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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024044227
(43)【公開日】2024-04-02
(54)【発明の名称】グルコース産生抑制剤
(51)【国際特許分類】
A61K 35/10 20150101AFI20240326BHJP
A61P 3/08 20060101ALI20240326BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240326BHJP
A61K 31/365 20060101ALI20240326BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20240326BHJP
A21D 13/80 20170101ALN20240326BHJP
【ＦＩ】
A61K35/10
A61P3/08
A61P3/10
A61K31/365
A23L33/10
A21D13/80
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022149634
(22)【出願日】2022-09-20
(71)【出願人】
【識別番号】504165591
【氏名又は名称】国立大学法人岩手大学
(71)【出願人】
【識別番号】507148456
【氏名又は名称】学校法人 岩手医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106611
【弁理士】
【氏名又は名称】辻田 幸史
(72)【発明者】
【氏名】木村 賢一
(72)【発明者】
【氏名】吉田 潤
【テーマコード（参考）】
4B018
4B032
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B018MD48
4B018ME03
4B018MF01
4B032DB21
4B032DG02
4B032DK02
4B032DK12
4B032DK29
4B032DK45
4B032DK47
4B032DL20
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA17
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA35
4C086NA14
4C086ZC35
4C087AA01
4C087AA02
4C087BA07
4C087CA06
4C087CA37
4C087NA14
4C087ZC35
(57)【要約】
【課題】 天然由来の新規なグルコース産生抑制剤を提供すること。
【解決手段】 琥珀の抽出物を有効成分とする。また、琥珀の抽出物に含まれる下記の化学構造式で表されるスピロラクトンノルジテルペノイド化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする。
【化１】
【選択図】 図１
【解決手段】 琥珀の抽出物を有効成分とする。また、琥珀の抽出物に含まれる下記の化学構造式で表されるスピロラクトンノルジテルペノイド化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする。
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
琥珀の抽出物を有効成分とするグルコース産生抑制剤。
【請求項2】
琥珀の抽出物が、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物またはエタノール抽出物である請求項１記載のグルコース産生抑制剤。
【請求項3】
琥珀の抽出物が、下記の化学構造式で表されるスピロラクトンノルジテルペノイド化合物を含む請求項１記載のグルコース産生抑制剤。
【化1】
【請求項4】
下記の化学構造式で表されるスピロラクトンノルジテルペノイド化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とするグルコース産生抑制剤。
【化2】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、天然由来の新規なグルコース産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【0002】
２型糖尿病は、インスリン抵抗性と膵臓機能不全によるインスリン作用不足を要因とする高血糖病態であり、糖尿病全体の９０％以上を占める。２型糖尿病は、いちど発症すると治癒することが難しく、網膜症などの様々な合併症を引き起こすことから、その予防・治療法の開発が古くから行われてきており、様々な薬剤が既に上市されている。しかしながら、２型糖尿病の予防・治療のための新たな有効成分の探索は今日においても意義深い状況にあることから、本発明者らの研究グループは、天然由来の２型糖尿病の予防・治療剤の有効成分の探索を精力的に行っており、例えば非特許文献１において、セリ科植物に含まれるポリアセチレン化合物であるファルカリンジオールが、ＧＳＫ（グリコーゲン合成酵素キナーゼ）－３β阻害作用に基づくグルコース産生抑制作用を有することを報告している。けれども、天然にはグルコース産生抑制作用を有することが知られていない成分がまだ存在すると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】吉田 潤ら、講演番号：３Ｄ１２ａ１３ セリ科植物から得られたＧＳＫ－３β阻害物質ｆａｌｃａｒｉｎｄｉｏｌの肝細胞における糖新生抑制作用、公益社団法人日本農芸化学会２０１５年度大会講演要旨集
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
そこで本発明は、天然由来の新規なグルコース産生抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、琥珀（植物の樹脂が化石化したもの）の抽出物が、グルコース産生抑制作用を有することを見出すとともに、琥珀の抽出物に含まれるスピロラクトンノルジテルペノイド化合物が、グルコース産生抑制作用を有することを見出した。
【0006】
上記の知見に基づいてなされた本発明のグルコース産生抑制剤は、請求項１記載の通り、琥珀の抽出物を有効成分とする。
また、請求項２記載のグルコース産生抑制剤は、請求項１記載のグルコース産生抑制剤において、琥珀の抽出物が、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物またはエタノール抽出物である。
また、請求項３記載のグルコース産生抑制剤は、請求項１記載のグルコース産生抑制剤において、琥珀の抽出物が、下記の化学構造式で表されるスピロラクトンノルジテルペノイド化合物を含む。
また、請求項２記載のグルコース産生抑制剤は、請求項１記載のグルコース産生抑制剤において、琥珀の抽出物が、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物またはエタノール抽出物である。
また、請求項３記載のグルコース産生抑制剤は、請求項１記載のグルコース産生抑制剤において、琥珀の抽出物が、下記の化学構造式で表されるスピロラクトンノルジテルペノイド化合物を含む。
【0007】
【化1】
【0008】
また、本発明のグルコース産生抑制剤は、請求項４記載の通り、下記の化学構造式で表されるスピロラクトンノルジテルペノイド化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする。
【0009】
【化2】
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、天然由来の新規なグルコース産生抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本発明において用いる琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物が、濃度依存的にグルコース産生抑制作用を示すグラフである。
【図2】本発明において用いるスピロラクトンノルジテルペノイド化合物が、濃度依存的にグルコース産生抑制作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明のグルコース産生抑制剤は、琥珀の抽出物を有効成分とする。本発明において用いることができる琥珀としては、ロシア、ポーランド、ウクライナ、ドイツ、スペイン、ドミニカ、ミャンマー、インドネシア、中国などの国を産地とするものの他、日本国内では、岩手県久慈市、福島県いわき市、千葉県銚子市、岐阜県瑞浪市、山口県宇部市、また、これらの近辺を産地とするものが挙げられる。
【0013】
琥珀の抽出物は、一般的な天然有機成分の抽出方法に従って、例えば粉末化した琥珀に有機溶媒を加えて抽出操作を行った後、得られた濾液から有機溶媒を除去することで得ることができる。用いることができる有機溶媒としては、アルコール（メタノールやエタノールやイソプロパノールなど）、ベンゼン、ヘキサン、酢酸エチル、アセトニトリル、アセトン、クロロホルム、ジクロロメタンなどが挙げられる。抽出操作は、単一の有機溶媒を用いて行ってもよいし、複数の有機溶媒を混合して用いて行ってもよい。また、抽出操作を、例えばアルコールで抽出した後、さらに酢酸エチルで抽出するといったように多段階で行い、抽出物の精製度を高めてもよい。さらに、イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲルろ過クロマトグラフィー、活性炭やアルミナやシリカゲルなどの吸着剤によるクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーを用いた分離操作の他、結晶化操作、減圧濃縮操作、凍結乾燥操作などの各種操作を適宜組み合わせてもよい。また、琥珀の抽出物は、天然有機成分の抽出方法として知られている超臨界状態の二酸化炭素を用いた超臨界抽出法によって得られる超臨界二酸化炭素抽出物などであってもよい。適用者に対する安全性などを考慮すると、琥珀の抽出物は、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物やエタノール抽出物であることが望ましい。なお、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物とエタノール抽出物は、本発明者らの研究グループによって既に報告されている公知のものである（Ｓａｔｏｓｈｉ Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｋｕｊｉ ａｍｂｅｒ，ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２０２０，ＶＯＬ．８４，ＮＯ．３，５１８－５２５）。
【0014】
琥珀の抽出物がどのようにしてグルコース産生抑制作用を発揮するのかについては、現時点では本発明者らにも明確でない。しかしながら、本発明者らは、琥珀の抽出物に含まれる下記の化学構造式で表されるスピロラクトンノルジテルペノイド（ｓｐｉｒｏｌａｃｔｏｎｅ ｎｏｒｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）化合物（（４Ｒ＊，５Ｓ＊，８Ｒ＊，９Ｒ＊，１０Ｓ＊）－１４，１５，１６，１９－ｔｅｔｒａｎｏｒ－ｌａｂｄａｎ－１３，９－ｏｌｉｄｅ）が、グルコース産生抑制作用を有することを見出していることから、このスピロラクトンノルジテルペノイド化合物が、琥珀の抽出物が有するグルコース産生抑制作用に関与していると考えられる。なお、このスピロラクトンノルジテルペノイド化合物も、本発明者らの研究グループによって既に報告されている公知のものであり、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物とエタノール抽出物にも含まれていることは、上記のＳｕｚｕｋｉらの文献に記載の通りである。
【0015】
【化3】
【0016】
従って、本発明のグルコース産生抑制剤は、上記の化学構造式で表されるスピロラクトンノルジテルペノイド化合物やその薬学的に許容される塩を有効成分としてもよい。このスピロラクトンノルジテルペノイド化合物は、例えば本発明者らの研究グループによる文献（Ｅｉｓａｋｕ Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｐｉｒｏｌａｃｔｏｎｅ ｎｏｒｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ ａｓ ａ ｙｅａｓｔ Ｃａ２＋ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒｏｍ Ｋｕｊｉ ａｍｂｅｒ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ＰＰＭ１Ａ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ，２０１９；１３４：２９０－２９６）に従って、琥珀の抽出物から単離精製することで得ることができる。また、このスピロラクトンノルジテルペノイド化合物は、有機化学的手法により合成されたものであってもよい。このスピロラクトンノルジテルペノイド化合物の薬学的に許容される塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩やマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルギニン塩やリジン塩などのアミノ酸塩、無機酸塩（塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩など）、有機酸塩（酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩など）を例示することができる。
【0017】
本発明のグルコース産生抑制剤は、各種の製剤形態に製剤化することでそれ自体を医薬品や健康食品として服用や摂取することができることに加え、各種の飲食品に配合して摂取することで、２型糖尿病の予防・治療剤としての効果が期待できる。その適用量は、適用者の年齢や体重、症状の程度、適用形態などによって異なるが、特に制限されるものではない。
【実施例0018】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。なお、以下においては、下記の化学構造式で表されるスピロラクトンノルジテルペノイド化合物を、単にスピロラクトンノルジテルペノイド化合物と記載する。
【0019】
【化4】
【0020】
試験例１：琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物のグルコース産生抑制作用
（試験方法）
合成グルココルチコイドによってグルコース産生を惹起させたラット肝癌由来Ｈ４ＩＩＥ細胞の培地中へのグルコース放出に対する作用により評価した。具体的には、Ｈ４ＩＩＥ細胞（ＡＴＣＣ）を、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｗｅｌｌで１２ｗｅｌｌプレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で２日間培養した後、０．５μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）と１００μＭのジブチリルサイクリックＡＭＰ（Ｂｔ２ｃＡＭＰ）を含む無血清ＤＭＥＭ培地に交換した。その際、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物（上記のＳｕｚｕｋｉらの文献に従って市販の超臨界抽出システムを用いて温度８０℃，圧力２０ＭＰａ，二酸化炭素流速３ｍＬ／分の条件で久慈産の琥珀の粉末から抽出した後に二酸化炭素を留去した黄色透明オイル状液体）のＤＭＳＯ溶液を、各種の濃度になるように交換した培地に添加し、２４時間培養した。２４時間後、２ｍＭのピルビン酸ナトリウムと２０ｍＭの乳酸ナトリウムを含むグルコース不含培地に交換し、４時間培養した。４時間後、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いたグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ法で測定した各ｗｅｌｌの培地に含まれるグルコース量を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した各ｗｅｌｌの細胞タンパク質量で除することでノーマライズした値を算出し、Ｈ４ＩＩＥ細胞からのグルコース放出量とした。
（試験方法）
合成グルココルチコイドによってグルコース産生を惹起させたラット肝癌由来Ｈ４ＩＩＥ細胞の培地中へのグルコース放出に対する作用により評価した。具体的には、Ｈ４ＩＩＥ細胞（ＡＴＣＣ）を、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｗｅｌｌで１２ｗｅｌｌプレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で２日間培養した後、０．５μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）と１００μＭのジブチリルサイクリックＡＭＰ（Ｂｔ２ｃＡＭＰ）を含む無血清ＤＭＥＭ培地に交換した。その際、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物（上記のＳｕｚｕｋｉらの文献に従って市販の超臨界抽出システムを用いて温度８０℃，圧力２０ＭＰａ，二酸化炭素流速３ｍＬ／分の条件で久慈産の琥珀の粉末から抽出した後に二酸化炭素を留去した黄色透明オイル状液体）のＤＭＳＯ溶液を、各種の濃度になるように交換した培地に添加し、２４時間培養した。２４時間後、２ｍＭのピルビン酸ナトリウムと２０ｍＭの乳酸ナトリウムを含むグルコース不含培地に交換し、４時間培養した。４時間後、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いたグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ法で測定した各ｗｅｌｌの培地に含まれるグルコース量を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した各ｗｅｌｌの細胞タンパク質量で除することでノーマライズした値を算出し、Ｈ４ＩＩＥ細胞からのグルコース放出量とした。
【0021】
（試験結果）
琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物のＤＭＳＯ溶液を培地に添加した場合のＨ４ＩＩＥ細胞からのグルコース放出量を、コントロールとしてＤＭＳＯのみを培地に添加した場合のＨ４ＩＩＥ細胞からのグルコース放出量を１００とした相対値として図１に示す。図１から明らかなように、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物は、濃度依存的にグルコース産生抑制作用を示し（ＩＣ５０：１３．１μｇ／ｍＬ、ｎ＝３）、１２．５μｇ／ｍＬにおけるグルコース産生抑制作用は、ＧＳＫ－３β阻害剤として知られているＢＩＯ（６－ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３－ｏｘｉｍｅ）の１０μＭにおけるグルコース産生抑制作用よりも優れていた。また、５０μｇ／ｍＬにおけるグルコース産生抑制作用は、インスリンの０．０１μＭにおけるグルコース産生抑制作用に匹敵した。なお、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物は、１００μｇ／ｍＬでもＨ４ＩＩＥ細胞に対して毒性を示さなかった（ＭＴＴアッセイによる）。以上の結果から、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物は、肝臓におけるグルコース産生抑制作用に基づく、安全性の高い２型糖尿病の予防・治療剤としての効果が期待できることがわかった。
琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物のＤＭＳＯ溶液を培地に添加した場合のＨ４ＩＩＥ細胞からのグルコース放出量を、コントロールとしてＤＭＳＯのみを培地に添加した場合のＨ４ＩＩＥ細胞からのグルコース放出量を１００とした相対値として図１に示す。図１から明らかなように、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物は、濃度依存的にグルコース産生抑制作用を示し（ＩＣ５０：１３．１μｇ／ｍＬ、ｎ＝３）、１２．５μｇ／ｍＬにおけるグルコース産生抑制作用は、ＧＳＫ－３β阻害剤として知られているＢＩＯ（６－ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３－ｏｘｉｍｅ）の１０μＭにおけるグルコース産生抑制作用よりも優れていた。また、５０μｇ／ｍＬにおけるグルコース産生抑制作用は、インスリンの０．０１μＭにおけるグルコース産生抑制作用に匹敵した。なお、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物は、１００μｇ／ｍＬでもＨ４ＩＩＥ細胞に対して毒性を示さなかった（ＭＴＴアッセイによる）。以上の結果から、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物は、肝臓におけるグルコース産生抑制作用に基づく、安全性の高い２型糖尿病の予防・治療剤としての効果が期待できることがわかった。
【0022】
試験例２：琥珀のエタノール抽出物のグルコース産生抑制作用
琥珀のエタノール抽出物（上記のＳｕｚｕｋｉらの文献に従って３倍量のエタノールを用いて久慈産の琥珀の粉末から２日間抽出した後にエタノールを留去した茶褐色固体）のグルコース産生抑制作用を、試験例１における試験方法に従って評価した。その結果、程度の違いはあるが、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物と同様のグルコース産生抑制作用を確認することができた。
琥珀のエタノール抽出物（上記のＳｕｚｕｋｉらの文献に従って３倍量のエタノールを用いて久慈産の琥珀の粉末から２日間抽出した後にエタノールを留去した茶褐色固体）のグルコース産生抑制作用を、試験例１における試験方法に従って評価した。その結果、程度の違いはあるが、琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物と同様のグルコース産生抑制作用を確認することができた。
【0023】
試験例３：スピロラクトンノルジテルペノイド化合物のグルコース産生抑制作用
スピロラクトンノルジテルペノイド化合物（上記のＳｈｉｍｉｚｕらの文献に従って久慈産の琥珀のメタノール抽出物から単離精製した白色アモルファス粉末）のグルコース産生抑制作用を、試験例１における試験方法に従って評価した。スピロラクトンノルジテルペノイド化合物のＤＭＳＯ溶液を培地に添加した場合のＨ４ＩＩＥ細胞からのグルコース放出量を、コントロールとしてＤＭＳＯのみを培地に添加した場合のＨ４ＩＩＥ細胞からのグルコース放出量を１００とした相対値として図２に示す。図２から明らかなように、スピロラクトンノルジテルペノイド化合物は、濃度依存的にグルコース産生抑制作用を示し（ＩＣ５０：１１．７μＭ、ｎ＝６）、１０μＭにおけるグルコース産生抑制作用は、ＢＩＯの１０μＭにおけるグルコース産生抑制作用よりも優れていた。また、１００μＭにおけるグルコース産生抑制作用は、インスリンの０．０１μＭにおけるグルコース産生抑制作用に匹敵した。なお、スピロラクトンノルジテルペノイド化合物は、１００μＭでもＨ４ＩＩＥ細胞に対して毒性を示さなかった（ＭＴＴアッセイによる）。以上の結果から、スピロラクトンノルジテルペノイド化合物は、肝臓におけるグルコース産生抑制作用に基づく、安全性の高い２型糖尿病の予防・治療剤としての効果が期待できることがわかった。
スピロラクトンノルジテルペノイド化合物（上記のＳｈｉｍｉｚｕらの文献に従って久慈産の琥珀のメタノール抽出物から単離精製した白色アモルファス粉末）のグルコース産生抑制作用を、試験例１における試験方法に従って評価した。スピロラクトンノルジテルペノイド化合物のＤＭＳＯ溶液を培地に添加した場合のＨ４ＩＩＥ細胞からのグルコース放出量を、コントロールとしてＤＭＳＯのみを培地に添加した場合のＨ４ＩＩＥ細胞からのグルコース放出量を１００とした相対値として図２に示す。図２から明らかなように、スピロラクトンノルジテルペノイド化合物は、濃度依存的にグルコース産生抑制作用を示し（ＩＣ５０：１１．７μＭ、ｎ＝６）、１０μＭにおけるグルコース産生抑制作用は、ＢＩＯの１０μＭにおけるグルコース産生抑制作用よりも優れていた。また、１００μＭにおけるグルコース産生抑制作用は、インスリンの０．０１μＭにおけるグルコース産生抑制作用に匹敵した。なお、スピロラクトンノルジテルペノイド化合物は、１００μＭでもＨ４ＩＩＥ細胞に対して毒性を示さなかった（ＭＴＴアッセイによる）。以上の結果から、スピロラクトンノルジテルペノイド化合物は、肝臓におけるグルコース産生抑制作用に基づく、安全性の高い２型糖尿病の予防・治療剤としての効果が期待できることがわかった。
【0024】
参考試験例１：スピロラクトンノルジテルペノイド化合物のＧＳＫ－３β阻害作用
（試験方法）
ヒト組換えＧＳＫ－３βと合成ペプチド基質を用いた化学発光法にて評価した。具体的には、ヒト組換えＧＳＫ－３β（ａｂｃａｍ社）、合成ペプチド基質Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－２（Ｍｅｒｃｋ社）、スピロラクトンノルジテルペノイド化合物のＤＭＳＯ溶液、酵素反応バッファーを、９６ｗｅｌｌホワイトマイクロプレートに加え、総容量が５０μＬ／ｗｅｌｌの検体液とした。この時、ヒト組換えＧＳＫ－３βは３１．２５ｎｇ／ｗｅｌｌ、合成ペプチド基質は２０μＭ、酵素反応バッファーは（８ｍＭ ＭＯＰＳ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５μＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０）とした。スピロラクトンノルジテルペノイド化合物のＤＭＳＯ溶液は２μＬ／ｗｅｌｌ加えた。検体液を３０℃で１８０分間インキュベーションした後、Ｋｉｎａｓｅ－Ｇｌｏ ｐｌｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）より調製したＫｉｎａｓｅ－Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔを４０μＬ／ｗｅｌｌ加えて２５℃で１０分間インキュベーションした。１０分後、マルチプレートリーダーを用いて測定した検体液の相対発光値を、ヒト組換えＧＳＫ－３βと合成ペプチド基質を含まないこと以外は検体液と同じ組成のブランク液の相対発光値から差し引いた値から、スピロラクトンノルジテルペノイド化合物のＤＭＳＯ溶液のかわりにＤＭＳＯのみを加えたコントロール液の相対発光値を、ヒト組換えＧＳＫ－３βと合成ペプチド基質を含まないこと以外はコントロール液と同じ組成のブランク液の相対発光値から差し引いた値を１００とした相対値を算出し、ＧＳＫ－３β酵素活性とした。ポジティブコントロールとして用いたＴＤＺＤ－８（４－Ｂｅｎｚｙｌ－２－ｍｅｔｈｙｌ－１，２，４－ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ－３，５－ｄｉｏｎｅ）のこの試験方法によるＧＳＫ－３β阻害活性はＩＣ５０：４２．２μＭであった。
（試験方法）
ヒト組換えＧＳＫ－３βと合成ペプチド基質を用いた化学発光法にて評価した。具体的には、ヒト組換えＧＳＫ－３β（ａｂｃａｍ社）、合成ペプチド基質Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－２（Ｍｅｒｃｋ社）、スピロラクトンノルジテルペノイド化合物のＤＭＳＯ溶液、酵素反応バッファーを、９６ｗｅｌｌホワイトマイクロプレートに加え、総容量が５０μＬ／ｗｅｌｌの検体液とした。この時、ヒト組換えＧＳＫ－３βは３１．２５ｎｇ／ｗｅｌｌ、合成ペプチド基質は２０μＭ、酵素反応バッファーは（８ｍＭ ＭＯＰＳ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、５μＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０）とした。スピロラクトンノルジテルペノイド化合物のＤＭＳＯ溶液は２μＬ／ｗｅｌｌ加えた。検体液を３０℃で１８０分間インキュベーションした後、Ｋｉｎａｓｅ－Ｇｌｏ ｐｌｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）より調製したＫｉｎａｓｅ－Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔを４０μＬ／ｗｅｌｌ加えて２５℃で１０分間インキュベーションした。１０分後、マルチプレートリーダーを用いて測定した検体液の相対発光値を、ヒト組換えＧＳＫ－３βと合成ペプチド基質を含まないこと以外は検体液と同じ組成のブランク液の相対発光値から差し引いた値から、スピロラクトンノルジテルペノイド化合物のＤＭＳＯ溶液のかわりにＤＭＳＯのみを加えたコントロール液の相対発光値を、ヒト組換えＧＳＫ－３βと合成ペプチド基質を含まないこと以外はコントロール液と同じ組成のブランク液の相対発光値から差し引いた値を１００とした相対値を算出し、ＧＳＫ－３β酵素活性とした。ポジティブコントロールとして用いたＴＤＺＤ－８（４－Ｂｅｎｚｙｌ－２－ｍｅｔｈｙｌ－１，２，４－ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ－３，５－ｄｉｏｎｅ）のこの試験方法によるＧＳＫ－３β阻害活性はＩＣ５０：４２．２μＭであった。
【0025】
（試験結果）
スピロラクトンノルジテルペノイド化合物は、ＧＳＫ－３β阻害作用を有さなかった（ＩＣ５０：＞４００μＭ、ｎ＝３）。よって、スピロラクトンノルジテルペノイド化合物が有するグルコース産生抑制作用は、２型糖尿病の予防・治療のための標的物質として知られているＣａ２＋シグナル伝達に関わるＧＳＫ－３βと異なる物質を標的とした作用に基づくことがわかった。
スピロラクトンノルジテルペノイド化合物は、ＧＳＫ－３β阻害作用を有さなかった（ＩＣ５０：＞４００μＭ、ｎ＝３）。よって、スピロラクトンノルジテルペノイド化合物が有するグルコース産生抑制作用は、２型糖尿病の予防・治療のための標的物質として知られているＣａ２＋シグナル伝達に関わるＧＳＫ－３βと異なる物質を標的とした作用に基づくことがわかった。
【0026】
製剤例１：錠剤
以下の成分組成からなる２型糖尿病の予防・治療のための錠剤を自体公知の方法で製造した。
スピロラクトンノルジテルペノイド化合物 １
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム １９（単位：重量％）
以下の成分組成からなる２型糖尿病の予防・治療のための錠剤を自体公知の方法で製造した。
スピロラクトンノルジテルペノイド化合物 １
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム １９（単位：重量％）
【0027】
製剤例２：ビスケット
以下の成分組成からなる２型糖尿病の予防・治療のためのビスケットを自体公知の方法で製造した。
琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物 １
薄力粉 ３２
全卵 １６
バター １６
砂糖 ２４
水 １０
ベーキングパウダー １（単位：重量％）
以下の成分組成からなる２型糖尿病の予防・治療のためのビスケットを自体公知の方法で製造した。
琥珀の超臨界二酸化炭素抽出物 １
薄力粉 ３２
全卵 １６
バター １６
砂糖 ２４
水 １０
ベーキングパウダー １（単位：重量％）
【産業上の利用可能性】
【0028】
本発明は、天然由来の新規なグルコース産生抑制剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図1】
【図2】
