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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024053465
(43)【公開日】2024-04-15
(54)【発明の名称】バクテリオファージ及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 7/00 20060101AFI20240408BHJP
A61K 8/99 20170101ALI20240408BHJP
A61Q 11/00 20060101ALI20240408BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20240408BHJP
C12N 15/34 20060101ALN20240408BHJP
【ＦＩ】
C12N7/00
A61K8/99 ZNA
A61Q11/00
A61P1/02
C12N15/34
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022159774
(22)【出願日】2022-10-03
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小松澤 均
(72)【発明者】
【氏名】松尾 美樹
(72)【発明者】
【氏名】レ グエン トラ ミ
(72)【発明者】
【氏名】谷本 幸太郎
(72)【発明者】
【氏名】菅井 克仁
(72)【発明者】
【氏名】岩野 英知
(72)【発明者】
【氏名】藤木 純平
(72)【発明者】
【氏名】菅井 基行
(72)【発明者】
【氏名】久恒 順三
【テーマコード（参考）】
4B065
4C083
【Ｆターム（参考）】
4B065AA98X
4B065AA98Y
4B065CA44
4C083AA031
4C083CC41
4C083EE32
(57)【要約】
【課題】う蝕原因菌であるＳ．ミュータンスに感染し、これを特異的に排除することが可能なバクテリオファージを提供する。
【解決手段】配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号１で示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、バクテリオファージ。
【選択図】なし
【解決手段】配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号１で示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、バクテリオファージ。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号１で示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、バクテリオファージ。
【請求項2】
請求項１記載のバクテリオファージを有効成分とするストレプトコッカス・ミュータンス増殖抑制剤。
【請求項3】
請求項１記載のバクテリオファージを有効成分とする口腔バイオフィルム形成阻害剤。
【請求項4】
請求項１記載のバクテリオファージを有効成分とするう蝕予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はストレプトコッカス・ミュータンスに特異的に感染するバクテリオファージに関する。
【背景技術】
【0002】
人類は、様々な細菌感染症を抗菌薬によって克服してきたが、既に臨床で使用されているほぼ全ての抗菌薬に対して耐性菌が出現している。薬剤耐性菌の出現及び蔓延は世界的に問題視されており、世界各国で薬剤耐性菌に対する対策が講じられている。日本でも２０１６年に薬剤耐性対策アクションプランが立ちあがり、抗菌薬の適正使用が提唱されているが、それに加えて新しい治療薬の開発も本アクションプランに掲げられている。しかし、抗菌薬の開発は頭打ちの状態であり、新しい観点からの開発が必要である。
【0003】
一方、２０１４年にｎａｔｕｒｅ誌から、ファージを用いた療法の有用性の報告がされた（非特許文献１）。これは薬剤耐性菌の問題を受け、ファージ療法が関心を集め始めていることを表している。ファージとは、細菌に特異的に感染するウイルスのことであり、正式にはバクテリオファージと呼ばれる。ファージが感染した細菌は細胞膜を破壊され、死滅する。自然界には多くのファージが存在することが明らかになっており、細菌に特異的に作用することから人体には無害である。そこで、これまでの抗菌薬に次ぐ第２の抗菌剤として、病原細菌を特異的に殺菌するバクテリオファージの探索が盛んになってきている。
【0004】
ヒトの口腔に常在するミュータンス菌はストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｍｕｔａｎｓ；以下、「Ｓ．ミュータンス」と称す」）とストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）がある。Ｓ．ミュータンスは砂糖の成分であるスクロースを分解し、粘着性が高い不溶性グルカンを産生する。この不溶性グルカンがデンタルプラーク形成には必須の成分であり、Ｓ．ミュータンスのみが形成する。また、Ｓ．ミュータンスは酸産生能が高く、歯の成分を脱灰することでう蝕を誘発する。したがって、Ｓ．ミュータンスを口腔から除去することで、デンタルプラーク形成を抑制し、う蝕の発症を阻害することができ、さらに歯周病発症の抑制にもつながると考えられている。
【0005】
さらに、近年口腔と全身疾患との関連性が着目され、特に口腔細菌が糖尿病、動脈硬化症、関節リウマチ、アルツハイマー病（ＡＬＺ）、がんなど様々な疾患との関連が報告されている（非特許文献２）。また、Ｓ．ミュータンス自体が脳卒中や認知機能障害などと関連があることも報告されている（非特許文献３）。
したがって、Ｓ．ミュータンスの除去は、これらの疾患の予防にも繋がると考えられ、ＱＯＬの向上に大きく寄与すると考えられる。
したがって、Ｓ．ミュータンスの除去は、これらの疾患の予防にも繋がると考えられ、ＱＯＬの向上に大きく寄与すると考えられる。
【0006】
これまで、う蝕予防法としてブラッシング、洗口剤などの方法があるが、Ｓ．ミュータンスを排除することは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Reardon S. Nature 2014.510(7503):15-16．
【非特許文献2】Bui FQ, et al. Biomed J. 2019. 42(1):27-35
【非特許文献3】Watanabe I, et al. Sci Rep. 2016. 6:38561.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、う蝕原因菌であるＳ．ミュータンスに感染し、これを特異的に排除することが可能なバクテリオファージを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、ヒト口腔由来分離株であるＳ．ミュータンス ＫＳＭ９６株から、Ｓ．ミュータンスに感染してその増殖を抑制し、当該菌によるバイオフィルム形成を阻害できる新たなバクテリオファージを見出した。
【0010】
本発明は、以下の１）～４）に係るものである。
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号１で示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、バクテリオファージ。
２）１）のバクテリオファージを有効成分とするストレプトコッカス・ミュータンス増殖抑制剤。
３）１）のバクテリオファージを有効成分とする口腔バイオフィルム形成阻害剤。
４）１）のバクテリオファージを有効成分とするう蝕予防剤。
１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号１で示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、バクテリオファージ。
２）１）のバクテリオファージを有効成分とするストレプトコッカス・ミュータンス増殖抑制剤。
３）１）のバクテリオファージを有効成分とする口腔バイオフィルム形成阻害剤。
４）１）のバクテリオファージを有効成分とするう蝕予防剤。
【発明の効果】
【0011】
本発明のバクテリオファージは、Ｓ．ミュータンスの増殖を抑制し、当該細菌によるバイオフィルムの形成を阻害できることから、Ｓ．ミュータンスに起因する疾患、例えばう蝕の予防等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明バクテリオファージの透過型電子顕微鏡像。
【図2】本発明バクテリオファージの全長ゲノム配列及びＯＲＦを示す図。
【図3】本発明バクテリオファージと既報のＳ．ミュータンスファージ（Ｍ１０２ＡＤ）のゲノム領域の比較。
【図4】既存のレンサ球菌ファージとの系統樹解析。
【図5】本発明バクテリオファージの各細菌種に対する感受性。
【図6】本発明バクテリオファージのバイオフィルム形成阻害効果。
【図7】本発明バクテリオファージのＳ．ミュータンスに対する増殖阻害効果；（Ａ）高感受性株（ＫＳＭ１９３） １．０×１０7ＣＦＵ添加、（Ｂ）高感受性株（ＫＳＭ１７） １．０×１０7ＣＦＵ添加。
【図8】本発明バクテリオファージによるＳ．ミュータンスに対する増殖阻害効果；（Ａ）中等度感受性株ＫＳＭ９６ １．０×１０7ＣＦＵ添加、（Ｂ）低感受性株（ＫＳＭ５６） １．０×１０7ＣＦＵ添加。
【図9】本発明バクテリオファージによるＳ．ミュータンスに対する増殖阻害効果。
【図10】Ｓ．ミュータンスと他の細菌種の共培養時における本発明バクテリオファージの効果；（Ａ）Ｓ．ミュータンス ＫＳＭ１９３×Ｌ．ｌａｃｔｉｓ１３０６、（Ｂ）Ｓ．ミュータンス ＫＳＭ１９３×Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ ＧＴＣ２１５、（Ｃ）Ｓ．ミュータンス ＫＳＭ１９３×Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＧＴＣ２１７、（Ｄ）Ｓ．ミュータンス ＫＳＭ１９３×Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉＪＣＭ１２９９５、（Ｅ）Ｓ．ミュータンス ＫＳＭ１９３ ×Ｓ．ｍｉｔｉｓ ＧＴＣ４９５。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明において、「ポリヌクレオチド」と云う用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、「ＲＮＡ」には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎｏｎ-ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
【0014】
本発明のバクテリオファージは、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号１で示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものであり、より具体的には、当該ポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡとして有する。
【0015】
配列番号１で示される塩基配列と少なくとも９０％以上の同一性を有する塩基配列としては、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性をいう。
塩基配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
塩基配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【0016】
配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むバクテリオファージはＳ．ミュータンス ＫＳＭ９６株（ヒト口腔由来分離株、広島大学大学院医系科学研究科細菌学教室保有株）から分離回収されたファージ粒子であり、Ｐｈａｇｅ－ＫＳＭ９６として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に寄託されている（ＮＩＴＥ ＡＰ－０３７５６（寄託日：２０２２年９月３０日））。
当該ファージ粒子はＨｅａｄ（頭部）及びｔａｉｌ（尾部）から構成される。Ｈｅａｄの直径は約５０－６０ｎｍ程度で、尾部は長いｔａｉｌと当該ｔａｉｌの先端に短いｔａｉｌ－ｆｉｂｅｒを有する、典型的なＳｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅの形態を呈する。（図１）。当該ファージ粒子の構造はファージ粒子を酢酸ウラニルで染色し、透過電子顕微鏡で観察することができる。
当該ファージ粒子はＨｅａｄ（頭部）及びｔａｉｌ（尾部）から構成される。Ｈｅａｄの直径は約５０－６０ｎｍ程度で、尾部は長いｔａｉｌと当該ｔａｉｌの先端に短いｔａｉｌ－ｆｉｂｅｒを有する、典型的なＳｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅの形態を呈する。（図１）。当該ファージ粒子の構造はファージ粒子を酢酸ウラニルで染色し、透過電子顕微鏡で観察することができる。
【0017】
上記のファージ粒子からゲノムＤＮＡを分離し、次世代シーケンサー（Ｍｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）とＨｉＳｅｑ Ｘ ＦＩＶＥ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社））を用いてファージゲノムの完全長を決定し、決定したゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号１）を配列解析プログラム及び配列データベースを用いて解析することで、ＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）及び遺伝子の機能を推定した。図２にファージの全長ゲノム配列及びＯＲＦを図示する。
バクテリオファージのゲノムＤＮＡは環状であり、３９８２０ｂｐ（塩基対）の長さであり、ＤＮＡ上には４８個の遺伝子（ＯＲＦ）が存在する。
バクテリオファージのゲノムＤＮＡは環状であり、３９８２０ｂｐ（塩基対）の長さであり、ＤＮＡ上には４８個の遺伝子（ＯＲＦ）が存在する。
【0018】
本発明のバクテリオファージのゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号１）を用いて、既存のファージのゲノムＤＮＡとの相同性解析をｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を用いて検討したところ、既知のＳ．ミュータンスファージＤＮＡであるＭ１０２ＡＤ（Delisle AL, et al. Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78:2264-71）との配列同一性は２５％以下であり（図３の本発明ファージ（ＫＳＭ９６ ｐｈａｇｅ）とＭ１０２ＡＤファージの間の灰色で示す部分における一致率は８６．０４％）、本発明のバクテリオファージは新規なバクテリオファージであると云える。
【0019】
本発明のバクテリオファージのゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号１）を用いて、相同性解析（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ)と、Ｍａｕｖｅ（https://darlinglab.org/mauve/mauve.html)とｉＴＯＬ ｖｅｒ．６(https://itol.embl.de)を用いて、既存のファージとの系統樹解析を行ったところ、本発明のバクテリオファージは既存のＳ．ミュータンスファージＤＮＡであるＭ１０２ＡＤ，ＡＰＣＭ０１，Ｍ１０２（APCM01:Dalmasso M et al., PLoS One,2015, 23;10(9): e0138651., M102:Shibata Y,et al. FEMS Microbiol. Lett.2009, 294(1):68-73.）と同じクラスターに属したが、他のレンサ球菌のファージとは異なるクラスターであった（図４）。
【0020】
本発明のバクテリオファージは、後述する実施例に示すとおり、上記のＳ．ミュータンス ＫＳＭ９６株をトリプチケース・ソイ液体培地で培養後、マイトマイシンＣを添加（最終濃度０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌ）して更に培養を行った菌液から分離回収することができる。
【0021】
本発明のバクテリオファージは、後述する実施例に示すとおり、Ｓ．ミュータンスに特異的に感染し、他の口腔レンサ球菌や黄色ブドウ球菌には感染しない。そして、バクテリオファージが感染したＳ．ミュータンスはその増殖能が抑制され、Ｓ．ミュータンスによるバイオフィルム形成を阻害する。したがって、本発明のバクテリオファージは、Ｓ．ミュータンス増殖抑制剤、口腔バイオフィルム形成阻害剤、う蝕予防剤となり得、Ｓ．ミュータンスの増殖抑制のため、口腔バイオフィルムの形成を阻害するため、う蝕を予防するために使用できる。
【0022】
本発明において、「Ｓ．ミュータンスの増殖抑制」とは、Ｓ．ミュータンスの増殖能を低下させ、その菌数を低減することを意味する。Ｓ．ミュータンスの増殖抑制効果は、例えば、Ｓ．ミュータンスをＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ液体培地で培養し、その濁度（ＯＤ６５０ｎｍ）を測定する方法を用いて確認することができる。
【0023】
本発明において、「口腔バイオフィルム形成阻害」とは、口腔内においてバイオフィルムを形成する細菌の共凝集を抑制することにより、バイオフィルムの形成を阻害することを意味する。本発明において、バイオフィルムを形成する細菌としては少なくともＳ．ミュータンスを含む口腔内細菌が挙げられる。
Ｓ．ミュータンスは、プラスチックシャーレでスクロース含有Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ液体培地を用いて培養することでシャーレ底面にバイオフィルムを形成する。したがって、バイオフィルム形成阻害効果は、Ｓ．ミュータンスと同時に本発明のファージを当該培地に摂取して培養後、培地を除去し、底面に付着した菌を染色剤で染め、吸光度を測定する方法を用いて確認することができる。
Ｓ．ミュータンスは、プラスチックシャーレでスクロース含有Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ液体培地を用いて培養することでシャーレ底面にバイオフィルムを形成する。したがって、バイオフィルム形成阻害効果は、Ｓ．ミュータンスと同時に本発明のファージを当該培地に摂取して培養後、培地を除去し、底面に付着した菌を染色剤で染め、吸光度を測定する方法を用いて確認することができる。
【0024】
本発明において、「う蝕の予防」とは、う蝕の防止又は遅延を意味し、う蝕になる危険性の低下、う蝕原因の除去を包含する。
【0025】
本発明のＳ．ミュータンス増殖抑制剤、口腔バイオフィルム形成阻害剤、う蝕予防剤は、それ自体で、Ｓ．ミュータンスの増殖を抑制するため、口腔バイオフィルムの形成を阻害するため又はう蝕を予防するための医薬品、医薬部外品、口腔用組成物となり、また当該医薬品、医薬部外品、口腔用組成物に配合して使用される素材又は製剤となり得る。
【0026】
医薬品や医薬部外品として用いる場合の形態としては経口投与の形態が好ましく、その剤型は、例えば、液剤；錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、タブレット等の固形剤；或いは当該液剤又は固形剤を封入したカプセル剤、口腔用スプレー、トローチ等の様々な形態が挙げられる。
【0027】
口腔用組成物として用いる場合の具体的な形態としては、洗口剤、マウスウオッシュ、練歯磨、粉歯磨、水歯磨、口腔用軟膏剤、ゲル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、グミゼリー、トローチ、タブレット、カプセル、キャンディー、チューインガム等が挙げられ、好ましくは、練歯磨、洗口剤、グミゼリー、トローチが挙げられる。
【0028】
当該医薬品、医薬部外品、口腔用組成物は、本発明のバクテリオファージを他の有効成分、医薬品や口腔用組成物等に許容される添加物、例えば発泡剤、発泡助剤、研磨剤、湿潤剤、粘結剤、増量剤、甘味剤、保存料、ｐＨ調整剤、殺菌剤、フッ化物、血行促進剤、消炎剤、酵素、粘着剤、顔料、色素、香料等を適宜組み合わせて、定法に従って調製することができる。
【0029】
上記医薬品、医薬部外品、口腔用組成物への本発明のバクテリオファージの含有量は、特に限定されず、一日投与量等に合わせて適宜調節すれば良い。
【0030】
上記医薬品、医薬部外品、口腔用組成物において、摂取又は投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜決定することができるが、成人一人、一日当たり、本発明のバクテリオファージとして１．０×１０９ｃｆｕ／ｍＬ以上、好ましくは１．０×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ以上で、１．０×１０１１ｃｆｕ／ｍＬ以下、好ましくは１．０×１０１２ｃｆｕ／ｍＬ以下が挙げられる。
【実施例0031】
実施例１ Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＫＳＭ９６株からのバクテリオファージの精製
－８０℃凍結保存Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＫＳＭ９６株（ヒト口腔由来分離株、広島大学大学院医系科学研究科細菌学教室保有）を５ｍｌのｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ （Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）培地（ＴＳＢ）に接種し、３７℃、５％存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。一晩培養した菌液２００μｌを２０ｍｌの新しいＴＳＢに接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で３時間～５時間培養した。菌の濁度が６６０ｎｍで０．２～０．３に到達した段階で、マイトマイシンＣ（富士フィルム和光純薬）（０．１ｍｇ／ｍｌ）溶液２０μｌを２０ｍｌ細菌培養液に添加し（最終濃度０．１μｇ／ｍｌ）、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。培養液を遠心機（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－３０Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で遠心後（８，５００ｒｐｍ，１５分、４℃）、上清を回収し、ろ過膜 （ＤＩＳＭＩＣ－２５ＣＳφ２５ｍｍ，孔径：０．４５μｍ，Ｔｏｙｏ Ｒｏｓｈｉ Ｋａｉｓｈａ，Ｌｔｄ）でろ過滅菌を行った。高速遠心機（Ｏｐｔｉｍａ（商標） ＴＬ，Ｂｅｃｋｍａｎ社）を用いて、ろ過液を２５，０００ｒｐｍ、２時間、４℃の条件で遠心を行った。上清を除去し、沈査を少量（５０μｌ）のＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈに懸濁した。得られたファージを本発明のバクテリオファージと称する。
－８０℃凍結保存Ｓ． ｍｕｔａｎｓ ＫＳＭ９６株（ヒト口腔由来分離株、広島大学大学院医系科学研究科細菌学教室保有）を５ｍｌのｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ （Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）培地（ＴＳＢ）に接種し、３７℃、５％存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。一晩培養した菌液２００μｌを２０ｍｌの新しいＴＳＢに接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で３時間～５時間培養した。菌の濁度が６６０ｎｍで０．２～０．３に到達した段階で、マイトマイシンＣ（富士フィルム和光純薬）（０．１ｍｇ／ｍｌ）溶液２０μｌを２０ｍｌ細菌培養液に添加し（最終濃度０．１μｇ／ｍｌ）、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。培養液を遠心機（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－３０Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）で遠心後（８，５００ｒｐｍ，１５分、４℃）、上清を回収し、ろ過膜 （ＤＩＳＭＩＣ－２５ＣＳφ２５ｍｍ，孔径：０．４５μｍ，Ｔｏｙｏ Ｒｏｓｈｉ Ｋａｉｓｈａ，Ｌｔｄ）でろ過滅菌を行った。高速遠心機（Ｏｐｔｉｍａ（商標） ＴＬ，Ｂｅｃｋｍａｎ社）を用いて、ろ過液を２５，０００ｒｐｍ、２時間、４℃の条件で遠心を行った。上清を除去し、沈査を少量（５０μｌ）のＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈに懸濁した。得られたファージを本発明のバクテリオファージと称する。
【0032】
実施例２ バクテリオファージの電子顕微鏡による観察
（１）方法
実施例１で得られたファージ溶液をエステル支持膜（ＥＭ Ｊａｐａｎ，Ｕ１００９：https://www.em-japan.com/supportfilm.html）に滴下し吸着させた。支持膜をＳＭ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０１％ ｇｅｌａｔｉｎ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］）で２回洗浄を行った。支持膜を２％酢酸ウラニルで染色を行った後、染色サンプルを透過電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＴ７７００）で観察（７５ｋＶ）を行った。
（１）方法
実施例１で得られたファージ溶液をエステル支持膜（ＥＭ Ｊａｐａｎ，Ｕ１００９：https://www.em-japan.com/supportfilm.html）に滴下し吸着させた。支持膜をＳＭ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ ＭｇＳＯ４，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０１％ ｇｅｌａｔｉｎ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］）で２回洗浄を行った。支持膜を２％酢酸ウラニルで染色を行った後、染色サンプルを透過電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ ＨＴ７７００）で観察（７５ｋＶ）を行った。
【0033】
（２）透過電子顕微鏡像を図１に示す。
＜ファージの形態的特徴＞
・Ｈｅａｄ（頭部）及びｔａｉｌ（尾部）から成る。
・Ｈｅａｄの直径が約５０－６０ｎｍ程度。
・長いｔａｉｌを有し、ｔａｉｌの先端に短い尾部繊維状構造物（ｔａｉｌ－ｆｉｂｅｒ）を有する。
・典型的なＳｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅの形態を呈する。
＜ファージの形態的特徴＞
・Ｈｅａｄ（頭部）及びｔａｉｌ（尾部）から成る。
・Ｈｅａｄの直径が約５０－６０ｎｍ程度。
・長いｔａｉｌを有し、ｔａｉｌの先端に短い尾部繊維状構造物（ｔａｉｌ－ｆｉｂｅｒ）を有する。
・典型的なＳｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅの形態を呈する。
【0034】
実施例３ バクテリオファージの全塩基配列の決定
（１）方法
実施例１で得られたファージ粒子からＰｈａｇｅ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ社）を用いてＤＮＡの抽出を行った。抽出したＤＮＡを用いて、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社の前処理試薬を用いて、シーケンス用のＤＮＡライブラリーの作成を行った。Ｍｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）とＨｉｓｅｑ Ｘ－Ｆｉｖｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてショットガンシーケンスを行い、生データ（ｆａｓｔｑファイル）を取得した。取得したイルミナリードをｓｈｏｖｉｌｌ ｖ１．０．９(https://github.com/tseemann/shovill）パイプラインを使用し、アセンブルしてドラフトゲノム配列（ｆａｓｔａファイル）を得た。得られたｆａｓｔａファイルを用いてファージ解析ソフトである ＰＨＡＳＴＥＲ (https://phaster.ca)とＢＬＡＳＴＰ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins）を用いて、遺伝子検索を行った。目的の遺伝子についてＳｎａｐＧｅｎｅ（ＧＳＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＬＬＣ）を用いて、遺伝子マップを作製した。
（１）方法
実施例１で得られたファージ粒子からＰｈａｇｅ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ社）を用いてＤＮＡの抽出を行った。抽出したＤＮＡを用いて、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ社の前処理試薬を用いて、シーケンス用のＤＮＡライブラリーの作成を行った。Ｍｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）とＨｉｓｅｑ Ｘ－Ｆｉｖｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてショットガンシーケンスを行い、生データ（ｆａｓｔｑファイル）を取得した。取得したイルミナリードをｓｈｏｖｉｌｌ ｖ１．０．９(https://github.com/tseemann/shovill）パイプラインを使用し、アセンブルしてドラフトゲノム配列（ｆａｓｔａファイル）を得た。得られたｆａｓｔａファイルを用いてファージ解析ソフトである ＰＨＡＳＴＥＲ (https://phaster.ca)とＢＬＡＳＴＰ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins）を用いて、遺伝子検索を行った。目的の遺伝子についてＳｎａｐＧｅｎｅ（ＧＳＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＬＬＣ）を用いて、遺伝子マップを作製した。
【0035】
（２）結果
本発明のバクテリオファージＤＮＡは環状であり、３９，８２０ｂｐ（塩基対）の長さであった。また、本発明のバクテリオファージＤＮＡ上には４８個の遺伝子（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が存在していた（図２）。
本発明のバクテリオファージＤＮＡは環状であり、３９，８２０ｂｐ（塩基対）の長さであった。また、本発明のバクテリオファージＤＮＡ上には４８個の遺伝子（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）が存在していた（図２）。
【0036】
実施例４ 既存のＳ．ｍｕｔａｎｓファージＤＮＡとの相同性解析
本発明のバクテリオファージＤＮＡの塩基配列と既存のＳ． ｍｕｔａｎｓファージＤＮＡとの相同性解析をｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を用いて検討した。
その結果、本発明のバクテリオファージＤＮＡは、過去の報告のあったＳ．ｍｕｔａｎｓファージＤＮＡであるＭ１０２ＡＤ（Delisle AL, et al. Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78:2264-71）との配列同一性は２５％以下であり（図３の本発明ファージ（ＫＳＭ９６ ｐｈａｇｅ）とＭ１０２ＡＤファージの間の灰色で示す部分における一致率は８６．０４％）、新規なバクテリオファージであることが明らかになった。
本発明のバクテリオファージＤＮＡの塩基配列と既存のＳ． ｍｕｔａｎｓファージＤＮＡとの相同性解析をｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を用いて検討した。
その結果、本発明のバクテリオファージＤＮＡは、過去の報告のあったＳ．ｍｕｔａｎｓファージＤＮＡであるＭ１０２ＡＤ（Delisle AL, et al. Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78:2264-71）との配列同一性は２５％以下であり（図３の本発明ファージ（ＫＳＭ９６ ｐｈａｇｅ）とＭ１０２ＡＤファージの間の灰色で示す部分における一致率は８６．０４％）、新規なバクテリオファージであることが明らかになった。
【0037】
実施例５ バクテリオファージＤＮＡの既存のファージＤＮＡとの系統樹解析
本発明のバクテリオファージＤＮＡの塩基配列を用いて、相同性解析をｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を行い、一部の塩基配列に類似性を認めたファージＤＮＡの塩基配列を用い、Ｍａｕｖｅ (https://darlinglab.org/mauve/mauve.html)とｉＴＯＬ ｖｅｒ．６(https://itol.embl.de)を用いて系統樹解析を行った。
図４に示すように、本発明のバクテリオファージＤＮＡは過去の報告のあったＳ． ｍｕｔａｎｓファージＤＮＡであるＭ１０２ＡＤ，ＡＰＣＭ０１，Ｍ１０２（APCM01:Dalmasso M et al., PLoS One,2015, 23;10(9): e0138651., M102:Shibata Y,et al. FEMS Microbiol. Lett.2009, 294(1):68-73.）と同じクラスターに属したが、他のレンサ球菌のファージとは異なるクラスターであった。
本発明のバクテリオファージＤＮＡの塩基配列を用いて、相同性解析をｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を行い、一部の塩基配列に類似性を認めたファージＤＮＡの塩基配列を用い、Ｍａｕｖｅ (https://darlinglab.org/mauve/mauve.html)とｉＴＯＬ ｖｅｒ．６(https://itol.embl.de)を用いて系統樹解析を行った。
図４に示すように、本発明のバクテリオファージＤＮＡは過去の報告のあったＳ． ｍｕｔａｎｓファージＤＮＡであるＭ１０２ＡＤ，ＡＰＣＭ０１，Ｍ１０２（APCM01:Dalmasso M et al., PLoS One,2015, 23;10(9): e0138651., M102:Shibata Y,et al. FEMS Microbiol. Lett.2009, 294(1):68-73.）と同じクラスターに属したが、他のレンサ球菌のファージとは異なるクラスターであった。
【0038】
実施例６ 本発明のバクテリオファージの各細菌種に対する感受性試験
（１）方法
－８０℃凍結保存Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及び以下に示す他の細菌種を５ｍｌ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ液体培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。一晩培養菌液をＴＳＢで１０倍希釈し、希釈した菌液１００μｌをＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ寒天培地に接種し、コンラージ棒により寒天培地上に拡げた。実施例１で得たファージ溶液５μｌを寒天培地上に滴下し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。ファージ液を滴下した部分に形成した阻止円を肉眼で判定し、感受性の有無を評価した。
＜実験で使用した菌株＞
S.mutans 臨床分離株123株
Streptococcus sobrinus MS5103
Streptococcus salivarius GTC217
Streptococcus sanguinis GTC215
Lactococcus lactis ATCC11454
Streptococcus oralis ATCC10557
Streptococcus mitis GTC495
Staphylococcus aureus MW2
（１）方法
－８０℃凍結保存Ｓ．ｍｕｔａｎｓ及び以下に示す他の細菌種を５ｍｌ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ液体培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。一晩培養菌液をＴＳＢで１０倍希釈し、希釈した菌液１００μｌをＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ寒天培地に接種し、コンラージ棒により寒天培地上に拡げた。実施例１で得たファージ溶液５μｌを寒天培地上に滴下し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。ファージ液を滴下した部分に形成した阻止円を肉眼で判定し、感受性の有無を評価した。
＜実験で使用した菌株＞
S.mutans 臨床分離株123株
Streptococcus sobrinus MS5103
Streptococcus salivarius GTC217
Streptococcus sanguinis GTC215
Lactococcus lactis ATCC11454
Streptococcus oralis ATCC10557
Streptococcus mitis GTC495
Staphylococcus aureus MW2
【0039】
（２）結果
本バクテリオファージはＳ．ｍｕｔａｎｓに特異的に感受性を示した（図５）。また、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ １２３株中、１２０株に感受性を示したことから、本発明のバクテリオファージは広くＳ．ｍｕｔａｎｓ株に有効である（表１）。
本バクテリオファージはＳ．ｍｕｔａｎｓに特異的に感受性を示した（図５）。また、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ １２３株中、１２０株に感受性を示したことから、本発明のバクテリオファージは広くＳ．ｍｕｔａｎｓ株に有効である（表１）。
【0040】
【表1】
【0041】
実施例７ バクテリオファージのＳ．ｍｕｔａｎｓバイオフィルム形成に対する効果
（１）方法
－８０℃凍結保存Ｓ．ｍｕｔａｎｓを５ｍｌ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。一晩培養菌液をＴＳＢで濁度１．０に調整（１０９／ｍｌ）後、１００倍希釈を行った。濁度１．０の菌液及び１００倍希釈液１０μｌを２％ ｓｕｃｒｏｓｅを含むＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地９０μｌ（９６ウェルプレート）に接種した。菌の接種と同時に本ファージ（２×１０８～２×１０１０粒子）をウェルに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。菌液を除去し、各ウェルを生理食塩水で３回洗浄を行った。洗浄後、０．１％クリスタルバイオレット溶液１００μｌを各ウェルプレートに添加し、１５分、室温で静置した。その後、クリスタルバイオレット溶液を除去し、各ウェルを生理食塩水で３回洗浄した。ウェルプレート底面に形成したバイオフィルムが青く染まるので、写真撮影を行った。その後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）で吸光度（ＯＤ：５９５ｎｍ）を測定した。
（１）方法
－８０℃凍結保存Ｓ．ｍｕｔａｎｓを５ｍｌ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。一晩培養菌液をＴＳＢで濁度１．０に調整（１０９／ｍｌ）後、１００倍希釈を行った。濁度１．０の菌液及び１００倍希釈液１０μｌを２％ ｓｕｃｒｏｓｅを含むＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地９０μｌ（９６ウェルプレート）に接種した。菌の接種と同時に本ファージ（２×１０８～２×１０１０粒子）をウェルに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。菌液を除去し、各ウェルを生理食塩水で３回洗浄を行った。洗浄後、０．１％クリスタルバイオレット溶液１００μｌを各ウェルプレートに添加し、１５分、室温で静置した。その後、クリスタルバイオレット溶液を除去し、各ウェルを生理食塩水で３回洗浄した。ウェルプレート底面に形成したバイオフィルムが青く染まるので、写真撮影を行った。その後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）で吸光度（ＯＤ：５９５ｎｍ）を測定した。
【0042】
（２）結果
本発明のバクテリオファージにはＳ．ｍｕｔａｎｓによるバイオフィルム形成を阻害する効果が認められた。当該バイオフィルム形成阻害効果はＳ．ｍｕｔａｎｓの菌量の１００倍以上のファージ量を添加することで、認められた（図６）。
また、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ臨床分離株９株についても同様に阻害効果が認められた（表２）。
本発明のバクテリオファージにはＳ．ｍｕｔａｎｓによるバイオフィルム形成を阻害する効果が認められた。当該バイオフィルム形成阻害効果はＳ．ｍｕｔａｎｓの菌量の１００倍以上のファージ量を添加することで、認められた（図６）。
また、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ臨床分離株９株についても同様に阻害効果が認められた（表２）。
【0043】
【表2】
【0044】
実施例８ バクテリオファージによるＳ．ｍｕｔａｎｓ増殖阻害効果の検討１
（１）方法
－８０℃凍結保存の臨床分離Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（高感受性株：ＫＳＭ１９３、ＫＳＭ１７、非感受性株：ＫＳＭ５６、本ファージ産生株：ＫＳＭ９６及び表３の株）を５ｍｌ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。一晩培養菌液をＴＳＢで濁度１．０に調整（１０９／ｍｌ）後、１０μｌ（１０７ＣＦＵ）をＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地８０μｌに接種した。菌の接種と同時にファージ（２×１０９，２×１０１０）を菌液に添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で培養した。培養中に経時的にマイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ（商標），Ｂｉｏ－ｒａｄ社）で濁度（ＯＤ：６６０ｎｍ）を測定した（ＫＳＭ１９３、ＫＳＭ１７、ＫＳＭ５６、ＫＳＭ９６）。表３の株については、培養後、６時間及び１２時間の濁度（ＯＤ：６６０ｎｍ）を計測し、ファージ非添加の濁度値（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する割合を算出した。
（１）方法
－８０℃凍結保存の臨床分離Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（高感受性株：ＫＳＭ１９３、ＫＳＭ１７、非感受性株：ＫＳＭ５６、本ファージ産生株：ＫＳＭ９６及び表３の株）を５ｍｌ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。一晩培養菌液をＴＳＢで濁度１．０に調整（１０９／ｍｌ）後、１０μｌ（１０７ＣＦＵ）をＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地８０μｌに接種した。菌の接種と同時にファージ（２×１０９，２×１０１０）を菌液に添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で培養した。培養中に経時的にマイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ（商標），Ｂｉｏ－ｒａｄ社）で濁度（ＯＤ：６６０ｎｍ）を測定した（ＫＳＭ１９３、ＫＳＭ１７、ＫＳＭ５６、ＫＳＭ９６）。表３の株については、培養後、６時間及び１２時間の濁度（ＯＤ：６６０ｎｍ）を計測し、ファージ非添加の濁度値（ｃｏｎｔｒｏｌ）に対する割合を算出した。
【0045】
（２）結果
本発明のバクテリオファージは多くのファージ感受性菌の増殖を抑制した。その抑制効果は細菌量の１００倍以上のファージ粒子を添加することで著名であった。バクテリオファージ非感受性及び低感受性株ではその効果は認めなかった（図７－８、表３）。
本発明のバクテリオファージは多くのファージ感受性菌の増殖を抑制した。その抑制効果は細菌量の１００倍以上のファージ粒子を添加することで著名であった。バクテリオファージ非感受性及び低感受性株ではその効果は認めなかった（図７－８、表３）。
【0046】
【表3】
【0047】
実施例９ バクテリオファージによるＳ．ｍｕｔａｎｓ増殖阻害効果の検討２
（１）方法
－８０℃凍結保存の臨床分離Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（高感受性株：ＫＳＭ１９３）を５ｍｌ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。一晩培養菌液をＴＳＢで濁度１．０に調整（１０９／ｍｌ）後、１０μｌをＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地８０μｌに接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で培養した。濁度（ＯＤ：６６０ｎｍ）０．２に到達後、ファージ（２×１０１０粒子）を菌液に添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で培養し、経時的に濁度（ＯＤ：６６０ｎｍ）を測定した。
（１）方法
－８０℃凍結保存の臨床分離Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（高感受性株：ＫＳＭ１９３）を５ｍｌ Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。一晩培養菌液をＴＳＢで濁度１．０に調整（１０９／ｍｌ）後、１０μｌをＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地８０μｌに接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で培養した。濁度（ＯＤ：６６０ｎｍ）０．２に到達後、ファージ（２×１０１０粒子）を菌液に添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で培養し、経時的に濁度（ＯＤ：６６０ｎｍ）を測定した。
【0048】
（２）結果
本発明バクテリオファージは増殖過程の菌にも有効であり、増殖の阻害効果が認められた（図９）。
本発明バクテリオファージは増殖過程の菌にも有効であり、増殖の阻害効果が認められた（図９）。
【0049】
実施例１０ Ｓ．ｍｕｔａｎｓと他の細菌種の共培養時におけるバクテリオファージの効果の検討
（１）方法
１）定量性ＰＣＲを用いた各細菌種の菌数を求める検量線の作成
－８０℃凍結保存の臨床分離Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＵＡ１５９株及び下記に示すその他の細菌種を５ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。
Streptococcus salivarius GTC217
Streptococcus sanguinis GTC215
Lactococcus lactis ATCC11454
Streptococcus gordonii JCM12995
Streptococcus mitis GTC495
（１）方法
１）定量性ＰＣＲを用いた各細菌種の菌数を求める検量線の作成
－８０℃凍結保存の臨床分離Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＵＡ１５９株及び下記に示すその他の細菌種を５ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。
Streptococcus salivarius GTC217
Streptococcus sanguinis GTC215
Lactococcus lactis ATCC11454
Streptococcus gordonii JCM12995
Streptococcus mitis GTC495
【0050】
一晩培養菌液をＴＳＢで濁度１．０に調整（１０９／ｍｌ）後、１ｍｌの菌液を遠心（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を捨て、沈査をＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］）に懸濁後、９５℃、１５分処理を行った。再度、遠心後（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、上清を回収しＤＮＡ溶液（１０９／ｍｌのＤＮＡ溶液）を調整した。得られたＤＮＡ溶液をｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで１０倍～１００００倍の希釈液を作製した。調整したＤＮＡを鋳型に下記に示す菌種特異的プライマーを用いて、定量性ＰＣＲ法により各菌種の細菌数を算出した。定量性ＰＣＲは定量性ＰＣＲ機器（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６、Ｒｏｃｈｅ社製）、試薬はＦＳ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ ＭＭｘ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、反応条件は下記に示す条件で行った。各ＤＮＡ希釈液を用いて定量性ＰＣＲにより算出されたＣｔ値を用いて、菌数とＣｔ値の検量線を作成した。
【0051】
２）ＰＣＲ条件
Preincubation 1cycle 95℃ for 600s
Amplification 45cycle 95℃ for 10s
60℃ for 30s
Preincubation 1cycle 95℃ for 30s
Melting 1cycle 95℃ for 10s
60℃ for 60s
97℃ for 1s
Preincubation 1cycle 95℃ for 600s
Amplification 45cycle 95℃ for 10s
60℃ for 30s
Preincubation 1cycle 95℃ for 30s
Melting 1cycle 95℃ for 10s
60℃ for 60s
97℃ for 1s
【0052】
【表4】
【0053】
３）共培養試験
実験１：Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＫＳＭ１９３株と他の細菌種１株の計２菌種の共培養
実験２：Ｓ．ｍｕｔａｎｓ １株（ＫＳＭ１９３、ＫＳＭ８３，ＫＳＭ２９株）と他の細菌種３株（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ，Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ，Ｓ．ｍｉｔｉｓ）の計４菌種での共培養
実験１：Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＫＳＭ１９３株と他の細菌種１株の計２菌種の共培養
実験２：Ｓ．ｍｕｔａｎｓ １株（ＫＳＭ１９３、ＫＳＭ８３，ＫＳＭ２９株）と他の細菌種３株（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ，Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ，Ｓ．ｍｉｔｉｓ）の計４菌種での共培養
【0054】
－８０℃凍結保存の臨床分離Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（高感受性株：ＫＳＭ１９３、ＫＳＭ８３，ＫＳＭ２９）及び下記に示すその他の細菌種を５ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地に接種し、３７℃、５％ ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で一晩培養した。
Streptococcus salivarius GTC217
Streptococcus sanguinis GTC215
Lactococcus lactis ATCC11454
Streptococcus gordonii JCM12995
Streptococcus mitis GTC495
Streptococcus salivarius GTC217
Streptococcus sanguinis GTC215
Lactococcus lactis ATCC11454
Streptococcus gordonii JCM12995
Streptococcus mitis GTC495
【0055】
一晩培養菌液をＴＳＢで濁度１．０に調整（１０９／ｍｌ）後、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地で１００倍に希釈（１０７／ｍｌ）した。新しいＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ培地５００μｌに希釈したＳ． ｍｕｔａｎｓ菌液１０ μｌ（１０５ ＣＦＵ）及び他の細菌の菌液１０μｌ（１０５ＣＦＵ）を添加した。
実験１：Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＫＳＭ１９３株と他の細菌種１株の計２菌種の共培養
実験２：Ｓ．ｍｕｔａｎｓ １株（ＫＳＭ１９３、ＫＳＭ８３，ＫＳＭ２９株）と他の細菌種３株（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ，Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ，Ｓ．ｍｉｔｉｓ）の計４菌種での共培養
実験１：Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＫＳＭ１９３株と他の細菌種１株の計２菌種の共培養
実験２：Ｓ．ｍｕｔａｎｓ １株（ＫＳＭ１９３、ＫＳＭ８３，ＫＳＭ２９株）と他の細菌種３株（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ，Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ，Ｓ．ｍｉｔｉｓ）の計４菌種での共培養
【0056】
各細菌を接種と同時にバクテリオファージ溶液２０μｌ（２×１０１０粒子）を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２存在下（ＣＯ２インキュベーター）で８時間、培養した。培養液を遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ社）で遠心した（８，５００ｒｐｍ、１５分、４℃）。上清を捨て、沈査（菌体）にＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］）に懸濁後、９５℃、１５分処理を行い、遠心後（１５，０００ ｒｐｍ、１０分、４℃）、上清を回収しＤＮＡ溶液を調整した。調整したＤＮＡを鋳型に表４に示す菌種特異的プライマーを用いて、定量性ＰＣＲ法によりＣｔ値を算出した。検量線を用いて、各サンプル中の細菌数を算出し、各細菌の割合を算出した。
【0057】
（２）結果
Ｓ．ｍｕｔａｎｓと他の口腔レンサ球菌１種あるいは３種を共培養の系で、バクテリオファージを添加することでＳ．ｍｕｔａｎｓのみが顕著に菌数の割合が減少した（図１０、表５）。
Ｓ．ｍｕｔａｎｓと他の口腔レンサ球菌１種あるいは３種を共培養の系で、バクテリオファージを添加することでＳ．ｍｕｔａｎｓのみが顕著に菌数の割合が減少した（図１０、表５）。
【0058】
【表5】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】