｐＡ血清型３ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；ＯｓｐＡ血清型４ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；ＯｓｐＡ血清型５ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；ＯｓｐＡ血清型６ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；ＯｓｐＡ血清型７ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチドから選択される１、２、３、４、５、６、または７つの抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含む、実施形態４２に記載の組成物である。
【0069】
実施形態４４は、ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；ＯｓｐＡ血清型２ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；ＯｓｐＡ血清型３ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；ＯｓｐＡ血清型４ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；ＯｓｐＡ血清型５ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；ＯｓｐＡ血清型６ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド；ＯｓｐＡ血清型７ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含む、実施形態４３に記載の組成物である。
【0070】
実施形態４５は、ボレリアに対する免疫応答を誘発する方法またはライム病に対する対象の保護において使用するための、実施形態１～４４のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド、フェリチン粒子、ルマジンシンターゼ粒子、または組成物である。
【0071】
実施形態４６は、ボレリアに対する免疫応答を誘発する、またはライム病に対して対象を保護する方法であって、実施形態１～４４のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド、フェリチン粒子、ルマジンシンターゼ粒子、または組成物のいずれか１つまたはそれ以上を対象に投与する工程を含む方法である。
【0072】
実施形態４７は、対象がヒトである、実施形態４５～４６のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド、フェリチン粒子、ルマジンシンターゼ粒子、組成物、または方法である。
【0073】
実施形態４７ａは、対象が哺乳動物であり、場合により哺乳動物が霊長類または家畜哺乳動物であり、さらに場合により霊長類が非ヒト霊長類、サル、マカク、アカゲザル、またはカニクイザル、もしくは類人猿であり、または家畜哺乳動物がイヌ、ウサギ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ラクダ、またはロバである、実施形態４５～４６のいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド、フェリチン粒子、ルマジンシンターゼ粒子、組成物、または方法である。
【0074】
実施形態４８は、実施形態１～４４に記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチド、フェリチン粒子、ルマジンシンターゼ粒子、および組成物を含み、場合によりライム病に対して対象
を免疫するために使用するための説明書を含むキットである。
を免疫するために使用するための説明書を含むキットである。
【0075】
実施形態４９は、場合により核酸がＲＮＡである、実施形態１～３６ｌのいずれか１つに記載の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドをコードする核酸である。
【0076】
追加の目的および利点は、以下の説明に部分的に記載され、部分的に説明から明白であり、または実践により学ぶことができるであろう。目的および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘された要素および組合せによって実現および達成される。
【0077】
前述の一般的説明および以下の詳細な説明は、単なる例示および説明であり、特許請求の範囲を制限するものではない。
【0078】
本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成する以下の図面は、いくつかの実施形態を例証し、説明と共に本明細書に記載する原理を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【0079】
【図1A】ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子の例示的な設計を示す図である。図１Ａ．フェリチンに遺伝的に融合したＯｓｐＡは、融合タンパク質を形成する。ＯｓｐＡおよびフェリチン配列は、グリシン－セリンリンカー（－ＧＳ－）によって分離される。
【図1D】ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子の例示的な設計を示す図である。図１Ｄ．例示的なＯｓｐＡ－フェリチン融合タンパク質ナノ粒子。フェリチン（薄灰色）、グリシン－セリンリンカー（ＧＳ）の位置、ＯｓｐＡ（濃灰色および黒色）を示す（ｎ：サブユニット数）。
【図2-1】図２Ａ－２Ｄは、例示的なＯｓｐＡ－フェリチンの発現および精製を示す図である。図２Ａ．Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム上で精製された例示的なＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイル。図２Ｂ．Ｅｘｐｉ２９３細胞由来の精製された例示的なＯｓｐＡ－フェリチンのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。図２Ｃ．例示的なＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）プロファイル。半径は１３ｎｍであり、Ｐｄ％（標準化された多分散性の尺度）は７．４であり、質量は１００％である。図２Ｄ．６７，０００倍で３１８個の粒子の透過電子顕微鏡写真のクラス平均から構成された例示的なＯｓｐＡ－フェリチンの複合画像。フェリチンナノ粒子は、中空中心を有する強い円形密度として透過型電子顕微鏡上に現れる。各ナノ粒子は、環状またはわずかに長円形に見えるＯｓｐＡに対応する多数の短い形状に囲まれている。
【図4】例示的な血清型１のＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子のＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライム（ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）の精製された外表面タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）の液体懸濁液）との免疫原性および期間の比較を示す図である。Ｃ３Ｈマウス（ｎ＝５）に１μｇのＯｓｐＡ－フェリチン＋Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａアジュバントシステム、カタログ番号Ｓ６３２２－１ｖｌ）またはＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライムを第０週および第４週に筋肉内に免疫した。抗体応答は、各組成物を用いて２回目の免疫（６週目）の２週間後および２回目の免疫（２５週目）の２１週間後に、ＥＬＩＳＡを介してエンドポイント力価を測定することにより評価された。
【図5-1】図５Ａ－５Ｃは、例示的なＯｓｐＡ－フェリチンに関する情報を提供する図である。ＯｓｐＡポリペプチドは、ヒト白血球機能関連抗原－１（ｈＬＦＡ－１）の配列の断片と相同性を有するＯｓｐＡ血清型１のエピトープで修飾される。図５Ａ．ＯｓｐＡエクトドメイン内のＬＦＡ－１相同部位（配列番号８３のアミノ酸１６５～１７３）の位置を示す構造。図５Ｂ．配列番号８３（Ｂ．ブルドルフェリ血清型１のＯｓｐＡ）のＯｓｐＡアミノ酸１６５～１７３と、ｈＬＦＡ－１および他のボレリア属（Borrelia）種および血清型の対応する配列との関係を示す樹状図。図５Ｃ．配列番号８３のアミノ酸１６５～１７３における９アミノ酸セグメント（ノナペプチド）（「ＯｓｐＡ」と標識）を、血清型２および血清型３のＯｓｐＡ由来の対応するノナペプチド（それぞれ「Ｓ２」（配列番号７９）および「Ｓ３」（配列番号８０））、合理的に設計された置換ノナペプチド（「ＲＤ２」、配列番号８１）、およびｈＬＦＡ－１由来の対応するノナペプチド（配列番号７８）と比較する。図５Ｃは、配列番号７７、７９～８１、および７８を、それぞれ、外観順に開示する。図５Ｄは、Ｃ３Ｈマウス（ｎ＝５）に、１μｇ用量のＯｓｐＡ血清型１－フェリチンナノ粒子をＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバント（スクアレンベース水中油ナノエマルジョン、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ｖａｃ－ａｄｘ－１０から入手可能）で０週および４週に筋肉内（ＩＭ）に免疫した図である。ＯｓｐＡ配列は、野生型ｈＬＦＡ－１相同部位（すなわち、配列番号８３のアミノ酸１６５～１７３、「Ｓｅｒｏ１」）または配列番号８１（「ＲＤ」）、配列番号８０（「Ｓｅｒｏ ３置き換え」）、配列番号７９（「Ｓｅｒｏ ２置き換え」）のような置換配列を含んでいた。抗体応答は、示された構築物の２回目の免疫の２週間後にＥＬＩＳＡにより測定したエンドポイント力価を介して評価された。
【図6A】例示的な免疫刺激性部分：ＴＬＲ７／８アゴニスト（３Ｍ－０１２）にコンジュゲートされた例示的なＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子に関する情報を提示する図である。図６Ａ．３Ｍ－０１２をフェリチンに結合させるために、２ステップクリックケミストリー戦略を使用した。ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドリンカーをフェリチン上の表面露出システインに最初に付着させた。過剰のリンカーを除去した後、アジド－３Ｍ－０１２を添加した。
【図6B】例示的な免疫刺激性部分：ＴＬＲ７／８アゴニスト（３Ｍ－０１２）にコンジュゲートされた例示的なＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子に関する情報を提示する図である。図６Ｂ．Ｃ３Ｈマウス（ｎ＝５）に、０および４週目に示された組成物１μｇを筋肉内に免疫し、２週間後に分析した。「コンジュゲート」は、ＯｓｐＡ－フェリチン－３Ｍ－０１２コンジュゲートナノ粒子を示す。「混合」は、２９ｎｇまたは２０μｇの３Ｍ－０１２またはミョウバンとともに投与された同じＯｓｐＡ－フェリチンの非コンジュゲート混合物を示す。ＯｓｐＡ－フェリチンと３Ｍ－０１２の２９ｎｇ「混合」混合物は、コンジュゲートナノ粒子上の３Ｍ－０１２のモル当量を表す。
【図7-1】図７Ａ－７Ｃは、例示的な免疫刺激性部分：ＩＳＳ－１０１８ ＣｐＧ（配列番号２１０）にコンジュゲートされた例示的なＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子に関する情報を提供する図である。図７Ａ．２ステップクリックケミストリー戦略を用いて、ＣＰＧをフェリチンに結合させた。ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドリンカーを、フェリチン上の表面露出システインに最初に付着させた。過剰のリンカーを除去した後、アジド－ＣｐＧを添加した。図７Ａは、配列番号２２８を開示する。図７Ｂ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによるＣｐＧコンジュゲーションの生化学的分析は、ＣｐＧにコンジュゲートされたＯｓｐＡ－フェリチンの９２％とのＣｐＧへのコンジュゲーション後の分子量のシフトを明らかにする。図７Ｃ．Ｃ３Ｈマウス（ｎ＝５）は、指示された組成物の１μｇで０週目と４週目に筋肉内に免疫され、２週間後に分析された。「コンジュゲート」は、ＯｓｐＡ－フェリチン－ＣＰＧコンジュゲートナノ粒子を示す。「混合」は、３３９ｎｇもしくは５０μｇのＣｐＧまたはミョウバンとともに投与された同じＯｓｐＡ－フェリチンの非コンジュゲート混合物を示す。ＯｓｐＡ－フェリチンとＣＰＧの３３９ｎｇ「混合」混合物は、コンジュゲートナノ粒子上のＣｐＧのモル当量を表す。
【図8-1】図８Ａ－８Ｆは、ミョウバンアジュバントを含む一価血清型適合ＯｓｐＡ－フェリチン（１μｇ／用量）（「一価」）、または血清型１のＯｓｐＡ－フェリチン、血清型２のＯｓｐＡ－フェリチン、血清型３のＯｓｐＡ－フェリチン、血清型４のＯｓｐＡ－フェリチン、血清型５のＯｓｐＡ－フェリチン、および血清型７のＯｓｐＡ－フェリチンの各々（各１μｇ／用量）をミョウバンアジュバントとともに含む六価組成物（「六価」）を投与した後、血清型１（図８Ａ）、血清型２（図８Ｂ）、血清型３（図８Ｃ）、血清型４（図８Ｄ）、血清型５（図８Ｅ）、および血清型７（図８Ｆ）に対する抗体応答を比較する図である。抗体応答は、Ｃ３Ｈマウス（ｎ＝５）を第０週および第４週に筋肉内に免疫し、２週間後にＥＬＩＳＡにより測定したエンドポイント力価を介して評価された。ＥＬＩＳＡプレートをＯｓｐＡの特定の血清型で被覆した。
【図9-1】図９Ａ－９Ｇは、コンジュゲートされたおよびコンジュゲートされていない六価ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子組成物の投与後にマウスで観察された血清型１（図９Ａ）、血清型２（図９Ｂ）、血清型３（図９Ｃ）、血清型４（図９Ｄ）、血清型５（図９Ｅ）、血清型６（図９Ｆ）、および血清型７（図９Ｇ）に対するマウスにおける抗体応答を示す図である。「六価－ＣＰＧ」および「六価－３Ｍ－０１２」が、ナノ粒子がＣＰＧおよび３Ｍ－０１２に化学的にコンジュゲートされていることを示す以外は、六価組成物は、図８Ａ－Ｆに記載されるように、血清型１のＯｓｐＡ－フェリチン、血清型２のＯｓｐＡ－フェリチン、血清型３のＯｓｐＡ－フェリチン、血清型４のＯｓｐＡ－フェリチン、血清型５のＯｓｐＡ－フェリチン、および血清型７のＯｓｐＡ－フェリチンの各々を含む（図７Ａおよび６Ａ、ならびに添付の記載を参照されたい）。抗体応答は、２週間後にＥＬＩＳＡにより測定されたエンドポイント力価を介して評価された。ＥＬＩＳＡプレートをＯｓｐＡの特定の血清型で被覆した。
【図10-1】図１０Ａ－１０Ｇは、六価ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子組成物に対する、アカゲサル（ｎ＝３匹／群）における血清型１～７に対する抗体応答をそれぞれ示す図である。これは、用量が総６０μｇ（各血清型１０μｇ）であり、コンジュゲートされていないＡＦ０３アジュバントを含有すること以外は、図９Ａ～Ｇについて記載したものであった。サルは、第０週および第６週に筋肉内に免疫された。抗体応答は、免疫後２週間で、ＥＬＩＳＡにより測定したエンドポイント力価を介して分析された。ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライムを比較対照として１０μｇ用量で使用した。全ての実験について、ＥＬＩＳＡプレートを各パネルに示されたＯｓｐＡ血清型で被覆した。図１０Ｈ－１０Ｎは、六価ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子組成物に対する、アカゲサル（ｎ＝３匹／群）における血清型１～７に対する抗体応答をそれぞれ示す図である。これは、ＡＦ０３アジュバントを使用せず、代わりにナノ粒子を３Ｍ－０１２またはＣｐＧにコンジュゲートさせたこと以外は、図１０Ａ～１０Ｇについて記載したものであった（図６Ａおよび７Ａ、ならびに添付の記載を参照されたい）。用量は、総６０μｇ（各血清型１０μｇ）であった。サルは、第０週および第６週に筋肉内に免疫された。抗体応答は、免疫後２週間で、ＥＬＩＳＡにより測定したエンドポイント力価を介して分析された。全ての実験について、ＥＬＩＳＡプレートを各パネルに示されたＯｓｐＡ血清型で被覆した。
【図11】３Ｍ－０１２結合ＯｓｐＡ－フェリチン組成物のダニ負荷試験の結果を示す図である。マウスは、第０週および第４週に、示された組成物の１μｇ用量で免疫された。一価組成物は、３Ｍ－０１２にコンジュゲートされたＯｓｐＡ－フェリチン血清型１の１μｇを含有した。「六価－３Ｍ－０１２」組成物は、図９Ａ～Ｇについて記載された通りであった。対照粒子は、ＯｓｐＡポリペプチドを欠いていた。マウスは、ボレリア・ブルグドルフェリＮ４０株（血清型１）に感染した５～６匹のダニを、２回目の免疫後、２週間で５日間負荷させ、２週間後に屠殺した。心臓、足首および耳からの組織試料を、Ｂ．ブルグドルフェリに対する抗生物質を添加したＢＳＫ培地中で６週間培養した。陰性試料は、ＰＣＲ法によりＢ．ブルグドルフェリの存在について試験された。陽性試料は、培養またはＰＣＲ法のいずれかで陽性であった。
【図12】質量分析によるＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子のＴＬＲ７／８アゴニスト３Ｍ－０１２へのコンジュゲーションの確認を示す図である。上のパネルは、コンジュゲートされていない構築物を示し、下のパネルはコンジュゲートされた構築物を示す。データは、３Ｍ－０１２の添加と一致して、５８６．６９ダルトンの質量シフトを示した。
【図13】示される希釈系列にわたってＥＬＩＳＡにより測定されたグリコシル化対応物（ＲＤ）と比較した、非グリコシル化変異体ＯｓｐＡ－フェリチン（ＮＧ－ＲＤ）に対するマウスにおける抗体応答を示す図である。ＲＤ＝配列番号５２。ＮＧ－ＲＤ＝配列番号５３。マウスに第０週および第４週に１μｇ用量をワクチン接種した。
【図14】ＯｓｐＡ－フェリチン（配列番号５２）に対するマウスにおける抗体応答を示す図である。ＯｓｐＡ－フェリチングリコシル化変異体Ｎ＞Ｑ（配列番号５３）、およびグリコシル化変異体Ｓ／Ｔ＞Ａ（配列番号６３）は、示される希釈系列にわたってＥＬＩＳＡにより測定された、ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライム対照および陰性（Ｐｒｅ免疫）対照と比較された。
【図15-1】図１５Ａ－１５Ｅは、異なるリンカー（ＧＳ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー、ＧＳ１、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー（配列番号２２６）、ＧＳ２、配列番号９１リンカー、ＧＳ５、配列番号９２リンカー、構築物配列は、それぞれ、配列番号５３および６０～６２）を含むＯｓｐＡ構築物の精製および特徴付けを示す。図１５Ａ．示されるリンカーを含む精製ＯｓｐＡ構築物のクーマシー染色。図１５Ａは、外観順に、配列番号２２６および９１～９２をそれぞれ開示する。図１５Ｂ．ＧＳ１（配列番号６０）を含むＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）。図１５Ｃ．ＧＳ２（配列番号６１）を含むＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子のＤＬＳ。図１５Ｄ．ＧＳ５（配列番号６２）を含むＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子の電子顕微鏡写真（ＥＭ）。図１５Ｅ．ＧＳ５（配列番号６２）を含むＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子のＤＬＳ。
【図16】示される希釈系列にわたるＥＬＩＳＡにより測定したＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライムおよび陰性（Ｐｒｅ免疫）対照と比較した、異なるリンカーを（リンカー１×ＧＧＧＳ（配列番号２２６）構築物、配列番号６０、リンカー２×ＧＧＧＳ（配列番号９１）構築物、配列番号６１、リンカー５×ＧＧＧＳ（配列番号９２）構築物、配列番号６２）含むＯｓｐＡ－フェリチン構築物に対するマウスの抗体応答を示す図である。
【図17-1】図１７Ａ－１７Ｃは、ルマジンシンターゼＯｓｐＡ血清型４構築物（配列番号１８）の特徴付けを示す図である。図１７Ａ．ＤＬＳデータ。図１７Ｂ．サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）トレースの示された画分２２～６４のクーマシーゲル。図１７Ｃ．ＥＭデータ。
【図18】ミョウバンを伴うまたは伴わない、ＯｓｐＡ血清型４－フェリチン構築物（配列番号４）およびＯｓｐＡ血清型４－ルマジンシンターゼ構築物（配列番号１８）に対するマウスにおける抗体応答を示す図である。
【図19-1】図１９Ａ－１９Ｃは、ＯｓｐＡ血清型１－ルマジンシンターゼ構築物（配列番号１２）の特徴付けを示す図である。図１９Ａ．ＥＭデータ。図１９Ｂ．ＳＥＣトレースの示された画分２０～４０のクーマシーゲル。図１９Ｃ．ＤＬＳデータ。
【図20-1】図２０Ａ－２０Ｃは、ＯｓｐＡ血清型２－ルマジンシンターゼ構築物（配列番号１６）の特徴付けを示す図である。図２０Ａ．ＥＭデータ。図２０Ｂ．ＳＥＣトレースの示された画分２７～５６のクーマシーゲル。図２０Ｃ．ＤＬＳデータ。
【図24-1】図２４Ａ－２４Ｇは、Ｃ３Ｈマウス（ｎ＝５匹／群）において、ミョウバンまたはＡＦ０３のいずれかでアジュバント化したＯｓｐＡ血清型１～７（全部で７μｇ）に対応する各１μｇのＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子の七価ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子組成物、またはＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）ライムに対する血清型１～７に対する抗体応答をそれぞれ示す図である。全ての実験において、ＥＬＩＳＡプレートは、各パネルに「Ｓ Ｘ」（Ｘは血清型番号である）として示されるＯｓｐＡ血清型で被覆された。
【図25】アカゲザルにおけるエンドポイント抗体価の時間経過を示す図である。０週目および６週目に、六価ＯｓｐＡ－フェリチンワクチン（別々のナノ粒子中に血清型１、２、３、４、５、および７のＯｓｐＡを含む）をＡＦ０３アジュバントまたはＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）でサルに筋肉内接種した。ＥＬＩＳＡプレートをＯｓｐＡ血清型１でコーティングした。
【発明を実施するための形態】
【0080】
本明細書において、ライム病に対するワクチン接種のための新規抗原を提供する。ライム病は、ボレリア・ブルグドルフェリセンスラト（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ｓｅｎｓｕ ｌａｔｏ）（ｓ．ｌ．）複合体（本明細書では「ボレリア」と呼ぶ
）に属する細菌によって引き起こされる。本明細書に記載される抗原は、ライム病に対して対象をワクチン接種するために、単独でまたは非コンジュゲートアジュバントと共に使用することができる、抗原性ポリペプチド、融合タンパク質、ナノ粒子、および組成物を含む。融合タンパク質は、フェリチンに融合した抗原性ポリペプチドを含み得る。フェリチンは、野生型であり得るか、または１つもしくはそれ以上の変異、例えば表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含んでもよく、それによって免疫刺激性部分を、操作された表面に露出したシステインに直接コンジュゲートすることができる。そのような変異に起因するシステインは、個別に投与されたアジュバントの必要性を除去または低減させ、同様に抗原に対する免疫応答を誘発するために必要なアジュバント／免疫刺激性部分の量を低減させる可能性がある。本明細書に記載される抗原性ポリペプチドをコードする核酸もまた提供される。
）に属する細菌によって引き起こされる。本明細書に記載される抗原は、ライム病に対して対象をワクチン接種するために、単独でまたは非コンジュゲートアジュバントと共に使用することができる、抗原性ポリペプチド、融合タンパク質、ナノ粒子、および組成物を含む。融合タンパク質は、フェリチンに融合した抗原性ポリペプチドを含み得る。フェリチンは、野生型であり得るか、または１つもしくはそれ以上の変異、例えば表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異を含んでもよく、それによって免疫刺激性部分を、操作された表面に露出したシステインに直接コンジュゲートすることができる。そのような変異に起因するシステインは、個別に投与されたアジュバントの必要性を除去または低減させ、同様に抗原に対する免疫応答を誘発するために必要なアジュバント／免疫刺激性部分の量を低減させる可能性がある。本明細書に記載される抗原性ポリペプチドをコードする核酸もまた提供される。
【0081】
Ａ．定義
「アジュバント」は、本明細書で使用される場合、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する物質またはビヒクルを指す。アジュバントには、抗原を吸着させた無機質（例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸塩）の懸濁液、抗原溶液を鉱油または水中で乳化させた油中水型または水中油型乳剤（例えば、フロイント不完全アジュバント）を挙げることができるがこれらに限定されない。時に、抗原性をさらに増強するために死菌マイコバクテリア（例えば、フロイント完全アジュバント）を含める。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ）もまた、アジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；第６，３３９，０６８号；第６，４０６，７０５号；および第６，４２９，１９９号を参照されたい）。アジュバントはまた、Ｔｏｌｌ－Ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよび共刺激分子のような生物学的分子も含み得る。アジュバントは、組成物中の個別の分子として、またはフェリチンもしくは抗原性フェリチンポリペプチドに共有結合（コンジュゲート）して投与してもよい。
「アジュバント」は、本明細書で使用される場合、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する物質またはビヒクルを指す。アジュバントには、抗原を吸着させた無機質（例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸塩）の懸濁液、抗原溶液を鉱油または水中で乳化させた油中水型または水中油型乳剤（例えば、フロイント不完全アジュバント）を挙げることができるがこれらに限定されない。時に、抗原性をさらに増強するために死菌マイコバクテリア（例えば、フロイント完全アジュバント）を含める。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ）もまた、アジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；第６，３３９，０６８号；第６，４０６，７０５号；および第６，４２９，１９９号を参照されたい）。アジュバントはまた、Ｔｏｌｌ－Ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストおよび共刺激分子のような生物学的分子も含み得る。アジュバントは、組成物中の個別の分子として、またはフェリチンもしくは抗原性フェリチンポリペプチドに共有結合（コンジュゲート）して投与してもよい。
【0082】
本明細書で使用される場合、「抗原」は、生物に曝露または投与した場合に、免疫応答を誘発する作用物質、および／またはＴ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示される場合）が結合する、もしくは抗体（例えば、Ｂ細胞によって産生される）に結合する作用物質を指す。一部の実施形態では、抗原は、生物において液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発する。あるいはまたは加えて、一部の実施形態では、抗原は、生物において細胞性応答（例えば、その受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞を含む）を誘発する。特定の抗原は、標的生物（例えば、マウス、ウサギ、霊長類、ヒト）の１つまたは幾つかのメンバーにおいて免疫応答を誘発し得るが、標的生物種の全てのメンバーにおいて誘発するわけではない。一部の実施形態では、抗原は、標的生物種のメンバーの少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％において免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、抗原は、抗体および／またはＴ細胞受容体に結合するが、生物において特定の生理的応答を誘導しても誘導しなくてもよい。一部の実施形態では、例えば、抗原は、ｉｎ ｖｉｖｏでそのような相互作用が起こるか否かによらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体および／またはＴ細胞受容体に結合し得る。一部の実施形態では、抗原は、異種免疫原によって誘導される産物を含む、特異的液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。抗原は、本明細書に記載されるフェリチン（例えば、１つまたはそれ以上の変異を含む）および非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質を含む。
【0083】
「フェリチン」または「フェリチンタンパク質」は、本明細書で使用される場合、Ｈ．ピロリフェリチン（配列番号２０８または２０９）、またはＰ．フリオスス（Ｐ．ｆｕｒ
ｉｏｓｕｓ）フェリチン、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）フェリチン、もしくはヒトフェリチンのような本明細書で考察される別のフェリチンと検出可能な配列同一性を有し、鉄を例えば細胞内もしくは組織内で貯蔵する、または鉄を血流に運ぶ役目を果たすタンパク質を指す。重鎖および軽鎖（例えば、イラクサギンウワバおよびヒトフェリチン）として知られる２つのポリペプチド鎖として存在するフェリチンを含むそのような例示的なフェリチンを、以下で詳細に考察する。一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に、例えば表１（配列表）に開示されるフェリチン配列と少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。フェリチンは、完全長の天然に存在する配列の断片であり得る。「野生型フェリチン」は、本明細書で使用される場合、その配列が天然に存在する配列からなるフェリチンを指す。フェリチンはまた、完全長のフェリチン、または野生型フェリチンとはそのアミノ酸配列において１つまたはそれ以上の差を有するフェリチンの断片も含む。
ｉｏｓｕｓ）フェリチン、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）フェリチン、もしくはヒトフェリチンのような本明細書で考察される別のフェリチンと検出可能な配列同一性を有し、鉄を例えば細胞内もしくは組織内で貯蔵する、または鉄を血流に運ぶ役目を果たすタンパク質を指す。重鎖および軽鎖（例えば、イラクサギンウワバおよびヒトフェリチン）として知られる２つのポリペプチド鎖として存在するフェリチンを含むそのような例示的なフェリチンを、以下で詳細に考察する。一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に、例えば表１（配列表）に開示されるフェリチン配列と少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の同一性を有する配列を含む。フェリチンは、完全長の天然に存在する配列の断片であり得る。「野生型フェリチン」は、本明細書で使用される場合、その配列が天然に存在する配列からなるフェリチンを指す。フェリチンはまた、完全長のフェリチン、または野生型フェリチンとはそのアミノ酸配列において１つまたはそれ以上の差を有するフェリチンの断片も含む。
【0084】
本明細書で使用される場合、「フェリチン単量体」は、他のフェリチン分子と集合していない単一のフェリチン分子（例えば、該当する場合、単一のフェリチン重鎖または軽鎖）を指す。「フェリチン多量体」は、複数の会合したフェリチン単量体を含む。「フェリチンタンパク質」は、単量体フェリチンおよび多量体フェリチンを含む。
【0085】
本明細書で使用される場合、「フェリチン粒子」は、球状形態に自己集合したフェリチンを指す。フェリチン粒子は時に、「フェリチンナノ粒子」または単に「ナノ粒子」と呼ばれる。一部の実施形態では、フェリチン粒子は、２４個のフェリチン単量体（または該当する場合、全体で２４個の重鎖および軽鎖）を含む。
【0086】
「ハイブリッドフェリチン」は、本明細書で使用される場合、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部を有するＨ．ピロリフェリチンを含むフェリチンを指す。ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部として使用される例示的な配列を、配列番号２１７として示す。ハイブリッドフェリチンでは、免疫刺激性部分の結合部位がフェリチン粒子表面上に均一に分布するように、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部をＨ．ピロリフェリチンに融合することができる。「ウシガエルリンカー」は、本明細書で使用される場合、配列番号２１７の配列を含むリンカーである。ハイブリッドフェリチンはまた、時に「ｂｆｐＦｅｒｒ」または「ｂｆｐフェリチン」と呼ばれる。ウシガエル配列を含むいずれの構築物も、ウシガエル配列がなくとも、例えばリンカーまたは代替リンカーがなくとも提供することができる。例示的なウシガエルリンカー配列を、表１に提供する。表１はウシガエルリンカーを示すが、リンカーまたは代替リンカーを有しない同じ構築物を作製してもよい。
【0087】
「グリコシル化」は、本明細書で使用される場合、タンパク質への糖質単位の付加を指す。
【0088】
「免疫応答」は、本明細書で使用される場合、抗原またはワクチンのような刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、または多形核細胞のような免疫系の細胞の応答を指す。免疫応答は、例えばインターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主防御応答に関係する体の任意の細胞を含み得る。免疫応答は、生得のおよび／または適応免疫応答を含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、「保護的免疫応答」は、対象を感染から保護する（例えば、感染を防止する、または感染に関連する疾患の発生を防止する）免疫応答を指す。免疫応答を測定する方法は、当技術分野で周知であり、例えばリンパ球（例えば、ＢまたはＴ細胞）の増殖および／または活性、サイトカインまたはケモカインの分泌、炎症、抗体産生等を測定することを含む。「抗体応答」は、抗体が産生される免疫応答である。
【0089】
「免疫刺激性部分」は、本明細書で使用される場合、免疫系の構成要素を活性化することができる（単独で、またはフェリチンもしくは抗原性フェリチンポリペプチドに結合した場合）フェリチンまたは抗原性フェリチンポリペプチドに共有結合した部分を指す。例示的な免疫刺激性部分は、ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）のアゴニスト、例えば、ＴＬＲ４、７、８、または９を含む。一部の実施形態では、免疫刺激性部分はアジュバントである。
【0090】
本明細書で使用される場合、用語「キット」は、１つまたはそれ以上の化合物または組成物のような関連する構成要素、および溶媒、溶液、緩衝液、説明書、または乾燥剤のような１つまたはそれ以上の関連する材料の包装された組を指す。
【0091】
「Ｎ－グリカン」は、本明細書で使用される場合、タンパク質のＮ（アスパラギン）残基のアミド窒素でタンパク質に結合する糖質鎖を指す。そのため、Ｎ－グリカンは、Ｎ－グリコシル化プロセスによって形成される。このグリカンは多糖類であり得る。
【0092】
「ＯｓｐＡエクトドメイン」は、本明細書で使用される場合、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ＯｓｐＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＣＬ６６）のアミノ酸残基約２７～２７３、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって同定される、そのホモログの対応する位置を指す。ＯｓｐＡエクトドメインのさらなる例は、配列番号８３～８９のいずれかの２７～Ｘ位を含み、ここでＸは関連する配列のＣ末端位置であり、場合によりＣ末端Ｌｙｓは含まれていない。一部の実施形態では、エクトドメインは、そのＮ末端に、対応する完全長の野生型配列の２６番目の残基または２５番目および２６番目の残基をさらに含み；配列番号８３～８９では、２５番目および２６番目の残基はＡｓｐおよびＧｌｕである。ＯｓｐＡエクトドメインのなおさらなる例は、配列番号９４～１０２のいずれかを含み、場合によりＮ末端の１、２、または３つの残基（Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ）が含まれておらず、さらに場合によりＣ末端Ｌｙｓが含まれていない。
【0093】
「ＯｓｐＡ膜貫通ドメイン」は、本明細書で使用される場合、Ｂ．ブルグドルフェリＯｓｐＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＣＬ６６）のアミノ酸残基約２～２４、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって同定される、そのホモログの対応する位置を指す。
【0094】
「自己アジュバント性」は、本明細書で使用される場合、フェリチンおよび免疫刺激性部分が同じ分子実体中にあるように、フェリチンおよびフェリチンに直接コンジュゲートされた免疫刺激性部分を含む組成物またはポリペプチドを指す。非フェリチンポリペプチドを含む抗原性フェリチンポリペプチドを、免疫刺激性部分にコンジュゲートして、自己アジュバント性ポリペプチドを生成してもよい。
【0095】
「抗原性ＯｓｐＡポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドがＯｓｐＡに関して抗原性であるのに十分な長さのＯｓｐＡの全てまたは一部を含むポリペプチドを指す。完全長のＯｓｐＡは、以下に定義するように、膜貫通ドメインおよびエクトドメインを含む。抗原性は、フェリチンまたはルマジンシンターゼタンパク質のような異種配列をさらに含む構築物の一部としてのＯｓｐＡ配列の機能であり得る。すなわち、ＯｓｐＡが異種配列をさらに含む構築物の一部である場合、構築物は、異種配列を有しないＯｓｐＡ配列がそうすることができるか否かによらず、抗ＯｓｐＡ抗体を生成する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。
【0096】
「抗原性フェリチンポリペプチド」および「抗原性フェリチンタンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、分子が非フェリチンポリペプチドに関して抗原性であるの
に十分な長さのフェリチンおよびＯｓｐＡのような非フェリチンポリペプチドを含むポリペプチドを指す。抗原性フェリチンポリペプチドはさらに、免疫刺激性部分を含み得る。抗原性は、より大きい構築物の一部としての非フェリチン配列の機能であり得る。すなわち、構築物は、フェリチンを有しない非フェリチンポリペプチド（および該当する場合、免疫刺激性部分）がそうすることができるか否かによらず、非フェリチンポリペプチドに対する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、ＯｓｐＡポリペプチドであり、この場合抗原性フェリチンポリペプチドもまた「抗原性ＯｓｐＡポリペプチド」である。しかし、明白にするために、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、フェリチンを含む必要はない。「抗原性ポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、抗原性フェリチンポリペプチド、および抗原性ＯｓｐＡポリペプチドのいずれかまたは両方であるポリペプチドを指す。本開示は、所定の核酸配列またはアミノ酸配列（参照配列）に対してそれぞれ、ある特定の程度の同一性を有する核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。
に十分な長さのフェリチンおよびＯｓｐＡのような非フェリチンポリペプチドを含むポリペプチドを指す。抗原性フェリチンポリペプチドはさらに、免疫刺激性部分を含み得る。抗原性は、より大きい構築物の一部としての非フェリチン配列の機能であり得る。すなわち、構築物は、フェリチンを有しない非フェリチンポリペプチド（および該当する場合、免疫刺激性部分）がそうすることができるか否かによらず、非フェリチンポリペプチドに対する抗原としての役目を果たすことができれば十分である。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、ＯｓｐＡポリペプチドであり、この場合抗原性フェリチンポリペプチドもまた「抗原性ＯｓｐＡポリペプチド」である。しかし、明白にするために、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、フェリチンを含む必要はない。「抗原性ポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、抗原性フェリチンポリペプチド、および抗原性ＯｓｐＡポリペプチドのいずれかまたは両方であるポリペプチドを指す。本開示は、所定の核酸配列またはアミノ酸配列（参照配列）に対してそれぞれ、ある特定の程度の同一性を有する核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。
【0097】
２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同定されたヌクレオチドのパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
【0098】
用語「同一％」、「同一性％」、または類似の用語は、特に比較される配列間の最適なアライメントにおいて同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すと意図される。前記パーセンテージは、純粋に統計学的であり、２つの配列間の差は、比較される配列の全長にわたって分布していてもよいが、必ずしもランダムに分布している必要はない。２つの配列の比較は通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアライメント後に前記配列を、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して比較することによって実行される。比較のための最適なアライメントは、手動で、またはＳｍｉｔｈ
ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２頁によるローカルホモロジーアルゴリズムの助けを借りて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３頁のローカルホモロジーアルゴリズムの助けを借りて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４頁の類似性検索アルゴリズムの助けを借りて、または前記アルゴリズムを使用するコンピュータプログラムの助けを借りて（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、およびＴＦＡＳＴＡ、 ｉｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）実行してもよい。
ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２頁によるローカルホモロジーアルゴリズムの助けを借りて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３頁のローカルホモロジーアルゴリズムの助けを借りて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４頁の類似性検索アルゴリズムの助けを借りて、または前記アルゴリズムを使用するコンピュータプログラムの助けを借りて（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、およびＴＦＡＳＴＡ、 ｉｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）実行してもよい。
【0099】
パーセンテージ同一性は、比較される配列が対応する同一の位置の数を決定する工程、この数を比較される位置の数（例えば、参照配列における位置の数）で除算する工程、およびこの結果に１００を乗算する工程によって得られる。
【0100】
一部の実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％である領域に関して与えられる。例えば、参照核酸配列が２００ヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００ヌクレオチド、一部の実施形態では、連続ヌクレオチドに関して与えられる。一部の実施形態では、同一性の程度は、参照配列の全長にわたって与えられる。
【0101】
所定の核酸配列またはアミノ酸配列に対してそれぞれ、特定の同一性の程度を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所定の配列の少なくとも１つの機能的特性を有するこ
とができ、例えば、一部の例では前記所定の配列と機能的に等価である。１つの重要な特性は、特に、対象に投与した場合にサイトカインとして作用する能力を含む。一部の実施形態では、所定の核酸配列またはアミノ酸配列に対して特定の同一性の程度を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所定の配列と機能的に等価である。
とができ、例えば、一部の例では前記所定の配列と機能的に等価である。１つの重要な特性は、特に、対象に投与した場合にサイトカインとして作用する能力を含む。一部の実施形態では、所定の核酸配列またはアミノ酸配列に対して特定の同一性の程度を有する核酸配列またはアミノ酸配列は、前記所定の配列と機能的に等価である。
【0102】
本明細書で使用される場合、「対象」は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「対象」はヒトを指す。一部の実施形態では、「対象」は非ヒト動物を指す。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または虫を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、対象は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであり得る。本発明のある特定の実施形態では、対象は成体、青年期、または幼体である。一部の実施形態では、用語「個体」または「患者」は、「対象」と互換的に使用され、互換的であると意図される。
【0103】
「表面に露出したアミノ酸」は、本明細書で使用される場合、該当する場合に、多量体形成後、タンパク質がその本来の三次元コンフォメーションにある場合に溶媒分子が接触することができる側鎖を有するタンパク質（例えば、フェリチン）中のアミノ酸残基を指す。このように、例えば２４量体を形成するフェリチンの場合、表面に露出したアミノ酸残基は、フェリチンが２４量体として、例えばフェリチン多量体またはフェリチン粒子として集合する場合に、その側鎖に溶媒が接触することができる残基である。
【0104】
本明細書で使用される場合、用語「ワクチン接種」または「ワクチン接種する」は、例えば病原体に対して免疫応答を生成することが意図される組成物の投与を指す。ワクチン接種は、病原体に対する曝露および／または１つもしくはそれ以上の症状の発生の前、間、および／または後に投与することができ、一部の実施形態では、病原体に対する曝露の前、間、および／または直後に投与することができる。一部の実施形態では、ワクチン接種は、ワクチン接種組成物の適切な間隔を空けた複数回の投与を含む。
【0105】
Ｂ．ＯｓｐＡポリペプチド
単独で、個別の分子としてアジュバントと共に、および／またはナノ粒子（例えば、フェリチン粒子またはルマジンシンターゼ粒子）の一部として投与した場合に抗原性であり得て、自己アジュバント性であり得るＯｓｐＡポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ボレリアの改変外部表面タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）を含む。ＯｓｐＡは、ＯｓｐＡの異なるエピトープに対するモノクローナル抗体とのその反応性によって定義される複数の血清型で存在する（Ｗｉｌｓｋｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ３１（２）：３４０～３５０頁（１９９３）を参照されたい）。これらの血清型は、ボレリア細菌の異なる遺伝子種と相関する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡは、血清型１～７のいずれか１つである。一部の実施形態では、ＯｓｐＡは、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・マヨニイ、ボレリア・アフゼリ、ボレリア・ガリニ、またはボレリア・ババリエンシスに由来する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡは、ボレリア・ブルグドルフェリＯｓｐＡである。一部の実施形態では、ボレリアは、マダニ属のダニが運ぶことができる。一部の実施形態では、ボレリアは、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・マヨニイ、ボレリア・アフゼリ、ボレリア・ガリニ、またはボレリア・ババリエンシスである。
単独で、個別の分子としてアジュバントと共に、および／またはナノ粒子（例えば、フェリチン粒子またはルマジンシンターゼ粒子）の一部として投与した場合に抗原性であり得て、自己アジュバント性であり得るＯｓｐＡポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ボレリアの改変外部表面タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）を含む。ＯｓｐＡは、ＯｓｐＡの異なるエピトープに対するモノクローナル抗体とのその反応性によって定義される複数の血清型で存在する（Ｗｉｌｓｋｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ３１（２）：３４０～３５０頁（１９９３）を参照されたい）。これらの血清型は、ボレリア細菌の異なる遺伝子種と相関する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡは、血清型１～７のいずれか１つである。一部の実施形態では、ＯｓｐＡは、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・マヨニイ、ボレリア・アフゼリ、ボレリア・ガリニ、またはボレリア・ババリエンシスに由来する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡは、ボレリア・ブルグドルフェリＯｓｐＡである。一部の実施形態では、ボレリアは、マダニ属のダニが運ぶことができる。一部の実施形態では、ボレリアは、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・マヨニイ、ボレリア・アフゼリ、ボレリア・ガリニ、またはボレリア・ババリエンシスである。
【0106】
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１エクトドメインのようなＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドである。文献により、配列番号８３のアミノ酸１６５～１７３でのＯｓｐＡ血清型１のエピトープは、ヒト白血球機能関連抗原－１（ｈＬＦＡ－１）－すなわち配列番号７８（Ｇｒｏｓｓ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５
３７７）：７０３～６頁（１９９８）を参照されたい）の配列の断片と相同性を有することが報告されている。配列番号８３のアミノ酸１６５～１７３は、配列番号７７における単離されたノナペプチドとして示され、ｈＬＦＡ－１相同性部位と呼ばれる。配列番号８３は、例示的な野生型血清型１ ＯｓｐＡ配列であり、これはＯｓｐＡにおけるアミノ酸位置の考察のための参照配列として本明細書において使用される。この相同性部位は、抗生物質耐性ライム関節炎を含むライム関節炎の発症において役割を果たし得る。本明細書において、改変ＯｓｐＡが配列番号７７の配列を含まない、ボレリアの改変ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを記載する。そのようなポリペプチドは、抗体を誘発するために使用する場合、改善された安全性、例えば自己免疫応答を誘発するリスクの低減を有し得る。一部の実施形態では、ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドは、ｈＬＦＡ－１との同一性を低減させる１つまたはそれ以上の改変を有する。配列番号７８との相同性を低減させる、配列番号７８との同一性を低減させる、または配列番号７８と比較して１つもしくはそれ以上の非保存的置換を導入する任意の改変が包含される。一部の実施形態では、配列番号７７の配列を含まない、ボレリアのＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のエクトドメインを含み、エクトドメインは、配列番号７７の配列を含まない。一部の実施形態では、抗原性ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドは、配列番号９４～１０２のいずれか１つの配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
３７７）：７０３～６頁（１９９８）を参照されたい）の配列の断片と相同性を有することが報告されている。配列番号８３のアミノ酸１６５～１７３は、配列番号７７における単離されたノナペプチドとして示され、ｈＬＦＡ－１相同性部位と呼ばれる。配列番号８３は、例示的な野生型血清型１ ＯｓｐＡ配列であり、これはＯｓｐＡにおけるアミノ酸位置の考察のための参照配列として本明細書において使用される。この相同性部位は、抗生物質耐性ライム関節炎を含むライム関節炎の発症において役割を果たし得る。本明細書において、改変ＯｓｐＡが配列番号７７の配列を含まない、ボレリアの改変ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを記載する。そのようなポリペプチドは、抗体を誘発するために使用する場合、改善された安全性、例えば自己免疫応答を誘発するリスクの低減を有し得る。一部の実施形態では、ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドは、ｈＬＦＡ－１との同一性を低減させる１つまたはそれ以上の改変を有する。配列番号７８との相同性を低減させる、配列番号７８との同一性を低減させる、または配列番号７８と比較して１つもしくはそれ以上の非保存的置換を導入する任意の改変が包含される。一部の実施形態では、配列番号７７の配列を含まない、ボレリアのＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のエクトドメインを含み、エクトドメインは、配列番号７７の配列を含まない。一部の実施形態では、抗原性ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドは、配列番号９４～１０２のいずれか１つの配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む。
【0107】
「相同性を低減させる」は、配列同一性を低減させることおよび／または配列類似性を低減させることを包含し、以下の表において保存的置換として記載された１組のアミノ酸の各メンバーは、記載された当初の残基およびその組の他のメンバーに対して類似であると考えられ；例えば表の１列目は、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンが互いに類似であることを示し、８列目は、アラニンおよびグリシンが互いに類似であることを示している。類似性は、推移的ではなく、そのため例えばイソロイシンおよびグリシンは類似ではないと考えられる。一部の実施形態では、改変ＯｓｐＡは、野生型ＯｓｐＡ血清型と比較してｈＬＦＡ－１に対して低減された相同性を有するＯｓｐＡ血清型１タンパク質を含む。一部の実施形態では、改変ＯｓｐＡは、配列番号７７のアミノ酸の任意の１つまたはそれ以上に対する改変を含むＯｓｐＡ血清型１を含む。一部の実施形態では、配列番号７７に対する改変は、非保存的アミノ酸置換である。非保存的置換は、以下の表に示す保存的置換とは異なる置換である。
【0108】
【表1】
【0109】
一部の実施形態では、配列番号７７の１つまたはそれ以上のアミノ酸は、血清型２、３、４、５、６、または７ ＯｓｐＡのような非血清型１ ＯｓｐＡの対応するアミノ酸に置き換えられている。一部の実施形態では、配列番号７７のアミノ酸の各々は、血清型２、３、４、５、６、または７ ＯｓｐＡの対応するアミノ酸に置き換えられている。一部の実施形態では、配列番号７７のアミノ酸は、血清型２（Ｓ２、配列番号７９）または血清型３（Ｓ３、配列番号８０）の対応するアミノ酸に置き換えられている。
【0110】
一部の実施形態では、改変ＯｓｐＡは、配列番号８１を含む。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、配列番号８２を含む。配列番号８１および８２は、配列番号７７を置き換えると意図され、それによって配列番号７８に対する相同性を低減させる。
【0111】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、完全長のＯｓｐＡ（例えば、本明細書に記載されるｈＬＦＡ－１に対する相同性を低減させる改変を含んでもよくまたは含まなくてもよい膜貫通ドメインおよびエクトドメインを含む）である。
【0112】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠如する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、膜貫通ドメインの一部、例えば野生型ＯｓｐＡ配列のＮ末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４アミノ酸を欠如する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のアミノ酸１７、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって同定される、そのホモログの対応する位置を含むセグメントを欠如する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ペアワイズもしくは構造アライメントによって同定されたＯｓｐＡ血清型１のようなＯｓｐＡのアミノ酸少なくとも１～１７またはそのホモログにおける対応するアミノ酸を欠如する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ペアワイズもしくは構造アライメントによって同定されたＯｓｐＡ血清型１のようなＯｓｐＡの少なくともＮ末端の１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４アミノ酸、またはそのホモログにおける対応するアミノ酸を欠如する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ペアワイズもしくは構造アライメントによって同定されたＯｓｐＡ血清型１のようなＯｓｐＡのアミノ酸１～２５またはそのホモログにおける対応するアミノ酸を欠如する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドは、ペアワイズもしくは構造アライメントによって同定されたＯｓｐＡ血清型１のアミノ酸１～２６またはそのホモログにおける対応するアミノ酸を欠如する。誤解を避けるために、膜貫通ドメインを欠如することは、ポリペプチドがＮ末端メチオニンを欠如することを必要としない；例えば第１の残基がメチオニンで第２の残基が野生型ＯｓｐＡの残基２６に対応し、その後に２７番目、２８番目等の野生型ＯｓｐＡ残基に対応する残基が続くポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠如すると考えられる。一部の実施形態では、ＯｓｐＡを含むポリペプチドは、野生型ＯｓｐＡ血清型１の膜貫通ドメイン内に含有される脂質付加部位のような脂質付加部位を欠如する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のシステイン１７を欠如する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＯｓｐＡ、例えば配列番号８３～８９のいずれかの１～２５位のいずれかに対応するシステインを含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のシステイン１７を欠如するか、またはシステイン１７で置換を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、脂質付加部位を欠如するように、野生型ＯｓｐＡ膜貫通ドメインの少なくとも一部を欠如する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のアミノ酸１～１７と整列するアミノ酸を欠如する。
【0113】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、パルミトイル基を含まない。一部の実施形態で
は、ポリペプチドは、ジアシルグリセロール基を含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、脂質付加されていない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、脂質付加部位を欠如する。一部の実施形態では、この脂質付加部位は、膜貫通ドメイン内に含有される。一部の実施形態では、除去される脂質付加部位は、ＯｓｐＡ血清型１のシステイン１７である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のシステイン１７を欠如するかまたはシステイン１７で置換を有する。
は、ポリペプチドは、ジアシルグリセロール基を含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、脂質付加されていない。一部の実施形態では、ポリペプチドは、脂質付加部位を欠如する。一部の実施形態では、この脂質付加部位は、膜貫通ドメイン内に含有される。一部の実施形態では、除去される脂質付加部位は、ＯｓｐＡ血清型１のシステイン１７である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＯｓｐＡ血清型１のシステイン１７を欠如するかまたはシステイン１７で置換を有する。
【0114】
一部の実施形態では、ＯｓｐＡ脂質付加部位および／もしくは膜貫通ドメインもしくはその一部の除去、ならびに／またはパルミトイルおよび／もしくはジアシルグリセロール基の欠如は、例えばタンパク質の溶解度を改善することによって、および／またはタンパク質を、イオン交換および他の形態のクロマトグラフィーのような技術による精製をより受けやすくすることによって、より容易なタンパク質精製を可能にする。
【0115】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、哺乳動物リーダー配列（シグナル配列としても知られる）を含む。一部の実施形態では、哺乳動物リーダー配列は、哺乳動物細胞において発現された場合に、ポリペプチドの分泌をもたらす。
【0116】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、グリコシル化部位を欠如する。グリコシル化部
位を除去する改変を、本明細書において詳細に記載する。本開示に従うＯｓｐＡポリペプチドは、ｈＬＦＡ－１相同性部位に対する改変、および／または膜貫通ドメインの一部もしくは全ての欠失を含む、本明細書に記載される任意の他の改変と組み合わせることができる任意のそのような改変を含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７７（例えば、ｈＬＦＡ－１ａに対して低減された相同性を有する）を含まず、およびグリコシル化を低減させる変異を有し、および／または膜貫通ドメインを欠如する。
位を除去する改変を、本明細書において詳細に記載する。本開示に従うＯｓｐＡポリペプチドは、ｈＬＦＡ－１相同性部位に対する改変、および／または膜貫通ドメインの一部もしくは全ての欠失を含む、本明細書に記載される任意の他の改変と組み合わせることができる任意のそのような改変を含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７７（例えば、ｈＬＦＡ－１ａに対して低減された相同性を有する）を含まず、およびグリコシル化を低減させる変異を有し、および／または膜貫通ドメインを欠如する。
【0117】
１．グリコシル化の改変
Ｎ結合グリコシル化は、タンパク質のアスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）残基のアミド窒素に対するグリカンの結合である。結合プロセスは、グリコシル化タンパク質をもたらす。グリコシル化は、タンパク質の翻訳後にグリコシル化酵素により接近可能であり、認識されるタンパク質中の任意のアスパラギン残基で起こり得て、ＮＸＳ／ＴＸ部位の一部である接近可能なアスパラギンで最も一般的であり、アスパラギンの後に続く第２のアミノ酸残基は、セリンまたはトレオニンである。非ヒトグリコシル化パターンは、抗体を誘発するために使用する場合、ポリペプチドを望ましくない反応原性にすることができる。加えて、通常グリコシル化されないポリペプチドのグリコシル化は、その免疫原性を変化させることができる。例えば、グリコシル化は、タンパク質内の重要な免疫原性エピトープを隠すことができる。このように、グリコシル化を低減または除去するために、アスパラギン残基またはセリン／トレオニン残基のいずれかを、例えば別のアミノ酸への置換によって改変することができる。
Ｎ結合グリコシル化は、タンパク質のアスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）残基のアミド窒素に対するグリカンの結合である。結合プロセスは、グリコシル化タンパク質をもたらす。グリコシル化は、タンパク質の翻訳後にグリコシル化酵素により接近可能であり、認識されるタンパク質中の任意のアスパラギン残基で起こり得て、ＮＸＳ／ＴＸ部位の一部である接近可能なアスパラギンで最も一般的であり、アスパラギンの後に続く第２のアミノ酸残基は、セリンまたはトレオニンである。非ヒトグリコシル化パターンは、抗体を誘発するために使用する場合、ポリペプチドを望ましくない反応原性にすることができる。加えて、通常グリコシル化されないポリペプチドのグリコシル化は、その免疫原性を変化させることができる。例えば、グリコシル化は、タンパク質内の重要な免疫原性エピトープを隠すことができる。このように、グリコシル化を低減または除去するために、アスパラギン残基またはセリン／トレオニン残基のいずれかを、例えば別のアミノ酸への置換によって改変することができる。
【0118】
一部の実施形態では、ＯｓｐＡを含むポリペプチドは、グリコシル化を低減または除去するように改変される。一部の実施形態では、ＯｓｐＡにおける１つまたはそれ以上のＮ－グリコシル化部位が除去される。一部の実施形態では、Ｎグリコシル化部位の除去は、ＯｓｐＡのグリコシル化を減少させる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、野生型血清型１ ＯｓｐＡのような野生型ＯｓｐＡと比較して減少したグリコシル化を有する。一部の実施形態では、Ｎ－グリコシル化部位の除去は、ＯｓｐＡのグリコシル化を除去する。
【0119】
一部の実施形態では、ＯｓｐＡにおける１つまたはそれ以上のアスパラギンは、非アスパラギンアミノ酸に置き換えられている。一部の実施形態では、ＯｓｐＡにおける各アスパラギンは、非アスパラギンアミノ酸に置き換えられている。タンパク質において見出される任意の天然または非天然アミノ酸、例えばグルタミンを使用して、アスパラギンを交換してもよい。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去するための改変は、ＮＸＳ／ＴＸグリコシル化部位を改変する（Ｎの後の第２の残基はＳまたはＴである）。一部の実施形態では、ＮＸＳ／ＴＸ部位における第１のＸおよび／またはＮＸＳ／ＴＸ部位における第２のＸは、プロリンではない。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＮからＱへの置換である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、Ｓ／ＴのＡへの置換である。
【0120】
グリコシル化を低減または除去するように改変することができる位置の詳細な考察を以下に述べる。位置の番号は、配列番号８３～８９として提供される完全長のＯｓｐＡ配列における位置を指す。位置の番号は、部分的および改変ＯｓｐＡ配列に関して適切に調節すべきであると理解される（例えば、Ｎ末端欠失によって２５アミノ酸残基の真の短縮がもたらされる場合、位置の番号を２５減少すべきである）。
【0121】
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型１（配列番号８３）のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１９０、Ｎ２０２、およびＮ２５１の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型１のＮ７１、Ｎ１９０、Ｎ２０２、およびＮ２５１の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコ
シル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型１のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ１９０Ｑ、Ｎ２０２Ｑ、またはＮ２５１Ｑの１つまたはそれ以上を含む。対応するアミノ酸は、ペアワイズアライメントによって異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型２～７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型１のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１９０、Ｎ２０２、およびＮ２５１と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型１の２２、７３、１９２、２０４、および２５３位でＳｅｒまたはＴｈｒの任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型１の２２、７３、１９２、２０４、および２５３位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
シル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型１のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ１９０Ｑ、Ｎ２０２Ｑ、またはＮ２５１Ｑの１つまたはそれ以上を含む。対応するアミノ酸は、ペアワイズアライメントによって異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型２～７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型１のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１９０、Ｎ２０２、およびＮ２５１と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型１の２２、７３、１９２、２０４、および２５３位でＳｅｒまたはＴｈｒの任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型１の２２、７３、１９２、２０４、および２５３位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
【0122】
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型２（配列番号８４）のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ１６４、Ｎ２０２、およびＮ２０５の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型２のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ１６４、Ｎ２０２、およびＮ２０５の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型２のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ１４１Ｑ、Ｎ１６４Ｑ、Ｎ２０２Ｑ、またはＮ２０５Ｑの１つまたはそれ以上を含む。類似のアミノ酸を、ペアワイズアライメントによって異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１または３～７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型２のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ１６４、Ｎ２０２、およびＮ２０５と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型２の２２、７３、１４３、１６６、２０４、および２０７位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型２の２２、７３、１４３、１６６、２０４、および２０７位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
【0123】
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型３（配列番号８５）のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ９５、Ｎ１４１、Ｎ１９１、およびＮ２０３の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型３のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ９５、Ｎ１４１、Ｎ１９１、およびＮ２０３の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型３のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ９５Ｑ、Ｎ１４１Ｑ、Ｎ１９１Ｑ、またはＮ２０３Ｑの１つまたはそれ以上を含む。類似のアミノ酸を、ペアワイズアライメントによって異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１～２、または４～７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型３のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ９５、Ｎ１４１、Ｎ１９１、およびＮ２０３と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型３の２２、７３、９７、１４３、１９３、および２０５位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型３の２２、７３、９７、１４３、１９３、および２０５位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
【0124】
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型４（配列番号８６）のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ２０２、Ｎ２０５、およびＮ２１９の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型４のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ２０２、Ｎ２０５、およびＮ２１９の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型４のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ１４１Ｑ、Ｎ２０２Ｑ、Ｎ２０５Ｑ、またはＮ２１９Ｑの１つまたはそれ以上を含む。類似のアミノ酸を、ペアワイズアライメントによって異なる血清型
のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１～３、または５～７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型４のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ２０２、Ｎ２０５、およびＮ２１９と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型４の２２、７３、１４３、２０４、２０７、および２２１位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型４の２２、７３、１４３、２０４、２０７、および２２１位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１～３、または５～７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型４のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、Ｎ２０２、Ｎ２０５、およびＮ２１９と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型４の２２、７３、１４３、２０４、２０７、および２２１位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型４の２２、７３、１４３、２０４、２０７、および２２１位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
【0125】
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型５のＮ２０、Ｎ７１、およびＮ１４１の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む（血清型５～７を含むある特定の血清型は、血清型１のようなある特定の他のＯｓｐＡ配列より少ないグリコシル化部位を含有する）。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型５（配列番号８７）のＮ２０、Ｎ７１、およびＮ１４１の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型５のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、またはＮ１４１Ｑの１つまたはそれ以上を含む。類似のアミノ酸を、ペアワイズアライメントによって、異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１～４、または６～７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型５のＮ２０、Ｎ７１、およびＮ１４１と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型５の２２、７３、および１４３位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型５の２２、７３、および１４３位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
【0126】
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型６（配列番号８８）のＮ２０、Ｎ７１、およびＮ１４１の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型６のＮ２０、Ｎ７１、およびＮ１４１の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型６のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、またはＮ１４１Ｑの１つまたはそれ以上を含む。類似のアミノ酸を、ペアワイズアライメントによって異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１～５、または７のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型６のＮ２０、Ｎ７１、およびＮ１４１と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型６の２２、７３、および１４３位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型６の２２、７３、および１４３位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
【0127】
一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型７（配列番号８９）のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、およびＮ１９１の任意の１つまたはそれ以上の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型７のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、およびＮ１９１の各々で改変を含む。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型７のＮ２０Ｑ、Ｎ７１Ｑ、Ｎ１４１Ｑ、またはＮ１９１Ｑの１つまたはそれ以上を含む。類似のアミノ酸を、ペアワイズアライメントによって異なる血清型のＯｓｐＡにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、血清型１～６のＯｓｐＡにおいて置き換えられたアスパラギン残基は、ＯｓｐＡ血清型７のＮ２０、Ｎ７１、Ｎ１４１、およびＮ１９１と整列するアミノ酸残基である。一部の実施形態では、グリコシル化を低減または除去する改変は、ＯｓｐＡ血清型７の２２、７３、１４３、および１９３位で任意の１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基
の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型７の２２、７３、１４３、および１９３位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
の置換を含む。一部の実施形態では、改変は、ＯｓｐＡ血清型７の２２、７３、１４３、および１９３位で１つまたはそれ以上のＳｅｒまたはＴｈｒ残基のアラニンとの置換を含む。
【0128】
Ｃ．ＯｓｐＡポリペプチドおよびフェリチンまたはルマジンシンターゼを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチド
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドおよびフェリチンまたはルマジンシンターゼを含む抗原性ポリペプチドが提供される。本明細書に開示されるそのような抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ構成要素に関して抗原性であり、例えばそれらを、抗ＯｓｐＡ抗体の産生を誘発するためにヒトのような哺乳動物に投与することができる。抗原性ポリペプチドのフェリチン構成要素は、いずれも本明細書に記載される、任意の種の野生型フェリチン、または１つもしくはそれ以上の変異を含む任意の種のフェリチンであり得る。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、配列番号１～７６のいずれか１つのアミノ酸を含む。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、配列番号１～７６のいずれか１つの配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む。抗原性ポリペプチドのルマジンシンターゼ構成要素は、任意の種のルマジンシンターゼであり得る。
一部の実施形態では、ＯｓｐＡポリペプチドおよびフェリチンまたはルマジンシンターゼを含む抗原性ポリペプチドが提供される。本明細書に開示されるそのような抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、ＯｓｐＡ構成要素に関して抗原性であり、例えばそれらを、抗ＯｓｐＡ抗体の産生を誘発するためにヒトのような哺乳動物に投与することができる。抗原性ポリペプチドのフェリチン構成要素は、いずれも本明細書に記載される、任意の種の野生型フェリチン、または１つもしくはそれ以上の変異を含む任意の種のフェリチンであり得る。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、配列番号１～７６のいずれか１つのアミノ酸を含む。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、配列番号１～７６のいずれか１つの配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含む。抗原性ポリペプチドのルマジンシンターゼ構成要素は、任意の種のルマジンシンターゼであり得る。
【0129】
一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、哺乳動物リーダー配列（シグナル配列としても知られる）を含む。一部の実施形態では、哺乳動物リーダー配列は、哺乳動物において発現させた場合、抗原性ポリペプチドの分泌をもたらす。
【0130】
１．ＯｓｐＡポリペプチド構成要素
抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、本明細書に記載される任意の改変ＯｓｐＡポリペプチドを含み得る。
抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、本明細書に記載される任意の改変ＯｓｐＡポリペプチドを含み得る。
【0131】
例えば、一部の実施形態では、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドのＯｓｐＡ構成要素は、ＯｓｐＡのエクトドメインを含む。一部の実施形態では、ＯｓｐＡのエクトドメインは、血清型１、２、３、４、５、６、または７のいずれか１つに由来する。例示的な野生型ＯｓｐＡ配列は、配列番号８３～８９として提供される。そのＮ末端の２５アミノ酸は、例えば脂質付加部位を除去するために除去することができる。例示的なＯｓｐＡ配列の受託番号もまた、実施例に提供する。一部の実施形態では、エクトドメインは、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・マヨニイ、ボレリア・アフゼリ、ボレリア・ガリニ、またはボレリア・ババリエンシスに由来する。一部の実施形態では、エクトドメインはボレリア・ブルグドルフェリである。
【0132】
一部の実施形態では、エクトドメインは、野生型エクトドメインである。
【0133】
一部の実施形態では、エクトドメインは、改変エクトドメイン、例えばグリコシル化を低減するように改変されたエクトドメインである。導入としてのグリコシル化の考察は前の節に提供され、簡潔にするためにここでは繰り返さない。抗原性ＯｓｐＡポリペプチドのＯｓｐＡ構成要素は、例えば本明細書において詳細に考察されるアミノ酸置換によってエクトドメインにおける１つまたはそれ以上のＮグリコシル化部位の除去を含むがこれらに限定されない、グリコシル化を低減または除去するための本明細書に記載される任意の改変を含み得る。
【0134】
一部の実施形態では、ＯｓｐＡエクトドメインは、例えば膜貫通ドメインの一部または全てを含む、抗原性ポリペプチドにおけるより大きいＯｓｐＡ配列の一部として存在する。一部の実施形態では、ＯｓｐＡエクトドメインは、抗原性ポリペプチド内の完全長ＯｓｐＡ配列に存在する。一部の実施形態では、完全長のＯｓｐＡ配列は、野生型の完全長Ｏ
ｓｐＡ配列である。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、膜貫通ドメインを含まない。
ｓｐＡ配列である。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、膜貫通ドメインを含まない。
【0135】
上記で考察した改変のいずれも、抗原性ポリペプチドにおいて組み合わせることができる。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、グリコシル化を低減させる少なくとも１つの改変および本明細書に記載される少なくとも１つのさらなる改変を含む。
【0136】
一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドのＯｓｐＡエクトドメインは、上記の節Ｂで記載した改変ＯｓｐＡエクトドメインのいずれか１つである。
【0137】
本明細書で記載されるＯｓｐＡエクトドメイン（または完全長のＯｓｐＡのようなＯｓｐＡエクトドメインを含む配列のいずれかを、抗原性ポリペプチドにおいて以下に記載されるフェリチンのいずれかと共に組み合わせることができる。
【0138】
２．フェリチン構成要素
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ＯｓｐＡポリペプチドおよびフェリチンを含む融合タンパク質が包含される。抗原性ポリペプチド中のフェリチンは、野生型であり得るか、または１つもしくはそれ以上の変異（以下の節を参照されたい）を含み得る。一部の実施形態では、フェリチンは、細菌、昆虫、真菌、鳥類、または哺乳動物である。一部の実施形態では、フェリチンはヒトである。一部の実施形態では、フェリチンは細菌である。一部の実施形態では、フェリチンは、イラクサギンウワバフェリチン（ＰＤＢ：１Ｚ６Ｏ＿Ｘ、配列番号２１１および２１２）である。
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ＯｓｐＡポリペプチドおよびフェリチンを含む融合タンパク質が包含される。抗原性ポリペプチド中のフェリチンは、野生型であり得るか、または１つもしくはそれ以上の変異（以下の節を参照されたい）を含み得る。一部の実施形態では、フェリチンは、細菌、昆虫、真菌、鳥類、または哺乳動物である。一部の実施形態では、フェリチンはヒトである。一部の実施形態では、フェリチンは細菌である。一部の実施形態では、フェリチンは、イラクサギンウワバフェリチン（ＰＤＢ：１Ｚ６Ｏ＿Ｘ、配列番号２１１および２１２）である。
【0139】
一部の実施形態では、フェリチンは、軽鎖および／または重鎖フェリチンである。一部の実施形態では、フェリチンは、ヒト重鎖フェリチン（ＦＴＨ１、ＧＥＮＥ ＩＤ番号：２４９５）、またはヒト軽鎖フェリチン（ＦＴＬ、ＧＥＮＥ ＩＤ番号：２５１２）である。一部の実施形態では、フェリチンは、重鎖フェリチンおよび軽鎖フェリチンの全体で２４個のサブユニットを含む、「フェリチン粒子」、または「フェリチンナノ粒子」として本明細書で呼ばれる多量体タンパク質である。
【0140】
一部の実施形態では、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、軽鎖フェリチンおよびＯｓｐＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、重鎖フェリチンおよびＯｓｐＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、軽鎖フェリチンおよびＯｓｐＡポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドは、非フェリチンポリペプチドに連結していない重鎖フェリチンと集合することができる。一部の実施形態では、重鎖フェリチンおよびＯｓｐＡポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドは、非フェリチンポリペプチドに連結していない軽鎖フェリチンと集合することができる。非フェリチンポリペプチドに連結していないフェリチンを、「裸のフェリチン」と呼ぶことがある。
【0141】
一部の実施形態では、重鎖フェリチンおよびＯｓｐＡポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドは、軽鎖フェリチンおよびＯｓｐＡポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドと集合して、単一のフェリチン粒子上で同じまたは異なる抗原の２つの発現を可能にすることができる。一部の実施形態では、２つの異なる抗原は、単一の感染作用物質によってコードされる。一部の実施形態では、２つの異なる抗原は、２つの異なる感染作用物質、例えば異なる血清型または種のボレリアによってコードされる。
【0142】
一部の実施形態では、重鎖フェリチンおよびＯｓｐＡポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドは、軽鎖フェリチンおよびＯｓｐＡポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドと集合して、二価組成物を産生することができる。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｈ．ピロリフェリチン（そのＮ末端にウシガエルフェリチンからの８アミノ酸伸長部を含む例示
的な野生型Ｈ．ピロリフェリチン配列に関しては、配列番号９０を参照されたい）である。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチン（または他の細菌フェリチン）とヒトフェリチンとの間の配列相同性がより低いことにより、抗原性ポリペプチドを構築するためのワクチンプラットフォームとして使用した場合に自己免疫の可能性を減少させ得る（Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｃｅｌｌ １６２，１０９０～１１００頁（２０１５）を参照されたい）。
的な野生型Ｈ．ピロリフェリチン配列に関しては、配列番号９０を参照されたい）である。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチン（または他の細菌フェリチン）とヒトフェリチンとの間の配列相同性がより低いことにより、抗原性ポリペプチドを構築するためのワクチンプラットフォームとして使用した場合に自己免疫の可能性を減少させ得る（Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｃｅｌｌ １６２，１０９０～１１００頁（２０１５）を参照されたい）。
【0143】
一部の実施形態では、フェリチンは、場合により本明細書に記載される１つまたはそれ以上の変異を有するピュロコックスフリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）フェリチン（ＮＣＢＩ ｓｅｑ ＷＰ＿０１１０１１８７１．１）である。
【0144】
一部の実施形態では、フェリチンは、野生型フェリチンと７０％より高い、７５％より高い、８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、９７％より高い、９８％より高い、または９９％より高い同一性を有する配列を含む。
【0145】
一部の実施形態では、フェリチンは昆虫フェリチンである。一部の実施形態では、フェリチンは、場合により本明細書に記載される１つまたはそれ以上の変異を有するイラクサギンウワバフェリチン（ＰＤＢ：１Ｚ６Ｏ＿Ｘ、配列番号２１１および２１２）である。
【0146】
ａ）フェリチン変異
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の変異を含むフェリチンを本明細書に開示する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の変異は、例えば野生型フェリチンのアミノ酸配列の変化、および／またはＮもしくはＣ末端での挿入を含む。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、またはそれより多くの異なるアミノ酸が、野生型フェリチンと比較してフェリチンにおいて変異している（一部の実施形態では、任意のＮ末端挿入に加えて）。１つまたはそれ以上の変異は、例えば以下で詳細に考察するように、フェリチンの機能的特性を変化させることができる。一般的に、変異は単に、対応する野生型フェリチンと比較した配列の差（置換された、付加された、または欠失されたアミノ酸残基または複数の残基のような）を指す。
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の変異を含むフェリチンを本明細書に開示する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の変異は、例えば野生型フェリチンのアミノ酸配列の変化、および／またはＮもしくはＣ末端での挿入を含む。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、またはそれより多くの異なるアミノ酸が、野生型フェリチンと比較してフェリチンにおいて変異している（一部の実施形態では、任意のＮ末端挿入に加えて）。１つまたはそれ以上の変異は、例えば以下で詳細に考察するように、フェリチンの機能的特性を変化させることができる。一般的に、変異は単に、対応する野生型フェリチンと比較した配列の差（置換された、付加された、または欠失されたアミノ酸残基または複数の残基のような）を指す。
【0147】
１．コンジュゲーションのためのシステイン
一部の実施形態では、フェリチンを、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチドのコンジュゲーションのための化学ハンドルを提供するように変異させる。これは、表面に露出した非システインアミノ酸をシステインに置き換える変異によって達成することができる。誤解を避けるため、「表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える」のような表現は、野生型または変異前配列における表面に露出したアミノ酸がシステインではないことを必然的に暗示している。免疫刺激性部分または非フェリチンポリペプチドのコンジュゲーションのための化学ハンドルを提供する別のアプローチは、リンカーのようなアミノ酸のセグメントをフェリチンのＮまたはＣ末端に含めることであり、アミノ酸のセグメントはシステインを含む。一部の実施形態では、このシステイン（表面に露出したアミノ酸を置き換えるか、またはＮもしくはＣ末端リンカーにある）は不対であり、このことは、これがジスルフィド結合を形成するために適切なパートナーシステインを有していないことを意味する。一部の実施形態では、このシステインは、フェリチンの二次構造を変化させない。一部の実施形態では、このシステインは、フェリチンの三次構造を変化させない。
一部の実施形態では、フェリチンを、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチドのコンジュゲーションのための化学ハンドルを提供するように変異させる。これは、表面に露出した非システインアミノ酸をシステインに置き換える変異によって達成することができる。誤解を避けるため、「表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える」のような表現は、野生型または変異前配列における表面に露出したアミノ酸がシステインではないことを必然的に暗示している。免疫刺激性部分または非フェリチンポリペプチドのコンジュゲーションのための化学ハンドルを提供する別のアプローチは、リンカーのようなアミノ酸のセグメントをフェリチンのＮまたはＣ末端に含めることであり、アミノ酸のセグメントはシステインを含む。一部の実施形態では、このシステイン（表面に露出したアミノ酸を置き換えるか、またはＮもしくはＣ末端リンカーにある）は不対であり、このことは、これがジスルフィド結合を形成するために適切なパートナーシステインを有していないことを意味する。一部の実施形態では、このシステインは、フェリチンの二次構造を変化させない。一部の実施形態では、このシステインは、フェリチンの三次構造を変化させない。
【0148】
一部の実施形態では、このシステインを使用して、免疫刺激性部分のような作用物質をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、このシステインは、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン上のこのシステインにコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン粒子の表面上で露出
する。一部の実施形態では、このシステインは、投与後にフェリチン粒子が集合する間、対象の分子および細胞と相互作用することができる。
する。一部の実施形態では、このシステインは、投与後にフェリチン粒子が集合する間、対象の分子および細胞と相互作用することができる。
【0149】
一部の実施形態では、このシステインの存在により、１つまたはそれ以上の免疫刺激性部分、例えばアジュバントのコンジュゲーションが可能となる。一部の実施形態では、免疫刺激性部分のコンジュゲーションは、このシステインの非存在下では起こらない。
【0150】
一部の実施形態では、システインに置き換えられる非システインアミノ酸は、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、およびＳ１１１から選択される。このように、一部の実施形態では、システインのために置き換えられる表面に露出したアミノ酸は、Ｈ．ピロリフェリチンのＥ１２、Ｓ２６、Ｓ７２、Ａ７５、Ｋ７９、Ｓ１００、またはＳ１１１に対応するアミノ酸残基である。類似のアミノ酸を、ペアワイズまたは構造アライメントによって、非Ｈ．ピロリフェリチンにおいて見出すことができる。一部の実施形態では、システインに置き換えられる非システインアミノ酸は、ヒト軽鎖フェリチンのＳ３、Ｓ１９、Ｓ３３、Ｉ８２、Ａ８６、Ａ１０２、およびＡ１２０に対応するアミノ酸から選択することができる。一部の実施形態では、システインに置き換えられる表面に露出したアミノ酸は、本来のアミノ酸がシステインに置き換えられた場合、これは集合したフェリチン多量体もしくは粒子において反応性である、および／またはこのシステインはフェリチン多量体もしくは粒子の安定性を妨害しない、および／またはこのシステインがフェリチンの発現レベルの低減をもたらさないという理解に基づいて選択される。
【0151】
一部の実施形態では、フェリチンはＥ１２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｅ１２Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｅ１２Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＥ１２Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＥ１２Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【0152】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ２６Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ２６Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ２６Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ２６Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ２６Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【0153】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ７２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ７２Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ７２Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ７２Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ７２Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【0154】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ａ７５Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ａ７５Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ａ７５Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリ
チン単量体上のＡ７５Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＡ７５Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
チン単量体上のＡ７５Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＡ７５Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【0155】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｋ７９Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｋ７９Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｋ７９Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＫ７９Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＫ７９Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【0156】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ１００Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ１００Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ１００Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ１００Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ１００Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【0157】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｓ１１１Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、Ｓ１１１Ｃ残基を使用して、作用物質（例えば、免疫刺激性部分および／または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、Ｓ１１１Ｃ残基は、反応性である遊離のチオール基を提供する。一部の実施形態では、フェリチン単量体上のＳ１１１Ｃ残基にコンジュゲートされた作用物質は、集合したフェリチン多量体または粒子の表面上で発現される。一部の実施形態では、２４個のＳ１１１Ｃ残基（各単量体から１つ）が、フェリチン多量体または粒子の表面上に存在する。
【0158】
２．内部システインの除去
一部の実施形態では、フェリチンは、内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異を含む。本来の内部システイン残基を除去することによって、フェリチン単量体あたり１つのみの不対システインが存在することを確実にし、ジスルフィド形成のような望ましくない反応を回避することができ、より安定かつ効率的な結果（例えば、アジュバントの提示）をもたらし得る。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１が非システインアミノ酸に置き換えられる。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１がセリンに置き換えられる（Ｃ３１Ｓ）が、任意の非システイン残基、例えばアラニン、グリシン、トレオニン、またはアスパラギンを使用してもよい。類似のアミノ酸を、ペアワイズまたは構造アライメントによって、非Ｈ．ピロリフェリチンにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、非システインのために置き換えられる内部システインは、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１と整列するアミノ酸残基である。Ｃ３１Ｓ変異を示す例示的なフェリチン配列を、配列番号２０１～２０７に示す。一部の実施形態では、１つより多くの内部システインがフェリチンに存在する場合、２つまたはそれより多く（例えば、各々の）内部システインは、セリン、またはセリン、アラニン、グリシン、トレオニン、もしくはアスパラギンから選択されるアミノ酸のような非システインアミノ酸に置き換えられる。
一部の実施形態では、フェリチンは、内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異を含む。本来の内部システイン残基を除去することによって、フェリチン単量体あたり１つのみの不対システインが存在することを確実にし、ジスルフィド形成のような望ましくない反応を回避することができ、より安定かつ効率的な結果（例えば、アジュバントの提示）をもたらし得る。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１が非システインアミノ酸に置き換えられる。一部の実施形態では、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１がセリンに置き換えられる（Ｃ３１Ｓ）が、任意の非システイン残基、例えばアラニン、グリシン、トレオニン、またはアスパラギンを使用してもよい。類似のアミノ酸を、ペアワイズまたは構造アライメントによって、非Ｈ．ピロリフェリチンにおいて見出すことができる。このように、一部の実施形態では、非システインのために置き換えられる内部システインは、Ｈ．ピロリフェリチンのＣ３１と整列するアミノ酸残基である。Ｃ３１Ｓ変異を示す例示的なフェリチン配列を、配列番号２０１～２０７に示す。一部の実施形態では、１つより多くの内部システインがフェリチンに存在する場合、２つまたはそれより多く（例えば、各々の）内部システインは、セリン、またはセリン、アラニン、グリシン、トレオニン、もしくはアスパラギンから選択されるアミノ酸のような非システインアミノ酸に置き換えられる。
【0159】
３．グリコシル化
ヒト適合性のグリコシル化は、組換え薬物製品における安全性および効能に関与し得る。規制当局の承認は、極めて重要な品質属性として適切なグリコシル化を証明することを条件とし得る（Ｚｈａｎｇら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２１（５）
：７４０～７６５頁（２０１６）を参照されたい）。Ｎ－グリカンは、アスパラギン側鎖のグリコシル化に起因することができ、ヒトと、細菌および酵母のような他の生物との間で構造が異なり得る。このように、本開示に従うフェリチンにおいて、非ヒトグリコシル化および／またはＮグリカン形成を低減または除去することが望ましいであろう。一部の実施形態では、フェリチンのグリコシル化を制御することにより、特にヒトワクチン接種に使用する場合、組成物の効能および／または安全性が改善される。
ヒト適合性のグリコシル化は、組換え薬物製品における安全性および効能に関与し得る。規制当局の承認は、極めて重要な品質属性として適切なグリコシル化を証明することを条件とし得る（Ｚｈａｎｇら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２１（５）
：７４０～７６５頁（２０１６）を参照されたい）。Ｎ－グリカンは、アスパラギン側鎖のグリコシル化に起因することができ、ヒトと、細菌および酵母のような他の生物との間で構造が異なり得る。このように、本開示に従うフェリチンにおいて、非ヒトグリコシル化および／またはＮグリカン形成を低減または除去することが望ましいであろう。一部の実施形態では、フェリチンのグリコシル化を制御することにより、特にヒトワクチン接種に使用する場合、組成物の効能および／または安全性が改善される。
【0160】
一部の実施形態では、フェリチンを、Ｎ－グリカンの形成を阻害するように変異させる。一部の実施形態では、変異したフェリチンは、その対応する野生型フェリチンと比較して低減されたグリコシル化を有する。
【0161】
一部の実施形態では、フェリチンは、表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異を含む。一部の実施形態では、表面に露出したアスパラギンは、Ｈ．ピロリフェリチンのＮ１９、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって決定される、Ｈ．ピロリフェリチンの３１位に対応する位置である。一部の実施形態では、そのようなアスパラギン、例えばＨ．ピロリフェリチンのＮ１９を変異させることは、フェリチンのグリコシル化を減少させる。一部の実施形態では、変異は、アスパラギンをグルタミンに置き換える。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異を含むＨ．ピロリフェリチンである。配列番号２０１～２０７は、Ｎ１９Ｑ変異を含む例示的なフェリチン配列である。
【0162】
細菌または酵母において産生されたグリコシル化タンパク質に曝露された哺乳動物は、細菌または酵母における所定のタンパク質のグリコシル化パターンが、哺乳動物における同じタンパク質のグリコシル化パターンとは異なり得ることから、グリコシル化タンパク質に対する免疫応答を生じ得る。このように、いくつかのグリコシル化治療タンパク質は、細菌または酵母における産生にとって適切ではないことがあり得る。
【0163】
一部の実施形態では、アミノ酸変異によるフェリチンのグリコシル化の減少は、細菌または酵母におけるタンパク質の産生を促進する。一部の実施形態では、フェリチンのグリコシル化の減少は、細菌または酵母において発現された変異フェリチンの投与時の哺乳動物における副作用の可能性を低減させる。一部の実施形態では、細菌または酵母において産生された変異フェリチンのヒト対象における反応原性は、グリコシル化が減少していることから低い。一部の実施形態では、ヒト対象における過敏応答の発生率は、野生型フェリチンと比較して低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンによる処置後では低い。
【0164】
一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物の対象における分解は、野生型フェリチンを含む組成物、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較して遅い。一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物は、野生型フェリチン、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較して、対象において低減されたクリアランスを有する。一部の実施形態では、低減されたグリコシル化を有する変異フェリチンを含む組成物は、野生型フェリチン、または野生型グリコシル化を有する対応するフェリチンを含む組成物と比較してより長い血清中半減期を有する。
【0165】
４．変異の組合せ
一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に記載される変異の１つより多くのタイプを含む。一部の実施形態では、フェリチンは、グリコシル化を減少させる変異、内部システインを除去する変異、および表面に露出したシステインを生成する変異から独立して選択される１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、グリ
コシル化を減少させる変異、内部システインを除去する変異、および表面に露出したシステインを生成する変異を含む。
一部の実施形態では、フェリチンは、本明細書に記載される変異の１つより多くのタイプを含む。一部の実施形態では、フェリチンは、グリコシル化を減少させる変異、内部システインを除去する変異、および表面に露出したシステインを生成する変異から独立して選択される１つまたはそれ以上の変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、グリ
コシル化を減少させる変異、内部システインを除去する変異、および表面に露出したシステインを生成する変異を含む。
【0166】
一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、および表面に露出したシステインを生成する変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＥ１２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ７２Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＡ７５Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＫ７９Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ１００Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、Ｎ１９Ｑ変異、Ｃ３１Ｓ変異、およびＳ１１１Ｃ変異を含む。一部の実施形態では、フェリチンは、前述の変異の組のいずれかに対応する変異を含み、対応する変異は、フェリチンアミノ酸配列とＨ．ピロリフェリチンアミノ酸配列（配列番号２０８または２０９）とのペアワイズアライメントによって決定した位置で、ＮをＱに、ＣをＳに、および非システインの表面に露出したアミノ酸をシステインに変化させる。
【0167】
１つより多くのタイプの変異を含む例示的なフェリチンを、配列番号２０１～２０７に提供する。
【0168】
５．構造アライメント
本明細書で考察したように、所与のポリペプチド（例えば、Ｈ．ピロリフェリチン）に関して記載した変異に対応する変異の位置は、ペアワイズまたは構造アライメントによって同定することができる。構造アライメントは、タンパク質がかなりの配列変動にも関わらず類似の構造を共有し、ファミリーの多くのメンバーが構造的に特徴付けされている、フェリチンのような大きいタンパク質ファミリーにとって適切であり、これもまた、ボレリアポリペプチド（例えば、ＯｓｐＡ）のような、本明細書に記載される他のポリペプチドの異なる形態における対応する位置を同定するために使用することができる。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）は、その受託番号と共に以下に列挙するフェリチンを含む、多くのフェリチンに関する３Ｄ構造を含む。
本明細書で考察したように、所与のポリペプチド（例えば、Ｈ．ピロリフェリチン）に関して記載した変異に対応する変異の位置は、ペアワイズまたは構造アライメントによって同定することができる。構造アライメントは、タンパク質がかなりの配列変動にも関わらず類似の構造を共有し、ファミリーの多くのメンバーが構造的に特徴付けされている、フェリチンのような大きいタンパク質ファミリーにとって適切であり、これもまた、ボレリアポリペプチド（例えば、ＯｓｐＡ）のような、本明細書に記載される他のポリペプチドの異なる形態における対応する位置を同定するために使用することができる。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）は、その受託番号と共に以下に列挙するフェリチンを含む、多くのフェリチンに関する３Ｄ構造を含む。
【0169】
２ｊｄ６，２ｊｄ７－ＰｆＦＲ－ピュロコックスフリオスス。２ｊｄ８－ＰｆＦＲ＋Ｚｎ。３ａ６８－遺伝子ＳｆｅｒＨ４由来のｓｏＦＲ－ダイズ。３ａ９ｑ－遺伝子ＳｆｅｒＨ４（変異体）由来のｓｏＦＲ。３ｅｇｍ，３ｂｖｆ，３ｂｖｉ，３ｂｖｋ，３ｂｖｌ－ＨｐＦＲ－ヘリコバクターピロリ。５ｃ６ｆ－ＨｐＦＲ（変異体）＋Ｆｅ。１ｚ４ａ，１ｖｌｇ－ＦＲ－テルモトガマリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅ）。１ｓ３ｑ，１ｓｑ３，３ｋｘ９－ＦＲ－アルカエオグロブスフルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｕｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ），１ｋｒｑ－ＦＲ－カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）。１ｅｕｍ－ＥｃＦＲ－大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）。４ｒｅｕ－ＥｃＦＲ＋Ｆｅ。４ｘｇｓ－ＥｃＦＲ（変異体）＋Ｆｅ２Ｏ２。４ｚｔｔ－ＥｃＦＲ（変異体）＋Ｆｅ２Ｏ＋Ｆｅ２＋Ｆｅ＋Ｏ２。１ｑｇｈ－ＬｉＦＲ－リステリアイノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）。３ｑｚ３－ＶｃＦＲ－ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）。３ｖｎｘ－ＦＲ－アナアオサ（Ｕｌｖａ ｐｅｒｔｕｓａ）。４ｉｓｍ，４ｉｓｐ，４ｉｔｔ，４ｉｔｗ，４ｉｗｊ，４ｉｗｋ，４ｉｘｋ，３ｅ６ｓ－ＰｎｍＦＲ－プセウドニッチア（Ｐｓｅｕｄｏ－ｎｉｔｓｃｈｉａ ｍｕｌｔｉｓｅｒｉｅｓ）。４ｚｋｈ，４ｚｋｗ，４ｚｋｘ，４ｚｌ５，４ｚｌ６，４ｚｌｗ，４ｚｍｃ－ＰｎｍＦＲ（変異体）＋Ｆｅ。１ｚ６ｏ－ＦＲ－イラクサギンウワバ。４ｃｍｙ－ＦＲ＋Ｆｅ－緑色硫黄細菌（Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ
ｔｅｐｉｄｕｍ）。フェリチン軽鎖（ＦＴＬ）。１ｌｂ３，１ｈ９６－ｍＦＴＬ－マウス。１ｒｃｃ，１ｒｃｄ，１ｒｃｉ－ｂＦＴＬ＋タルトレート＋Ｍｇ。１ｒｃｅ，１ｒｃ
ｇ－ｂＦＴＬ＋タルトレート＋Ｍｎ。３ｎｏｚ，３ｎｐ０，３ｎｐ２，３ｏ７ｒ－ｈｏＦＴＬ（変異体）－ウマ。３ｏ７ｓ，３ｕ９０－ｈｏＦＴＬ。４ｖ１ｗ－ｈｏＦＴＬ－ｃｒｙｏ ＥＭ。３ｒａｖ，３ｒｄ０－ｈｏＦＴＬ＋バルビツレート。フェリチン軽鎖＋重鎖：５ｇｎ８－ｈＦＴＨ＋Ｃａ。
ｔｅｐｉｄｕｍ）。フェリチン軽鎖（ＦＴＬ）。１ｌｂ３，１ｈ９６－ｍＦＴＬ－マウス。１ｒｃｃ，１ｒｃｄ，１ｒｃｉ－ｂＦＴＬ＋タルトレート＋Ｍｇ。１ｒｃｅ，１ｒｃ
ｇ－ｂＦＴＬ＋タルトレート＋Ｍｎ。３ｎｏｚ，３ｎｐ０，３ｎｐ２，３ｏ７ｒ－ｈｏＦＴＬ（変異体）－ウマ。３ｏ７ｓ，３ｕ９０－ｈｏＦＴＬ。４ｖ１ｗ－ｈｏＦＴＬ－ｃｒｙｏ ＥＭ。３ｒａｖ，３ｒｄ０－ｈｏＦＴＬ＋バルビツレート。フェリチン軽鎖＋重鎖：５ｇｎ８－ｈＦＴＨ＋Ｃａ。
【0170】
構造アライメントは、（ｉ）第２の配列の公知の構造を使用して第１の配列の構造をモデリングする工程、または（ｉｉ）両方が公知である第１および第２の配列の構造を比較する工程、ならびに第２の配列における目的の残基に最も類似に位置する第１の配列中の残基を同定する工程によって、２つ（またはそれより多く）のポリペプチド配列を超えて対応する残基を同定する工程を伴う。対応する残基は、重ねた構造におけるアルファ炭素の距離の最小化（例えば、どの組のアルファ炭素対がアライメントに関する最小平均二乗偏差を提供するか）に基づいて一部のアルゴリズムにおいて同定される。Ｈ．ピロリフェリチンに関して記載された位置に対応する非Ｈ．ピロリフェリチンにおける位置を同定する場合、Ｈ．ピロリフェリチンは、「第２の」配列であり得る。目的の非Ｈ．ピロリフェリチンが利用可能な公知の構造を有しないが、公知の構造を有する別の非Ｈ．ピロリフェリチンに、Ｈ．ピロリフェリチンより密接に関連する場合、密接に関連する非Ｈ．ピロリフェリチンの公知の構造を使用して目的の非Ｈ．ピロリフェリチンをモデリングし、次にそのモデルをＨ．ピロリフェリチン構造と比較して、目的のフェリチンにおける所望の対応する残基を同定することが最も有効であり得る。構造モデリングおよびアライメントに関して広範囲の文献が存在し、代表的な開示には、米国特許第６８５９７３６号；米国特許第８７３８３４３号；およびＡｓｌａｍら、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０（２０１６）９～１３頁において引用される開示が挙げられる。公知の関連する構造または複数の構造に基づく構造のモデリングの考察に関して、例えば、Ｂｏｒｄｏｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ４（２００９）１～１３頁、およびその中で引用されている参考文献を参照されたい。
【0171】
４．ルマジンシンターゼ
一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ルマジンシンターゼタンパク質（Ｒａら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓ ３：２２７～２３４頁（２０１４）を参照されたい）を含む。一部の実施形態では、このタンパク質は、ルマジンシンターゼ血清型１、２、３、４、５、６、または７である。例示的なルマジンシンターゼ配列を、配列番号２１６および２１９に提供する。一部の実施形態では、ルマジンシンターゼは、配列番号２１６または２１９と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。ルマジンシンターゼは、高次構造、例えば６０サブユニットのルマジンシンターゼ粒子を形成することができる。例示的なルマジンシンターゼは、アクイフェクス・アエオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）ルマジンシンターゼおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ルマジンシンターゼである。ルマジンシンターゼは、ＯｓｐＡ（例えば、完全長のＯｓｐＡのようなＯｓｐＡエクトドメインを含む配列）のＣ末端に位置することができ、本明細書に記載されるリンカーによってＯｓｐＡから分離することができる。ルマジンシンターゼタンパク質を含む例示的な抗原性ポリペプチドは、配列番号１２～２１である。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、配列番号１２～２１のいずれか１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ルマジンシンターゼタンパク質（Ｒａら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓ ３：２２７～２３４頁（２０１４）を参照されたい）を含む。一部の実施形態では、このタンパク質は、ルマジンシンターゼ血清型１、２、３、４、５、６、または７である。例示的なルマジンシンターゼ配列を、配列番号２１６および２１９に提供する。一部の実施形態では、ルマジンシンターゼは、配列番号２１６または２１９と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。ルマジンシンターゼは、高次構造、例えば６０サブユニットのルマジンシンターゼ粒子を形成することができる。例示的なルマジンシンターゼは、アクイフェクス・アエオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）ルマジンシンターゼおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ルマジンシンターゼである。ルマジンシンターゼは、ＯｓｐＡ（例えば、完全長のＯｓｐＡのようなＯｓｐＡエクトドメインを含む配列）のＣ末端に位置することができ、本明細書に記載されるリンカーによってＯｓｐＡから分離することができる。ルマジンシンターゼタンパク質を含む例示的な抗原性ポリペプチドは、配列番号１２～２１である。一部の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、配列番号１２～２１のいずれか１つと８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
【0172】
５．リンカー
一部の実施形態では、フェリチンまたはルマジンシンターゼは、リンカーを介してＯｓｐＡ（例えば、完全長のＯｓｐＡのようなＯｓｐＡエクトドメインを含む配列）に結合（例えば、融合）される。
一部の実施形態では、フェリチンまたはルマジンシンターゼは、リンカーを介してＯｓｐＡ（例えば、完全長のＯｓｐＡのようなＯｓｐＡエクトドメインを含む配列）に結合（例えば、融合）される。
【0173】
一部の実施形態では、リンカーは、非フェリチンポリペプチド（例えば、ＯｓｐＡ）の
アミノ酸配列をフェリチンのアミノ酸配列から分離する。任意のリンカーを使用してもよい。一部の実施形態では、リンカーは、融合タンパク質としての抗原性フェリチンポリペプチドの発現を容易にすることができるペプチドリンカーである（例えば、単一のオープンリーディングフレーム由来）。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンリンカーである。一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、ＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号２２６）、２ＸＧＧＧＳ（配列番号９１）（すなわち、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９１））、または５ＸＧＧＧＳ（配列番号９２）である。リンカーは、フェリチンに対してＮまたはＣ末端である。
アミノ酸配列をフェリチンのアミノ酸配列から分離する。任意のリンカーを使用してもよい。一部の実施形態では、リンカーは、融合タンパク質としての抗原性フェリチンポリペプチドの発現を容易にすることができるペプチドリンカーである（例えば、単一のオープンリーディングフレーム由来）。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンリンカーである。一部の実施形態では、グリシン－セリンリンカーは、ＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号２２６）、２ＸＧＧＧＳ（配列番号９１）（すなわち、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号９１））、または５ＸＧＧＧＳ（配列番号９２）である。リンカーは、フェリチンに対してＮまたはＣ末端である。
【0174】
一部の実施形態では、リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、約２～４、２～６、２～８、２～１０、２～１２、または２～１４アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも２５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも３０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも３５アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも４０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、６０アミノ酸長未満またはそれに等しい。一部の実施形態では、リンカーは、５０アミノ酸長未満またはそれに等しい。一部の実施形態では、リンカーは、約１６、２８、４０、４６、または４７アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、フレキシブルである。一部の実施形態では、リンカーは、例えば免疫刺激性部分（例えば、アジュバント）のコンジュゲーション部位として使用するためのシステインを含む；システインを含む例示的なリンカーを、配列番号２２５として提供する。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２２５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含み、配列番号２２５中のシステインに対応するシステインをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも２５アミノ酸（例えば、２５～６０アミノ酸）を含み、システインは、Ｎ末端から８番目のアミノ酸からＣ末端から８番目のアミノ酸までの範囲の位置、または中央残基の１０アミノ酸以内の位置、またはリンカーの結合位置に位置する。
【0175】
一部の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）および／またはセリン（Ｓ）アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、および／またはアラニン（Ａ）アミノ酸、ならびに場合により上記のようなシステインを含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号２２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号２２０）、ＧＧＳＧＳＧＳＮＳＳＡＳＳＧＡＳＳＧＧＡＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２２１）、ＧＧＳＧＳＡＳＳＧＡＳＡＳＧＳＳＮＧＳＧＳＧＳＧＳＮＳＳＡＳＳＧＡＳＳＧＧＡＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号２２２）、またはＧＳである。一部の実施形態では、リンカーは、ＦＲ１（配列番号２２３）またはＦＲ２（配列番号２２４）である。
【0176】
一部の実施形態では、フェリチンは、ウシガエルフェリチンのアミノ末端伸長部を有するＨ．ピロリフェリチン（ハイブリッドフェリチンと呼ぶ）を含む。一部の実施形態では、このハイブリッドフェリチンは、表面上に均一に分布した非フェリチンポリペプチド結合部位を有する多量体を形成する（Ｋａｎｅｋｉｙｏ ２０１５を参照されたい）。一部の実施形態では、ハイブリッドフェリチンとのＮ末端融合タンパク質は、フェリチンナノ粒子表面上の非フェリチンポリペプチドの提示を可能にする。一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチドは、ウイルスまたは細菌ポリペプチドである。一部の実施形態では、フェリチンは、配列番号２０８（このグルタメートを含むハイブリッドフェリチン）の１３位、または配列番号２０９（６位がイソロイシンである野生型Ｈ．ピロリフェリチン
）の６位に対応する位置でグルタメートを含む。ウシガエルリンカーと組み合わせて、このグルタメートは、ヒトおよびウシガエルフェリチンにおいて見出される保存された塩架橋を保存すると考えられる（ヒト軽鎖およびウシガエル下部サブユニットフェリチンの両方における６Ｒおよび１４Ｅ）。Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｃｅｌｌ １６２，１０９０～１１００頁（２０１５）を参照されたい。
）の６位に対応する位置でグルタメートを含む。ウシガエルリンカーと組み合わせて、このグルタメートは、ヒトおよびウシガエルフェリチンにおいて見出される保存された塩架橋を保存すると考えられる（ヒト軽鎖およびウシガエル下部サブユニットフェリチンの両方における６Ｒおよび１４Ｅ）。Ｋａｎｅｋｉｙｏら、Ｃｅｌｌ １６２，１０９０～１１００頁（２０１５）を参照されたい。
【0177】
一部の実施形態では、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、システイン－トロンビン－ヒスチジンリンカーを介してフェリチンに連結される。一部の実施形態では、このリンカーを使用して、クリックケミストリーを介してある部分（例えば、免疫刺激性部分または非フェリチンポリペプチド）をフェリチンに直接コンジュゲートする。システイン－トロンビン－ヒスチジンリンカーを含む例示的な配列は、配列番号２１８である。システイン－トロンビン－ヒスチジンリンカーを伴うコンジュゲーション反応にとって適したクリックケミストリーは上記で考察されている。
【0178】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分のためのコンジュゲーション部位としてシステインを含むリンカーは、表面に露出した不対システインを欠如するフェリチン分子を含む構築物において、または表面に露出した不対システインを含むフェリチン分子を含む構築物において使用される。
【0179】
一部の実施形態では、構築物はリンカーを含まない。一部の実施形態では、構築物は、１つのリンカーを含む。一部の実施形態では、構築物は、２つまたは２つより多くのリンカーを含む。
【0180】
６．免疫刺激性部分；アジュバント；コンジュゲートポリペプチド
一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチド（例えば、ＯｓｐＡポリペプチド）および／またはアジュバントのような免疫刺激性部分は、フェリチンまたはリンカーの表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸は、例えば上記で考察した変異に起因するシステインである。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸は、リシン、アスパルテート、またはグルタメートである。グルタルアルデヒド（リシンをアミノ担持リンカーまたは部分にコンジュゲートするため）またはカルボジイミド（例えば、アスパルテートもしくはグルタメートをアミノ担持リンカーもしくは部分にコンジュゲートするための、またはリシンをカルボキシル担持リンカーもしくは部分にコンジュゲートするための、１－シクロヘキシル－３－（２－モルフォリン－４－イル－エチル）カルボジイミド、または１－エチル－３－（３－ジメチル－アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；ＥＤＡＣ））を使用するコンジュゲーション手順は、例えばワールドワイドウェブｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ．から入手可能な、Ｃｈａｐｔｅｒ ４ ｏｆ Ｈｏｌｔｚｈａｕｅｒ，Ｍ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２００６，ＩＳＢＮ ９７８－３－５４０－３２７８５－１に記載されている。
一部の実施形態では、非フェリチンポリペプチド（例えば、ＯｓｐＡポリペプチド）および／またはアジュバントのような免疫刺激性部分は、フェリチンまたはリンカーの表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸は、例えば上記で考察した変異に起因するシステインである。一部の実施形態では、表面に露出したアミノ酸は、リシン、アスパルテート、またはグルタメートである。グルタルアルデヒド（リシンをアミノ担持リンカーまたは部分にコンジュゲートするため）またはカルボジイミド（例えば、アスパルテートもしくはグルタメートをアミノ担持リンカーもしくは部分にコンジュゲートするための、またはリシンをカルボキシル担持リンカーもしくは部分にコンジュゲートするための、１－シクロヘキシル－３－（２－モルフォリン－４－イル－エチル）カルボジイミド、または１－エチル－３－（３－ジメチル－アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；ＥＤＡＣ））を使用するコンジュゲーション手順は、例えばワールドワイドウェブｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ．から入手可能な、Ｃｈａｐｔｅｒ ４ ｏｆ Ｈｏｌｔｚｈａｕｅｒ，Ｍ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２００６，ＩＳＢＮ ９７８－３－５４０－３２７８５－１に記載されている。
【0181】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分は、フェリチンの表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、アジュバントのような１つより多くの免疫刺激性部分が、フェリチンの表面に露出したアミノ酸に結合する。一部の実施形態では、２４個の免疫刺激性部分が、フェリチン多量体または粒子（例えば、Ｈ．ピロリフェリチン粒子における各々の単量体の１つの部分）に結合する。複数の免疫刺激性部分がフェリチンナノ粒子に結合した一部の実施形態では、免疫刺激性部分は全て同一である。複数の免疫刺激性部分がフェリチンナノ粒子に結合した一部の実施形態では、免疫刺激性部分は全て同一ではない。
【0182】
ａ）免疫刺激性部分のタイプ；アジュバント
表面に露出したアミノ酸（例えば、システイン）に結合することができる免疫刺激性部分を、本開示に従ってフェリチン（またはリンカー）において使用することができる。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、Ｂ細胞アゴニストである。
表面に露出したアミノ酸（例えば、システイン）に結合することができる免疫刺激性部分を、本開示に従ってフェリチン（またはリンカー）において使用することができる。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、Ｂ細胞アゴニストである。
【0183】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、疎水性ではない。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は親水性である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、極性である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、水素結合またはイオン結合することが可能であり、例えば水素結合ドナー、水素結合アクセプター、カチオン性部分またはアニオン性部分を含む。部分が、ｐＨ ６、７、７．４、または８のような生理的に関連するｐＨで、水溶液中でイオン化される場合、部分はカチオン性またはアニオン性であると考えられる。
【0184】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、アジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を含む。一部の実施形態では、アジュバントは、ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストまたはインターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストの刺激剤である。一部の実施形態では、アジュバントはＢおよび／またはＴ細胞におけるＴＬＲシグナル伝達を活性化する。一部の実施形態では、アジュバントは、適応免疫応答を調節する。
【0185】
（１）ＴＬＲ２アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ２シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【0186】
一部の実施形態では、ＴＬＲ２アゴニストは、ＰＡＭ２ＣＳＫ４、ＦＳＬ－１、またはＰＡＭ３ＣＳＫ４である。
【0187】
（２）ＴＬＲ７／８アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニスト（すなわち、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の少なくとも１つのアゴニスト）である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニスト（すなわち、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の少なくとも１つのアゴニスト）である。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【0188】
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、イミダゾキノリンである。一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、ヌクレオシドアナログである。
【0189】
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、３Ｍ－０１２（３Ｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のようなイミダゾキノリンアミンＴｏｌｌ－ｌｉｋｅ受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。遊離の３Ｍ－０１２の構造は：
である。３Ｍ－０１２または本明細書で考察する任意の部分のような免疫刺激性部分は、この部分の適切な末端原子（例えば、水素）を、例えば表面に露出したシステインの硫黄での本明細書に記載されるフェリチンとの結合に置換することによって、またはそのような硫黄に結合するリンカーによってフェリチンにコンジュゲートすることができると理解される。このように、フェリチンにコンジュゲートする場合、免疫刺激性部分の構造は、遊離の分子の構造とはわずかに異なる。
【化1】
【0190】
一部の実施形態では、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストは、ＳＭ７／８ａである。遊離のＳＭ７／８ａの構造は：
である。
【化2】
【0191】
例えば、Ｌｙｎｎら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｎｏｖ；３３（１１）：１２０１～１０頁．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３３７１を参照されたい。
【0192】
（３）ＴＬＲ９アゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９アゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９シグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９の合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＴＬＲ９シグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【0193】
一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、非メチル化ＣｐＧ ＯＤＮである。一部の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、通常のＤＮＡにおいて見出される天然のホスホジエステル（ＰＯ）骨格の代わりに、部分的または完全なホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を含む。
【0194】
一部の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、クラスＢ ＯＤＮであり、これは５’プリン（Ｐｕ）－ピリミジン（Ｐｙ）－Ｃ－Ｇ－Ｐｙ－Ｐｕ３’を含む１つまたはそれ以上の６量体ＣｐＧモチーフを含み；十分にホスホロチオエート化された（すなわち、ＰＳ改変された）骨格を有し；１８～２８ヌクレオチド長を有する。一部の実施形態では、ＣｐＧ ＯＤＮは、配列番号２１０の配列を含み、場合により、骨格にホスホロチオエート結合を含む。
【0195】
一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、免疫刺激性配列（ＩＳＳ）を含む。一部の実施形態では、ＴＬＲ９アゴニストは、ＩＳＳ－１０１８（Ｄｙｎａｖａｘ）（配列番号２１０）である。
【0196】
（４）ＳＴＩＮＧアゴニスト
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子タンパク質刺激因子、小胞体ＩＦＮ刺激因子とも呼ばれる）アゴニストである。一部の実施形態
では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧの合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子タンパク質刺激因子、小胞体ＩＦＮ刺激因子とも呼ばれる）アゴニストである。一部の実施形態
では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達を刺激する。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧの合成低分子リガンドである。一部の実施形態では、免疫刺激性部分は、ＳＴＩＮＧシグナル伝達の合成低分子アゴニストである。
【0197】
一部の実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である。例えば、Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａら、Ｃｅｌｌ １５４：９６２～９７０頁（２０１３）を参照されたい。例示的なＣＤＮは、ｃｄＡ、ｃｄＧ、ｃＡＭＰ－ｃＧＭＰ、および２’－５’，３’－５’ｃＧＡＭＰを含む（構造に関しては、Ｄａｎｉｌｃｈａｎｋａらを参照されたい）。ＳＴＩＮＧアゴニストはまた、ＤＭＸＡＡのような合成アゴニストも含む。
【化3】
【0198】
ｂ）コンジュゲートした非フェリチンポリペプチド
一部の実施形態では、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、フェリチンの表面に露出したアミノ酸にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、単独で抗原性であるが、一部の実施形態では、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、フェリチンとのその会合のために抗原性である。
一部の実施形態では、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、フェリチンの表面に露出したアミノ酸にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、単独で抗原性であるが、一部の実施形態では、抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、フェリチンとのその会合のために抗原性である。
【0199】
７．コンジュゲーション
一部の実施形態では、表面に露出したシステインを使用して、アジュバントのような免疫刺激性部分または抗原性ＯｓｐＡポリペプチドをフェリチンにコンジュゲートする。一部の実施形態では、表面に露出したシステインを使用して、リンカーをフェリチンにコンジュゲートし、リンカーを次に、アジュバントのような免疫刺激性部分、または抗原性ＯｓｐＡポリペプチドにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、表面に露出したシステインは、アジュバント、リンカー、または抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを結合させるコンジュゲーション反応のための化学ハンドルを作製する。
一部の実施形態では、表面に露出したシステインを使用して、アジュバントのような免疫刺激性部分または抗原性ＯｓｐＡポリペプチドをフェリチンにコンジュゲートする。一部の実施形態では、表面に露出したシステインを使用して、リンカーをフェリチンにコンジュゲートし、リンカーを次に、アジュバントのような免疫刺激性部分、または抗原性ＯｓｐＡポリペプチドにコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、表面に露出したシステインは、アジュバント、リンカー、または抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを結合させるコンジュゲーション反応のための化学ハンドルを作製する。
【0200】
一部の実施形態では、バイオコンジュゲートが産生され、アジュバントのような免疫刺激性部分、または抗原性ＯｓｐＡポリペプチドが、フェリチンの表面に露出した不対システインの還元後にフェリチンに連結される。表面に露出した不対システインは、ジスルフィド結合を形成するためのパートナーシステインを適切な位置に欠如するシステインである。一部の実施形態では、不対システインは、遊離のチオール側鎖を含む。
【0201】
ａ）コンジュゲーションケミストリーのタイプ
任意のタイプのケミストリーを使用して、例えばシステインまたはＬｙｓ、Ｇｌｕ、もしくはＡｓｐのような別のアミノ酸のような表面に露出したアミノ酸の反応を介して、アジュバントのような免疫刺激性部分または抗原性ＯｓｐＡポリペプチドをフェリチンにコンジュゲートすることができる。
任意のタイプのケミストリーを使用して、例えばシステインまたはＬｙｓ、Ｇｌｕ、もしくはＡｓｐのような別のアミノ酸のような表面に露出したアミノ酸の反応を介して、アジュバントのような免疫刺激性部分または抗原性ＯｓｐＡポリペプチドをフェリチンにコンジュゲートすることができる。
【0202】
一部の実施形態では、コンジュゲーションは、クリックケミストリーを使用して実施さ
れる。本明細書で使用される場合、「クリックケミストリー」は、互いに急速かつ選択的に反応する（すなわち、「クリックする」）１対の官能基間での反応を指す。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、緩和な水性条件下で実施することができる。一部の実施形態では、クリックケミストリー反応は、表面に露出したアミノ酸の変異に起因するシステインのようなフェリチンの表面上のシステインを利用し、システインと反応することができる官能基を使用してクリックケミストリーを実施する。
れる。本明細書で使用される場合、「クリックケミストリー」は、互いに急速かつ選択的に反応する（すなわち、「クリックする」）１対の官能基間での反応を指す。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、緩和な水性条件下で実施することができる。一部の実施形態では、クリックケミストリー反応は、表面に露出したアミノ酸の変異に起因するシステインのようなフェリチンの表面上のシステインを利用し、システインと反応することができる官能基を使用してクリックケミストリーを実施する。
【0203】
クリックケミストリーの基準を満たす多様な反応が、当技術分野で公知であり、当業者は、複数の公表された方法論のいずれかを使用することができる（例えば、Ｈｅｉｎら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２５（１０）：２２１６～２２３０頁（２００８）を参照されたい）。クリックケミストリーに関してＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、またはＬｕｍｉｐｒｏｂｅの試薬のような広範囲の市販の試薬を使用することができる。一部の実施形態では、コンジュゲーションは、以下の実施例に記載されるようにクリックケミストリーを使用して実施される。
【0204】
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、フェリチンの還元後に起こる。
【0205】
一部の実施形態では、クリックケミストリーは、１ステップクリック反応であり得る。一部の実施形態では、クリックケミストリーは、２ステップクリック反応であり得る。
【0206】
一部の実施形態では、反応は、金属フリーのクリックケミストリーを含む。一部の実施形態では、反応は、チオール－マレイミドおよび／またはジスルフィド交換を含む。
【0207】
金属フリークリックケミストリー
金属フリークリックケミストリーは、タンパク質の起こり得る酸化を回避するためにコンジュゲーション反応に関して使用することができる。金属フリークリックケミストリーは、抗体コンジュゲートを形成するために使用されている（ｖａｎ Ｇｅｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，２２３３～２２４２頁を参照されたい）。
金属フリークリックケミストリーは、タンパク質の起こり得る酸化を回避するためにコンジュゲーション反応に関して使用することができる。金属フリークリックケミストリーは、抗体コンジュゲートを形成するために使用されている（ｖａｎ Ｇｅｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，２２３３～２２４２頁を参照されたい）。
【0208】
一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、アジュバントをフェリチンに結合させる反応において使用される。一部の実施形態では、アジュバントをフェリチンに結合させる反応において銅フリーコンジュゲーションを使用する。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）を使用する。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、ジベンゾアザシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を使用する。一部の実施形態では、ＢＣＮまたはＤＢＣＯは、アジド基と反応する。
【0209】
ＤＢＣＯは、触媒の非存在下での歪み促進型クリック反応を介してアジド基に対して高い特異性を有し、高収率の安定なトリアゾールをもたらす。一部の実施形態では、ＤＢＣＯは、銅触媒の非存在下でアジドと反応する。
【0210】
一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、１ステップクリック反応において使用される。一部の実施形態では、金属フリークリックケミストリーは、２ステップクリック反応において使用される。
【0211】
チオール－マレイミドおよびジスルフィド交換
本明細書で使用されるフェリチンは、スルフヒドリルとしても知られるチオールを含むシステインを含むことができ、これはスルフヒドリル反応性化学基との反応に関して利用可能である（または還元を通して利用可能となり得る）。このように、システインは、ア
ジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンに付加するための化学選択的改変を可能にする。塩基性条件下では、システインは、脱プロトン化されて、チオレート求核試薬を生成し、これはマレイミドおよびヨードアセトアミドのような弱い求電子試薬と反応することができる。システインとマレイミドまたはヨードアセトアミドとの反応は、炭素－硫黄結合をもたらす。
本明細書で使用されるフェリチンは、スルフヒドリルとしても知られるチオールを含むシステインを含むことができ、これはスルフヒドリル反応性化学基との反応に関して利用可能である（または還元を通して利用可能となり得る）。このように、システインは、ア
ジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンに付加するための化学選択的改変を可能にする。塩基性条件下では、システインは、脱プロトン化されて、チオレート求核試薬を生成し、これはマレイミドおよびヨードアセトアミドのような弱い求電子試薬と反応することができる。システインとマレイミドまたはヨードアセトアミドとの反応は、炭素－硫黄結合をもたらす。
【0212】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、表面に露出したシステインまたはフェリチンのリンカー中のシステインと反応する。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、またはＴＮＢ－チオールである。
【0213】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、アルキル化によってシステインのスルフヒドリルにコンジュゲートする（すなわち、チオエーテル結合の形成）。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ジスルフィド交換によってシステインのスルフヒドリルにコンジュゲートする（すなわち、ジスルフィド結合の形成）。
【0214】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンにコンジュゲートする反応は、チオール－マレイミド反応である。
【0215】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、マレイミドである。一部の実施形態では、マレイミドとシステインとの反応は、例えば可逆的ではない安定なチオエステル結合の形成をもたらす。一部の実施形態では、マレイミドは、フェリチン中のチロシン、ヒスチジン、またはメチオニンとは反応しない。一部の実施形態では、非反応マレイミドは、遊離のチオールを例えば過剰に添加することによって、反応終了時にクエンチされる。
【0216】
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分をフェリチンにコンジュゲートする反応は、ジスルフィド相互交換としても知られるチオール－ジスルフィド交換である。一部の実施形態では、反応は、当初のジスルフィドの一部を含む混合ジスルフィドの形成を伴う。一部の実施形態では、当初のジスルフィドは、表面に露出したアミノ酸の変異またはＮ末端リンカーの付加によってフェリチンに導入されたシステインである。
【0217】
一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ピリジルジチオールである。一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基は、ＴＮＢ－チオール基である。
【0218】
ｂ）リンカー
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分、または抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、システインのような表面に露出したアミノ酸に共有結合したリンカーを介してフェリチンに結合する。一部の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧリンカーを含む。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ）リンカーは、アジュバントのような免疫刺激性部分に連結したフェリチンの水溶性およびライゲーション効率を増加させる。ＰＥＧリンカーは、２～１８ＰＥＧ長の間、例えば、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、およびＰＥＧ１８である。
一部の実施形態では、アジュバントのような免疫刺激性部分、または抗原性ＯｓｐＡポリペプチドは、システインのような表面に露出したアミノ酸に共有結合したリンカーを介してフェリチンに結合する。一部の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧリンカーを含む。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ）リンカーは、アジュバントのような免疫刺激性部分に連結したフェリチンの水溶性およびライゲーション効率を増加させる。ＰＥＧリンカーは、２～１８ＰＥＧ長の間、例えば、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、ＰＥＧ１０、ＰＥＧ１１、ＰＥＧ１２、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ１４、ＰＥＧ１５、ＰＥＧ１６、ＰＥＧ１７、およびＰＥＧ１８である。
【0219】
一部の実施形態では、リンカーは、マレイミドを含む。一部の実施形態では、リンカーは、免疫刺激性部分（ＩＳＭ）－リンカー－マレイミドの構成要素を含む。一部の実施形態では、ＩＳＭ－リンカー－マレイミドは、マレイミドとフェリチンのシステインとの反応によって１ステップクリックケミストリーにおいてフェリチンにコンジュゲートされる
。一部の実施形態では、アジュバント－リンカー－マレイミドのＩＳＭは、ＳＭ７／８ａである。一部の実施形態では、ＩＳＭ－リンカー－マレイミドのリンカーはＰＥＧ４である。一部の実施形態では、ＩＳＭ－リンカー－マレイミドは、ＳＭ７／８ａ－ＰＥＧ４－マレイミドである。
。一部の実施形態では、アジュバント－リンカー－マレイミドのＩＳＭは、ＳＭ７／８ａである。一部の実施形態では、ＩＳＭ－リンカー－マレイミドのリンカーはＰＥＧ４である。一部の実施形態では、ＩＳＭ－リンカー－マレイミドは、ＳＭ７／８ａ－ＰＥＧ４－マレイミドである。
【0220】
一部の実施形態では、２ステップクリックケミストリープロトコルを、１つの末端でスルフヒドリル反応性化学基および他方の末端でアミン反応基を含むリンカーと共に使用する。そのような２ステップクリックケミストリープロトコルでは、スルフヒドリル反応性化学基は、フェリチンのシステインと反応するが、アミン反応基はＩＳＭに結合した試薬と反応する。このようにして、ＩＳＭは、１組の２クリックケミストリー試薬の組を介してフェリチンにコンジュゲートされる。
【0221】
２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、スルフヒドリル反応性化学基はマレイミドである。２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、マレイミドは、表面に露出したアミノ酸の変異またはＮ末端リンカーの付加によってフェリチンに導入されたシステインと反応する。
【0222】
２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、アミン反応基はＤＢＣＯである。２ステップクリックケミストリープロトコルの一部の実施形態では、ＤＢＣＯは、ＩＳＭに結合したアジド基と反応する。
【0223】
一部の実施形態では、マレイミド－リンカー－ＤＢＣＯを使用する。一部の実施形態では、マレイミド－リンカー－ＤＢＣＯは、フェリチンの還元後、フェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、マレイミド－リンカー－試薬は、第１のステップでマレイミドとフェリチンのシステインとの反応によってフェリチンにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＤＢＣＯを使用してアジドに結合したＩＳＭに連結する。一部の実施形態では、アジドに連結したＩＳＭは、ＩＳＳ－１０１８である。一部の実施形態では、アジドにカップリングしたアジュバントは、３Ｍ－０１２またはＣｐＧである。
【0224】
一部の実施形態では、反応基を有するリンカーをＩＳＭに付加する。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧ４－アジドリンカー、またはＰＥＧ４－マレイミドリンカーである。
【0225】
一部の実施形態では、ＰＥＧ４－アジドリンカーは、３Ｍ－０１２にコンジュゲートされる。ＰＥＧ４－アジドリンカーにコンジュゲートされた３Ｍ－０１２の例示的な構造は：
である。
【化4】
【0226】
一部の実施形態では、ＰＥＧ４－アジドリンカーは、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされる。ＰＥＧ４－アジドリンカーにコンジュゲートされたＳＭ７／８ａの例示的な構造は：
である。
【化5】
【0227】
一部の実施形態では、ＰＥＧ４－マレイミドリンカーは、ＳＭ７／８ａにコンジュゲートされる。ＰＥＧ４－マレイミドリンカーにコンジュゲートされたＳＭ７／８ａの例示的な構造は：
である。
【化6】
【0228】
一部の実施形態では、アジド基は、ＩＳＳ－１０１８にコンジュゲートされる。ＮＨＳエステル－アジドリンカーにコンジュゲートされたＩＳＳ－１０１８の例示的な構造は：
である。
【化7】
【0229】
Ｄ．例示的な組成物、キット、核酸、使用、および方法
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドおよび薬学的に許容される媒剤、アジュバント、賦形剤のうちのいずれか１つもしくはそれ以上を含む組成物が提供される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドおよび薬学的に許容される媒剤、アジュバント、賦形剤のうちのいずれか１つもしくはそれ以上を含む組成物が提供される。
【0230】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物は、ボレリアによって引き起こされる感染症、例えばライム病に対して免疫するために、ヒトのような対象に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドは、ボレリアによる将来の感染に対する保護的免疫応答を産生するために、ヒトのような対象に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される改変ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含むポリペプチドが投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＯｓｐＡおよびフェリチンを含む抗原性ポリペプチドが投与される。
【0231】
一部の実施形態では、保護的免疫応答は、入院の発生率を減少させる。一部の実施形態では、組成物がボレリアポリペプチドを含む場合、保護的免疫応答は、関節の炎症、神経学的症状、認知障害、または心リズム不規則を含む急性または慢性ライム病の発生率を減少させる。
【0232】
一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型２ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型３ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型６ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型７ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、１つのみのＯｓｐＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型１、２、３、４、５、６、および７の１つまたはそれ以上を含む。
【0233】
一部の実施形態では、組成物は、例えば１つより多くのＯｓｐＡ血清型に由来する１つより多くのＯｓｐＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、そのような組成物は、ボレリアの複数のタイプ、例えば血清型１～７の１、２、３、４、５、６、または７つに対するワクチン接種を可能にする。ＯｓｐＡの血清型は、ボレリアの遺伝子種に関連することから（Ｗｉｌｓｋｅ １９９３を参照されたい）、複数の血清型のＯｓｐＡを含むそのような組成物によるワクチン接種は、ライム病を引き起こし得る広範囲の細菌に対する免疫を産生し得る。
【0234】
一部の実施形態では、複数の血清型のＯｓｐＡを含む組成物は、異なるＯｓｐＡ血清型
を発現するボレリアに対する免疫を産生する。例えば、実施例に考察されているように、血清型１～５および７のＯｓｐＡポリペプチドを含む組成物が、ＯｓｐＡ血清型６を認識する抗体を誘発することができることが観察されている。一部の実施形態では、そのような組成物は、ボレリアの複数の遺伝子種に対する免疫を生じる。
を発現するボレリアに対する免疫を産生する。例えば、実施例に考察されているように、血清型１～５および７のＯｓｐＡポリペプチドを含む組成物が、ＯｓｐＡ血清型６を認識する抗体を誘発することができることが観察されている。一部の実施形態では、そのような組成物は、ボレリアの複数の遺伝子種に対する免疫を生じる。
【0235】
一部の実施形態では、組成物は、２つの異なるＯｓｐＡ血清型を含む。一部の実施形態では、多価組成物は、３つの異なるＯｓｐＡ血清型を含む。一部の実施形態では、多価組成物は、４つの異なるＯｓｐＡ血清型を含む。一部の実施形態では、多価組成物は、５つの異なるＯｓｐＡ血清型を含む。一部の実施形態では、多価組成物は、６つの異なるＯｓｐＡ血清型を含む。一部の実施形態では、多価組成物は、７つの異なるＯｓｐＡ血清型を含む。
【0236】
一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型１およびＯｓｐＡ血清型２～７の任意の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型２、ならびにＯｓｐＡ血清型１および３～７の任意の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型３、ならびにＯｓｐＡ血清型１～２および４～７の任意の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型４、ならびにＯｓｐＡ血清型１～３および５～７の任意の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型５、ならびにＯｓｐＡ血清型１～４および６～７の任意の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型６、ならびにＯｓｐＡ血清型１～５および７の任意の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＯｓｐＡ血清型７、ならびにＯｓｐＡ血清型１～６の任意の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物は、血清型１～５および７のＯｓｐＡポリペプチドの少なくとも２、３、４、５、または６つを含む。
【0237】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物の任意の１つまたはそれ以上は、ボレリアによって引き起こされる感染症、例えばライム病に対する免疫に使用するために提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物の任意の１つまたはそれ以上は、ボレリアによる将来の感染症に対する保護的免疫応答の産生に使用するために提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物の任意の１つまたはそれ以上は、霊長類（例えば、サル（例えば、アカゲザルまたはカニクイザルのようなマカク）または類人猿のような非ヒト霊長類）、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、または家畜哺乳動物（例えば、イヌ、ウサギ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ラクダ、またはロバ）のような哺乳動物において使用するためである。
【0238】
１．アジュバント
アジュバントは、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドと共に対象に投与してもよく、そのような投与は、アジュバントなしでのＯｓｐＡの投与と比較して、対象においてＯｓｐＡに対するより高力価の抗体を生じる。アジュバントは、抗原性ポリペプチドに対するより早期の、より強力な、またはより持続性の免疫応答を促進し得る。
アジュバントは、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドと共に対象に投与してもよく、そのような投与は、アジュバントなしでのＯｓｐＡの投与と比較して、対象においてＯｓｐＡに対するより高力価の抗体を生じる。アジュバントは、抗原性ポリペプチドに対するより早期の、より強力な、またはより持続性の免疫応答を促進し得る。
【0239】
一部の実施形態では、組成物は、１つのアジュバントを含む。一部の実施形態では、組成物は１つより多くのアジュバントを含む。一部の実施形態では、組成物は、アジュバントを含まない。
【0240】
一部の実施形態では、アジュバントはアルミニウムを含む。一部の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。一部の実施形態では、アジュバントはミョウバン（Ａｌｙｈｙｄｒｏｇｅｌ’８５ ２％；Ｂｒｅｎｎｔａｇ－カタログ番号２１６４５－５１－２）である。
【0241】
一部の実施形態では、アジュバントは有機アジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは油基剤のアジュバントである。一部の実施形態では、アジュバントは水中油型ナノ乳剤を含む。
【0242】
一部の実施形態では、アジュバントはスクワレンを含む。一部の実施形態では、スクワレンを含むアジュバントは、Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａアジュバントシステムカタログ番号Ｓ６３２２－１ｖｌ）、Ａｄｄａｖａｘ（商標）（スクワレン基剤の水中油型ナノ乳剤）、ＭＦ５９、ＡＳ０３、またはＡＦ０３（米国特許第９７０３０９５号を参照されたい）である。一部の実施形態では、スクワレンを含むアジュバントは、ナノ乳剤である。
【0243】
一部の実施形態では、アジュバントは、ポリアクリル酸ポリマー（ＰＡＡ）を含む。一部の実施形態では、ＰＡＡを含むアジュバントはＳＰＡ０９である（ＷＯ２０１７２１８８１９を参照されたい）。
【0244】
一部の実施形態では、アジュバントは非代謝性油を含む。一部の実施形態では、アジュバントは、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む。
【0245】
一部の実施形態では、アジュバントは、非代謝性油および結核死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む。一部の実施形態では、アジュバントはフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）である。
【0246】
一部の実施形態では、アジュバントは、リポ多糖類である。一部の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルＡ（ＭＰＬまたはＭＰＬＡ）である。
【0247】
２．対象
一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
【0248】
一部の実施形態では、対象は成人（年齢１８歳より上または１８歳に等しい）である。一部の実施形態では、対象は小児または青年（年齢１８歳未満）である。一部の実施形態では、対象は高齢者（年齢６０歳より上）である。一部の実施形態では、対象は、非高齢成人（年齢１８歳より上またはそれに等しく、年齢６０歳未満またはそれに等しい）である。
【0249】
一部の実施形態では、組成物の１回より多くの投与を対象に投与する。一部の実施形態では、ブースター投与は免疫応答を改善する。
【0250】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドまたは組成物の１つまたはそれ以上は、霊長類（例えば、サル（例えば、アカゲザルまたはカニクイザルのようなマカク）または類人猿のような非ヒト霊長類）、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、または家畜哺乳動物（例えば、イヌ、ウサギ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ラクダ、またはロバ）のような哺乳動物において使用するためである。
【0251】
一部の実施形態では、組成物は、意図される投与経路のために適切に製剤化される。適した投与経路の例は、筋肉内、経皮、皮下、鼻腔内、経口、または経皮を含む。
【0252】
一部の実施形態では、組成物の１回より多くの投与を対象に投与する。一部の実施形態では、ブースター投与は免疫応答を改善する。
【0253】
３．医薬組成物
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドおよび／または関連する実体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、ボレリアに対して保護的免疫応答のような免疫応答を誘発することが可能な免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドおよび／または関連する実体を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、ボレリアに対して保護的免疫応答のような免疫応答を誘発することが可能な免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。
【0254】
例えば、一部の実施形態では、医薬組成物は、以下の１つまたはそれ以上を含み得る：（１）（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異、および（ｉｉ）抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質；（２）（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異、およびシステインに連結した免疫刺激性部分；ならびに（ｉｉ）抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質；（３）（ｉ）表面に露出したシステイン、（ｉｉ）フェリチンタンパク質に対してＮ末端のペプチドリンカー；および（ｉｉｉ）ペプチドリンカーに対してＮ末端の抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質；（４）（ｉ）表面に露出したアミノ酸をシステインに置き換える変異、およびシステインに連結した免疫刺激性部分、（ｉｉ）Ｈ．ピロリフェリチンの３１位の内部システイン、またはペアワイズもしくは構造アライメントによって同定される、非Ｈ．ピロリフェリチンの３１位と類似の位置の内部システインを非システインアミノ酸に置き換える変異；（ｉｉｉ）表面に露出したアスパラギンを非アスパラギンアミノ酸に置き換える変異、ならびに（ｉｖ）抗原性ＯｓｐＡポリペプチドを含む抗原性フェリチンタンパク質；または（５）前述のフェリチンタンパク質を含むフェリチン粒子。
【0255】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドに関連する抗体または他の作用物質を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドに結合するおよび／またはそれと競合する抗体を含む。あるいは、抗体は、本明細書に記載される抗原性ポリペプチドの非フェリチンポリペプチド構成要素を含むウイルス粒子または細菌を認識し得る。
【0256】
一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、単独で、または免疫応答を増強するための１つもしくはそれ以上の作用物質、例えば本明細書に記載されるアジュバントと組み合わせて投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、上記のアジュバントをさらに含む。
【0257】
一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「担体」は、それと共に医薬組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。例示的な実施形態では、担体は、滅菌液体、例えば水、および石油、動物、植物、または合成起源の油を含む油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等を含み得る。一部の実施形態では、担体は、１つまたはそれ以上の固体構成要素であるか、またはそれらを含む。薬学的に許容される担体はまた、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびその組合せを含み得るがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、賦形剤は、例えば所望のコンシステンシーまたは安定化効果を提供するまたはそれに関与するように医薬組成物に含めることができる任意の非治療剤である。適した薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含むがこれらに限定されない。様々な実施形態では、医薬組成物は無菌的である。
【0258】
一部の実施形態では、医薬組成物は、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、安定化剤、緩衝剤、または保存剤のよ
うな任意の多様な添加剤を含み得る。加えて、補助剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤、および着色剤を含めることができる。
うな任意の多様な添加剤を含み得る。加えて、補助剤、安定化剤、濃化剤、潤滑剤、および着色剤を含めることができる。
【0259】
様々な実施形態では、医薬組成物は、任意の所望の投与様式に適合するように製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、滴剤、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体を含有するカプセル、ゼラチンカプセル、散剤、徐放性製剤、坐剤、乳剤、エアロゾル、噴霧剤、懸濁剤、凍結乾燥粉末、凍結懸濁液、乾燥粉末の形態、または使用するために適した他の任意の形態をとることができる。薬剤の製剤化および製造における一般的検討は、例えば参照によって本明細書に組み入れられる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９th ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に見出すことができる。
【0260】
医薬組成物は、任意の投与経路を介して投与することができる。投与経路は、例えば経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、粘膜、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸内、気管内点滴、気管支点滴、吸入、または局所投与経路を含む。投与は局所または全身であり得る。一部の実施形態では、投与は経口で実施される。別の実施形態では、投与は非経口注射による。一部の例では、投与は、本明細書に記載される抗原性フェリチンポリペプチドの血流への放出をもたらす。投与様式は、医師の裁量に委ねることができる。
【0261】
一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、および皮下）にとって適している。そのような組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤等として製剤化することができる。それらは、使用直前に滅菌注射可能媒体に溶解または懸濁することができる滅菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造してもよい。例えば、非経口投与は注射によって達成することができる。そのような実施形態では、注射剤は、通常の形態、すなわち液体溶液または懸濁液、注射前に液体中の溶液または懸濁液にとって適した固体形態、または乳剤として調製される。一部の実施形態では、注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、凍結乾燥粉末、または顆粒から調製される。
【0262】
さらなる実施形態では、医薬組成物は、吸入（例えば、肺および呼吸器への直接送達）による送達のために製剤化される。例えば、組成物は、点鼻用噴霧剤または他の任意の公知のエアロゾル製剤の形態をとり得る。一部の実施形態では、吸入用またはエアロゾル送達のための調製物は、複数の粒子を含む。一部の実施形態では、そのような調製物は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、または約１３ミクロンの平均粒子サイズを有し得る。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、乾燥粉末として製剤化される。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、例えば湿潤剤を含めることを通して湿潤粉末として製剤化される。一部の実施形態では、湿潤剤は、水、食塩水、または生理的ｐＨの他の液体からなる群から選択される。
【0263】
一部の実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、鼻または口腔への滴剤として投与される。一部の実施形態では、用量は、複数の液滴（例えば、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１～５滴等）を含み得る。
【0264】
本発明の医薬組成物は、所望の転帰を達成するために適切な任意の用量で投与することができる。一部の実施形態では、所望の転帰は、組成物に存在する抗原性フェリチンポリペプチドに存在する非フェリチンポリペプチドの起源のような病原体に対する長期間持続する適応免疫応答の誘導である。一部の実施形態では、所望の転帰は、感染症の１つまたはそれ以上の症状の強度、重症度、頻度の低減、および／または発生の遅延である。一部
の実施形態では、所望の転帰は、感染症の阻害または予防である。必要な用量は、対象の種、年齢、体重、および全身状態、予防または処置される感染の重症度、使用される特定の組成物、およびその投与様式に応じて対象毎に変化する。
の実施形態では、所望の転帰は、感染症の阻害または予防である。必要な用量は、対象の種、年齢、体重、および全身状態、予防または処置される感染の重症度、使用される特定の組成物、およびその投与様式に応じて対象毎に変化する。
【0265】
一部の実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、単回または複数回用量で投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、異なる日に投与される複数回用量で投与される（例えば、プライム－ブーストワクチン接種戦略）一部の実施形態では、医薬組成物は、ブースターレジメンの一部として投与される。
【0266】
様々な実施形態では、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の追加の治療剤と同時投与される。同時投与は、それらの投与時期が、追加の治療剤および医薬組成物中の活性成分の薬理活性が時間的に重複し、それによって組み合わせた治療効果を発揮する場合には、治療剤を同時に投与する必要はない。一般的に、各々の作用物質は、その作用物質に関して決定された用量および時間スケジュールで投与される。
【0267】
４．核酸／ＲＮＡ
同様に、本明細書に記載される抗原性ＯｓｐＡポリペプチドをコードする核酸も提供される。一部の実施形態では、核酸はｍＲＮＡである。ポリペプチドをもたらす翻訳を受けることが可能な任意の核酸は、本開示の目的に関してｍＲＮＡであると考えられる。
同様に、本明細書に記載される抗原性ＯｓｐＡポリペプチドをコードする核酸も提供される。一部の実施形態では、核酸はｍＲＮＡである。ポリペプチドをもたらす翻訳を受けることが可能な任意の核酸は、本開示の目的に関してｍＲＮＡであると考えられる。
【0268】
５．キット
同様に本明細書において、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の抗原性ポリペプチド、核酸、抗原性フェリチン粒子、抗原性ルマジンシンターゼ粒子、組成物、または医薬組成物を含むキットも提供される。一部の実施形態では、キットは、溶媒、溶液、緩衝剤、説明書、または乾燥剤の１つまたはそれ以上をさらに含む。
同様に本明細書において、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の抗原性ポリペプチド、核酸、抗原性フェリチン粒子、抗原性ルマジンシンターゼ粒子、組成物、または医薬組成物を含むキットも提供される。一部の実施形態では、キットは、溶媒、溶液、緩衝剤、説明書、または乾燥剤の１つまたはそれ以上をさらに含む。
【0269】
本説明および例示的な実施形態は、制限すると解釈すべきではない。本明細書および添付の特許請求の目的に関して、特に示していない限り、量、パーセンテージ、または割合を表記する全ての数値、ならびに本明細書および特許請求の範囲で使用される他の数値は、全ての例において、既にそのように修飾されていない程度に、用語「約」によって修飾されると理解される。「約」は、記載される主題の特性に実質的に影響を及ぼさない変動の程度、例えば１０％、５％、２％、または１％以内の変動を示す。したがって、逆を示していない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲で記載される数値パラメータは、得ることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、および特許請求の範囲と均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各々の数値パラメータは、報告された有効数字を検討する、および通常の四捨五入技術を適用することによると少なくとも解釈すべきである。
【0270】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」、ならびに他の用語の任意の単数形での使用は、１つの指示対象に明白かつ明確に限定されていない限り、複数の指示対象を含むことに注意されたい。本明細書に使用される場合、用語「含む」およびその文法的変形形態は、非制限的であると意図され、リストにおける項目の引用は、列挙される項目に置換または追加することができる他の類似の項目の除外ではない。用語「または」は、包括的な意味で使用され、すなわち本文がそれ以外であることを示していない限り、「および／または」と等価である。
【0271】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【表16】
【表17】
【表18】
【表19】
【表20】
【表21】
【表22】
【表23】
【実施例0272】
以下の実施例は開示した特定の実施形態を説明するために提供され、本開示の範囲を限定するものとは決して解釈すべきでない。
【0273】
１．ＯｓｐＡ－フェリチン抗原性ポリペプチドの調製
ＯｓｐＡおよびフェリチンを含む抗原性ポリペプチドを産生した。
ＯｓｐＡおよびフェリチンを含む抗原性ポリペプチドを産生した。
【0274】
ＯｓｐＡは、下の配列：ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株Ｂ３１（血清型１）ＮＢＣＩ配列ＩＤ ＷＰ＿０１０８９０３７８．１、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ）株ＰＫＯ（血清型２）ＮＣＢＩ配列：ＷＰ＿０１１７０３７７７．１、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒ（血清型３）ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ５６５４９．１、ボレリア・ババリエンシス（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）（血清型４）ＮＣＢＩ配列ＷＰ＿０１１１８７１５７．１、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）（血清型５）ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ５９７２７．１、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）（血清型６）ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ４５０１０．１、およびボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）（血清型７）ＧｅｎＢａｎｋ
ＣＡＡ５６５４７．１からＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔによって合成した。Ｎ末端ウシガエルフェリチン配列を挿入したＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）フェリチンはＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔによって合成した。その中でウシガエルフェリチン配列は以前の研究のものと同様である（Ｋａｎｅｋｉｙｏ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ １６２（５）：１０９０～１００頁（２０１５）を参照）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＨｉｓタグ付けＯｓｐＡおよびＯｓｐＡ－フェリチンのナノ粒子を発現させるために、ｐｅｔ２１ａベクターを用いた。Ｅｘｐｉ２９３細胞中で発現させるために、以前用いたものと同様の哺乳動物発現ベクターを用いた（Ｘｕ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８（６３５９）：８５～９０頁（２０１７）を参照）。
ＣＡＡ５６５４７．１からＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔによって合成した。Ｎ末端ウシガエルフェリチン配列を挿入したＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）フェリチンはＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔによって合成した。その中でウシガエルフェリチン配列は以前の研究のものと同様である（Ｋａｎｅｋｉｙｏ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ １６２（５）：１０９０～１００頁（２０１５）を参照）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＨｉｓタグ付けＯｓｐＡおよびＯｓｐＡ－フェリチンのナノ粒子を発現させるために、ｐｅｔ２１ａベクターを用いた。Ｅｘｐｉ２９３細胞中で発現させるために、以前用いたものと同様の哺乳動物発現ベクターを用いた（Ｘｕ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８（６３５９）：８５～９０頁（２０１７）を参照）。
【0275】
ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子は、ＯｓｐＡのエクトドメインをフェリチンのアミノ末端に遺伝子的に融合させて抗原性ポリペプチドを産生させることによって創成した（図１Ａ）。ＯｓｐＡは、ただ１つのカルボキシ末端αヘリックスを有する２１個の連続したアンチパラレルβストランドから作られた、延長されたβシート構造を有する３１ｋＤａのリポタンパク質である（図１Ｂ）（Ｋｉｔａｈａｒａ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ １０２（４）：９１６～２６頁（２０１２）を参照）。ＯｓｐＡのカルボキシ末端はまた、著しく大きな空洞（約２００Å）を有し、これがグリシン－セリン配列を用いるフェリチンへの連結に適合する部位に相当する（図１Ｂ）。フェリチンの２４個のサブユニットは自発的に集合して、中空の球状ナノ粒子を形成する（図１Ｃ）。本研究で用いたフェリチンはヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）のフェリチンに融合したウシガエルフェリチンのアミノ末端配列を含み、ヒトフェリチンとの関連が最小のキメラを創成している（Ｋａｎｅｋｉｙｏ、２０１５を参照）。アミノ末端ウシガエルフェリチン配列はナノ粒子のコアから半径方向に突出しており（Ｔｒｉｋｈａ，Ｊ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８（５）：９４９～６７頁（１９９５）を参照）、ナノ粒子の表面上におけるＯｓｐＡの均一な提示を容易にしている。
【0276】
フェリチンの機能性を改善するために、フェリチンの構造に３つの追加的な変更、すなわちＮ１９Ｑ、Ｃ３１Ｓ、およびＳ１１１Ｃを行った。Ｎ１９Ｑの置換によってアミノ末端のグリコシル化の可能性のある部位を除去した。Ｓ１１１Ｃの置換によって、フェリチンの表面に露出したシステインが導入され、これは例えばクリックケミストリーによってアジュバントをコンジュゲートするために用いることができる。最後に、コンジュゲーションによってただ１つのシステインが修飾されるように、システイン３１をセリンに改変した。ナノ粒子の表面上のＯｓｐＡの呈示は、２４量体の抗原性ナノ粒子を提供する（図
１Ｄ）。
１Ｄ）。
【0277】
大腸菌からの精製のため、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ＃Ｃ６０１００３）を用いた。１００μＭのＩＰＴＧと終夜、１６℃でタンパク質を誘起した。Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８、５０ｍＭ ＮａＣｌ中での超音波処理を用いて、細胞ペレットを溶解した。濾過滅菌した上清をアニオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ、ＧＥ社）でフロースルーからＯｓｐＡ－フェリチンを採取することによって精製した。次いで１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４抽出を６回繰り返すことによって、エンドトキシンを除去した。次いでＡｍｉｃｏｎ １００ＭＷカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｃａｔ＃ＵＦＣ９１００９６）を用いて水相を濃縮し、次いでＳｕｐｅｒｏｓｅ６調製用ＳＥＣカラム １２０ｍｌにて４℃でナノ粒子をさらに精製した。哺乳動物細胞の培養からの精製については、ＦｅｃｔｏＰＲＯトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社、Ｃａｔ＃１１６－１００）を用い、メーカーの指示書に従ってＥｘｐｉ２９３細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を５日目に培養し、上清を採取して濾過した。エンドトキシンフリーの試薬およびガラス器具を用い、エンドトキシンフリーのプロトコルに従った。５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７、５０ｍＭのＮａＣｌを用いてＱセファロースファストフロービーズ（ＧＥ社、Ｃａｔ＃１７－０５１０－０１）を調製し、濾過滅菌した上清に重力流で添加した。フロースルーを採取し、Ａｍｉｃｏｎ １００ＭＷカットオフフィルターを用いて４ｍｌに濃縮した。次いでＳｕｐｅｒｏｓｅ６調製用ＳＥＣカラム １２０ｍｌにて室温でナノ粒子をさらに精製した。
【0278】
Ｈｉｓ6タグ付けした（配列番号２２７）ＯｓｐＡの精製のため、血清型１、４、５、
および７のＯｓｐＡを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ＃Ｃ６００００３）から精製し、血清型２および３をＥｘｐｉ２９３細胞から精製した。これらの構築物は膜貫通ドメインを欠き、Ｃ末端Ｈｉｓ6タグ（配列番号２２７）を含み、そ
れ以外は野生型であった。大腸菌の精製については、５００μＭのＩＰＴＧで５時間、タンパク質を誘起し、細胞をペレット化して－２０℃で凍結した。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ＃１１６９７４９８００１）を含むＴＢＳ緩衝液中１％ Ｔｒｉｔｏｎにペレットを再懸濁し、超音波処理によって細胞を溶解した。上清を濾過滅菌した。哺乳動物細胞の培養については、トランスフェクションの５日後に上清を採取し、濾過滅菌した。上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣに取り付けたＧＥ社のＨｉＴｒａｐ ＨＰ ５ｍｌカラム（Ｃａｔ＃１７－５２４８－０２）に流した。ＴＢＳ中２０ｍＭのイミダゾールでカラムを洗浄し、負荷し、再び洗浄した。ＴＢＳ中２５０ｍＭのイミダゾールで最終のタンパク質を溶出させた。
および７のＯｓｐＡを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ＃Ｃ６００００３）から精製し、血清型２および３をＥｘｐｉ２９３細胞から精製した。これらの構築物は膜貫通ドメインを欠き、Ｃ末端Ｈｉｓ6タグ（配列番号２２７）を含み、そ
れ以外は野生型であった。大腸菌の精製については、５００μＭのＩＰＴＧで５時間、タンパク質を誘起し、細胞をペレット化して－２０℃で凍結した。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ＃１１６９７４９８００１）を含むＴＢＳ緩衝液中１％ Ｔｒｉｔｏｎにペレットを再懸濁し、超音波処理によって細胞を溶解した。上清を濾過滅菌した。哺乳動物細胞の培養については、トランスフェクションの５日後に上清を採取し、濾過滅菌した。上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣに取り付けたＧＥ社のＨｉＴｒａｐ ＨＰ ５ｍｌカラム（Ｃａｔ＃１７－５２４８－０２）に流した。ＴＢＳ中２０ｍＭのイミダゾールでカラムを洗浄し、負荷し、再び洗浄した。ＴＢＳ中２５０ｍＭのイミダゾールで最終のタンパク質を溶出させた。
【0279】
ＯｓｐＡ血清型１は、トランスフォームされたヒト腎上皮細胞株Ｅｘｐｉ２９３中のフェリチンに融合したＢ．ブルグドルフェリ株Ｂ３１から発現した（図２Ａ～図２Ｄ、配列番号５２）。ナノ粒子の形成およびタンパク質の純度は、サイズ排除カラムクロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ（それぞれ図２Ａおよび図２Ｂ）によって確認した。ＳＥＣ解析により、予想された保持時間における単一で対称的なピークが明らかになった（図２Ａ）。
【0280】
動的光散乱（ＤＬＳ）解析も実施した。精製したナノ粒子を、透明な底を有する黒色の３８４ウェルのプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、Ｃａｔ＃３５４０）に濃度約０．４μｇ／ｍｌで負荷した。サンプルを制御温度２５℃で、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダーＩＩ（Ｗｙａｔｔ社）で読み取った。ＤＬＳにより、純粋で凝集物のない、低い多分散性（７．４％）の粒径１３ｎｍが記録された（図２Ｃ）。脂質化部位を含むＯｓｐＡの膜貫通ドメイン（アミノ酸１～２５）を除去することにより、精製の容易さが改善された。ＯｓｐＡの配列はアミノ連結グリコシル化の可能性のある４つの部位を含んでおり、哺乳動物細胞
から精製されたＯｓｐＡ－フェリチンはグリカンの付加に符合する高い分子量で泳動した（図２Ｂ）。
から精製されたＯｓｐＡ－フェリチンはグリカンの付加に符合する高い分子量で泳動した（図２Ｂ）。
【0281】
ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子について透過型電子顕微鏡陰性染色イメージングおよび２Ｄクラス平均解析を実施した（図２Ｄ）。ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子のサンプルを１×ＴＢＳで３００倍に希釈し、４００メッシュの銅グリッド上のニトロセルロースによって支持された連続炭素層の上でイメージングした。グリッドは、清浄したグリッドの上にサンプル懸濁液３μｌを塗布し、濾紙で吸い取り、直ちにギ酸ウラニルで染色することによって調製した。電子顕微鏡観察は、ＦＥＩ Ｅａｇｌｅ ４ｋ×４Ｋ ＣＣＤカメラを取り付けたＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２電子顕微鏡を用いて実施した。高拡大画像は６７，０００倍（０．１６ｍｍ／ピクセル）で取得した。画像は－１．９μｍ～－０．８μｍの公称アンダーフォーカスおよび約３０ｅ-／Å2の電子量で取得した。自動摘取プロトコル（Ｌａｎｄｅｒ，Ｇ．Ｃ．ら、Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，１６６（１）：９５～１０２頁（２００９）を参照）を用いて、６７，０００倍高拡大画像中の個別の粒子を選択した。ＸＭＩＰＰ処理パッケージに基づく参照なし整列戦略を用いた（Ｓｏｒｚａｎｏ，Ｃ．Ｏ．ら、Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １４８（２）：１９４～２０４頁（２００４）を参照）。このパッケージにおけるアルゴリズムは選択した粒子を整列させ、これらを自己相似群またはクラスに分類する。
【0282】
フェリチンナノ粒子は、中央部に中空の中心を有する円形の高密度として現れた（図２Ｄ）。それぞれのナノ粒子は、やや楕円形状に見えるＯｓｐＡの多くの短く均一なスパイクに取り囲まれていた。粒子は約１９４～２２０Åの範囲の全体の直径を有し、フェリチンコアの直径は１２５Åであった。スパイクは粒子の表面から長さ４５Åまでで、均一な大きさ、形状、および配向をもって延在していた。ＯｓｐＡスパイクの幅は約３０Åで、フェリチンのグリシン－セリンリンカーにおいて最小の密度に細くなっていた。
【0283】
ＬＹＭＥｒｉｘ（商標）ワクチンが２００２年に中止された際に、このワクチンがヒト白血球機能関連抗原－１（ｈＬＦＡ－１、Ｇｒｏｓｓ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７７）：７０３～６頁（１９９８）参照）のノナペプチドセグメント（配列番号７８）にホモロジーを有するエピトープ（配列番号８３のアミノ酸１６５～１７３）を含んでいるという懸念が生じていた（図５Ａ）。配列番号８３のアミノ酸１６５～１７３をｈＬＦＡ－１ホモロジー部位と称する。ＯｓｐＡ血清型１は、この配列ホモロジーを含む唯一の血清型である（図５Ｂ）。この配列に関する潜在的な懸念があればこれを避けるため、ｈＬＦＡ－１ホモロジー部位を、対応するＯｓｐＡ血清型２（配列番号７９）または血清型３（配列番号８０）のノナペプチド配列に交換し、あるいはｈＬＦＡ－１に対する類似性を低減させる点置換を導入し、ｈＬＦＡ－１に結合する抗体の産生を防止することを意図した（ＲＤ２、配列番号８１）（図５Ｃ）。点置換については、βシート構造の不安定化を避けまたは最小化しつつ、ｈＬＦＡ－１への類似性を低減させるために表面に露出したアミノ酸を置換した。
【0284】
ｈＬＦＡ－１へのホモロジー部位を改変したｈＬＦＡ－１ナノ粒子の免疫原性をマウスで試験し、そのような改変を行っていないＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子に対して免疫応答を比較した（図５Ｄ）。ｈＬＦＡ－１ホモロジー部位を改変したナノ粒子によって誘発された抗体力価は強力であり、改変していないｈＬＦＡ－１ホモロジー部位を有するナノ粒子との間に有意な差はなかった。
【0285】
２．ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子の免疫原性の特徴解析
ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子の免疫原性を評価するため、Ｒｉｂｉアジュバントの存在下の血清型１ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子、または血清型１で脂質化された完全長の組換えＯｓｐＡを含むイヌワクチンであるＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ（
Ｂ．ブルグドルフェリの精製された外表面プロテインＡ（ＯｓｐＡ）の脂質懸濁液）で２回、Ｃ３Ｈマウスを免疫した（図４）。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスは、０週および４週で筋肉内ワクチン接種した。２回目の投与の２週後から血清についてＥＬＩＳＡを行った。Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａ社アジュバントシステムＣａｔ＃Ｓ６３２２－１ｖｌ）をＰＢＳ１ｍｌ中に再懸濁して１分ボルテックスし、免疫に先立って等体積で抗原に添加した。
ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子の免疫原性を評価するため、Ｒｉｂｉアジュバントの存在下の血清型１ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子、または血清型１で脂質化された完全長の組換えＯｓｐＡを含むイヌワクチンであるＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ（
Ｂ．ブルグドルフェリの精製された外表面プロテインＡ（ＯｓｐＡ）の脂質懸濁液）で２回、Ｃ３Ｈマウスを免疫した（図４）。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスは、０週および４週で筋肉内ワクチン接種した。２回目の投与の２週後から血清についてＥＬＩＳＡを行った。Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａ社アジュバントシステムＣａｔ＃Ｓ６３２２－１ｖｌ）をＰＢＳ１ｍｌ中に再懸濁して１分ボルテックスし、免疫に先立って等体積で抗原に添加した。
【0286】
抗体応答は、組換えＯｓｐＡに対する酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定した。簡単には、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍｌのＯｓｐＡ－Ｈｉｓで９６ウェルプレートをコートし、４℃で終夜インキュベートした。ＯｓｐＡ－Ｈｉｓを除去し、ＰＢＳＴに溶解した５％のスキムミルクでプレートをブロックした。ブロッキング試薬を除去した後、一次血清サンプルをＰＢＳＴで連続的に希釈して加えた。最終的に５０％のブロッキング溶液濃度になるよう、一次サンプルをブロッキング溶液に等体積で加えた。１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを洗浄し、ＨＲＰ連結ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ブロッキング溶液中５，０００倍希釈）と室温で１時間インキュベートした。二次抗体を吸引除去し、洗浄して、プレートをＳｕｒｅ Ｂｌｕｅ ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とインキュベートし、続いて等体積の停止溶液（０．５Ｎ硫酸）を加えた。４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0287】
ＯｓｐＡ－フェリチンによる免疫は６週でＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅより４．４倍高いエンドポイント力価を誘起した（ｐ＜０．００１）。２５週における抗体力価も、ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅより有意に高かった（ｐ＜０．００５）（図４）。
【0288】
３．グリコシル化変異体；有効性の評価
このＯｓｐＡ－フェリチンの保護有効性を評価するため、Ｂ．ブルグドルフェリを持つダニを免疫マウスまたは対照マウスに感染させるチャレンジモデルを用いた（Ｒｏｓａ，Ｐ．Ａ．ら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３（２）：１２９～４３頁（２００５）参照）。
このＯｓｐＡ－フェリチンの保護有効性を評価するため、Ｂ．ブルグドルフェリを持つダニを免疫マウスまたは対照マウスに感染させるチャレンジモデルを用いた（Ｒｏｓａ，Ｐ．Ａ．ら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３（２）：１２９～４３頁（２００５）参照）。
【0289】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに筋肉内で、ＡｄｄａＶａｘ（商標）と１：１で混合したＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子１μｇ、またはフェリチンナノ粒子１μｇをワクチン接種した。マウスは０週および４週でワクチン接種した。マウスを免疫するために、ｈＬＦＡ－１ホモロジー部位に対する合理的に設計した改変および全ての潜在的なＮ－グリコシル部位を除去する改変を加えた血清型１ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子（配列番号５３）を用いた。それは、天然に細菌で発現されたＯｓｐＡはこれらの部位でグリコシル化されないからである。グリコシル化を防止するため、配列は下記：Ｎ７１Ｑ、Ｎ１９０Ｑ、Ｎ２０２Ｑ、およびＮ２５１ＱのＮ＞Ｑ置換を含んでいた。その免疫原性はグリコシル化ナノ粒子と同様であった（図１３）。
【0290】
グリコシル化部位セリン／トレオニンがアラニンに変異した場合（配列番号６３）、ＯｓｐＡ－フェリチンのグリコシル化変異体も試験した。この構築物および上で論じたＮ＞Ｑ構築物のいずれも、野生型のグリコシル化部位を有するＯｓｐＡ－フェリチン（配列番号５２）と比較して強い免疫応答を生じ、ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ対照より優れていた（図１４）。
【0291】
ダニチャレンジモデルにおいてＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子の保護有効性を評価するさらなる実験では、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｉｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ，ＯＫ）からイクソデス・スカプラリス（Ｉｘｏｄｅｓ ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ）ダニ幼虫（larvae）を入手した。Ｂ．ブルグドルフェリに感染した幼虫（ニ
ンフ、nymphs）は、未感染の幼虫にＢ．ブルグドルフェリ株Ｎ４０に感染させたＳＣＩＤマウスを飽食するまで吸血させることによって産生した。充血した幼虫を採取し、室温および高相対湿度で４～６週、脱皮させてニンフとした。吸血した幼虫におけるＢ．ブルグドルフェリ感染率は、各バッチから回収したダニの一部を培養することによって決定した。
ンフ、nymphs）は、未感染の幼虫にＢ．ブルグドルフェリ株Ｎ４０に感染させたＳＣＩＤマウスを飽食するまで吸血させることによって産生した。充血した幼虫を採取し、室温および高相対湿度で４～６週、脱皮させてニンフとした。吸血した幼虫におけるＢ．ブルグドルフェリ感染率は、各バッチから回収したダニの一部を培養することによって決定した。
【0292】
ＯｓｐＡ－フェリチン（配列番号５３）およびＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバント、または対照のフェリチンの１μｇ用量で０週と４週の２回、マウスを免疫し、並行して比較群をＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅで免疫した。６週目（すなわち２回目のワクチン投与の２週後）に５～６匹のＢ．ブルグドルフェリ感染ダニニンフを飽食するまで吸血させることによってマウスをチャレンジした。吸血したニンフを採取し、ＢＳＫ培地中で培養することによってＢ．ブルグドルフェリ感染をアッセイした。チャレンジの２週後にマウスを屠殺し、耳、足首、および心臓の培養によってＢ．ブルグドルフェリ感染をアッセイした。Ｂ．ブルグドルフェリの存在は、暗視野顕微鏡によって培養液を観察することによって決定した。暗視野顕微鏡によって１つまたはそれ以上の臓器培養が陽性となった場合に、マウスはＢ．ブルグドルフェリに感染していると定義した。陰性培養もＢ．ブルグドルフェリに特異的なＰＣＲによって試験した。
【0293】
２週後にマウスを屠殺した。心臓、足首、および耳からの組織サンプルをＢＳＫ培地中、Ｂ．ブルグドルフェリに対する抗生剤の存在下に６週培養した。陰性サンプルはＰＣＲによってＢ．ブルグドルフェリの存在について試験した。また、陰性培養液は全てＰＣＲ陰性であった。保護は感染しなかったマウスの百分率として計算した。
【0294】
ＯｓｐＡ－フェリチンおよびＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバントを含む組成物は感染を示さず（０／４）、５匹中４匹の動物が感染した陰性対照フェリチンと対照的であった（表２、ｐ＜０．０１）。
【0295】
【表3】
【0296】
４．免疫刺激性部分にコンジュゲートしたＯｓｐＡ－フェリチンの有効性の評価
クリックケミストリーによってＴＬＲアゴニスト（図６Ａ）またはＣｐＧ（配列番号２１０；ＩＳＳ－１０１８、図７Ａ）等の免疫刺激性部分の直接コンジュゲーションを可能にする、フェリチンナノ粒子の表面上のシステインの操作（Ｓ１１Ｃ）によって、自己アジュバント性構築物を産生した。直接コンジュゲーションの手順は下記の通りであった。哺乳動物から生成された材料を５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５中の１０ｍＭのＴＣＥＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ社、Ｋ８３１－１０Ｇ）で１時間還元してシステイン化を解除した。次いでタンパク質を１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌ中に透析してＴＣ
ＥＰを除去した。大腸菌から生成した材料は還元する必要はない。ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドリンカー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社ｃａｔ＃７６０６７６、５ｍｇ）をＤＭＳＯ中で５ｍｇ／ｍｌに再懸濁した。リンカー２．５ｍｇを体積１０ｍｌでタンパク質３ｍｇに加えた（最終ＤＭＳＯ濃度は５％であった）。リンカーを還元タンパク質と室温で３０分インキュベートした。Ａｍｂｉｃｏｎ社の１００ＭＷカットオフフィルター濃縮器を用いて緩衝液交換により過剰なリンカーを除去した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社Ｃａｔ＃ＵＦＣ９１００９６）。アジド－ＰＥＧ４－３Ｍ－０１２（社内で合成）およびアジド－ＣＰＧ（ＩＳＳ－１０１８、ＩＤＴ社によりカスタム合成）を最終のクリックケミストリーステップに用いた。最終のコンジュゲーションステップとしてアジュバント０．５ｍｇをタンパク質０．５ｍｇに加え、３７℃で６時間、次いで４℃で終夜インキュベートした。Ａｍｂｉｃｏｎ社の１００ＭＷカットオフフィルター濃縮器を用いて緩衝液交換により過剰なアジュバントを除去した。コンジュゲーションの効率は、３Ｍ－０１２についてはマススペクトロメトリーで、ＣＰＧについてはＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析で確認した。
クリックケミストリーによってＴＬＲアゴニスト（図６Ａ）またはＣｐＧ（配列番号２１０；ＩＳＳ－１０１８、図７Ａ）等の免疫刺激性部分の直接コンジュゲーションを可能にする、フェリチンナノ粒子の表面上のシステインの操作（Ｓ１１Ｃ）によって、自己アジュバント性構築物を産生した。直接コンジュゲーションの手順は下記の通りであった。哺乳動物から生成された材料を５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５中の１０ｍＭのＴＣＥＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ社、Ｋ８３１－１０Ｇ）で１時間還元してシステイン化を解除した。次いでタンパク質を１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、５０ｍＭのＮａＣｌ中に透析してＴＣ
ＥＰを除去した。大腸菌から生成した材料は還元する必要はない。ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドリンカー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社ｃａｔ＃７６０６７６、５ｍｇ）をＤＭＳＯ中で５ｍｇ／ｍｌに再懸濁した。リンカー２．５ｍｇを体積１０ｍｌでタンパク質３ｍｇに加えた（最終ＤＭＳＯ濃度は５％であった）。リンカーを還元タンパク質と室温で３０分インキュベートした。Ａｍｂｉｃｏｎ社の１００ＭＷカットオフフィルター濃縮器を用いて緩衝液交換により過剰なリンカーを除去した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社Ｃａｔ＃ＵＦＣ９１００９６）。アジド－ＰＥＧ４－３Ｍ－０１２（社内で合成）およびアジド－ＣＰＧ（ＩＳＳ－１０１８、ＩＤＴ社によりカスタム合成）を最終のクリックケミストリーステップに用いた。最終のコンジュゲーションステップとしてアジュバント０．５ｍｇをタンパク質０．５ｍｇに加え、３７℃で６時間、次いで４℃で終夜インキュベートした。Ａｍｂｉｃｏｎ社の１００ＭＷカットオフフィルター濃縮器を用いて緩衝液交換により過剰なアジュバントを除去した。コンジュゲーションの効率は、３Ｍ－０１２についてはマススペクトロメトリーで、ＣＰＧについてはＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析で確認した。
【0297】
ＨＩＶのＧａｇタンパク質に直接コンジュゲートした場合に抗体応答を増大させることが以前に示されたＴＬＲ７／８アゴニスト３Ｍ－０１２（Ｗｉｌｌｅ－Ｒｅｅｃｅ，Ｕ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２（４２）；１５１９０～４頁（２００５）参照）を用いた。２ステップクリックケミストリーアプローチを用いて３Ｍ－０１２を配列番号５３のナノ粒子に結合させた。最初にＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミドリンカーをシステインに連結し、次いで修飾した３Ｍ－０１２をＰＥＧ４－アジドリンカーとともに銅を含まないアジド－アルキン環化付加によって付加した（図６Ａ）。マススペクトロメトリーによって９９％超のコンジュゲーション効率が確認され、マスシフトは５８７ダルトンであった（図１２）。アジド－３Ｍ－０１２に加えて、アジド－ＣＰＧの付加にも成功した（図７Ａ）。これについては、ゲルシフトによってコンジュゲーションが確認できた（図７Ｂ）。
【0298】
フェリチンのほぼ完全なコンジュゲーションが観察され、大部分のナノ粒子が２４分子のアゴニストを持っていることが示唆された。次いでコンジュゲートしたＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子の免疫原性をマウスで評価した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスを０週と４週に筋肉内でワクチン接種した。２回目の投与の２週後から血清についてＥＬＩＳＡを行った。免疫に先立ってアラム（Ａｌｙｈｙｄｒｏｇｅｌ’８５ ２％、Ｂｒｅｎｎｔａｇ社、Ｃａｔ＃２１６４５－５１－２）を等体積で抗原に添加した。Ｒｉｂｉ（Ｓｉｇｍａ社アジュバントシステムＣａｔ＃Ｓ６３２２－１ｖｌ）をＰＢＳ １ｍｌ中に再懸濁して１分ボルテックスし、免疫に先立って等体積で抗原に添加した。
【0299】
３Ｍ－０１２をコンジュゲートした粒子で免疫したマウスは、コンジュゲートしていない材料より４．５倍高いＯｓｐＡ抗体応答を生成した（図６Ｂ、ｐ＜０．０５）。３Ｍ－０１２をコンジュゲートした粒子によって誘発された抗体応答は、等モル量の３Ｍ－０１２（２９ｎｇ）と混合した粒子よりも大きく、１０００倍高い用量（２０μｇ）の３Ｍ－０１２または標準のアラム（Ａｌｙｈｙｄｒｏｇｅｌ’８５、２％、Ｂｒｅｎｎｔａｇ社－Ｃａｔ＃２１６４５－５１－２）アジュバントと混合した粒子と同程度であった。
【0300】
同様の抗体生成の増強がＣＰＧをコンジュゲートしたＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子（配列番号５３）で観察され、コンジュゲートしていない粒子と比較して免疫応答が６．３倍増大し、ナノ粒子と混合した等量のコンジュゲートしていないＣＰＧに対して４．７倍増大した（図７Ｃ）。
【0301】
したがって、ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子にコンジュゲートしたアジュバントの標的送達により、効果的かつ特異的な抗体応答を刺激しつつ、アジュバントの量を実質的に低減させることが可能になる。
【0302】
５．様々な血清型を含むＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子の免疫原性の評価
血清型１ＯｓｐＡ株Ｂ．ブルグドルフェリは米国で疾患を引き起こす一方、Ｂ．アフゼリ（血清型２）、Ｂ．ガリニ（血清型３、５、６、７）、およびＢ．ババリエンシス（血清型４）は欧州、アジア、およびその他の地域で疾患を引き起こす。幅広く交差保護する組成物を産生するため、血清型１、２、３、４、５、および７（配列番号１、５、６、７、８、および１０）についてＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子を設計した。これらの粒子を発現させ、大腸菌からアニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した（図３Ａ）。全てのＯｓｐＡ－フェリチン抗原性ポリペプチドは予想された分子量である４７ｋＤａを有し、ＤＬＳ解析および透過型電子顕微鏡によっても６種のＯｓｐＡナノ粒子全ての形成が確認された（図３Ｂ）。
血清型１ＯｓｐＡ株Ｂ．ブルグドルフェリは米国で疾患を引き起こす一方、Ｂ．アフゼリ（血清型２）、Ｂ．ガリニ（血清型３、５、６、７）、およびＢ．ババリエンシス（血清型４）は欧州、アジア、およびその他の地域で疾患を引き起こす。幅広く交差保護する組成物を産生するため、血清型１、２、３、４、５、および７（配列番号１、５、６、７、８、および１０）についてＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子を設計した。これらの粒子を発現させ、大腸菌からアニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した（図３Ａ）。全てのＯｓｐＡ－フェリチン抗原性ポリペプチドは予想された分子量である４７ｋＤａを有し、ＤＬＳ解析および透過型電子顕微鏡によっても６種のＯｓｐＡナノ粒子全ての形成が確認された（図３Ｂ）。
【0303】
血清型１～５および７のＯｓｐＡ－フェリチンのそれぞれを等モルの割合で組み合わせることによって、６成分の組成物を産生した。
【0304】
アラムを添加したこの６成分の組成物（すなわち六価）の免疫原性を、同じアジュバントを添加した単一血清型の粒子（すなわち一価）とマウスで比較した（図８Ａ～図８Ｆ）。各血清型について一価の組成物は１μｇ用量で、六価の組成物は１μｇで投与した（総量６μｇ用量）。免疫に先立ってアラム（Ａｌｙｈｙｄｒｏｇｅｌ’８５、２％、Ｂｒｅｎｎｔａｇ社－Ｃａｔ＃２１６４５－５１－２）を等体積で抗原に添加した。６成分の組成物はＯｓｐＡ血清型１～５および７の６種全てに対して強力な抗体応答を誘起した。さらに、単一血清型の対照に対する応答は混合物と同様であり、６種の血清型の組合せの中で干渉がないことが示された。血清型４に対し、六価の組成物において単一成分の組成物と比較して改善された免疫応答が見られた（図８Ｄ、血清型４を参照）。
【0305】
六価の組成物が免疫原性であること、およびいくつかの例では一価の組成物より優れていることが確立されたので、６種のＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子のそれぞれと３Ｍ－０１２およびＣｐＧとのコンジュゲートを調製した。３Ｍ－０１２にコンジュゲートした６種のＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子を組み合わせ、別にＣｐＧにコンジュゲートした６種のＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子を組み合わせることによって、２種の６成分をコンジュゲートした組成物を創成した。ＣｐＧコンジュゲートした六価の組成物および３Ｍ－０１２コンジュゲートした六価の組成物は、世界的に見出されるＯｓｐＡの７種の血清型全てについて、コンジュゲートしていない六価の組成物と比較して抗体応答の顕著な増大をマウスで示し（図９Ａ～図９Ｇ）、ＯｓｐＡ血清型６ポリペプチドが組成物中に存在していないにも関わらず、六価の処方も血清型６に対する保護を付与していることが示された。
【0306】
非ヒト霊長類（ＮＨＰ、アカゲザル）で試験すると、ＡＦ０３アジュバントを添加した六価のナノ粒子組成物（非コンジュゲート）は、ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ対照より性能が優れており、循環するボレリア血清型７種全てに対して１１倍～２００倍高いＡｂ力価を示した（図１０Ａ～図１０Ｇ）。マウスと同様に、六価の組成物はアジュバントの存在下で高い力価の抗体応答を誘発した。３Ｍ－０１２およびＣｐＧとコンジュゲートした組成物はＮＨＰにおいてＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ対照と同様の応答を誘起した（図１０Ａ～図１０Ｇをそれぞれ図１０Ｈ～図１０Ｎと比較）。ＮＨＰにおける六価のワクチンの抗体力価はブースト投与の１９週後も強力であり、ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ対照に対する優位性を保持していた（図２５）。
【0307】
コンジュゲートした組成物をダニチャレンジモデルでも試験した。マウスを０週および４週に１μｇの用量の抗原でワクチン接種した。一価の組成物は３Ｍ－０１２にコンジュゲートしたＯｓｐＡ－フェリチン血清型１ １μｇを含んでいた。六価の組成物はそれぞれ３Ｍ－０１２にコンジュゲートした血清型１、２、３、４、５、および７のＯｓｐＡ
１μｇを含んでいた。２回目の免疫の２週後にボレリア・ブルグドルフェリＮ４０株（血清型１）に感染させた５～６匹のダニを５日間、マウスにチャレンジし、２週後に屠殺した。心臓、足首、および耳からの組織サンプルを、Ｂ．ブルグドルフェリに対する抗生剤を添加したＢＳＫ培地中で６週培養した。陰性サンプルをＰＣＲによりＢ．ブルグドルフェリの存在について試験した。陽性サンプルは培養またはＰＣＲのいずれかについて陽性であった（図１１）。
１μｇを含んでいた。２回目の免疫の２週後にボレリア・ブルグドルフェリＮ４０株（血清型１）に感染させた５～６匹のダニを５日間、マウスにチャレンジし、２週後に屠殺した。心臓、足首、および耳からの組織サンプルを、Ｂ．ブルグドルフェリに対する抗生剤を添加したＢＳＫ培地中で６週培養した。陰性サンプルをＰＣＲによりＢ．ブルグドルフェリの存在について試験した。陽性サンプルは培養またはＰＣＲのいずれかについて陽性であった（図１１）。
【0308】
さらに、７種の血清型全てを含む七価のワクチンをマウスで試験した。アラムもしくはＡＦ０３をアジュバントとして添加したＯｓｐＡ血清型１～７に対応するＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子それぞれ１μｇ（総量７μｇ）の七価ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子組成物、またはＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）Ｌｙｍｅ（１μｇ用量）で、マウスを０週および４週に筋肉内で免疫した。免疫の２週後にＥＬＩＳＡによって測定したエンドポイント力価で抗体応答を解析した。ＲＥＣＯＭＢＩＴＥＫ（登録商標）と比較して強力な免疫応答が実証された（図２４Ａ～図２４Ｇ）。
【0309】
このように、ＯｓｐＡ－フェリチンナノ粒子は、７種の主要な血清型に対して高い力価の抗体応答を誘発した。さらに、７成分のライムワクチン候補は、ライム病の世界的な蔓延を制御する可能性を提示している。
【0310】
６．様々な可撓性のリンカーを有するＯｓｐＡ－フェリチン構築物の特徴解析
ＯｓｐＡとフェリチンとの間に可撓性を提供するためにいくつかの異なったリンカーを試験した。構築物は１個から５個の－ＧＧＧＳ－（配列番号２２６）配列の範囲であった。種々のリンカー構築物を精製し、均一な大きさのナノ粒子を形成した。
ＯｓｐＡとフェリチンとの間に可撓性を提供するためにいくつかの異なったリンカーを試験した。構築物は１個から５個の－ＧＧＧＳ－（配列番号２２６）配列の範囲であった。種々のリンカー構築物を精製し、均一な大きさのナノ粒子を形成した。
【0311】
ＧＳ１（ＧＧＧＳ）（配列番号２２６）、ＧＳ２（配列番号９１）、またはＧＳ５（配列番号９２）のリンカーを含むＯｓｐＡ－リンカー－フェリチン構築物は全て発現することができ（図１５Ａ）、矛盾のないＤＬＳ（図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｅ）およびＥＭ（図１５Ｄ）のプロファイルを示した。
【0312】
さらに、様々な－ＧＧＧＳ－（配列番号２２６）－リンカー構築物（リンカー１×ＧＧＧＳ（配列番号２２６）［配列番号６０］、リンカー２×ＧＧＧＳ（配列番号９１）［配列番号６１］、およびリンカー５×ＧＧＧＳ（配列番号９２）［配列番号６２］）は全てＣ３Ｈマウスにおいて強い免疫応答を示した（図１６）。
【0313】
７．ルマジンシンターゼＯｓｐＡナノ粒子の特徴解析
もう１つのナノ粒子であるアクイフェックス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）由来のルマジンシンターゼについて、ＯｓｐＡの抗原呈示を検討した。様々な血清型を含むＯｓｐＡ－ルマジンシンターゼ粒子は、大腸菌細胞からアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって容易に精製された。ＯｓｐＡ血清型１（配列番号１２、図１９Ａ～図１９Ｃ）、ＯｓｐＡ血清型２（配列番号１６、図２０Ａ～図２０Ｃ）、ＯｓｐＡ血清型３（配列番号１７、図２１Ａ～図２１Ｂ）、ＯｓｐＡ血清型４（配列番号１８、図１７Ａ～図１７Ｃ）、ＯｓｐＡ血清型５（配列番号１９、図２２Ａ～図２２Ｃ）、およびＯｓｐＡ血清型７（配列番号２１、図２３Ａ～図２３Ｃ）からなる構築物を産生し特徴解析した。ＯｓｐＡ－ルマジンシンターゼ粒子はＥＭで１５．８ｎｍの粒子を形成しており、ＤＬＳで大きさは均一であった。
もう１つのナノ粒子であるアクイフェックス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）由来のルマジンシンターゼについて、ＯｓｐＡの抗原呈示を検討した。様々な血清型を含むＯｓｐＡ－ルマジンシンターゼ粒子は、大腸菌細胞からアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって容易に精製された。ＯｓｐＡ血清型１（配列番号１２、図１９Ａ～図１９Ｃ）、ＯｓｐＡ血清型２（配列番号１６、図２０Ａ～図２０Ｃ）、ＯｓｐＡ血清型３（配列番号１７、図２１Ａ～図２１Ｂ）、ＯｓｐＡ血清型４（配列番号１８、図１７Ａ～図１７Ｃ）、ＯｓｐＡ血清型５（配列番号１９、図２２Ａ～図２２Ｃ）、およびＯｓｐＡ血清型７（配列番号２１、図２３Ａ～図２３Ｃ）からなる構築物を産生し特徴解析した。ＯｓｐＡ－ルマジンシンターゼ粒子はＥＭで１５．８ｎｍの粒子を形成しており、ＤＬＳで大きさは均一であった。
【0314】
ＯｓｐＡ血清型４ルマジンシンターゼ粒子（配列番号１８）をマウスで免疫原性について試験した（図１８）。アラムを添加しまたは添加していないＯｓｐＡルマジンシンターゼ粒子は、同様のＯｓｐＡ血清型４フェリチンナノ粒子（配列番号７）の免疫応答と少なくとも同じく強力と思われる強い免疫応答を生じた。
【0315】
したがって、ルマジンシンターゼおよびＯｓｐＡポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドも、抗ＯｓｐＡ抗体応答を誘発させるために用いることができる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6A】
【図6B】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図9-4】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図10-4】
【図10-5】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20-1】
【図20-2】
【図21A】
【図21B】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【図23A】
【図23B】
【図23C】
【図24-1】
【図24-2】
【図24-3】
【図24-4】
【図25】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-02-02
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のＯｓｐＡ血清型１ポリペプチドを含む抗原性ＯｓｐＡポリペプチドであって、配列番号７７の配列を含まない前記抗原性ＯｓｐＡポリペプチド。
【外国語明細書】