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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024055152
(43)【公開日】2024-04-18
(54)【発明の名称】熱処理リゾチーム組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 9/36 20060101AFI20240411BHJP
【ＦＩ】
C12N9/36 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022161849
(22)【出願日】2022-10-06
(71)【出願人】
【識別番号】504196300
【氏名又は名称】国立大学法人東京海洋大学
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼橋 肇
(72)【発明者】
【氏名】築舘 加奈子
【テーマコード（参考）】
4B050
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050DD11
4B050FF20C
4B050LL01
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、効果的にウイルス及び細菌を不活化できる薬剤を提供することである。
【解決手段】前記課題は、本発明のｐＨ２．０～４．５で熱処理された低ｐＨ熱処理リゾチーム及びｐＨ５．５～８．５で熱処理された高ｐＨ熱処理リゾチームを含む、熱処理リゾチーム組成物によって解決することができる。
【選択図】なし
【解決手段】前記課題は、本発明のｐＨ２．０～４．５で熱処理された低ｐＨ熱処理リゾチーム及びｐＨ５．５～８．５で熱処理された高ｐＨ熱処理リゾチームを含む、熱処理リゾチーム組成物によって解決することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｐＨ２．０～４．５で熱処理された低ｐＨ熱処理リゾチーム及びｐＨ５．５～８．５で熱処理された高ｐＨ熱処理リゾチームを含む、熱処理リゾチーム組成物。
【請求項2】
ｐＨ２．０～４．５である、請求項１に記載の熱処理リゾチーム組成物。
【請求項3】
ウイルス不活化及び殺菌用である請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
（ａ）リゾチームをｐＨ２．０～４．５で熱処理し、低ｐＨ熱処理リゾチームを得る工程、
（ｂ）別のリゾチームをｐＨ５．５～８．５で熱処理し、高ｐＨ熱処理リゾチームを得る工程、
（ｃ）前記低ｐＨ熱処理リゾチーム及び高ｐＨ熱処理リゾチームを混合する工程、
を含む、熱処理リゾチーム組成物の製造方法。
（ｂ）別のリゾチームをｐＨ５．５～８．５で熱処理し、高ｐＨ熱処理リゾチームを得る工程、
（ｃ）前記低ｐＨ熱処理リゾチーム及び高ｐＨ熱処理リゾチームを混合する工程、
を含む、熱処理リゾチーム組成物の製造方法。
【請求項5】
（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物をｐＨ２．０～４．５に調整する工程、
を更に含む、請求項４に記載の熱処理リゾチーム組成物の製造方法。
を更に含む、請求項４に記載の熱処理リゾチーム組成物の製造方法。
【請求項6】
請求項１又は２に記載の熱処理リゾチーム組成物を、検体と接触させる工程を含む、ウイルス不活化及び／又は殺菌方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、熱処理リゾチーム組成物に関する。本発明によれば、細菌及びウイルスを効果的に不活化することができる。
【背景技術】
【0002】
リゾチームはグラム陽性菌の細胞壁を分解する酵素として知られていた（非特許文献１）が、加熱を行うことによってタンパクの立体構造が変化し、細胞壁の薄いグラム陰性菌に対しても殺菌効果を有することが明らかとなった（非特許文献２）。
一方、ノロウイルスは、ヒトに対する感染性が高く、食中毒又はウイルス性急性胃腸炎を引き起こすことが知られている。本発明者らは、リゾチームを加熱変性することによって、ノロウイルスを不活化できることを見出した（特許文献１及び２）。
一方、ノロウイルスは、ヒトに対する感染性が高く、食中毒又はウイルス性急性胃腸炎を引き起こすことが知られている。本発明者らは、リゾチームを加熱変性することによって、ノロウイルスを不活化できることを見出した（特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開第２０１５／１２５９６１号
【特許文献2】国際公開第２０１６／０１７７８４号
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Journal of Food Science., Vol. 79, 2014
【非特許文献2】J. Agric. Food Chem., 44, 1416-1423. 1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
前記の通り、リゾチームを加熱することによって、細菌及びウイルスをそれぞれ不活化できることが分かった。しかしながら、ウイルス及び細菌の不活化作用を併せ持つ、更に効果的にウイルス及び細菌を不活化できる薬剤の開発が期待されていた。
本発明の目的は、効果的にウイルス及び細菌を不活化できる薬剤を提供することである。
本発明の目的は、効果的にウイルス及び細菌を不活化できる薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は、効果的にウイルス及び細菌を不活化できる薬剤について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、加熱時のｐＨを調整することによって、ウイルス及び細菌を効果的に不活化できることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］ｐＨ２．０～４．５で熱処理された低ｐＨ熱処理リゾチーム及びｐＨ５．５～８．５で熱処理された高ｐＨ熱処理リゾチームを含む、熱処理リゾチーム組成物、
［２］ｐＨ２．０～４．５である、［１］に記載の熱処理リゾチーム組成物、
［３］ウイルス不活化及び殺菌用である［１］又は［２］に記載の組成物、
［４］（ａ）リゾチームをｐＨ２．０～４．５で熱処理し、低ｐＨ熱処理リゾチームを得る工程、（ｂ）別のリゾチームをｐＨ５．５～８．５で熱処理し、高ｐＨ熱処理リゾチームを得る工程、（ｃ）前記低ｐＨ熱処理リゾチーム及び高ｐＨ熱処理リゾチームを混合する工程、を含む、熱処理リゾチーム組成物の製造方法、
［５］（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物をｐＨ２．０～４．５に調整する工程、を更に含む、［４］に記載の熱処理リゾチーム組成物の製造方法、及び
［６］［１］又は［２］に記載の熱処理リゾチーム組成物を、検体と接触させる工程を含む、ウイルス不活化及び／又は殺菌方法、
に関する。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］ｐＨ２．０～４．５で熱処理された低ｐＨ熱処理リゾチーム及びｐＨ５．５～８．５で熱処理された高ｐＨ熱処理リゾチームを含む、熱処理リゾチーム組成物、
［２］ｐＨ２．０～４．５である、［１］に記載の熱処理リゾチーム組成物、
［３］ウイルス不活化及び殺菌用である［１］又は［２］に記載の組成物、
［４］（ａ）リゾチームをｐＨ２．０～４．５で熱処理し、低ｐＨ熱処理リゾチームを得る工程、（ｂ）別のリゾチームをｐＨ５．５～８．５で熱処理し、高ｐＨ熱処理リゾチームを得る工程、（ｃ）前記低ｐＨ熱処理リゾチーム及び高ｐＨ熱処理リゾチームを混合する工程、を含む、熱処理リゾチーム組成物の製造方法、
［５］（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物をｐＨ２．０～４．５に調整する工程、を更に含む、［４］に記載の熱処理リゾチーム組成物の製造方法、及び
［６］［１］又は［２］に記載の熱処理リゾチーム組成物を、検体と接触させる工程を含む、ウイルス不活化及び／又は殺菌方法、
に関する。
【発明の効果】
【0007】
本発明の熱処理リゾチーム組成物によれば、ウイルス及び細菌の両者を効果的に不活化することができる。特に食中毒の原因菌及び／又は原因ウイルスを効果的に不活化することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】卵白リゾチームを異なるｐＨで処理して、V. parahaemolyticusに対する殺菌作用を測定したグラフである。
【図2】卵白リゾチームを異なるｐＨで処理して、V. harveyiに対する殺菌作用を測定したグラフである。
【図3】ｐＨ３．２で熱処理した卵白リゾチーム、及びｐＨ７．０で熱処理した卵白リゾチームを混合した熱処理リゾチーム組成物（ｐＨ３．５、ｐＨ４．５又はｐＨ７．０に調整）のV. parahaemolyticusに対する殺菌作用を示したグラフである。
【図4】ｐＨ３．２で熱処理した卵白リゾチーム、及びｐＨ７．０で熱処理した卵白リゾチームを混合した熱処理リゾチーム組成物（ｐＨ３．５、ｐＨ４．５又はｐＨ７．０に調整）のＭＮＶ－１に対する抗ウイルス作用を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
［１］熱処理リゾチーム組成物
本発明の熱処理リゾチーム組成物は、ｐＨ２．０～４．５で熱処理された低ｐＨ熱処理リゾチーム及びｐＨ５．５～８．５で熱処理された高ｐＨ熱処理リゾチームを含む。
本発明の熱処理リゾチーム組成物は、ｐＨ２．０～４．５で熱処理された低ｐＨ熱処理リゾチーム及びｐＨ５．５～８．５で熱処理された高ｐＨ熱処理リゾチームを含む。
【0010】
《低ｐＨ熱処理リゾチーム》
本発明に用いる低ｐＨ熱処理リゾチームは、ｐＨ２．０～４．５で熱処理されたものである。
ｐＨの下限は、ｐＨ２．０以上であり、好ましくはｐＨ２．２５以上であり、より好ましくはｐＨ２．５以上であり、更に好ましくはｐＨ２．７５以上であり、更に好ましくはｐＨ３．０以上である。ｐＨの上限は、４．５以下であり、好ましくはｐＨ４．２５以下であり、より好ましくはｐＨ４．０以下であり、更に好ましくはｐＨ３．７５以下であり、更に好ましくはｐＨ３．５以下である。前記上限と下限とは、任意に組み合わせてｐＨの範囲とすることができる。
本発明に用いる低ｐＨ熱処理リゾチームは、ｐＨ２．０～４．５で熱処理されたものである。
ｐＨの下限は、ｐＨ２．０以上であり、好ましくはｐＨ２．２５以上であり、より好ましくはｐＨ２．５以上であり、更に好ましくはｐＨ２．７５以上であり、更に好ましくはｐＨ３．０以上である。ｐＨの上限は、４．５以下であり、好ましくはｐＨ４．２５以下であり、より好ましくはｐＨ４．０以下であり、更に好ましくはｐＨ３．７５以下であり、更に好ましくはｐＨ３．５以下である。前記上限と下限とは、任意に組み合わせてｐＨの範囲とすることができる。
【0011】
処理されるリゾチームの種類は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、Ｃ型リゾチーム（ニワトリ型リゾチーム）、Ｇ型リゾチーム（グース型リゾチーム）、又は無脊椎動物リゾチームが挙げられる。Ｃ型リゾチームとしては、ニワトリ、キジ、アヒルなどの小型の鳥類、哺乳類、魚類、又は昆虫類のリゾチームが挙げられる。Ｇ型リゾチームとしては、ガン、ハクチョウ、又は走鳥類などの大型の鳥類のリゾチームが挙げられる。無脊椎動物リゾチームとしては、貝類などのリゾチームが挙げられる。具体的なＣ型リゾチームとしては、例えば卵白リゾチーム（配列番号１）、又はヒトリゾチーム（配列番号２）が挙げられる。
具体的には、前記低ｐＨ熱処理リゾチームは、限定されるものではないが、後述の熱処理リゾチーム組成物の製造方法における工程ａによって調製することができる。
具体的には、前記低ｐＨ熱処理リゾチームは、限定されるものではないが、後述の熱処理リゾチーム組成物の製造方法における工程ａによって調製することができる。
【0012】
《細菌の不活化（殺菌効果）》
本発明に用いる低ｐＨ熱処理リゾチームは、限定されるものではないが、細菌を不活化することができる。リゾチームは、グラム陽性菌に対して殺菌効果を有する。加熱処理した加熱処理リゾチームはグラム陽性菌に対して、殺菌効果を示す。
前記低ｐＨ熱処理リゾチームは、グラム陽性菌及びグラム陰性菌に対して殺菌効果を有する。グラム陽性菌としては、例えばラクトコッカス・ガルビエ（Lactococus garvieae）、リステリア菌、ブドウ球菌、又はバチルス菌が挙げられる。グラム陰性菌としては、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、広範な腸内細菌科の菌群、シュードモナスなどが挙げられる。
本発明に用いる低ｐＨ熱処理リゾチームは、限定されるものではないが、細菌を不活化することができる。リゾチームは、グラム陽性菌に対して殺菌効果を有する。加熱処理した加熱処理リゾチームはグラム陽性菌に対して、殺菌効果を示す。
前記低ｐＨ熱処理リゾチームは、グラム陽性菌及びグラム陰性菌に対して殺菌効果を有する。グラム陽性菌としては、例えばラクトコッカス・ガルビエ（Lactococus garvieae）、リステリア菌、ブドウ球菌、又はバチルス菌が挙げられる。グラム陰性菌としては、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、広範な腸内細菌科の菌群、シュードモナスなどが挙げられる。
【0013】
本明細書において「細菌の不活化活性（殺菌活性）」とは、細菌を抑制できる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば後述の実施例で示すように、リゾチーム組成物と、ビブリオ・パラヘモリティカスとを接触させた後に、ビブリオ・パラヘモリティカスのコロニー形成数を減少させる活性が挙げられる。例えば、増殖性を失っており、増殖性が回復しないものが含まれる。具体的には、５時間、１０時間、又は１５時間前培養したビブリオ・パラヘモリティカス（１００μＬ）と、１．１重量％の低ｐＨ熱処理リゾチーム（９００μＬ）を、３０℃、１時間接触させ、生菌数を測定することによって、「細菌の不活化活性（殺菌活性）」を測定することができる。例えば、５時間の前培養の場合、６．４ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍＬのコロニー数を、１／１０以下、１／１００以下、１／１０００以下、１／１００００以下、又は検出限界以下にすることによって、細菌を不活化（殺菌）することが確認できる。同様に、１０時間、又は１５時間前培養においても、コロニー数を、１／１０以下、１／１００以下、１／１０００以下、１／１００００以下、又は検出限界以下にすることによって、細菌を不活化（殺菌）することが確認できる。
【0014】
《高ｐＨ熱処理リゾチーム》
本発明に用いる高ｐＨ熱処理リゾチームは、ｐＨ５．５～８．５で熱処理されたものである。
ｐＨの下限は、ｐＨ５．５以上であり、好ましくはｐＨ５．７５以上であり、より好ましくはｐＨ６．０以上であり、更に好ましくはｐＨ６．２５以上であり、更に好ましくはｐＨ６．５以上であり、更に好ましくはｐＨ６．７５以上である。ｐＨの上限は、８．５以下であり、好ましくはｐＨ８．２５以下であり、より好ましくはｐＨ８．０以下であり、更に好ましくはｐＨ７．７５以下であり、更に好ましくはｐＨ７．５以下であり、更に好ましくはｐＨ７．２５以下である。前記上限と下限とは、任意に組み合わせてｐＨの範囲とすることができる。
処理されるリゾチームの種類は、前記高ｐＨ熱処理リゾチームに用いるものを制限なく用いることができる。
具体的には、前記高ｐＨ熱処理リゾチームは、限定されるものではないが、後述の熱処理リゾチーム組成物の製造方法における工程ｂによって調製することができる。
本発明に用いる高ｐＨ熱処理リゾチームは、ｐＨ５．５～８．５で熱処理されたものである。
ｐＨの下限は、ｐＨ５．５以上であり、好ましくはｐＨ５．７５以上であり、より好ましくはｐＨ６．０以上であり、更に好ましくはｐＨ６．２５以上であり、更に好ましくはｐＨ６．５以上であり、更に好ましくはｐＨ６．７５以上である。ｐＨの上限は、８．５以下であり、好ましくはｐＨ８．２５以下であり、より好ましくはｐＨ８．０以下であり、更に好ましくはｐＨ７．７５以下であり、更に好ましくはｐＨ７．５以下であり、更に好ましくはｐＨ７．２５以下である。前記上限と下限とは、任意に組み合わせてｐＨの範囲とすることができる。
処理されるリゾチームの種類は、前記高ｐＨ熱処理リゾチームに用いるものを制限なく用いることができる。
具体的には、前記高ｐＨ熱処理リゾチームは、限定されるものではないが、後述の熱処理リゾチーム組成物の製造方法における工程ｂによって調製することができる。
【0015】
《ウイルスの不活化》
本発明に用いる高ｐＨ熱処理リゾチームは、限定されるものではないが、ウイルスを不活化することができる。対象ウイルスは、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、特にはエンベロープを有さないＲＮＡウイルスが挙げられる。エンベロープを有さないＲＮＡウイルスとしては、カリシウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、へパトウイルス、パレコウイルス、コブウイルス、カルディオウイルス、アフソウイルス、エルボウイルス、テスコウイルスが挙げられる。カリシウイルス科のウイルスとしては、ベシウイルス、ラゴウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、又はネボウイルスが挙げられる。
例えば、ノロウイルスには、Ｇ１、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ、及びＧＶの５つの遺伝子型が知られており、Ｇ１、ＧＩＩ、及びＧＩＶの３つの遺伝子型のノロウイルスが、ヒトに感染する。ＧＩＩＩは、ウシ又はヒツジに感染し、ＧＶはマウスに感染する。またＧＩＩはヒト以外にブタに感染する。本発明の熱処理リゾチーム組成物は、これらのウイルスを不活化することができる。
本発明に用いる高ｐＨ熱処理リゾチームは、限定されるものではないが、ウイルスを不活化することができる。対象ウイルスは、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、特にはエンベロープを有さないＲＮＡウイルスが挙げられる。エンベロープを有さないＲＮＡウイルスとしては、カリシウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、へパトウイルス、パレコウイルス、コブウイルス、カルディオウイルス、アフソウイルス、エルボウイルス、テスコウイルスが挙げられる。カリシウイルス科のウイルスとしては、ベシウイルス、ラゴウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、又はネボウイルスが挙げられる。
例えば、ノロウイルスには、Ｇ１、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ、及びＧＶの５つの遺伝子型が知られており、Ｇ１、ＧＩＩ、及びＧＩＶの３つの遺伝子型のノロウイルスが、ヒトに感染する。ＧＩＩＩは、ウシ又はヒツジに感染し、ＧＶはマウスに感染する。またＧＩＩはヒト以外にブタに感染する。本発明の熱処理リゾチーム組成物は、これらのウイルスを不活化することができる。
【0016】
本明細書において「ウイルス不活化活性」とは、ウイルスを抑制できる限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば後述の実施例で示すように、高ｐＨ熱処理リゾチームと、ノロウイルス（例えば、ＭＮＶ－１）とを接触させた後に、ノロウイルスのプラク形成数を減少させる活性が挙げられる。具体的には、一定量のウイルスを含むウイルス液と、高ｐＨ熱処理リゾチーム液（高ｐＨ熱処理リゾチームと低ｐＨ熱処理リゾチームとの混合液）とを等量混合して、１時間接触させ、ウイルスのプラク数を測定することによって、「ウイルス不活化活性」を測定することができる。例えば、５時間の前培養の場合、約５．０ｌｏｇ ＰＦＵ／ｍＬのプラク形成数を、１／１０以下、１／１００以下、１／１０００以下、又は検出限界以下にすることによって、ウイルスを不活化することが確認できる。
【0017】
《組成物のｐＨ》
また、本発明の熱処理リゾチーム組成物のｐＨは、限定されるものではなく、例えばｐＨ２．０～８．５で用いることができるが、好ましくはｐＨ２．０～７．５であり、より好ましくは、ｐＨ２．０～６．５であり、更に好ましくはｐＨ２．０～５．５であり、最も好ましくはｐＨ２．０～４．５である。本発明の熱処理リゾチーム組成物は、前記ｐＨにおいてウイルス及び細菌を効果的に不活化することができるが、特に低いｐＨにおいて細菌を効果的に不活化することができる。
また、本発明の熱処理リゾチーム組成物のｐＨは、限定されるものではなく、例えばｐＨ２．０～８．５で用いることができるが、好ましくはｐＨ２．０～７．５であり、より好ましくは、ｐＨ２．０～６．５であり、更に好ましくはｐＨ２．０～５．５であり、最も好ましくはｐＨ２．０～４．５である。本発明の熱処理リゾチーム組成物は、前記ｐＨにおいてウイルス及び細菌を効果的に不活化することができるが、特に低いｐＨにおいて細菌を効果的に不活化することができる。
【0018】
本発明の熱処理リゾチーム組成物は、生体外又は生体内で使用することができる。例えば、生体外で使用する場合は、魚類のウイルス及び／又は細菌を不活化することができる。また、水産物を含む食品のウイルス及び／又は細菌を不活化に用いることもできる。生体内で使用する場合は、食中毒に罹患した患者への医薬組成物として使用することができる。
【0019】
［２］熱処理リゾチーム組成物の製造方法
熱処理リゾチーム組成物の製造方法は、（ａ）リゾチームをｐＨ２．０～４．５で熱処理し、低ｐＨ熱処理リゾチームを得る工程、（ｂ）別のリゾチームをｐＨ５．５～８．５で熱処理し、高ｐＨ熱処理リゾチームを得る工程、（ｃ）前記低ｐＨ熱処理リゾチーム及び高ｐＨ熱処理リゾチームを混合する工程、を含む。熱処理リゾチーム組成物の製造方法は、好ましくは（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物をｐＨ２．０～４．５に調整する工程、を更に含む。
熱処理リゾチーム組成物の製造方法は、（ａ）リゾチームをｐＨ２．０～４．５で熱処理し、低ｐＨ熱処理リゾチームを得る工程、（ｂ）別のリゾチームをｐＨ５．５～８．５で熱処理し、高ｐＨ熱処理リゾチームを得る工程、（ｃ）前記低ｐＨ熱処理リゾチーム及び高ｐＨ熱処理リゾチームを混合する工程、を含む。熱処理リゾチーム組成物の製造方法は、好ましくは（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物をｐＨ２．０～４．５に調整する工程、を更に含む。
【0020】
《工程ａ》
前記工程ａにおいては、リゾチームをｐＨ２．０～４．５で熱処理し、低ｐＨ熱処理リゾチームを得る。工程ａで使用するリゾチームの種類は、特に限定されるものではないが、前記「熱処理リゾチーム組成物」の項に記載のリゾチームを用いることができる。
前記工程ａにおいては、リゾチームをｐＨ２．０～４．５で熱処理し、低ｐＨ熱処理リゾチームを得る。工程ａで使用するリゾチームの種類は、特に限定されるものではないが、前記「熱処理リゾチーム組成物」の項に記載のリゾチームを用いることができる。
【0021】
前記リゾチームを水又は緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）に、０．１～５重量％程度の濃度で溶解する。リゾチーム溶液のｐＨの調整は、通常の方法を用いることができるが、例えば、ｐＨを下げる場合は、例えば塩酸などを用いることができる。ｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムなどを用いることができる。
【0022】
リゾチーム溶液の加熱方法も、本分野で通常用いられる方法を限定することなく使用することができる。例えば、ウォーターバス、オイルバス、又はヒートブロックが挙げられる。
熱処理の温度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば上限は、１５０℃以下であり、好ましくは１４０℃以下であり、より好ましくは１３０℃以下であり、更に好ましくは１２５℃以下である。下限は、６０℃以上であり、好ましくは７０℃以上であり、より好ましくは８０℃以上であり、より好ましくは９０℃以上であり、更に好ましくは９５℃以上である。前記、上限と下限とは、組み合わせて好適な範囲とすることができる。
熱処理の温度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば上限は、１５０℃以下であり、好ましくは１４０℃以下であり、より好ましくは１３０℃以下であり、更に好ましくは１２５℃以下である。下限は、６０℃以上であり、好ましくは７０℃以上であり、より好ましくは８０℃以上であり、より好ましくは９０℃以上であり、更に好ましくは９５℃以上である。前記、上限と下限とは、組み合わせて好適な範囲とすることができる。
【0023】
加熱時間も、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば１０分～１０時間であり、ある態様では２０分～２時間であり、ある態様では３０分～１時間である。
【0024】
《工程ｂ》
前記工程ｂにおいては、別のリゾチームをｐＨ５．５～８．５で熱処理し、高ｐＨ熱処理リゾチームを得る。前記「別のリゾチーム」は、工程ａで熱処理されたリゾチームではないリゾチームを意味する。
前記工程ｂにおいては、別のリゾチームをｐＨ５．５～８．５で熱処理し、高ｐＨ熱処理リゾチームを得る。前記「別のリゾチーム」は、工程ａで熱処理されたリゾチームではないリゾチームを意味する。
【0025】
工程ａで使用するリゾチームの種類は、特に限定されるものではないが、前記「熱処理リゾチーム組成物」の項に記載のリゾチームを用いることができる。
【0026】
工程ｂにおける、リゾチームの溶解液、ｐＨの調整方法、加熱方法、加熱温度、及び加熱時間は、ｐＨ５．５～８．５とすることを除いては、前記工程ａに記載の方法等を用いることができる。
【0027】
《工程ｃ》
前記工程ｃにおいては、前記低ｐＨ熱処理リゾチーム及び高ｐＨ熱処理リゾチームを混合する。混合方法は、特に限定されない。また、低ｐＨ熱処理リゾチーム及び高ｐＨ熱処理リゾチームの混合比も、本発明の効果が得られる限りにおいて限定されるものではないが、低ｐＨ熱処理リゾチームと高ｐＨ熱処理リゾチームとは、例えば１００：１～１～１００の混合比（重量比）で混合することができる。混合比は、ある態様では５０：１～１：５０であり、ある態様では２０：１～１：２０であり、ある態様では１０：１～１：１０であり、ある態様では５：１～１：５であり、ある態様では３：１～１：３であり、ある態様では２：１～１：２であり、ある態様では１：１である。
前記工程ｃにおいては、前記低ｐＨ熱処理リゾチーム及び高ｐＨ熱処理リゾチームを混合する。混合方法は、特に限定されない。また、低ｐＨ熱処理リゾチーム及び高ｐＨ熱処理リゾチームの混合比も、本発明の効果が得られる限りにおいて限定されるものではないが、低ｐＨ熱処理リゾチームと高ｐＨ熱処理リゾチームとは、例えば１００：１～１～１００の混合比（重量比）で混合することができる。混合比は、ある態様では５０：１～１：５０であり、ある態様では２０：１～１：２０であり、ある態様では１０：１～１：１０であり、ある態様では５：１～１：５であり、ある態様では３：１～１：３であり、ある態様では２：１～１：２であり、ある態様では１：１である。
【0028】
《工程ｄ》
前記工程（ｄ）においては、工程（ｃ）で得られた混合物をｐＨ２．０～４．５に調整する。
混合物のｐＨの調整は、通常の方法を用いることができるが、例えば、ｐＨを下げる場合は、例えば塩酸などを用いることができる。ｐＨを上げる場合は、例えば水酸化ナトリウムなどを用いることができる。
前記工程（ｄ）においては、工程（ｃ）で得られた混合物をｐＨ２．０～４．５に調整する。
混合物のｐＨの調整は、通常の方法を用いることができるが、例えば、ｐＨを下げる場合は、例えば塩酸などを用いることができる。ｐＨを上げる場合は、例えば水酸化ナトリウムなどを用いることができる。
【0029】
［３］ウイルス不活化及び／又は殺菌方法
本発明のウイルス不活化及び／又は殺菌方法は、前記熱処理リゾチーム組成物を、検体と接触させる工程を含む。
本発明のウイルス不活化及び／又は殺菌方法は、前記熱処理リゾチーム組成物を、検体と接触させる工程を含む。
【0030】
《検体》
本発明のウイルス不活化及び／又は殺菌方法が対象とする検体は、ウイルス及び／又は細菌を含み、それらを不活化したい検体であれば、特に限定されるものではないが、例えば水産物（例えば、魚類、又は貝類）、養殖における魚類又は貝類、畜養時の魚類又は貝類、水産物加工品、肉類及びその加工品、卵及びその加工品、乳類及びその加工品、穀類及びその加工品、野菜類及びその加工品、菓子類などが挙げられる。
また、食中毒患者の吐しゃ物等に含まれるウイルス及び／又は細菌を不活化することもできる。この場合、食中毒患者の吐しゃ物等が検体となる。
本発明のウイルス不活化及び／又は殺菌方法が対象とする検体は、ウイルス及び／又は細菌を含み、それらを不活化したい検体であれば、特に限定されるものではないが、例えば水産物（例えば、魚類、又は貝類）、養殖における魚類又は貝類、畜養時の魚類又は貝類、水産物加工品、肉類及びその加工品、卵及びその加工品、乳類及びその加工品、穀類及びその加工品、野菜類及びその加工品、菓子類などが挙げられる。
また、食中毒患者の吐しゃ物等に含まれるウイルス及び／又は細菌を不活化することもできる。この場合、食中毒患者の吐しゃ物等が検体となる。
【0031】
《作用》
本発明の熱処理リゾチーム組成物が、ウイルス及び細菌を効率的に不活化できるメカニズムは、詳細に解析されているわけではないが、以下のように推定することができる。しかしながら以下の推定によって、本発明は限定されるものではない。
リゾチームを低いｐＨ下で熱処理することにより、細菌に対する不活化作用に優れた低ｐＨ熱還元リゾチームを得ることができると考えられる。また、リゾチームを高いｐＨで熱処理することによって、ウイルスに対する不活化作用に優れた高ｐＨ熱還元リゾチームを得ることができると考えられる。このような熱還元リゾチームを混合して用いることにより、細菌及びウイルスの両方に有効な熱処理リゾチーム組成物を作製することができると考えられる。更に、前記低ｐＨ熱還元リゾチームは、低いｐＨ条件において、効率的に細菌を不活化することができる。一方、前記高ｐＨ熱還元リゾチームは、低いｐＨにおいても、高いｐＨにおいても効率的にウイルスを不活化することができる。従って、細菌及びウイルスを同時に効率的に不活化するためには、本発明の熱処理リゾチーム組成物を低いｐＨに調製することによって、より高い効果が得られると推定される。
本発明の熱処理リゾチーム組成物が、ウイルス及び細菌を効率的に不活化できるメカニズムは、詳細に解析されているわけではないが、以下のように推定することができる。しかしながら以下の推定によって、本発明は限定されるものではない。
リゾチームを低いｐＨ下で熱処理することにより、細菌に対する不活化作用に優れた低ｐＨ熱還元リゾチームを得ることができると考えられる。また、リゾチームを高いｐＨで熱処理することによって、ウイルスに対する不活化作用に優れた高ｐＨ熱還元リゾチームを得ることができると考えられる。このような熱還元リゾチームを混合して用いることにより、細菌及びウイルスの両方に有効な熱処理リゾチーム組成物を作製することができると考えられる。更に、前記低ｐＨ熱還元リゾチームは、低いｐＨ条件において、効率的に細菌を不活化することができる。一方、前記高ｐＨ熱還元リゾチームは、低いｐＨにおいても、高いｐＨにおいても効率的にウイルスを不活化することができる。従って、細菌及びウイルスを同時に効率的に不活化するためには、本発明の熱処理リゾチーム組成物を低いｐＨに調製することによって、より高い効果が得られると推定される。
【実施例0032】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0033】
《実施例１》
本実施例では、卵白リゾチームを異なるｐＨで処理して、細菌（V. parahaemolyticus、又はV. harveyi）に対する殺菌作用を測定した。
卵白リゾチーム（富士フィルム和光純薬株式会社）を蒸留水で溶解し、３０ｍＬ（１．１ｗ／ｖ％）の溶液を調製した。４ｍＬずつ１５ｍＬの遠沈管（Ｌａｂｃｏｎ）に分注し、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ３．２（未調整）、４．０、５．０、６．０、７．０、又は８．０に調整した。１００℃に設定したオイルバスで４０分間加熱した後、氷上で急冷し、熱処理リゾチーム溶液を得た。
本実施例では、卵白リゾチームを異なるｐＨで処理して、細菌（V. parahaemolyticus、又はV. harveyi）に対する殺菌作用を測定した。
卵白リゾチーム（富士フィルム和光純薬株式会社）を蒸留水で溶解し、３０ｍＬ（１．１ｗ／ｖ％）の溶液を調製した。４ｍＬずつ１５ｍＬの遠沈管（Ｌａｂｃｏｎ）に分注し、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ３．２（未調整）、４．０、５．０、６．０、７．０、又は８．０に調整した。１００℃に設定したオイルバスで４０分間加熱した後、氷上で急冷し、熱処理リゾチーム溶液を得た。
【0034】
Phosphate buffered saline（ＰＢＳ）、前記６種類の熱処理リゾチーム溶液９００μＬに、５時間、１０時間、１５時間前培養したV. parahaemolyticus、又はV. harveyiを１００μＬずつそれぞれ曝露し、３０℃で１時間培養した。各細菌の生菌数は、段階希釈液を１．５％ＮａＣｌを添加したＴＳＡ培地、又はＴＳＡ培地に１００μＬ表面塗抹し、３０℃で２２時間培養後、コロニー数を測定した。
【0035】
表１及び図１に示すように、５時間培養のV. parahaemolyticusを曝露した場合、生菌数は検出限界である２．０ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍＬ以下となった。１０時間培養のV. parahaemolyticusを曝露した場合、ｐＨ未調整（ｐＨ３．２）の熱処理リゾチーム溶液では生菌数が４．７ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍＬ以上減少し検出限界以下となった。ｐＨ４．０では４．４ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍＬ減少したが（ｐ＜０．０５）、ｐＨの上昇に伴い生菌数は多くなった。ｐＨ８．０では２．６ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍＬの減少に留まった（ｐ＜０．０５）。１５時間培養したV. parahaemolyticusを曝露した場合、１０時間培養の場合と同様、ｐＨ未調整の熱処理リゾチーム溶液では生菌数が４．６ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍＬ以上減少し検出限界以下となった。
【0036】
【表1】
【0037】
表２及び図２に示すように、５時間又は１０時間培養のV. harveyiを曝露した場合、ＰＢＳを除いてすべての試験区で３．３ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍＬ以上減少し、検出限界以下となった（ｐ＜０．０５）。１５時間培養のV. harveyiを曝露した場合、ｐＨ未調整の熱処理リゾチーム溶液で検出限界以下となった。ｐＨ４．０～８．０に調整した熱処理リゾチーム溶液では、V. harveyiの生菌数が３．１～３．８ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍＬ減少した（ｐ＜０．０５）。
【0038】
【表2】
【0039】
《実施例２》
本実施例では、卵白リゾチームをｐＨ３．２、又はｐＨ７．０で熱処理して、それらを混合して、熱処理リゾチーム組成物を得た。そして、得られた熱処理リゾチーム組成物のV. parahaemolyticusに対する殺菌作用、及びＭＮＶ－１に対する抗ウイルス作用を測定した。
卵白リゾチーム（富士フィルム和光純薬株式会社）を蒸留水で溶解し、１６ｍＬのリゾチーム溶液（２．２ｗ／ｖ％）を調製した。１５ｍＬの遠沈管（Ｌａｂｃｏｎ）に８ｍＬずつ分注し、一方はｐＨ未調整（ｐＨ３．２）、もう一方は１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．０に調整した。１００℃に設定したオイルバスで４０分間加熱した後、氷上で急冷した。ｐＨ未調整のリゾチーム溶液とｐＨ７．０のリゾチーム溶液とを等量混合し、１．１％混合リゾチーム溶液（ｐＨ４．５）を作製した。その後、再度ｐＨを調整し、ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、又はｐＨ７．０の３種の１．１％混合リゾチーム溶液を得た。
ＰＢＳ、３種の１．１％混合リゾチーム溶液１０８０μＬに１０時間前培養したV. parahaemolyticus及びＭＮＶ－１を等量混合した溶液１２０μＬを１時間曝露した。その後、V. parahaemolyticus 測定用に生理食塩水９００μＬに曝露後の溶液１００μＬを接種し、段階希釈を行った。１．５％ＮａＣｌを添加したＴＳＡ培地に１００μＬ表面塗抹し、３０℃で２２時間培養後、曝露後の生菌数を測定した。ＭＮＶ－１測定用には、曝露後の溶液８００μＬを孔径０．２μｍのシリンジフィルターでろ過し、ろ液１２０μＬをＤ－ＭＥＭに接種し、段階希釈を行い、以下に述べるプラークアッセイにより感染価を測定した。
本実施例では、卵白リゾチームをｐＨ３．２、又はｐＨ７．０で熱処理して、それらを混合して、熱処理リゾチーム組成物を得た。そして、得られた熱処理リゾチーム組成物のV. parahaemolyticusに対する殺菌作用、及びＭＮＶ－１に対する抗ウイルス作用を測定した。
卵白リゾチーム（富士フィルム和光純薬株式会社）を蒸留水で溶解し、１６ｍＬのリゾチーム溶液（２．２ｗ／ｖ％）を調製した。１５ｍＬの遠沈管（Ｌａｂｃｏｎ）に８ｍＬずつ分注し、一方はｐＨ未調整（ｐＨ３．２）、もう一方は１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７．０に調整した。１００℃に設定したオイルバスで４０分間加熱した後、氷上で急冷した。ｐＨ未調整のリゾチーム溶液とｐＨ７．０のリゾチーム溶液とを等量混合し、１．１％混合リゾチーム溶液（ｐＨ４．５）を作製した。その後、再度ｐＨを調整し、ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、又はｐＨ７．０の３種の１．１％混合リゾチーム溶液を得た。
ＰＢＳ、３種の１．１％混合リゾチーム溶液１０８０μＬに１０時間前培養したV. parahaemolyticus及びＭＮＶ－１を等量混合した溶液１２０μＬを１時間曝露した。その後、V. parahaemolyticus 測定用に生理食塩水９００μＬに曝露後の溶液１００μＬを接種し、段階希釈を行った。１．５％ＮａＣｌを添加したＴＳＡ培地に１００μＬ表面塗抹し、３０℃で２２時間培養後、曝露後の生菌数を測定した。ＭＮＶ－１測定用には、曝露後の溶液８００μＬを孔径０．２μｍのシリンジフィルターでろ過し、ろ液１２０μＬをＤ－ＭＥＭに接種し、段階希釈を行い、以下に述べるプラークアッセイにより感染価を測定した。
【0040】
プラークアッセイはGonzalez-Hernandezら（Gonzalez-Hernandez et al., 2012）の方法を参考にして行った。ＲＡＷ ２６４．７細胞を６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）におよそ６ｌｏｇ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう分注し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１８時間インキュベートした。培養後プレートの培養液を全て抜き、段階希釈したサンプルを２ウェルずつ５００μＬ接種し、室温で１時間振盪させた。その後、接種したサンプルをプレートから全て抜き、SeaPlaque Agarose（ロンザジャパン株式会社）を１．５％添加したＤ－ＭＥＭを２ｍＬずつ重層した。これを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。その後、プレートに０．０３％ Neutral red solution（シグマ・アルドリッチジャパン株式会社）を２ｍＬずつ重層し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１時間インキュベートした。その後、染色液を抜き、プラークを測定、感染価を算出した。
【0041】
【産業上の利用可能性】
【0042】
本発明の熱処理リゾチーム組成物は、ウイルス及び細菌を効果的に不活化することができる。特に食中毒の原因菌及び／又は原因ウイルスを効果的に不活化することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】