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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024053409
(43)【公開日】2024-04-15
(54)【発明の名称】リグナン産生能の推定方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/689 20180101AFI20240408BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240408BHJP
C12Q 1/6874 20180101ALI20240408BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/689 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6874 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022159672
(22)【出願日】2022-10-03
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000231637
【氏名又は名称】株式会社ニップン
(71)【出願人】
【識別番号】505314022
【氏名又は名称】国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100100480
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100135839
【弁理士】
【氏名又は名称】大南 匡史
(74)【代理人】
【識別番号】100201455
【弁理士】
【氏名又は名称】横尾 宏治
(72)【発明者】
【氏名】澤根 健人
(72)【発明者】
【氏名】大越 幸太
(72)【発明者】
【氏名】國澤 純
(72)【発明者】
【氏名】細見 晃司
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ03
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS10
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】本発明は、従来に比べて簡便且つ非侵襲的に推定対象者の哺乳類リグナン産生能を推定可能なリグナン産生能の推定方法を提供する。
【解決手段】推定対象者から採取された糞便試料に含まれるRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属からなる群より選択される２以上の細菌の存在比率に基づき、推定対象者の哺乳類リグナン産生能を推定する推定工程を含む方法とする。
【選択図】図１
【解決手段】推定対象者から採取された糞便試料に含まれるRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属からなる群より選択される２以上の細菌の存在比率に基づき、推定対象者の哺乳類リグナン産生能を推定する推定工程を含む方法とする。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
推定対象者から採取された糞便試料に含まれるRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属からなる群より選択される２以上の細菌の存在比率に基づき、前記推定対象者の哺乳類リグナン産生能を推定する推定工程を含む、リグナン産生能の推定方法。
【請求項2】
過去の被験者における前記存在比率を含む腸内細菌叢データと、前記過去の被験者における植物リグナンを摂取したときのエンテロラクトンの産生能の有無に関するデータを含む分類データとのデータセットを、教師データとして機械学習し、判別モデルを作成する機械学習工程をさらに含み、
前記推定工程では、前記判別モデルを用いて、前記推定対象者の前記エンテロラクトンの産生能の有無を推定する、請求項１に記載のリグナン産生能の推定方法。
前記推定工程では、前記判別モデルを用いて、前記推定対象者の前記エンテロラクトンの産生能の有無を推定する、請求項１に記載のリグナン産生能の推定方法。
【請求項3】
前記機械学習工程では、線形回帰モデル、ロジスティック回帰、ラッソ回帰、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、及びサポートベクターマシンからなる群より選択される少なくとも一つのアルゴリズムで機械学習する、請求項２に記載のリグナン産生能の推定方法。
【請求項4】
前記機械学習工程では、ランダムフォレストで機械学習する、請求項３に記載のリグナン産生能の推定方法。
【請求項5】
前記推定工程では、前記２以上の細菌の存在比率の合計値を用いて、エンテロラクトンの産生能の有無を推定する、請求項１に記載のリグナン産生能の推定方法。
【請求項6】
前記２以上の細菌の存在比率は、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域を対象にして前記糞便試料を解析して得られた全リードデータの中から無作為に１００００リードを抽出し、抽出した１００００リード当たりのそれぞれの細菌のリード数である、請求項１～５のいずれか１項に記載のリグナン産生能の推定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、推定対象者の哺乳類リグナン産生能を推定する推定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
植物リグナンは、摂取後、腸内でＤＤＳＩ（didemethyl-secoisolariciresinol）、エンテロジオール（enterodiol、以下、ＥＤともいう）、エンテロラクトン（enterolactone、以下、ＥＬともいう）の順に代謝されることが知られている。
なお、植物リグナンは、セサミン（sesamin）、ヒドロキシマタイレシノール（hydroxymatairesinol）、マタイレシノール（matairesinol）、セコイソラリシレシノール（secoisolariciresinol、以下、ＳＥＣＯともいう）、シリンガレシノール（syringaresinol）、アークチゲニン（arctigenin）、ラリシレシノール（lariciresinol）、ピノレシノール（pinoresinol）等、及びこれらの配糖体の総称である。
なお、植物リグナンは、セサミン（sesamin）、ヒドロキシマタイレシノール（hydroxymatairesinol）、マタイレシノール（matairesinol）、セコイソラリシレシノール（secoisolariciresinol、以下、ＳＥＣＯともいう）、シリンガレシノール（syringaresinol）、アークチゲニン（arctigenin）、ラリシレシノール（lariciresinol）、ピノレシノール（pinoresinol）等、及びこれらの配糖体の総称である。
【0003】
これら代謝物のうち、エンテロジオールとエンテロラクトンは、哺乳類リグナンと呼ばれており、特にエンテロラクトンは、体内でエストロゲン受容体へ結合することで女性ホルモン様作用を発揮し、女性ホルモンの増減に起因する各種症状（更年期症状、月経前症候群など）の緩和などに有効である可能性が示唆されている。
このことから、植物リグナンの健康機能性を享受する上で、植物リグナンを摂取したときに、植物リグナンからエンテロラクトンへ代謝できることが非常に重要である。
このことから、植物リグナンの健康機能性を享受する上で、植物リグナンを摂取したときに、植物リグナンからエンテロラクトンへ代謝できることが非常に重要である。
【0004】
植物リグナンからエンテロラクトンへの代謝は、腸管管腔内の腸内細菌によって進むことが知られている。
腸内細菌叢は、これを構成する細菌の種類や構成比が個人によって大きく異なることから、腸内細菌叢の違いに伴ってエンテロラクトンへの代謝能が一人一人異なる可能性が示唆されている。
これまでの研究により、Eggerthella lenta、Blautia producta、Gordonibacter pamelaeae、Lactonifactor longoviformis等の腸内細菌が、植物リグナンのエンテロラクトンへの代謝に関与していることが明らかにされている（非特許文献１）。
なお、本発明に関連する公報として、例えば、特許文献１がある。
腸内細菌叢は、これを構成する細菌の種類や構成比が個人によって大きく異なることから、腸内細菌叢の違いに伴ってエンテロラクトンへの代謝能が一人一人異なる可能性が示唆されている。
これまでの研究により、Eggerthella lenta、Blautia producta、Gordonibacter pamelaeae、Lactonifactor longoviformis等の腸内細菌が、植物リグナンのエンテロラクトンへの代謝に関与していることが明らかにされている（非特許文献１）。
なお、本発明に関連する公報として、例えば、特許文献１がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特表２０２０－５２６５４１号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Bess EN et al., "Genetic basis for the cooperative bioactivation of plant lignans by Eggerthella lenta and other human gut bacteria", Nature Microbiology, 5, 56-66 (2020)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、上記の細菌を腸内で保有していることが、直接その人のエンテロラクトンへの代謝能を決定するという報告はされておらず、代謝能と腸内細菌叢の関係については、未だ不明な点が多い。
そのため，従来から、特定の被験者が植物リグナンをエンテロラクトンに代謝できるか否かを調べるには、当該特定の個人から血液検体あるいは尿検体を回収し、検体に含まれるエンテロラクトンを機器分析にて検出することによって行われている。
しかしながら、臨床試験の設計・運営、検体採取、精密機器を使用した分析など多くの作業が必要となり、前記特定の個人、調査担当者ともに負担が大きい。従って、より簡便に植物リグナンのエンテロラクトン産生能を推定できる方法が求められていた。
そのため，従来から、特定の被験者が植物リグナンをエンテロラクトンに代謝できるか否かを調べるには、当該特定の個人から血液検体あるいは尿検体を回収し、検体に含まれるエンテロラクトンを機器分析にて検出することによって行われている。
しかしながら、臨床試験の設計・運営、検体採取、精密機器を使用した分析など多くの作業が必要となり、前記特定の個人、調査担当者ともに負担が大きい。従って、より簡便に植物リグナンのエンテロラクトン産生能を推定できる方法が求められていた。
【0008】
そこで、本発明は、従来に比べて簡便且つ非侵襲的に推定対象者の哺乳類リグナン産生能を推定可能なリグナン産生能の推定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記した課題を解決するために、本発明者が機械学習を用いて腸内細菌叢とエンテロラクトン産生能の関係について分析したところ、糞便試料に含まれる細菌の存在比率がエンテロラクトン産生能に密接に関連することを発見した。
そこで、本発明者がこの発見を元に鋭意検討したところ、特定の細菌の存在比率が支配的にエンテロラクトン産生能に大きく影響を与えることを見出し、本発明に至った。
そこで、本発明者がこの発見を元に鋭意検討したところ、特定の細菌の存在比率が支配的にエンテロラクトン産生能に大きく影響を与えることを見出し、本発明に至った。
【0010】
本発明の一つの様相は、推定対象者から採取された糞便試料に含まれるRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属からなる群より選択される２以上の細菌の存在比率に基づき、前記推定対象者の哺乳類リグナン産生能を推定する推定工程を含む、リグナン産生能の推定方法である。
【0011】
ここでいう「推定対象者」とは、本発明の推定方法による推定対象であり、推定方法を使用して哺乳類リグナン産生能が推定される被験者をいう。
【0012】
本様相によれば、推定対象者は、糞便試料を調べるだけで、哺乳類リグナンを摂取した場合の哺乳類リグナン産生能を推定できるので、従来に比べて簡便且つ非侵襲的に推定対象者の哺乳類リグナン産生能を推定可能である。
【0013】
好ましい様相は、過去の被験者における前記存在比率を含む腸内細菌叢データと、前記過去の被験者における植物リグナンを摂取したときのエンテロラクトンの産生能の有無に関するデータを含む分類データとのデータセットを、教師データとして機械学習し、判別モデルを作成する機械学習工程をさらに含み、前記推定工程では、前記判別モデルを用いて、前記推定対象者の前記エンテロラクトンの産生能の有無を推定する。
【0014】
ここでいう「過去の被験者」とは、過去に医療機関や研究所等で腸内細菌叢データやエンテロラクトンの産生能の有無の測定・判断がなされた被験者である。
【0015】
本様相によれば、推定対象者は、過去の被験者のデータセットから得られた判別モデルを用いて推定対象者のエンテロラクトンの産生能の有無を推定するので、より正確にエンテロラクトンの産生能の有無を推定できる。
【0016】
より好ましい様相は、前記機械学習工程では、線形回帰モデル、ロジスティック回帰、ラッソ回帰、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、及びサポートベクターマシンからなる群より選択される少なくとも一つのアルゴリズムで機械学習する。
【0017】
本様相によれば、分類評価が可能な教師あり学習が可能であり、エンテロラクトンの産生能の有無を判別しやすい。
【0018】
さらに好ましい様相は、前記機械学習工程では、ランダムフォレストで機械学習する。
【0019】
本様相によれば、データにノイズが多くても精度良く学習でき、データ数が多くてもより高速な学習と識別が可能である。
【0020】
好ましい様相は、前記推定工程では、前記２以上の細菌の存在比率の合計値を用いて、エンテロラクトンの産生能の有無を推定する。
【0021】
本様相によれば、Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属のうち少なくとも２種の細菌の存在比率の合計値が算出できれば、エンテロラクトンの産生能の有無を判別できるので、エンテロラクトンの産生能の有無を容易に判別できる。
【0022】
好ましい様相は、前記２以上の細菌の存在比率は、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域を対象にして前記糞便試料を解析して得られた全リードデータの中から無作為に１００００リードを抽出し、抽出した１００００リード当たりに占めるそれぞれの細菌のリード数の比率である。
【0023】
本様相によれば、推定対象者の糞便試料ごとに総リード数が異なっていても、推定対象者間で腸内細菌叢の組成を横並びで評価することができる。
【発明の効果】
【0024】
本発明によれば、従来に比べて簡便且つ非侵襲的に推定対象者の哺乳類リグナン産生能を推定可能である。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】本発明の実施例１の第１判別モデルにおいて各細菌を重要度が高い順に並べたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0026】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【0027】
本発明の第１実施形態の推定方法は、推定対象者の糞便試料から哺乳類リグナン産生能を推定するものであり、主に、前処理工程と、機械学習工程と、推定工程によって構成されている。
【0028】
（前処理工程）
前処理工程は、機械学習工程で使用するデータを作成する工程であり、試料採取工程と、腸内細菌叢データ作成工程と、第１分類データ作成工程と、第１データセット作成工程を含んでいる。
前処理工程は、機械学習工程で使用するデータを作成する工程であり、試料採取工程と、腸内細菌叢データ作成工程と、第１分類データ作成工程と、第１データセット作成工程を含んでいる。
【0029】
具体的には、前処理工程は、まず１００名以上の被験者を、腸内細菌により哺乳類リグナンを生成する植物リグナンを所定量、所定期間摂取した被験者で構成される各被験者から糞便試料と血液試料を採取する（試料採取工程）。
なお、植物リグナン及び哺乳類リグナンの詳細については、後述する。
なお、植物リグナン及び哺乳類リグナンの詳細については、後述する。
【0030】
採取した糞便試料からＤＮＡ抽出を行い、抽出したＤＮＡから１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づいたマイクロバイオーム解析を行い、腸内細菌叢における各細菌の存在比率を算出し、各細菌の存在比率を含む腸内細菌叢データを作成する（腸内細菌叢データ作成工程）。
【0031】
このとき、細菌の存在比率は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の解析から得られた全リードデータから無作為に１００００リードをピックアップし、その１００００リード内における各種細菌のリード数を算出して１００００リード当たりの存在比率を示す数値データに変換することが好ましい。
また、腸内細菌叢データは、少なくとも腸内細菌叢における少なくともRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属の存在比率を含んでいる。
また、腸内細菌叢データは、少なくとも腸内細菌叢における少なくともRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属の存在比率を含んでいる。
【0032】
また、採取した血液試料から、血清を採取し、ＬＣ－ＭＳＭＳ分析により、エンテロラクトン（以下、単にＥＬともいう）又はエンテロラクトングルクロン酸抱合体（以下、単にＥＬＧｌｕともいう）が含まれるかどうかによってエンテロラクトンの産生能（以下、ＥＬ産生能ともいう）を分類し、ＥＬ産生能の有無に関するデータを含む分類データを作成した（第１分類データ作成工程）。
ここで、ＥＬ産生能の有無は、血液試料中にＥＬ及び／又はＥＬＧｌｕを検出した被験者を「ＥＬ産生能あり」と分類し、血液試料中にＥＬ及びＥＬＧｌｕのいずれも検出しなかった被験者を「ＥＬ産生能なし」と分類した。
ここで、ＥＬ産生能の有無は、血液試料中にＥＬ及び／又はＥＬＧｌｕを検出した被験者を「ＥＬ産生能あり」と分類し、血液試料中にＥＬ及びＥＬＧｌｕのいずれも検出しなかった被験者を「ＥＬ産生能なし」と分類した。
【0033】
そして、腸内細菌叢データ作成工程で作成された腸内細菌叢データと、第１分類データ作成工程で作成された分類データを紐付けしてデータセットにして、データセットＡ１を作成した（第１データセット作成工程）。
【0034】
（機械学習工程）
機械学習工程は、前処理工程で作成されたデータセットＡ１を用いて機械学習し、学習モデルを生成する工程であり、第１データセット分割工程と、第１判別モデル作成工程と、第１検証工程と、重要度選別工程と、第２分類データ作成工程と、第２データセット作成工程と、第２判別モデル作成工程と、第２検証工程を含んでいる。
機械学習工程は、前処理工程で作成されたデータセットＡ１を用いて機械学習し、学習モデルを生成する工程であり、第１データセット分割工程と、第１判別モデル作成工程と、第１検証工程と、重要度選別工程と、第２分類データ作成工程と、第２データセット作成工程と、第２判別モデル作成工程と、第２検証工程を含んでいる。
【0035】
具体的には、機械学習工程は、まず、データセットＡ１について、所定の割合で学習用データセットＴ１－１と、検証用データセットＴ１－２に分割した（第１データセット分割工程）。
【0036】
このときの学習用データセットＴ１－１と検証用データセットＴ１－２の比率は、特に限定されるものではないが、学習用データセットＴ１－１の比率は、検証用データセットＴ１－２の比率よりも大きいことが好ましい。
【0037】
続いて、学習用データセットＴ１－１から、機械学習アルゴリズムに則して教師あり学習を行い、第１判別モデルＬ１を作成する（第１判別モデル作成工程）。
すなわち、第１判別モデル作成工程では、糞便試料から検出される腸内細菌叢の全細菌の属レベルでの存在比率を含む腸内細菌叢データを説明変数とし、ＥＬ産生能の有無に関するデータを含む分類データを目的変数として機械学習を行い、第１判別モデルＬ１を構築する。
すなわち、第１判別モデル作成工程では、糞便試料から検出される腸内細菌叢の全細菌の属レベルでの存在比率を含む腸内細菌叢データを説明変数とし、ＥＬ産生能の有無に関するデータを含む分類データを目的変数として機械学習を行い、第１判別モデルＬ１を構築する。
【0038】
ここで、「教師あり学習」とは、教師データ、すなわち、ある入力（説明変数）と結果（目的変数）のデータセットにある特徴を学習し、入力から結果を推定するモデル（誤差モデル）、すなわち、入力と結果の関係性を帰納的に獲得するものである。
本実施形態の第１判別モデル作成工程では、入力部と、出力部を有した学習器を使用し、教師データをもとに学習器に機械学習させることによって、入力部に入力された説明変数（腸内細菌叢データ）から出力部から出力される目的変数（分類データ）を算出する学習モデルたる第１判別モデルＬ１を構築する。
第１判別モデル作成工程で使用される機械学習アルゴリズムとしては、分類評価可能な教師あり学習のアルゴリズムであれば、特に限定されるものではない。
第１判別モデル作成工程で使用される機械学習アルゴリズムとしては、例えば、線形回帰モデル（Linear model）、ロジスティック回帰、ラッソ回帰（Lasso）、ランダムフォレスト（RandomForest）、ニューラルネットワーク（Neural net）、線形カーネルのサポートベクターマシン（SVM (linear)）からなる群より選択される少なくとも一つのアルゴリズムが使用でき、その中でも、ランダムフォレストが好ましい。
機械学習アルゴリズムとしてランダムフォレストを使用することで、データにノイズが多くても精度良く学習でき、データ数が多くてもより高速な学習と識別が可能である。
本実施形態の機械学習アルゴリズムは、アンサンブル学習のバギングを基にして多数の決定木モデルを用いて分類を行うランダムフォレストを使用しており、複数の決定木モデルに当てはめ、各決定木モデルの結果に対して多数決で判断を下すものである。
本実施形態の第１判別モデル作成工程では、入力部と、出力部を有した学習器を使用し、教師データをもとに学習器に機械学習させることによって、入力部に入力された説明変数（腸内細菌叢データ）から出力部から出力される目的変数（分類データ）を算出する学習モデルたる第１判別モデルＬ１を構築する。
第１判別モデル作成工程で使用される機械学習アルゴリズムとしては、分類評価可能な教師あり学習のアルゴリズムであれば、特に限定されるものではない。
第１判別モデル作成工程で使用される機械学習アルゴリズムとしては、例えば、線形回帰モデル（Linear model）、ロジスティック回帰、ラッソ回帰（Lasso）、ランダムフォレスト（RandomForest）、ニューラルネットワーク（Neural net）、線形カーネルのサポートベクターマシン（SVM (linear)）からなる群より選択される少なくとも一つのアルゴリズムが使用でき、その中でも、ランダムフォレストが好ましい。
機械学習アルゴリズムとしてランダムフォレストを使用することで、データにノイズが多くても精度良く学習でき、データ数が多くてもより高速な学習と識別が可能である。
本実施形態の機械学習アルゴリズムは、アンサンブル学習のバギングを基にして多数の決定木モデルを用いて分類を行うランダムフォレストを使用しており、複数の決定木モデルに当てはめ、各決定木モデルの結果に対して多数決で判断を下すものである。
【0039】
第１判別モデル作成工程において、第１判別モデルＬ１のＲＯＣカーブ（Receiver Operating Characteristic curve）のＡＵＣ（Area Under the Curve）が０．７以上となると、第１判別モデルＬ１に対して検証用データセットＴ１－２を用い、検証用データセットＴ１－２の各被験者の腸内細菌叢データを入力してＥＬ産生能の有無を算出し、第１判別モデルＬ１の適合性を検証する（第１検証工程）。
第１検証工程にて、ＥＬ産生能の予測結果と実測結果をもとに算出された正解率（Accuracy）及びｋａｐｐａ係数がそれぞれ所定の基準以上の場合には、重要度選別工程に移行し、正解率（Accuracy）又はｋａｐｐａ係数が所定の基準未満の場合には、第１判別モデル作成工程に戻って再度第１判別モデルＬ１を作成する。
第１検証工程にて、ＥＬ産生能の予測結果と実測結果をもとに算出された正解率（Accuracy）及びｋａｐｐａ係数がそれぞれ所定の基準以上の場合には、重要度選別工程に移行し、正解率（Accuracy）又はｋａｐｐａ係数が所定の基準未満の場合には、第１判別モデル作成工程に戻って再度第１判別モデルＬ１を作成する。
【0040】
このときの正解率の基準は、７０％以上の値であることが好ましい。
このときのｋａｐｐａ係数の基準は、０．４以上の値であることが好ましい。
このときのｋａｐｐａ係数の基準は、０．４以上の値であることが好ましい。
【0041】
続いて、第１判別モデルＬ１における各細菌の重要度によって並び替えを行い、所定のスコア以上の細菌を選別する（重要度選別工程）。
【0042】
このときの所定のスコアは、５０以上の値であることが好ましい。
例えば、図１の場合では、Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属のスコアがこの順に５０以上となって上位を占めているため、Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属が選別される。
例えば、図１の場合では、Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属のスコアがこの順に５０以上となって上位を占めているため、Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属が選別される。
【0043】
続いて、腸内細菌叢データの中から重要度選別工程で選別された細菌、すなわち、Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属の存在比率を抽出し、残りの細菌の存在比率を含まない特定細菌叢データを作成し、当該特定細菌叢データと分類データのデータセットＡ２を作成する（第２分類データ作成工程）。
【0044】
そして、データセットＡ２を学習用データセットＴ２－１と検証用データセットＴ２－２に分割した（第２データセット作成工程）。
【0045】
このときの学習用データセットＴ２－１と検証用データセットＴ２－２の比率は、特に限定されるものではないが、学習用データセットＴ２－１の比率は、検証用データセットＴ２－２の比率よりも大きいことが好ましい。
【0046】
続いて、学習用データセットＴ２－１を用いて機械学習アルゴリズムに則して教師あり学習を行い、第２判別モデルＬ２を作成する（第２判別モデル作成工程）。
【0047】
すなわち、第２判別モデル作成工程は、学習用データセットＴ２－１のRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属の存在比率を含む特定細菌叢データを説明変数とし、分類データを目的変数として機械学習を行い、学習モデルたる第２判別モデルＬ２を構築する。
【0048】
特定細菌叢データは、Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属のみの存在比率を含み、他の細菌の存在比率を含まないデータである。
第２判別モデル作成工程で使用される機械学習アルゴリズムとしては、分類評価可能な教師あり学習アルゴリズムであれば、特に限定されるものではない。例えば、線形回帰モデル（Linear model）、ロジスティック回帰、ラッソ回帰（Lasso）、ランダムフォレスト（RandomForest）、ニューラルネットワーク（Neural net）、線形カーネルのサポートベクターマシン（SVM (linear)）からなる群より選択される少なくとも一つのアルゴリズムが使用でき、その中でもランダムフォレストが好ましい。
本実施形態の機械学習アルゴリズムは、アンサンブル学習のバギングを基にして多数の決定木モデルを用いて分類を行うランダムフォレストを使用しており、複数の決定木モデルに当てはめ、各決定木モデルの結果に対して多数決で判断を下すものである。
第２判別モデル作成工程で使用される機械学習アルゴリズムとしては、分類評価可能な教師あり学習アルゴリズムであれば、特に限定されるものではない。例えば、線形回帰モデル（Linear model）、ロジスティック回帰、ラッソ回帰（Lasso）、ランダムフォレスト（RandomForest）、ニューラルネットワーク（Neural net）、線形カーネルのサポートベクターマシン（SVM (linear)）からなる群より選択される少なくとも一つのアルゴリズムが使用でき、その中でもランダムフォレストが好ましい。
本実施形態の機械学習アルゴリズムは、アンサンブル学習のバギングを基にして多数の決定木モデルを用いて分類を行うランダムフォレストを使用しており、複数の決定木モデルに当てはめ、各決定木モデルの結果に対して多数決で判断を下すものである。
【0049】
第２判別モデル作成工程において第２判別モデルＬ２のＲＯＣカーブのＡＵＣが０．７以上となると、第２判別モデルＬ２に対して検証用データセットＴ２－２の特定細菌叢データを入力してＥＬ産生能の有無を算出し、第２判別モデルＬ２の適合性を検証する（第２検証工程）。
第２検証工程にて、ＥＬ産生能の予測結果と実測結果をもとに算出された正解率（Accuracy）及びｋａｐｐａ係数がそれぞれ所定の基準以上の場合には、機械学習工程を終了して推定工程に移行し、正解率（Accuracy）及びｋａｐｐａ係数が所定の基準未満の場合には、第２判別モデル作成工程に戻って再度第２判別モデルＬ２を作成する。
第２検証工程にて、ＥＬ産生能の予測結果と実測結果をもとに算出された正解率（Accuracy）及びｋａｐｐａ係数がそれぞれ所定の基準以上の場合には、機械学習工程を終了して推定工程に移行し、正解率（Accuracy）及びｋａｐｐａ係数が所定の基準未満の場合には、第２判別モデル作成工程に戻って再度第２判別モデルＬ２を作成する。
【0050】
このときの正解率の基準は、７０％以上の値であることが好ましい。
このときのｋａｐｐａ係数の基準は、０．４以上の値であることが好ましい。
このときのｋａｐｐａ係数の基準は、０．４以上の値であることが好ましい。
【0051】
（推定工程）
推定工程は、機械学習工程で作成した第２判別モデルＬ２を用いて、未知の推定対象者の糞便試料から検出される特定細菌叢データからＥＬ産生能の有無を判別する。
すなわち、推定対象者から採取した糞便試料からＤＮＡ抽出を行い、抽出したＤＮＡから１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づいたマイクロバイオーム解析を行って、腸内細菌叢におけるRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属の存在比率を算出して特定細菌叢データを作成し、第２判別モデルＬ２に入力してＥＬ産生能の有無を判別する。
推定工程は、機械学習工程で作成した第２判別モデルＬ２を用いて、未知の推定対象者の糞便試料から検出される特定細菌叢データからＥＬ産生能の有無を判別する。
すなわち、推定対象者から採取した糞便試料からＤＮＡ抽出を行い、抽出したＤＮＡから１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づいたマイクロバイオーム解析を行って、腸内細菌叢におけるRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属の存在比率を算出して特定細菌叢データを作成し、第２判別モデルＬ２に入力してＥＬ産生能の有無を判別する。
【0052】
最後に、植物リグナンと哺乳類リグナンについて説明する。
【0053】
植物リグナンは、フェニルアラニンを出発物質とし、モノマー単位の前駆体（例えば、桂皮酸、コーヒー酸、フェルラ酸、クマル酸、及び没食子酸）がカップリングすることによって形成されるものである。
具体的には、植物リグナンは、モノリグノールである置換ケイ皮アルコールの二量化反応（置換ケイ皮アルコール側鎖のβ位同士の酸化的縮合）によって生成する２，３－ジベンジルブタン骨格を有するポリフェノール性物質の一群である。
植物リグナンは、植物の様々な部位（根、葉、茎、種、果実）に局在している。
植物リグナンは、種子や果実等において、多くの場合植物を構成する繊維成分と結合したグリコシド接合体として存在している。
植物リグナンとして、セサミン（sesamin）、ヒドロキシマタイレシノール（hydroxymatairesinol）、マタイレシノール（matairesinol）、セコイソラリシレシノール（secoisolariciresinol、以下、ＳＥＣＯともいう）、シリンガレシノール（syringaresinol）、アークチゲニン（arctigenin）、ラリシレシノール（lariciresinol）、ピノレシノール（pinoresinol）等、及びそれらの配糖体が知られている。
例えば、セコイソラリシレシノールでは、セコイソラリシレシノールジグルコシド（secoisolariciresinol diglucoside、以下、ＳＤＧともいう）及びセコイソラリシレシノールモノグルコシド（secoisolariciresinol monoglucoside、以下、ＳＭＧともいう）がある。
これらは、アマ、ゴマ、カボチャ、ヒマワリ、ラッカセイ、ダイズ等の種子；小麦、ライ麦、大麦、オーツ麦等の穀物；ブラックベリー、クランベリー、イチゴ等の果実；ブロッコリー等の緑黄色野菜など様々な作物に含まれている。
亜麻科植物アマ（学名：Linum usitatissimum）の種子であるアマニには、ＳＤＧが豊富に含まれており、マタイレシノール、ピノレシノール、イソラリシレシノール及びこれらの配糖体等が少量含まれている。
ゴマ科植物ゴマ（学名: Sesamum indicum）には、セサミン、ピノレシノール、マタイレシノール及びこれらの配糖体が含まれている。
本実施形態の植物リグナンは、特に限定されるものではなく、上記したような公知の植物リグナンであればよい。
植物リグナンの定義には、上記した化合物の任意の幾何異性体又は立体異性体又は異性体の任意の混合物（例えば、ラセミ体）を含み、上記した化合物の塩、付加物及び複合体も含む。
具体的には、植物リグナンは、モノリグノールである置換ケイ皮アルコールの二量化反応（置換ケイ皮アルコール側鎖のβ位同士の酸化的縮合）によって生成する２，３－ジベンジルブタン骨格を有するポリフェノール性物質の一群である。
植物リグナンは、植物の様々な部位（根、葉、茎、種、果実）に局在している。
植物リグナンは、種子や果実等において、多くの場合植物を構成する繊維成分と結合したグリコシド接合体として存在している。
植物リグナンとして、セサミン（sesamin）、ヒドロキシマタイレシノール（hydroxymatairesinol）、マタイレシノール（matairesinol）、セコイソラリシレシノール（secoisolariciresinol、以下、ＳＥＣＯともいう）、シリンガレシノール（syringaresinol）、アークチゲニン（arctigenin）、ラリシレシノール（lariciresinol）、ピノレシノール（pinoresinol）等、及びそれらの配糖体が知られている。
例えば、セコイソラリシレシノールでは、セコイソラリシレシノールジグルコシド（secoisolariciresinol diglucoside、以下、ＳＤＧともいう）及びセコイソラリシレシノールモノグルコシド（secoisolariciresinol monoglucoside、以下、ＳＭＧともいう）がある。
これらは、アマ、ゴマ、カボチャ、ヒマワリ、ラッカセイ、ダイズ等の種子；小麦、ライ麦、大麦、オーツ麦等の穀物；ブラックベリー、クランベリー、イチゴ等の果実；ブロッコリー等の緑黄色野菜など様々な作物に含まれている。
亜麻科植物アマ（学名：Linum usitatissimum）の種子であるアマニには、ＳＤＧが豊富に含まれており、マタイレシノール、ピノレシノール、イソラリシレシノール及びこれらの配糖体等が少量含まれている。
ゴマ科植物ゴマ（学名: Sesamum indicum）には、セサミン、ピノレシノール、マタイレシノール及びこれらの配糖体が含まれている。
本実施形態の植物リグナンは、特に限定されるものではなく、上記したような公知の植物リグナンであればよい。
植物リグナンの定義には、上記した化合物の任意の幾何異性体又は立体異性体又は異性体の任意の混合物（例えば、ラセミ体）を含み、上記した化合物の塩、付加物及び複合体も含む。
【0054】
哺乳類リグナンは、植物リグナンから腸内細菌により代謝産生され、エストロゲン様作用を有する代謝産物である。
すなわち、植物リグナンは、それ自体がエストロゲン様作用の役割を果たすものではないが、腸内細菌の代謝によりセコイソラリシレシノール（ＳＥＣＯ）及びＤＤＳＩ等の中間代謝物を経てエンテロジオール（ＥＤ）ないしはエンテロラクトン（ＥＬ）に変換され、エストロゲン様作用を発揮するようになる。
哺乳類リグナンは、特に制限されるものではなく、植物リグナン起源であってエストロゲン様作用を有する代謝産物であればよく、好ましくはエンテロラクトン又はそれらの抱合体である。
哺乳類リグナン抱合体を形成する水溶性物質としては、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上が挙げられる。アミノ酸としては、生体内に存在するアミノ酸、例えば必須アミノ酸が挙げられる。
哺乳類リグナンは、経口投与などによって直接摂取する以外にも、セサミン、ヒドロキシマタイレシノール、マタイレシノール、セコイソラリシレシノール（ＳＥＣＯ）、セコイソラリシレシノールジグルコシド（ＳＤＧ）、シリンガレシノール、アークチゲニン、ラリシレシノール、ピノレシノール等の植物リグナンを含有する食品等を経口摂取することで、腸内細菌による代謝を介して体内の哺乳類リグナン量を増加させることができる。
哺乳類リグナンの定義には、上記した化合物の任意の幾何異性体又は立体異性体又は異性体の任意の混合物（例えばラセミ体）を含み、上記した化合物の塩、付加物及び複合体も含む。
すなわち、植物リグナンは、それ自体がエストロゲン様作用の役割を果たすものではないが、腸内細菌の代謝によりセコイソラリシレシノール（ＳＥＣＯ）及びＤＤＳＩ等の中間代謝物を経てエンテロジオール（ＥＤ）ないしはエンテロラクトン（ＥＬ）に変換され、エストロゲン様作用を発揮するようになる。
哺乳類リグナンは、特に制限されるものではなく、植物リグナン起源であってエストロゲン様作用を有する代謝産物であればよく、好ましくはエンテロラクトン又はそれらの抱合体である。
哺乳類リグナン抱合体を形成する水溶性物質としては、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン及びアミノ酸から選ばれる１種以上が挙げられる。アミノ酸としては、生体内に存在するアミノ酸、例えば必須アミノ酸が挙げられる。
哺乳類リグナンは、経口投与などによって直接摂取する以外にも、セサミン、ヒドロキシマタイレシノール、マタイレシノール、セコイソラリシレシノール（ＳＥＣＯ）、セコイソラリシレシノールジグルコシド（ＳＤＧ）、シリンガレシノール、アークチゲニン、ラリシレシノール、ピノレシノール等の植物リグナンを含有する食品等を経口摂取することで、腸内細菌による代謝を介して体内の哺乳類リグナン量を増加させることができる。
哺乳類リグナンの定義には、上記した化合物の任意の幾何異性体又は立体異性体又は異性体の任意の混合物（例えばラセミ体）を含み、上記した化合物の塩、付加物及び複合体も含む。
【0055】
第１実施形態の推定方法によれば、推定対象者は、糞便試料を調べるだけで、哺乳類リグナンを摂取した場合の哺乳類リグナン産生能を推定できるので、従来に比べて簡便且つ非侵襲的に推定対象者の哺乳類リグナン産生能を推定可能である。
【0056】
第１実施形態の推定方法によれば、推定対象者は、過去の被験者のデータセットから得られた学習モデルである第２判別モデルＬ２を用いてエンテロラクトンの産生能の有無を推定するので、より正確にエンテロラクトンの産生能の有無を推定できる。
【0057】
第１実施形態の推定方法によれば、細菌の存在比率を、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域を対象にして糞便試料を解析して得られた全リードデータの中から無作為に１００００リードを抽出し、抽出した１００００リード当たりのそれぞれの細菌のリード数で算出するため、推定対象者の糞便試料ごとに総リード数が異なっていても、推定対象者間で腸内細菌叢の組成を横並びで評価することができる。
【0058】
上記した実施形態では、第２判別モデルＬ２を用いて推定対象者の糞便試料の特定細菌叢データからＥＬ産生能の有無を判別したが、本発明はこれに限定されるものではなく、第２判別モデルＬ２を用いずに推定対象者のＥＬ産生能の有無を判別してもよい。
以下、本発明の第２実施形態の推定方法として詳細に説明する。
以下、本発明の第２実施形態の推定方法として詳細に説明する。
【0059】
第２実施形態の推定方法は、推定対象者の糞便試料からRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属のうち少なくとも２種の細菌の存在比率を算出し、各存在比率の合計値を基準値と比較する。そして、基準値以上の場合にはＥＬ産生能ありとし、基準値未満の場合にはＥＬ産生能なしとして判別する。
【0060】
このときの基準値は、２種類の場合において、０．０２超過であることが好ましく、０．０５以上であることがより好ましい。
また基準値は、２種類の場合において、０．５０未満であることが好ましく、０．２０以下であることがより好ましい。
このときの基準値は、３種類の場合において、０．１超過であることが好ましく、０．２以上であることがより好ましく、０．７以上であることがさらに好ましい。
また基準値は、３種類の場合において、２未満であることが好ましく、１．５以下であることがより好ましく、１．０以下でさらにあることがより好ましい。
また基準値は、２種類の場合において、０．５０未満であることが好ましく、０．２０以下であることがより好ましい。
このときの基準値は、３種類の場合において、０．１超過であることが好ましく、０．２以上であることがより好ましく、０．７以上であることがさらに好ましい。
また基準値は、３種類の場合において、２未満であることが好ましく、１．５以下であることがより好ましく、１．０以下でさらにあることがより好ましい。
【0061】
第２実施形態の推定方法によれば、Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属のうち少なくとも２種の細菌の存在比率が算出できれば、ＥＬ産生能の有無を判別できるので、ＥＬ産生能の有無を容易に判別できる。
【0062】
上記した第１実施形態では、第１判別モデルＬ１の適合性を確認するために第１検証工程を行い、第２判別モデルＬ２の適合性を確認するために第２検証工程を行ったが、本発明はこれに限定されるものではない。第１検証工程及び／又は第２検証工程を省略してもよい。
【0063】
上記した第１実施形態では、第１判別モデル作成工程と第２判別モデル作成工程において、ともに機械学習アルゴリズムとしてランダムフォレストに固定していたが、本発明はこれに限定されるものではない。
第１検証工程及び第２検証工程にて最も適合性が高い機械学習アルゴリズムによって作成された学習モデルを判別モデルＬ１，Ｌ２としてもよい。
例えば、第１判別モデルＬ１は、検証用データセットＴ１－２を用いたエンテロラクトンの産生能の有無に関する予測値の実測値に対する正解率（Accuracy）が最も大きい学習モデルを使用してもよい。
すなわち、上記した第１実施形態では、第１判別モデルＬ１の機械学習アルゴリズムとしてランダムフォレストを使用しているが、他の機械学習アルゴリズムの方が、ランダムフォレストよりも正解率が高い場合には、第１判別モデルＬ１として他の機械学習アルゴリズムを用いた学習モデルを使用してもよい。
同様に、第２判別モデルＬ２は、検証用データセットＴ２－２を用いたエンテロラクトンの産生能の有無に関する予測値の実測値に対する正解率（Accuracy）が最も大きいモデルを使用してもよい。
すなわち、上記した第１実施形態では、第２判別モデルＬ２の機械学習アルゴリズムとしてランダムフォレストを使用しているが、他の機械学習アルゴリズムの方が、ランダムフォレストよりも正解率が高い場合には、第２判別モデルＬ２として他の機械学習アルゴリズムを用いた学習モデルを使用してもよい。
第１検証工程及び第２検証工程にて最も適合性が高い機械学習アルゴリズムによって作成された学習モデルを判別モデルＬ１，Ｌ２としてもよい。
例えば、第１判別モデルＬ１は、検証用データセットＴ１－２を用いたエンテロラクトンの産生能の有無に関する予測値の実測値に対する正解率（Accuracy）が最も大きい学習モデルを使用してもよい。
すなわち、上記した第１実施形態では、第１判別モデルＬ１の機械学習アルゴリズムとしてランダムフォレストを使用しているが、他の機械学習アルゴリズムの方が、ランダムフォレストよりも正解率が高い場合には、第１判別モデルＬ１として他の機械学習アルゴリズムを用いた学習モデルを使用してもよい。
同様に、第２判別モデルＬ２は、検証用データセットＴ２－２を用いたエンテロラクトンの産生能の有無に関する予測値の実測値に対する正解率（Accuracy）が最も大きいモデルを使用してもよい。
すなわち、上記した第１実施形態では、第２判別モデルＬ２の機械学習アルゴリズムとしてランダムフォレストを使用しているが、他の機械学習アルゴリズムの方が、ランダムフォレストよりも正解率が高い場合には、第２判別モデルＬ２として他の機械学習アルゴリズムを用いた学習モデルを使用してもよい。
【0064】
上記した第１実施形態では、第１判別モデル作成工程において第１判別モデルＬ１のＲＯＣカーブのＡＵＣが０．７以上となると、第１検証工程に移行していたが、本発明はこれに限定されるものではなく、第１判別モデル作成工程から第１検証工程への移行する基準は特に限定されない。十分な精度があることが確認できれば、ＡＵＣが０．７以下でも第１判別モデル作成工程から第１検証工程に移行してもよい。
同様に、第２判別モデル作成工程において第２判別モデルＬ２のＲＯＣカーブのＡＵＣが０．７以上となると、第２検証工程に移行していたが、本発明はこれに限定されるものではなく、第２判別モデル作成工程から第２検証工程への移行する基準は特に限定されない。十分な精度があることが確認できれば、ＡＵＣが０．７以下でも第１判別モデル作成工程から第２検証工程に移行してもよい。
同様に、第２判別モデル作成工程において第２判別モデルＬ２のＲＯＣカーブのＡＵＣが０．７以上となると、第２検証工程に移行していたが、本発明はこれに限定されるものではなく、第２判別モデル作成工程から第２検証工程への移行する基準は特に限定されない。十分な精度があることが確認できれば、ＡＵＣが０．７以下でも第１判別モデル作成工程から第２検証工程に移行してもよい。
【0065】
上記した第２実施形態では、Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属のうち少なくとも２種の細菌の存在比率の合計値を基準値と比較したが、本発明はこれに限定されるものではない。細菌の存在比率の乗算値を基準値と比較してもよい。
【0066】
本開示は、推定対象者から採取された糞便試料に含まれるRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属からなる群より選択される２以上の細菌の存在比率に基づき、前記推定対象者の哺乳類リグナン産生能を推定するための情報を取得する方法、並びに、当該情報を提供する方法を包含する。
【0067】
上記した実施形態は、本発明の技術的範囲に含まれる限り、各実施形態間で各構成要素を自由に置換や付加できる。
【実施例0068】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【0069】
（実施例１）
実施例１の推定方法は、第１実施形態と同様、主に前処理工程と学習モデル生成工程と推定工程で構成されている。
実施例１の推定方法は、第１実施形態と同様、主に前処理工程と学習モデル生成工程と推定工程で構成されている。
【0070】
（前処理工程）
＜データ処理と統計解析＞
データの処理と統計解析は、特に記載がない限り、統計解析ソフトであるＲを使用した。解析に使用したパッケージは、すべてＣＲＡＮ（https://cran.r-project.org/）に公開されているものを使用した。
＜データ処理と統計解析＞
データの処理と統計解析は、特に記載がない限り、統計解析ソフトであるＲを使用した。解析に使用したパッケージは、すべてＣＲＡＮ（https://cran.r-project.org/）に公開されているものを使用した。
【0071】
＜被験者及び試料採取＞
実施例１では、ゴマなどから植物リグナンを摂取する食習慣があり、ＥＬ産生能を有する人が存在することが報告されていることから、日本人を被験者とした。
具体的には、日本人の被験者２３３名を対象とし、１４７名の第１集団Ａと、８６名の第２集団Ｂとに分割した。
第１集団Ａの被験者へは、事前にローストアマニ粉末５ｇ入りスティックを１５本配布し、採便・採血予定日の直近２週間に定期的に摂取するよう依頼した。ローストアマニ粉末は、亜麻種子を焙煎処理した後粉砕することで得た。
第２集団Ｂの被験者へは、ローストアマニの摂取を推奨しなかった。
実施例１では、ゴマなどから植物リグナンを摂取する食習慣があり、ＥＬ産生能を有する人が存在することが報告されていることから、日本人を被験者とした。
具体的には、日本人の被験者２３３名を対象とし、１４７名の第１集団Ａと、８６名の第２集団Ｂとに分割した。
第１集団Ａの被験者へは、事前にローストアマニ粉末５ｇ入りスティックを１５本配布し、採便・採血予定日の直近２週間に定期的に摂取するよう依頼した。ローストアマニ粉末は、亜麻種子を焙煎処理した後粉砕することで得た。
第２集団Ｂの被験者へは、ローストアマニの摂取を推奨しなかった。
【0072】
各被験者から、エンテロラクトン分析に使用する血液試料と、腸内細菌叢解析に使用する糞便試料を採取した。
採取した血液試料について、３０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離して血清を採取し、使用まで－８０℃で保管した。
採取した糞便試料について、株式会社テクノスルガ製の細菌分離用糞便採取キットを使用して回収した。
具体的には、採取した糞便試料を３ｍＬのグアニジンチオシアン酸塩溶液を含む１５ｍＬのバイアルに入れ、よく混合し、ＤＮＡ抽出まで４℃で保存した。
被験者の中から、採血未実施もしくは量が不十分、採便量が不十分であった１１名を除外し、第１集団Ａからは１３６名分、第２集団Ｂからは８６名分の血液試料と糞便試料を解析対象とした。
採取した血液試料について、３０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離して血清を採取し、使用まで－８０℃で保管した。
採取した糞便試料について、株式会社テクノスルガ製の細菌分離用糞便採取キットを使用して回収した。
具体的には、採取した糞便試料を３ｍＬのグアニジンチオシアン酸塩溶液を含む１５ｍＬのバイアルに入れ、よく混合し、ＤＮＡ抽出まで４℃で保存した。
被験者の中から、採血未実施もしくは量が不十分、採便量が不十分であった１１名を除外し、第１集団Ａからは１３６名分、第２集団Ｂからは８６名分の血液試料と糞便試料を解析対象とした。
【0073】
＜血中エンテロラクトンの測定と個人のＥＬ産生能の定義＞
（１）血中エンテロラクトン分析用の血清前処理
血清５０μｌに対して２％ギ酸入りメタノールを５０μｌ添加し、１分間ボルテックスした。
１００００ｘｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を抽出液として回収した。
抽出液はＧＬクロマトディスク １３Ｎ ０．２μｍ（ジーエルサイエンス株式会社製）を使用してフィルターろ過し、通過した液を哺乳類リグナン分析用サンプルとし、ＬＣ－ＭＳＭＳにより分析した。
腸管管腔内で腸内細菌の代謝を受けて産生されたエンテロラクトンは、腸管から吸収される際に主にグルクロン酸による抱合を受け、血中ではほとんどがグルクロン酸抱合体として存在している。
そのため、血液中のエンテロラクトンを測定する場合、血液サンプルに脱抱合酵素を添加する前処理を行って遊離したアグリコンを測定する方法と、ＥＬグルクロン酸抱合体（ＥＬＧｌｕ）を脱抱合することなく測定する手法がある。
実施例１は、血液サンプルに含まれるＥＬＧｌｕを脱抱合することなく測定した。
（１）血中エンテロラクトン分析用の血清前処理
血清５０μｌに対して２％ギ酸入りメタノールを５０μｌ添加し、１分間ボルテックスした。
１００００ｘｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を抽出液として回収した。
抽出液はＧＬクロマトディスク １３Ｎ ０．２μｍ（ジーエルサイエンス株式会社製）を使用してフィルターろ過し、通過した液を哺乳類リグナン分析用サンプルとし、ＬＣ－ＭＳＭＳにより分析した。
腸管管腔内で腸内細菌の代謝を受けて産生されたエンテロラクトンは、腸管から吸収される際に主にグルクロン酸による抱合を受け、血中ではほとんどがグルクロン酸抱合体として存在している。
そのため、血液中のエンテロラクトンを測定する場合、血液サンプルに脱抱合酵素を添加する前処理を行って遊離したアグリコンを測定する方法と、ＥＬグルクロン酸抱合体（ＥＬＧｌｕ）を脱抱合することなく測定する手法がある。
実施例１は、血液サンプルに含まれるＥＬＧｌｕを脱抱合することなく測定した。
【0074】
（２）ＬＣ－ＭＳＭＳ分析用標準品
エンテロラクトンの標準品は、Cayman Chemical社製のものを使用した。
ＥＬＧｌｕは、出発原料としてエンテロラクトンを用い、先行文献（Shoji et al., Food Chem 2014, Asai et al., Life Sci 200）の手法を一部改変して調製した。
すなわち、抱合体調製反応液（１０ｍｇ／ｍＬのマウス肝臓ホモジェネート液、０．０２％のTriton X-100、１．２５ｍＭのuridine diphosphate glucuronic acid、１０ｍＭのD-saccharic acid 1,4-lactone、１０ｍＭのMgCl2、１ｍＭのdithiothreitol、０．１５ＭのTris?HCl）にエンテロラクトンが最終濃度１００μＭとなるように添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
インキュベート後、等量のメタノールを添加して反応を停止した。２倍量のクロロホルムを入れて混合・遠心分離を行い、上層を回収して濃縮・乾固した。
乾固物を水に再溶解させたのち、ＨＰＬＣを使用してＥＬＧｌｕに相当する画分を分取した。
分取物を濃縮乾固し、適切な溶媒に溶解し、以降の分析に使用した。
分取ＨＰＬＣの条件は、以下（ａ）～（ｆ）のとおりである。
（ａ）装置：Chromaster（株式会社日立ハイテク製）
（ｂ）カラム：Intertsil ODS-3、６μｍ、４．６×１５０ｍｍ（ジーエルサイエンス株式会社製）
（ｃ）カラムオーブン：４０℃・ＵＶ検出条件：２８０ｎｍ
（ｄ）移動相：Ａ：水／アセトニトリル／酢酸（９５：５：０．１）、Ｂ：アセトニトリル
（ｅ）流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
（ｆ）表１のグラジエントプログラム
エンテロラクトンの標準品は、Cayman Chemical社製のものを使用した。
ＥＬＧｌｕは、出発原料としてエンテロラクトンを用い、先行文献（Shoji et al., Food Chem 2014, Asai et al., Life Sci 200）の手法を一部改変して調製した。
すなわち、抱合体調製反応液（１０ｍｇ／ｍＬのマウス肝臓ホモジェネート液、０．０２％のTriton X-100、１．２５ｍＭのuridine diphosphate glucuronic acid、１０ｍＭのD-saccharic acid 1,4-lactone、１０ｍＭのMgCl2、１ｍＭのdithiothreitol、０．１５ＭのTris?HCl）にエンテロラクトンが最終濃度１００μＭとなるように添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
インキュベート後、等量のメタノールを添加して反応を停止した。２倍量のクロロホルムを入れて混合・遠心分離を行い、上層を回収して濃縮・乾固した。
乾固物を水に再溶解させたのち、ＨＰＬＣを使用してＥＬＧｌｕに相当する画分を分取した。
分取物を濃縮乾固し、適切な溶媒に溶解し、以降の分析に使用した。
分取ＨＰＬＣの条件は、以下（ａ）～（ｆ）のとおりである。
（ａ）装置：Chromaster（株式会社日立ハイテク製）
（ｂ）カラム：Intertsil ODS-3、６μｍ、４．６×１５０ｍｍ（ジーエルサイエンス株式会社製）
（ｃ）カラムオーブン：４０℃・ＵＶ検出条件：２８０ｎｍ
（ｄ）移動相：Ａ：水／アセトニトリル／酢酸（９５：５：０．１）、Ｂ：アセトニトリル
（ｅ）流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
（ｆ）表１のグラジエントプログラム
【0075】
【表1】
【0076】
（３）ＥＬＧｌｕ及びＥＬのＬＣ－ＭＳＭＳ分析
血中のＥＬＧｌｕ及びＥＬの分析は、前記前処理した血清試料を用い、液体クロマトグラフィー（Waters社製）とタンデム質量分析計（Orbitrap Elite、Thermofisher Scientific社製）を接続した装置で実施した。
被験者の血中にＥＬＧｌｕ及びＥＬが含まれるか否かは、標準品のリテンションタイムとＭＳＭＳフラグメントの一致をもって判断した。
血中のＥＬＧｌｕ及びＥＬの分析は、前記前処理した血清試料を用い、液体クロマトグラフィー（Waters社製）とタンデム質量分析計（Orbitrap Elite、Thermofisher Scientific社製）を接続した装置で実施した。
被験者の血中にＥＬＧｌｕ及びＥＬが含まれるか否かは、標準品のリテンションタイムとＭＳＭＳフラグメントの一致をもって判断した。
【0077】
液体クロマトグラフィー条件は、以下（ａ）～（ｆ）の通りである。
（ａ）カラム：１．７ｍｍ、１０×１５０ｍｍのACQUITY UPLC BEH C18 column
（ｂ）カラムオーブン：４０℃
（ｃ）サンプル注入量：５μｌ
（ｄ）移動相：Ａ：０．１％酢酸水、Ｂ：アセトニトリル
（ｅ）流速：０．１ｍｌ／ｍｉｎ
（ｆ）表２のグラジエントプログラム
（ａ）カラム：１．７ｍｍ、１０×１５０ｍｍのACQUITY UPLC BEH C18 column
（ｂ）カラムオーブン：４０℃
（ｃ）サンプル注入量：５μｌ
（ｄ）移動相：Ａ：０．１％酢酸水、Ｂ：アセトニトリル
（ｅ）流速：０．１ｍｌ／ｍｉｎ
（ｆ）表２のグラジエントプログラム
【0078】
【表2】
【0079】
質量分析計の条件は、以下（ａ）～（ｃ）の通りである。
（ａ）イオンソースモード：ネガティブイオンモード
（ｂ）分析モード：multiple reaction monitoring (MRM)モード
（ｃ）各化合物の検出条件（MRMペア、溶出時間［分］）：ＥＬ（297/253、18.7）、ＥＬＧｌｕ（473/297、14.1）
（ａ）イオンソースモード：ネガティブイオンモード
（ｂ）分析モード：multiple reaction monitoring (MRM)モード
（ｃ）各化合物の検出条件（MRMペア、溶出時間［分］）：ＥＬ（297/253、18.7）、ＥＬＧｌｕ（473/297、14.1）
【0080】
ＥＬ産生能の有無の判断は、血液試料中にＥＬ及び／又はＥＬＧｌｕを検出した被験者を「ＥＬ産生能あり」とし、血液試料中にＥＬ及びＥＬＧｌｕのいずれも検出しなかった被験者を「ＥＬ産生能なし」とした。
第１集団Ａは、１３６名中、ＥＬ産生能ありの人数が７９名となり、ＥＬ産生能なしの人数が５７名となった。
第２集団Ｂは、８６名中、ＥＬ産生能ありの人数が３１名となり、ＥＬ産生能なしの人数が５５名となった。
第１集団Ａは、１３６名中、ＥＬ産生能ありの人数が７９名となり、ＥＬ産生能なしの人数が５７名となった。
第２集団Ｂは、８６名中、ＥＬ産生能ありの人数が３１名となり、ＥＬ産生能なしの人数が５５名となった。
【0081】
＜ＤＮＡ抽出と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づいたマイクロバイオーム解析＞
（１）糞便試料からのＤＮＡ抽出とシーケンスデータの取得
前記保存した糞便試料を０．１ｍｍのガラスビーズを用いたビーズビート法に供して機械的に破砕し、ＤＮＡ自動分離装置（Gene Prep Star PI-80X、倉敷紡績株式会社製）を用いてＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３－Ｖ４領域を標的としてＰＣＲで増幅させた。プライマーは、以下を使用した。
（１）糞便試料からのＤＮＡ抽出とシーケンスデータの取得
前記保存した糞便試料を０．１ｍｍのガラスビーズを用いたビーズビート法に供して機械的に破砕し、ＤＮＡ自動分離装置（Gene Prep Star PI-80X、倉敷紡績株式会社製）を用いてＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３－Ｖ４領域を標的としてＰＣＲで増幅させた。プライマーは、以下を使用した。
【0082】
5-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGCGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3（配列番号１）
5-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3（配列番号２）
5-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3（配列番号２）
【0083】
その後、増幅させた配列についてIllumina社製のMiSeqシーケンサーを用いてシーケンス解析を行い、被験者サンプルごとにリードデータを取得した。
【0084】
（２）バイオインフォマティクス及び統計解析
シーケンス解析によって得られたシーケンスデータ（FASTQファイル）を使用し、Qiimeパイプラインを用いて腸内細菌叢解析を行った。
統計解析ソフトPythonのAnaconda packageを使用してシークエンスデータのFASTAQファイルをQiimeへ代入し、得られた配列を用いて９７％の類似性でクラスタリングを行い、OTU（operational taxonomic unit）を作成し、得られたOTUはSILVAデータベースを用いて系統分類した。
ここで、この時点で取得したリードデータは、サンプルごとに総リード数が異なるため、被験者間で腸内細菌叢の組成を横並びで評価するのは難しい。
そこで、実施例１では、１６Ｓ ｒＲＮＡの解析から得られたリードデータを基に腸内細菌叢組成を解析する場合、被験者の全リードデータからランダムに１００００リードをピックアップし、その１００００リード内における各種細菌のリード数を算出して１００００リード当たりの存在比率を示す数値データに変換し、この存在比率を示すデータを解析に使用する。
すなわち、各被験者のリードデータそれぞれについて、ランダムにピックアップした１００００リードにおける各種細菌のリード数をもとに、各種細菌の存在比率を求めた。
その後、caret R packageのnearZeroVar機能を用いて、分散がゼロに近い変数と変数間で高い相関を持つ項目を除去した（cutoff [r] > 0.9）。
これらの処理により得られたデータから、個々の細菌の属レベルでの存在比率を示すデータを抽出し、被験者ごとに細菌の属レベルでの個々の存在比率で構成される被験者集団全体の腸内細菌叢データを得た。
シーケンス解析によって得られたシーケンスデータ（FASTQファイル）を使用し、Qiimeパイプラインを用いて腸内細菌叢解析を行った。
統計解析ソフトPythonのAnaconda packageを使用してシークエンスデータのFASTAQファイルをQiimeへ代入し、得られた配列を用いて９７％の類似性でクラスタリングを行い、OTU（operational taxonomic unit）を作成し、得られたOTUはSILVAデータベースを用いて系統分類した。
ここで、この時点で取得したリードデータは、サンプルごとに総リード数が異なるため、被験者間で腸内細菌叢の組成を横並びで評価するのは難しい。
そこで、実施例１では、１６Ｓ ｒＲＮＡの解析から得られたリードデータを基に腸内細菌叢組成を解析する場合、被験者の全リードデータからランダムに１００００リードをピックアップし、その１００００リード内における各種細菌のリード数を算出して１００００リード当たりの存在比率を示す数値データに変換し、この存在比率を示すデータを解析に使用する。
すなわち、各被験者のリードデータそれぞれについて、ランダムにピックアップした１００００リードにおける各種細菌のリード数をもとに、各種細菌の存在比率を求めた。
その後、caret R packageのnearZeroVar機能を用いて、分散がゼロに近い変数と変数間で高い相関を持つ項目を除去した（cutoff [r] > 0.9）。
これらの処理により得られたデータから、個々の細菌の属レベルでの存在比率を示すデータを抽出し、被験者ごとに細菌の属レベルでの個々の存在比率で構成される被験者集団全体の腸内細菌叢データを得た。
【0085】
（３）解析用データセットの作成
上記により得られたデータを基に、ＥＬ産生能の有無に関する分類データと、腸内細菌叢データを被験者ごとに紐づけて被験者集団全体のデータセットを作成した。
次に、この全体のデータセットを、第１集団Ａの１３６名のデータセット（以下、データセットＡ１ともいう）と、第２集団Ｂの８６名のデータセット（以下、データセットＢ１とする）に分割した。
データセットＡ１は、機械学習を通した判別モデルの作成や重要度の高い説明変数の算出に使用するデータとした。
データセットＢ１は、データセットＡ１を使用して作成した判別モデルの外挿性を確認するためのデータとした。
上記により得られたデータを基に、ＥＬ産生能の有無に関する分類データと、腸内細菌叢データを被験者ごとに紐づけて被験者集団全体のデータセットを作成した。
次に、この全体のデータセットを、第１集団Ａの１３６名のデータセット（以下、データセットＡ１ともいう）と、第２集団Ｂの８６名のデータセット（以下、データセットＢ１とする）に分割した。
データセットＡ１は、機械学習を通した判別モデルの作成や重要度の高い説明変数の算出に使用するデータとした。
データセットＢ１は、データセットＡ１を使用して作成した判別モデルの外挿性を確認するためのデータとした。
【0086】
（機械学習工程）
＜第１判別モデルＬ１の作成＞
データセットＡ１（１３６名分）について、caret R packageのcreateDataPartitionを使用し、学習用データセットＴ１－１として８０％（１１０名）、検証用データセットＴ１－２として２０％（２６名）に分けた。
この際、各データセットＴ１－１，Ｔ１－２の間でＥＬ産生能を有する被験者（目的変数）の分布が同じ程度になっていることを確認した。
＜第１判別モデルＬ１の作成＞
データセットＡ１（１３６名分）について、caret R packageのcreateDataPartitionを使用し、学習用データセットＴ１－１として８０％（１１０名）、検証用データセットＴ１－２として２０％（２６名）に分けた。
この際、各データセットＴ１－１，Ｔ１－２の間でＥＬ産生能を有する被験者（目的変数）の分布が同じ程度になっていることを確認した。
【0087】
次に、トレーニング用のデータセットＴ１－１を使用して、caret R packageのtrain機能を用いたランダムフォレスト解析を行い、説明変数（腸内細菌叢データ）から目的変数（ＥＬ産生者）を判別する学習モデルの作成を行った。
決定木の数、チューニング範囲、クロスバリデーション回数などの各種パラメーターを調整して演算を繰り返し、作成した学習モデルの中で最も精度が高いと考えられる学習モデルを第１判別モデルＬ１とした。
得られた第１判別モデルＬ１の学習結果の混同行列を表３に示す。
決定木の数、チューニング範囲、クロスバリデーション回数などの各種パラメーターを調整して演算を繰り返し、作成した学習モデルの中で最も精度が高いと考えられる学習モデルを第１判別モデルＬ１とした。
得られた第１判別モデルＬ１の学習結果の混同行列を表３に示す。
【0088】
【表3】
【0089】
第１判別モデルＬ１の学習結果は、ＲＯＣカーブ（Receiver Operatorating Characteristic curve）のＡＵＣ（Area Under Curve）が０．７１３となり、正解率（Accuracy）が０．７４３となった。
ここで、正解率（Accuracy）は、全予測正答率を表し、以下の数式（１）により算出される。
ここで、正解率（Accuracy）は、全予測正答率を表し、以下の数式（１）により算出される。
【0090】
【数1】
【0091】
なお、ＴＰは、実際の代謝能がＥＬ産生能ありで、予測代謝能がＥＬ産生能ありの場合（真陽性）を表す。
ＦＰは、実際の代謝能がＥＬ産生能なしで、予測代謝能がＥＬ産生能ありの場合（偽陽性）を表す。
ＴＮは、実際の代謝能がＥＬ産生能なしで、予測代謝能がＥＬ産生能なしの場合（真陰性）を表す。
ＦＮは、実際の代謝能がＥＬ産生能ありで、予測代謝能がＥＬ産生能なしの場合（偽陰性）を表す。
ＦＰは、実際の代謝能がＥＬ産生能なしで、予測代謝能がＥＬ産生能ありの場合（偽陽性）を表す。
ＴＮは、実際の代謝能がＥＬ産生能なしで、予測代謝能がＥＬ産生能なしの場合（真陰性）を表す。
ＦＮは、実際の代謝能がＥＬ産生能ありで、予測代謝能がＥＬ産生能なしの場合（偽陰性）を表す。
【0092】
すなわち、正解率（Accuracy）は、ＥＬ産生能なしと予測され、実際にＥＬ産生能なしの真陰性の場合（２６．８％）、及びＥＬ産生能ありと予測され、実際にＥＬ産生能ありの真陽性（４７．５％）を合算した値に等しい。
【0093】
次に、第１判別モデルＬ１の精度を示すＲＯＣカーブのＡＵＣが一般的な目安とされる０．７以上となり、精度が一定以上となったので、caret R packageのpredict機能を使用して検証用データセットＴ１－２の説明変数を第１判別モデルＬ１に代入してランダムフォレスト解析を行い、第１判別モデルＬ１の精度と信頼度を評価した。
得られた第１判別モデルＬ１の評価結果の混同行列を表４に示す。
得られた第１判別モデルＬ１の評価結果の混同行列を表４に示す。
【0094】
【表4】
【0095】
第１判別モデルＬ１の評価結果は、ＲＯＣカーブのＡＵＣが０．７８５、正解率（Accuracy）が０．８０８となり、ｋａｐｐａ係数が０．５９１となった。
すなわち、第１判別モデルＬ１の評価結果は、その精度を示すＡＵＣと正解率（Accuracy）が０．７５以上の高い値を取り、その信頼度を示すｋａｐｐａ係数が０．５５以上の高い値（一般的な信頼度の目安は０．４以上）となった。
この結果から、第１判別モデルＬ１は、精度及び信頼度が高く、ＥＬ産生能の有無を判定するモデルとして有用であると考えられる。
すなわち、第１判別モデルＬ１の評価結果は、その精度を示すＡＵＣと正解率（Accuracy）が０．７５以上の高い値を取り、その信頼度を示すｋａｐｐａ係数が０．５５以上の高い値（一般的な信頼度の目安は０．４以上）となった。
この結果から、第１判別モデルＬ１は、精度及び信頼度が高く、ＥＬ産生能の有無を判定するモデルとして有用であると考えられる。
【0096】
次に、第１判別モデルＬ１における重要度の高い説明変数（腸内細菌）を確認した。
具体的には、第１判別モデルＬ１に対して、説明変数の重要度を算出させるcaret R packageのVarImp機能を適用させ、「重要度」の高い細菌上位２０種を算出した。算出結果を図１に示す。
図１に示されるように、各細菌の中でも、特に上位３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）の重要度が突出して高いことが分かった。
このことから、第１判別モデルＬ１において重要度が高い３菌種の存在比率データのみを使用することで、ＥＬ産生能を判別できる可能性が示唆された。
使用する細菌種の数を少なくすることで判別結果の出力に要する時間が短縮され、腸内細菌叢データすべてを使用した時と比較し、より簡便かつ素早く判別できるようになることが期待される。
具体的には、第１判別モデルＬ１に対して、説明変数の重要度を算出させるcaret R packageのVarImp機能を適用させ、「重要度」の高い細菌上位２０種を算出した。算出結果を図１に示す。
図１に示されるように、各細菌の中でも、特に上位３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）の重要度が突出して高いことが分かった。
このことから、第１判別モデルＬ１において重要度が高い３菌種の存在比率データのみを使用することで、ＥＬ産生能を判別できる可能性が示唆された。
使用する細菌種の数を少なくすることで判別結果の出力に要する時間が短縮され、腸内細菌叢データすべてを使用した時と比較し、より簡便かつ素早く判別できるようになることが期待される。
【0097】
＜第２判別モデルＬ２の作成＞
第１判別モデルＬ１において重要度の高い３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）の存在比率データとＥＬ産生能の有無に関する分類データを使用し、第２判別モデルＬ２を作成した。
具体的には、データセットＡ１から、第１判別モデルＬ１を用いて同定された重要度の高い３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）の存在比率データと、ＥＬ産生能の有無に関する分類データを抽出した。
これにより、各被験者の腸内細菌３種の存在比率のみの存在比率データと分類データとのデータセットＡ２を得た。
このデータセットＡ２を、データセットＡ１と同じ方法で学習用データセットＴ２－１（１１０名）、検証用データセットＴ２－２（２６名）に振り分けた。
この際、各データセットＴ２－１，Ｔ２－２の間でＥＬ産生能を有する被験者（目的変数）の分布が同じ程度になっていることを確認した。
第１判別モデルＬ１において重要度の高い３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）の存在比率データとＥＬ産生能の有無に関する分類データを使用し、第２判別モデルＬ２を作成した。
具体的には、データセットＡ１から、第１判別モデルＬ１を用いて同定された重要度の高い３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）の存在比率データと、ＥＬ産生能の有無に関する分類データを抽出した。
これにより、各被験者の腸内細菌３種の存在比率のみの存在比率データと分類データとのデータセットＡ２を得た。
このデータセットＡ２を、データセットＡ１と同じ方法で学習用データセットＴ２－１（１１０名）、検証用データセットＴ２－２（２６名）に振り分けた。
この際、各データセットＴ２－１，Ｔ２－２の間でＥＬ産生能を有する被験者（目的変数）の分布が同じ程度になっていることを確認した。
【0098】
次に、学習用データセットＴ２－１を使用して、caret R packageのtrain機能を用いたランダムフォレスト解析を行い、説明変数（腸内細菌叢データ）から目的変数（ＥＬ産生能の有無）を判別する学習モデルを作成した。その結果、学習モデルの中で最も精度が高いと考えられる学習モデルを第２判別モデルＬ２とした。
得られた第２判別モデルＬ２の学習結果の混同行列を表５に示す。
得られた第２判別モデルＬ２の学習結果の混同行列を表５に示す。
【0099】
【表5】
【0100】
第２判別モデルＬ２の学習結果は、ＲＯＣカーブのＡＵＣが０．７７９、正解率（Accuracy）が０．８０１となった。
【0101】
次に、第２判別モデルＬ２の精度を示すＲＯＣカーブのＡＵＣが０．７以上となり、精度が一定以上となったので、caret R packageのpredict機能を使用して検証用データセットＴ２－２の説明変数を第２判別モデルＬ２に代入してランダムフォレスト解析を行い、第２判別モデルＬ２の精度と信頼度を評価した。
得られた第２判別モデルＬ２の評価結果の混同行列を表６に示す。
得られた第２判別モデルＬ２の評価結果の混同行列を表６に示す。
【0102】
【表6】
【0103】
第２判別モデルＬ２の評価結果は、ＲＯＣカーブのＡＵＣが０．８３０、正解率（Accuracy）が０．８４５、ｋａｐｐａ係数が０．６７７となった。
すなわち、第２判別モデルＬ２の評価結果は、その精度を示すＡＵＣと正解率（Accuracy）が０．８以上の高い値を取り、その信頼度を示すｋａｐｐａ係数が０．６５以上の高い値となった。
この結果から、第２判別モデルＬ２は、精度及び信頼度が高く、ＥＬ産生能の有無を判定するモデルとして有用であると考えられる。
すなわち、第２判別モデルＬ２の評価結果は、その精度を示すＡＵＣと正解率（Accuracy）が０．８以上の高い値を取り、その信頼度を示すｋａｐｐａ係数が０．６５以上の高い値となった。
この結果から、第２判別モデルＬ２は、精度及び信頼度が高く、ＥＬ産生能の有無を判定するモデルとして有用であると考えられる。
【0104】
（推定工程）
外挿性を確認するデータセットとして、データセットＢ１から、第１判別モデルＬ１を用いて同定された重要度の高い３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）の存在比率データと、ＥＬ産生能を示すデータを抽出し、各被験者のＥＬ産生能と腸内細菌３種の存在比率とを紐づけたデータセットＢ２を得た。
外挿性を確認するデータセットとして、データセットＢ１から、第１判別モデルＬ１を用いて同定された重要度の高い３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）の存在比率データと、ＥＬ産生能を示すデータを抽出し、各被験者のＥＬ産生能と腸内細菌３種の存在比率とを紐づけたデータセットＢ２を得た。
【0105】
続いて、caret R packageのpredict機能を使用して、データセットＢ２の説明変数を第２判別モデルＬ２に代入してランダムフォレスト解析を行い、判別精度と信頼度を評価した。
得られた第２判別モデルＬ２の判別結果の混同行列を表７に示す。
得られた第２判別モデルＬ２の判別結果の混同行列を表７に示す。
【0106】
【表7】
【0107】
第２判別モデルＬ２の判別結果は、ＲＯＣカーブのＡＵＣが０．７０９、正解率（Accuracy）が０．７０９３となり、ｋａｐｐａ係数が０．４０となった。
この結果から、被験者（推定対象者）のRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属の３種の腸内細菌データを使うことで、被験者（推定対象者）のＥＬ産生能の有無を精度良く判別できるとわかった。
この結果から、被験者（推定対象者）のRuminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属の３種の腸内細菌データを使うことで、被験者（推定対象者）のＥＬ産生能の有無を精度良く判別できるとわかった。
【0108】
（実施例２）
データセットＢ１から、実施例１の第１判別モデルＬ１で同定された重要度の高い３種のうち、Ruminococcaceae.UCG.002属及びLachnospiraceae.UCG.008属の存在比率データと、ＥＬ産生能の有無に関する分類データを抽出した。
これにより、各被験者のＥＬ産生能（目的変数）と腸内細菌２種の存在比率（説明変数）のデータセットＢ３を得た。
データセットＢ１から、実施例１の第１判別モデルＬ１で同定された重要度の高い３種のうち、Ruminococcaceae.UCG.002属及びLachnospiraceae.UCG.008属の存在比率データと、ＥＬ産生能の有無に関する分類データを抽出した。
これにより、各被験者のＥＬ産生能（目的変数）と腸内細菌２種の存在比率（説明変数）のデータセットＢ３を得た。
【0109】
続いて、データセットＢ３に含まれる２種の存在比率の数値を被験者ごとに合計し、この合計値に対して任意に設定した一定の基準値以上の場合に、その被験者をＥＬ産生能ありと判別する方法で被験者（推定対象者）のＥＬ産生能の有無を判定した。
表８に、設定した基準値と正答率と評価の結果を示す。
なお、正答率は、（（実際にＥＬ産生能ありの被験者数）／（ＥＬ産生能ありと予想された被験者数）×１００）によって算出した。
また、評価は、正答率が７０％以上のものをＡとし、正答率が６０％以上７０％未満のものをＢとし、正答率が６０％未満のものをＣとした。
表８に、設定した基準値と正答率と評価の結果を示す。
なお、正答率は、（（実際にＥＬ産生能ありの被験者数）／（ＥＬ産生能ありと予想された被験者数）×１００）によって算出した。
また、評価は、正答率が７０％以上のものをＡとし、正答率が６０％以上７０％未満のものをＢとし、正答率が６０％未満のものをＣとした。
【0110】
【表8】
【0111】
基準値が０．０２超過０．５０未満の範囲で正答率が７０％以上となってＡ評価となり、基準値が０以上０．０２以下の範囲及び０．５０以上１未満の範囲で正答率が６０％以上となってＢ評価となった。
このことから、基準値を０以上１未満の範囲とすることで十分な正答率が得られ、基準値を０．０２超過０．５０未満の範囲とすることで、実施例１の第１判別モデルＬ１で同定した腸内細菌３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）のうち少なくとも２種のみの存在比率のデータであっても、第２判別モデルＬ２による３種の判定と同程度の精度で判別でき、良好な精度となることがわかった。
このことから、基準値を０以上１未満の範囲とすることで十分な正答率が得られ、基準値を０．０２超過０．５０未満の範囲とすることで、実施例１の第１判別モデルＬ１で同定した腸内細菌３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）のうち少なくとも２種のみの存在比率のデータであっても、第２判別モデルＬ２による３種の判定と同程度の精度で判別でき、良好な精度となることがわかった。
【0112】
（実施例３）
データセットＢ１から、実施例１の第１判別モデルＬ１で同定された重要度の高い３種である、Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属の存在比率データと、ＥＬ産生能の有無に関する分類データを抽出した。
これにより、各被験者のＥＬ産生能（目的変数）と腸内細菌３種の存在比率（説明変数）のデータセットＢ４を得た。
データセットＢ１から、実施例１の第１判別モデルＬ１で同定された重要度の高い３種である、Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属の存在比率データと、ＥＬ産生能の有無に関する分類データを抽出した。
これにより、各被験者のＥＬ産生能（目的変数）と腸内細菌３種の存在比率（説明変数）のデータセットＢ４を得た。
【0113】
続いて、データセットＢ４に含まれる３種の存在比率の数値を被験者ごとに合計し、この合計値に対して任意に設定した一定の基準値以上の場合に、その被験者をＥＬ産生能ありと判別する方法で被験者（推定対象者）のＥＬ産生能の有無を判定した。
表９に、設定した基準値と正答率と評価の結果を示す。
表９に、設定した基準値と正答率と評価の結果を示す。
【0114】
【表9】
【0115】
基準値が０．１超過２未満の範囲で正答率が６０％以上となり、Ｂ評価となった。
このことから、基準値を０．１超過以上２未満の範囲とすることで十分な正答率が得られ、実施例１の第１判別モデルＬ１で同定した腸内細菌３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）の存在比率のデータがあれば、十分な精度の予測が可能となることがわかった。
このことから、基準値を０．１超過以上２未満の範囲とすることで十分な正答率が得られ、実施例１の第１判別モデルＬ１で同定した腸内細菌３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）の存在比率のデータがあれば、十分な精度の予測が可能となることがわかった。
【0116】
以上のことから、腸内細菌３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）について、少なくとも２種の存在比率データの組み合わせにより、被験者（推定対象者）のＥＬ産生能の有無を十分な精度で推定できることがわかった。
また、腸内細菌３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）の存在比率のうち、２種の存在比率のデータを使用することで、３種の存在比率のデータを使用する場合に比べてより良好な精度で推定できることがわかった。
また、腸内細菌３種（Ruminococcaceae.UCG.002属、Lachnospiraceae.UCG.008属、及びRuminococcus.torques.group属）の存在比率のうち、２種の存在比率のデータを使用することで、３種の存在比率のデータを使用する場合に比べてより良好な精度で推定できることがわかった。
【符号の説明】
【0117】
Ａ 第１集団
Ａ１，Ａ２ データセット
Ｂ 第２集団
Ｂ１～Ｂ４ データセット
Ｌ１ 第１判別モデル
Ｌ２ 第２判別モデル
Ａ１，Ａ２ データセット
Ｂ 第２集団
Ｂ１～Ｂ４ データセット
Ｌ１ 第１判別モデル
Ｌ２ 第２判別モデル
【図1】
【配列表】